ES2350147T3 - Procedimientos para detectar infección por vih. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para controlar la progresión de la enfermedad en un paciente infectado por VIH que comprende medir el nivel de fosforilación de la cofilina en una muestra procedente de dicho paciente.

Description

ANTECEDENTES

La infección por VIH de células susceptibles, tales como los linfocitos T CD4+, está mediada por la interacción del CD4 y un correceptor de quimiocinas de la superficie celular con la proteína de envoltura gp120. La partícula vírica del VIH se une inicialmente a través de su proteína de envoltura gp120 al receptor CD4 de la célula objetivo. Se produce un cambio conformacional en la gp120 que da como resultado su subsiguiente unión a un receptor de quimiocinas, tal como el receptor CCR5. Véase, por ejemplo, Wyatt y col., Science, 280: 1884-1888 (1998). Las cepas víricas de VIH-1 que se originan subsiguientemente en la infección se unen al receptor de quimiocinas CXCR4.

El VIH no se replica inmediatamente en todas las células infectadas, sino que puede progresar hasta un estado de infección latente, en la que el VIH está inactivo. Tras la activación de una célula latente infectada, por ejemplo mediante la unión a los CD3 y CD28 de la superficie del linfocito T, el virus de VIH "inactivo" puede activarse, iniciando el proceso de replicación vírica. La replicación del VIH da como resultado la producción de partículas infecciosas de VIH, que facilitan la propagación de la infección por todas las células del sujeto.

El conjunto de células infectadas de forma latente en el compartimento de los linfocitos T CD4+ en reposo está considerado como uno de los principales impedimentos para la erradicación del VIH. Cuando están infectados de forma latente, y los linfocitos T en reposo se activan, las partículas víricas liberadas durante el proceso de reactivación pueden propagarse e infectar a los linfocitos T en reposo, así como a los linfocitos T CD4+ activados. Este proceso de reactivación puede facilitar el continuo reabastecimiento del reservorio de los linfocitos T CD4+, contrarrestando los beneficios de un tratamiento antivírico, tal como HAART, y contribuyendo a la persistencia del VIH y al inicio de nuevos ciclos de infección. Véase, por ejemplo, Chun y col., J. Clin. Invest. 115: 3250-3255, 2005.

Consecuentemente, son necesarios procedimientos capaces de detectar

y tratar la infección por VIH durante esta fase latente.

RESUMEN

En un aspecto, se prevé un procedimiento para controlar la progresión de la enfermedad en un paciente infectado por VIH que comprende la medición del nivel de fosforilación de la cofilina en una muestra de un paciente. En una forma de realización, el nivel de fosforilación se mide en el residuo de serina-3 de la cofilina. En otra forma de realización, la medición se realiza detectando un cambio conformacional provocado por la fosforilación en el transporte de electrones regulado por la fosforilación en el residuo de serina-3 de la cofilina.

En otra forma de realización, en la que se mide el nivel de fosforilación del residuo de serina-3 de la cofilina, el nivel de fosforilación puede medirse usando un anticuerpo anti-fosfo-cofilina ser3. Esta medición del nivel de fosforilación puede comprender la proporción entre la cofilina fosforilada y la cofilina, o dicha medición puede comprender la proporción entre la cofilina fosforilada y la cofilina activa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIGURA 1: la gp120 del VIH-1 media en la despolimerización de la actina cortical en linfocitos T CD4 en reposo.

FIGURA 2: la señalización mediante gp120-CXCR4 del VIH desencadena la despolimerización de la actina sensible a la toxina tosferínica.

FIGURA 3: inhibición de la infección latente por VIH-1 por Jas. (A) Efectos del Jas sobre la activación del LFA-1.

FIGURA 4: efectos de la Lat-A sobre la despolimerización de la actina y la replicación del VIH-1 en linfocitos T CD4 en reposo.

FIGURA 5: la señalización mediante gp120-CXCR4 del VIH desencadena la activación de la cofilina sensible a VIH.

FIGURA 6: la inducción de la cofilina activa promueve la infección vírica

latente de los linfocitos T en reposo.

FIGURA 7: fraccionamiento de la actina citoesquelética de los linfocitos T CD4 tratados con gp 120.

FIGURA 8: microscopía confocal de la distribución de CD4 y CXCR4 en linfocitos T CD4 latentes tratados con Jas 120 nM .

FIGURA 9: inhibición de la secreción de IL-2 por la estaurosporina.

FIGURA 10: inhibición de la activación de los linfocitos T y la replicación vírica por la estaurosporina.

FIGURA 11: activación de la cofilina en pacientes seropositivos para VIH.

FIGURA 12: vía de señalización para la activación de la cofilina.

FIGURA 13: cribado de inhibidores del VIH. El inhibidor JNK II inhibe la cinasa C-jun-N-terminal. CA significa caliculina A, un inhibidor de la fosfatasa PP1a y PP2A. SB90 significa SB 202190, un inhibidor de la p38 Map cinasa. SB74 significa SB 202474, un control negativo de SB 90. FK 506 inhibe PP2B/Calcineurina. El control es una célula infectada por VIH sin fármacos.

FIGURA 14: cribado de inhibidores del VIH. La genisteína es un inhibidor de la tirosina cinasa. PD59 es un inhibidor de la MAP cinasa cinasa. FK506 es un inhibidor de la calcineurina. Wortmannin es un inhibidor de PI3K. LY294002 es un inhibidor de PI3K. El control es una célula infectada por VIH sin fármacos.

FIGURA 15: cribado de inhibidores del VIH. PP2 es un inhibidor de la tirosina cinasa de la familia Src. PP3 es un control negativo de PP2. AG1478 es un inhibidor de la EGFR cinasa. AG1296 es una cinasa del receptor PDGF. El control es una célula infectada por VIH sin fármacos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La infección por VIH puede detectarse midiendo eventos de la cascada de transducción de señales, tal como evaluando los niveles de fosforilación de los miembros de la familia del factor despolimerizante de la actina (actinadepolymerizing factor, ADF)/cofilina. Por ejemplo, la infección por VIH de linfocitos T en reposo da como resultado una activación de la cofilina mediante la desfosforilación en la serina-3. Por lo tanto, puede usarse un control del estado desfosforilación de la cofilina para detectar el VIH en muestras de pacientes y para controlar la progresión de la enfermedad.

Todos los términos técnicos de esta descripción son los usados habitualmente en bioquímica, biología molecular e inmunología, respectivamente, y pueden ser comprendidos por los expertos en la materia en el campo de esta invención. Estos términos pueden encontrarse en: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª ed., vol. 1-3, ed. Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel y col., Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience, Nueva York, 1988 (con actualizaciones periódicas); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5ª ed., vol. 1-2, ed. Ausubel y col., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. 1-2, ed. Green y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997; CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 4ª ed. Abbas y col., WB Saunders, 1994.

DEFINICIONES

La cofilina se refiere a una secuencia proteica que controla reversiblemente la polimerización y despolimerización de la actina de una forma sensible al pH. La cofilina tiene la capacidad de unirse a la actina G y F en una proporción de 1:1 entre la cofilina y la actina. Según se usa en este documento, cofilina se refiere a la molécula de cofilina funcionalmente activa que no está fosforilada y que es capaz de alterar el citoesqueleto celular. Algunos ejemplos de polinucleótidos y secuencias polipeptídicas de cofilina se establecen en las ID SEC Nº: 1 y 2, respectivamente.

La "vía del correceptor del VIH" incluye los correceptores del VIH (por ejemplo, CXCR4, CCR5, etc.) que se usan para que el virus entre en las células, y miembros corriente abajo de su vía de señalización. Dichos miembros incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, proteínas G; JAK1, JAK2, JAK3; tirosina cinasas, tales como MEK1 y/o MEK2; Rac1/PAK1/LIMK; cofilina; fosfatasas, tales como PP1, PP2A, bSSK y/o cronofina; etc. Un miembro de la vía de señalización del correceptor también puede describirse como un efector de la estimulación del correceptor, es decir, que es modulado tras la estimulación del correceptor por la proteína de envoltura del VIH.

I. DETECCIÓN DE LA INFECCIÓN POR VIH

La red de filamentos de actina está implicada en diversos procesos celulares, incluyendo el control de la polarización celular, la orientación, el tráfico intracelular, la fusión de membrana y la motilidad. Las proteínas de la familia del factor de despolimerización de la actina (ADF)/cofilina (AC) regulan dinámicamente estas disposiciones citoesqueléticas incrementando el recambio de la actina. La actividad de la cofilina está regulada por la fosforilación en la serina 3, que evita su asociación con la actina, mientras que la desfosforilación por fosfatasas tales como PP1, PP2A o Slingshot (SSH) activa la cofilina y promueve su asociación con la actina incrementando la dinámica de la actina.

En células eucariotas, la función fisiológica más importante de la cofilina es escindir y despolimerizar los filamentos de actina, promoviendo la dinámica de la actina. In vitro, la ADF/cofilina se une directamente a actina G y F y despolimeriza la actina F, modificando el giro de los filamentos de actina o estabilizando una conformación angulada preexistente de las subunidades de actina. In vivo, se ha demostrado que la cofilina es el principal regulador de la actina cortical en levaduras, está entre el mínimo conjunto de proteínas en la cola de actina requerido para la motilidad del patógeno intracelular Listeria.

En el sistema inmune humano, la cofilina ha sido implicada en sostener la activación de los linfocitos T. En particular, la coestimulación activa la cofilina y promueve su asociación directa con la actina F para aumentar la dinámica de la actina. La actividad de la cofilina está regulada por la fosforilación en la serina-3, que evita su asociación con la actina, mientras que la desfosforilación por las fosfatasas activa la cofilina. Debido a que la infección por VIH de los linfocitos T en reposo in vitro da como resultado una activación de la cofilina, el estado de fosforilación de la serina-3 de la cofilina puede usarse como un marcador diagnóstico de la infección por VIH.

Se conocen diversos procedimientos en la técnica para analizar los estados desfosforilación de las proteínas. Por ejemplo, pueden aislarse proteínas para un análisis western usando un anticuerpo de conejo anti-cofilina y un anticuerpo de conejo anti-fosfo-cofilina (ser3). En otro ejemplo, puede determinarse el estado de fosforilación midiendo el cambio conformacional provocado por la fosforilación en el transporte de electrones. El trabajo de otros ha demostrado que el despliegue de la hélice afecta a la tasa del transporte de electrones en un modelo de péptido dicromomórfico, dando como resultado una diferencia de un orden de magnitud en el transporte de electrones. Fox y col., J. Am. Chem. Soc., 119: 5277-5285 (1997). Una diferencia de 10 veces, por ejemplo, en el transporte de electrones, resultante de la adición del grupo fosfato a la superficie del péptido, es probablemente atribuible al cambio conformacional dentro de la estructura secundaria del péptido. Adicionalmente, la fosforilación puede aumentar la distancia entre los átomos dentro de un péptido, y como resultado, puede aumentar la longitud total del péptido. La fosforilación de la cofilina también puede medirse mediante espectrometría de masas.

A continuación se presentan ejemplos específicos de procedimientos para detectar el VIH. Pretenden ilustrar pero no limitar la presente invención. Ejemplo 1: aislamiento de linfocitos T CD4 en reposo a partir de sangre periférica

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) de donantes sanos en el Student Health Center, George Mason University (GMU), Fairfax, VA. Todos los protocolos que implicaban sujetos humanos fueron revisados y aprobados por el GMU IRB. Los linfocitos T CD4 en reposo fueron purificados mediante dos ciclos de selección negativa según se describió previamente en Wu y Marsh, Science 293 (5534), 1503-6 (2001). Las células purificadas se cultivaron en medio RPMI 1604 complementado con suero bovino fetal al 10% inactivado por calor (Invitrogen, Carlsbad, CA), penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 mg/ml). Las células se dejaron reposar hasta el día siguiente antes de la infección o el tratamiento.

Ejemplo 2: preparación del virus e infección de los linfocitos T CD4 en reposo

Se prepararon conjuntos de virus del VIH-1NL4-3 (Adachi y col. J Virol 59 (2), 284-91 (1986)) mediante transfección de células HeLa con ADN provírico clonado según se describe en Wu y Marsh (2001). El sobrenadante se recogió a las 48 horas y se filtró a través de una membrana de nitrocelulosa de 0,45 mm. El título del virus (TCID50) se midió mediante la infección de una línea celular indicadora Rev-CEM que se construyó mediante una integración estable de un vector lentiviral de expresión de GFP dependiente de Rev en CEM-SS. Esta línea celular Rev-CEM no tiene antecedentes de expresión de GPF y proporciona títulos cercanos a los obtenidos usando PBMC. Para la infección de los linfocitos T CD4 en reposo, en primer lugar se valoraron los virus para determinar los niveles mínimos detectables mediante un ELISA de la p24 en los ensayos de replicación descritos a continuación. Salvo que se especifique, para la mayoría de los ensayos de replicación se usaron entre

103,5

y 104,5 unidades TCID50 de VIH-1 para infectar 106 células. Para el procedimiento de infección, se incubaron linfocitos T con el virus durante 2 horas y después se lavaron dos veces con medio para eliminar el virus no unido. Las células infectadas se resuspendieron en medio RPMI 1604 nuevo complementado con suero bovino fetal al 10% inactivado por calor, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 mg/ml) a una densidad de 106 por ml, y se incubaron durante 5 días sin estimulación. Las células se activaron en el día 5 con perlas magnéticas anti-CD3/CD28 a 4 perlas por célula. Para el ensayo de replicación vírica, se recogió el 10% de las células infectadas en los días 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9 tras la infección. Las células se sedimentaron y el sobrenadante se guardó para el ELISA de la p24. Los niveles de la p24 en el sobrenadante se midieron usando el kit de ensayo Coulter VIH-1 para p24 (Beckman Coulter, Inc. Miami, FL). Las placas se leyeron cinéticamente usando un lector de microplacas automático ELx808 (Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, Vt) a 630 nm.

Ejemplo 3: pretratamiento de los linfocitos T CD4 en reposo con inhibidores

Los linfocitos T CD4 en reposo se trataron con toxina tosferínica (Sigma, St. Louis, MO) a una concentración final de 100 ng/ml durante 2 horas, y después se infectaron con VIH-1. Tras la infección, las células se lavaron de 2 a 3 veces para eliminar los virus libres y el inhibidor. Las células se trataron con Jasplakinolide (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 1 a 2 horas o Latrunculina A (Biomol, Plymouth Meeting, PA) durante 5 minutos a varias concentraciones, se lavaron dos veces con medio y después se infectaron con VIH-1. Tras la infección, las células se lavaron dos veces para eliminar los virus libres. Las células se trataron con estaurosporina 200 nM (Biomol, Plymouth Meeting, PA) durante 2 horas y después se infectaron con VIH-1. Tras la infección, las células se lavaron dos veces para eliminar los virus libres y el inhibidor.

Para detectar los efectos de la estaurosporina sobre la activación de la cofilina y la despolimerización de la actina, las células se trataron con estaurosporina 200 nM durante diversos tiempos, y después se sedimentaron y se lisaron en tampón de muestra NuPAGE LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la inmunotransferencia western, o directamente se fijaron y permeabilizaron para la tinción de actina F. Para la activación de los linfocitos T CD4 en reposo con PHA (3 mg/ml) (Sigma, St. Louis, MO) más IL-2 (100U/m 1) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), las células se cultivaron en presencia de estos agentes durante 1 día. Ejemplo 4: pretratamiento de los linfocitos T CD4 en reposo con péptido sintético

Se derivó el péptido sintético S3 (MASGVAVSDGVIKVFN) de los 16 aminoácidos N-terminales de la cofilina humana, y el péptido de control Q104 (WAPESAPLQSQM) se derivó de los residuos de la cofilina humana 104 a 115 con las lisinas 112 y 114 mutadas a glutaminas. Ambos péptidos fueron sintetizados por Celtek Peptides (Nashville, TN) y conjugados con un péptido de penetratina (RQIKIWFQNRRMKWKK) para su administración intracelular. Los linfocitos T CD4 en reposo se trataron con S3 o Q104 durante de 1 a 2 horas y después se infectaron con VIH-1. Tras la infección, las células se lavaron de 2 a 3 veces para eliminar los virus libres y los péptidos.

Ejemplo 5: conjugación de anticuerpos con perlas magnéticas y estimulación de los linfocitos T CD4 en reposo

Los anticuerpos monoclonales de nuevo CD3 (clon UCHT1), CD28 (clon CD28.2), CD4 (clon PRA-T4) y CXCR4 (clon 12G5) humanos eran de BD Pharmingen (BD Biosciences, San Diego, CA). Los anticuerpos anti-CD4, CXCR4 fueron seleccionados por sus epítopos compartidos con la gp120. El anticuerpo CD4, clon RPA-T4, se une al dominio D1 del antígeno CD4 y es capaz de bloquear la unión de la gp120 al CD4 (Dalgleish y col., Nature 312 (5996), 763-7 (1984)), mientras que el anticuerpo anti-CXCR4, clon 12G5, interactúa con los bucles extracelulares 1 y 2 de CXCR4 que se superponen parcialmente con dominios para la función de correceptor de VIH-1. Lu y col., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 94 (12), 6426-31 (1997). También se ha demostrado que el anticuerpo 12G5 bloquea la fusión celular mediada por VIH1 (Hesselgesser y col., J Immunol 160 (2), 877-83 (1998)) y la infección por VIH-2 independiente de CD4. Endres y col., Cell 87: 745-756 (1996). Para la conjugación, se conjugaron 10 µg de anticuerpos con 4 x 108 perlas Dynal (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 30 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos libres se eliminaron con PBS-BSA al 0,5%, y las perlas magnéticas se resuspendieron en 1 ml de PBS-BSA al 0,5%.

Para la estimulación de los linfocitos T CD4 en reposo, las perlas conjugadas con anticuerpos se lavaron dos veces y después se añadieron al cultivo celular y se balancearon durante 5 min. La conjugación de los anticuerpos anti-CD4, CXCR4 con partículas BD IMag marcadas con estreptavidina (BD Biosciences, San Diego, CA) se llevó a cabo usando 25 µl de partículas lavadas y 125 µl de anticuerpos anti-CD4, CXCR4 marcados con biotina (BD Biosciences, San Diego, CA). La mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente con una agitación suave, y se lavó tres veces y se resuspendió en 250 µl de PBS-BSA al 0,1%. Los linfocitos T CD4 en reposo se

trataron con 10 µl de partículas por 106 células.

Ejemplo 6: tinción con FITC-faloidina de la actina F y citometría de flujo

Las células se estimularon con VIH-1 o gp120 IIIB (Microbix Biosystems Inc. Toronto, Ontario). La tinción de la actina F usando faloidina marcada con FITC (Sigma, St. Louis, MO) se llevó a cabo según las recomendaciones del fabricante con modificaciones menores. En resumen, cada tinción se llevó a cabo usando 106 células. Las células se sedimentaron, se fijaron y se permeabilizaron con cytoperm/cytofix (BD biosciences, San Diego, CA) durante 20 min en hielo, seguido por una tinción con 5 µl de faloidina marcada con FITC 0,3 uM durante 30 min a 4ºC. Tras el lavado, las células se resuspendieron en paraformaldehído al 1% y se analizaron mediante FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) Ejemplo 7: tinción de la activación de LAF-1 en linfocitos T CD4 en reposo

Se trató medio millón de linfocitos T CD4 en 500 µl de medio de cultivo con 5 µl de IgG humana (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) para bloquear la tinción no específica. Las células se tiñeron con 10 µl (50 µg/ml) de quimera ICAM-1 Fc humana (R&D System, Minneapolis, MN) durante 20 min a 4ºC. Las células se lavaron y se bloquearon con 5 µl de IgG de ratón (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), seguido por la adición de 10 µl de Fc de ratón anti-humana marcada con FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), y se incubaron durante 20 min a 4ºC. Finalmente las células se lavaron y se resuspendieron en 500 µl de paraformaldehído al 1% para la citometría de flujo. Ejemplo 8: microscopía confocal

Las células teñidas se visualizaron usando un microscopio de barrido por láser Zeiss (Thornwood, NY), LSM 510 META, con un objetivo de aceite 40 NA 1,3 o 60 NA 1,4 Dic Plan-Neofluar. Las muestras se excitaron con dos líneas de láser, 488 nm para GFP y 543 nm para Alexa 594. Las imágenes se registraron simultáneamente en tres canales: canal uno: emisiones fluorescentes desde 505 hasta 530 nm para GFP (verde); canal dos: emisiones desde 580 hasta 650 nm para Alexa 594 (rojo); canal tres. DIC. Las imágenes se procesaron y analizaron mediante el programa informático LSM 510 META.

La Fig. 8 ilustra la microscopía confocal de CD4 y la distribución de CXCR4 en linfocitos T CD4 en reposo tratados con Jas 120 nM. Los linfocitos T CD4 en reposo se trataron con 120 nM de Jas durante 2 horas y después se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti-CD4 humano marcado con FITC y un anticuerpo monoclonal anti-CXCR4 humano marcado con biotina, seguido por estreptomicina marcada con Alexa Fluor-594 (panel derecho). Los linfocitos T CD4 en reposo sin tratar se usaron como control (panel izquierdo). Ejemplo 9: amplificación mediante PCR

Para eliminar la contaminación por ADN de plásmido, el conjunto vírico se trató con benzonasa (Novagen, Madison, WI) (250 U/ml) a 37ºC durante 15 min antes de la infección. Los ADN celulares totales se purificaron usando el kit de aislamiento de ARN total SV según recomienda el fabricante (Promega, Madison, WI). Para la detección de los productos de transcripción inversa víricos tardíos mediante PCR, se usaron el cebador directo VIH/Tat-Rev-5’ (5’ GGTTAGACCAGATCTGAGCCTG 3’) y el cebador inverso LTR-gag2 (5’ TTAATACCGACGCTCTCGCACC 3’). La PCR se llevó a cabo en 1 x de tampón Ambion PCR, 125 µM de dNTP, 50 pmol de cada cebador, 1U de SuperTaq Plus (Ambion Inc. Austin, TX), con 30 ciclos a 94ºC durante 20 segundos, a 68ºC durante 60 segundos. Para la cuantificación relativa, se coamplificaron los pseudogenes de la actina celular usando estándares internos de ARN de actina Quantum (Ambion Inc. Austin, TX), con una proporción de entre 5/5 y 1/9 para el cebador de actina/competidor. Ejemplo 10: inmunotransferencia Western de cofilina y fosfocofilina

En resumen, se lisaron 106 linfocitos T CD4 en tampón de muestra NuPAGE LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguido por la aplicación de ultrasonidos. Las muestras se calentaron a 70ºC durante 10 minutos antes de la carga, y después se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las membranas se lavaron con TBS durante 5 minutos y después se bloquearon 30 minutos a temperatura ambiente con tampón de bloqueo Starting Block (Pierce, Rockford, IL). Los inmunotransferidos se incubaron, bien con un anticuerpo de conejo anti-cofilina (dilución 1:1000) (Cell Signaling, Danvers, MA), o bien con un anticuerpo de conejo anti-fosfocofilina (ser3) (dilución 1:1000) (Cell Signaling, Danvers, MA) diluidos en BSA-TBST al 5%, y se balancearon a temperatura ambiente durante 1 hora. Los inmunotransferidos se lavaron tres veces durante 15 minutos cada una y después se incubaron con anticuerpos de cabra anticonejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (KPL, Inc. Gaithersburg, MD) diluidos en leche desnatada al 2,5%-TBST (1:1000) durante 1 hora. Los inmunotransferidos se lavaron de nuevo tres veces durante 15 minutos cada una y después se desarrollaron con sustrato de sensibilidad máxima SuperSignal west femto (Pierce, Rockford, IL). Las imágenes se capturaron con una cámara CCD (FluorChem 9900 Imaging Systems) (Alpha Innotech, San Leandro, CA) y fueron analizadas y procesadas mediante NIH-Image Version

163.

Ejemplo 11: fraccionamiento de actina G/actina F y ensayos de cosedimentación de actina F/cofilina

Se prepararon fracciones celulares de actina G/actina F usando el kit de ensayo in vivo actina G/actina F (Cytoskeleton, Inc, Denver, Co). En resumen, se trataron 2 millones de linfocitos T CD4 en reposo por muestra con gp120 500 pM entre 5 minutos y 1 hora. Las células se recogieron mediante centrifugación a 2.000 g durante 1 minuto a 37ºC y después se re suspendieron en 1,5 ml de tampón de lisis (PIPES 50 mM pH 6,9, KCl 50 mM, MgC12 5 mM, EGTA 5 mM, glicerol al 5% (v/v), Nonidet P40 al 0,1%, Triton X-100 al 0,1%, Tween 20 al 0,1%, 2-mercaptoetanol al 0,1%, Antifoam C al 0,001 % y metiléster de tosil-arginina 4 uM, leupeptina 15 uM, pepstatina A10 uM, benzamidina 10 mM y ATP 1 uM). Los lisados se homogeneizaron con una pipeta de 200 ml de boca fina y después se colocaron a 37ºC durante 10 minutos. Entonces los lisados se centrifugaron a 420 g durante 5 minutos para eliminar los desechos celulares y el sobrenadante se recogió y se centrifugó a

100.000 g a 37ºC durante 1 hora. Tras la centrifugación, el sobrenadante que contenía la actina G se guardó, y el sedimento que contenía la actina F se resuspendió en disolución despolimerizante de actina F (citocalasina D 10 mM) y se incubó en hielo durante 1 hora con pipeteado ocasional. Se usaron volúmenes iguales del sobrenadante y las fracciones sedimentadas para el SDS PAGE y la inmunotransferencia western de la actina. Para el ensayo de cosedimentación de actina F/cofilina se resuspendió directamente el sedimento de actina F en 1 x de tampón de muestra LDS para el SDS-PAGE y la inmunotransferencia western de la cofilina y la actina.

Ejemplo 12: NEPHGE e inmunotransferencia Western de la cofilina

Se realizó una NEPHGE monodimensional según se describe previamente en Nebl y col. Cell Signal 16 (2), 235-43 (2004)). En resumen, los linfocitos T en reposo se lisaron con tampón TKM (Tris 50 mM pH 7,6, KCL 25 mM, MgCL2 5 mM, Vanadato Na 1mM, NaF 5 mM, 20 ug/ml de leupeptina, 20 ug/ml de aprotinina, ácido okadaico 0,3 uM que contiene NP-40 al 0,5-1%) y se sedimentaron a 20.800 g durante 10 minutos a 4ºC. La fracción postnuclear se recogió y se usó para detección de la cofilina. Las NEPHGE se realizaron con gel plano de isoelectroenfoque al 6% con anfolinas al 5% a un pH de 3 a 10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los geles se desarrollaron durante 1 hora a 100V, 2 horas a 250V y 2 horas a 300V, después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se incubaron con una dilución 1:1000 de un anticuerpo de conejo anti-cofilina (Cell Signaling, Danvers, MA), seguido de una incubación con una dilución 1:1000 de un anticuerpo de cabra anticonejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (KPL, Gaithersburg, MD). Las señales se adquirieron usando sustrato de sensibilidad máxima SuperSignal west femto (Pierce, Rockford, IL) y una cámara CCD (FluoxChem 9900 Imaging Systems) (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Las imágenes se analizaron y se cuantificaron usando NIH-Image Version 163 según sugiere el desarrollador del programa informático. EJEMPLO 13: ensayo in vitro de LIMK cinasa

Se realizaron ensayos de LIMK1 cinasa usando LIMK1 purificado y cofilina recombinante humana marcada con GST (Up-state Biotechnologies, Lake Placid, NY) según las recomendaciones del fabricante con modificaciones menores. En resumen, se incubaron 18 mg de cofilina recombinante en 1x de tampón de reacción de cinasa (MOPS-NaOH 800 nM, pH 7,0, EDTA 200 mM) en presencia o ausencia de estaurosporina (200 nM) o los péptidos S3, Q104.

LIMK1 se diluyó sucesivamente en tampón de dilución (MOPS-NaOH 20 mM pH 7,0, EDTA 1 mM, Brij-35 al 0,01%, glicerol al 5%, 2-ME 0,1%, 1 mg/ml de BSA), y después se añadió a la reacción junto con el tampón de ATP (acetato magnésico 10 mM, ATP 100 mM). La reacción se incubó durante 15 minutos a 30ºC con agitación constante. La reacción se detuvo añadiendo un 25% (V/V) de 4 x tampón de muestra LDS para SDS-PAGE y se calentó durante 10 minutos a 70ºC. La fosforilación de la cofilina se analizó mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia western usando un anticuerpo de conejo anti-fosfo-cofilina (ser3) (Cell Signaling, Danvers, MA) según se describe en el Ejemplo 10.

Ejemplo 14: ELISA de la IL-2

La liberación de IL-2 en el sobrenadante del cultivo celular fue detectada mediante un kit de desarrollo de ELISA para IL-2 humana (PeproTech, Rocky Hill, NJ) según las instrucciones del fabricante. En resumen, cada pocillo de una placa se recubrió con 100 µl de anticuerpo de captura (1 µg/ml) y se incubó hasta el día siguiente a temperatura ambiente, después se lavó y se bloqueó con 300 µl de disolución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Las muestras de las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC, después se lavaron y se incubaron con 100 µl de anticuerpo de detección (0,5 µg/ml) durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron y se incubaron con 100 µl del conjugado avidina-peroxidasa (dilución 1:2000) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por un lavado e incubación con 100 µl de tampón de sustrato tetrametilbencidina (TMB). Las placas se leyeron cinéticamente usando un lector de microplacas automático ELx808 (Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, Vt) a 630 nm. Ejemplo 15: la gp120 induce un reordenamiento citoesquelético

Para determinar la naturaleza del reordenamiento citoesquelético inducido por la gp120, se comparó el cambio en la actina filamentosa (actina F) después del tratamiento de los linfocitos T en reposo con SDF-1, el ligando natural de CXCR4, o con gp120. En las células tratadas con SDF-1 se observó una rápida polimerización de la actina (Fig. 1A) con una característica de actina cortical altamente polarizada (12) (Fig. 1C). Por el contrario, en las células tratadas con gp120, la despolimerización de la actina comenzó a 5 mm y se hizo más pronunciada a entre 1 y 3 horas (Fig. 1B). La despolimerización era coherentemente observada en múltiples donantes y a lo largo de un intervalo de concentraciones de gp120 por debajo de 50 nM.

Según se muestra en la Fig. 1, la gp120 del VIH-1 media en la despolimerización de la actina cortical en linfocitos T CD4 en reposo. La Fig. 1B muestra la despolimerización de la actina por la gp120. Las células se trataron con gp120IIIB (50 nM) y se tiñeron con FITC-faloidina y se analizaron mediante un citómetro de flujo. Se muestra el histograma. La Fig. 1B muestra la despolimerización de la actina por el SDF-1. Las células se trataron con SDF-1 (50 ng/ml) y se tiñeron con FITC-faloidina. La Fig. 1C muestra la microscopía confocal de linfocitos T en reposo tratados con SDF-1 (50 ng/ml), VIH-1 (ng de p24) o gp120 (50 nM), respectivamente, y teñidos con FITC-faloidina. Las imágenes se adquirieron en condiciones idénticas. Las flechas rojas indican la polimerización de la actina localizada inducida por el SDF-1 o la gp120. La Fig. 1D muestra la despolimerización de la actina cortical mediada por el VIH-1. Se seleccionaron y compararon el linfocito T en reposo brillante (control sin tratar) y la célula pequeña (tratada con HI-1). La intensidad relativa de la tinción de la actina F se midió a lo largo de las líneas de flechas rojas (n = 1.000 medidas por línea) y se representaron gráficamente más abajo. La principal diferencia detectada era en la región de la actina cortical. La Fig. 1E muestra la tinción citosólica (no cortical) de la actina F entre células tratadas y no tratadas con VIH-1 no se detectaron diferencias. La intensidad de la tinción de la actina F citosólica en células elegidas aleatoriamente (igual número de infectadas y de no infectadas) se midió a lo largo de las líneas rojas plegadas (n = 1.000 medidas por línea) y se muestran como la media ± DT a la derecha (P > 0,117, n = 20.000).

Estos datos sugieren distintas diferencias entre el SDF-1 y la gp 120 en la estimulación de respuestas celulares, a pesar de sus similitudes compartidas en la unión a CXCR4. K. Balabanian y col., J Immunol 173, 7150 (2004). Mientras que el SDF-1 desencadena respuestas fisiológicas, la gp 120 probablemente media en una señalización aberrante con potenciales consecuencias patógenas. Adicionalmente, al contrario que el SDF-1, la gp120 se une tanto a CXCR4 como a CD4.

Ejemplo 16: la gp120 despolimeriza la actina

Para confirmar adicionalmente la despolimerización de la actina por la gp 120, se realizó un fraccionamiento celular para medir los cambios en la proporción entre la actina F y el monómero de actina globular (actina G) en respuesta a un tratamiento con gp 120. Hubo un aumento significativo en la proporción de actinas G/F tras el tratamiento con gp 120, coherente con los datos de la tinción con FITC-faloidina (Fig. 7). Finalmente, la microscopía confocal reveló que la despolimerización de la actina en células tratadas con VIH se producía principalmente en la región de actina cortical en linfocitos T CD4 en reposo (Fig. 1D). No se observó una diferencia significativa en la tinción de actina F intracelular más allá de la actina cortical entre las células tratadas y sin tratar (Fig. 1 E). Por lo tanto, la gp120 del VIH-1 despolimeriza en gran parte la actina cortical en linfocitos T en reposo. Ejemplo 17: CD4 y CXCR4 en la despolimerización de la actina mediada por la gp120

Para definir los papeles específicos de los CD4 y CXCR4 en la despolimerización de la actina mediada por la gp120, se estimularon linfocitos T en reposo con partículas magnéticas recubiertas con anticuerpos contra ambos receptores. La Fig. 2. ilustra que la señalización por gp120-CXCR4 del VIH desencadena una despolimerización de la actina sensible a la toxina tosferínica (A) Despolimerización de la actina por anticuerpos anti-CD4/CXCR4 conjugados con partículas BD IMag. (B) Despolimerización de la actina por anti-CXCR4 pero no partículas anti-CD4 BD IMag. (C) La despolimerización de la actina mediada por el VIH-1 era dependiente de la señalización sensible al VIH. Las células no se trataron (panel izquierdo) o se trataron con toxina tosferínica (panel derecho), seguido de una infección por VIH-1 (ng de p24 por 106 células), y tinción con FITC-faloidina de la actina F.

La Figura 2A muestra la despolimerización de la actina tras la estimulación por anticuerpos. Cuando las células fueron estimuladas con partículas anti-CD4 o anti-CXCR4, la despolimerización de la actina sólo se produjo con la estimulación de CXCR4, mientras que la estimulación de CD4 aumentó ligeramente la polimerización de la actina (Fig. 2B). Por lo tanto, el CXCR4 es suficiente para mediar en la despolimerización de la actina. Cabe destacar que la capacidad de estos anticuerpos de inducir la polimerización de la actina está correlacionada con su capacidad de incrementar la replicación vírica.

Ejemplo 18: despolimerización de la actina mediada por la Gai

La polimerización de la actina inducida por el SDF-1 está regulada mediante la unión al CXCR4 y la subsiguiente activación de las proteínas G (M.

P. Crump y col., Embo J 16, 6996 (1997); X. Huang y col., Biophys J 84, 171 (2003)), particularmente la Gai sensible a la toxina tosferínica (Y. Sotsios, y col., Journal of Immunology 163, 5954 (1999)). Para determinar si la despolimerización inducida por la gp 120 está de igual modo mediada por la Gai, se trataron linfocitos T en reposo con toxina tosferínica y se encontró que la toxina tosferínica inhibía completamente la despolimerización de la actina inducida por el virus (Fig. 2C), lo que sugiere que la despolimerización también está mediada a través del CXCR4 y la proteína Gai. Mientras que el mismo receptor media tanto en la polimerización como en la despolimerización de la actina, se ha descrito que el SDF-1 atrae y repele a la vez a linfocitos T dependiendo de la dosis. M. C. Poznansky y col., Nat Med 6, 543 (2000). El hecho de que la toxina tosferínica inhiba la replicación vírica, así como la despolimerización de la actina, sugiere que la despolimerización podría ser una de las funciones esenciales de la señalización por gp 120-CXCR4 en el cebado de la infección vírica latente de los linfocitos T en reposo.

Ejemplo 19: efecto del Jas sobre la actividad de los linfocitos T

Para comprobar si la actina cortical en los linfocitos T en reposo es una barrera que necesita ser despolimerizada, se evaluó la capacidad de un agente estabilizador de la actina F, el jasplakinolide (Jas), para interferir en la despolimerización de la actina inducida por la envoltura del VIH. De forma similar a la faloidina, el Jas se une irreversiblemente a la actina F y estabiliza los filamentos de actina. M. R. Bubb, y col., J Biol Chem 275, 5163 (2000). Dado que el citoesqueleto de actina también está implicado en la activación de los linfocitos T, el Jas puede afectar indirectamente a la replicación del VIH afectando a la actividad de los linfocitos T. Por ejemplo, se sabe que el citoesqueleto de actina es la fuerza directriz de la agregación de los receptores y la formación del agregado de activación supramolecular (supramolecular activation cluster, SMAC) durante la activación de los linfocitos T. C. Wulfing y Davis, M. M., Science 282, 2266 (1998). Este proceso implica la activación dependiente de la actina del LFA-1 (Y. van Kooyk, y col., J Biol Chem 274, 26869 (1999); M. L. Dustin y T. A. Springer, Nature 341, 619 (1989)), que es necesaria para la señalización sostenida hasta alcanzar la completa activación de los linfocitos T. C. Wulfing, y col., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 95, 6302 (1998).

Por lo tanto, se determinó el efecto del Jas sobre la actividad de los linfocitos T. La Fig. 3A ilustra la inhibición de la infección latente por VIH-1 del Jas. También se ensayaron los efectos del Jas sobre la activación del LFA-1. Los linfocitos T en reposo tratados o no tratados con Jas fueron activados mediante perlas anti-CD3/CD28 y teñidos con ICAM-1 humana/quimera Fc y analizados mediante citometría de flujo. También se midieron los efectos del Jas sobre la secreción de IL-2. La Fig. 3A muestra los efectos del Jas sobre la infección latente por VIH-1 de linfocitos T en reposo. Las células se trataron con Jas durante 2 horas, se lavaron, se infectaron con VIH-1 durante 5 días y después se activaron con anti-CD3/CD28. La Fig. 3B muestra los efectos del Jas sobre la entrada del virus. Tras la infección, el ADN celular fue amplificado mediante PCR para evaluar el ADN vírico tardío y el pseudogen de la actina P. Los efectos del Jas sobre la infección por VIH-1 en linfocitos T preactivados se muestran en la Fig. 3C. Las células fueron preactivadas con PHA más IL-2, y después tratadas e infectadas como en la Fig. 3A. La Fig. 3D muestra los efectos del Jas sobre la infección por VIH-1 de células transformadas. Se trataron células CEM-SS y se infectaron como en la Fig. 3A. Los efectos del Jas sobre la infección por VIH-1 de linfocitos T en reposo pre-estimulados con perlas anti-CD4/CXCR4 (2 perlas/célula) se muestran en la Fig. 3E. Las células pre-estimuladas se trataron e infectaron como en la Fig. 3A.

La tinción de los linfocitos T en reposo con ICAM-1, el ligando del LFA-1

activo, confirmó que la activación de los linfocitos T inducía a la activación del

LFA-1. Sin embargo, el tratamiento de los linfocitos T con Jas 3 mM inhibió ampliamente la activación del LFA-1. Por lo tanto, se ajustó el Jas a dosis menores. Se encontró que a 120 nM o por debajo, el Jas no tenía una inhibición detectable sobre la activación del LFA-1. Usando la secreción de IL-2 como segundo indicador de la actividad de los linfocitos T, se confirmó que a 120 nM y por debajo, el Jas tenía un efecto significativo sobre la secreción de IL-2, aunque a 600 nM y por encima inhibía la expresión de la IL-2 tras la activación de los linfocitos T. Se ensayaron adicionalmente los efectos del Jas sobre la actividad de los linfocitos T mediante un análisis del ciclo celular. A 3 mM, el Jas detenía las células en fase S, mientras que a 120 nM, no se observaba detención del ciclo celular (datos no mostrados).

A partir de estos resultados se determinó que podría usarse una concentración de Jas por debajo de 120 nM para comprobar sus efectos sobre la replicación del VIH (Fig. 3A). A 120 nM, el Jas conserva las características de unión irreversible a la actina F e inhibe significativamente la subsiguiente unión competitiva de la faloidina (datos no mostrados). Dado su mínimo impacto sobre la actividad de los linfocitos T a dosis menores, se usó el Jas para tratar linfocitos T en reposo durante 2 horas, y después las células se infectaron. Se observó una inhibición completa de la replicación del VIH a 600 y 120 nM, y una inhibición parcial a 24 nM (Fig. 3A). La inhibición del Jas se observó en múltiples donantes (datos no mostrados), y la inhibición no era debida a la inhibición de la gp120 mediada por la agregación de receptores CD4/CXCR4, que se había sugerido que era dependiente de la actina. S. Iyengar, y col., J Virol 72, 5251 (1998). La microscopía confocal no reveló ninguna diferencia significativa en la distribución de CD4/CXCR4 en la superficie entre células tratadas y no tratadas con Jas 120 nM (Fig. 8). La inhibición tampoco era debida a los efectos de la fusión virus-célula, de la que también se había sugerido que era dependiente de la actina. S. E. Pontow, y col., Journal of Virology 78, 7138 (2004). La amplificación cuantitativa mediante PCR del ADN vírico intracelular no detectó ninguna diferencia entre las células tratadas y no tratadas con Jas 120 nM, lo que sugiere que la inhibición no era a nivel de la entrada (Fig. 3B).

Estos resultados muestran que el reordenamiento de la actina mediado por la envoltura del VIH es crítico para un proceso post-entrada, tal como el desprendimiento de la envoltura o la migración intracelular. Al contrario que en los linfocitos T CD4 en reposo, un tratamiento similar con Jas de células CEMSS transformadas o de linfocitos T preactivados no inhibió la replicación vírica del VIH (Fig. 3, C y D). Es probable que a 120 nM, el Jas no inhiba el remodelado de la actina mediado por el ciclo celular. A una dosis mayor (3 mM), sin embargo, cuando el ciclo celular se detuvo, el Jas sí inhibió la replicación del VIH en CEM-SS (datos no mostrados). Estos datos también confirman que a 120 nM, el Jas no afecta a la entrada o a la retrotranscripción del virus (Fig. 3B). También, la pre-estimulación de linfocitos T en reposo con CD4/CXCR4 también abolió completamente la inhibición por Jas 120 nM, lo que sugiere que el citoesqueleto de actina en linfocitos T en reposo puede no ser ya una barrera una vez reorganizado por la pre-estimulación de CD4/CXCR4 (Fig. 3E). Ejemplo 20: efecto de la Lat-A sobre los linfocitos T

Para confirmar adicionalmente que el citoesqueleto de actina cortical constituye una restricción en los linfocitos T en reposo, se investigó otro inhibidor de la actina, la latraculina A (Lat-A), de la que se ha demostrado que induce específicamente la despolimerización de la actina sin afectar a los microtúbulos. I. Spector, y col., Science 219, 493 (1983); M. Coue, y col., FEBS Lett 213, 316 (1987); y K. R. Ayscough y col., J Cell Biol 137, 399 (1997). Al contrario que el Jas, la Lat-A no interactúa directamente con la actina F para promover el desensamblaje de la actina (Ayscough (1997)), sino que más bien se une reversiblemente a la actina G e inhibe su ensamblaje a la actina filamentosa. Spector (1983); Ayscough (1997).

Se especuló con que la inducción artificial de la despolimerización de la actina por la Lat-A podría incrementar la replicación del VIH si la actina citoesquelética sirve como barrera. Para comprobar esto, se valoró la Lat-A a diversas dosis desde 2,5 µM hasta 2,5 nM, y se examinó la despolimerización de la actina en linfocitos T CD4 en reposo.

La Fig. 4 muestra los efectos de la Lat-A sobre la despolimerización de

la actina y la replicación del VIH-1 en linfocitos T CD4 en reposo. La Fig. 4A muestra la despolimerización de la actina dependiente de la dosis por la Lat-A. Las células se trataron con Lat-A durante 5 min, después se tiñeron para la actina F y se analizaron mediante un citómetro de flujo. Las células sin tratar y las tratadas con VIH-1 se usaron como controles. La Fig. 4B muestra la despolimerización de la actina en función del tiempo por la Lat-A. Las células se trataron con Lat-A 25 nM durante diversos tiempos, se tiñeron y se analizaron como en la Fig. 4A. El incremento en la infección latente por VIH-1 por parte de la Lat-A se muestra en la Fig. 4C. Las células se trataron con Lat-A 25 nM durante 5 min, se lavaron, se infectaron con VIH-1 durante 5 días, y después se activaron con perlas anti-CD3/CD28. Como control, las células también se trataron con Lat-A durante 5 minutos después de la infección. La Fig. 4D muestra el incremento en la replicación vírica dependiente de la dosis por parte de la Lat-A. Los linfocitos T CD4 en reposo se trataron con diferentes dosis de Lat-A durante 5 min, y después se infectaron y activaron como en la Fig. 4C.

A dosis altas (de 2,5 µM a 250 nM), la Lat-A indujo una considerable despolimerización de la actina, mientras que a una dosis menor (25 nM) indujo una despolimerización de la actina hasta un grado similar al inducido por el VIH-1 (Fig. 4A). Por lo tanto, los linfocitos T en reposo se pretrataron con Lat-A 25 nM, y después se infectaron con VIH-1. El incremento en la replicación del VIH con Lat-A 25 nM se observó en todos los donantes examinados (Fig. 4C).

Cabe destacar que este incremento sólo se observó en células pretratadas con Lat-A antes de la infección (Fig. 4C). Estos resultados demuestran que la despolimerización artificial antes de la infección incrementa la infección por VIH. También se ensayaron los efectos de la Lat-A a dosis mayores, en los que la despolimerización de la actina inducida por la Lat-A era mucho mayor que la despolimerización fisiológica inducida por el VIH-1 (Fig. 4D). Resulta interesante que, a 250 nM, se produjeron variaciones dependientes del donante desde el incremento hasta la inhibición (datos no mostrados). Sin embargo, a 2,5 µM, la Lat-A inhibió la replicación vírica en todos los donantes (Fig. 4D). Estos resultados muestran que una excesiva y no fisiológica despolimerización puede afectar a la función de los linfocitos T. Por lo tanto, aparte de ser una barrera, el citoesqueleto puede participar activamente en los procesos post-entrada. Por lo tanto, una despolimerización excesiva puede afectar a la función vírica.

Por lo tanto, la estabilización de la actina por parte del Jas inhibe la replicación del VIH, mientras que la despolimerización de la actina por la Lat-A

o las perlas de CD4/CXCR4 incrementa la replicación vírica. En conjunto, estos hallazgos muestran que en linfocitos T CD4 en reposo, el citoesqueleto de actina representa una barrera que necesita ser reorganizada dinámicamente hasta cierto grado y que el VIH-1 aprovecha la vía de señalización por CXCR4 para cumplir este requisito.

Ejemplo 21: actividad de la cofilina en linfocitos T CD4 en reposo y en células infectadas por el VIH-1

Dado que la señalización por envoltura-CXCR4 del VIH-1 media en la despolimerización de la actina, se comparó la actividad de la cofilina en linfocitos T CD4 en reposo y en células infectadas por el VIH-1.

La Fig. 5 muestra que la señalización por gp120-CXCR4 del VIH desencadena la activación sensible a la toxina tosferínica de la cofilina. Las inmunotransferencias Western de las células tratadas con VIH-1 se analizaron para la cofilina P, después se transfirieron y se volvieron analizar para la cofilina total (Fig. 5A). La Fig. 5B muestra la activación de la cofilina por la gp120. La activación de la cofilina por las perlas anti-CD4/CXCR4 (dos perlas/célula) se muestra en la Fig. 5C. La Fig. 5D muestra que la activación de la cofilina por la gp120 promueve su asociación con el citoesqueleto de actina. Se prepararon fracciones de actina F a partir de linfocitos T en reposo tratados con gp120 y se inmunotransfirieron para actina (banda superior) y cofilina (banda inferior). La Fig. 5E muestra la activación sensible a toxina tosferínica de la cofilina por parte del VIH-1. Las células no se trataron (panel izquierdo) o se trataron (panel derecho) con toxina tosferínica, y después se infectaron y analizaron como en la Fig. 5A. La Fig. 5F muestra la activación constitutiva de la cofilina en líneas celulares transformadas. La cofilina P (banda superior) y la cofilina activa (banda inferior) fueron separadas mediante inmunotransferencia NEPHGE-western, y abajo se indicó la proporción relativa entre cofilina P y cofilina activa. Los linfocitos T CD4 en reposo se usaron como control en el extremo derecho. La tinción de la actina F de células CEM-SS infectadas por VIH-1 se muestra en la Fig. 5G. La activación de la cofilina inducida por PHA más IL-2 y el tratamiento con VIH-1 de los linfocitos T CD4 en reposo se muestra en la Fig. 5H.

En los linfocitos T CD4 en reposo, la cofilina era ampliamente inactivada por fosforilación, y tras la infección por VIH, era activada por desfosforilación en unos minutos (Fig. 5A). La activación de la cofilina inducida por el VIH se observó en todos los donantes examinados. La cinética se correlacionaba bien con la despolimerización de la actina inducida por el VIH-1, con una fuerte activación de la cofilina y produciéndose la despolimerización de la actina a entre 1 y 2 horas (Fig. 2C).

Para confirmar que la activación de la cofilina era desencadenada por la unión de la envoltura del VIH, se trataron linfocitos T CD4 en reposo con gp120. De nuevo, la cofilina era activada por la gp120 (Fig. 5B). Adicionalmente, la estimulación con perlas magnéticas anti-CD4/CXCR4 de los linfocitos T CD4 en reposo da como resultado una activación de la cofilina (Fig. 5D). Estos datos demuestran que el acoplamiento de la envoltura del VIH-1 en los receptores CD4/CXCR4 es suficiente para activar la cofilina en linfocitos T en reposo. Para demostrar la asociación de la cofilina activa con la actina F en linfocitos T en reposo estimulados por gp120, se fraccionó la actina F antes y después del tratamiento con gp120. Se observó un bajo nivel de cosedimentación de la cofilina con la actina F en linfocitos T en reposo (Fig. 5D). Tras la estimulación de la gp120, hubo un incremento significativo en la asociación de la cofilina con la actina F, seguida de una disminución en la actina F en 1 hora (Fig. 5D). Estos datos confirman que la activación de la cofilina por parte de la gp120 promueve su asociación con la actina F y la subsiguiente despolimerización de la actina.

Para determinar si la activación de la cofilina procede de la señalización por CXCR4 dependiente de Gai, se pretrataron linfocitos T CD4 en reposo con toxina tosferínica y después se infectaron con VIH-1. Se observó una completa inhibición de la activación de la cofilina por parte de la toxina tosferínica (Fig. 5E). Esto es coherente con la inhibición de la toxina tosferínica de la despolimerización de la actina por el VIH-1. Por lo tanto, la unión de la envoltura del VIH a CXCR4 desencadena una activación sensible a toxina tosferínica de la cofilina y su asociación con la actina F para promover la dinámica de la actina.

Ejemplo 22: activación de la cofilina mediada por la señalización por CXCR4

Al contrario que los linfocitos T CD4 en reposo, los linfocitos T transformados no requieren la señalización por CXCR4 para sustentar la replicación vírica. Sin embargo, la unión de la gp 120 al CXCR4 desencadena cascadas de señalización que dan como resultado la movilización del Ca2+ (B.

J. Doranz y col., J Virol 73, 2752 (abr, 1999) y la activación de moléculas de señalización tales como Pyk2 en líneas celulares. C. B. Davis y col., Journal of Experimental Medicine 186, 1793 (1997). Por lo tanto, se investigó si la señalización por CXCR4 también conduce a la activación de la cofilina en estas células.

Usando una electroforesis en gel con pH en no equilibrio (NEPHGE) (P.

Z. O’Farrell, y col., Cell 12, 1133 (1977)), se midieron los niveles basales de cofilina activa en células transformadas. En gran contraste con los linfocitos T CD4 en reposo, en los que la cofilina está mayormente en su forma inactiva, los linfocitos T transformados portan predominantemente cofilina activa (Fig. 5F). Estos resultados muestran que en células transformadas, la cofilina es activa constitutivamente (Y. Samstag y col., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 91, 4494 (1994)) y que la activación a través de CXCR4 ya no es necesaria para el virus. Coherentemente, el tratamiento de linfocitos T CEMSS transformados con VIH1 no indujo una despolimerización adicional de la actina (Fig. 5G).

Estos hallazgos explican observaciones previas de un innecesario papel de la señalización por CXCR4 en la infección por VIH-1 de líneas celulares transformadas. Por ejemplo, el tratamiento de células U87-MG transfectadas con CXCR4 con toxina tosferínica no afectó a la replicación vírica (B. J. Doranz y col., J Virol 73, 2752 (Abr, 1999)). De forma similar, diversos mutantes de CXCR4 (2333b, 2442, 4442 y CXCR4-QAA) que no eran capaces de unirse al SDF-1 o de mediar en la señalización, todavía sustentaban la replicación del VIH en células U87-MG (Doranz y col., (1999)). Por lo tanto, el requisito de la activación de la cofilina es una característica única observada sólo en linfocitos T en reposo y no en líneas celulares transformadas. También se observó que la estimulación de los linfocitos T CD4 en reposo con PHA más IL-2 activaba la cofilina de una forma similar a la del VIH-1 (Fig. 5H). Estos datos confirmaron que la activación de los linfocitos T puede conducir a una activación de la cofilina, haciendo que la señalización por CXCR4 sea innecesaria para la replicación del VIH.

Ejemplo 23: la activación de la cofilina está directamente implicada en la infección vírica latente

En linfocitos T CD4 en reposo, la cofilina es inhibida por la fosforilación en la serina-3. La inhibición es mantenida a través de la actividad basal de la familia de proteínas cinasas LIM, para los que las proteínas ADF/cofilina son los únicos sustratos conocidos (S. Arber y col., Nature 393, 805 (1998); N. Yang y col., Nature 393, 809 (1998)). Hasta la fecha no se conoce un inhibidor específico de las cinasas LIM.

Para demostrar que la activación de la cofilina está directamente implicada en la infección vírica latente, se usó un péptido sintético para competir con la cofilina por LIMK1 para inhibir la fosforilación de la cofilina. Este péptido, S3, porta los 16 residuos N-terminales que incluyen la serina 3 de la cofilina humana. M. Nishita y col. Molecular & Cellular Biology 22, 774 (2002). Para demostrar la inhibición competitiva de la fosforilación de la cofilina por el S3, se realizó un ensayo de cinasa LIMK1 in vitro usando como sustrato una cofilina-1 recombinante humana marcada con GST.

La Fig. 6 ilustra que la inducción de la cofilina activa promueve la infección vírica latente en linfocitos T en reposo. La Fig. 6A ilustra que el péptido S3 específico de la cofilina activa la cofilina a través de una inhibición competitiva de la fosforilación de la cofilina por LIMK1. Se usó una cofilina recombinante humana como sustrato para el ensayo de la cinasa LIMK1 in vitro. Se usó Q104 como péptido de control. La Fig. 6B ilustra el incremento dependiente de la dosis de la replicación vírica por parte del S3. Las células se trataron con S3 o Q104 durante 2 horas, después se infectaron, se lavaron y se cultivaron durante 5 días y se activaron mediante perlas anti-CD3/CD28. Se muestra la liberación de p24 en el día 8. La Fig. 6C muestra el curso de la replicación vírica en células tratadas e infectadas de forma similar a la de la Fig. 6B. La Fig. 6D ilustra que la estaurosporina induce la activación de la cofilina en linfocitos T en reposo. Las células se trataron con estaurosporina y se inmunotransfirieron para la cofilina P y la cofilina total. La Fig. 6E ilustra que la estaurosporina induce la despolimerización de la actina en linfocitos T en reposo. La estaurosporina induce la activación de la cofilina mediante la inhibición directa de LIMK1, según se muestra en la Figura 6F. El ensayo de la cinasa LIMK1 in vitro se realizó según se describió anteriormente para la Fig. 6A, en presencia o en ausencia de estaurosporina. La Figura 6G muestra el incremento en la replicación vírica por parte de la estaurosporina. Las células en reposo se trataron con estaurosporina durante 2 horas, se infectaron, se lavaron y se incubaron durante 5 días, y después se activaron con perlas antiCD3/CD28. La Figura 6H muestra un modelo de señalización por gp120CXCR4 en la mediación de la activación de la cofilina.

Dado que se observó que el S3 inhibía la fosforilación de la cofilina por LIMK1 (Fig. 6A), se realizaron ensayos para determinar si la activación de la cofilina por el S3 incrementaría la replicación vírica. Se pretrataron linfocitos T CD4 en reposo con S3 o un péptido de control, Q104, y después se infectaron con VIH. S3 incrementaba la replicación vírica (Fig. 6, B y C) y este incremento era coherentemente observado en múltiples donantes (datos no mostrados). Por lo tanto, el aumento en la actividad de la cofilina incrementa directamente la infección latente por VIH-1 en linfocitos T CD4 en reposo. Ejemplo 24: los inhibidores de cinasas afectan a la fosforilación de la cofilina

Dada la importancia de la cofilina para la infección vírica latente, según se demostró anteriormente, se cribaron inhibidores de cinasa para comprobar su capacidad de afectar a la fosforilación de la cofilina en linfocitos T en reposo. Inesperadamente, se ha descubierto que la estaurosporina, un inhibidor general de la serina/treonina cinasa (T. Tamaoki y col., Biochem Biophys Res Commun 135, 397 (1986), tuvo una intensa inhibición sobre la fosforilación de la cofilina. Un breve tratamiento de los linfocitos T CD4 en reposo con estaurosporina 200 nM dio lugar a una desfosforilación gradual y una activación de la cofilina en ausencia de cualquier estimulación (Fig. 6D). Con la activación de la cofilina también se observó una despolimerización de la actina en las células tratadas con estaurosporina (Fig. 6E). Estos resultados concuerdan con los datos que demuestran que la activación de la cofilina da lugar a la despolimerización de la actina en linfocitos T CD4 en reposo (Fig. 5D).

Para determinar si la estaurosporina actúa directamente sobre la fosforilación de la cofilina, se ensayó, según se describió anteriormente, el efecto de la estaurosporina sobre la actividad cinasa de LIMKI in vitro usando cofilina-1 humana purificada como sustrato. A 200 nM, la estaurosporina inhibía directamente la fosforilación de la cofilina por LIMK1 (Fig. 6F). Esta inhibición era mucho más fuerte que la inhibición competitiva por el péptido S3 (Fig. 6A). Por lo tanto, la estaurosporina induce la activación de la cofilina a través de la inhibición directa sobre LIMK1. Basándonos en estos resultados, se ensayó adicionalmente si la estaurosporina facilitaría la replicación vírica. Cabe destacar que el tratamiento de linfocitos CD4 en reposo con estaurosporina 200 nM poco antes de la infección dio lugar a un intenso incremento en la replicación del VIH (Fig. 6G). Este incremento no era debido al incremento en la actividad de los linfocitos T por la estaurosporina.

Cuando los linfocitos T eran tratados de forma similar con estaurosporina, incubados y activados, había una leve inhibición en la secreción de IL-2 por la estaurosporina (Fig. 9-10), coherente con la demostración previa de los amplios efectos inhibidores de la estaurosporina sobre la actividad de los linfocitos T. Según se muestra en la Fig. 10, se infectaron linfocitos T CD4 en reposo con VIH-1, se lavaron y después se cultivaron durante 5 días. En el día 5, las células se activaron mediante perlas anti-CD3/CD28 (4 perlas por célula) en presencia de estaurosporina 200 nM. Se midió la liberación de la p24 vírica. Las células de control fueron infectadas idénticamente con VIH y activadas en ausencia de estaurosporina.

Adicionalmente, cuando se añadió estaurosporina durante la activación de los linfocitos T en el día 5, ésta inhibió la activación de los linfocitos T y abolió completamente la replicación del VIH-1.

Por lo tanto, dado que la estaurosporina puede inhabilitar una gran parte de las vías de señalización críticas para la actividad de los linfocitos T mientras que simultáneamente activa la cofilina e incrementa ampliamente la replicación vírica, la activación de la cofilina es una de las etapas más críticas en la infección latente por VIH en linfocitos T en reposo. Ejemplo 25: activación de la cofilina en pacientes positivos para VIH

Se comparó el estado de fosforilación de la cofilina en linfocitos T en reposo aislados a partir de pacientes con VIH, con el de donantes sanos. Según se muestra en la Fig. 11, la proporción entre la cofilina activa y la cofilina inactiva cambia hacia la forma activa desfosforilada en los linfocitos T en reposo en los pacientes con VIH. Este es el primer informe de disfunción de la cofilina en una inmunodeficiencia mediada por linfocitos T.

Se purificaron linfocitos T CD4 en reposo procedentes de cinco pacientes con VIH bajo tratamiento con HAART y cinco donantes sanos mediante depleción negativa, y después se lisaron y subsiguientemente se inmunotransfirieron para cofilina P (Ser3) o cofilina (Fig. 11A). Según se ilustra en la Fig. 11, la activación de la cofilina se produce en los pacientes positivos para VIH. La proporción relativa entre la cofilina P y la cofilina está representada en la Fig. 11B. Los donantes positivos para VIH tienen unos niveles inferiores estadísticamente significativos de cofilina P/cofilina (p = 0,001), lo que sugiere mayores niveles de cofilina activa. Los resultados fueron confirmados mediante inmunotransferencia NEPHEGE western usando un anticuerpo anti-cofilina. Se muestran las proporciones absolutas entre la cofilina P y la cofilina activa en tres donantes sanos (Fig. 11 C) y en tres donantes infectados por el VIH (Fig. 11D).

Para controlar las leves diferencias en el número de células, se calculó la proporción entre la cofilina P y la cofilina en cada donante tomando medidas de densidad de las bandas de los inmunotransferidos western usando un

programa informático de visualización de imágenes NIH. En los pacientes con

VIH, la proporción entre la cofilina P y la cofilina era significativamente menor, con una media de 0,535 en comparación con 1,142 en donantes sanos (valor de p: 0,001). Estos resultados sugieren que en pacientes VIH hay un cambio hacia la cofilina activada en comparación con los donantes sanos.

La activación a gran escala de la cofilina en pacientes con VIH es notable, dado el hecho de que un informe previo averiguó que sólo hay 0,216,4 linfocitos T infectados latentemente por VIH por 106 linfocitos T en reposo en pacientes bajo tratamiento con HAART. A pesar de esta mínima carga vírica, se observó una activación global de la cofilina en todos los linfocitos T en reposo purificados a partir de pacientes con VIH bajo tratamiento con HAART. Estos hallazgos sugieren que la activación de la cofilina podría no ocurrir simplemente como un resultado de la infección directa por el VIH, sino que es el resultado de mecanismos indirectos, quizás a través de la diseminación vírica o celular de la gp120. De hecho, se ha demostrado previamente que el tratamiento con gp 120 de linfocitos T CD4 en reposo in vitro a concentraciones por debajo de 50 nM dan como resultado la desfosforilación de la cofilina y su subsiguiente activación.

Las implicaciones de la activación de la cofilina en linfocitos T en reposo en pacientes con VIH son numerosas. Actualmente, los únicos marcadores diagnósticos de la progresión de la enfermedad por VIH son las cifras de carga vírica calculadas mediante PCR y el recuento total de linfocitos T CD4. Está ampliamente aceptado que hay un efecto inespecífico de los linfocitos T infectados por VIH-1 sobre otras células no infectadas, provocando apoptosis, anergia, y el deterioro en la migración de los linfocitos T. Sin embargo, actualmente no hay forma de cuantificar este cambio en los linfocitos T. El hecho de que la cofilina juegue un papel crítico en la activación de los linfocitos T, la quimiotaxia y, parezca ser disfuncional en pacientes con VIH, significa que la activación de la cofilina podría servir como un marcador clínico de la progresión de la enfermedad por VIH. Ejemplo 26: inhibición de la infección por VIH-1 de linfocitos T CD4 en reposo.

Tratamos linfocitos T CD4 en reposo con una variedad de inhibidores

durante 2 horas antes de la infección, y después los infectamos con VIH-1 durante 2 horas. Después de la infección, las células se lavaron dos veces para eliminar los inhibidores y los virus libres. Incubamos las células infectadas durante 5 días, y después activamos las células añadiendo perlas magnéticas 5 recubiertas con un anticuerpo anti-CD3/CD28 (4 perlas por célula). Después controlamos la replicación vírica diariamente desde el día 5 hasta el 9. Los resultados están representados en las Figuras 13-15, que muestran la replicación vírica en el día 8. Los ejes Y muestran la replicación vírica evaluada por la liberación de la proteína p24 vírica en el medio (pg/ml en concentración

10 de p24).

Tabla 2

ID

Fuente Secuencia

SEC

Nº

1

ARNm de

Homo sapiens

de cofilina, cds

completos; GenBank gi: 219544

2

Secuencia de la proteína

cofilina de Homo sapiens

GenBank gi: 219545

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para controlar la progresión de la enfermedad en un

   paciente infectado por VIH que comprende medir el nivel de fosforilación de la 5 cofilina en una muestra procedente de dicho paciente.
2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de fosforilación se mide en el residuo serina-3 de la cofilina.

   10 3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha medición se realiza detectando un cambio conformacional provocado por la fosforilación sobre el transporte de electrones regulado por la fosforilación en el residuo de serina-3 de la cofilina.

   15 4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el nivel de fosforilación se mide usando un anticuerpo anti-fosfo-ser3 de cofilina.

3. 5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha medición

   comprende la proporción entre cofilina fosforilada y cofilina. 20
4. 6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha medición comprende la proporción entre cofilina fosforilada y cofilina activa.