ES2348923T3 - Medios y métodos para mejorar el desarrollo y maduración de huevos y/o esperma en peces utilizando hormonas producidas por células transplantadas. - Google Patents
Medios y métodos para mejorar el desarrollo y maduración de huevos y/o esperma en peces utilizando hormonas producidas por células transplantadas. Download PDFInfo
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Abstract
Método para mejorar el desarrollo y/o maduración de huevos y/o esperma en peces empleando la administración de una hormona de fertilidad que comprende proveer al pez células que produzcan dicha hormona de fertilidad para utilizarse en la creación de progenie o la producción de huevos.
Description
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al sector del cultivo
de peces. La presente invención se refiere en particular al sector
del mejoramiento conducido por hormonas del desarrollo y maduración
de huevos y/o esperma en peces.
Muchas especies de peces maduran en respuesta a
factores ambientales. Estos factores tales como ciclo luminoso,
temperatura, estación, presión, y reservas de energía, son
detectados por el animal y controlan la acción inhibidora de
centros hipotalámicos en la pituitaria. De esta forma, la
producción de gonadotropinas por medio de la pituitaria normalmente
se reduce y se activa solo bajo ciertas condiciones ambientales.
Cuando se activa, la pituitaria libera gonadotropinas que estimulan
el crecimiento y desarrollo de las gónadas macho y hembra.
Para la pesca es importante que la maduración sea
estimulada típicamente de manera artificial mediante inyecciones
regulares con las mismas hormonas, que consisten con frecuencia en
extractos crudos de pituitaria. Las inyecciones regulares anulan
hasta cierto grado los activadores ambientales para el desarrollo
de gónadas tanto macho como hembra. Sin embargo, la práctica actual
de mejoramiento artificial del desarrollo y/o maduración de huevos
y/o esperma utilizando hormonas no es completamente satisfactoria.
Por ejemplo, en las anguilas, que son aún inmaduras cuando
comienzan su migración para desovar, las hembras tienen que ser
tratadas semanalmente durante 3-5 meses antes de que los oocitos
maduren suficientemente para la ovulación. Este es un procedimiento
que consume tiempo y estresante para el pez.
La presente invención da a conocer un método para
mejorar el desarrollo y/o maduración de huevos y/o esperma en peces
utilizando la administración de hormonas de fertilidad que
comprende proporcionar a dichos peces células que producen dicha
hormona de fertilidad para la utilización en la creación de
progenie o la producción de huevos. Las células que son
trasplantadas en el pez liberan una o más hormonas, reduciendo al
menos de esta manera la necesidad de inyecciones regulares con la
propia hormona u hormonas. Las células pueden ser trasplantadas en
varias formas siempre y cuando la hormona u hormonas secretadas se
liberen en el sistema de circulación y alcancen a todos los tejidos
y en particular los órganos sexuales en cantidad suficiente. Las
células pueden trasplantarse en cualquier parte en el cuerpo. Los
implantes, que consisten en células productoras de una o varias
hormonas, se utilizan típicamente para evitar la glándula
pituitaria con el fin de producir hormonas de fertilidad, tal como
la hormona luteinizante (HL), hormona estimulante del folículo
(HEF) o gonadotropina coriónica (GC). Los implantes con células
productoras de hormonas se insertan preferentemente en sitios que
tienen acceso al torrente sanguíneo. Los métodos preferentes de
inserción son inyección intraperitoneal y subcutánea. Los sitios
con acceso al torrente sanguíneo son muy adecuados para células que
producen hormonas secundarias tales como HL, HEF, GC. El trasplante
de células se utiliza con frecuencia en mamíferos y se ha obtenido
bastante experiencia con respecto a métodos para trasplantar y
mantener células durante al menos cierto tiempo. Considerando que
los peces se matan típicamente después de desovar o de la cosecha
de los huevos o esperma madurados, no hay una gran necesidad de
controlar las células trasplantadas. Lo importante es que las
células estén presentes en número suficiente para permitir el
completo desarrollo y la maduración de las gónadas. Por lo tanto,
el número de células no puede ser menor que lo requerido para el
desarrollo y maduración y las células no pueden ser (o volverse)
tan numerosas que impidan el desarrollo y maduración de las gónadas
o la salud general del animal. El nivel de producción de la hormona
mediante las células no es muy crítico. El número de células
inyectadas dependerá de la cantidad total requerida para la
maduración. La producción de hormona se cuantificará por medio de
un bioensayo. La liberación de hormona de las células inyectadas
necesita ser suficientemente alta para estimular el desarrollo y/o
maduración de huevos y/o esperma. El límite superior para la
expresión de la hormona no es crítico, dado que la sobreexpresión
de una hormona de fertilidad no es tóxica en sí misma y no afecta
negativamente la estimulación de la maduración y/o desarrollo de
huevos y/o esperma. En el mundo de los mamíferos, se han
desarrollado varios tipos de adyuvantes de injerto para permitir la
permanencia prolongada de las células o para permitir la
diferenciación de las células. Estos adyuvantes pueden desde luego
utilizarse también en la presente invención. Tales adyuvantes
incluyen, pero no se limitan a, colágeno o matrices sintéticas de
injerto y unión de células.
Como las células, en muchos casos, no necesitan estar
presentes durante un tiempo muy largo, es posible trasplantar
células de peces de muchas especies diferentes en un pez receptor.
Si la diferencia evolutiva entre las células trasplantadas y el
receptor es muy grande, es probable que el pez receptor desarrolle
una respuesta inmune hacia las células trasplantadas (el injerto).
Sin embargo, como las células con frecuencia sólo necesitan estar
presentes durante una cantidad de tiempo limitada, dicha respuesta
inmune típicamente puede tolerarse. Para aumentar la fortaleza y
predictibilidad del procedimiento es preferente que el injerto se
derive del mismo género o familia que las especies de peces
receptores. Preferentemente, los dos son de la misma especie. Como
- los
- peces son típicamente poblaciones exogámicas existen
- diferencias
- inmunológicas entre peces de la misma especie. Esto
- normalmente
- no es un problema como se muestra en uno de los
presentes ejemplos de experimentos con anguilas, sin embargo, es
posible hacer coincidir adicionalmente el injerto y el receptor
para marcadores inmunológicos comunes. Los marcadores típicos son
antígenos de histocompatibilidad mayor y menor. El injerto de las
células trasplantadas puede facilitarse además proporcionando al
pez receptor inmunosupresores, tales como ciclosporina.
El trasplante de las células productoras de hormonas de
la presente invención puede utilizarse para mejorar la maduración
de los huevos y/o esperma, la fertilidad de los huevos y/o esperma,
la inseminación de huevos, la calidad de los embriones resultantes,
la supervivencia de huevos fertilizados y no fertilizados y la
supervivencia de embriones. Todas estas mejoras dan lugar a un
desarrollo y maduración mejorados de huevos y/o esperma en peces.
El término desarrollo y maduración de huevos y/o esperma en peces
no se limita por lo tanto al proceso natural de desovado sino que
también se refiere a métodos artificiales para la inseminación de
huevos. Por lo tanto, se relaciona con la cosecha de huevos y/o
esperma no fertilizados de peces tratados con un método de la
presente invención. Los huevos no fertilizados también pueden
utilizarse para otros propósitos diferentes a la creación de
progenie. Un ejemplo no limitante de ello en la producción de
huevos para consumo humano, tal como caviar.
El desarrollo y maduración de huevos y/o esperma en
peces puede estimularse de varias formas. En una realización de la
presente invención el desarrollo y maduración de huevos y/o esperma
en peces se dice que se estimula cuando se incrementa el número
absoluto o la calidad de los huevos, esperma o embriones que
resultan de los huevos fertilizados.
La reproducción es un proceso biológico altamente
regulado. Diferentes aspectos de la reproducción están regulados
por diferentes hormonas. Sin embargo, varias hormonas pueden
producir más o menos efectos similares cuando son expresadas por
una célula que es trasplantada en un pez. Estas hormonas incluyen:
HEF, HL, GC (gonadotropina coriónica), o una combinación de las
mismas. Las hormonas mencionadas anteriormente también se conocen
bajo nombres diferentes. Como la secuencia de aminoácidos
subyacente es la misma, las hormonas denominadas por medio de
sinónimos también están dentro del alcance de la presente
invención. Por ejemplo, la HEF también se denomina hormona
estimulante del folículo, folitropina u hormona gametocinética. La
HL también se denomina hormona luteinizante, luteotropina u hormona
estimulante de células intersticiales (HECI). La GC (gonadotropina
coriónica) también se denomina hormona gonadotrópica coriónica,
coriogonadotropina o gonadotropina coriónica.
En una realización preferente de la presente invención
dicha hormona es una hormona directamente involucrada en el
desarrollo y maduración de huevos. Tales hormonas de fertilidad son
producidas típicamente por la pituitaria, o los órganos sexuales.
En una realización preferente la hormona de fertilidad comprende
hormona luteinizante (HL), hormona estimulante del folículo (HEF),
o gonadotropina coriónica (GC) o una parte funcional, derivado y/o
análogo de tal hormona. Estas hormonas son estimuladores muy
potentes del desarrollo y maduración de huevos y/o esperma en
peces. Estas hormonas están muy conservadas en su naturaleza y
difícilmente tienen una barrera de especies. Por ejemplo, la
presencia de hormonas de fertilidad humanas en la orina puede
detectarse incubándolas con huevos de rana. De forma similar, la
gonadotropina coriónica humana (GCh) también funciona en anguilas y
carpas y extractos de pituitaria de salmón funcionan en muchas
especies de peces diferentes, tales como anguila, pargo y trucha.
Es posible que el receptor desarrolle una respuesta
inmune contra una hormona heteróloga. A pesar de que esta respuesta
inmune es típicamente demasiado tardía para afectar la estimulación
de la maduración y/o el desarrollo de huevos y/o esperma, es
preferente que la hormona sea una hormona de pez o una parte
funcional, derivado y/o análogo de la misma. Esto limita la
divergencia entre la hormona proporcionada y la endógena, limitando
con ello al menos en parte el desarrollo de una respuesta inmune
contra la hormona proporcionada en el receptor. Preferentemente, la
hormona se deriva de una especie que pertenece al mismo género que
el receptor. De esta forma la posibilidad de que se desarrolle una
respuesta inmune se reduce aún más. En una realización
particularmente preferente una hormona proporcionada es
inmunológicamente idéntica al equivalente de la misma en el
receptor. Esto evita completamente el desarrollo de cualquier
respuesta inmune perjudicial contra la hormona proporcionada.
Las células pueden expresar ya sea la hormona deseada
sin manipulación o pueden manipularse para expresar la hormona
deseada. Cuando las células no expresan aún la hormona o no
expresan suficiente hormona, se les puede proporcionar información
genética para expresar la hormona.
En una realización preferente las células están
provistas con la información genética para expresar la hormona de
fertilidad. Esto puede hacerse proporcionando las células con
casetes de expresión que comprenden secuencias de codificación para
las hormonas. Sin embargo, también es posible activar los genes
endógenos insertando una secuencia reguladora activa cerca de la
secuencia o secuencias de codificación para las hormonas
respectivas. Esto puede hacerse, por ejemplo, a través de
recombinación homóloga.
Las proteínas HL y HEF pertenecen a una familia de
proteínas relacionadas. Ambas comparten las características de que
son funcionales como heterodímeros que consisten en una subunidad α común y una subunidad β diferente. En el caso de hormonas que consisten en más de una cadena de proteína es posible que las células no expresen todas las cadenas necesarias para generar la hormona. En estos casos solo se requieren casetes de expresión para la cadena o cadenas que faltan. Por lo tanto, si una o más de las subunidades, pero no todas, de la hormona son expresadas adecuadamente en las células sólo se necesita expresar la subunidad
o subunidades restantes en la célula. Si no se expresa ninguna de
las subunidades, se tienen que manipular las células de tal forma
que las subunidades se expresen en niveles adecuados. En una
realización preferente, las células están provistas con casetes de
expresión para las subunidades de la hormona. En una realización
preferente las células están provistas con casetes de expresión
para las tres cadenas de proteína que componen la HL y HEF (es decir, para la subunidad α común y las subunidades β únicas para cada una de las hormonas), o en líneas celulares separadas se expresa la combinación de βHL + α y βHEF + α. Por lo tanto, en una realización preferente dichas células son modificadas genéticamente
para expresar dichas hormona u hormonas. Preferentemente, las
células se proveen con uno o más genes que codifican dichas hormona
u hormonas.
Las células pueden ser células primarias o líneas
celulares que son cultivadas in vitro durante un extenso periodo.
En una realización preferente, las células se derivan de una
población clonal de células. De esta manera, las células pueden
someterse a un control de calidad detallado antes de su
utilización. Esto también permite la generación de bancos de
células que tienen la misma propiedad. Además, una población
clonal, puede someterse a manipulaciones adicionales. Por ejemplo,
si se desea reducir las respuestas inmunes en el receptor, es
posible anular la expresión de antígenos de histocompatibilidad
mayor y/o menor. Por lo tanto, en una realización preferente, las
células han sido seleccionadas para una inmunogenicidad reducida en
el receptor. Una célula para su utilización en un método o
utilización de la presente invención puede ser una célula primaria
o una célula cultivada. Preferentemente, dicha célula es una célula
cultivada, más preferentemente, una célula cultivada inmortalizada.
Las células cultivadas son típicamente líneas celulares. Las líneas
celulares pueden propagarse durante al menos 5 pasadas sin cambio
substancial en el fenotipo de dicha célula. Las líneas celulares
inmortalizadas pueden pasarse al menos 50 veces sin experimentar
dicho cambio fenotípico. Las células inmortalizadas pueden
obtenerse de células primarias de varias maneras. Preferentemente,
dicha célula inmortalizada se obtiene de un cultivo de células
primarias que ha experimentado la crisis que es típicamente para
células primarias en cultivo. En otra realización preferente dicha
célula se ha inmortalizado mediante la introducción de uno o más
genes en una célula primaria.
Un método de la presente invención se puede utilizar
para todos los tipos de peces. Los peces preferentes son anguila,
lobina, pargo, halibut, salmón, trucha, bacalao, carpa, bagre, y
esturión. Sin embargo, la presente invención es particularmente
adecuada para peces diádromos y preferentemente semélparos. Estos
peces esperan largo tiempo antes de desovar y típicamente no todos
responden de forma similar a señales externas. Con un método de la
presente invención es posible estimular el desarrollo y maduración
de los peces al menos en parte independientemente del estímulo
ambiental. Esto introduce una gran cantidad de predictibilidad
hacia el punto de inicio para el cultivo de peces. En peces
diádromos es además posible sincronizar el desarrollo y maduración
de los huevos de tal manera que el trabajo se puede programar mejor
en el proceso de producción.
La presente invención da a conocer adicionalmente una
célula de pez aislada y/o recombinante que produce una hormona de
fertilidad. En una realización preferente la célula se modifica
genéticamente para expresar dicha hormona de fertilidad. La
presente invención da a conocer adicionalmente una célula de pez
provista con la capacidad de expresar una hormona de fertilidad.
Preferentemente, la célula de pez está provista con una secuencia
de ácido nucleico recombinante y/o aislada que codifica dicha
hormona de fertilidad. Si la hormona consiste en una o más
subunidades, la célula de pez está provista preferentemente con una
secuencia de ácido nucleico aislada y/o recombinante que codifica
al menos una subunidad de esa hormona. Preferentemente, la célula
de pez está provista con una secuencia de ácido nucleico que
codifica todas las subunidades de dicha hormona. Preferentemente,
la célula es una célula de un pez comestible. En una realización
preferente dicha célula se origina de anguila, lobina, pargo,
halibut, salmón, trucha, bacalao, carpa, bagre, o esturión.
Preferentemente, dicha célula es tal como se ha descrito
anteriormente, es decir, una célula primaria o una célula derivada
de una línea celular que es cultivada in vitro durante un periodo
amplio. En una realización preferente, las células se derivan de
una población clonal de células. Preferentemente, la célula es una
célula cultivada, más preferentemente una célula cultivada
inmortalizada.
En una realización preferente se utilizan implantes de
células que pueden cultivarse. Además, éstas células son
preferentemente clonales, y preferentemente de características
elegibles. Sin embargo, también es posible utilizar cultivos
primarios, tejidos, huevos fertilizados, o material embrionario. Se
ha publicado un método para hacer huevos de peces transgénicos
(Morita y otros 2004, Transgenic Research 13, 551). Sin embargo,
los huevos de peces transgénicos mencionados no pueden propagarse
más. Adicionalmente, la expresión del gen (o de los genes)
introducidos, tal como lo describe Morita y otros, no es estable.
La selección de los genes introducidos en huevos es difícil y la
utilización de huevos de peces como biorrectores consume bastante
tiempo en relación con las células cultivables debido a que tiene
que emplearse la microinyección para cada uno de los huevos,
mientras que en cultivos celulares se puede utilizar la tecnología
de transfección estándar. Las células cultivables pueden tener la
ventaja de que se almacenan con facilidad, y están disponibles en
cualquier momento. Además, no existen problemas éticos con el
trabajo con células cultivables en comparación con los huevos
genéticamente modificados. La inyección de una suspensión de
células cultivadas es bastante fácil en comparación con la
implantación de huevos, y/o embriones.
La presente invención adicionalmente proporciona un pez
que comprende una célula según la presente invención.
Preferentemente, el pez en un pez comestible. Preferentemente, el
pez es un pez comestible joven o adulto. El tiempo para la
reproducción es preferentemente corto. El material embrionario
primario tiene la desventaja de que podría no estar disponible en
cantidades suficientes. En una realización preferente el pez es
anguila, lobina, pargo, halibut, salmón, trucha, bacalao, carpa,
bagre, o esturión. En una realización preferente el pez comprende
- células
- de esperma no modificadas genéticamente, oocitos y/o
- progenitores de los mismos.
- Ejemplos
- Clonación de HLβ, HEFβ
- y genes α de pez cebra
- Los
- genes del pez cebra ya están publicados HLβ
- (AY424304),
- HEFβ (AY424303) y α (AY424306), también se han
presentado los genes de anguila para HLβ (AB175835) en Anguilla japonica; HEFβ (AY169722) en Anguilla anguilla y para α (AB175834) en Anguilla japonica. Con el fin de clonar HLβ, HEFβ y α se
diseñaron cebadores basados en la secuencia de ADNc de cada uno:
La secuencia utilizada para el diseño de los cebadores de la HLβ fue: atatataaat ctggacacgc agagacactt acaacagcct gctgagcaac cgcaacgcct gtcaagatgt tattggctgg aaatggtgtc ttctttctct tctctttgtt tttcctgctg gcggctgctc agagcttggt ttttccacgc tgtgagctag taaatgagac ggtatcggtg
gaaaaagagg gctgtccaaa atgcctggtg tttcagacca ccatctgcag cggccactgc
gtaacaaggg atcccgttta caagagcccg ttttccaccg tccaccagac agtgtgcatg
taccgggacg tccgctatga gaccattaac ctgcccgact gttccgccgg cgtggacccg
cagatcacat acccggtggc gctgagctgc gactgcagtc tgtgcaccat aaacacttcc
gactgcacca tccagagcct gcagcccgac ttctgcatgt cccagagaga ggatttcccc
gcatactaga cctcgggcaa ctcacgtcaa cctacgcaca tagtcgagct cagcattatt
agccctcctg tatgtttttt ccattaatat atatactttc aagacactag tattcagctt
aaagtgacat ttaaagacta aactaggtta attaggggga aaagtagagt aagtcattgt
ataatagtgg tttgttctgg agacaatcca aaactaatat tgcttaaggg ggctaataaa
attgacctta aaatgaattt aaataattta aaaactgcat ttattctagt cgaaataaaa
gaaataagac tttctttaga agaaaaaaca ttataggaaa tactgcaaaa aaattcctga
atctgttcaa catcattcgg gaaatcaaag gagggctaat aactgtgact tcagctgtac
atcaataaag aggctggttc ttaaattcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa
La secuencia utilizada para el diseño de los cebadores de la HEFβ fue: ggtctccacg aaactcccgc agatgaggat gcgtgtgctt gttctggcgc tgctgttgcc ggtgttaatg agcgcagaat cagaatgcqg gtgcagctgt cgactcacca acatctccat cactgtggag agcgaagaat gtgggagctg cgtcacaatc gacaccacag cctgtgcagg actatgctgg acaatggatc gagtttaccc tagttccatg gcacagcaca cccagaaggt ctgtaacttc aagaacttga tgtacaagag ctacgagttt aaaggctgctc ctgcaggggt tgattcagtc ttcgtgtacc ccgtggctct gagctgtgag tgcaaccagg ttaactcaga cacaacagac tggggagcta tcagcccgca gaccaccagc tgcagcatac actagagcac tgtatcatga ccttaacaac atgtacgttg cagaatcaaa ttaagtaagg agtacaatta gaccatttaa ggatatcaat tatttacaaa acctttagtt tttcatgcat cccacacaca tggtaatttg gttacttgaa ttaatctgtt gtgttaattc tatagttggt actatggtaa ctagagtact agagtatcca atgctatact agttttaatt acagttaatt atagaaaagt atgctacagt atttattaca gtttttctgt tttcaatatt tagtactaca gtatgctagt gcattcatta acaataagct gtaaatacta taataaatac aggttaatac actttactat agtatgcttg atcaacacta ttatttaatg tgagttacta tagtactttt caattgggat ttgtcatttt ggatattgtg ggcttttttg gctattcata aagttttttt tatttttttt
- ttatttaatt
- ttcagtcaaa tggaaacaag tccaccataa tacacttgtg tttcttttgt
- caaacttatc
- aatttgtgtc tgtagatttc aattacaata catattttaa aggccaaaaa
- aaaaaaaaaa
- aaaaaaaa
La secuencia utilizada para el diseño de los cebadores de la subunidad α fue: gaagacactc atcacgctcc gccggaagtc gaggacaaag ccatcatgtt ttggacaaga tacgctgaag caagcatttt cttgttgtta atgattcttc atgtcggaca actgtattca agaaacgatg tgtctaacta tggatgtgaa gagtgcaaac tcaagatgaa cgaacgtttc tccaaacccg gggctccggt ctatcagtgc gtgggctgct gcttttcgag agcttacccc acacccctga ggtccaagaa aaccatgctt gtcccraaaaa acatcacatc agaagccact
tgctgtgtag caaaagaatc taaaatggtt gccacgaata tcccactata caaccacaca
gactgccact gcagcacctg ttactatcat aagtcttaaa acacactctc ttcacatttc
tcaaatgctc atttcctgtt cttaaatcac agtgactcat gaaatatgat ttttatgtag
ctttccatat ttcaactgtg gccatttcca attcgtttct aaaatggttg gcataagtat
tgtaaactgc atattctgtc actatccctt taagagcgta atatgccatc ctttactatc
attaaatcgc ttatttattt tgttgccttt actgtgacat tcttcaaatc tataaatgaa
ataaaagatt gctgaaggca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
En cada caso la parte gris representa la secuencia de
codificación, y la región amplificada predicha está subrayada.
Los cebadores diseñados fueron: HLβ/EcoRI superior 5’-CAA CCG AAT TCA ACG CCT TCA AGA TGT-3’ HLβ /EcoRV inferior 5’-CCG ATA TCT AGT ATG CGG GGA AAT-3’ HEFβ3 superior 5’-AGG ATG CGT GTG CTT GTT CT-3’ HEFβ2/3 inferior 5’-TGT TGT TAA GGT CAT GAT ACA GTG C-3’ α1 superior 5’-GTC GAG GAC AAA GCC ATC AT-3’ α1 inferior 5’-TGC CAA CCA TTT TAG AAA CGA-3’
Para facilitar etapas adicionales de clonación los oligos HLβ, incluyen sitios de enzimas de restricción para EcoRI y EcoRV en el oligo superior y en el oligo inferior, respectivamente.
El ARN total se aisló de cabezas de pez cebra
homogeneizadas en nitrógeno líquido y se extrajo utilizando
reactivo TRIZOL según las instrucciones del fabricante. Se
eliminaron las trazas de ADN por incubación con DNasaI seguido por
extracción con fenol/cloroformo y precipitación en etanol. Se
realizó RT-PCR utilizando el sistema RT-PCR de una etapa
Superscript II con Platinum Taq. Las reacciones se realizaron con
100 ng de ARN total utilizando 25 pmol de los cebadores superior e
inferior. Se realizó la transcripción inversa a 50oC durante 30
minutos. Las condiciones de PCR fueron 40 ciclos de
desnaturalización a 94oC durante 20 s, emparejamiento (“annealing”)
a 55oC para HLβ y para HEFβ y 50oC durante 30 s y extensión a 72oC durante 1 minuto seguido por una etapa de extensión final a 72oC durante 10 minutos. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se colorearon con bromuro de etidio. El producto de PCR HEFβ produjo una banda tenue cuando se observó en el gel de agarosa, con el fin de optimizar se realizó un PCR empleando como patrón este producto de PCR, la reacción se efectuó con 1/20 de la reacción del producto de PCR utilizando 10 µM de los cebadores superior e inferior. Las condiciones del PCR
fueron 40 ciclos de desnaturalización a 94oC durante 20 segundos,
el emparejamiento se realizó en un gradiente de 50oC a 60oC durante
30 segundos y extensión a 72oC durante 1 minuto seguido por una
etapa de extensión final a 72oC durante 10 minutos. Se observó
entonces una banda nítida. Para confirmar la identidad de las
secuencias amplificadas, los productos de PCR se clonaron en el
vector pCRII-TOPO, se sometieron a digestión con enzimas de
restricción para identificar la dirección correcta y se
secuenciaron. El análisis de la secuencia reveló que se habían
clonado subunidades HLβ, α y HEFβ de pez cebra. Estas construcciones permiten ahora la subclonación de los genes bajo un promotor constitutivo.
Clonación de HLβ, HEFβ y α bajo el control de un promotor constitutivo (CMV). El vector de expresión p3XFLAG-CMV-9 se utiliza para establecer proteínas de fusión transitorias o estables. El vector codifica tres epítopos FLAG adyacentes corriente arriba de la región de clonación múltiple. Esto resulta en una mayor detección utilizando el anticuerpo anti-FLAG. La región reguladora del promotor del CMV dirige la transcripción de las construcciones de fusión FLAG. La secuencia líder preprotripsina antecede a la secuencia FLAG, promoviendo la secreción de la proteína. El gen fosfotransferasa aminoglucósido (Neo) confiere resistencia a los aminoglucósidos tales como Geneticina (G418), permitiendo la selección de transfectantes estables.
Utilizamos este vector porque posee las ventajas de que
las proteínas sintetizadas se secretarán dirigidas por el líder
preprotripsina, podemos detectar la expresión de las proteínas por
medio de la Técnica de Transferencia Western con el anticuerpo anti
FLAG y podemos hacer líneas celulares estables con geneticina.
Clonación de HLβ
El producto de PCR se purificó y se sometió a digestión con EcoRI y EcoRV así como el vector de expresión p3XFLAG-CMV-9. Los fragmentos de ADN se ligaron durante la noche a 4oC. La mezcla de unión se utilizó después para transformar células químicas competentes. Las digestiones enzimáticas seleccionaron clones positivos. Se secuenciaron aquellos clones que proporcionan un patrón correcto de digestión. En el momento, el clon secuenciado mostró una inserción incorrecta de HLβ de tal manera que tuvo que repetirse esta etapa de clonación. La secuencia de aminoácido predicha dio una proteína de 187 aminoácidos con un peso molecular de 20593,8. Clonación de HEFβ
pCRII-TOPO HEFβ se sometió a digestión con BamHI/NotI la banda que corresponde a ADNc de HEFβ se purificó y se subclonó en el p3XFLAG-CMV-9. Los clones positivos se sometieron entonces a digestión con Not/EcoRV y la nucleasa S1 de Aspergillus y se volvió a ligar para obtener HEFβ en estructura con el líder preprotripsina, esta construcción se designó como CMV-HEFβ. Alternativamente, pCRII-TOPO HEFβ se sometió a digestión con Xba/BamHI y la banda resultante se subclonó en el p3XFLAG-CMV-9. Los clones positivos se sometieron entonces a digestión con EcoRV y se volvió a ligar para obtener HEFβ en estructura con el líder preprotripsina, esta construcción se designó como CMV-HEFβ. Las digestiones enzimáticas seleccionaron clones positivos; se secuenciaron aquellos clones que proporcionaron un patrón correcto de digestión. La secuenciación de las dos diferentes colonias, que corresponden a las diferentes estrategias de clonación, fue correcta. Estas construcciones se utilizaron para la transformación de la línea celular ZF4. La secuencia de aminoácidos predicha da una proteína de 174/183 aminoácidos con un peso molecular de 19062,24/19965,21 respectivamente para las dos estrategias diferentes de clonación. Clonación de α
Se sometió a digestión pCRII-TOPO α con KpnI/XbaI y la banda resultante se subclonó en el p3XFLAG-CMV-9. Las digestiones
enzimáticas seleccionaron clones positivos. Se secuenciaron aquellos clones que proporcionaron un patrón correcto de digestión. El análisis de la secuencia reveló que se había clonado α en la orientación correcta y en estructura con la secuencia indicadora y
el líder preprotripsina, esta construcción recibió el nombre de CMV-α. La secuencia de aminoácidos predicha da una proteína de 190 aminoácidos con un peso molecular de 21083,24.
Los plásmidos CMV-HEFβ y CMV-α se purificaron por lisis alcalina con SDS utilizando el equipo QIAprep spin Miniprep. Los plásmidos purificados se linealizaron con Scal. Los productos linealizados se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se colorearon con bromuro de etidio. El plásmido linealizado se purificó y se cuantificó.
Transfección de HEFβ en la línea celular de fibroblasto de pez cebra (ZF4)
Las células ZF4 (número ATCC: CRL-2050) son fibroblastos de embriones de pez cebra de 1 día de edad. La alícuota congelada de células ZF4 se retiró del nitrógeno líquido y se colocó inmediatamente en hielo durante 10 minutos. La suspensión de células descongelada se retiró del frasco y se diluyó en 10 ml de medio completo (mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado de Dubelco y F12 de Ham conteniendo 1,2 g/l de bicarbonato de sodio, L-glutamina 2,5 mM, HEPES 15 mM y piruvato de sodio 0,5 mM, 10% de suero bovino fetal y penicilina/estreptomicina) a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó por centrifugación a 1200 rpm durante 8 minutos. Las células se volvieron a suspender en 8 ml de medio completo y se transfirieron a un matraz de tejido (T25) y se cultivaron a 28oC. Las células son examinadas bajo el microscopio invertido para verificar la densidad celular. En cultivos con una confluencia del 80% el medio se retira y se lava con 3 ml de PBS para retirar los restos celulares y el suero. Después se agregan 0,5 ml de solución de tripsina (0,25%) y se incuba a temperatura ambiente hasta que las células de la monocapa se desprenden del matraz, cuando se ha obtenido una sola suspensión de células se agregan 5 ml de medio completo para detener la tripsinización. Se cuentan las células viables y las no viables utilizando un hemocitómetro Fuchs-Rosenthal. Las células se sembraron en matraces nuevos a una densidad de 100-150 células/mm2 (5X105 en cada matraz T25). Las células se incubaron a 28oC para un máximo de 4 días antes de la siguiente pasada. La transfección se realizó en fibroblastos de pez cebra cuando tuvieron una confluencia del 5060% utilizando Fugene 6 siguiendo las instrucciones del fabricante. El complejo Fugene6/ADN se preparó en una relación 6:1 de Fugene6:ADN en un medio sin suero. El medio de cultivo se retira de las células y se reemplaza con medio libre de suero. El complejo Fugene6/ADN se añade por goteo y se mezcla. Las células se incubaron a 28oC durante 5 horas. Entonces el medio se retira y se reemplaza con el medio completo. Como control se cotransfectaron células ZF4 con el plásmido pEYFP-N1 y se analizó para determinar células positivas bajo el confocal Leica a las 16 y 24 horas después de la transfección. Se utilizaron diferentes concentraciones de ADN para establecer la concentración óptima para este plásmido dando como resultado que 1 µg de ADN en una
superficie de 21 cm2 fue la mejor concentración para obtener una
transformación de aproximadamente el 30%. Detección de la expresión de HLβ, HEFβ y α Inmunoquímica
Las células transfectadas se analizaron también por
inmunohistoquímica para detectar la expresión de la proteína en las
células. Las células se fijaron con p-formaldehído 2%
glutaraldehído 0,1% en PBS durante 10 minutos, para eliminar el
fijador las células se lavaron dos veces con PBS. Después se
permeabilizaron durante 10 minutos con el 0,2% de Triton X-100 en
PBS. Para reducir la autofluorescencia ocasionada por el fijador se
agregó NaBH4 2mg/ml en PBS durante 10 minutos. Se realizó el
bloqueo con 0,1% de BSA-c, 0,02% de gelatina de piel de pescado en
agua fría durante 30 minutos. Se efectuó la incubación con
anticuerpo anti-FLAG (1:250) durante toda la noche a 4oC en 0,1% de
BSA-c, 0,02% de gelatina de piel de pescado en agua fría. El
anticuerpo se retiró y se lavó con 0,1% de BSA-c, 0,02% de gelatina
de piel de pescado en agua fría dos veces durante 10 minutos cada
vez. El anticuerpo secundario (antiConejo Alexa 488) se agrega en
una dilución 1:1000 en 0.1% de BSA-c, 0,02% de gelatina de piel de
pescado en agua fría y se incuba a temperatura ambiente durante 60
minutos. Después se lava tres veces con 0,1% de BSA-c, 0,02% de
gelatina de piel de pescado en agua fría y se monta en
DABCO/Gelvatol. El análisis de las células en el confocal Leica
reveló la expresión de la proteína en vesículas en las células
transfectadas. Esta localización está conforme con el sitio
esperado para las proteínas que van a secretarse.
Transferencia Western
Las diferentes construcciones se transfectaron
utilizando Fugene 6 en matraces T25 por duplicado, como control las
células no se transfectaron con ADN, se transfectaron con el vector
vacío y con el control positivo CMV-BAP. Las proteínas se
obtuvieron en el tercer y quinto día después de la transfección a
partir del sobrenadante. El sobrenadante se concentró utilizando
columnas de amicon siguiendo las instrucciones de los fabricantes.
Las proteínas de fusión FLAG se inmunoprecipitaron con gel de
afinidad anti-FLAG M2, siguiendo las instrucciones de los
fabricantes. Las muestras de proteína se diluyeron a 1:4 con una
muestra de solución tampón hervida y mantenida a -80oC. Para
establecer las condiciones de la transferencia Western solo se
analizaron los controles positivo (CMV-BAP) y negativo (sin ADN),
las muestras se cargaron en un gel de acrilamida al 12%, durante 60
minutos a 50 mAmp. Los geles se transfirieron en membranas de
nitrocelulosa. La membrana de bloqueó con leche al 5% durante toda
la noche a 4oC y se realizó la inmunodetección contra anticuerpos
anti FLAG a una dilución de 1:250 en leche al 5% durante una hora a
temperatura ambiente. La inmunodetección se reveló con ECL
siguiendo las instrucciones de fabricante. El anticuerpo reconoció
la proteína BAP expresada mostrando una banda del tamaño predicho.
Con estos experimentos se muestra que las células transfectadas
transitorias están produciendo las proteínas de interés.
Elaboración de líneas celulares estables
Las células se transfectaron en cámaras de 6
receptáculos con ADN linealizado y purificado utilizando Fugene 6.
Como control las células se transfectaron sin ADN. Después de 3 ó 5
días de la transfección el medio completo se reemplazó con medio
completo con G418 agregado. La cantidad de G418 para matar células
que no expresan las construcciones varía de una línea celular a
otra. Para la línea celular ZF4 las concentraciones sugeridas por
el fabricante están entre 0,8 y 1 mg/ml. Las células se trataron
con 0,8 y 1 mg/ml por cuadruplicado, el medio se cambió diariamente
para eliminar por lavado las células muertas. Esto se realizó
durante 15 días hasta que las placas que contenían las células que
no tenían ADN murieron y no se pudo observar ninguna célula en la
placa. Después las células transfectadas se incubaron con la misma
concentración de G418 durante otros 5 días. Cuando se obtuvo una
monocapa confluente, las células se subcultivaron en un frasco T25
y la concentración de G418 se redujo a 0,5 mg/ml en medio completo.
Las líneas celulares estables se probarán con inmunohistoquímica y
análisis de transferencia Western con anticuerpo anti-FLAG para
detectar la expresión de la proteína.
Bioensayo
Con el fin de probar si las hormonas expresadas por las
células transfectadas son activas se efectuará un bioensayo simple.
Los cultivos de células foliculares de pez cebra responden a
extractos de pituitaria y/o gonadotropina coriónica humana (GCh)
regulando hacia arriba y abajo la expresión de los diferentes
genes. GCh (15IU/ml) aumenta el nivel de expresión de activina βA en una forma dependiente del tiempo. Este efecto es evidente a los 40 minutos del tratamiento y alcanza un nivel máximo en 2 h, un tratamiento más largo (4 h) ocasiona una disminución del efecto. Por el contrario, la activina βB se anula en las mismas condiciones. Cuando se realizan experimentos utilizando diferentes concentraciones de GCh se observa una respuesta dependiente de la dosis. El extracto de pituitaria de pez cebra también estimula la expresión de activina βA y anula la activina βB en una forma que depende de la dosis. Se planea utilizar esta característica de las
células foliculares en cultivo para probar si las HEFβ y HLβ son activas. Cultivo de células foliculares in vitro Aislamiento de células foliculares
Se adquirieron peces cebra jóvenes de una tienda de
mascotas y se mantuvieron sin separar machos y hembras. Las hembras
se anestesiaron con el 0,01% de solución de metanosulfonato de
tricaína durante 2 minutos o hasta que permanecieron quietas, y se
decapitaron antes de la disección. Los ovarios se extirparon
entonces y se colocaron en un plato de cultivo de 10 mm con L-15
(Gibco). Los folículos de 5 hembras se separaron cuidadosamente con
la ayuda de agujas de insulina. Los folículos separados se midieron
con un micrómetro ocular en un microscopio de disección y se
seleccionaron los folículos viotelogénicos saludables en
aproximadamente 0,45 mm, se acumularon y se cultivaron en matraces
T25 durante 6 días en medio M199 complementado con el 10% de suero
fetal bovino a 28oC y el 5% de CO2. El medio se cambia al tercer día
de la incubación. Durante la incubación de 6 días las células
foliculares proliferaron significativamente, aumentando el
rendimiento de las células para los experimentos. Las células se
lavaron y se tripsinaron a 28oC durante 15 minutos. Posteriormente
las células se lavan tres veces con medio M199 a través de
centrifugación a 1000 rpm durante 2 minutos, y después se
subcultivaron en 24 placas a una densidad de 1X105 células/ml por
receptáculo durante 24 horas en M199 completo antes del tratamiento
hormonal. La cantidad de células no fue suficiente para el
experimento, así que se comenzó con 20 hembras para obtener
material suficiente.
Tratamiento hormonal
Se usarán diferentes concentraciones de sobrenadante,
como control positivo se usará GCh a 15IU/ml, y también se
incluirán extractos de pituitaria de carpa. Con la condición de
extractos de pituitaria de carpa comparamos la cantidad de células
que deberán usarse para observar un efecto en la capacidad de
reproducción de la anguila hembra.
Inyección in vivo
Se disolvió GCh en el 0,9% de solución de NaCl en una concentración de 20IU/ml. Cada pez recibirá 50 µl de solución salina como control negativo, GCh como control positivo y concentraciones diferentes del sobrenadante o la HEFβ y/o HLβ purificada. En 1, 2, 4, 6 y 12 horas después de las inyecciones los peces se matan y se extirpan los ovarios para la extracción de ARN. Extracción de ARN
Al final del tratamiento hormonal el ARN total se aisló
de los ovarios de los peces cebra o células foliculares, se
homogeneizó en nitrógeno líquido y se extrajo utilizando reactivo
TRIZOL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se
eliminaron las trazas de ADN por incubación con DNasaI seguido por
extracción en fenol/cloroformo y precipitación en etanol. Se
efectuó RT-PCR utilizando el sistema RT-PCR de una etapa
Superscript II con Platinum Taq. Las reacciones se realizaron con
100 ng de ARN total utilizando 25 pmol de los cebadores superior e
inferior. Se efectuó transcripción inversa a 50oC durante 30
minutos. Las condiciones de PCR fueron 40 ciclos de
desnaturalización a 94oC durante 20 segundos, emparejamiento a 56oC
durante 30 segundos y extensión a 72oC durante 1 minuto seguido por
una etapa de extensión final a 72oC durante 10 minutos. Los
productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa
al 1% y se colorearon con bromuro de etidio.
Cebadores diseñados para amplificar la Activina βA, Activina βBy βActina: Activina A superior 5’-TGC TGC AAG CGA CAA TTT TA -3’ Activina A inferior 5’-CAT TCG TTT CGG ACT CAA G -3’ Activina B superior 5’-CAA CTT AGA TGG ACA CGC TG-3’ Activina B inferior 5’-GTG GAT GTC GAG GTC TTG TC-3’ β Actina superior 5’-CCC CTT GTT CAC AAT AAC CT-3’ β Actina inferior 5’-TCT GTG GCT TTG GGA TTC A-3’ Trasplante de las líneas celulares estables en la anguila
Se trasplantarán a la anguila líneas celulares estables
intraperitonealmente. Las anguilas se anestesiarán y se hará una
pequeña incisión en el abdomen. Se trasplantará la cantidad
correcta de células que producen una cantidad constante de hormona.
Como control negativo se trasplantarán células no expresan hormonas
y solo tienen el vector vacío, y como control positivo se inyectará
un grupo de anguilas con extractos de pituitaria.
Mediciones del proceso de maduración y maduración de huevos
Para cuantificar la maduración final de anguilas hembra
existen diferentes características que cambian a lo largo del
proceso de maduración, estos son un aumento significativo del peso
corporal, aumento en el diámetro de los ojos y cambios morfológicos
durante el desarrollo de los oocitos. Se observan siete etapas
morfológicas de maduración final de oocitos durante los
tratamientos de extractos de pituitaria. Los oocitos no
transparentes (etapa 0) son aún pequeños y completamente llenos con
gotitas de grasa. La hidratación final inicia el desarrollo en la
etapa 1, mostrando oocitos con mayor transparencia y un núcleo
centrado. En la etapa 2, los oocitos son completamente
transparentes y las gotitas de grasa se acumulan y se centralizan.
En la etapa 3, ocurre la migración de la vesícula germinal (VG). En
la etapa 4, la vesícula germinal se encuentra en la periferia y las
gotitas de grasa se localizan en el lado opuesto. En la etapa 5,
las gotitas de grasa disminuyen debido a la fusión de la grasa,
dando como resultado gotitas de grasa más grandes. En la etapa 6 se
completa la meiosis II con desaparición de la vesícula germinal y
se observan pocas gotitas de grasa grandes. En la etapa 7 los
oocitos tienen una sola gotita de grasa. Hay un cambio en el
diámetro de los oocitos durante las primeras dos etapas; esto es
debido al proceso de hidratación. Estos cambios morfológicos en la
maduración de los oocitos nos permitirán determinar el efecto del
trasplante de células. Después del trasplante de las células, se
pesarán las anguilas, y se medirá regularmente el diámetro de los
ojos. Durante el tratamiento se tomarán muestras de oocitos para
determinar si los oocitos están respondiendo al tratamiento.
Implantes con células productoras de hormona
Introducción
Se llevó a cabo una prueba para comparar la efectividad
de la implantación con células ZF4 productoras de hormona con la
técnica estándar de inyección con EPC (extracto de pituitaria de
carpa). La maduración sexual puede obtenerse por la inyección
repetida con EPC tal como ha descrito recientemente Palstra y otros
(2005). Las inyecciones repetidas no dan como resultados huevos de
calidad y descendientes viables, probablemente debido al estrés
inducido. Por lo tanto el protocolo de inyección de EPC tuvo que
reemplazarse por un procedimiento menos estresante, tal como
implantes con células productoras de hormona, tal como se describe
en este ejemplo. Como el efecto del EPC en una anguila se puede
observar después de unas pocas semanas por cambios morfológicos,
histológicos, y endocrinológicos, se llevó a cabo una prueba de 4
semanas con angulas plateadas hembra. La cantidad de células
inyectadas se relacionó con el peso estimado de la pituitaria de la
anguila experimental (aproximadamente 6 µl de tejido/kg de anguila). Materiales y Métodos
Células productoras de hormona
Se desarrollaron independientemente tres diferentes líneas celulares estables: genes para HEFβ, HLβ, y HEF/HLα se insertaron en el promotor de CMV y se transfectaron establemente en células ZF4, de conformidad con el protocolo descrito anteriormente (se transfectaron con Fugene 6 y se seleccionaron con G418).
Línea celular estable PFV-β-galactosidasa
El plásmido pM2838 se utilizó para elaborar una línea celular estable ZF4 que expresa una proteína de fusión entre la proteína fluorescente verde (PFV) y la proteína β-galactosidasa. Este plásmido fue descrito por Bakkers (2000). Brevemente: el gen gfp-LacZ del plásmido pUAS-gfpN_LacZ se tomó y se utilizó como reemplazo del gen gfp en el plásmido pEGFP-C3. De tal manera que
una proteína de fusión fluorescente verde con actividad βgalactosidasa (gfpN-LacZ) se expresó bajo control del promotor CMV. El plásmido pMP2838 también contiene el gen neomicina resistente (Neor) que permite la selección de clones positivos con gentamicina (G418), tal como se describió anteriormente para elaborar líneas celulares estables. De la misma forma se generaron líneas celulares estables ZF4 con el mismo protocolo, tal como se describió anteriormente (transfectadas con Fugene 6 y seleccionadas con G418).
El día en la inyección las células se cosecharon y
cuantificaron para un total de 108 células por cada línea celular.
Las 4 líneas celulares se mezclaron a concentraciones iguales de
células y se diluyeron en medio DMEM-F12 sin suero hasta una
concentración final de 20 millones de células en un ml.
Coloración de tejido de β-galactosidasa
El tejido se enjuaga brevemente en PBS (solución salina
tamponada con fosfato) y se fija inmediatamente con
paraformaldehído 1%-glutaraldehído 0,1% en PBS con MgCl2 2 mM, EDTA
5 mM y 0,02% de NP-40 durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después se lava dos veces durante 5 minutos con solución de lavado
(PBS con MgCl2 2 mM, EDTA 5 mM, 0,02% de NP-40 y 0,01% de
deoxicolato de Na) a temperatura ambiente. Posteriormente el tejido
se colorea durante 12 horas con solución para colorear (PBS con
MgCl2 2 mM, 0,02% de NP-40, 0,01% de deoxicolato de Na, K3Fe(CN)6 5
mM, K4Fe(CN)6 5 mM y 1 mg/ml de X-gal) a 37oC. El tejido coloreado
se lavó después con PBS y se introdujo en parafina.
Animales y protocolo
Se capturaron sesenta anguilas plateadas hembra (9001600 g) en su estado natural durante su migración hacia el mar en
el Lago Grevelingen (Holanda). Al llegar todas las anguilas se
equiparon con un microchip (Trovan) para identificación, y se
midieron parámetros externos. Se sacrificaron inmediatamente diez
anguilas como animales de control. Las anguilas hembra restantes se
mantuvieron en un sistema de recirculación de 3000 litros en agua
marina artificial (35 por millar) a una temperatura de 18oC. Para
evitar infecciones bacterianas en el día de la manipulación, los
animales se expusieron durante 3 horas al antibiótico Flumequine
(50 mg/l) en un tanque separado grande. Un grupo de 24 anguilas se
inyectó semanalmente con Extracto de Pituitaria de Carpa (EPC: 20
mg/kg) de acuerdo con el método descrito anteriormente (Palstra y
otros, 2005), el otro grupo se inyectó solo una vez al inicio del
experimento con 1 ml de una mezcla de 4 tipos de células (β-gal, HLβ, HEFβ, HL/HEFα). Las células se inyectaron por vía subcutánea como suspensión debajo del principio de la aleta dorsal y por arriba de la línea lateral.
Cada semana 6 anguilas de cada grupo se sacrificó para
analizar los efectos del tratamiento. Esto incluyó: peso total,
índice ocular, peso de las gónadas, y longitud de la aleta
pectoral. Además se tomaron muestras de tejido (sangre, pituitaria,
hígado, gónada) para análisis posterior. Adicionalmente, se obtuvieron muestras de los lugares de inyección para probar la presencia de células positivas β-galactosidasa. De las mismas
muestras de control de anguilas se obtuvieron de regiones en donde
no se inyectaron células.
Resultados y Discusión
Implantes de células
El análisis histológico de los implantes subcutáneos se verificó para la coloración de β-galactosidasa. Todas las muestras mostraron la ocurrencia de las células (figura 12). La coloración ocurrió inicialmente en el tejido de grasa/colágeno que es típico para las capas subcutáneas, sin embargo, también en muchos casos pudo observarse la infiltración alrededor de las capas de músculos. Comparando las muestras entre la semana 1 y la semana 4, frecuentemente hubo un incremento de la masa total de células de coloración β-galactosidasa, indicando claramente que esas células son capaces de infiltrar el tejido huésped. No hubo indicación de rechazo, esto es una observación notable dado que las células ZF4 se originan del pez cebra, el cual está evolutivamente muy alejado de la anguila. Cambios morfológicos
El cambio más destacado y próximo que indica el inicio
de la maduración es el aumento en el tamaño de los ojos en las
anguilas plateadas (Drif y otros, 2004). De la figura 13 está claro
que los cambios observados en el índice ocular -[área superficial
en relación con la longitud, Pankhurst 1982] -inducido por los
implantes celulares son casi idénticos a aquellos inducidos por
inyección de EPC. Este resultado muestra claramente la efectividad
de los implantes celulares. Se obtendrá una prueba adicional de una
estimulación de 3-4 meses de las anguilas plateadas, lo cual deberá
dar como resultado una maduración final.
Conclusiones
Como mínimo, se pueden obtener dos conclusiones del
experimento anterior: 1) las células ZF4 de pez cebra (línea
celular de fibroblastos) no son rechazadas por las anguilas
plateadas durante un periodo de 4 semanas, y se encuentra incluso
que proliferan. 2) La mezcla implantada de células tuvo un efecto
similar en el índice ocular como lo tuvo el protocolo estándar con
EPC, mostrando por lo tanto evidencia de estimulación hormonal.
Empleando el protocolo y las construcciones descritas
anteriormente se generaron y trasplantaron en anguilas líneas
celulares de anguila. Se generaron además células de peces que
expresan ambas unidades (α + β).
Referencias:
Palstra, A.P., Cohen, E.G.H., Niemantsverdriet, P.R.W., van
Ginneken, V.J.T., van den Thillart, G.E.E.J.M. (2005)
Artificial maturation and reproduction of European silver
eel: Development of oocytes during final maturation.
Aquaculture, 2005.
Durif, C, Dufour, S., Elie, P. (2005) The silvering process
of the eel : a new classification from the yellow resident
stage to the silver migrating stage. J. Fish Biol. 66, 1-19
Pankhurst, W.N. (1982) The relation of visual changes to the
onset of sexual maturation in European eel, Anguilla anguilla
L. J. Fish Biol. 21, 179-196
Bakker J. (2000) Chitin oligosacharides in Zebrafish
development. Investigations at the molecular and cellular
level. (Tesis Universidad de Leiden).
Descripción breve de los dibujos y figuras Figura 1. Dendrograma basado en la alineación de la HLβ (HLβ), HEFβ (HEFβ) originada de (a) humano (Hs), ratón (Mm), rata (Rn), pez cebra (Dr) y anguila (Aj).
Figura 2. vector de expresión p3XFLAG-CMV-9.
Figura 3. Estrategia de clonación para la expresión de HLβ.
Figura 4. La secuencia de aminoácidos predicha de HLβ
proporciona una proteína de 187 aminoácidos con un peso
molecular de 20593,8.
Figura 5. Estrategia de clonación para la expresión de HEFβ.
Figura 6. La secuencia de aminoácidos predicha de HEFbblu y
HEFb proporciona una proteína de 174/183 aminoácidos con un
peso molecular de 19062,24/19965,21 respectivamente para las
dos diferentes estrategias de clonación.
Figura 7. Estrategia de clonación para la expresión de α.
Figura 8. La secuencia de aminoácidos predicha proporciona
una proteína de 190 aminoácidos con un peso molecular de
21083,24.
Figura 9. Transfección de células ZF4 con pEYFP-N1. La
transfección se observó después de 24 horas de transfección.
Figura 10. Inmunohistoquímica con anticuerpos anti-FLAG en
células cotransfectadas con pEYFP-N1.
Figura 11. Transferencia Western con anti-FLAG. El anticuerpo
reconoció una proteína del tamaño esperado para FLAG-BAP.
Figura 12. Coloración para β-galactosa indicó la ocurrencia de células β-gal-ZF4 que se inyectaron subcutáneamente en anguilas plateadas. De la misma anguila se diseccionó tejido de piel/músculo del área inyectada y un área más alejada hacia la cola. El tejido graso subcutáneo es fácilmente reconocible en las figuras, como lo es la dermis y la capa muscular. Figura 13. Cambios de índice ocular (IO) con respecto a la etapa inicial (%) de anguilas plateadas durante 4 semanas (S1-S4) de tratamiento con célula productora de hormona (CPH)
o con extractos de pituitaria de carpa (EPC). Para la etapa
inicial y cada una de las semanas se tomaron 6 anguilas
plateadas hembra completamente desarrolladas (peso 1300 ± 300
g).
Claims (15)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Método para mejorar el desarrollo y/o maduración de huevos y/o esperma en peces empleando la administración de una hormona de fertilidad que comprende proveer al pez células que produzcan dicha hormona de fertilidad para utilizarse en la creación de progenie o la producción de huevos.
-
- 2.
- Método, según la reivindicación 1, en el que dicha hormona de fertilidad comprende hormona luteinizante (HL), hormona estimulante de folículos (HEF) o gonadotropina coriónica (GC) o una parte funcional de la misma.
-
- 3.
- Método, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dichas células son modificadas genéticamente para expresar dicha hormona de fertilidad.
-
- 4.
- Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha hormona de fertilidad se deriva del mismo género que dicho pez.
-
- 5.
- Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas células se han dotado de uno o más genes que codifican para dicha hormona de fertilidad.
-
- 6.
- Método, según cualquiera de reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas células son una población clonal.
-
- 7.
- Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichas células se han seleccionado para una inmunogenicidad reducida en el pez.
-
- 8.
- Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichos peces son peces diádromos.
-
- 9.
- Célula de pez cultivable aislada y/o recombinante, que produce una hormona de fertilidad.
-
- 10.
- Célula de pez, según la reivindicación 9, en la que dicha célula está modificada genéticamente para expresar dicha hormona de fertilidad.
-
- 11.
- Célula de pez, según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en la que dicha célula es una célula de anguila.
-
- 12.
- Pez que comprende una célula, según cualquiera de las reivindicaciones 9-11.
-
- 13.
- Pez, según la reivindicación 12, que es un pez comestible.
- 14. Pez, según la reivindicación 13, que es una anguila.
- 15. Pez, según la reivindicación 14, en el que dicha anguila pertenece al género Anguilla.
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