ES2347336T3 - Inmunoanalisis del taxol. - Google Patents
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Abstract
Un inmunoanálisis para detectar el taxol en una muestra que comprende proporcionar una mezcla que contiene dicha muestra, un anticuerpo que es selectivamente reactivo con el taxol y que tiene una reactividad cruzada con el 6-α-hidroxipaclitaxel y el 3'-p-hidroxipaclitacel en comparación con el taxol de menos del 10% y un conjugado de un vehículo con un compuesto de fórmula: **(Ver fórmula)** en la que B es -CH2- o **(Ver fórmula)** Y es un grupo espaciador orgánico; X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a un polímero de poliamina; p es un número entero de 0 a 1; y Ph es fenilo, que hace que el taxol de la muestra y dicho conjugado se unan con dicho anticuerpo y, a partir de entonces, medir la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que está unido o no unido a dicho anticuerpo mediante lo cual se puede determinar la presencia de taxol en la muestra.
Description
Inmunoanálisis del taxol.
La presente invención se refiere al campo de los
análisis inmunológicos para determinar la presencia y/o cuantificar
la cantidad de taxol en fluidos biológicos humanos con el fin de
determinar de manera rápida las concentraciones óptimas del fármaco
durante una quimioterapia.
Cáncer es un término usado para describir un
grupo de tumores malignos que comparten el rasgo común de
desarrollarse cuando las células de una parte del cuerpo comienzan
a crecer sin control. La mayoría de los cánceres se forman como
tumores, pero también se pueden manifestar en la sangre y circular
por otros tejidos en los que crecen. Los tumores malignos
cancerosos se tratan más comúnmente con una combinación de cirugía,
quimioterapia y/o radioterapia. El tipo de tratamiento usado para
tratar un cáncer específico depende de varios factores que incluyen
el tipo de tumor maligno canceroso y el estadio en el que fue
diagnosticado.
El taxol, también conocido como paclitaxel, es
uno de los agentes citotóxicos más comunes usados para el
tratamiento del cáncer de mama (Holmes et. al. Proc. Am. Soc.
Clin. Oncol., 10, 60, 1991), del cáncer de ovario (Einzig
et. al. Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 31, 1114, 1990) y del
cáncer de pulmón de células no pequeñas. El taxol tiene la
fórmula:
Este compuesto se ha asociado con efectos
secundarios debilitantes, tales como la pérdida de densidad de
médula ósea, reacción alérgica, neutropenia, hipotensión,
bardicardia, náuseas y vómitos. Mediante el control de los niveles
de taxol en el cuerpo y el ajuste de la dosis, es posible controlar
y limitar mejor estos efectos secundarios en los pacientes.
Al mismo tiempo, a menudo, existe una relación
muy variable entre la dosis del taxol y la concentración del
fármaco en suero resultante que afecta al efecto terapéutico. El
grado de variabilidad farmacocinética intra- e interindividual del
taxol puede ser tan elevado como de cinco veces (Gurney et. al.,
J. Clin. Oncol. 14, pp 2590-2611, 1996) y se ve
afectado por muchos factores que incluyen:
- \bullet
- la función orgánica,
- \bullet
- la regulación genética,
- \bullet
- el estado patológico,
- \bullet
- la edad,
- \bullet
- la interacción fármaco-fármaco,
- \bullet
- el momento de la ingestión del fármaco,
- \bullet
- el modo de administración del fármaco y
- \bullet
- la administración en relación con la técnica.
Como resultado de esta variabilidad, las dosis
iguales de un mismo fármaco en individuos diferentes pueden
producir resultados clínicos espectacularmente diferentes (Hon
et. al. Clinical Chemistry 44, pp
388-400,1998). La eficacia de la misma dosis de
taxol varía significativamente en base al aclaramiento del fármaco
individual y la concentración de fármaco en suero final en el
paciente. La administración terapéutica del fármaco proporcionaría
al profesional clínico la oportunidad de comprender la variación
producida en el paciente en la administración tanto oral como
intravenosa del fármaco. Con la administración terapéutica del
fármaco, se podrían individualizar las dosis de fármaco para el
paciente, y las posibilidades de tratar el cáncer con eficacia, sin
los no deseados efectos secundarios, podrían ser mucho mayores.
Además, la administración terapéutica del
fármaco taxol serviría como una excelente herramienta para
garantizar la administración de la quimioterapia con las dosis
reales prescritas y el logro de niveles de concentración en suero
eficaces. Se ha descubierto que la variabilidad de la concentración
en suero no sólo se debe a factores fisiológicos, sino que también
puede ser el resultado de la variación en la técnica de
administración.
La administración terapéutica rutinaria del
fármaco taxol requeriría la disponibilidad de análisis automáticos
sencillos adaptables al equipo de laboratorio general. Los análisis
que mejor cumplen estos criterios son los inmunoanálisis. Para el
taxol, se han publicado un radioinmunoanálisis y un análisis de
inmunoabsorción ligado a una enzima (análisis ELISA) (Erlanger
et. al., patente estadounidense 5.756.301, 26 de mayo de
1998 y Grothaus et al., J. Nat. Prod., 1995, Vol. 58, n.º 7,
pp 1003-1014). Sin embargo, los derivados y los
inmunógenos usados en este análisis confieren a los correspondientes
anticuerpos una amplia reactividad cruzada con el taxol y los
metabolitos del taxol, particularmente, con el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel. Para
ser más eficaz en el control de los niveles de fármaco, el
anticuerpo debería ser más específico del compuesto activo y
presentar una reactividad cruzada de muy baja a nula con los
metabolitos no activos.
Según la presente invención, se ha producido una
nueva clase de anticuerpos que son sustancialmente selectivamente
reactivos con el taxol como para unirse al taxol sin una reactividad
cruzada sustancial con los metabolitos del taxol, particularmente,
con el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel
y el 3'-p-hidroxipaclitaxel. "Selectivamente reactivo"
pretende significar que este anticuerpo sólo reacciona con la
molécula de taxol y no reacciona sustancialmente con otros
compuestos, tales como los metabolitos del taxol, siendo los
metabolitos bloqueadores más importantes el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el
3'-p-hidroxipaclitaxel.
Se ha descubierto que mediante el uso de
inmunógenos que sean conjugados de un polímero de poliamina
inmunogénico con un compuesto de fórmula:
en la
que:
Y es un grupo espaciador orgánico;
X es un grupo funcional terminal capaz de unirse
a un polímero de poliamina;
p es un número entero de 0 a 1; y
Ph es fenilo
\vskip1.000000\baselineskip
y B es -CH_{2}- o
o mezclas del mismo; se producen
anticuerpos que son específicos del taxol y que no reaccionan
sustancialmente ni se unen con otros compuestos, tales como
metabolitos o compuestos relacionados del taxol, tales como Bacatina
III, 3'-p-hidroxipaclitaxel y
6-\alpha-hidroxipaclitaxel. El
suministro de estos anticuerpos que reaccionan sustancialmente
selectivamente con el taxol y no reaccionan de manera cruzada con el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel ni con
el 3'-p-hidroxipaclitaxel (i.e., menos del 10%) permite la
producción de un inmunoanálisis que puede detectar y controlar
específicamente el taxol en muestras de fluidos de pacientes que
estén siendo tratados con taxol. También se incluyen en la presente
los reactivos y equipos para dicho inmunoanálisis. La presencia del
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el
3'-p-hidroxipaclitaxel como metabolitos del taxol es la causa
principal de lecturas de falsos positivos en los inmunoanálisis
pasados del
taxol.
Según la presente invención, se proporciona una
nueva clase de anticuerpos que reaccionan sustancialmente
selectivamente con el taxol y no reaccionan sustancialmente ni
reaccionan de manera cruzada con los metabolitos del taxol
mencionados anteriormente en la presente memoria. Se ha descubierto
que con el uso de estos derivados del
7-hidroxi-taxol de fórmula
II-B como inmunógenos, se proporciona esta nueva
clase de anticuerpos de la presente invención. Mediante el uso de
estos anticuerpos se ha desarrollado un inmunoanálisis, incluyendo
reactivos y equipos para tal inmunoanálisis, para detectar y/o
cuantificar el taxol en sangre, plasma u otras muestras de fluidos
corporales. Mediante el uso de este inmunoanálisis, se puede
detectar y/o cuantificar la presencia y la cantidad de taxol en
muestras de fluidos corporales, preferiblemente, en una muestra de
sangre o de plasma. De esta manera, se puede hacer un seguimiento de
un paciente que esté siendo tratado con taxol durante una terapia y
ajustar su tratamiento según dicho seguimiento. Por medio de la
presente invención se consigue la administración terapéutica del
fármaco taxol en pacientes con cáncer que estén siendo tratados con
taxol como agente quimioterapéutico.
Los reactivos utilizados en el análisis de la
presente invención son conjugados de un vehículo polimérico con los
compuestos de fórmula II-B. Estos conjugados son
parejas de unión competitiva con el taxol presente en la muestra
por la unión con los anticuerpos de la presente. Por lo tanto, la
cantidad de reactivo de conjugado que se une con el anticuerpo será
inversamente proporcional a la cantidad de taxol de la muestra.
Según la presente, el análisis utiliza cualquier procedimiento de
medición convencional para detectar y medir la cantidad de dicho
conjugado que está unido o no está unido con el anticuerpo. Mediante
el uso de dicho procedimiento, se puede determinar la cantidad de
conjugado unido o no unido. Generalmente, la cantidad de taxol de
una muestra se determina correlacionando la cantidad medida del
conjugado unido o no unido producido por el taxol en la muestra con
valores del conjugado unido o no unido determinados a partir de
muestras patrón o de curvas de calibración que contienen cantidades
conocidas de taxol, cuyas cantidades conocidas están en el intervalo
esperado para la muestra que se vaya a analizar. Estos estudios
para producir curvas de calibración se determinan usando el mismo
procedimiento de inmunoanálisis usado para la muestra.
Los conjugados, así como los inmunógenos, se
preparan a partir de compuestos de fórmula II-B. Los
conjugados o los inmunógenos del vehículo están unidos a las partes
ligando del polímero de poliamina que tienen la fórmula:
en la que X', B y p son como se
definen
anteriormente.
Estas partes ligando pueden estar unidas a uno o
más sitios activos del vehículo o del polímero de poliamina del
inmunógeno.
A lo largo de la presente descripción, se
entenderán las siguientes definiciones:
El término "Ph", como se usa a lo largo de
esta solicitud, indica un radical fenilo. El término
"alquileno" indica un sustituyente de hidrocarburo de cadena
lineal o ramificada saturada divalente que contiene de uno a diez
átomos de carbono.
Los términos "inmunógeno" e
"inmunogénico" se refieren a sustancias capaces de provocar,
producir o generar una respuesta inmune en un organismo.
El término "conjugado" se refiere a
cualquier sustancia formada a partir de la unión de dos partes. Los
conjugados representativos según la presente invención incluyen los
formados mediante la unión de una molécula pequeña, tal como el
compuesto de fórmula II-B, y una molécula grande,
tal como un vehículo o un polímero de poliamina, particularmente,
una proteína. En el conjugado, la molécula pequeña puede estar unida
a uno o más sitios activos de la molécula grande. El término
conjugado incluye el término inmunógeno.
"Haptenos" son antígenos parciales o
incompletos. Son sustancias libres de proteínas, en su mayor parte,
sustancias de bajo peso molecular, que no son capaces de estimular
la formación de anticuerpos, pero que reaccionan con los
anticuerpos. Éstos se forman mediante el acoplamiento de un hapteno
con un vehículo inmunogénico de alto peso molecular y luego la
inyección de este producto acoplado, i. e., el inmunógeno, en un
sujeto humano o animal. El hapteno de la presente es el taxol.
Como se usa en la presente memoria, un "grupo
espaciador" o "espaciador" se refiere a una parte de una
estructura química que conecta dos o más subestructuras, tales como
haptenos, vehículos, inmunógenos, marcadores o trazadores, a través
de un grupo CH_{2} o un grupo de unión funcional. Estos grupos
espaciadores se enumerarán en lo sucesivo en esta solicitud. Los
átomos de un grupo espaciador y los átomos de una cadena del grupo
espaciador se conectan entre sí mediante enlaces químicos. Entre
los espaciadores preferidos están las cadenas de carbonos,
saturadas o insaturadas, lineales o ramificadas. Estas cadenas de
carbonos también pueden incluir uno o más heteroátomos en la cadena
o en los terminales de las cadenas. "Heteroátomos" pretende
significar átomos distintos del carbono que se seleccionan del
grupo constituido por oxígeno, nitrógeno o azufre. Los grupos
espaciadores también pueden incluir grupos cíclicos o aromáticos
como parte de la cadena o como una sustitución en uno de los átomos
de la cadena.
El número de átomos del grupo espaciador se
determina contando los átomos distintos del hidrógeno. El número de
átomos de una cadena de un grupo espaciador se determina contando el
número de átomos distintos del hidrógeno a lo largo de la ruta más
corta entre las subestructuras que están siendo conectadas. Se puede
usar un grupo de unión funcional para activar, p. ej., proporcionar
un sitio funcional disponible en un hapteno o un grupo espaciador
para sintetizar un conjugado de un hapteno con un marcador o un
vehículo o un polímero de poliamina.
Un "vehículo inmunogénico", como se usa la
expresión en la presente memoria, es una sustancia inmunogénica,
comúnmente, una proteína, que se puede unir con un hapteno, en este
caso, con el taxol o con los derivados de taxol descritos
anteriormente en la presente memoria, permitiendo así que estos
derivados de hapteno provoquen una respuesta inmune y generen la
producción de anticuerpos que puedan unirse específicamente con
estos haptenos. En lo sucesivo, en esta solicitud, se enumerarán
los vehículos inmunogénicos y los grupos de unión. Entre las
sustancias vehículo inmunogénicas se incluyen proteínas,
glucoproteínas, poliamino-polisacáridos complejos,
partículas y ácidos nucleicos que son reconocidos como foráneos y
provocan, por tanto, una respuesta inmunológica en el huésped. Los
poliamino-polisacáridos se pueden preparar a partir
de polisacáridos usando cualquier procedimiento convencional
conocido para esta preparación.
También se pueden emplear diversos tipos de
proteínas como vehículo inmunogénico de poli(aminoácido).
Estos tipos incluyen albúminas, proteínas séricas, lipoproteínas,
etc. Las proteínas ilustrativas incluyen la albúmina de suero
bovino (ASB), la hemocianina de lapa californiana (KLH), la
ovoalbúmina, la tiroglobulina bovina (BTG), etc. Alternativamente,
se pueden utilizar poli(aminoácidos) sintéticos.
Los vehículos inmunogénicos también pueden
incluir poliamino-polisacáridos que sean un polímero
de alto peso molecular formado mediante condensaciones repetidas de
monosacáridos. Los ejemplos de polisacáridos son almidones,
glucógeno, celulosa, gomas de hidratos de carbono, tales como goma
arábiga, agar, etcétera. El polisacárido también contiene residuos
de poliaminoácido y/o residuos lipídicos.
El vehículo inmunogénico también puede ser un
poli(ácido nucleico) bien solo o conjugado con uno de los
poli(aminoácidos) o polisacáridos anteriormente
mencionados.
El vehículo inmunogénico también puede incluir
partículas sólidas. Las partículas son generalmente de un diámetro
de al menos aproximadamente 0,02 micrómetros (\mum) o de no más de
aproximadamente 100 \mum, y habitualmente, de aproximadamente
0,05 \mum a 10 \mum. La partícula puede ser orgánica o
inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa,
óptimamente, de una densidad que se aproxima a la del agua,
generalmente de aproximadamente 0,7 a 1,5 g/ml, y compuesta por
material que puede ser transparente, parcialmente transparente u
opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos, tales como
células y microorganismos, incluyendo ejemplos no restrictivos,
tales como eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas,
estreptococos, Staphylococcus aureus, E. coli
y virus. Las partículas también pueden estar compuestas de polímeros
orgánicos e inorgánicos, liposomas, látex, vesículas posfolipídicas
o lipoproteínas.
"Poli(aminoácido)" o
"polipéptido" es una poliamida formada a partir de aminoácidos.
Los poli(aminoácidos) variarán generalmente de un peso
molecular de aproximadamente 2.000, sin un límite superior de peso
molecular, siendo normalmente de menos de 10.000.000 y,
habitualmente, de no más de aproximadamente 600.000 daltons.
Habitualmente, habrá diferentes intervalos en función de si hay
implicado o no un vehículo inmunogénico o una enzima.
Un "péptido" es cualquier compuesto formado
mediante el enlace de dos o más aminoácidos mediante enlaces de
tipo amida (peptídicos), habitualmente, un polímero de
\alpha-aminoácidos en el que el grupo
\alpha-amino de cada residuo de aminoácido (a
excepción del terminal NH_{2}) está unido al grupo
\alpha-carboxilo del siguiente residuo de la
cadena lineal. Los términos péptido, polipéptido y
poli(aminoácido) se usan como sinónimos en la presente
memoria para referirse a esta clase de compuestos sin ninguna
restricción en cuanto al tamaño. Los miembros más grandes de esta
clase se denominan proteínas.
Un "marcador", una "molécula
detectora" o un "trazador" es cualquier molécula que
produce, o que puede ser inducida a producir, una señal detectable.
El marcador puede estar conjugado a un analito, un inmunógeno, un
anticuerpo u otra molécula, tal como un receptor o una molécula que
se pueda unir con un receptor, tal como un ligando,
particularmente, un hapteno. Los ejemplos no restrictivos de
marcadores incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fragmentos
enzimáticos, sustratos enzimáticos, inhibidores enzimáticos,
coenzimas, catalizadores, fluoróforos, colorantes,
quimioluminiscentes, luminiscentes o sensibilizadores; una partícula
no magnética o magnética, un soporte sólido, un liposoma, un
ligando o un receptor.
El término "anticuerpo" se refiere a una
pareja de unión proteica específica para un antígeno, y es cualquier
sustancia o grupo de sustancias que tenga una afinidad de unión
específica por un antígeno hasta la exclusión de otras sustancias.
El término genérico anticuerpo subsume anticuerpos policlonales,
anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos.
El término "derivado" se refiere a un
compuesto químico o una molécula formada a partir de un compuesto
precursor mediante una o más reacciones químicas.
El término "vehículo" se refiere a
partículas sólidas y/o polímeros poliméricos, tales como polímeros
inmunogénicos, tales como aquéllos mencionados anteriormente.
Cuando el vehículo es una partícula sólida, la partícula sólida
puede estar unida, revestida con o unida de otro modo con un
polímero de poliamina para proporcionar uno o más sitios reactivos
para la unión con el grupo funcional terminal X de los compuestos de
fórmula II-B.
El término "equipo de reactivos" o
"equipo de análisis" se refiere a un conjunto de materiales que
se usan en la realización de un análisis. Los reactivos se pueden
proporcionar en una combinación empaquetada en el mismo envase o en
envases separados en función de sus reactividades cruzadas y
estabilidades, y en forma líquida o liofilizada. Las cantidades y
las proporciones de los reactivos proporcionados en el equipo se
pueden seleccionar para proporcionar resultados óptimos para una
determinada aplicación. Un equipo de reactivos que incorpora las
características de la presente invención comprende anticuerpos
específicos del taxol. El equipo puede comprender además ligandos
del analito, y
materiales de calibración y de control. Los reactivos pueden permanecer en estado líquido o pueden estar liofilizados.
materiales de calibración y de control. Los reactivos pueden permanecer en estado líquido o pueden estar liofilizados.
La expresión "materiales de calibración y de
control" se refiere a cualquier patrón o material de referencia
que contiene una cantidad conocida de un fármaco que se vaya a
medir. La concentración del fármaco se calcula comparando los
resultados obtenidos para la muestra desconocida con los resultados
obtenidos para el patrón. Esto se hace comúnmente construyendo una
curva de calibración.
El término "muestra biológica" incluye,
pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia procedente
de un ser vivo o un ser anteriormente vivo. Tales seres vivos
incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, ratones, monos,
ratas, conejos, caballos y otros animales. Tales sustancias
incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, plasma, orina,
células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, linfa, nódulos
linfáticos, tejido sinovial, condrocitos, macrófagos sinoviales,
células endoteliales y piel.
En la construcción de un inmunoanálisis, se
construye un conjugado de taxol para competir con el taxol de la
muestra por los sitios de unión de los anticuerpos. En el
inmunoanálisis de la presente, los reactivos son derivados de
7-taxol de fórmula III-B. En los
compuestos de fórmula III-B, el espaciador ligador
constituye la parte -CH_{2}-(Y)_{p}-
X'- o -B-(Y)_{p}-X' de esta molécula. Este ligador X' y el espaciador -CH_{2}-(Y)_{p}- o -B-(Y)_{p}-X' son convencionales en la preparación de conjugados e inmunógenos. En los compuestos de fórmula III-B, se puede utilizar cualquiera de los grupos de unión a espaciadores convencionales para preparar conjugados e inmunógenos para inmunoanálisis. Tales ligadores y espaciadores convencionales se revelan en la patente estadounidense n.º 5.501.987 y la patente estadounidense n.º 5.101.015.
X'- o -B-(Y)_{p}-X' de esta molécula. Este ligador X' y el espaciador -CH_{2}-(Y)_{p}- o -B-(Y)_{p}-X' son convencionales en la preparación de conjugados e inmunógenos. En los compuestos de fórmula III-B, se puede utilizar cualquiera de los grupos de unión a espaciadores convencionales para preparar conjugados e inmunógenos para inmunoanálisis. Tales ligadores y espaciadores convencionales se revelan en la patente estadounidense n.º 5.501.987 y la patente estadounidense n.º 5.101.015.
Entre los grupos espaciadores preferidos se
incluyen los grupos espaciadores mencionados anteriormente en la
presente memoria. Los grupos espaciadores particularmente preferidos
son grupos tales como el alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de
carbono,
en la que n y o son números enteros
de 0 a 6, y m es un número entero de 1 a 6, siendo el alquileno el
grupo espaciador especialmente
preferido.
En los compuestos de fórmula
III-B, X' es -CH_{2}- o un grupo funcional que
liga el espaciador, preferiblemente, con un grupo amina del
vehículo polimérico. El grupo X' es el resultado del grupo funcional
terminal X en los compuestos de fórmula II-B, que
es capaz de unirse al grupo amino del polímero de poliamina usado
bien como el vehículo o como el inmunógeno. Se puede utilizar
cualquier grupo funcional terminal capaz de reaccionar con una
amina como el grupo funcional X en los compuestos de fórmula
II-B. Estos grupos funcionales terminales incluidos
preferiblemente en X son:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{3} es hidrógeno o
tomado junto con su átomo de oxígeno unido forma un éster reactivo y
R_{4} es oxígeno o azufre. El radical -N=C=R_{4} puede ser un
isocianato o un isotiocianato. Los ésteres activos formados por
OR_{3} incluyen imidoéster, tal como N-hidroxisuccinamida,
1-hidroxi-benzotriazol y
p-nitrofenil-éster. Sin embargo, se puede usar
cualquier éster activo que pueda reaccionar con un grupo
amina.
El grupo carboxílico y los ésteres activos son
acoplados al vehículo o al polímero inmunogénico mediante
procedimientos convencionales. El grupo amina del polímero de
poliamina, tal como una proteína, produce un grupo amida que
conecta el espaciador con el polímero, los inmunógenos o el vehículo
y/o los conjugados de la presente.
En los inmunógenos y los conjugados de la
presente invención, los enlaces químicos entre los haptenos de taxol
que contienen grupos carboxilo y los grupos amino del polímero de
poliaminas del vehículo o del inmunógeno se pueden establecer
usando una variedad de procedimientos conocidos por el experto en la
técnica. Frecuentemente, es preferible formar enlaces de tipo
amida. Los enlaces de tipo amida se forman activando primero el
resto de ácido carboxílico del hapteno taxol de los compuestos de
fórmula II-B haciendo reaccionar el grupo carboxilo
con un reactivo del grupo saliente (p. ej.,
N-hidroxisuccinimida, 1-hidroxibenzotriazol,
p-nitrofenol y similares). Se puede usar un
reactivo activador tal como diciclohexilcarbodiimida,
diisopropilcarbodiimida y similares. Luego se hace reaccionar la
forma activada del grupo carboxilo del hapteno taxol de fórmula
II-B con una solución tamponada que contiene el la
proteína vehículo.
En los casos en los que el derivado de taxol de
fórmula II-B contiene un grupo amino primario o
secundario, así como el grupo carboxilo, es necesario usar un grupo
protector de aminas durante las reacciones de activación y
acoplamiento para evitar que los conjugados reaccionen entre sí.
Comúnmente, las aminas del conjugado se protegen formando la
correspondiente N-trifluoroacetamida,
N-terc-butiloxicarbonil-uretano
(N-t-BOC-uretano),
N-carbobenciloxi-uretano o una estructura
similar. Una vez realizada la reacción de acoplamiento con el
polímero inmunogénico o el vehículo, según lo descrito
anteriormente, se puede retirar el grupo protector de aminas usando
reactivos que no alteren de otro modo la estructura del inmunógeno o
del conjugado. Tales reactivos y procedimientos son conocidos por
el experto en la técnica e incluyen ácidos anhidros o acuosos
débiles o fuertes, bases anhidras o acuosas débiles o fuertes,
reactivos que contienen hidruro, tales como borohidruro de sodio o
cianoborohidruro de sodio y la hidrogenación catalítica. En la
patente estadounidense n.º 3.996.344 y la patente estadounidense
n.º 4.016.146, se revelan diversos procedimientos de conjugación de
haptenos y vehículos.
Por otro lado, cuando X es un radical de
isocianato o de tioisocianato terminal del compuesto de fórmula
II-B, estos radicales, cuando han reaccionado con
la amina libre de un polímero de poliamina, producen el conjugado o
el inmunógeno de fórmula III-B, en la que X' es
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{4} es como se define
anteriormente, que se conecta funcionalmente con el grupo amino
R_{4} del vehículo de poliamina o del polipéptido
inmunogénico.
Cuando X, en los compuestos de fórmula
II-B, es un grupo aldehído, estos compuestos pueden
ser conectados al grupo amina del polipéptido de poliamina o del
vehículo a través de un enlace de tipo amina mediante aminación
reductora. Se puede usar cualquier procedimiento convencional de
condensación de un aldehído con una amina, tal como a través de una
aminación reductora para formar este enlace. En este caso, X' de las
partes ligando de fórmula III-B es
Los compuestos 7-sustituidos de
fórmula II-B en la que B es -CH_{2}- se forman
haciendo reaccionar el grupo 7-hidroxilo del taxol
con un haluro de fórmula:
en la que p, Y y X son como se
definen
anteriormente.
En la formación del compuesto de fórmula
II-B del taxol, se puede utilizar cualquier
procedimiento convencional para hacer reaccionar un alcohol para
formar un éter en la condensación del compuesto de fórmula
V-C con la posición 7-hidroxilo del
taxol. El uso de un haluro en el compuesto de fórmula
V-C proporciona un medio eficaz para formar tal
éter mediante la condensación con el alcohol. Por otro lado, cuando
el compuesto de fórmula V-C contiene grupos
funcionales, que pueden interferir con esta reacción para formar el
compuesto de fórmula II-B, se pueden proteger estos
grupos funcionales por medio de grupos protectores adecuados que se
puedan eliminar tras esta reacción según lo descrito anteriormente
en la presente memoria.
Los compuestos 7-sustituidos de
fórmula II-B en la que B es
se producen haciendo reaccionar el
grupo 7-hidroxilo del taxol con un compuesto amino
de
fórmula:
en la que X, Y y p son como se
definen
anteriormente.
Tras convertir primero el grupo
7-hidroxilo del taxol en el grupo
cloroformiático
Se puede usar cualquier procedimiento
convencional para convertir un grupo hidroxilo en un grupo
cloroformiático. Tras la formulación de un cloroformiato, se
condensa el grupo halo del cloroformiato con el grupo amina del
compuesto de fórmula VI. Antes de esta reacción, se protegen el
grupo reactivo del taxol y/o del compuesto de fórmula VI según lo
descrito anteriormente en la presente memoria con un grupo protector
convencional.
Se pueden eliminar estos grupos protectores tras
esta condensación del haluro mediante procedimientos convencionales,
tales como los descritos anteriormente en la presente memoria.
El compuesto de fórmula II-B se
puede convertir en los inmunógenos y/o los reactivos de conjugados
de la presente haciendo reaccionar estos compuestos con una
poliamina o con un polipéptido. Se puede utilizar el mismo
polipéptido como vehículo y como polímero inmunogénico en el
inmunógeno de la presente con la condición de que la poliamina o el
polipéptido sean inmunológicamente activos. Sin embargo, para formar
los conjugados, es necesario que estos polímeros no produzcan una
respuesta inmunológica como la necesaria para los inmunógenos. Según
la presente, se pueden conjugar los diversos grupos funcionales
representados por X en los compuestos de fórmula
II-B con el material polimérico mediante
procedimientos convencionales de unión de un grupo funcional con un
grupo amina contenido en el polímero. Según una realización
preferida, en el compuesto de fórmula II-B, X es un
grupo de ácido carboxílico.
La presente invención también se refiere a
nuevos anticuerpos incluyendo anticuerpos monoclonales contra el
taxol producidos utilizando los inmunógenos anteriormente
mencionados. Según la presente, se ha descubierto que estos
anticuerpos producidos según la presente son selectivamente
reactivos con el taxol, y a diferencia de los anticuerpos de la
técnica anterior, no reaccionan con los metabolitos que
interferirían con los inmunoanálisis del taxol. Los más
problemáticos de estos metabolitos del taxol son el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el
3'-p-hidroxipaclitaxel. La capacidad de los anticuerpos de
la presente para no reaccionar con estos metabolitos
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y
3'-hidroxipaclitaxel convierte a estos anticuerpos
en particularmente valiosos para proporcionar un inmunoanálisis
para el taxol.
La presente invención se refiere a nuevos
anticuerpos y anticuerpos monoclonales contra el taxol según lo
definido en las reivindicaciones.
Los antisueros de la invención se pueden
producir convenientemente inmunizando animales huésped con los
inmunógenos de la presente. Los animales huésped adecuados incluyen
roedores tales como, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cerdos
de guinea y similares, o mamíferos superiores, tales como cabras,
ovejas, caballos y similares. Las dosis iniciales, las sangrías y
las inyecciones de refuerzo se pueden administrar y realizar según
protocolos aceptados para provocar respuestas inmunes en animales,
p. ej., en una realización preferida, los ratones recibieron una
dosis inicial de 100 ug de inmunógeno/ratón, i.p., y dos o más
inyecciones de refuerzo posteriores de entre 50 y 100 ug
inmunógeno/ratón en un período de seis meses. Mediante una sangría
periódica, se observaron las muestras de sangre de los ratones
inmunizados en cuanto al desarrollo de una respuesta inmune frente a
la unión del taxol utilizando inmunoanálisis convencionales. Estos
procedimientos proporcionan un modo conveniente de rastrear los
huéspedes que estén produciendo antisueros que tengan la actividad
deseada. También se rastrearon los anticuerpos contra los
metabolitos principales del taxol, y no se observó una unión
sustancial con estos compuestos.
Los anticuerpos monoclonales se producen
convenientemente inmunizando ratones Balb/c según el plan anterior
e inyectando después 100 ug de inmunógeno i.p. o i.v. en los ratones
en tres días sucesivos comenzando cuatro días antes de la fusión
celular. Por supuesto, también se pueden utilizar otros protocolos
en la técnica de los anticuerpos. El protocolo de inmunización
completo detallado en la presente memoria proporcionó un protocolo
óptimo para la respuesta del anticuerpo en suero contra el
taxol.
Se pueden usar linfocitos B obtenidos de bazo,
sangre periférica, nódulos linfáticos u otro tejido del huésped
como la célula productora de anticuerpos monoclonales. Los más
preferidos son los linfocitos B obtenidos del bazo. Los hibridomas
capaces de generar los anticuerpos monoclonales deseados de la
invención se obtienen fusionando tales linfocitos B con una línea
celular inmortal, que es una línea celular que confiere una
estabilidad del cultivo tisular a largo plazo en la célula híbrida.
En la realización preferida de la invención, la célula inmortal
puede ser una célula linfoblastoide o una célula de plasmacitoma,
tal como una célula de mieloma, una célula productora de
anticuerpos, pero también una célula maligna. Los hibridomas murinos
que producen anticuerpos monoclonales contra el taxol se forman
mediante la fusión de células de mieloma de ratón y células de bazo
procedentes de ratones inmunizados contra conjugados de
taxol-proteína. Es posible producir anticuerpos
monoclonales quiméricos y humanizados mediante la clonación de genes
que expresan los anticuerpos de las células de hibridoma y el
empleo de procedimientos de ADN recombinante actualmente ampliamente
conocidos en la técnica, bien para unir la subsecuencia de la
región variable de ratón con las regiones constantes humanas o para
combinar las regiones marco humanas con regiones de determinación
de la complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina de ratón o de
rata donante. En la solicitud de patente internacional WO 92/11018,
se expone un procedimiento mejorado para llevar a cabo la
humanización de anticuerpos monoclonales murinos que proporciona
anticuerpos de mayores afinidades.
Se pueden producir fragmentos polipeptídicos que
sólo comprendan una parte de la estructura primaria del anticuerpo,
fragmentos que poseen una o más actividades de la inmunoglobulina.
Estos fragmentos polipeptídicos se pueden producir mediante la
escisión proteolítica de anticuerpos intactos mediante
procedimientos ampliamente conocidos en la técnica, o insertando
codones de terminación en las ubicaciones deseadas de los vectores
de expresión que contienen los genes frente a los anticuerpos
usando una mutagénesis de sitio dirigida para producir fragmentos
Fab o fragmentos (Fab')_{2}. Se pueden producir anticuerpos
monocatenarios uniendo las regiones VL y VH con un ligador de ADN
(véase Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
85:5879-5883 (1988) y Bird et al., Science,
242:423-426 (1988)).
Los anticuerpos de la presente son selectivos
del taxol sin tener ninguna reactividad cruzada sustancial con
metabolitos del taxol tales como los metabolitos mencionados
anteriormente en la presente memoria. No tener una reactividad
cruzada sustancial pretende significar que los anticuerpos de la
presente tienen una reactividad cruzada con estos metabolitos, en
comparación con el taxol, de menos del 10%. Los anticuerpos de la
presente pueden ser reactivos con otros compuestos de tipo taxol,
tales como el docetaxel.
Según la presente, los conjugados y los
anticuerpos generados a partir de los inmunógenos de estos
compuestos de fórmula II-B, o mezclas de los
mismos, se pueden utilizar como reactivos para la determinación del
taxol en muestras de pacientes. Esta determinación se realiza por
medio de un inmunoanálisis. Para determinar la presencia del taxol
en una muestra de paciente, se puede utilizar cualquier
inmunoanálisis en el que los conjugados de reactivos formados a
partir de los compuestos de fórmula II-B compiten
con el taxol en la muestra por los sitios de unión de los
anticuerpos generados según la presente. La manera de llevar a cabo
tal análisis para el taxol en una muestra sospechosa de contener
taxol comprende combinar (a) una muestra en medio acuoso, (b) un
anticuerpo contra el taxol generado según la presente y (c) los
conjugados formados a partir de los compuestos de fórmula
II-B, o mezclas de los mismos. La cantidad de taxol
en la muestra se puede determinar midiendo la inhibición de la
unión con el anticuerpo específico de una cantidad conocida del
conjugado añadida a la mezcla de la muestra y el anticuerpo. El
resultado de la inhibición de tal unión de la cantidad conocida de
conjugados mediante la muestra desconocida se compara con los
resultados obtenidos en el mismo análisis utilizando soluciones
patrón conocidas de taxol. En la determinación de la cantidad de
taxol en una muestra desconocida, la muestra, los conjugados
formados a partir de los compuestos de fórmula II-B
y el anticuerpo se pueden añadir en cualquier orden.
Se pueden utilizar diversos procedimientos para
medir la cantidad de conjugado formado a partir de los compuestos
de fórmula II-B unidos al anticuerpo. Un
procedimiento es aquél en el que la unión de los conjugados con el
anticuerpo provoca una disminución en la velocidad de rotación de un
conjugado de fluoróforo. La cantidad de disminución en la velocidad
de rotación de un conjugado de fluoróforo en la mezcla líquida se
puede detectar mediante la técnica de polarización fluorescente,
tal como la revelada en la patente estadounidense n.º 4.269.511 y
la patente estadounidense n.º 4.420.568.
Por otro lado, se puede utilizar el anticuerpo
para revestir o ser absorbido en nanopartículas de modo que cuando
estas partículas reaccionan con los conjugados del taxol formados a
partir de los compuestos de fórmula II-B, estas
nanopartículas formen un agregado. Sin embargo, cuando las
nanopartículas que han absorbido o han sido revestidas con el
anticuerpo reaccionan con el taxol en la muestra, el taxol de la
muestra unido a estas nanopartículas no produce la agregación de
las nanopartículas con anticuerpo. La cantidad de agregación o
aglutinamiento se puede medir en la mezcla de análisis mediante
absorbancia.
Por otro lado, estos análisis se pueden llevar a
cabo teniendo bien el anticuerpo o los conjugados de taxol unidos a
un soporte sólido, tal como una placa de microvaloración o cualquier
otro soporte sólido convencional, incluyendo partículas sólidas. La
unión de anticuerpos y proteínas a tales partículas sólidas es
ampliamente conocida en la técnica. Se puede utilizar cualquier
procedimiento convencional para llevar a cabo tales uniones. En
muchos casos, para ayudar en la medición, se pueden colocar
marcadores sobre los anticuerpos, los conjugados o las partículas
sólidas, tales como marcadores radiactivos o marcadores enzimáticos,
como asistentes en la detección de la cantidad de los conjugados
formados a partir de compuestos de fórmula II-B que
esté unida o no unida con el anticuerpo. Otros marcadores adecuados
incluyen cromóforos, fluoróforos, etc.
Por conveniencia, los componentes del análisis
de la presente invención se pueden proporcionar en un equipo, una
combinación empaquetada con cantidades predeterminadas de nuevos
reactivos empleados en el análisis del taxol. Estos reactivos
incluyen el anticuerpo de la presente, así como los conjugados
formados a partir de los compuestos de fórmula
II-B, o mezclas de los mismos. Si se utiliza un
conjugado formado a partir de un compuesto de fórmula
II-B, es preferible que el anticuerpo generado por
el inmunógeno se forme a partir de un compuesto de fórmula
II-B. Sin embargo, puede que esto no sea necesario,
y que los anticuerpos y los conjugados de un análisis dado se
obtengan de cualquiera o de ambos de estos conjugados e
inmunógenos.
Además de estos reactivos necesarios, se pueden
incluir aditivos tales como reactivos auxiliares, por ejemplo,
estabilizadores, tampones y similares. Las cantidades relativas de
los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar
concentraciones en disolución de los reactivos que optimicen
sustancialmente la sensibilidad del análisis. Se pueden
proporcionar los reactivos en disolución o como un polvo seco,
habitualmente, liofilizado, incluyendo excipientes que en
disolución proporcionarán una solución de reactivos que tendrá las
concentraciones apropiadas para realizar el análisis.
En los ejemplos, Ph representa fenilo. En los
ejemplos, se usan las siguientes abreviaturas para designar los
siguientes términos:
- THF
- Tetrahidrofurano
- EA
- Alcohol etílico
- EtOAc
- Acetato de etilo
- DCM
- Diclorometano
- DMAP
- Dimetilaminopiridina
- NHS
- N-hidroxi-succinimida
- EDC
- Clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
- CCF
- Cromatografía de capa fina
- ANS
- Ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico
- i.p.
- Intraperitoneal
- HRP
- Peroxidasa de rábano picante
- TMB
- 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina
- TRIS
- Clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano
- ASB
- Albúmina de suero bovino
- BTG
- Tiroglobulina bovina
- PBS
- Solución salina tamponada con fosfato
- di
- Agua desionizada
En los ejemplos, los siguientes Esquema 1 y
Esquema 2 presentan los compuestos específicos preparados e
indicados mediante números en los ejemplos. Los esquemas son los
siguientes:
Esquema
1
Esquema
2
Se colocó taxol 1 (1,685 g) en un matraz de tres
cuellos con 26 ml de diclorometano recién destilado bajo un flujo
continuo de argón. Durante esta adición, se mantuvo la temperatura a
-15ºC, y también se añadieron diisopropilamina (1 eq.) y
cloroformiato de alilo (1,1 eq.). Se llevó la temperatura de la
mezcla de reacción hasta la temperatura ambiente y se dejó agitando
durante 4 horas. Tras este tiempo, se añadieron 40 ml de
diclorometano y se lavó la mezcla de reacción con HCl 0,1N (60 ml),
se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró sobre un
rotaevaporador para generar el producto 2, con el grupo
2'-hidroxilo del taxol protegido. Se dejó este
producto en un desecador durante 2 días y luego se usó en la
siguiente etapa y en el ejemplo 2 sin mayor purificación.
Entonces, se disolvió el producto 2 en 40 ml de
THF bajo argón mientras se mantenía la temperatura a -15ºC. Después
se añadió a esta solución primero NaH (2 eq.) y, tras 10 minutos,
ácido 5-bromo-valérico (1,1 eq.
disueltos en 3 ml de THF y añadidos lentamente) para generar 3 como
un producto en la mezcla de reacción. Tras una confirmación
mediante CCF del producto 3, se añadieron 4,4 ml de HCl 2N en gotas
a esta mezcla de reacción. Se lavó la mezcla de reacción que
contenía el producto 3 con agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se
concentró sobre un rotaevaporador y luego se purificó. Se purificó
el producto 3 sobre una columna de gel de sílice, se eluyó con
EtOAc al 15%:DCM hasta EtOAc al 20%:DCM, produciendo 1,1611 g de
producto puro 3.
Se disolvió el producto 3 purificado en 40 ml de
diclorometano bajo argón y luego se añadió PhSiH_{3} (6,25 eq) a
esta solución junto con Pd(PPh_{3})_{4} (0,05
eq.). Se dejó reposar la mezcla de reacción resultante durante 1
hora. Tras ese tiempo, se añadieron 12 ml de MeOH a la mezcla de
reacción y se agitó la mezcla de reacción resultante durante 10
minutos. Se evaporó esta mezcla de reacción hasta la sequedad para
generar el producto 4 con el grupo 2'-hidroxilo
desprotegido. Se purificó el producto 4 de la mezcla de reacción
sobre una columna de gel de sílice usando EtOAc al 30%:DCM como
sistema disolvente y se aisló como un polvo de color hueso (817 mg;
43,4% en peso producido a partir del material inicial). Se disolvió
el producto 4 purificado (355 mg; 0,37 mmoles) en 15 ml de
diclorometano. Luego se añadieron
N-hidroxi-succinimida (2 eq.) y EDC (2 eq.)
bajo argón y se dejó agitando la mezcla de reacción resultante
durante una noche. Se lavó la mezcla de reacción que contenía el
producto 5 con HCl 0,1N y luego con H_{2}O tan rápidamente como
fue posible. Se secó sobre Na_{2}SO_{4} la mezcla de reacción
que contenía el producto 5 y se concentró sobre un rotaevaporador
bajo un alto vacío para producir 401 mg (pureza del 99,9%) del
producto 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió cloruro de tionilo lentamente a una
suspensión de ácido 6-aminohexanoico (3 g; 22,87
mmoles) en alcohol alílico (14 ml; exceso). Se agitó la mezcla de
reacción a temperatura ambiente durante una noche para producir
éster alílico de ácido 4-aminohexanoico 6. Tras
eliminar el exceso de alcohol alílico, se secó el producto de éster
alílico de ácido 4-aminohexanoico (3,9 g; sólido
cristalino blanco) bajo un alto vacío.
Se añadió trietilamina (1,57 mmoles) seguida de
cloroformiato de p-nitrofenilo (103 mg; 0,51 mmoles) a una
solución del producto 2 de taxol alilo-protegido
producido en el ejemplo 1 (400 mg; 0,43 mmoles) y DMAP (191,5 mg;
1,57 mmoles) en DCM (10 ml) bajo nitrógeno. Entonces, se agitó la
mezcla de reacción a la temperatura ambiente durante 5,5 horas y
luego se añadió una solución de la amina 6, preparada anteriormente,
como un sólido cristalino blanco (1,1 eq.) disuelto en DCM (2 ml)
para formar el producto 7. Se dejó agitando la mezcla resultante
durante una noche a temperatura ambiente. Se retiró de esta mezcla
de reacción resultante el DCM al vacío y se purificó el producto de
reacción 7 crudo sobre una columna de gel de sílice con EtOAc al
15%/DCM como sistema disolvente para generar el producto 7
purificado (320 mg; 66,1%) como un sólido de color hueso.
Se disolvió el producto 7 purificado, preparado
anteriormente, en 30 ml de diclorometano bajo argón y luego se
añadió PhSiH_{3} (6,25 eq) junto con
Pd(PPh_{3})_{4} (0,05 eq.). Tras 1,5 horas, se
añadieron 12 ml de MeOH y se agitó durante 10 minutos más. Se
evaporó la mezcla de reacción hasta la sequedad para generar el
producto 8 de 7-hidroxi-taxol
derivado. Se purificó este producto 8 sobre una columna de gel de
sílice (MeOH al 10%:EtOAc como sistema disolvente) y se aisló como
una goma de color hueso (236 mg; 82,8%), rendimiento del 54,73% a
partir del material inicial.
\vskip1.000000\baselineskip
A 6,8 ml de BTG (36,4 mg/ml) en tampón de
fosfato 50 mM (50 mM, pH 7,5), se añadió dimetilsulfóxido (DMSO)
(13,8 ml) en gotas para formar una solución. A 16,6 ml de esta
solución, se añadió en gotas el derivado de taxol 5 de éster de
N-hidroxisuccinimida activado purificado preparado en el
ejemplo 1 (1,26 ml de una solución de 50 mg/ml de DMSO). Se dejó
agitando la mezcla resultante durante una noche a temperatura
ambiente para conjugar la BTG con el derivado de taxol 5
purificado. Entonces se purificó este conjugado inmunogénico
mediante diálisis y se caracterizó según procedimientos descritos
anteriormente (Wu et. al., Bioconj. Chem., 8: pp
385-390, 1997, Li et. al., Bioconj. Chem., 8:
pp. 896-905, 1997, Salamone et. al., J. Forensic
Sci. pp. 821-826, 1998).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron diez ratones Balb/c hembra i.p.
con 100 \mug/ratón de taxol-BTG (preparado en el
ejemplo 3) emulsionado en adyuvante completo de Freund. Cuatro
semanas después de la inyección inicial, se volvieron a inyectar
una vez a los ratones 100 \mug de taxol-BTG/ratón
emulsionado en adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de
la inyección de refuerzo, se realizaron extracciones de sangre para
analítica en cada ratón mediante sangrías orbitales. El
anti-suero de estas sangrías para analítica contenía
los anticuerpos contra el taxol evaluados en los ejemplos 7, 8a y
9. Para los anticuerpos monoclonales, comenzando cuatro días antes
de la fusión, se inyectaron a los ratones i.p. 100 \mug de
taxol-BTG en PBS en tres días sucesivos. Se
aislaron células de bazo de los ratones seleccionados y se
fusionaron con 2 x 10^{7} células de mieloma SP_{2}/0 con
polietilenglicol 1500 al 50% según el procedimiento de Coligan, J.
E. et al., eds., "Current Protocols in Immunology",
2.5.1-2.5.8, (1992), Wiley & Sons, NY. Se
emplacaron las células fusionadas sobre diez placas de 96 pocillos
en DMEM/F12 complementado con FetalClone I al 20%,
L-glutamina al 2% (100 mM) y HAT 50X al 2%. Dos
semanas después, se analizó el sobrenadante de hibridoma en cuanto a
la presencia de anticuerpos contra taxol-BTG
mediante ELISA (ejemplo 8b). Las células de los pocillos que dieron
resultados positivos en el ELISA (ejemplo 8b) se expandieron a
placas de 24 pocillos. Se subclonaron una vez o dos veces los clones
positivos según el ELISA mediante dilución limitante según el
procedimiento revelado en Coligan, J.E. et al., eds.,
"Current Protocols in Immunology",
2.5.8-2.5.17, (1992), Wiley & Sons, NY. La unión
al taxol de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma que
contenían anticuerpo monoclonal de los subclones seleccionados se
confirmó mediante un ELISA competitivo (ejemplos 8a y 9). Se
analizaron estos anticuerpos monoclonales en cuanto a su unión con
el taxol y su reactividad cruzada con metabolitos de taxol mediante
un análisis competitivo indirecto de las placas de microvaloración
según lo descrito en el ejemplo 9.
\vskip1.000000\baselineskip
A 20 ml de solución de ASB (50 mg/ml) en tampón
de fosfato (50 mM, pH 7,5), se añadieron 20 ml de dimetilsulfóxido
(DMSO) en gotas. A 18 ml de esta solución, se añadió en gotas el
derivado de taxol 5 de éster de N-hidroxisuccinimida
activado purificado preparado como en el ejemplo 1 (0,316 ml de una
solución de 50 mg/ml de DMSO). Se dejó agitar la mezcla durante una
noche a temperatura ambiente para producir el conjugado del éster 5
activado y ASB. Entonces se purificó este conjugado mediante
diálisis y se caracterizó según procedimientos descritos
anteriormente (Wu et. al., Bioconj. Chem., 8: pp
385-390, 1997, Li et. al., Bioconj. Chem., 8:
pp. 896-905, 1997, Salamone et. al., J. Forensic
Sci. pp. 821-826, 1998).
\vskip1.000000\baselineskip
A 25 mg del derivado de taxol 8, preparado en el
ejemplo 2, en cloruro de metileno (3 ml), se añadieron EDC (28 mg)
y NHS (16,8 mg). Se agitó la solución en una atmósfera de nitrógeno
a temperatura ambiente durante 24 h. A esta mezcla, se añadieron 7
ml de más cloruro de metileno seguidos de 2 ml de ácido clorhídrico
(0,3N). Se agitó la mezcla de reacción durante 15 minutos y se
separó la capa orgánica, se secó y se evaporó hasta producir un
residuo blanco amorfo que era el éster activado de NHS del derivado
de taxol 8. Se disolvió este residuo en 2 ml de DMSO y se añadieron
1,25 ml de esta solución en gotas a 40 ml de una solución de ASB (25
mg/ml; 20 ml de DMSO/20 ml de fosfato 50 mM, pH 7,5). Se agitó la
solución durante 60 horas a temperatura ambiente para producir el
conjugado de ASB y el derivado de taxol 8. Se purificó este
conjugado mediante diálisis según procedimientos descritos
anteriormente (Wu et. al., Bioconj. Chem., 8: pp
385-390, 1997, Li et. al., Bioconj. Chem.,
8: pp. 896-905, 1997, Salamone et. al., J.
Forensic Sci. pp. 821-, 826).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el procedimiento ELISA para medir las
concentraciones de taxol en placas de microvaloración de
poliestireno (Inmunomódulos C8 o F8 MaxiSorp de Nunc) optimizadas en
cuanto a la unión de proteínas y que contenían 96 pocillos por
placa. Se revistió cada pocillo con conjugado de
taxol-ASB (preparado como en el ejemplo 5)
añadiendo 300 \mul de conjugado de taxol-BSA a 10
\mug/ml en bicarbonato de sodio 0,05M, pH = 9,6, e incubando
durante tres horas a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos
con bicarbonato de sodio 0,05M, pH 9,6, y luego se bloquearon con
400 \mul de sacarosa al 5%, solución de caseinato de sodio al 0,2%
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras eliminar solución
de post-revestimiento, se secaron las placas a 37ºC
durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el procedimiento ELISA para medir las
concentraciones de taxol en placas de microvaloración de
poliestireno (Inmunomódulos C8 o F8 MaxiSorp de Nunc) optimizadas en
cuanto a la unión de proteínas y que contenían 96 pocillos por
placa. Se revistió cada pocillo con conjugado de
taxol-ASB (preparado como en el ejemplo 6)
añadiendo 300 \mul de conjugado de taxol-BSA a 10
\mug/ml en bicarbonato de sodio 0,05M, pH = 9,6, e incubando
durante tres horas a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos
con bicarbonato de sodio 0,05M, pH 9,6, y luego se bloquearon con
400 \mul de sacarosa al 5%, solución de caseinato de sodio al 0,2%
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras eliminar la
solución de post-revestimiento, se secaron las
placas a 37ºC durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el procedimiento ELISA para rastrear
anticuerpos contra el taxol (producidos en el ejemplo 4) con las
placas de microvaloración que fueron sensibilizadas con
taxol-ASB según lo descrito en el ejemplo 7. El
análisis de rastreo de anticuerpos se realizó diluyendo los
antisueros que contenían anticuerpos contra el taxol (del ejemplo
4) hasta 1:100; 1:1.000; 1:10.000 y 1:100.000 en solución salina
tamponada con fosfato que contenía ASB al 0,1% y timerosal al
0,01%. Para la evaluación de anticuerpos monoclonales, se diluyeron
los sobrenadantes de hibridoma del ejemplo 4, que resultaron ser
positivos en cuanto a la presencia de anticuerpo mediante el
procedimiento de 8b, 1:2; 1:4; 1:8; 1:16, etc., en solución salina
tamponada con fosfato que contenía ASB al 0,1% y timerosal al
0,01%. Se añadieron a cada uno de los pocillos sensibilizados con
taxol-ASB (preparados en el ejemplo 7) 100 \mul
de anticuerpo diluido y se incubaron durante 10 minutos a
temperatura ambiente con agitación. Durante esta incubación, el
anticuerpo se une con el conjugado de taxol en el pocillo. Se
lavaron los pocillos de las placas tres veces con TRIS 0,02M, NaCl
al 0,9%, Tween-80 al 0,5% y timerosal al 0,001%, pH
7,8, para eliminar cualquier anticuerpo sin unir. Para detectar la
cantidad de anticuerpo contra el taxol unido al conjugado de
taxol-ASB en los pocillos, se añadieron a cada
pocillo 100 \mul de un conjugado de anticuerpo de cabra
anti-ratón-enzima HRP (Jackson
Immunoresearch) diluido hasta una actividad específica
predeterminada (aproximadamente 1/2000) en PBS con ASB al 0,1%; ANS
al 0,05%; timerosal al 0,01%, capaz de unirse específicamente con
inmunoglobulinas murinas y generar un producto coloreado cuando se
incuba con un sustrato. Tras una incubación de 10 minutos a
temperatura ambiente con agitación, durante la que el conjugado de
HRP secundario se une a los anticuerpos contra el taxol en los
pocillos, se volvieron a lavar las placas tres veces para eliminar
el conjugado secundario sin unir. Para desarrollar un color medible
en los pocillos, el lavado fue seguido por la adición de 100 \mul
de TMB (sustrato líquido de TMB, Sigma), un sustrato para la HRP,
hasta desarrollar un color durante una incubación de 10 minutos con
agitación a temperatura ambiente. Tras la incubación para el
desarrollo del color, se añadieron 50 \mul de solución de
detención (fluoruro de sodio al 1,5% en H_{2}O di) a cada pocillo
hasta detener el desarrollo de la coloración y, tras 10 segundos de
agitación, se determinó la absorbancia a 650 nm (lector de placas de
Molecular Devices). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue
proporcional a la absorbancia medida y se expresó como la dilución
(título) resultante en una absorbancia de 1,5. Los títulos se
determinaron representando el Log de la dilución del anticuerpo
medido (eje X) frente a la absorbancia a 650 nm (eje Y) y
extrapolando el título a una absorbancia de 1,5. El título
determinó la concentración (dilución) del anticuerpo usado en el
análisis competitivo indirecto de las placas de microvaloración
descrito en el ejemplo 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el procedimiento ELISA para rastrear
anticuerpos monoclonales contra el taxol (producidos en el ejemplo
4) con las placas de microvaloración que fueron sensibilizadas con
taxol-ASB según lo descrito en el ejemplo 6. Se
añadieron a cada uno de los pocillos sensibilizados con
taxol-ASB (preparados en el ejemplo 7b) 50 ul de
solución salina tamponada con fosfato que contenía ASB al 0,1% y
timerosal al 0,01%, y luego se añadieron 50 \mul de sobrenadante
de cultivo monoclonal y se incubaron durante 10 minutos a
temperatura ambiente con agitación. Durante esta incubación, el
anticuerpo se une con el conjugado de taxol en el pocillo. Se
lavaron los pocillos de las placas tres veces con TRIS 0,02M, NaCl
al 0,9%, Tween-80 al 0,5% y timerosal al 0,001%, pH
7,8, para eliminar cualquier anticuerpo sin unir. Para detectar la
cantidad de anticuerpo contra el taxol unido al conjugado de
taxol-ASB en los pocillos, se añadieron a cada
pocillo 100 \mul de un conjugado de anticuerpo de cabra
anti-ratón-enzima HRP (Jackson
Immunoresearch) diluido hasta una actividad específica
predeterminada (aproximadamente 1/2000) en PBS con ASB al 0,1%; ANS
al 0,05%; timerosal al 0,01%, capaz de unirse específicamente con
inmunoglobulinas murinas y generar un producto coloreado cuando se
incuba con un sustrato. Tras una incubación de 10 minutos a
temperatura ambiente con agitación, durante la que el conjugado de
anticuerpo de cabra
anti-ratón-enzima HRP se une a los
anticuerpos contra el taxol en los pocillos, se volvieron a lavar
las placas tres veces para eliminar el conjugado de anticuerpo de
cabra anti-ratón-enzima HRP sin
unir. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado
fue seguido por la adición de 100 \mul de TMB (sustrato líquido
de TMB, Sigma), un sustrato para la HRP, hasta desarrollar un color
durante una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura
ambiente. Tras la incubación para el desarrollo del color, se
añadieron 50 \mul de solución de detención (fluoruro de sodio al
1,5% en H2O di) a cada pocillo hasta detener el desarrollo de la
coloración y, tras 10 segundos de agitación, se determinó la
absorbancia a 650 nm (lector de placas de Molecular Devices). La
cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la
absorbancia medida. Las muestras con una absorbancia de más de dos
veces el fondo fueron designadas positivas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el procedimiento ELISA para medir las
concentraciones de taxol con las placas de microvaloración que
fueron sensibilizadas con taxol-ASB descritas en el
ejemplo 7a. Se diluyeron taxol, bacatina III,
3'-p-hidroxipaclitaxel,
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y
taxotere 10 veces en PBS o en PBS que contenía ASB al 0,1% y
timerosal al 0,01% en un intervalo de concentraciones de 0,01 hasta
10.000 ng/ml. El análisis se realizó incubando 50 \mul de los
analitos que se iban a medir con 50 \mul de anticuerpo (producido
en el ejemplo 4) diluidos hasta un título determinado en el ejemplo
8a. Durante la incubación de 10 minutos (T.A., con agitación), hay
una competición en la unión del anticuerpo por el conjugado de
taxol en el pocillo y el analito en la solución. Tras esta
incubación, se lavaron los pocillos de la placa tres veces con TRIS
0,02M, NaCl al 0,9%, Tween-80 al 0,5% y timerosal
al 0,001%, pH 7,8, para eliminar cualquier material que no se
hubiera unido. Para detectar la cantidad de anticuerpo contra el
taxol unido al conjugado de taxol-ASB en los
pocillos, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de un anticuerpo
secundario que era un conjugado de anticuerpo contra la globulina
de cabra anti-ratón-enzima HRP
(Jackson Immunoresearch) diluido hasta una actividad específica
predeterminada (aproximadamente 1/2000) en PBS con ASB al 0,1%; ANS
al 0,05%; timerosal al 0,01%, capaz de unirse específicamente con
inmunoglobulinas murinas y generar un producto coloreado cuando se
incuba con un sustrato. Tras una incubación de 10 minutos a
temperatura ambiente con agitación, durante la que el conjugado de
HRP secundario se une a los anticuerpos contra el taxol en los
pocillos, se volvieron a lavar las placas tres veces para eliminar
el conjugado secundario sin unir. Para desarrollar un color medible
en los pocillos, el lavado fue seguido por la adición de 100 \mul
de TMB (sustrato líquido de TMB, Sigma), un sustrato para la HRP,
hasta desarrollar un color durante una incubación de 10 minutos con
agitación a temperatura ambiente. Tras la incubación para el
desarrollo del color, se añadieron 50 \mul de solución de
detención (fluoruro de sodio al 1,5% en H_{2}O di) a cada pocillo
hasta detener el desarrollo de la coloración y, tras 10 segundos de
agitación, se determinó la absorbancia a 650 nm (lector de placas
de Molecular Devices). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue
proporcional a la absorbancia medida e inversamente proporcional a
la cantidad de taxol de la muestra. Se compara la absorbancia del
color en los pocillos que contenían analito con la de los que no
tienen analito y se genera una curva estándar. El valor de la
CI_{50} para un analito dado fue definido como la concentración
de analito que es necesaria para inhibir el 50% de la absorbancia
para los pocillos que no contienen analito. Se calculó la
reactividad cruzada de un analito dado como la proporción entre la
CI_{50} para el taxol y la CI_{50} para la bacatina III, el
3'-p-hidroxipaclitaxel,
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el
taxotere expresadas como un porcentaje. Para evaluar las
reactividades cruzadas de la bacatina III, el
3'-p-hidroxipaclitaxel, el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el
taxotere con los anticuerpos policlonales contra el taxol generados
en el ejemplo 4, se elaboró una mezcla de antisueros de sangrías
orbitales. Esta mezcla combinaba los anticuerpos de cuatro ratones,
que tenían individualmente valores de CI_{50} < 20 ng/ml para
el taxol. Cuando se midió con esta mezcla de anticuerpos, el
porcentaje de reactividades cruzadas en comparación con el taxol
para la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel y el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel fue
menor del 10%. La reactividad cruzada con el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel fue
menor del 60%. En la tabla I, figuran los resultados. Para evaluar
las reactividades cruzadas de la bacatina III, el
3'-p-hidroxipaclitaxel, el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el
taxotere con los anticuerpos monoclonales contra el taxol generados
en el ejemplo 4, se usaron sobrenadantes de cultivos de hibridoma
de monoclonales subclonados seleccionados. Cuando se midió con dos
de estos anticuerpos monoclonales, el porcentaje de reactividades
cruzadas en comparación con el taxol para la bacatina III, el
3'-p-hidroxipaclitaxel y el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel fue
menor del 6%. En la tabla II, figuran los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el procedimiento ELISA para medir las
concentraciones de taxol con las placas de microvaloración que
fueron sensibilizadas con taxol-ASB descritas en el
ejemplo 7b. Se diluyeron taxol, bacatina III,
3'-p-hidroxipaclitaxel,
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y
taxotere 10 veces en PBS o en PBS que contenía ASB al 0,1% y
timerosal al 0,01% en un intervalo de concentraciones de 0,01 hasta
10.000 ng/ml. El análisis se realizó incubando 50 \mul de los
analitos que se iban a medir con 50 \mul de anticuerpo (producido
en el ejemplo 4) diluidos hasta un título determinado en el ejemplo
8a. Durante la incubación de 10 minutos (T.A., con agitación), hay
una competición en la unión del anticuerpo por el conjugado de
taxol en el pocillo y el analito en la solución. Tras esta
incubación, se lavaron los pocillos de la placa tres veces con TRIS
0,02M, NaCl al 0,9%, Tween-80 al 0,5% y timerosal
al 0,001%, pH 7,8, para eliminar cualquier material que no se
hubiera unido. Para detectar la cantidad de anticuerpo contra el
taxol unido al conjugado de taxol-ASB en los
pocillos, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de un anticuerpo
secundario que era un conjugado de anticuerpo contra la globulina
de cabra anti-ratón-enzima HRP
(Jackson Immunoresearch) diluido hasta una actividad específica
predeterminada (aproximadamente 1/2000) en PBS con ASB al 0,1%; ANS
al 0,05%; timerosal al 0,01%. Este anticuerpo secundario fue capaz
de unirse específicamente con inmunoglobulinas murinas generando un
producto coloreado cuando se incubó con un sustrato. Tras una
incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con agitación,
durante la que el conjugado de HRP secundario se une a los
anticuerpos contra el taxol en los pocillos, se volvieron a lavar
las placas tres veces para eliminar el conjugado secundario sin
unir. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado
fue seguido por la adición de 100 \mul de TMB (sustrato líquido de
TMB, Sigma), un sustrato para la HRP, hasta desarrollar un color
durante una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura
ambiente. Tras la incubación para el desarrollo del color, se
añadieron 50 \mul de solución de detención (fluoruro de sodio al
1,5% en H_{2}O di) a cada pocillo hasta detener el desarrollo de
la coloración y, tras 10 segundos de agitación, se determinó la
absorbancia a 650 nm (lector de placas de Molecular Devices). La
cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la
absorbancia medida e inversamente proporcional a la cantidad de
taxol de la muestra. Se compara la absorbancia del color en los
pocillos que contenían analito con la de los que no tienen analito
y se genera una curva estándar. El valor de la CI_{50} para un
analito dado fue definido como la concentración de analito que es
necesaria para inhibir el 50% de la absorbancia para los pocillos
que no contienen analito. Se calculó la reactividad cruzada de un
analito dado como la proporción entre la CI_{50} para el taxol y
la CI_{50} para la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel,
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el
taxotere expresadas como un porcentaje. Para evaluar las
reactividades cruzadas de la bacatina III, el
3'-p-hidroxipaclitaxel, el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el
taxotere con los anticuerpos contra el taxol generados en el
ejemplo 4, se usó la mezcla del ejemplo 9a. Cuando se midió con esta
mezcla de anticuerpos, los porcentajes de reactividades cruzadas en
comparación con el taxol para la bacatina III, el
3'-p-hidroxipaclitaxel, el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el
taxotere (docetaxel) fueron menores del 2%. En la tabla I, figuran
los resultados. Cuando se midió con anticuerpos monoclonales
seleccionados (como en el ejemplo 9a), los porcentajes de
reactividades cruzadas en comparación con el taxol para la bacatina
III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel y el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel fueron
menores del 9%. En la tabla I, figuran los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según lo observado en la tabla anterior, los
anticuerpos de la presente no son reactivos con los metabolitos
principales del taxol, pero son reactivos con el taxol y los
fármacos de tipo taxol. Cuando los pacientes que están recibiendo
taxol no están recibiendo simultáneamente docetaxil, se pueden usar
estos anticuerpos en un inmunoanálisis que puede detectar y
controlar específicamente el taxol en muestras de fluidos de
pacientes que estén siendo tratados con taxol.
Claims (25)
1. Un inmunoanálisis para detectar el taxol en
una muestra que comprende proporcionar una mezcla que contiene
dicha muestra, un anticuerpo que es selectivamente reactivo con el
taxol y que tiene una reactividad cruzada con el
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el
3'-p-hidroxipaclitacel en comparación con el taxol de menos
del 10% y un conjugado de un vehículo con un compuesto de
fórmula:
en la que B es -CH_{2}-
o
Y es un grupo espaciador orgánico;
X es un grupo funcional terminal capaz de unirse
a un polímero de poliamina;
p es un número entero de 0 a 1; y
Ph es fenilo,
que hace que el taxol de la muestra y dicho
conjugado se unan con dicho anticuerpo y, a partir de entonces,
medir la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que está unido
o no unido a dicho anticuerpo mediante lo cual se puede determinar
la presencia de taxol en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un inmunoanálisis según la reivindicación 1,
en el que p es 0.
3. Un inmunoanálisis según la reivindicación 1,
en el que p es 1.
4. Un inmunoanálisis según la reivindicación 3,
en el que Y es alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de
carbono,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que n y o son números enteros
de 0 a 6, y m es un número entero de 1 a
6.
5. Un inmunoanálisis según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que X es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{3} es hidrógeno o
tomado junto con su átomo de oxígeno unido forma un éster reactivo y
R_{4} es oxígeno o
azufre.
6. Un inmunoanálisis según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que X es
y R_{3} es
hidrógeno.
7. Un inmunoanálisis según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que X es
y R_{3} forma un éster
reactivo.
8. Un inmunoanálisis según la reivindicación 7,
en el que el éster formado es un alquiléster inferior, un
imidoéster o un amidoéster.
9. Un inmunoanálisis según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la muestra es una muestra
humana.
10. Un inmunoanálisis según una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se
genera a partir de un inmunógeno que comprende un polímero
inmunogénico ligado a un compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Ph, p, Y, X y B son como
se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
11. Un inmunoanálisis según una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo está unido
a un soporte sólido.
12. Un inmunoanálisis según la reivindicación
11, en el que el soporte sólido es placas de microvaloración.
13. Un inmunoanálisis según la reivindicación
11, en el que el soporte sólido es nanopartículas.
14. Un anticuerpo que es selectivamente reactivo
con el taxol y que tiene una reactividad cruzada con
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y
3'-p-hidroxipaclitacel en comparación con el taxol de menos
del 10%.
15. Un anticuerpo según la reivindicación 14, en
el que dicho anticuerpo deriva de ratones, conejos o ratas.
16. Un anticuerpo según la reivindicación 14 o
la reivindicación 15, anticuerpo que es un anticuerpo
monoclonal.
17. Un anticuerpo según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, anticuerpo que deriva de un inmunógeno de
un polímero de poliamina con un compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Ph, p, Y, X y B son como
se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
18. Un conjugado de un vehículo con un compuesto
de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Ph, p, Y, X y B son como
se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
19. Un conjugado según la reivindicación 18, en
el que el vehículo contiene uno o más grupos amino ligados por
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{4} es oxígeno o
azufre.
20. Un inmunógeno que contiene un polímero de
poliamina inmunogénico ligado a un compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Ph, p, Y, X y B son como
se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
21. Un inmunógeno según la reivindicación 20, en
el que el polímero inmunogénico contiene uno o más grupos amino
ligados por
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{4} es oxígeno o
azufre.
22. Un equipo para determinar la presencia de
taxol en una muestra de paciente que comprende reactivos en
recipientes separados, siendo uno de los reactivos un conjugado de
un vehículo con un compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Ph, p, Y, X y B son como
se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8,
y conteniendo el segundo recipiente un
anticuerpo que es selectivamente reactivo con el taxol y que tiene
una reactividad cruzada con
6-\alpha-hidroxipaclitaxel y
3'-p-hidroxipaclitacel en comparación con el taxol de menos
del 10%.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Un equipo según la reivindicación 22, en el
que dicho conjugado está presente en una cantidad predeterminada en
dicho primer recipiente.
24. Un equipo según la reivindicación 22 o la
reivindicación 23, equipo que se usa para determinar la cantidad de
taxol en dicha muestra.
25. Un equipo según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, en el que dicho anticuerpo se genera a
partir de un inmunógeno de un polipéptido de poliamina inmunogénico
ligado a un compuesto de fórmula:
en la que Ph, p, Y, X y B son como
se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
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