JP2003506076A - トリ始原生殖細胞を使用して、未分化のトリ細胞培養物を取得する方法 - Google Patents
トリ始原生殖細胞を使用して、未分化のトリ細胞培養物を取得する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞を取得する方法。その方法には、始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞を原条形成後のトリ胚から集め；そのトリ生殖腺細胞を予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて置き；そして本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細胞培養物を取得するのに十分な時間、そのトリ生殖腺細胞を培地の存在下に予め調整しておいたフィーダーマトリックスで増殖させる；という段階が含まれる。
Description
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞に関し、そして
特にトリ始原生殖細胞および胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞に関す
る。
特にトリ始原生殖細胞および胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞に関す
る。
【０００２】
略語表
【表１】
【０００３】
背景技術
哺乳動物において、生殖隆起から培養した始原生殖細胞は、多能性胚幹細胞を
発生させる能力を有する。例えば、Ｈoganの１９９７年１１月２５日に発行され
た米国特許第５,６９０,９２６号；Ｈoganの１９９７年９月２３日に発行された
米国特許第５,６７０,３７２号；およびＨoganの１９９５年９月２６日に発行さ
れた米国特許第５,５３７,３５７号は各々、哺乳動物の多能性胚幹細胞およびそ
れらを製造する方法を開示している。これらの特許の開示は、哺乳動物の胚幹細
胞、そして特にＳＣＦ、ＦＧＦおよびＬＩＦよりなる増殖因子の組み合わせを使
用して、マウスおよび他の哺乳動物の胚幹細胞を培養することに限定されている
。
発生させる能力を有する。例えば、Ｈoganの１９９７年１１月２５日に発行され
た米国特許第５,６９０,９２６号；Ｈoganの１９９７年９月２３日に発行された
米国特許第５,６７０,３７２号；およびＨoganの１９９５年９月２６日に発行さ
れた米国特許第５,５３７,３５７号は各々、哺乳動物の多能性胚幹細胞およびそ
れらを製造する方法を開示している。これらの特許の開示は、哺乳動物の胚幹細
胞、そして特にＳＣＦ、ＦＧＦおよびＬＩＦよりなる増殖因子の組み合わせを使
用して、マウスおよび他の哺乳動物の胚幹細胞を培養することに限定されている
。
【０００４】
トリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）の培養物に関する現在の先行技術報告は、ＰＧＣ
表現型を保持する努力および増殖を刺激する努力に集中している。例えば、Ｃha
ng，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９７年８月；２１（８）４９５−９
；Ｃhang，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９５年２月；１９（２）１４
３−９；Ａllioli，Ｎ.ら，Ｄev. Ｂiol. １９９４年９月；１６５（１）３０−
７；および１９９９年２月１１日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／０６
５３３（出願人−Ｕniversity of Ｍassachusetts；発明者−Ｐonce de Ｌeonら
）を参照されたい。
表現型を保持する努力および増殖を刺激する努力に集中している。例えば、Ｃha
ng，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９７年８月；２１（８）４９５−９
；Ｃhang，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９５年２月；１９（２）１４
３−９；Ａllioli，Ｎ.ら，Ｄev. Ｂiol. １９９４年９月；１６５（１）３０−
７；および１９９９年２月１１日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／０６
５３３（出願人−Ｕniversity of Ｍassachusetts；発明者−Ｐonce de Ｌeonら
）を参照されたい。
【０００５】
胚幹細胞（ＥＳＣ）表現型を発現する未分化のトリ細胞およびそれらを取得す
る方法は、Ｐetitteらの１９９４年８月２３日に発行された米国特許第５,３４
０,７４０号；Ｐetitteらの１９９７年８月１２日に発行された米国特許第５,６
５６,４７９号；およびＰetitteらの１９９８年１１月３日に発行された米国特
許第５,８３０,５１０号に開示されている。ＥＳＣ表現型を発現する未分化のト
リ細胞は、とりわけ、発生学上の開発試験（すなわち、その細胞をマーカー遺伝
子で標識して、インビボに注入した後、それらの分布を観察することによる）お
よびトランスジェニック家禽の産生のためのツールとして有用である。それらは
、トランスジェニック家禽の産生に対して相同的組換えの適用を可能とするのに
有用である。そのような用途から考えて、ＥＳＣ表現型を発現する未分化のトリ
細胞を得るためのさらなる方法の開発は、当業界での継続的な必要性を表す。
る方法は、Ｐetitteらの１９９４年８月２３日に発行された米国特許第５,３４
０,７４０号；Ｐetitteらの１９９７年８月１２日に発行された米国特許第５,６
５６,４７９号；およびＰetitteらの１９９８年１１月３日に発行された米国特
許第５,８３０,５１０号に開示されている。ＥＳＣ表現型を発現する未分化のト
リ細胞は、とりわけ、発生学上の開発試験（すなわち、その細胞をマーカー遺伝
子で標識して、インビボに注入した後、それらの分布を観察することによる）お
よびトランスジェニック家禽の産生のためのツールとして有用である。それらは
、トランスジェニック家禽の産生に対して相同的組換えの適用を可能とするのに
有用である。そのような用途から考えて、ＥＳＣ表現型を発現する未分化のトリ
細胞を得るためのさらなる方法の開発は、当業界での継続的な必要性を表す。
【０００６】
発明の要約
胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の持続性培養物を取得する方法を
開示する。その方法の好ましい態様は、（ａ）始原生殖細胞を含有するトリ細胞
を原条形成後のトリ胚から集め；（ｂ）そのトリ細胞を予め調整しておいたフィ
ーダーマトリックスと接触させて置き；そして（ｃ）本質的には、胚幹細胞表現
型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細胞培養物を取得するのに十分な時
間、そのトリ細胞を培地の存在下にフィーダーマトリックスで増殖させる；こと
を含んでなる。
開示する。その方法の好ましい態様は、（ａ）始原生殖細胞を含有するトリ細胞
を原条形成後のトリ胚から集め；（ｂ）そのトリ細胞を予め調整しておいたフィ
ーダーマトリックスと接触させて置き；そして（ｃ）本質的には、胚幹細胞表現
型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細胞培養物を取得するのに十分な時
間、そのトリ細胞を培地の存在下にフィーダーマトリックスで増殖させる；こと
を含んでなる。
【０００７】
そのトリ細胞は、１４期以降の胚（Ｈ ＆ Ｈ）、好ましくは１４期〜４５期の
胚、より好ましくは１５期〜３１期の胚、そしてさらにより好ましくは２７期〜
３０期の胚から集める。より好ましくは、そのトリ細胞を約１０,０００〜約２
０,０００細胞の範囲数でフィーダーマトリックスと接触させて置く。さらによ
り好ましくは、約２０,０００のトリ細胞をフィーダーマトリックスと接触させ
て置く。
胚、より好ましくは１５期〜３１期の胚、そしてさらにより好ましくは２７期〜
３０期の胚から集める。より好ましくは、そのトリ細胞を約１０,０００〜約２
０,０００細胞の範囲数でフィーダーマトリックスと接触させて置く。さらによ
り好ましくは、約２０,０００のトリ細胞をフィーダーマトリックスと接触させ
て置く。
【０００８】
そのフィーダーマトリックスは、繊維芽細胞を含んでなるのがよい。その繊維
芽細胞は、約４０,０００〜約６０,０００細胞、好ましくは約５０,０００〜約
６０,０００細胞、さらにより好ましくは約５５,０００〜約６０,０００細胞の
範囲数でフィーダーマトリックスに存在し得る。最も好ましくは、約６０,００
０の繊維芽細胞がフィーダーマトリックスに存在する。
芽細胞は、約４０,０００〜約６０,０００細胞、好ましくは約５０,０００〜約
６０,０００細胞、さらにより好ましくは約５５,０００〜約６０,０００細胞の
範囲数でフィーダーマトリックスに存在し得る。最も好ましくは、約６０,００
０の繊維芽細胞がフィーダーマトリックスに存在する。
【０００９】
好ましくは、その繊維芽細胞は、マウス繊維芽細胞、より好ましくはマウスＳ
ＴＯ繊維芽細胞を含んでなる。好ましい態様において、そのマウス繊維芽細胞は
、マウス繊維芽細胞フィーダー層を形成する。
ＴＯ繊維芽細胞を含んでなる。好ましい態様において、そのマウス繊維芽細胞は
、マウス繊維芽細胞フィーダー層を形成する。
【００１０】
そのトリ胚は、限定されるものではないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒ
ル、ガチョウ、ウズラおよびキジの胚が含まれる群から任意に選択される胚であ
る。好ましい態様において、そのトリ胚は、ニワトリの胚である。
ル、ガチョウ、ウズラおよびキジの胚が含まれる群から任意に選択される胚であ
る。好ましい態様において、そのトリ胚は、ニワトリの胚である。
【００１１】
従って、本発明の目的は、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞を培養
するための新規方法を提供することである。
するための新規方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞を、始原生
殖細胞を含有するトリ細胞から培養する方法を提供することである。
殖細胞を含有するトリ細胞から培養する方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、トリ始原生殖細胞を使用して、胚幹細胞表現型を発
現する未分化のトリ細胞の培養物を作成する際に使用するためのフィーダーマト
リックスを提供することである。
現する未分化のトリ細胞の培養物を作成する際に使用するためのフィーダーマト
リックスを提供することである。
【００１４】
本発明のまたさらなる目的は、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の
培養物を確立する際に使用するための、始原生殖細胞を含有するトリ細胞の最適
数を特性決定することである。
培養物を確立する際に使用するための、始原生殖細胞を含有するトリ細胞の最適
数を特性決定することである。
【００１５】
本明細書中、本発明の目的の幾つかを上述しているが、本明細書中、以下に最
もよく記載する付随の実験例および図面と関連させると、他の目的も記載が進む
につれて明らかとなるであろう。
もよく記載する付随の実験例および図面と関連させると、他の目的も記載が進む
につれて明らかとなるであろう。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は、培養における様々な数のＳＴＯフィーダー細胞での生殖腺ＰＧＣの生
存率を図示する棒グラフである。１ウェルあたり１０,０００の生殖腺細胞を様
々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり５０,０００、５５,０００および６０,０
００細胞）に播種した。発生段階特異的マウス胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１−ＰＧ
ＣおよびＥＳＣのためのマーカー）に陽性の細胞を、培養後、０、１および３日
目に、ＰＧＣ数として数えた。１ウェルあたり６０,０００細胞のグループでは
、他のグループより高いＰＧＣ数を３日目に示す（Ｐ＜０.０５）。この結果は
、フィーダー細胞の実質的に完全な単層、例えば、約６０,０００細胞を含有す
る単層が、ＰＧＣ培養物に好ましいことを示す。
存率を図示する棒グラフである。１ウェルあたり１０,０００の生殖腺細胞を様
々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり５０,０００、５５,０００および６０,０
００細胞）に播種した。発生段階特異的マウス胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１−ＰＧ
ＣおよびＥＳＣのためのマーカー）に陽性の細胞を、培養後、０、１および３日
目に、ＰＧＣ数として数えた。１ウェルあたり６０,０００細胞のグループでは
、他のグループより高いＰＧＣ数を３日目に示す（Ｐ＜０.０５）。この結果は
、フィーダー細胞の実質的に完全な単層、例えば、約６０,０００細胞を含有す
る単層が、ＰＧＣ培養物に好ましいことを示す。
【００１７】
図２は、予め調整しておいたＳＴＯフィーダー細胞を使用しての生殖腺ＰＧＣ
培養の生存率を図示する棒グラフである。１または２日間予め調整しておいた後
、１ウェルあたり２０,０００の生殖腺細胞を１ウェルあたり６０,０００のＳＴ
Ｏ細胞に播種した。２日間予め調整しておいたＰＧＣが高い生存率を示す。
培養の生存率を図示する棒グラフである。１または２日間予め調整しておいた後
、１ウェルあたり２０,０００の生殖腺細胞を１ウェルあたり６０,０００のＳＴ
Ｏ細胞に播種した。２日間予め調整しておいたＰＧＣが高い生存率を示す。
【００１８】
図３は、１培養ウェルあたり様々な数の生殖腺細胞を播種する効果を図示する
一組の棒グラフである。
一組の棒グラフである。
【００１９】
図３Ａは、１ウェルあたり１０,０００または２０,０００の生殖腺細胞（図３
Ａに提示する凡例では、「１０」および「２０」として示す）を播種した後の、
様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,
０００−図３Ａに提示する凡例では、「４０」、「５０」および「６０」として
示す）での２０以上のＳＳＥＡ−１陽性細胞のコロニー数を図示する棒グラフで
ある。このように、図３Ａに提示する凡例では、「４０／１０」、「５０／１０
」および「６０／１０」という表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあたり４０
,０００、５０,０００または６０,０００であること、および１ウェルあたり１
０,０００の生殖腺細胞を播種することを示し、そして「４０／２０」、「５０
／２０」および「６０／２０」という表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあた
り４０,０００、５０,０００または６０,０００であること、および１ウェルあ
たり２０,０００の生殖腺細胞を播種することを示す。
Ａに提示する凡例では、「１０」および「２０」として示す）を播種した後の、
様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,
０００−図３Ａに提示する凡例では、「４０」、「５０」および「６０」として
示す）での２０以上のＳＳＥＡ−１陽性細胞のコロニー数を図示する棒グラフで
ある。このように、図３Ａに提示する凡例では、「４０／１０」、「５０／１０
」および「６０／１０」という表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあたり４０
,０００、５０,０００または６０,０００であること、および１ウェルあたり１
０,０００の生殖腺細胞を播種することを示し、そして「４０／２０」、「５０
／２０」および「６０／２０」という表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあた
り４０,０００、５０,０００または６０,０００であること、および１ウェルあ
たり２０,０００の生殖腺細胞を播種することを示す。
【００２０】
図３Ｂは、１ウェルあたり１０,０００または２０,０００の生殖腺細胞（図３
Ｂに提示する凡例では、「１０」および「２０」として示す）を播種した後の、
様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,
０００−図３Ｂに提示する凡例では、「４０」、「５０」および「６０」として
示す）での生殖腺ＰＧＣの増殖を図示する棒グラフである。このように、図３Ｂ
に提示する凡例では、「４０／１０」、「５０／１０」および「６０／１０」と
いう表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあたり４０,０００、５０,０００また
は６０,０００であること、および１ウェルあたり１０,０００の生殖腺細胞を播
種することを示し、そして「４０／２０」、「５０／２０」および「６０／２０
」という表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあたり４０,０００、５０,０００
または６０,０００であること、および１ウェルあたり２０,０００の生殖腺細胞
を播種することを示す。２０,０００の生殖腺細胞 対 １０,０００の生殖腺細胞
を使用すると、個々のＰＧＣの増殖はより高かった（Ｐ＜０.０５）。同様に、
５日後に形成されたＳＳＥＡ−１陽性コロニーの数は、播種した生殖腺細胞の数
に依存した。
Ｂに提示する凡例では、「１０」および「２０」として示す）を播種した後の、
様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,
０００−図３Ｂに提示する凡例では、「４０」、「５０」および「６０」として
示す）での生殖腺ＰＧＣの増殖を図示する棒グラフである。このように、図３Ｂ
に提示する凡例では、「４０／１０」、「５０／１０」および「６０／１０」と
いう表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあたり４０,０００、５０,０００また
は６０,０００であること、および１ウェルあたり１０,０００の生殖腺細胞を播
種することを示し、そして「４０／２０」、「５０／２０」および「６０／２０
」という表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあたり４０,０００、５０,０００
または６０,０００であること、および１ウェルあたり２０,０００の生殖腺細胞
を播種することを示す。２０,０００の生殖腺細胞 対 １０,０００の生殖腺細胞
を使用すると、個々のＰＧＣの増殖はより高かった（Ｐ＜０.０５）。同様に、
５日後に形成されたＳＳＥＡ−１陽性コロニーの数は、播種した生殖腺細胞の数
に依存した。
【００２１】
図４は、図３に関して上記したような、ＳＴＯ細胞で５日間培養したニワトリ
生殖腺細胞のＳＳＥＡ−１染色を示す一連の写真である。
生殖腺細胞のＳＳＥＡ−１染色を示す一連の写真である。
【００２２】
図４Ａは、個々のＳＳＥＡ−１陽性ＰＧＣを示す、新たに播種した培養物（０
日）を図示する。培養を開始した時点では、ＰＧＣのみがＳＳＥＡ−１エピトー
プに対して陽性であった。
日）を図示する。培養を開始した時点では、ＰＧＣのみがＳＳＥＡ−１エピトー
プに対して陽性であった。
【００２３】
図４Ｂは、３日間培養した後の、ＳＳＥＡ−１陽性ＥＳ細胞のコロニーを図示
する。
する。
【００２４】
図４Ｃは、３日間培養した後の、ＰＧＣにより誘導されたＥＳ細胞の大きなコ
ロニーを図示する。
ロニーを図示する。
【００２５】
図４Ｄは、ＳＳＥＡ−１で染色した３日間の培養物の低倍率像を図示する。個
々に染色したＰＧＣおよびＳＳＥＡ−１陽性ＥＳ細胞のコロニーに注目されたい
。
々に染色したＰＧＣおよびＳＳＥＡ−１陽性ＥＳ細胞のコロニーに注目されたい
。
【００２６】
図４Ｅは、５日間培養した後の、ＥＳ細胞コロニーのＳＳＥＡ−１染色を図示
する。
する。
【００２７】
図４Ｆは、５日間培養した後の、ＰＧＣにより誘導されたＥＳ細胞コロニーの
高倍率像を図示する。
高倍率像を図示する。
【００２８】
発明の詳細な説明
哺乳動物において、生殖隆起から培養した始原生殖細胞は、多能性胚幹細胞を
発生させる能力を有する。しかしながら、トリ（ＰＧＣ）の培養物に関する報告
は、ＰＧＣ表現型を保持する努力および増殖を刺激する努力に集中している。そ
こで、本発明の目的は、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の発生をト
リＰＧＣから可能とする方法を開発して提供することであった。
発生させる能力を有する。しかしながら、トリ（ＰＧＣ）の培養物に関する報告
は、ＰＧＣ表現型を保持する努力および増殖を刺激する努力に集中している。そ
こで、本発明の目的は、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の発生をト
リＰＧＣから可能とする方法を開発して提供することであった。
【００２９】
例えば、Ｈoganの１９９７年１１月２５日に発行された米国特許第５,６９０,
９２６号、Ｈoganの１９９７年９月２３日に発行された米国特許第５,６７０,３
７２号、およびＨoganの１９９５年９月２６日に発行された米国特許第５,５３
７,３５７号に開示されているように、ＰＧＣを哺乳動物の胚から単離するのと
は違って、本発明に従って単離した始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞は、
相当な数のストローマ細胞も含んでなる。ストローマ細胞の存在は、哺乳動物の
システムでは観察されない本発明の方法の開発に複雑さを加える。
９２６号、Ｈoganの１９９７年９月２３日に発行された米国特許第５,６７０,３
７２号、およびＨoganの１９９５年９月２６日に発行された米国特許第５,５３
７,３５７号に開示されているように、ＰＧＣを哺乳動物の胚から単離するのと
は違って、本発明に従って単離した始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞は、
相当な数のストローマ細胞も含んでなる。ストローマ細胞の存在は、哺乳動物の
システムでは観察されない本発明の方法の開発に複雑さを加える。
【００３０】
次の用語は、当業者により十分理解されると思われるが、本発明の説明を容易
にするために、次の定義を詳述する。
にするために、次の定義を詳述する。
【００３１】
本明細書中で使用する「トリ」という用語は、限定されるものではないが、Ｇ
allinacea sp.、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよび
キジを含め、全てのトリ種をいう。ニワトリが一般に好ましい。
allinacea sp.、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよび
キジを含め、全てのトリ種をいう。ニワトリが一般に好ましい。
【００３２】
ＥＳ細胞およびＥＳ細胞培養物に関して本明細書中で使用する「持続性」とい
う用語は、たとえ細胞が最終的に老化を被るとしても、さらなる細胞分裂をする
ことができる細胞または細胞培養物をいう。
う用語は、たとえ細胞が最終的に老化を被るとしても、さらなる細胞分裂をする
ことができる細胞または細胞培養物をいう。
【００３３】
「胚幹細胞表現型」という語句は、大きな核、突出した核小体、および小さな
細胞質を有する、未分化のトリ細胞をいう。
細胞質を有する、未分化のトリ細胞をいう。
【００３４】
ＬＩＦおよびbＦＧＦの存在下にＳＴＯフィーダー細胞単層で保持されるマウ
スＰＧＣは、胚幹細胞に似ている細胞を結果的にもたらすことが報告されている
。Ｒesnickら，Ｎature ３５９：５５０−５５１（１９９２）；Ｍatsuiら，Ｃe
ll ７０：８４１−８４３（１９９２）を参照されたい。Ｒesnickら，Ｎature
３５９：５５０−５５１（１９９２）は、そのような細胞を、便宜上、「胚細胞
」（ＥＧ）と名付けて、それらがインビボでＰＧＣから派生したという意味を含
めることを提唱した。しかしながら、当業者の間では、胚生殖細胞および胚幹細
胞は、それらが（幾つかの遺伝子のメチル化での相違が報告されているにもかか
わらず）顕微鏡検査で同一であるように見え、同一の免疫学的マーカーを示すと
いう点で表現型的に同一であり、そして両方とも培養で広く分化して、胚盤胞へ
と注入した場合にはキメラに与えられることから、それらの多能性および全能性
を実証することを示しているという点で機能的に同一であることが認識されてい
る。従って、「胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞」という語句は、ト
リ始原生殖細胞から誘導された細胞を包含し、それゆえに、本発明の方法に従っ
て培養した細胞を記載するために使用する。
スＰＧＣは、胚幹細胞に似ている細胞を結果的にもたらすことが報告されている
。Ｒesnickら，Ｎature ３５９：５５０−５５１（１９９２）；Ｍatsuiら，Ｃe
ll ７０：８４１−８４３（１９９２）を参照されたい。Ｒesnickら，Ｎature
３５９：５５０−５５１（１９９２）は、そのような細胞を、便宜上、「胚細胞
」（ＥＧ）と名付けて、それらがインビボでＰＧＣから派生したという意味を含
めることを提唱した。しかしながら、当業者の間では、胚生殖細胞および胚幹細
胞は、それらが（幾つかの遺伝子のメチル化での相違が報告されているにもかか
わらず）顕微鏡検査で同一であるように見え、同一の免疫学的マーカーを示すと
いう点で表現型的に同一であり、そして両方とも培養で広く分化して、胚盤胞へ
と注入した場合にはキメラに与えられることから、それらの多能性および全能性
を実証することを示しているという点で機能的に同一であることが認識されてい
る。従って、「胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞」という語句は、ト
リ始原生殖細胞から誘導された細胞を包含し、それゆえに、本発明の方法に従っ
て培養した細胞を記載するために使用する。
【００３５】
長年にわたる特許法条約に従い、「a」および「an」という用語は、特許請求
の範囲を含め、本出願で使用する場合には「１以上」を意味する。
の範囲を含め、本出願で使用する場合には「１以上」を意味する。
【００３６】
本発明を実施するために細胞を得るトリ胚は、原条形成後の時期のものである
のが好ましく、そして性分化より前の時期のものであるのが好ましい。本発明を
実施するために細胞を得るトリ胚は、１７、１８、１９、２０および２１期を含
め、好ましくは１４期以降のもの、より好ましくは１４期〜４５期のもの、さら
により好ましくは１５期〜３１期のものであって、最も好ましくはＨanburgerお
よびＨamilton（Ｈ ＆ Ｈ）ステージングシステムでの発生の２７〜３０期のも
のである。
のが好ましく、そして性分化より前の時期のものであるのが好ましい。本発明を
実施するために細胞を得るトリ胚は、１７、１８、１９、２０および２１期を含
め、好ましくは１４期以降のもの、より好ましくは１４期〜４５期のもの、さら
により好ましくは１５期〜３１期のものであって、最も好ましくはＨanburgerお
よびＨamilton（Ｈ ＆ Ｈ）ステージングシステムでの発生の２７〜３０期のも
のである。
【００３７】
そのような胚は、便利には、約５５〜約１６８時間（すなわち、約２〜約７日
間）、より好ましくは約７２〜約１６８時間（すなわち、約３〜７日間）、さら
により好ましくは約９６〜約１６８時間（すなわち、約４〜７日間）、そしてさ
らにより好ましくは約９６〜約１２０時間（すなわち、約４〜５日間）インキュ
ベートした受精卵から得るのがよい。好ましい態様において、胚生殖腺ＰＧＣお
よびストローマ細胞は、ＥＤＴＡおよび／または緩衝溶液といったような適当な
溶液を使用して、胚生殖腺から集めるのがよい。好ましくは、単細胞懸濁液を得
るよう注意する。
間）、より好ましくは約７２〜約１６８時間（すなわち、約３〜７日間）、さら
により好ましくは約９６〜約１６８時間（すなわち、約４〜７日間）、そしてさ
らにより好ましくは約９６〜約１２０時間（すなわち、約４〜５日間）インキュ
ベートした受精卵から得るのがよい。好ましい態様において、胚生殖腺ＰＧＣお
よびストローマ細胞は、ＥＤＴＡおよび／または緩衝溶液といったような適当な
溶液を使用して、胚生殖腺から集めるのがよい。好ましくは、単細胞懸濁液を得
るよう注意する。
【００３８】
このように、本発明の態様は、トリ胚から集めた始原生殖細胞を含有するトリ
生殖腺細胞からの、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の取得に関係す
る。本発明の開示より前は、当業者の間では、例えば、胚が生殖腺発生と関連の
ある時期に達したら、トリ胚生殖隆起または生殖腺から集めるのがよいといった
ような、始原生殖細胞を含有するトリ胚生殖腺細胞は、最後には生殖細胞のみに
分化するというのが一般的見解であった。本発明は、例えば、トリ胚の生殖隆起
または生殖腺から集めた始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞の一部が、胚幹
細胞表現型を発現する未分化の細胞になることを示す。これゆえに、本発明の方
法は、始原生殖細胞を、例えば、生殖隆起または生殖腺から、より多くの数で単
離するのがよい、胚幹細胞表現型を発現する未分化の細胞を培養する間、便宜性
を提供し、そして典型的には、より進歩したトリ胚の開発から考えて、単離する
のがより容易である。
生殖腺細胞からの、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の取得に関係す
る。本発明の開示より前は、当業者の間では、例えば、胚が生殖腺発生と関連の
ある時期に達したら、トリ胚生殖隆起または生殖腺から集めるのがよいといった
ような、始原生殖細胞を含有するトリ胚生殖腺細胞は、最後には生殖細胞のみに
分化するというのが一般的見解であった。本発明は、例えば、トリ胚の生殖隆起
または生殖腺から集めた始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞の一部が、胚幹
細胞表現型を発現する未分化の細胞になることを示す。これゆえに、本発明の方
法は、始原生殖細胞を、例えば、生殖隆起または生殖腺から、より多くの数で単
離するのがよい、胚幹細胞表現型を発現する未分化の細胞を培養する間、便宜性
を提供し、そして典型的には、より進歩したトリ胚の開発から考えて、単離する
のがより容易である。
【００３９】
典型的には、本発明の培養物には、本明細書中に定義するフィーダーマトリッ
クスが含まれる。フィーダーマトリックスは、ＥＳＣを得る目的で培養した細胞
またはセルラインのいずれかであり得る。あるいはまた、フィーダーマトリック
スは、始原生殖細胞が局在する器官もしくは組織、例えば、生殖腺から誘導する
ことができるか、またはそれらの器官もしくは組織により提供され得る。あるい
はまた、フィーダーマトリックスを含んでなるフィーダー細胞は、結合した増殖
因子を加えた細胞間マトリックスで置換することができる。
クスが含まれる。フィーダーマトリックスは、ＥＳＣを得る目的で培養した細胞
またはセルラインのいずれかであり得る。あるいはまた、フィーダーマトリック
スは、始原生殖細胞が局在する器官もしくは組織、例えば、生殖腺から誘導する
ことができるか、またはそれらの器官もしくは組織により提供され得る。あるい
はまた、フィーダーマトリックスを含んでなるフィーダー細胞は、結合した増殖
因子を加えた細胞間マトリックスで置換することができる。
【００４０】
当業界で知られている手順に従って、本明細書中で使用するフィーダーマトリ
ックスを構築する。上述したように、フィーダーマトリックスを予め調整してお
くのが好ましい。「予め調整しておく」という用語は、始原生殖細胞を含有する
生殖腺細胞をフィーダーマトリックスと接触させて置くより前の時間、例えば、
フィーダーマトリックスによる増殖因子または他の因子の産生を開始させて確立
するのに十分な時間、フィーダーマトリックスを培地の存在下に培養することを
意味する。実験例に開示するように、始原生殖細胞を含有する生殖腺細胞をフィ
ーダーマトリックスと接触させて置くより前に、フィーダーマトリックス自体を
１〜２日間培養することにより、フィーダーマトリックスを予め調整しておく。
ックスを構築する。上述したように、フィーダーマトリックスを予め調整してお
くのが好ましい。「予め調整しておく」という用語は、始原生殖細胞を含有する
生殖腺細胞をフィーダーマトリックスと接触させて置くより前の時間、例えば、
フィーダーマトリックスによる増殖因子または他の因子の産生を開始させて確立
するのに十分な時間、フィーダーマトリックスを培地の存在下に培養することを
意味する。実験例に開示するように、始原生殖細胞を含有する生殖腺細胞をフィ
ーダーマトリックスと接触させて置くより前に、フィーダーマトリックス自体を
１〜２日間培養することにより、フィーダーマトリックスを予め調整しておく。
【００４１】
そのフィーダーマトリックスは、マウス繊維芽細胞を含んでなるのが好ましい
。ＳＴＯ繊維芽細胞が好ましいが、一次繊維芽細胞も適当である。そしてまた、
本発明は、マウス細胞フィーダーマトリックスの用途に関して記載しているが、
他のマウス種（例えば、ラット）；他の哺乳動物の種（例えば、有蹄動物、ウシ
およびブタ種）；またはトリ種（例えば、Ｇallinacea、ニワトリ、シチメンチ
ョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジ）からの細胞を含んでなるフィーダ
ーマトリックスを使用してもよいことを意図する。
。ＳＴＯ繊維芽細胞が好ましいが、一次繊維芽細胞も適当である。そしてまた、
本発明は、マウス細胞フィーダーマトリックスの用途に関して記載しているが、
他のマウス種（例えば、ラット）；他の哺乳動物の種（例えば、有蹄動物、ウシ
およびブタ種）；またはトリ種（例えば、Ｇallinacea、ニワトリ、シチメンチ
ョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジ）からの細胞を含んでなるフィーダ
ーマトリックスを使用してもよいことを意図する。
【００４２】
本発明の培養方法は、場合により、フィーダー細胞の単層を確立することを含
んでなるのがよい。標準的な技術を使用して、フィーダー細胞を有糸分裂により
不活性化するのがよい。例えば、フィーダー細胞を、γ放射線（例えば、４００
ラドのγ放射線）にさらすのがよいか、またはマイトマイシンＣ（例えば、１０
μg／ml、２−３時間）で処理するのがよい。細胞を有糸分裂により不活性化す
る手順は、典型的には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ），１０８０１ Ｕniversity Ｂoulevard，Ｍanassas，ＶＡ ２０１１０−
２２０９から細胞（例えば、ＳＴＯフィーダー細胞は、ＡＴＣＣ受託番号 １５
０３の下に入手可能である）と共に送られる情報にも詳述されている。単層は、
場合により、約８０％の集密度まで、好ましくは約９０％の集密度まで、そして
より好ましくは約１００％の集密度まで培養するのがよい。フィーダー細胞の単
層としての構造は、培養物に好ましい構造であるが、全ての適当な構造が本発明
の範囲内のものであることを意図する。このように、例えば、フィーダー細胞の
層、単層、集合体、凝集体または他の会合体もしくは群集体は、本発明の範囲内
に入ることを意図し、そして特に「マトリックス」という用語の意味に入ること
を意図する。
んでなるのがよい。標準的な技術を使用して、フィーダー細胞を有糸分裂により
不活性化するのがよい。例えば、フィーダー細胞を、γ放射線（例えば、４００
ラドのγ放射線）にさらすのがよいか、またはマイトマイシンＣ（例えば、１０
μg／ml、２−３時間）で処理するのがよい。細胞を有糸分裂により不活性化す
る手順は、典型的には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ），１０８０１ Ｕniversity Ｂoulevard，Ｍanassas，ＶＡ ２０１１０−
２２０９から細胞（例えば、ＳＴＯフィーダー細胞は、ＡＴＣＣ受託番号 １５
０３の下に入手可能である）と共に送られる情報にも詳述されている。単層は、
場合により、約８０％の集密度まで、好ましくは約９０％の集密度まで、そして
より好ましくは約１００％の集密度まで培養するのがよい。フィーダー細胞の単
層としての構造は、培養物に好ましい構造であるが、全ての適当な構造が本発明
の範囲内のものであることを意図する。このように、例えば、フィーダー細胞の
層、単層、集合体、凝集体または他の会合体もしくは群集体は、本発明の範囲内
に入ることを意図し、そして特に「マトリックス」という用語の意味に入ること
を意図する。
【００４３】
このように、トリＰＧＣは、細胞凝集体が形成されるよう、縦に、横に、斜め
に、またはそれら全ての組み合わせで、不均一に拡張することができる。本発明
に従って、このように、ＰＧＣを適当なフィーダー細胞と混合して、その細胞を
マルチウェルプレートのような適当な培養容器へと挿入することにより、培養物
を形成することができることを意図する。
に、またはそれら全ての組み合わせで、不均一に拡張することができる。本発明
に従って、このように、ＰＧＣを適当なフィーダー細胞と混合して、その細胞を
マルチウェルプレートのような適当な培養容器へと挿入することにより、培養物
を形成することができることを意図する。
【００４４】
本発明を実施する際に使用する培地は、全ての適当な培地であるのがよい。そ
の培地は、調整培地または合成培地であるのがよく、これらは両方とも当業界で
知られている。調整培地、そして特にＢＲＬ調整培地が一般に好ましい。例とし
て、Ｓmith，Ａ. Ｇ.およびＨooper，Ｍ. Ｌ.，Ｄev. Ｂiol. １９８７年５月；
１２１（１）：１−９により記載されているような、当業界で認識されている技
術に従って、ＢＲＬ調整培地を作成する。ＢＲＬ細胞は、ＡＴＣＣから受託番号
ＣＲＬ−１４４２の下に入手可能である。場合により、その培地には、限定さ
れるものではないが、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧ
Ｆ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bＦＧＦ）
、幹細胞因子（ＳＣＦ−スチール因子またはＳＦとも呼ばれる）、トランスフォ
ーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）および抗レチノイン酸を含め、増殖因
子を補うのがよい。
の培地は、調整培地または合成培地であるのがよく、これらは両方とも当業界で
知られている。調整培地、そして特にＢＲＬ調整培地が一般に好ましい。例とし
て、Ｓmith，Ａ. Ｇ.およびＨooper，Ｍ. Ｌ.，Ｄev. Ｂiol. １９８７年５月；
１２１（１）：１−９により記載されているような、当業界で認識されている技
術に従って、ＢＲＬ調整培地を作成する。ＢＲＬ細胞は、ＡＴＣＣから受託番号
ＣＲＬ−１４４２の下に入手可能である。場合により、その培地には、限定さ
れるものではないが、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧ
Ｆ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bＦＧＦ）
、幹細胞因子（ＳＣＦ−スチール因子またはＳＦとも呼ばれる）、トランスフォ
ーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）および抗レチノイン酸を含め、増殖因
子を補うのがよい。
【００４５】
好ましい態様において、４〜５日間インキュベートしたトリ胚からの始原生殖
細胞を含有するトリ胚生殖腺細胞を、調整培地と共に、予め調整しておいたフィ
ーダーマトリックスへと播種すると、そのトリ細胞は、胚幹細胞表現型を示す細
胞のネストまたはコロニーを発生させる。哺乳動物の幹細胞での場合とは違って
、予め調整しておいたフィーダーマトリックスを有して、ＥＳＣ表現型を発現す
る未分化のトリ細胞へのトリＰＧＣの生存および発生を容易にするのが一般に好
ましい。本発明のトリ胚細胞は、一次細胞培養物に典型的であるように、少なく
とも１または２ヶ月間培養することができ、これは、インキュベートしていない
トリ胚からの細胞の一次培養物の通常２週間の寿命より相当長い。
細胞を含有するトリ胚生殖腺細胞を、調整培地と共に、予め調整しておいたフィ
ーダーマトリックスへと播種すると、そのトリ細胞は、胚幹細胞表現型を示す細
胞のネストまたはコロニーを発生させる。哺乳動物の幹細胞での場合とは違って
、予め調整しておいたフィーダーマトリックスを有して、ＥＳＣ表現型を発現す
る未分化のトリ細胞へのトリＰＧＣの生存および発生を容易にするのが一般に好
ましい。本発明のトリ胚細胞は、一次細胞培養物に典型的であるように、少なく
とも１または２ヶ月間培養することができ、これは、インキュベートしていない
トリ胚からの細胞の一次培養物の通常２週間の寿命より相当長い。
【００４６】
本発明の細胞培養物は、動物に投与するために、細胞を（例えば、機械的分離
により）分離して、その細胞を薬学的に許容され得る担体（例えば、リン酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ）溶液）と完全に混合することにより製剤化するのがよい。その
ような製剤でのトリ細胞を作成して、非相同ＤＮＡ配列を以下により多く詳細に
記載する方法でトリ被験対象へと運ぶのがよい。
により）分離して、その細胞を薬学的に許容され得る担体（例えば、リン酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ）溶液）と完全に混合することにより製剤化するのがよい。その
ような製剤でのトリ細胞を作成して、非相同ＤＮＡ配列を以下により多く詳細に
記載する方法でトリ被験対象へと運ぶのがよい。
【００４７】
本発明の方法により取得される未分化のトリ細胞は、とりわけ、発生学上の開
発試験（すなわち、その細胞をマーカー遺伝子で標識して、インビボに注入した
後、それらの分布を観察することによる）およびトランスジェニック家禽の産生
のためのツールとして有用である。それらは、トランスジェニック家禽の産生に
対して相同的組換えの適用を可能とするのに有用である。
発試験（すなわち、その細胞をマーカー遺伝子で標識して、インビボに注入した
後、それらの分布を観察することによる）およびトランスジェニック家禽の産生
のためのツールとして有用である。それらは、トランスジェニック家禽の産生に
対して相同的組換えの適用を可能とするのに有用である。
【００４８】
胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞は、トランスジェニックのキメラ
のトリを含め、キメラのトリの産生にも有用であるべきである。トランスジェニ
ックのキメラのトリは、異種タンパク質の回収に有用であろうことを意図し、こ
れは、そのようなキメラのトランスジェニックのトリの卵から直接回収すること
ができるのが好ましい。例えば、そのようなトリは、治療用タンパク質および他
のポリペプチドの産生および回収に使用することができる。
のトリを含め、キメラのトリの産生にも有用であるべきである。トランスジェニ
ックのキメラのトリは、異種タンパク質の回収に有用であろうことを意図し、こ
れは、そのようなキメラのトランスジェニックのトリの卵から直接回収すること
ができるのが好ましい。例えば、そのようなトリは、治療用タンパク質および他
のポリペプチドの産生および回収に使用することができる。
【００４９】
トリ種において、レシピエントの胚へと注入した場合に生存能力を保有する、
あるドナーの細胞型を単離している。Ｅtchesら，Ｐoultry Ｓcience ７２：８
８２−８８７（１９９３）；Ｅtchesら，Ａvian Ｉncubationにおいて，第２２
章、Ｂutterworth Ｐublishers（１９９０）；Ｖerrinder Ｇibbinsら，Ｆourth
Ｗorld Ｃongress on Ｇenetics Ａpplied to Ｌivestock Ｐroduction，Ｅdin
burgh（１９９０）；Ｐetitteら，Ｄevelopment １０８，１８５−１８９（１９
９０）を参照されたい。これらの試験は、Ｘ期の胚（産卵時の胚）から誘導され
た胞胚葉細胞が、比較可能なレシピエントのＸ期の胚に移された場合でも生存能
力を持ったままであることを示した。このように、本発明は、トリの表現型を変
える新たな方法、および本明細書中に開示するトリ胚幹細胞でそのように産生さ
れたトリを提供する。その方法は、本明細書中に開示するトリ胚幹細胞にインビ
トロでＤＮＡ配列を（例えば、レトロウイルスベクターでの電気穿孔またはトラ
ンスフォーメーションにより）トランスフェクトした後、そのトランスフェクト
した胚幹細胞を、孵化後のトリにおいて表現型の変化（例えば、タンパク質発現
の変化、増殖率、試料効率、疾患抵抗性、またはこれらの因子全ての組み合わせ
の変化）をもたらすのに有効であるＤＮＡ配列と共に、胚トリを含有する卵へと
（例えば、卵黄嚢へと、または漿尿膜へと、好ましくは胚下腔へと、そして好ま
しくは初期の胚発生の間に（例えば、インキュベーションの２または３日前に、
そして最も好ましくはインキュベーションの１日前に））注入することを含んで
なる。
あるドナーの細胞型を単離している。Ｅtchesら，Ｐoultry Ｓcience ７２：８
８２−８８７（１９９３）；Ｅtchesら，Ａvian Ｉncubationにおいて，第２２
章、Ｂutterworth Ｐublishers（１９９０）；Ｖerrinder Ｇibbinsら，Ｆourth
Ｗorld Ｃongress on Ｇenetics Ａpplied to Ｌivestock Ｐroduction，Ｅdin
burgh（１９９０）；Ｐetitteら，Ｄevelopment １０８，１８５−１８９（１９
９０）を参照されたい。これらの試験は、Ｘ期の胚（産卵時の胚）から誘導され
た胞胚葉細胞が、比較可能なレシピエントのＸ期の胚に移された場合でも生存能
力を持ったままであることを示した。このように、本発明は、トリの表現型を変
える新たな方法、および本明細書中に開示するトリ胚幹細胞でそのように産生さ
れたトリを提供する。その方法は、本明細書中に開示するトリ胚幹細胞にインビ
トロでＤＮＡ配列を（例えば、レトロウイルスベクターでの電気穿孔またはトラ
ンスフォーメーションにより）トランスフェクトした後、そのトランスフェクト
した胚幹細胞を、孵化後のトリにおいて表現型の変化（例えば、タンパク質発現
の変化、増殖率、試料効率、疾患抵抗性、またはこれらの因子全ての組み合わせ
の変化）をもたらすのに有効であるＤＮＡ配列と共に、胚トリを含有する卵へと
（例えば、卵黄嚢へと、または漿尿膜へと、好ましくは胚下腔へと、そして好ま
しくは初期の胚発生の間に（例えば、インキュベーションの２または３日前に、
そして最も好ましくはインキュベーションの１日前に））注入することを含んで
なる。
【００５０】
好ましくは、ＤＮＡを導入する卵を孵化するまでインキュベートして、そのよ
うに産生されたトリを少なくとも表現型の変化が現れる年齢まで育てる。全ての
適当な方法で測定する測定可能な表現型の変化を誘起するのに十分な孵化後の動
物において、生理反応が得られる限り、トランスフォームした胚およびトリがキ
メラであるならば、それは有害な結果のものではない。さらなる例として、キメ
ラ、またはＤＮＡ配列の生殖系列伝達により産生されるそのトランスジェニック
子孫におけるタンパク質発現は、プロモーターを誘発する薬剤での、キメラまた
はそのトランスジェニック子孫の処置で結合した、導入されたＤＮＡ配列への誘
発可能なプロモーターの取り込みによって確立され得る。
うに産生されたトリを少なくとも表現型の変化が現れる年齢まで育てる。全ての
適当な方法で測定する測定可能な表現型の変化を誘起するのに十分な孵化後の動
物において、生理反応が得られる限り、トランスフォームした胚およびトリがキ
メラであるならば、それは有害な結果のものではない。さらなる例として、キメ
ラ、またはＤＮＡ配列の生殖系列伝達により産生されるそのトランスジェニック
子孫におけるタンパク質発現は、プロモーターを誘発する薬剤での、キメラまた
はそのトランスジェニック子孫の処置で結合した、導入されたＤＮＡ配列への誘
発可能なプロモーターの取り込みによって確立され得る。
【００５１】
インオボ(in ovo)注入の機構は重要ではないが、その方法は、その処置が孵化
率を減少させないよう、胚の組織および器官並びにその周囲の胚外膜を過度に損
傷しないのが好ましい。例えば、出願人は、卵に窓を形成させた後、直径５０μ
mのマイクロピペットまたは直径５０μmの針といったような注入用マイクロピペ
ットまたは針を使用することにより、インオボ注入を実施している。所望ならば
、その卵をワックス等のような実質的に細菌不透過性のシーリング物質でシール
して、その後の望ましくない細菌の侵入を防ぐことができる。適当なシーリング
物質は、場合により、生物学的に許容され得る抗菌組成物を含んでなるのがよい
。
率を減少させないよう、胚の組織および器官並びにその周囲の胚外膜を過度に損
傷しないのが好ましい。例えば、出願人は、卵に窓を形成させた後、直径５０μ
mのマイクロピペットまたは直径５０μmの針といったような注入用マイクロピペ
ットまたは針を使用することにより、インオボ注入を実施している。所望ならば
、その卵をワックス等のような実質的に細菌不透過性のシーリング物質でシール
して、その後の望ましくない細菌の侵入を防ぐことができる。適当なシーリング
物質は、場合により、生物学的に許容され得る抗菌組成物を含んでなるのがよい
。
【００５２】
トリ胚のための高速自動注入システムは、特に本発明を実施するのに適当であ
ろうことが予想される。本発明を実施するのに適したそのような装置は全て、本
明細書中に記載する胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞を含む注入器を
含んでなり、その注入器は、その装置により卵にＤＮＡを注入するよう位置する
。加えて、その注入後の卵における穴をシールするために、操作上、注入と関連
のあるシーリング装置を与えるのがよい。
ろうことが予想される。本発明を実施するのに適したそのような装置は全て、本
明細書中に記載する胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞を含む注入器を
含んでなり、その注入器は、その装置により卵にＤＮＡを注入するよう位置する
。加えて、その注入後の卵における穴をシールするために、操作上、注入と関連
のあるシーリング装置を与えるのがよい。
【００５３】
本発明の胚幹細胞と共にインオボで導入したＤＮＡ配列は、一般に、トリ細胞
で機能的なプロモーター、およびそのプロモーターに操作可能なように結合させ
たペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含んでなる構築物である。好
ましくは、そのタンパク質またはペプチドは、生理学的に活性であって、トリに
おける表現型の変化を引き起こすことができる。一般に、ＤＮＡ構築物は、リポ
ソーム、リン酸カルシウム、電気穿孔またはＤＭＳＯといったような、当業界で
知られている様々な技術を使用して、本発明の胚幹細胞をトランスフォームする
ための、（電気穿孔により本発明の胚幹細胞へと導入された）線状ＤＮＡ配列、
またはベクターもしくは他の適当な担体により運ばれる配列であるのがよい。以
下に論ずるベクターは、天然型またはその誘導体のどちらかでの、プラスミド、
ウイルス（レトロウイルスを含む）およびファージであるのがよい。
で機能的なプロモーター、およびそのプロモーターに操作可能なように結合させ
たペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含んでなる構築物である。好
ましくは、そのタンパク質またはペプチドは、生理学的に活性であって、トリに
おける表現型の変化を引き起こすことができる。一般に、ＤＮＡ構築物は、リポ
ソーム、リン酸カルシウム、電気穿孔またはＤＭＳＯといったような、当業界で
知られている様々な技術を使用して、本発明の胚幹細胞をトランスフォームする
ための、（電気穿孔により本発明の胚幹細胞へと導入された）線状ＤＮＡ配列、
またはベクターもしくは他の適当な担体により運ばれる配列であるのがよい。以
下に論ずるベクターは、天然型またはその誘導体のどちらかでの、プラスミド、
ウイルス（レトロウイルスを含む）およびファージであるのがよい。
【００５４】
タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子の実例は、成長ホルモン、甲状
腺放出ホルモン（ＴＲＨ）、ＭarekのＭＤＸ、およびコクシジウム症のための抗
原のような免疫原性組換え抗原よりなる群から選択されるタンパク質またはペプ
チドをコードする遺伝子である。
腺放出ホルモン（ＴＲＨ）、ＭarekのＭＤＸ、およびコクシジウム症のための抗
原のような免疫原性組換え抗原よりなる群から選択されるタンパク質またはペプ
チドをコードする遺伝子である。
【００５５】
遺伝子光学による、クローン遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、トランスフォ
ームした宿主細胞、タンパク質およびタンパク質フラグメントの産生は十分知ら
れている。例えば、Ｂellらの米国特許第４,７６１,３７１号，第６コラム第３
行〜第９コラム第６５行；Ｃlarkらの米国特許第４,８７７,７２９号，第４コラ
ム第３８行〜第７コラム第６行；Ｓchillingの米国特許第４,９１２,０３８号，
第３コラム第２６行〜第１４コラム第１２行を参照されたい。制限エンドヌクレ
アーゼ消化、ベクターの作成、ＤＮＡ精製および他のそのような手順のためのプ
ロトコルは、本質的には、標準的なクローニングマニュアルに記載されている通
りである。Ｓambrookら，Ｍolecular Ｃloning，a Ｌaboratory Ｍanual（第２
版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress，Ｎ.Ｙ.（１９８９）を参照されたい。
ームした宿主細胞、タンパク質およびタンパク質フラグメントの産生は十分知ら
れている。例えば、Ｂellらの米国特許第４,７６１,３７１号，第６コラム第３
行〜第９コラム第６５行；Ｃlarkらの米国特許第４,８７７,７２９号，第４コラ
ム第３８行〜第７コラム第６行；Ｓchillingの米国特許第４,９１２,０３８号，
第３コラム第２６行〜第１４コラム第１２行を参照されたい。制限エンドヌクレ
アーゼ消化、ベクターの作成、ＤＮＡ精製および他のそのような手順のためのプ
ロトコルは、本質的には、標準的なクローニングマニュアルに記載されている通
りである。Ｓambrookら，Ｍolecular Ｃloning，a Ｌaboratory Ｍanual（第２
版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress，Ｎ.Ｙ.（１９８９）を参照されたい。
【００５６】
ベクターは、問題となる遺伝子をコードするＤＮＡを増幅および／または発現
させるために本明細書中で使用する製可能なＤＮＡ構築物である。適当な発現ベ
クターは、そのベクターを正しい宿主へと導入した場合にクローンcＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡを正しい方向で発現させることができる調節要素を有するであろ
う。そのような要素には、典型的には、限定されるものではないが、転写に関与
する細胞タンパク質と特異的に相互作用するプロモーター領域、または誘発剤の
投与により誘発可能であり得るプロモーター領域、結合した非相同プロモーター
、スプライスアクセプターおよび／またはドナー配列からの転写を何倍も刺激す
ることができるエンハンサー要素、並びに終止およびポリアデニル化シグナルが
含まれる。翻訳を可能とすることができるリボソーム結合部位のための配列も必
要であって、これを発現させるべき遺伝子に操作可能なように結合させる。最近
、骨格筋構造遺伝子および必須近位プロモーター配列の両方の上流に位置して、
操作可能なように互いに関連する、筋肉に特異的なプロモーターが単離された（
ＭarおよびＯrdahl，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８５，６４０４−６
４０８（１９８８））。ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、アデノウ
イルス、サイトメガロウイルス）、ファージ、および組換えにより宿主ゲノムへ
と組み込み可能なＤＮＡフラグメントを含んでなる。そのベクターは、場合によ
り、独立して宿主ゲノムを複製して機能するのがよく、または幾つかの場合には
、ゲノム自体へと組み込むのがよい。
させるために本明細書中で使用する製可能なＤＮＡ構築物である。適当な発現ベ
クターは、そのベクターを正しい宿主へと導入した場合にクローンcＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡを正しい方向で発現させることができる調節要素を有するであろ
う。そのような要素には、典型的には、限定されるものではないが、転写に関与
する細胞タンパク質と特異的に相互作用するプロモーター領域、または誘発剤の
投与により誘発可能であり得るプロモーター領域、結合した非相同プロモーター
、スプライスアクセプターおよび／またはドナー配列からの転写を何倍も刺激す
ることができるエンハンサー要素、並びに終止およびポリアデニル化シグナルが
含まれる。翻訳を可能とすることができるリボソーム結合部位のための配列も必
要であって、これを発現させるべき遺伝子に操作可能なように結合させる。最近
、骨格筋構造遺伝子および必須近位プロモーター配列の両方の上流に位置して、
操作可能なように互いに関連する、筋肉に特異的なプロモーターが単離された（
ＭarおよびＯrdahl，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８５，６４０４−６
４０８（１９８８））。ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、アデノウ
イルス、サイトメガロウイルス）、ファージ、および組換えにより宿主ゲノムへ
と組み込み可能なＤＮＡフラグメントを含んでなる。そのベクターは、場合によ
り、独立して宿主ゲノムを複製して機能するのがよく、または幾つかの場合には
、ゲノム自体へと組み込むのがよい。
【００５７】
実験例
本発明の好ましい方法を説明するために、次の実験例が含まれている。本発明
の発明者達により見出された、または彼らにより意図された技術および手順の面
から、次の実験例のある態様を記載して、本発明の実施において十分行う。これ
らの実施例を発明者達の標準的な実験実施の使用によって例示する。本発明の開
示および当業者の一般的レベルから考えて、当業者は、次の実験例が例示的なも
のであることのみを意図するものであって、本発明の精神および範囲を逸脱する
ことなく、多数の変更、修飾および交替を使用することができることが分かるで
あろう。
の発明者達により見出された、または彼らにより意図された技術および手順の面
から、次の実験例のある態様を記載して、本発明の実施において十分行う。これ
らの実施例を発明者達の標準的な実験実施の使用によって例示する。本発明の開
示および当業者の一般的レベルから考えて、当業者は、次の実験例が例示的なも
のであることのみを意図するものであって、本発明の精神および範囲を逸脱する
ことなく、多数の変更、修飾および交替を使用することができることが分かるで
あろう。
【００５８】
実施例１
生殖腺細胞の収集
ＥＤＴＡを使用して、生殖腺ＰＧＣおよびストローマ細胞の混合物を２７−３
０期（Ｈ ＆ Ｈ）の胚生殖腺から集めた。単細胞懸濁液を得るよう注意する。特
に、２７−３０期（Ｈ ＆ Ｈ）のニワトリ胚からの生殖腺を適当な(blunt)切開
により集めて、Ｃa２＋およびＭg２＋を含んでいないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
(−)）１滴にプールした。胚から集めた後、１.５mlのＥppendorfチューブ中、
その生殖腺を０.０２％ ＥＤＴＡ １mlへと入れた後、３７℃のインキュベータ
ーに１０分間入れた。次いで、そのチューブを２００Ｇで３分間遠心分離にかけ
て、上澄みを除去した。次いで、集めた生殖腺を、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢ
Ｓ）を含むＤＭＥＭと共に、細胞濾過器（ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）２３６０、
細孔径１００μＭ）から新たなチューブへと通した。これは、単細胞懸濁液を与
えた。
０期（Ｈ ＆ Ｈ）の胚生殖腺から集めた。単細胞懸濁液を得るよう注意する。特
に、２７−３０期（Ｈ ＆ Ｈ）のニワトリ胚からの生殖腺を適当な(blunt)切開
により集めて、Ｃa２＋およびＭg２＋を含んでいないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
(−)）１滴にプールした。胚から集めた後、１.５mlのＥppendorfチューブ中、
その生殖腺を０.０２％ ＥＤＴＡ １mlへと入れた後、３７℃のインキュベータ
ーに１０分間入れた。次いで、そのチューブを２００Ｇで３分間遠心分離にかけ
て、上澄みを除去した。次いで、集めた生殖腺を、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢ
Ｓ）を含むＤＭＥＭと共に、細胞濾過器（ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）２３６０、
細孔径１００μＭ）から新たなチューブへと通した。これは、単細胞懸濁液を与
えた。
【００５９】
１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭを使用して、照射したＳＴＯフィーダー層を９
６ウェルのプレートに作成した。次いで、ＦＢＳ起源、フィーダー細胞数、ＳＴ
Ｏ細胞のバッチ（旧 対 新）、フィーダー層の予調整、および播種した生殖腺細
胞数を含め、幾つかの培養パラメーターを試験した。
６ウェルのプレートに作成した。次いで、ＦＢＳ起源、フィーダー細胞数、ＳＴ
Ｏ細胞のバッチ（旧 対 新）、フィーダー層の予調整、および播種した生殖腺細
胞数を含め、幾つかの培養パラメーターを試験した。
【００６０】
実施例２
生殖腺細胞の培養
生殖腺細胞をＳＴＯフィーダー層で３−５日間培養して、抗ＳＳＥＡ−１で染
色した。単一のＳＳＥＡ−１陽性ＰＧＣ数およびＳＳＥＡ−１陽性コロニー数を
、培養の０、１および３日目に試験した。最も多くの場合、多数のＰＧＣの死が
最初の２４時間の培養物で起こり、続いて、単一のＰＧＣ数の増大が３−５日目
に起こった。生殖腺ＰＧＣの生存および増殖は、ＳＴＯフィーダー層の質、播種
したＳＴＯ細胞数、ＳＴＯフィーダー層の予調整、および初期に播種した生殖腺
細胞数により影響を受ける。実験の間に、多数の変動がＦＢＳの１つのバッチ内
で観察され、ＦＢＳ起源が培養物に影響を及ぼし得ることが提唱された。
色した。単一のＳＳＥＡ−１陽性ＰＧＣ数およびＳＳＥＡ−１陽性コロニー数を
、培養の０、１および３日目に試験した。最も多くの場合、多数のＰＧＣの死が
最初の２４時間の培養物で起こり、続いて、単一のＰＧＣ数の増大が３−５日目
に起こった。生殖腺ＰＧＣの生存および増殖は、ＳＴＯフィーダー層の質、播種
したＳＴＯ細胞数、ＳＴＯフィーダー層の予調整、および初期に播種した生殖腺
細胞数により影響を受ける。実験の間に、多数の変動がＦＢＳの１つのバッチ内
で観察され、ＦＢＳ起源が培養物に影響を及ぼし得ることが提唱された。
【００６１】
図１は、培養における様々な数のＳＴＯフィーダー細胞での生殖腺ＰＧＣの生
存率を示す。１ウェルあたり１０,０００細胞の生殖腺細胞を様々な数のＳＴＯ
細胞に播種した：１ウェルあたり５０,０００、５５,０００および６０,０００
細胞。ＳＳＥＡ−１陽性細胞を、培養後、０、１および３日目に、ＰＧＣ数とし
て数えた。１ウェルあたり６０,０００細胞のグループでは、ＰＧＣ数が他のグ
ループより３日目で高い（Ｐ＜０.０５）。この結果は、フィーダー細胞の完全
な単層がＰＧＣ培養物に好ましいことを示す。
存率を示す。１ウェルあたり１０,０００細胞の生殖腺細胞を様々な数のＳＴＯ
細胞に播種した：１ウェルあたり５０,０００、５５,０００および６０,０００
細胞。ＳＳＥＡ−１陽性細胞を、培養後、０、１および３日目に、ＰＧＣ数とし
て数えた。１ウェルあたり６０,０００細胞のグループでは、ＰＧＣ数が他のグ
ループより３日目で高い（Ｐ＜０.０５）。この結果は、フィーダー細胞の完全
な単層がＰＧＣ培養物に好ましいことを示す。
【００６２】
実施例３
ＳＴＯフィーダー層の予調整
ＳＴＯフィーダー層の予調整は、最初の２４時間以内に見られる初期の細胞死
を改善した。３日間の培養により、ＳＳＥＡ−１陽性細胞のコロニーを単一のＰ
ＧＣと共に見出すことができた。５日間の培養後、これらのコロニーは、数およ
び大きさを増大させた。コロニー内の細胞は、ＰＧＣより小さくて、十分に定義
されたコロニーボーターで密に充填されていることから、胚幹細胞表現型を発現
させた。幾つかのコロニーは、２,０００細胞以上含むと推定された。ＰＧＣお
よびＥＳＣ様コロニーの混合物は、生殖腺ＰＧＣの画分のみがＥＳＣ表現型を発
生させることができるであろうことを提唱する。
を改善した。３日間の培養により、ＳＳＥＡ−１陽性細胞のコロニーを単一のＰ
ＧＣと共に見出すことができた。５日間の培養後、これらのコロニーは、数およ
び大きさを増大させた。コロニー内の細胞は、ＰＧＣより小さくて、十分に定義
されたコロニーボーターで密に充填されていることから、胚幹細胞表現型を発現
させた。幾つかのコロニーは、２,０００細胞以上含むと推定された。ＰＧＣお
よびＥＳＣ様コロニーの混合物は、生殖腺ＰＧＣの画分のみがＥＳＣ表現型を発
生させることができるであろうことを提唱する。
【００６３】
図２は、予め調整しておいたＳＴＯフィーダー細胞を使用しての生殖腺ＰＧＣ
培養の生存率を示す。１または２日間予め調整しておいた後、１ウェルあたり２
０,０００の生殖腺細胞を１ウェルあたり６０,０００のＳＴＯ細胞に播種した。
２日間予め調整しておいたＰＧＣが高い生存率を示す。
培養の生存率を示す。１または２日間予め調整しておいた後、１ウェルあたり２
０,０００の生殖腺細胞を１ウェルあたり６０,０００のＳＴＯ細胞に播種した。
２日間予め調整しておいたＰＧＣが高い生存率を示す。
【００６４】
実施例４
生殖腺細胞の量
図３Ａは、１ウェルあたり１０,０００または２０,０００の生殖腺細胞を播種
した後の、様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００ま
たは６０,０００）での２０以上のＳＳＥＡ−１陽性細胞のコロニー数を示す。
２０以上のＳＳＥＡ−１陽性細胞を有するコロニー数を測定して、ＥＳＣ表現型
を発現する未分化の細胞を含有するコロニーを、個々のＰＧＣおよびＰＧＣの任
意の群集体から、保守的な方法で区別する。
した後の、様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００ま
たは６０,０００）での２０以上のＳＳＥＡ−１陽性細胞のコロニー数を示す。
２０以上のＳＳＥＡ−１陽性細胞を有するコロニー数を測定して、ＥＳＣ表現型
を発現する未分化の細胞を含有するコロニーを、個々のＰＧＣおよびＰＧＣの任
意の群集体から、保守的な方法で区別する。
【００６５】
図３Ｂは、１ウェルあたり１０,０００または２０,０００の生殖腺細胞を播種
した後の、様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００ま
たは６０,０００）での生殖腺ＰＧＣの増殖を示す。２０,０００の生殖腺細胞
対 １０,０００の生殖腺細胞を使用すると、個々のＰＧＣの増殖はより高かった
（Ｐ＜０.０５）。同様に、５日後に形成されたＳＳＥＡ−１陽性コロニーの数
は、播種した生殖腺細胞の数に依存した。
した後の、様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００ま
たは６０,０００）での生殖腺ＰＧＣの増殖を示す。２０,０００の生殖腺細胞
対 １０,０００の生殖腺細胞を使用すると、個々のＰＧＣの増殖はより高かった
（Ｐ＜０.０５）。同様に、５日後に形成されたＳＳＥＡ−１陽性コロニーの数
は、播種した生殖腺細胞の数に依存した。
【００６６】
参考文献
以下に挙げる参考文献、さらにはまた、明細書中に引用する参考文献は全て、
それらが、本明細書中で使用する方法、技術および／または組成物に関する背景
を補い、説明し、提供し、またはそれらを教示する程度まで参照することにより
、本明細書中に組み込まれる。
それらが、本明細書中で使用する方法、技術および／または組成物に関する背景
を補い、説明し、提供し、またはそれらを教示する程度まで参照することにより
、本明細書中に組み込まれる。
【００６７】
Ａllioli，Ｎ.ら，Ｄev. Ｂiol. １９９４年９月；１６５（１）３０−７;
Ｃhang，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９５年２月；１９（２）１４３
−９； Ｃhang，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９７年８月；２１（８）４９５
−９； Ｅtchesら，Ａvian Ｉncubationにおいて，第２２章、Ｂutterworth Ｐublisher
s（１９９０）； Ｅtchesら，Ｐoultry Ｓcience ７２：８８２−８８７（１９９３）； ＭarおよびＯrdahl，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８５，６４０４−６
４０８（１９８８）； １９９６年５月２日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９６／１２７９３； １９９９年２月１１日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／０６５３３； １９９９年２月１１日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／０６５３４；
−９； Ｃhang，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９７年８月；２１（８）４９５
−９； Ｅtchesら，Ａvian Ｉncubationにおいて，第２２章、Ｂutterworth Ｐublisher
s（１９９０）； Ｅtchesら，Ｐoultry Ｓcience ７２：８８２−８８７（１９９３）； ＭarおよびＯrdahl，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８５，６４０４−６
４０８（１９８８）； １９９６年５月２日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９６／１２７９３； １９９９年２月１１日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／０６５３３； １９９９年２月１１日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／０６５３４；
【００６８】
Ｐetitteら，Ｄevelopment １０８，１８５−１８９（１９９０）；
Ｓmith，Ａ. Ｇ.およびＨooper，Ｍ. Ｌ.，Ｄev. Ｂiol. １９８７年５月；１２
１（１）：１−９； 米国特許第４,０４０,３８８号； 米国特許第４,４６９,０４７号； 米国特許第４,５９３,６４６号； 米国特許第４,６８１,０６３号； 米国特許第４,７６１,３７１号； 米国特許第４,８７７,７２９号； 米国特許第４,９０３,６２５号；
１（１）：１−９； 米国特許第４,０４０,３８８号； 米国特許第４,４６９,０４７号； 米国特許第４,５９３,６４６号； 米国特許第４,６８１,０６３号； 米国特許第４,７６１,３７１号； 米国特許第４,８７７,７２９号； 米国特許第４,９０３,６２５号；
【００６９】
米国特許第４,９１２,０３８号；
米国特許第５,３４０,７４０号；
米国特許第５,５３７,３５７号；
米国特許第５,６５６,４７９号；
米国特許第５,６７０,３７２号；
米国特許第５,６９０,９２６号；
米国特許第５,８３０,５１０号；
Ｓambrookら，Ｍolecular Ｃloning，a Ｌaboratory Ｍanual（第２版，Ｃold
Ｓpring Ｈarbor Ｐress，Ｎ.Ｙ.（１９８９））； Ｖerrinder Ｇibbinsら，Ｆourth Ｗorld Ｃongress on Ｇenetics Ａpplied to
Ｌivestock Ｐroduction，Ｅdinburgh（１９９０）。
Ｓpring Ｈarbor Ｐress，Ｎ.Ｙ.（１９８９））； Ｖerrinder Ｇibbinsら，Ｆourth Ｗorld Ｃongress on Ｇenetics Ａpplied to
Ｌivestock Ｐroduction，Ｅdinburgh（１９９０）。
【００７０】
本発明の様々な詳細は、本発明の範囲を逸脱することなく変更してもよいこと
が理解されるであろう。さらにまた、先の記載は、説明のみを目的とするもので
あって、限定を目的とするものではなく、本発明は、特許請求の範囲により定義
される。
が理解されるであろう。さらにまた、先の記載は、説明のみを目的とするもので
あって、限定を目的とするものではなく、本発明は、特許請求の範囲により定義
される。
【図１】 図１は、培養における様々な数のＳＴＯフィーダー細胞での生殖
腺ＰＧＣの生存率を図示する棒グラフである。
腺ＰＧＣの生存率を図示する棒グラフである。
【図２】 図２は、予め調整しておいたＳＴＯフィーダー細胞を使用しての
生殖腺ＰＧＣ培養の生存率を図示する棒グラフである。
生殖腺ＰＧＣ培養の生存率を図示する棒グラフである。
【図３】 図３は、１培養ウェルあたり様々な数の生殖腺細胞を播種する効
果を図示する一組の棒グラフである。
果を図示する一組の棒グラフである。
【図４】 図４は、図３に関して上記したような、ＳＴＯ細胞で５日間培養
したニワトリ生殖腺細胞のＳＳＥＡ−１染色を示す一連の写真である。
したニワトリ生殖腺細胞のＳＳＥＡ−１染色を示す一連の写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，
ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 イ・グオ・ジャン
アメリカ合衆国27607ノースカロライナ州
ローリー、ナンバー104、ホートン・スト
リート3527番
Ｆターム(参考） 4B065 AA90 BB40 CA60
Claims (43)
- 【請求項１】 胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の持続性培養物
を取得する方法であって、 （ａ）始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞を原条形成後のトリ胚から集め； （ｂ）そのトリ生殖腺細胞を予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触
させて置き；そして （ｃ）本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細
胞培養物を取得するのに十分な時間、そのトリ生殖腺細胞を培地の存在下に予め
調整しておいたフィーダーマトリックスで増殖させる； ことを含んでなる方法。 - 【請求項２】 トリ生殖腺細胞を１４期〜４５期の胚から集める、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 トリ生殖腺細胞を１５期〜３１期の胚から集める、請求項２
に記載の方法。 - 【請求項４】 トリ生殖腺細胞を２７期〜３０期の胚から集める、請求項３
に記載の方法。 - 【請求項５】 トリ生殖腺細胞を約１０,０００〜約２０,０００細胞の範囲
数で予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて置く、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項６】 約２０,０００のトリ生殖腺細胞を予め調整しておいたフィ
ーダーマトリックスと接触させて置く、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 予め調整しておいたフィーダーマトリックスが繊維芽細胞を
含んでなる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 繊維芽細胞が約４０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で
予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項７に記載の方法
。 - 【請求項９】 繊維芽細胞が約５０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で
予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項８に記載の方法
。 - 【請求項１０】 繊維芽細胞が約５５,０００〜約６０,０００細胞の範囲数
で予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項９に記載の方
法。 - 【請求項１１】 約６０,０００の繊維芽細胞が予め調整しておいたフィー
ダーマトリックスに存在する、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 繊維芽細胞がマウス繊維芽細胞である、請求項７に記載の
方法。 - 【請求項１３】 マウス繊維芽細胞がマウス繊維芽細胞フィーダー層を形成
する、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 マウス繊維芽細胞がマウスＳＴＯ繊維芽細胞である、請求
項１２に記載の方法。 - 【請求項１５】 未分化のトリ細胞を培地の存在下に予め調整しておいた繊
維芽細胞フィーダーマトリックスで少なくとも３日間増殖させる場合に幹細胞表
現型を保持することができる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】 トリ胚が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ
、ウズラおよびキジの胚よりなる群から選択される胚である、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１７】 トリ胚がニワトリ胚である、請求項１５に記載の方法。
- 【請求項１８】 培地が調整培地である、請求項１に記載の方法。
- 【請求項１９】 胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の持続性培養
物を取得する方法であって、 （ａ）始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞を原条形成後のトリ胚から集め； （ｂ）そのトリ生殖腺細胞を予め調整しておいた繊維芽細胞フィーダー細胞マト
リックスと接触させて置き；そして （ｃ）本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細
胞培養物を取得するのに十分な時間、そのトリ生殖腺細胞を培地の存在下にフィ
ーダー細胞マトリックスで増殖させる； ことを含んでなる方法。 - 【請求項２０】 トリ生殖腺細胞を１４期〜４５期の胚から集める、請求項
１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 トリ生殖腺細胞を１５期〜３１期の胚から集める、請求項
２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 トリ生殖腺細胞を２７期〜３０期の胚から集める、請求項
２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 トリ生殖腺細胞を約１０,０００〜約２０,０００生殖腺細
胞の範囲数でフィーダー細胞マトリックスと接触させて置く、請求項１９に記載
の方法。 - 【請求項２４】 約２０,０００のトリ生殖腺細胞をフィーダー細胞マトリ
ックスと接触させて置く、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 繊維芽細胞が約４０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数
で繊維芽細胞フィーダーマトリックスに存在する、請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２６】 繊維芽細胞が約５０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数
で繊維芽細胞フィーダーマトリックスに存在する、請求項２５に記載の方法。 - 【請求項２７】 繊維芽細胞が約５５,０００〜約６０,０００細胞の範囲数
で繊維芽細胞フィーダーマトリックスに存在する、請求項２６に記載の方法。 - 【請求項２８】 約６０,０００の繊維芽細胞が繊維芽細胞フィーダーマト
リックスに存在する、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項２９】 繊維芽細胞フィーダーマトリックスがマウス繊維芽細胞を
含んでなる、請求項１９に記載の方法。 - 【請求項３０】 マウス繊維芽細胞がマウスＳＴＯ繊維芽細胞である、請求
項２９に記載の方法。 - 【請求項３１】 未分化のトリ細胞を培地の存在下に繊維芽細胞フィーダー
マトリックスで少なくとも３日間増殖させる場合に幹細胞表現型を保持すること
ができる、請求項１９に記載の方法。 - 【請求項３２】 トリ胚が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ
、ウズラおよびキジの胚よりなる群から選択される胚である、請求項１９に記載
の方法。 - 【請求項３３】 トリ胚がニワトリ胚である、請求項３２に記載の方法。
- 【請求項３４】 培地が調整培地である、請求項１９に記載の方法。
- 【請求項３５】 胚幹細胞表現型を発現する未分化のニワトリ細胞の持続性
培養物を取得する方法であって、 （ａ）生殖腺細胞を２７期〜３０期のニワトリ胚から集め； （ｂ）その生殖腺細胞を予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー細胞層
と接触させて置き；そして （ｃ）持続性トリ細胞培養物を取得するのに十分な時間、その生殖腺細胞を調整
培地の存在下に予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー細胞層で増殖さ
せ、その持続性トリ細胞培養物は、本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分
化のトリ細胞よりなる； ことを含んでなる方法。 - 【請求項３６】 生殖腺細胞を約１０,０００〜約２０,０００生殖腺細胞の
範囲数で予め調整しておいたマウスフィーダー細胞層と接触させて置く、請求項
３５に記載の方法。 - 【請求項３７】 約２０,０００の生殖腺細胞を予め調整しておいたマウス
フィーダー細胞層と接触させて置く、請求項３６に記載の方法。 - 【請求項３８】 繊維芽細胞が約４０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数
で予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項３５に
記載の方法。 - 【請求項３９】 繊維芽細胞が約５０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数
で予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項３８に
記載の方法。 - 【請求項４０】 繊維芽細胞が約５５,０００〜約６０,０００細胞の範囲数
で予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項３９に
記載の方法。 - 【請求項４１】 約６０,０００の繊維芽細胞が予め調整しておいたマウス
繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項４０に記載の方法。 - 【請求項４２】 予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー細胞層が
マウスＳＴＯ繊維芽細胞フィーダー細胞層である、請求項３５に記載の方法。 - 【請求項４３】 未分化のトリ細胞を培地の存在下に予め調整しておいたマ
ウス繊維芽細胞フィーダー層で少なくとも３日間増殖させる場合に幹細胞表現型
を保持することができる、請求項３５に記載の方法。
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