ES2352172T3

ES2352172T3 - Péptidos de transito de plastidio.

Info

Publication number: ES2352172T3
Application number: ES05759599T
Authority: ES
Inventors: Michael Lassner; Jack Q. Wilkinson
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 2004-06-09
Filing date: 2005-06-09
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2025-06-09
Also published as: AU2009215812A1; US20060225148A1; CA2569767C; CA2734624A1; US7563863B2; WO2005123929A3; US7557260B2; CA2569767A1; US7345143B2; AU2009215812B2; US20080168579A1; DE602005023727D1; CN101001957B; US20080178352A1; EP1753866B1; AU2005254993B2; US20070118925A1; CN101001957A; AU2009215233B2; AU2005254993A1

Abstract

Un péptido de tránsito de plastidio aislado seleccionado entre: (a) un péptido que comprende cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46. (b) un péptido que es idéntico al menos en un 95% a la secuencia de aminoácidos de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46. (c) un péptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46, o un complemento del mismo después de al menos un lavado en 0,2X SSC a 55ºC durante 20 minutos; (d) un fragmento que comprende al menos un 90% de los radicales de aminoácido consecutivos de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención se encuadra de forma general en el campo de la inserción dirigida de proteínas y proporciona

5 péptidos que dirigen la localización de polipéptidos unidos hacia plastidios vegetales. La presente invención se refiere también a métodos y composiciones para localizar polipéptidos en plastidios vegetales, incluyendo, pero sin limitarse sólo a ellos producción de plantas transgénicas.

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2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Los péptidos de tránsito de plastidio son extensiones N-terminales que facilitan la inserción dirigida y translocalización de proteínas precursoras sintetizadas

15 citosólicamente en plastidios a través de un mecanismo posttransduccional (revisado por Bruce, Bichim. Biophys. Acta 1541:2-21 (2001)). Una vez que se ha completado toda la secuenciación del genoma Arabidopsis, se estima que se insertan dirigidamente más de 3500 proteínas diferentes en

20 los plasmidios durante la vida de una planta típica. El desarrollo de un modelo sobre cómo funcionan todas estas secuencias de inserción dirigida para apuntar a la inserción dirigida apropiada ha resultado difícil, ya que son muy divergentes al nivel de secuencia primaria en lo que se

25 refiere a la longitud, la composición y la organización. La información estructural secundaria y terciaria está disponible solamente para algunos péptidos de tránsito de plastidio, y los resultados difieren significativamente dependiendo sobre si los experimentos se llevaron a cabo en

30 un entorno acuoso o de imitación de la membrana. Por lo tanto, no se ha delineado claramente ninguna característica estructural o propiedad.[0003] La capacidad de insertar dirigidamente proteínas recombinantes en diferentes compartimentos subcelulares en

35 plantas transgénicas constituye una importante parte de la ingeniería genética de la planta. Por ejemplo, muchos procesos fisiológicos de la planta muy importantes tienen lugar en los plastidios, incluyendo, sin limitarse sólo a ellos, la fotosíntesis, la síntesis de ácidos grasos, la síntesis de aminoácidos, la biosíntesis de carotenoides, la biosíntesis de terpenoides, y la biosíntesis de almidón. Así pues, existe la necesidad de poder insertar dirigidamente polipéptidos recombinantes en plastidios para modular o alterar los procesos fisiológicos que tienen lugar en los plastidios. Adicionalmente, algunos polipéptidos son tóxicos cuando se expresan recombinantemente en el citoplasma. Dado que los plastidios son compartimientos subcelulares, es posible insertar dirigidamente polipéptidos recombinantes en los plastidios para secuestrarlos del citoplasma, permitiendo así mayores niveles de expresión. Por otra parte, la expresión de polipéptidos recombinantes en plastidios puede facilitar el aislamiento del polipéptido para diversas aplicaciones.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN [0004] La presente invención se refiere a nuevos péptidos de tránsito de plastidio seleccionados entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID Nº: 46. Por otra parte, se apreciará que los péptidos de la invención también abarcan ciertas variantes, derivados y análogos de estas secuencias tal como se definen en las reivindicaciones, así como moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de la invención. [0005] Por consiguiente, la invención proporciona un péptido de tránsito de plastidio aislado seleccionado entre:

a) un péptido que comprende cualquiera entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID Nº: 46;

b) un péptido que es idéntico al menos en un 95% a la secuencia de aminoácidos de cualquiera entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID Nº: 46;

c) un péptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótido de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID Nº: 46, o un complemento del mismo tras al menos un lavado en 0,2 x SSC a 55ºC durante 20 minutos.

d) un fragmento que comprende al menos un 90% de radicales de aminoácido consecutivos de cualquiera entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID Nº: 46. [0006] La invención proporciona también un polipéptido de fusión que comprende dicho péptido.[0007] La invención proporciona también un polipéptido de fusión que comprende el péptido de la reivindicación 1.[0008] La invención proporciona también una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de fusión que comprende dicha molécula de ácido nucleico.[0009] Se abarcan también los vectores o casetes de expresión que comprenden moléculas de ácido nucleico de la invención. Asimismo, quedan abarcadas células, plantas o semillas que comprenden los vectores de la invención.[0010] La presente invención se refiere también a plantas transgénicas que expresan una molécula de ácido nucleico y/o péptido de la invención. Las plantas transgénicas pueden expresar el transgen según cualquiera de los modos conocidos en la especialidad, incluyendo pero sin limitarse sólo a ellos, expresión constitutiva, expresión regulada en el desarrollo, expresión específica de tejido, etc. Las semillas obtenidas a partir de una planta transgénica de la invención también quedan abarcadas.

[0011] Se proporcionan los métodos de producción de los péptidos de la invención y/o polipéptidos que comprenden uno

o más péptidos de la invención, v.g., por medios recombinantes. También quedan abarcadas composiciones que comprenden uno o más péptidos de la invención y/o polipéptidos que comprenden uno o más péptidos de la invención. [0012] La presente invención proporciona también métodos para insertar dirigidamente un polipéptido en un plastidio en una planta por unión de un péptido de tránsito de plastidio de la invención con el polipéptido que se va a insertar dirigidamente. En algunos modos de realización, el método comprende la unión por recombinación de una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de plastidio de la invención con una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se va a insertar dirigidamente de manera que la traducción de la molécula de ácido nucleico produce un polipéptido de fusión.

Los métodos para identificar nuevos péptidos de tránsito de plastidio quedan abarcados dentro de la presente invención que comprende i) introducir en una planta o célula vegetal un vector que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de plastidio candidato unida una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que está solamente activo en un plastidio de manera que la traducción de la primera y la segunda molécula de ácido nucleico produce una proteína de fusión y ii) la detección selectiva de la actividad del polipéptido, indicando dicha actividad que el polipéptido está localizado en un plastidio y el péptido de tránsito de plastidio candidato es funcional.

Definiciones [0013] Un “péptido de tránsito de plastidio” se refiere a una secuencia de aminoácidos que media la inserción dirigida o localización de una secuencia de aminoácidos a la que se une (v.g., como polipéptido de fusión) en un plastidio.[0014] Un “plastidio” se refiere a un organelo de membrana doble pequeño de células vegetales y ciertos protistos que contiene ribosomas, ADN y a menudo pigmento. Los plastidios pueden darse en una forma no diferenciada (proplastidio) y en varias formas diferenciadas, incluyendo, pero sin limitarse sólo a ellas cloroplastos, etioplastos, amiloplastos, cromoplastos, elaioplastos y leucoplastos.[0015] Los términos “molécula de ácido nucleico” o “polinucleótido” se refieren a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos, tanto en forma de hebra simple como de doble hebra. A no ser que se limite específicamente, el término abarca moléculas de ácido nucleico que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a los nucleótidos de referencia y se metabolizan de manera similar en nucleótidos naturales. [0016] Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se refieren a un polímero de radicales de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácido que contienen radicales de aminoácido naturales, así como polímeros de aminoácido en los que uno o más de los radicales aminoácido es un mimético químico artificial del aminoácido natural correspondiente (v.g., aminoácido no clásico). Los radicales de aminoácido de polímeros de aminoácido están unidos generalmente con uniones de péptido covalentes, pero pueden unirse a través de cualquier otro método conocido dentro de la especialidad. Tal como se utilizan aquí, los términos abarcan polímeros de aminoácido de cualquier longitud incluyendo proteínas de longitud completa. [0017] El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos naturales, aminoácidos sintéticos, así como análogos de aminoácido y miméticos que funcionan de manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por un código genético. Los análogos de aminoácido incluyen, sin limitarse sólo a ellos, aminoácidos naturales que se modifican después, v.g., hidroxiprolina, γcarboxiglutamato y O-fosfoserina. Los aminoácidos pueden denominarse aquí o bien por los símbolos de tres letras conocidos comúnmente o bien a través de los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Comisión de Nomenclatura Bioquímica.[0018] El término “promotor” se refiere a regiones o secuencias localizadas corriente arriba y/o corriente abajo desde el comienzo de la trascripción que están relacionados con el reconocimiento y la unión de RNA polimerasa y otras proteínas para iniciar la trascripción. Los promotores incluyen secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio del comienzo de la trascripción, como por ejemplo, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor incluye también opcionalmente elementos potenciadores o represores distales, que pueden estar localizados hasta a una distancia de varios miles de pares de base desde el sitio de comienzo de la trascripción. Un promotor “constitutivo” es un promotor que está activo en la mayoría de las condiciones del entorno y el desarrollo. Un promotor “inducible” es un promotor que está activo con la regulación del entorno o de desarrollo. El término “unido operativamente” se refiere a una unión funcional entre una secuencia de control de la expresión de ácido nucleico (como por ejemplo un promotor, una disposición de los sitios de unión de factor de trascripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, dirigiendo la secuencia de control de la expresión la trascripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.[0019] Un “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de replicación en una célula huésped independientemente y/o integrada en el cromosoma huésped. Los vectores pueden ser, v.g., plasmidios y pueden tener un origen de replicación y/o elementos de expresión como por ejemplo iniciadores de trascripción /traducción y terminadores y promotores útiles para la regulación de la expresión de la molécula de ácido nucleico en particular.[0020] Un “casete de expresión” se refiere a una molécula de ácido nucleico que, cuando se introduce en una célula huésped tiene como resultado la trascripción de un trascripto de ARN que corresponde a al menos a una porción del casete de expresión y la traducción de un péptido o polipéptido desde el trascripto de ARN. La molécula de ácido nucleico puede contener un comienzo trascripcional y/o un codón de parada.[0021] El término “planta” incluye plantas enteras, órganos/ estructuras vegetativas brotadas (v.g., hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/ estructuras florales

(v.g. brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embrión, endosperma y recubrimiento de semilla) y frutos (el ovario maduro), tejido vegetal (v.g., tejido vascular, tejido del suelo y similares) y células (v.g., células de guarda, óvulos, tricomas y similares) y la progenie de los mismos. La clase de plantas que se puede utilizar en el método de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas inferiores y superiores susceptible de las técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), gimnospermas, helechos y algas multicelulares. Incluye plantas de una variedad de niveles de ploidia, incluyendo aneuploídia, poliploídia, diploídia, haptoídia y hemzigotos.[0022] El término “toxina Bt” se refiere a una proteína insecticida aislada o derivada de la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt). El término incluye variantes naturales y no naturales, incluyendo fragmentos y versiones modificadas de toxinas Bt naturales (Ver, v.g., las patentes EE.UU. Nº 6.489.542; 5.281.530; 5.322.932; y la publicación PCT WO 92/04453).

[0023] El término “recombinante” se refiere a un polinucleótido manipulado por el hombre, una copia, o un complemento del mismo. Por ejemplo, un casete de expresión recombinante que comprende un promotor operativamente unido a un segundo polinucleótido puede incluir un promotor que puede ser heterólogo para un segundo polinucleótido como resultado de la manipulación humana (v.g., a través de los métodos descritos en Sambrook y cols., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1989) o Current Protocols in Molecular Biology Volúmenes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)). En otro ejemplo, un casete de expresión recombinante puede comprender polinucleótidos combinados de tal manera que es enormemente improbable que se encuentren los polinucleótidos en la naturaleza. Por ejemplo, los sitios de restricción manipulados por el hombre o secuencias de vector de plasmidio pueden flanquear o separar el promotor del segundo polinucleótido. Las personas especializadas en este campo podrán reconocer que se pueden manipular polinucleótidos de muchas maneras y que no se limitan a los ejemplos que se han expuesto anteriormente.[0024] El término “polipéptido variante” se refiere a un polipéptido que está relacionado con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 40, 42, 43 y 46, pero que ha sido alterado en algún sentido (v.g., supresión/ adición de uno o más radicales o obtención de un derivado o polipéptido análogo). En algunos modos de realización, los polipéptidos variantes tienen al menos una actividad funcional de tránsito de plastidio parcial (v.g., la capacidad de dirigir una fracción unida a un plastidio) de al menos un 50%, 60%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% cuando se compara con un polipéptido sin alterar. En otros modos de realización, los polipéptidos variantes tienen la misma actividad funcional de tránsito de plastidio o mejor cuando se compara con el polipéptido sin alterar. Por lo general, los polipéptidos variantes se crean para acentuar una característica deseable (v.g. aumentar la eficiencia de la inserción dirigida, impartir especificidad de plastidio, obtener la trascripción y/o traducción con mayor eficiencia) o para reducir una característica no deseable (v.g., susceptibilidad a la degradación) de un péptido de tránsito de plastidio o un polipéptido que comprende un péptido de tránsito de plastidio. Los polipéptidos variantes no abarcan ningún péptido de tránsito de plastidio natural.[0025] Se dispone de una gran variedad de protocolos de generación descritos en la técnica, ver v.g., Ling y cols. (1997) Anal. Biochem. 254(2): 157-178; Dale y cols. (1996) Methods Mol. Biol. 57: 369-374; US Pat. Nº 5.605.793, Pat.

U.S. Nº 5.811.238; patente US 5.830.721; Patente US Nº 5.834.252; patente US Nº 5.837.458; WO 95/22625; WO 96/33207, WO 97/20078; WO 97/35966; WO 99/41402; WO 99/41383; WO 99/41369; EP 752008; EP 0932670; WO 99/23107, WO 99/21979; WO 98/31837; WO 98/27230; WO 98/13487; WO 00/09679; WO 98/42832; WO 99/29902; WO 98/41653; WO 98/41622; WO 00/42561; WO 00/42560; WO 01/75767 y WO 98/42727.[0026] El término “polipéptido derivado” se refiere a un polipéptido que está relacionado con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 40, 42, 43 y 46, pero que ha sido alterado por uno o más cambios de radicales de aminoácido reteniendo a pesar de ello al menos una actividad funcional de tránsito de plastidio parcial. En algunos modos de realización, el radical de aminoácido sustituido es un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son muy conocidas dentro de la especialidad (ver v.g., Creighton, Proteins (1984)). Por ejemplo, los seis grupos que se citan a continuación contienen cada uno de ellos aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí; 1) Alanina (A), Serina(S), Treonina (T); 2) ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E), 3); Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V) y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W). En otros modos de realización, el radical de aminoácido sustituido no es una sustitución conservadora. Los polipéptidos derivativos pueden tener menos de un 5%, 3%, 1% de sus radicales alterados en comparación con un polipéptido sin alterar. [0027] Las alteraciones de secuencia pueden introducirse a través de técnicas patrón como por ejemplo las técnicas de evolución molecular dirigida, v.g., métodos de barajado de ADN (ver v.g., Christians y cols., 1999 Nature Biotechnology

17: 259-264, Crameri y cols., 1998, Nature, 391: 288-291; Crameri y cols, 1997, Nature Biotechnology 15: 436-438; Crameri y cols., 1996, Nature Biotechnology 14:315-319; Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; Stemmer y cols. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci, 91: 10747-10751; patentes estadounidenses Nº 5.605.793; 6.117.679; 6.132.970; 5.939.250; 5.965.408, 6.171.820; Publicaciones internacionales Nº WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; y WO 01/75767); mutagénesis dirigida a sitio (ver v.g., Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 488-492; Olliphant y cols., 1986, Gene 44: 177-183); mutagénesis dirigida a oligonucleótido (ver v.g., Reidhaar-Olson y cols., 1988; Science 241:53-57); mutagénesis química (ver v.g., Eckert y cols., 1987, Mutat. res. 178:1-10); PCR tendente a error (ver v.g., Caldwell & Joyce 1992, PCR Methods Applic. 2:28-33); y mutagénesis de casete (ver v.g., Arkin y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 1992, 89: 7871-7815); (ver en general v.g., Arnold. 1993, Curr. Opinion Biotechnol. 4:450-455; Ling y cols., 1997, Anal. Biochem. 254(2): 157-78; Dale y cols., 1996, Methods Mol. Biol. 57:369-74; Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein y cols. 1985, Science 229-1193-1201; Carter, 1986, Biochem. J. 237:1-7; Kramer y cols., 1984, Cell 38:879-887; Wells y cols. 1985, Gene 34:315-323; Minshull y cols. 1999, Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290)[0028] Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos derivativos pueden optimizarse con codón, ya sea totalmente o en parte. Dado que se codifica cualquiera de los aminoácidos (excepto metionina) a través de una serie de codones, la secuencia de la molécula de ácido nucleico puede cambiarse sin cambiar el aminoácido codificado. La optimización con codón es cuando se alteran uno o más codones a nivel del ácido nucleico para coincidir o aproximarse mejor al uso de codón de un huésped en particular. La frecuencia de uso de codón preferible que presenta una célula huésped se puede calcular tomando la media de la frecuencia de un uso de codón preferible en un gran número de genes expresados por la célula huésped. Este análisis puede limitarse a genes que se expresan altamente a través la célula huésped. En la patente EE.UU. Nº 5.824.864, por ejemplo, se proporciona la frecuencia de uso de codón a través de genes altamente expresados presentados por plantas dicotiledóneas y plantas monocotiledóneas. Las personas especializadas en este campo conocerán las tablas y otras referencias que proporcionan información de preferencia para una amplia gama de organismos están disponibles en este campo.[0029] El término “péptido análogo” se refiere a polipéptidos que poseen radicales que han sido modificados, es decir, a través de la unión covalente de cualquier tipo de molécula. Por ejemplo, pero sin limitarse sólo a ellos, un polipéptido análogo puede estar modificado, v.g., por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización a través de grupos protectores/bloqueo conocidos, segmentación proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Un polipéptido análogo puede cambiarse a través de modificaciones químicas utilizando técnicas conocidas entre las personas especializadas en este campo, incluyendo, sin limitarse sólo a ellas, segmentación química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Por otra parte, un análogo de un polipéptido puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. [0030] El término “idéntico” en conexión con las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos se refiere a dos secuencias que tienen radicales idénticos cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia, tal como se describe más adelante.[0031] El término “identidad de porcentaje” en conexión con las moléculas de ácido nucléico y los polipéptidos se refiere al porcentaje de radicales en dos secuencias que son idénticos cuando se comparan y se alinean para conseguir el máximo de correspondencia a lo largo de una ventana de comparación, tal como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por alineación manual y examen visual.[0032] Cuando se utiliza el porcentaje de la identidad de secuencia en relación con proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de radical que no son idénticas suelen diferir por sustituciones de aminoácido conservadoras, estando sustituidos los radicales de aminoácido por otros radicales de aminoácido con propiedades químicas similares (v.g., carga o hidrofilia) y por lo tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, se puede ajustar el porcentaje de identidad de la secuencia corriente arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son muy conocidos entre las personas especializadas en la técnica. Típicamente, esto implica la valoración de una sustitución conservadora, como un desajuste parcial más que un desajuste completo, aumentando así el procentage de identidad de secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se da la puntuación de uno a un aminoácido idéntico y se le da una puntuación de cero a una sustitución no conservadora, a una sustitución conservadora se le da una puntuación comprendida entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras se calcula con arreglo al algoritmo de Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988) v.g., según se implanta en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, EE.UU).[0033] Cuando se utiliza el porcentaje de la identidad de secuencia en referencia a moléculas de ácido nucleico, se puede utilizar cualquiera de los métodos conocidos en la especialidad. Se puede llevar a cabo el alineamiento óptimo de secuencias para comparación, v.g., según el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appli. Math. 2:482 (1981), según el algorimto de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), a través de la búsqueda de un método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), a través de implantaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science, Dr. Madison, WI) o a través de la alineación manual y examen visual.[0034] Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y cols., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa informático para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar la identificación de pares de secuencia de alta puntuación (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia query, que o bien se ajustan o bien satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en la secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de la palabra vecinal (Altschul y cols. anterior). Estos hitos de palabra vecinal inicial actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSPs más largos que los contienen. Los hitos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las secuencias en la medida en la que se pueda aumentar el alineamiento acumulativo. La extensión de los hitos de la palabra en cada dirección se puede detener cuando cae la puntuación de alineamiento acumulativo en la cantidad de X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa va hasta cero o por debajo de cero, como consecuencia de la acumulación de uno o más alineamientos de radicales de puntuación negativa, o se alcanza el extremo de cada una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N = 4 y una comparación de ambas hebras.[0035] El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (ver

v.g. Karlin & Altschul. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:58735787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)) que proporciona una indicación de la probabilidad con la que se dará el ajuste entre dos secuencias de aminoácido o nucleótido por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menos de aproximadamente 0,01 y siendo sobre todo preferible menos de aproximadamente 0,001.[0036] El término “condiciones rígidas” en conexión con la hibridación de ácido nucleico se refiere a las condiciones de hibridación en las que se hibrida una molécula de ácido nucleico con su molécula de ácido nucleico diana, típicamente, en una mezcla compleja de moléculas de ácido nucleico, pero esencialmente no con otros ácidos nucleicos. Las condiciones rígidas dependen de la secuencia y serán diferentes en cada circunstancia diferente. Los ácidos nucleicos más largos se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Se puede encontrar una extensa guía de la hibridación de ácidos nucleicos en la especialidad

(v.g. Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hibridation with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)). Generalmente, se seleccionan condiciones muy rígidas de aproximadamente 5-10ºC por debajo del punto de fusión (Tm) para el ácido nucleico específico a un pH de concentración iónica definida. Las condiciones de rigidez bajas se seleccionan generalmente como aproximadamente 1530ºC por debajo de la Tm. La Tm es la temperatura (a una concentración iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) en la que un 50% de las sondas complementarias a la diana se hibrida con el ácido nucleico diana en equilibrio (como los ácidos nucleicos diana están presentes en exceso, a la Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones de hibridación son típicamente aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1,0 M ión sodio, típicamente aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de ión sodio (u otras sales) a un pH comprendido entre 7,0 y 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (v.g., de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (v.g., más de 50 nucleótidos). Las condiciones rígidas se pueden conseguir también con la adición de agentes desestabilizantes como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces más la hibridación antecedente, preferiblemente 10 veces más la hibridación antecedente. En un modo de realización, las condiciones rígidas incluyen al menos un lavado (normalmente 2) en 0,02 X SSC a una temperatura de al menos aproximadamente 50ºC, normalmente aproximadamente 55ºC,

o a veces 60ºC o 65ºC, durante 20 minutos, o condiciones sustancialmente equivalentes. En un modo de realización específico, se hibrida una molécula de ácido nucleico de la invención específicamente tras al menos un lavado en 0,2 X SSC a 55ºC, durante 20 minutos, con una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera entre SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43, Y SEQ ID NO: 46. En otro modo de realización, las condiciones rígidas incluyen la hibridación 6 X cloruro sódico /citrato sódico (SSC), a aproximadamente 45ºC, tras uno o más lavados en 0,2 X SSC, 0,1% de SDS a 50-65ºC. [0037] La expresión “se hibrida específicamente” se refiere a la unión, duplexación, o hibridación de una molécula solamente con una secuencia de nucleótido en particular en condiciones de hibridación estrictas cuando está presente la secuencia en una mezcla de complejos (v.g., ADN o ARN de biblioteca o celular total).[0038] El término “sustancialmente similar” cuando se utiliza en conexión con la actividad funcional de péptido de tránsito de plastidio se refiere a dos péptidos de tránsito de plastidio que tienen un nivel de actividad que es similar entre sí. En algunos modos de realización, los péptidos de tránsito de plastidio tienen sustancialmente una actividad similar cuando sus actividades, tal como se miden en un ensayo, tienen una desviación normal o inferior a la normal una de otra. En otros modos de realización, los péptidos de tránsito de plastidio tienen sustancialmente una actividad similar cuando una de las actividades del péptido es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% de la actividad del otro péptido tal como se mide en el mismo ensayo.

4. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN [0039] La presente invención proporciona nuevos péptidos de tránsito de plastidio. Se proporcionan asimismo las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la invención. Se abarcan los métodos de uso de los péptidos y moléculas de ácido nucleico de la invención para insertar dirigidamente polipéptidos en plastidios vegetales (v.g., cloroplastos, etioplastos, amiloplastos, cromoplastos, elaioplastos y leucoplastos).

4.1. Polipéptidos de la invención[0040] La presente invención se refiere a nuevos péptidos de tránsito de plastidio de la invención y variantes, derivados y análogos, tal como se definen en el presente documento. En los modos de realización preferibles, los péptidos de tránsito de plastidio variantes tienen una actividad sustancialmente similar o mejorada en comparación con los péptidos de tránsito de plastidio no variantes.

En particular, los péptidos que quedan abarcados en la presente invención pueden ser fragmentos que comprenden al menos un 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de los radicales de aminoácido contiguos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 40, 42, 43 o 46. [0041] Se proporcionan los métodos de producción de los péptidos de la invención y/o polipéptidos que comprenden los péptidos de la invención, v.g., por medios recombinantes (ver la sección 4.6).[0042] Se abarcan asimismo las composiciones que comprenden uno o más péptidos de la invención y/o polipéptidos que comprenden los péptidos de la invención. Las composiciones de la invención pueden comprender además agentes adicionales incluyendo, pero sin limitarse sólo a ellos adyuvantes extensores-adherentes, agentes estabilizantes, diluyentes, agentes que optimizan las propiedades reológicas o la estabilidad de la composición, como por ejemplo tensioactivos, emulsionantes, dispersantes y/o polímeros.

4.2 Polipéptidos de fusión[0043] La presente invención proporciona métodos para insertar dirigidamente un polipéptido en un plastidio vegetal uniendo un péptido de tránsito de plastidio de la invención al polipéptido que se va a insertar dirigidamente. En los modos de realización preferibles, el método comprende la unión recombinante de una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de plastidio de la invención con una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se va a insertar dirigidamente, de manera que la traducción de la molécula de ácido nucleico produce un polipéptido de fusión. Los polipéptidos de fusión también quedan abarcados dentro de la presente invención.[0044] El péptido de tránsito de plastidio se condensa generalmente N-terminalmente con el polipéptido que se va a insertar dirigidamente (v.g., el socio de fusión). En un modo de realización, la proteína de fusión consiste esencialmente en el plastidio de tránsito de péptido y el polipéptido que se va a insertar dirigidamente. En otro modo de realización, la proteína de fusión comprende el plastidio de tránsito de péptido y el polipéptido que se va a insertar dirigidamente. En dichos modos de realización, el péptido de tránsito de plastidio está preferiblemente en el N-término de la proteína de fusión. No obstante, los radicales de aminoácido adicionales pueden estar N-terminales para el péptido de tránsito de plastidio, siempre y cuando la proteína de fusión vaya dirigida al menos parcialmente a un plastidio. En un modo de realización específico, el péptido de tránsito de plastidio está en la mitad N-terminal, la tercera parte N-terminal o la cuarta parte N-terminal de la proteína de fusión.

[0045] La mayor parte o todo el péptido de tránsito de plastidio se segmenta generalmente desde la proteína de fusión tras la inserción en el plastidio. La posición de segmentación puede variar ligeramente según la especie de la planta, en diferentes estadios de desarrollo de la plante, como resultado de las condiciones intracelulares específicas,

o la combinación particular del péptido de tránsito/ socio de fusión utilizada. En un modo de realización, la segmentación de péptido de tránsito de plastidio es homogénea, de manera que el sitio de segmentación es idéntico en una población de proteínas de fusión. En otro modo de realización, el péptido de tránsito de plastidio no es homogéneo, de manera que el sitio de segmentación varía en 1-10 aminoácidos en una población de proteínas de fusión.[0046] El péptido de tránsito de plastidio puede condensarse por recombinación con una segunda proteína de una entre varias formas. Por ejemplo, se puede introducir un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción en la secuencia de nucleótidos del péptido de tránsito en una posición que corresponda a su extremo C-terminal, y se puede introducir por ingeniería el mismo sitio o un sitio compatible en la secuencia de nucleótidos de la proteína que se va a insertar dirigidamente en su extremo N-terminal. Debe tenerse mucho cuidado al diseñar estos sitios para asegurar que las secuencias de codificación del péptido de tránsito y la segunda proteína se mantienen “en bastidor” para permitir la síntesis de la proteína de fusión deseada. En algunos casos, puede ser preferible eliminar el codón de metionina iniciador de la segunda proteína cuando se introduce el nuevo sitio de restricción. La introducción de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción en ambas moléculas de origen y su posterior unión a través de técnicas de ADN recombinante puede tener como resultado la adición de uno o más aminoácidos extra entre el péptido de tránsito y la segunda proteína. Por lo general, esto no afecta a la actividad de inserción dirigida siempre y cuando el sitio de segmentación de péptido de tránsito permanezca accesible y la función de la segunda proteína no se altere por la adición de estos aminoácidos extra en el N-término. Alternativamente, las personas especializadas en este campo pueden crear una fusión precisa entre el péptido de tránsito y la segunda proteína (con o sin su iniciador metionina) utilizando síntesis de gen (Stemmer y cols. Gene 164-49-53) (1995)) o métodos similares.[0047] Por otra parte, la fusión del péptido de tránsito puede incluir intencionadamente aminoácidos corriente abajo del sitio de segmentación. Los aminoácidos en el N-término de la proteína madura pueden afectar a la capacidad del péptido de tránsito de insertar dirigidamente las proteínas en plastidios y/o la eficacia de la segmentación tras la importación de proteína. Esto puede depender de la proteína que se va a insertar dirigidamente. Ver v.g., Comai y cols.

J. Biol. Chem. 263(29):15104-9 (1988).[0048] El socio de fusión (v.g., el polipéptido que se va a insertar dirigidamente) puede ser cualquier péptido para el que se desee la localización de plastidio. Los socios de fusión pueden consistir en proteínas de longitud completa (v.g., tal como se dan en la naturaleza) o pueden consistir en versiones modificadas de dichas proteínas (v.g., porciones

o fragmentos de las mismas, variantes u otras versiones de una proteína que no se dan en la naturaleza). Los socios de fusión pueden derivarse de cualquier organismo, incluyendo, pero sin limitarse sólo a ellos proteínas de bacterias, algas, levaduras, plantas, animales, así como proteínas sintéticas. Por ejemplo, los polipéptidos que se pueden incluir en las proteínas de fusión incluyen, sin limitarse sólo a ellas proteínas de toxina Bt (ver v.g., patentes EE.UU. Nº 6.489.542, 5.281.530, 5.322.932, la serie de solicitudes de patente EE.UU. Nº 11/067.557 registrada el 25 de febrero de 2005; y la publicación PCT WO 92/04453): 5enolpiruvil-3-fosfoshikimato sintasa (EPSP sintasa) (ver v.g.

patentes EE.UU. Nº 4.971.908, 6.225.114), glifosato N-acetil transferasa (GAT) (ver v.g., la publicación de patente EE.UU. Nº 2003/0083480), acetolactato sintasa (ASL) (ver v.g. patente EE.UU. Nº 5.013.659) enzimas que modifican un proceso fisiológico que tiene lugar en un plastidio (v.g., fotosíntesis o ácido graso, aminoácido, aceite, carotenoide, terpenoide, composición /síntesis de almidón) incluyendo, pero sin limitarse sólo a ellas, rubisco, rubisco activasa, sintasa de ácido graso, desaturasa de ácido graso fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa, sintasa de almidón, pirofosforilasa de ADP-glucosa.[0049] Los diferentes péptidos de tránsito de plastidio tienen diferentes grados de eficacia (v.g., una relación más alta entre el socio de fusión insertado dirigidamente y el no insertado) cuando se utilizan en combinación con diferentes socios de fusión. El péptido de tránsito de plastidio en particular para su uso en combinación con un socio de fusión en particular se puede determinar empíricamente utilizando v.g., los ensayos descritos en la sección 4.4.

4.3 Moléculas de ácido nucleico de la invención [0050] La presente invención se refiere también a moléculas de ácido nucleico de la invención tal como se definen aquí.[0051] En un modo de realización, las moléculas de ácido nucleico que entran dentro de la presente invención tienen actividad funcional de tránsito de plastidio (v.g., la capacidad para dirigir una fracción unida a un plastidio) y son un fragmento que comprende al menos un 90%, 95%, 97%, 98%

: o 99% de los radicales de ácido nucleico contiguos de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46. [0052] En otro modo de realización, las moléculas de ácido nucleico que abarca la presente invención tienen actividad

funcional de tránsito de plastidio (v.g., la capacidad para dirigir una fracción unida hacia un plastidio) y comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que es al menos un 95%, 97%, 98%, o 99% idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46. [0053] En otro modo de realización, las moléculas de ácido nucleico que abarca la presente invención tienen actividad funcional de tránsito de plastidio (v.g., la capacidad para dirigir una fracción unida hacia el plastidio) y comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos un 95%, 97%, 98%

: o 99% idéntica a cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46. [0054] Los vectores o casetes de expresión que comprenden moléculas de ácido nucleico de la invención también quedan abarcados (ver sección 4.6). Las células, plantas o semillas que comprenden los vectores de la invención también quedan abarcados (ver sección 4.7).

4.4 Métodos para ensayar la actividad de péptido de tránsitode plastidio[0055] Se puede someter a ensayo la función o actividad de péptido de tránsito de plastidio a través de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo Lee y cols. 2002, Mol. Cells, 14-388-97, Archer and Keegstra, 1993; Plant Mol. Biol. 23:1105-15; Reiss y cols. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:886-90, Rensink y cols., 1998, Plant Physiol. 118:691-9; Kindle and Lawrence, 1998, Plant Physiol. 116:1179-90; Jin y cols., 2003. Plant Mol. Biol. 51:493-507). Tal como se utiliza aquí, actividad o función de péptido de tránsito de plastidio se refiere a la capacidad de un péptido de tránsito de plastidio para dirigir una fracción unida (v.g., polipéptido) a un plastidio. Cuando se une a un péptido de tránsito de plastidio en funcionamiento, se enriquece la fracción unida (v.g., al menos en un 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 100% en comparación con una fracción no unida al péptido de tránsito de plastidio) en uno o más plastidios.[0056] Típicamente, se compara la actividad de un péptido de tránsito de plastidio con un control positivo (v.g., péptido de tránsito conocido por dirigir el socio de fusión en particular) y/o un control negativo (es decir, el polipéptido que carece de un péptido de tránsito de plastidio o que comprende un péptido de tránsito de plastidio no funcional). Los ensayos para la actividad del péptido de tránsito pueden implicar, sin limitarse sólo a ellos, la construcción de fusiones recombinantes entre un péptido de tránsito de plastidio candidato y un polipéptido de socio de fusión, y la expresión de la fusión en una planta o célula vegetal.[0057] En un modo de realización, el polipéptido de fusión es funcional solamente o sustancialmente de forma única en el plastidio; por consiguiente, la localización de plastidio del socio de fusión se determina según la funcionalidad del socio de fusión. En un modo de realización específico, se ensaya la actividad enzimática (v.g. haciendo un producto colorimétrico u otro producto fácilmente detectable) del socio de fusión. Por ejemplo, se puede insertar dirigidamente lisina decarboxilasa en plastidios y hacerse un seguimiento de la acumulación de cadaverina como indicación de la eficiencia de la inserción dirigida de enzima (ver v.g., Herminghaus y cols., 1991, Plant Mol. Biol. 17:475-486 and Herminghaus y cols. 1996, Transgenic Research 5: 193-201). La conversión de L-triptofano en triptamina a través de tritopfan decarboxilasa dirigida a plastidio se puede medir como una indicación de la eficacia de la inserción dirigida a enzima (ver v.g., Fiore y cols., 2002, Plant Physiol, 129:11601169). Se pueden examinar los cambios en la distribución de los pigmentos carotenoides existentes, o la acumulación de carotenoides no nativos como indicación de la inserción dirigida y actividad apropiadas de varias enzimas biosintéticas carotenoides. (ver v.g., Kumagai y cols., 1998, Plant J. 14:305-315).[0058] En otro modo de realización, el polipéptido de fusión es fluorescente; por lo tanto, la localización del plastidio del socio de fusión se determina haciendo un seguimiento de la acumulación de fluorescencia en los plastidios utilizando, v.g., un microscopio de fluorescencia. Una proteína fluorescente preferible es una proteína fluorescente verde y variantes de la misma (ver v.g., Nakrieko y cols., 2004, Eur.

J. Biochem. 271:509-516, Belluci y cols., 2003, Plant Cell Rep. 22:328-337; Chiu y cols. 1996, Curr Biol. 6:325-330).[0059] En otro modo de realización, la localización de plastidio del socio de fusión se determina determinando el tamaño del socio de fusión. Los péptidos de tránsito de plastidio se segmentan típicamente en su totalidad o parcialmente cuando se inserta la fusión en un plastidio. Si el péptido de tránsito de plastidio contiene un sitio de segmentación que es accesible como parte de la proteína de fusión, entonces el péptido de tránsito de plastidio se desprenderá por segmentación y la longitud (y por lo tanto el peso molecular) del polipéptido disminuirá. Si la secuencia del sitio de segmentación no es fácilmente accesible (v.g., si las secuencias circundantes impiden un reconocimiento apropiado del sitio de segmentación o si la proteína de fusión se pliega de forma que la proteasa estrómica no puede tener acceso al sitio de segmentación) entonces la segmentación será ineficaz y puede ocurrir en una o más posiciones alternativas. Aunque los polipéptidos socios de fusión procesados en este caso serán de longitudes ligeramente variadas, seguirán todos ellos descendiendo en longitud y peso molecular desde el polipéptido sin procesar.[0060] En otro modo de realización, se aíslan los plastidios desde el tejido de la planta y después se ensayan en cuanto a la presencia del polipéptido socio de fusión. Se puede utilizar cualquiera de los métodos conocidos en la especialidad para la detección de polipéptidos para el ensayo para determinar la presencia del socio de fusión incluyendo inmunomanchado, immunoprecipitación, ELISA o detección de una característica del socio de fusión (v.g., fluorescencia o actividad enzimática).[0061] Se considera que un péptido de tránsito es funcional si el nivel de producción del producto final, acumulación de proteína fluorescente dentro de los plastidios, o acumulación de proteína madura en los ensayos mencionados excede el del control negativo. Se considera que un péptido de tránsito de plastidio es eficiente si estos parámetros alcanzan o exceden un 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% del nivel alcanzado por el control positivo. En un modo de realización, el péptido de tránsito de plastidio utilizado como control positivo es el péptido de tránsito de gen de subunidad pequeña ribulosa bisfosfato-carboxilasa-oxigenasa (ver v.g., Comai y cols., J. Biol. Chem. 263:15104-15109, 1988, Herminghaus y cols. Plant Mol. Biol. 17:475-486, 1991).

Métodos de uso [0062] Los péptidos de tránsito de plastidio se pueden utilizar para insertar dirigidamente una fracción unida (v.g., polipéptido) en un plastidio vegetal. En un modo de realización, el péptido de tránsito de plastidio dirige la localización a todos los plastidios en todos los tipos de tejido. En otro modo de realización, el péptido de tránsito de plastidio dirige la localización a un subgrupo de plastidios en todos los tipos de tejido. En otro modo de realización, el péptido de tránsito de plastidio dirige la localización a todos los plastidios en un subgrupo de tipos de tejidos. En otro modo de realización, el péptido de tránsito de plastidio dirige la localización a un subgrupo de plastidios en un subgrupo de tipos de tejido.

[0063] En un modo de realización, el polipéptido unido insertado dirigidamente en un plastidio está relacionado con un proceso fisiológico que tiene lugar en el plastidio (incluyendo, pero sin limitarse sólo a ellos, fotosíntesis o composición / biosíntesis de ácido graso, aminoácido, aceite, carotenoide, terpenoide, almidón). Como tales, los polipéptidos recombinantes insertados dirigidamente pueden modular o alterar los procesos fisiológicos que tienen lugar en los plastidios (v.g. alterando los niveles de la enzima y/o proporcionando una enzima alterada con una función ligeramente diferente de la enzima de tipo silvestre). En un modo de realización específico, se altera el socio de fusión de tal manera que hace que la planta sea resistente a uno o más herbicidas. En un modo de realización más específico, el socio de fusión es acetolactato sintasa (ALS) mutado para ser resistente a uno o más herbicidas (ver v.g., la patente EE.UU. Nº 5.013.659).[0064] En otro modo de realización, los polipéptidos recombinantes se expresan y se dirigen a plastidios a través de los métodos de la presente invención para facilitar niveles de expresión superiores. Por ejemplo, algunos polipéptidos son tóxicos cuando se expresan por recombinación en el citoplasma de una célula vegetal y/o algunos polipéptidos son sensibles a proteasas y otros constituyentes del citoplasma que causan degradación. Dado que los plastidios son compartimientos subcelulares, es posible insertar dirigidamente polipéptidos recombinantes en los plastidios para secuestrarlos del citoplasma, permitiendo de este modo niveles de expresión superiores. En un modo de realización específico, el socio de fusión tiene actividad insecticida. En un modo de realización más específico, el socio de fusión es una o más proteínas de toxina Bt (ver v.g. las patentes EE.UU. Nº 6.489.542, 5.281.530, 5.322.932, y la publicación PCT WO 92104453).

[0065] En otro modo de realización, se expresan polipéptidos recombinantes y se dirigen a plastidios a través de los métodos de la presente invención para evitar efectos agronómicos adversos a la planta. Algunos polipéptidos son tóxicos y causan fenotipos de la planta no deseables cuando se expresan por recombinación en el citoplasma de la célula vegetal. Al secuestrar los polipéptidos recombinantes en los plastidios, a menudo se pueden reducir o eliminar estos efectos no deseados. [0066] En otro modo de realización, se expresan o se dirigen a plastidios los polipéptidos recombinantes a través de los métodos de la presente invención para facilitar un aislamiento más fácil del polipéptido. Se pueden aislar los plastidios del tejido de la planta a través de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica y extraer los polipéptidos contenidos en ellos.[0067] En otro modo de realización, se expresan y se dirigen a plastidios polipéptidos recombinantes a través de los métodos de la presente invención para facilitar niveles de expresión superiores. Algunos polipéptidos son sensibles a proteasas y otros constituyentes de citoplasma. Dado que los plastidios son compartimientos subcelulares, es posible insertar dirigidamente polipéptidos recombinantes en otros plastidios para secuestrarlos del citoplasma, permitiendo así niveles de expresión superiores.[0068] En otro modo de realización, se expresan y se dirigen a plastidios polipéptidos recombinantes a través de los métodos de la presente invención para regular su actividad en un sustrato(s) que está localizado en un compartimiento subcelular diferente. Al separar los polipéptidos/ enzimas y el (los) sustrato(s) en diferentes compartimientos subcelulares, se puede controlar la actividad de las enzimas a través de procesos como calentamiento, trituración o extracción mecánica con el resultado del mezclado de las enzimas y el sustrato en combinación.

[0069] En otro modo de realización, se expresa y se dirige a plastidios un polipéptido recombinante que forma un complejo heteromérico a través de los métodos de la presente invención para regular la actividad del complejo de enzima ensamblado. Al separar los componentes del complejo en diferentes compartimientos subcelulares, se puede controlar la actividad del complejo ensamblado a través de procesos como calentamiento, trituración o extracción mecánica lo que tiene como resultado el mezclado de los componentes de polipéptido en combinación.

4.6 Expresión recombinante[0070] Se pueden expresar moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de la invención recombinantemente utilizando técnicas de ADN recombinante y de clonación molecular normales que son conocidas dentro de la especialidad (v.g., Sambroock, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989). Adicionalmente, se pueden utilizar técnicas de ADN recombinante para crear constructos de ácido nucleico adecuados para su uso en la obtención de plantas transgénicas (v.g., Sección 4.7).[0071] Por consiguiente, un aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención, o una variante de la misma. Tal como se utiliza aquí, el término “vector” se refiere a un polinucleótido capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plasmidio”, que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en el que se pueden introducir segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, pudiéndose introducir segmentos de ADN adicionales en el genoma viral.[0072] Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (v.g.,

vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episómicos). Otros vectores (v.g., vectores no episómicos) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, de este modo, se replican junto con el genoma huésped. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante se encuentran frecuentemente en forma de plasmidios (vectores). No obstante, se pretende que la invención incluye, otras formas de vectores de expresión como por ejemplo vectores virales (v.g., retrovirus defectivos de replicación).[0073] Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula huésped. Esto significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en función de las células huésped que se vayan a utilizar para la expresión, que está operativamente asociada con el polinucleótido que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, se pretende “operativamente asociado” signifique que la secuencia de nucleótido de interés está unida a la secuencia(s) reguladora(s) en una manera que permita la expresión de la secuencia de nucleótidos (v.g., en un sistema de trascripción /traducción in vitro o en una célula huésped cuando se introduce el vector en una célula huésped). El término “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (v.g., señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen en la especialidad (v.g. Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 1990, Academic Press, San Diego, CA). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente a determinadas células huésped (v.g., secuencias reguladoras específicas de tejido). Las personas especializadas en este campo podrán apreciar que el diseño del vector de expresión puede depender de factores como la selección de la célula huésped que se vaya a transformar, del nivel de expresión de proteína deseado, del área del organismo en el que se desea la expresión. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células huésped para producir así proteína o péptidos incluyendo proteína o péptidos de fusión, codificadas por moléculas de ácidos nucleicos tal como se describe aquí.[0074] En algunos modos de realización, se pueden introducir ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o potenciadores en la posición apropiada (generalmente corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de la presente invención con el fin de regular hacia arriba o hacia abajo la expresión de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, se pueden alterar promotores endógenos in vivo por mutación, supresión y/o sustitución (ver la patente EE.UU. Nº 5.565.350; la solicitud de patente internacional Nº PCT /US93/03868), o se pueden introducir promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y a la distancia apropiados desde un gen cognado de un polinucleótido de la presente invención con el fin de controlar la expresión del gen. La expresión del gen puede modularse en condiciones adecuadas para el crecimiento de la planta con el fin de alterar la concentración total y/o alterar la composición de los polipéptidos de la presente invención en la célula vegetal. Por consiguiente, la presente invención proporciona composiciones y métodos para la obtención de promotores heterólogos y/o potenciadores unidos operativamente a una forma endógena nativa (es decir no heteróloga) de un polinucleótido de la presente invención.

[0075] Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región que codifica un polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivarse del gen natural, de una variedad de otros genes vegetales, o de T-ADN. La secuencia de extremo 3’ que se añada puede derivarse por ejemplo de genes nopalina sintasa o octopina sintasa, o alternativamente, de otro gen vegetal, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariótico.[0076] Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden designar para la la expresión de un polipéptido de la invención en células procarióticas (v.g., Enterobacteriaceae, como Escherichia, Bacillaceae; Rhizoboceae, como Rhizobium y Rhizogacter; Spirillaceae, como fotobacterium; Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio; Desulfovibrio; Spirillum; Lactobacillaceae, Pseudomonadaceae, como Pseudomonas y Acetobacter, Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae), o células eucarióticas (v.g. células de insectos empleando vectores de expresión de baculovirus, células de levadura, células vegetales, o células de mamífero) (ver Goeddel, suppra. Para una explicación sobre células huésped adecuadas). Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro por ejemplo utilizando secuencias reguladores de promotor T7 y T7 polimerasa.[0077] La expresión de proteínas en procariotas se lleva sobre todo con mayor frecuencia en E. coli con vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas tanto de fusión como proteínas que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, normalmente con el término amino de la proteína recombinante. Dichos vectores de fusión sirven típicamente al menos tres proósitos: 1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y/o 3) ayudar a purificar la proteína recombinante actuando como ligando en purificación de afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de segmentación proteolítica en la unión de la fracción de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la fracción de fusión tras la purificación de la proteína de fusión. Dichas enzimas y sus secuencias de reconocimiento de cognado incluyen Factor xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc. Smith and Johnson, 1988, Gene 67:3140), pMAL; (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia Piscataway, NJ), que funden glutationa Stransferasa (GST), proteína de unión de maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.[0078] En otro modo de realización, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Entre los ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae se incluyen pYepSecl (Baldari y cols.1987, EMBO, J. 6.229.234), pMFa (Kurjan and Herskowith, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz y cols., 1987, Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corp. San Diego, CA), y pPicZ (Invitrogen Corp. San Diego, CA).[0079] Alternativamente, el vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insectos cultivadas (v.g., células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith y cols., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2156) y la serie pVL (Lucklow and Summers, 1989, Virology 170:31-39).[0080] En otro modo de realización mas, se expresa un ácido nucleico de la invención en células vegetales utilizando un vector de expresión de planta, incluyendo, pero sin limitarse sólo a ellos, vectores de expresión de virus de la patata y virus mosaico del tabaco.

[0081] Otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procarióticas como eucarióticas son conocidos en la técnica (ver v.g., los capítulos 16 y 17 de Sambrook y cols., 1990., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold. Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).[0082] Se puede utilizar una serie de promotores en la puesta en práctica de la invención. Los promotores se pueden seleccionar en función de los resultados deseados. Se pueden combinar ácidos nucleicos con promotores constitutivos, específicos de tejido, inducibles u otros promotores para la expresión en el organismo huésped.[0083] El “promotor específico de tejido” puede dirigir la expresión de ácidos nucleicos de la presente invención en un tejido específico, órgano o tipo de célula. Los promotores específicos de tejido pueden ser inducibles. De manera similar, los promotores específicos de tejido pueden promover únicamente la trascripción dentro de un marco de tiempo determinado o en un estadio del desearrollo determinado dentro de dicho tejido. Otros promotores específicos de tejido pueden ser activos a lo largo del ciclo de vida de un tejido en particular. Las personas especializadas en este campo podrán reconocer que un promotor específico de tejido puede conducir la expresión de secuencias unidas operativamente en tejidos distintos al tejido objetivo. Por lo tanto, tal como se utiliza aquí, un promotor específico de tejido es aquel que conduce la expresión preferentemente en el tejido o el tipo de célula objetivo, pero que también puede conducir cierta expresión en otros tejidos también. Se puede utilizar una serie de promotores específicos de tejido en la presente invención. Con el promotor apropiado, se puede insertar dirigidamente en cualquier órgano, ya consista en estructuras, órganos vegetales de brote (v.g., hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/ estructuras florales

(v.g. brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embrión, endosperma y recubrimiento de la semilla) y frutos. Para la expresión de un polinucleótido de la presente invención en órganos vegetativos aéreos de la planta, se pueden utilizar promotores específicos de órganos fotosintéticos, como el promotor RBCS (Khoudi y cols., Gene 197:343, 1997). La expresión específica de raíz de polinucleótidos de la invención se puede conseguir con el control de un promotor específico de raíz, como por ejiemplo, un promotor del gen ANR1 (Zhang and Forde, Science, 279:407, 1998). Otros ejemplos ilustrativos de promotores incluyen gen glutamina sintetasa específico de raíz de la soja (Hirel y cols. 1992, Plant Molecular Biology 20:207-218) y el elemento de control específico de raíz en gen GRP 1.8 del frijol francés (Keller y cols. 1991, The Plant Cell 3:1051-1061).[0084] Un “promotor constitutivo” se define como un promotor que dirigirá la expresión de un gen en todos los tejidos y que es activo en la mayoría de las condiciones del entorno y los estadios de desarrollo o diferenciación de células. Entre los ejemplos de promotores constitutivos se incluyen la región de iniciación de transcripción 35S (CaMV) del virus mosaico de la colifor, el promotor 1’-ó 2’-derivado de TADN de Agrobacterium tumafaciens, y otras regiones de iniciación de la transcripción de diferentes genes vegetales conocidos entre las personas especializadas en este campo. Dichos genes incluyen por ejemplo ACT11 de Arabidopsis (Huang y cols., 1996, Plant Mol. Biol. 33:125-139), Cat3 de Arabidopsis (Nº acceso banco genético Nº U43147, Zhong y cols. 1996, Mol. Gen. Genet. 251:196-203), el gen que codifica la proteína vehículo estearoíl-acilo desaturasa de Brassica napus (número de acceso de banco genético Nº X74782, Solocombe y cols. 1994, Plant Physiol. 104:1167-1176), GPc1 del maíz (Nº de acceso del banco genético Nº X15596, Martínez y cols., 1989, J. Mol. Biol. 208-551-565) y Gpc2 del maíz (Nº de acceso del banco genético Nº U45855, Manjunath y cols., 1997, Plant Mol. Biol. 33:97-112). Se puede utilizar cualquier promotor constitutivo fuerte, como por ejemplo el promotor 35S CaMV, para la expresión de los polinucleótidos de la presente invención en toda la planta.[0085] El término “promotor inducible” se refiere a un promotor que se encuentra bajo un control del entorno o del desarrollo preciso. Entre los ejemplos de condiciones del entorno que pueden llevar a efecto la trascripción mediante promotores inducibles se incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, la presencia de luz o el rociado de sustancias químicas/hormonas.[0086] Entre los promotores constitutivos adecuados para su uso en la célula huésped vegetal se incluyen por ejemplo virus mosaico de la coliflor (CaMV) región de iniciación de la trascripción 35S, el promotor de transcripto de longitud completa del virus mosaico mirabilis (Dey and Maiti, Plant Mol. Biol. 40:771-782, (1999)), el promotor 1’-o 2’ derivado de T-ADN de Agrobacterium tumafaciens, el promotor de transcripto de longitud completa de virus veteado clorótico del cacahuete (Maiti and Shepherd, Biochem. Biophys. Res. Comm. 244:440-444 (1998)), el promotor 34S de virus mosaico de la escrofularia (Maiti y cols., Transgen. Res. 6:143-156 (1997); Sanger y cols. Plant Mol. Biol. 14:433-443 (1990)) y el promotor de transcripto del virus bandeado de las venas de las fresas de longitud completa (publicación de patente EE.UU. Nº 2002/0182593)) así como otras regiones de iniciación de la transcripción de varios genes vegetales conocidos entre las personas especializadas. Dichos genes incluyen por ejemplo ACT11 de Arabidopsis (Huang y cols., Plant Mol. Biol. 33: 125-139 (1996)), Cat3 de Arabidopsis (Nº banco genético U43147, Zhong y cols. Mol. Gen. Genet. 251:196-203 (1996)), la proteína vehículo estearoíl-acilo desaturasa de Brassica napus (Nº banco genético X74782, Solocombe y cols., Plant Physiol. 104-1167-1176 (1994)), GPc1 del maíz (Nº banco genético X 15596, Martínez y cols., J. Mol. Biol. 208:551-565 (1989)), Gpc2 del maíz (Nº banco genético US45855, Manjunath y cols. Plant. Mol. Biol. 33:97112 (1997)), actina del arroz (McElroy cols., 1990, Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen y cols., 1989, Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen y cols., 1992, Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last y cols., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588).[0087] Otro aspecto de la invención se refiere a células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos “célula huésped” y “célula huésped recombinante” se utilizan indistintamente aquí. Debe entenderse que dichos términos no solamente se refieren a una célula en cuestión en particular, sino a la progenie o la progenie potencial de dicha célula. Dado que se pueden producir determinadas modificaciones en las generaciones sucesivas como consecuencia de la mutación o de influencias del entorno, dicha progenie puede no ser idéntica de hecho a la célula de origen, pero con todo se incluye dentro del alcance del término aquí utilizado.[0088] Por consiguiente, la presente invención proporciona una célula huésped que tiene un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de la invención o una variante del mismo. Una célula huésped puede consistir en cualquier célula procariótica (v.g., E. Coli, Bacillus thuringiensis) o eucariótica (v.g., células de insecto, levadura o células vegetales). La invención proporciona asimismo un método para la expresión de un ácido nucleico de la invención obteniendo así un polipéptido codificado que comprende las etapas de i) cultivo de una célula que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención en condiciones que permitan la producción del polipéptido codificado y ii) aislamiento del polipéptido expresado.[0089] Se puede introducir un ADN de vector en células procarióticas o eucarióticas a través de técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal como se utiliza aquí, se pretende que los términos “transformación” y “transfección” se refieran a una serie de técnica reconocidas en la especialidad para introducir moléculas de ácido nucleico extrañas en una célula huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped se pueden encontrar en la especialidad (v.g., Sambrook, y cols. Supra.).

4.7 Producción de plantas transgénicas[0090] Se puede utilizar cualquier método conocido en la especialidad para transformar una planta o célula vegetal con una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Se pueden incorporar las moléculas de ácido nucleico en el ADN de la planta (v.g., ADN genómico o ADN de cloroplasto) o se pueden mantener sin inserción en el ADN de la planta (v.g., a través del uso de cromosomas artificiales). Entre los métodos adecuados para introducir moléculas de ácido nucleico en células vegetales se incluyen microinyección (Crossway y cols., 1986, Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs y cols., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:5602-5606, D’Halluin y cols., 1992, Plant Cell 4:1495-1505); transformación mediada por Agrobacterium (patentes EE.UU. Nº 5.563.055 y 5.981.840, Osjoda y cols., 1996, Nature Biotechnology 14: 745-750; Horsch y cols., 1984, Science 233:496-498, Fraley y cols., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci 80: 4803, and Gene Transfer to Plants, Potrykus ed, Springer-Vergag, Berlin, 1995); transferencia directa de gen (Paszkowski y cols., 1984, EMBO J. 3:2717-2722); aceleración de partícula balística (patente EE.UU. Nº 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes y cols. 1995; “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, in Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips, Springer-Verlag, Berlin; and McCabe y cols., 1988, Biotechnology 6:923-926), transformación mediada por virus (patentes EE.UU. Nº 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785; 5.589.367; y 5.316.931); transformación de polen (De Wet y cols., 1985, en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues ed. Chapman y cols., Longman, Nueva York, pp. 197-209); Lec 1 transformation (Ser. solicitud de patentes EE.UU. Nº 09/435.054; publicación de patente internacional Nº WO 00/28058); transformación mediada de Whiskers (Kaeppler y cols., 1990, Plant Cell Reports 9:415-418; Kaeppler y cols., 1992, Theor. Appl. Genet. 84:560-566), y tecnología de transformación de cloroplasto (Bogorad, 200, Trends in Biotechnology 18: 257-263, Ramesh y cols., 2004, Methods Mol. Biol. 274; 301-7; Hou y cols. 2003, Transgenic Res. 12:111-4; Kindle y cols., 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. 88:1721-5; Bateman y Purton, 2000; Mol. Gen Genet. 263-404-10; Sidorov y cols. 1999, Plant. J. 19:209-216).[0091] La selección de los protocolos de transformación utilizados para generar plantas transgénicas y células vegetales puede variar dependiendo del tipo de planta o células vegetal, es decir, monocotileónea o dicotiledónea, diana de la transformación. Entre los ejemplos de protocolos de transformación particularmente adecuados para un tipo de planta en particular se incluyen los de la patata (Tu y cols., 1998, Plant Molecular Biology 37: 829-838; Chong y cols., 2000; Transgenic Research 9:71-78); soja (Christou y cols., 1988, Plant Physiol. 87:671-674; McCabe y cols., 1988, Bio Technology 6:923-926; Finer and McMullen, 1991, In Vitro Cell Dev. Biol. 27P, 175-182, Singh y cols., 1998, Theor. Appl. Genet. 96:319-324); maíz (Kein y cols., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:4305-4309; Klein y cools., 1988, Biotechnology 6:559-563; Klein y cols., 1988, Plant Physiol.

91: 440-444; Fromm y cols., 1990, Biotechnology 8: 833-839; Tomes y cols., 1995, “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectille Bombardment” in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin)); cereales (Hooykaas-Van Slogteren y cols. 1984, Nature 311: 763-764; patente EE.UU. Nº 5.736.369).[0092] En algunos modos de realización, se utiliza más de un constructo para la transformación en la generación de plantas transgénicas y células vegetales. Se pueden incluir varios constructos en posiciones cis-o trans-. En los modos de realización preferibles, cada constructo tiene un promotor y otras secuencias reguladoras.[0093] Las células vegetales transformadas que se derivan de cualquiera de las técnicas de transformación mencionadas pueden cultivarse para regenerar toda una planta que posea el genotipo transformado y por lo tanto, el fenotipo deseado. Dichas técnicas de regeneración se basan en la manipulación de determinadas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, basado típicamente en un marcador de biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleótido deseadas. La regeneración de la planta desde protoplastos cultivados se describe en la especialidad (v.g., Evans y cols. Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMililan Publishing Company, Nueva York, 1983, and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Pres Boca Raton, 1985). La regeneración también se puede obtener a partir de callo de la planta, explantas, órganos o partes de los mismos, Dichas técnicas de regeneración también se describen en la especialidad (v.g., Klee y cols., 1987, Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486).[0094] Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden utilizar para insertar dirigidamente un polipéptido en un plastidio esencialmente en cualquier planta. Por lo tanto, la invención tiene uso en una amplia gama de plantas, incluyendo especies de los géneros Agrotis, Allium, Ananas, Anacardium, Apium, Arachis, Asparagus, Athamantha, Atropa, Avena, Bambusa, Beta, Brassica, Bromus, Browaalia, Carnelia, Cannabis, Carica, Ceratonia, Cicer, Chenopodium, Chicorium,

Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Coix, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eliusine, Euphorbia, Festuca, Ficus, Fragaria, Geranium, Glycine, Graminae, Gossypium, Helianthus, Hetorocallis, Hevea, Hibiscus, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lathyrus, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lopinus, Lycopersicon, Macadamia, Macrophylla, Malus, Mangifera, Manihot, Mahorana, Medicago, Musa, Narcissus, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Olea, Olyreae, Oryza, Panicum, Panicum, Panieum, Pannisetum, Pennisetum, Petunia, Pelargonium, Persea, Pharoideae, Phaseolus, Phleum, Picea, Poa, Pinus, Pistachia, Pisum, Populus, Pseudotsuga, Pyrus, Prunus, Pseutotsuga, Psidium, Quercus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rhododendron, Rosa, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sequoia, Sinapsis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobromus, Trigonella, Trifolium, Trigonella, Triticum, Tsuga, Tulipa, Vicia, Vitis, Vigna y Zea.

[0095] En los modos de realización específicos, las plantas transgénicas son maíz, tomate, patata, arroz, soja, plantas de algodón, girasol, alfalfa, lechuga o tabaco.[0096] Las plantas transgénicas pueden crecer y polinizarse con la misma cepa transformada o con cepas diferentes. Se pueden cultivar dos o más generaciones de plantas para asegurar que se mantiene establemente y se hereda la

expresión: de la molécula de ácido nucleico deseada,

polipéptido y/o característica: fenotípica. Las personas

especializadas: en este campo reconocerán que una vez

incorporada establemente la molécula de ácido nucleico de la presente invención en las plantas transgénicas y que se confirma como operativa, se puede introducir en otras plantas por cruce sexual. Se puede aplicar cualquiera de una serie de técnicas de cría normales, dependiendo de las especies que se crucen.

4.8.: Determinación de la expresión en plantas transgénicas[0097] Se pueden utilizar cualquiera de los métodos conocidos dentro de la especialidad para determinar el nivel de expresión en una planta de una molécula de ácido nucleico de la invención o polipéptido codificado desde el mismo. Por ejemplo, se puede determinar el nivel de expresión en una planta de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de la invención por inmunoensayo, inmunomanchado, electroforesis de gel cuantitativa, etc.[0098] Adicionalmente, se puede determinar el nivel de expresión en una planta de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de la invención según el grado de alteración del fenotipo de la planta transgénica. En un modo de realización específico, el polipéptido potenciado dirigido a los plastidios es el fenotipo sometido a ensayo. Dichos fenotipos incluyen, sin limitarse sólo a ellos, un cambio en la cantidad o composición de ácidos grasos, aminoácidos, aceites, terpenoides, o almidón en semillas u otros tejido, tolerancia potenciada al herbicida aplicado, mayor resistencia a las plagas (v.g., insecticidas y/o nematodos) y/o aumento del rendimiento las semillas/grano cosechable y/o biomasa de la planta.[0099] Las determinaciones se pueden realizar utilizando plantas enteras, tejidos de ellas, cultivos de células vegetales, o plastidios purificados de las mismas.[0100] El contenido de todos los artículos publicados, libros, manuales de referencia y resúmenes que se han citado aquí se incorporan en el presente documento como referencia en su integridad para describir más completamente el estado de la técnica en el que se encuadra la invención.[0101] Dado que se pueden introducir muchos cambios en la materia descrita sin por ello salirse del marco y espíritu de la presente invención, se pretende que toda la materia en cuestión contenida en esta descripción y/o definida en las reivindicaciones adjuntas sea interpretada como descriptiva e

ilustrativa de la presente invención. Son posibles modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las directrices expuestas.

5.: EJEMPLOS [0102] Se ofrece el siguiente ejemplo para ilustrar, sin limitar por ello la invención que se reivindica.

5.1 Ejemplo 1[0103] Se condensó una biblioteca de secuencias de péptido no naturales recombinantemente con un gen lisina decarboxilasa (LDC) de E. Coli y se expresó temporalmente en células en suspensión BY-2 de Nicotiana tabacum a través de la transformación mediada por Agrobacterium (ver de forma general Newman y cols., Plant Cell 5:701-714, 1993). Al cabo de 4 días, se congelaron-descongelaron rápidamente, las células, se rehidrataron en agua + ácido fórmico al 0,5% durante al menos una hora, se dispersaron en un dispositivo de horquilla replicadora de 96 pocillos, y después se recogieron los sobrenadantes por centrifugado de las mezclas a través de una placa de filtro MAHVN45 de Millipore. Se analizaron las diluciones de los sobrenadantes para determinar la presencia de cadaverina de producto final utilizando espectroscopía de masa LC (EM) del siguiente modo. [0104] Se conectó un instrumento de EM de cuatro polos triple (Quattro LC, Micromass) equipado con interfaz LC/EM de electrospray con una bomba de HPLC (Agilent 1050= que suministraba 40/60 de H2O/MeOH p/0,1% ácido fórmico a una velocidad de flujo constante de 0,3 ml/min. Se utilizó un método de inyección de flujo en el análisis con un autoinyector Twin Pal auto (Leap Technology), inyectando 5 µl de la solución de muestra en el EM a una velocidad de medio minuto por inyección. Se puso en funcionamiento el espectómetro de masa en modo MRM para determinar cuantitativamente la cadaverina (transacción EM/EM 102,8 > 85,8) y D-lisina (transacción EM/EM 146,8 > 83,6). Se determinaron las alturas pico y las áreas pico para los clones de blibioteca de péptido de tránsito y se compararon con un positivo (péptido de tránsito de subunidad pequeña del

5 tabaco) y controles negativos (péptido no tránsito). Para una información adicional del antecedente, ver Herminghaus y cols. Plant Mol. Biol. 17:475-486, 1991, y Herminghaus y cols. Transgenic Research 5: 193-201, 1996).[0105] Aplicando este ensayo, se encontró que las secuencias

10 de péptido descritas en la tabla 1 insertaban eficientemente la proteína lisina decarboxilasa en plastidios cuando se fundieron con el N-término de esta proteína.

Tabla 1: Péptidos de tránsito de plastidio eficientes 15 identificados con un socio de fusión LDC

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(continuación)

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5.2. Ejemplo 2[0106] Se condensó por recombinación una biblioteca de secuencias de péptido no naturales con toxina Cry2 Bt y se expresó transitoriamente en hojas de Nicotiana benthamiana por transformación mediada por Agrobacterium (ver Kapila y cols. Plant Science 122:101-108, 1997). Se extrajo la proteína de tejido de hoja infiltrado y se analizó por SDSPAGE y mancha de Western. Dado que el procesado de proteínas insertadas dirigidamente en un plastidio implica la segmentación de la secuencia de péptido de tránsito desde el resto de la proteína, una disminución del peso molecular de la proteína Cry2 en relación con la fusión péptido-Cry2 de tránsito inicial indica que la secuencia de péptido ha mediado una inserción dirigida apropiada en los plastidios y la segmentación subsiguiente tras la importación. Utilizando el ensayo descrito, se observó que las secuencias de péptido representadas en la tabla 2 insertaban dirigidamente eficientemente la proteína Cry2 en plastidios cuando se condensaba con el N-término de esta proteína.

Tabla 2. Péptidos de tránsito eficientes identificados con unsocio de fusión Cry2

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5.3. Ejemplo 3[0107] Se sometió a ensayo un pequeño subgrupo de los péptidos de tránsito de plastidio sintéticos enumerados en la Tabla 1 para determinar su eficacia con una proteína

5 glifosato acetil transferasa (ver Science 304: 1151-1154, 2004) utilizando el ensayo de infiltración de hoja Nicotiana benthamiana descrito en el ejemplo 2. Utilizando este ensayo, se observó que los péptidos de tránsito de plastidio sCTP-6H1 y sCTP-6F1 insertaban dirigidamente la proteína GAT en

10 platidios con una eficiencia razonable cuando se condensaban con el término N de esta proteína (no se muestran los datos).

LISTADO DE FRECUENCIAS

[0108] 15 <110> PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.

<120> Péptidos de tránsito de plastidio

<130> 2119-4284PC

20 <150> 60/578.535

<151> 2004-06-09

<160> 57

<170> Patentin versión 3.3

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<213> sintético

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<400> 48

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10: <210> 57 <211> 54 <212> PRT <213> sintético

15: <400> 57

20

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Claims

1. Un péptido de tránsito de plastidio aislado seleccionado entre:

(a): un péptido que comprende cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

(b): un péptido que es idéntico al menos en un 95% a la secuencia de aminoácidos de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

(c): un péptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46, o un complemento del mismo después de al menos un lavado en 0,2X SSC a 55ºC durante 20 minutos;

(d): un fragmento que comprende al menos un 90% de los radicales de aminoácido consecutivos de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

2.: Un polipéptido de fusión que comprende el péptido de la reivindicación 1.

3.: Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un péptido de tránsito de plastidio y que se selecciona entre:

(a): una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

(b): una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que es idéntica al menos en un 95% a cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifica

cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

(c): una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un péptido que es idéntico al menos en un 95% a la secuencia de aminoácido de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46; o un complemento de la misma.

(D): Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que se hibrida con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótido de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46, o un complemento de la misma seguido de al menos un lavado en 0,2 X SSC a 55ºC durante 20 minutos; y

(e): un fragmento que comprende al menos un 90% de los nucleótidos consecutivos de una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46, o un complemento de la misma.

4.: Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de fusión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.

5.: Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3.

6.: Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4.

7.: Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 5.

8.: Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6.

9.: Una planta transgénica que comprende un transgen que expresa:

(a): un polipéptido que comprende un péptido según la reivindicación 1;

(b): una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3;

(c): un polipéptido de fusión según la reivindicación 2; o

(d): una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4.

10.: La planta transgénica de la reivindicación 9, seleccionándose la planta entre maíz, soja, tomate, patata, algodón, girasol, alfalfa, lechuga y tabaco.

11.: Un método para insertar dirigidamente un polipéptido en un plastidio en una planta que comprende la introducción en la planta de un vector que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de plastidio unida a una segunda molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de manera que la traducción de la primera y la segunda molécula de ácido nucleico produce una proteína de fusión, seleccionándose dicho péptido de transferencia de plastidio entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

12.: El método de la reivindicación 11, en el que el péptido de tránsito de plastidio es N-terminal para el polipéptido en la proteína de fusión.

13.: El método de la reivindicación 11, en el que el polipéptido se selecciona entre proteínas de toxina Bt, EPSP

sintasa, GAT, ALS y enzimas que modifican un proceso fisiológico que tiene lugar en un plastidio.

14.: El método de la reivindicación 13, en el que el proceso fisiológico es fotosíntesis, síntesis de ácido graso, síntesis de aminoácido, síntesis de aceite, síntesis de carotenoide, síntesis de terpenoide y síntesis de almidón.

15.: El método de la reivindicación 11, en el que el polipéptido se aísla de los plastidios de la planta.

16.: El método para insertar dirigidamente un polipéptido en un plastidio en una planta que comprende la introducción en la planta de un vector que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de plastidio unida a una segunda molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de manera que la traducción de la primera y segunda molécula de ácido nucleico produce una proteína de fusión, seleccionándose dicho péptido de transferencia de plastidio entre los péptidos de la reivindicación 1.

17.: El método de la reivindicación 16, en el que el péptido de tránsito de plastidio está N-terminal del polipéptido en la proteína de fusión.

18.: El método de la reivindicación 16, en el que el polipéptido se selecciona entre proteínas de toxina Bt, EPSP sintasa, GAT, ALS y enzimas que modifican un proceso fisiológico que tiene lugar en un plastidio.