ES2346941T3 - Sialidasa recombinante de celula cho. - Google Patents

Abstract

UNA LINEA CELULAR RECOMBINANTE TIENE UNA SIALIDASA CONSTITUTIVA CUYA EXPRESION FUNCIONAL SE INTERRUMPE POR EJEMPLO POR RECOMBINACION HOMOLOGA O UTILIZANDO RNA ANTI-SENTIDO. LA SIALIDASA SE PURIFICA A PARTIR DEL FLUIDO DE CULTIVO CELULAR DE CELULAS DE OVARIO DE HAMSTER CHINO. EL DNA QUE CODIFICA LA SIALIDASA SE OBTIENE UTILIZANDO UNA SONDA OLIGONUCLEOTIDICA DISEÑADA UTILIZANDO DATOS DE SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LA SIALIDASA, Y EL DNA SE EXPRESA EN CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS CON EL DNA.

Description

Sialidasa recombinante de célula CHO.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a la actividad sialidasa, en particular a líneas celulares recombinantes que tienen actividad sialidasa modificada.

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Antecedentes de la invención

Las sialidasas son una familia de enzimas glucohidrolíticos que cortan los residuos de ácido siálico de los componentes oligosacáridos de las glucoproteínas y glucolípidos. Se han estudiado las enzimas virales y bacterianas, por ejemplo las sialidasas de la influenza en particular (Air, G. M. y Laver, W.G. (1989) Proteins: Struct. Func. Genet., 6: 341), aunque las sialidasas de mamífero no se han caracterizado bien. En la mayor parte de los casos, los estudios de sialidasas de mamífero se han reducido a la investigación de las especificidades de sustrato y al análisis de la cinética mediante la utilización de preparaciones parcialmente purificadas, aunque una sialidasa de hígado de rata y músculo se ha purificado hasta su homogeneidad (Miyagi, T. y Tsuiki, S. (1985) J. Biol. Chem., 260:6710). Las sialidasas se ha identificado en varios orgánulos celulares: la membrana plasmática (Schengrund, C., Rosenberg, A. y Repman, M.A. (1976) J. Biol. Chem., 79:555), los lisosomas y el citosol (Tulsiani, D.R.P. y Carubelli, R. (1970) J. Biol. Chem., 245:1821).

Las glucoproteínas se producen a menudo mediante la expresión de genes codificantes en células huésped recombinantes in vitro, que tienen los componentes enzimáticos normales de la maquinaria de glucosilación celular. El ácido siálico en el componente oligosacárido de una glucoproteína está implicado en la mediación del aclaramiento del suero y afecta las propiedades físicas, químicas e inmunogénicas de la molécula proteica. Por ello es importante mantener el contenido de ácido siálico de las glucoproteínas, en particular de aquellas proteínas que se desea utilizar como agentes terapéuticos.

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Descripción resumida de la invención

En la presente invención se describe la modificación, en una línea celular recombinante, de la expresión constitutiva de genes que codifican enzimas que están implicadas en la destrucción o producción de las porciones de oligosacáridos de glucoproteínas. En particular, la modificación en la línea celular recombinante puede realizarse de tal manera que asegure que el gen o genes de interés no se expresen de modo funcional. Un gen de particular interés es un gen de sialidasa en una línea celular recombinante, especialmente un gen que codifica para una sialidasa citosólica. Ejemplos de líneas celulares son aquellos derivados de ovarios de hámster chino y de riñones embrionarios humanos.

En la línea celular recombinante, la expresión del gen funcional se puede alterar mediante mutación, adición, o deleción de uno o más nucleótidos. Dicha mutación, adición o deleción puede realizarse mediante cualquiera de los procedimientos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo la recombinación homóloga entre el gen genómico y una secuencia de ácido nucleico diferente pero ampliamente homóloga introducida en las células. El gen se puede delecionar completamente.

Puede suceder que el gen no se exprese de modo funcional debido a la alteración de la función génica por la regulación de su transcripción o traducción, por ejemplo, utilizando ARN antisentido.

La presente invención proporciona una sialidasa sustancialmente homogénea que se puede obtener a partir de fluido de cultivo celular de una línea celular de ovario de hámster chino, o a partir de células huésped recombinantes que son capaces de expresar la sialidasa. Las características de dicha sialidasa se describen y discuten infra.

También se describen anticuerpos que son capaces de unirse a la sialidasa. Dichos anticuerpos son útiles para fines de diagnóstico, tales como la identificación o determinación de sialidasa en una muestra de prueba, para fines terapéuticos, y para la purificación de la sialidasa.

La presente invención también proporciona una sonda de oligonucleótidos que es útil en la obtención de un gen que codifica sialidasa y una secuencia de ácidos nucleicos obtenida mediante un proceso que comprende hibridar la sonda con ácido nucleico en una biblioteca de ADN de mamífero para formar híbridos que se pueden aislar. El ácido nucleico se puede utilizar para la expresión de sialidasa. Se puede modificar de todas las maneras, por ejemplo, mediante mutación, adición o deleción de uno o más nucleótidos, amplificación, separación y ajuste de tamaño.

También se proporciona la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica sialidasa aislado de células de ovarios hámster chino, así como vectores recombinantes y células huésped que comprende ADN aislado que tiene la secuencia de nucleótidos. Los vectores y células huésped se pueden utilizar, por ejemplo, para producir la enzima sialidasa recombinante.

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden sialidasa en una cantidad eficaz en la eliminación de residuos de ácido siálico de los componentes de oligosacárido de glicoproteínas y glicolípidos en un ser humano u otros mamíferos.

Se puede alterar un gen de sialidasa de una célula de modo que no se exprese funcionalmente, siendo el nivel de sialidasa funcional producido por las células de tal magnitud que los residuos de ácido siálico en las cadenas laterales de carbohidratos de la glicoproteína producida por las células no se cortan, o no se cortan en un grado que afecte a la función de la glicoproteína. Dichas células son útiles como células huésped para la expresión de glicoproteínas recombinantes a partir de ácido nucleico transformado en las células en condiciones apropiadas. Las glicoproteínas producidas mediante la expresión de ácido nucleico codificante introducido en estas células deberían tener intactas y funcionales las cadenas laterales de carbohidrato. Por tanto, las células deficientes en sialidasa son de especial utilidad para la expresión recombinante de proteínas que tengan residuos de ácido siálico que son necesarios para la actividad enzimática, inmunológica, u otra actividad biológica deseadas de la proteína.

Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Perfil de elución de enfoque cromatográfico de sialidasa de células CHO sobre DEAE Sepharose. La columna se eluyó con Politampón 96 como se describe en Métodos, o=pH de cada fracción. La localización de la enzima se determinó mediante ensayo utilizando 4-MU-Neu5Ac como sustrato O = actividad enzimática. El contenido proteico (\Delta) de cada fracción se determinó mediante análisis colorimétrico.

Figura 2: Gel de poliacrilamida-SDS de la sialidasa de células CHO teñido para proteínas. Carril A: sialidasa de células CHO, 2 \mug. Carril B: estándares de peso molecular, fosforilasa b, 97.400; albúmina sérica bovina, 66.200; ovoalbúmina, 45.000; anhidrasa carbónica, 31.000; inhibidor de tripsina de soja, 21.500; y lisozima, 14.400.

Figura 3: Gel de isoelectroenfoque de poliacrilamida de la sialidasa de células CHO. El gel se reveló como se describe en Métodos y se tiñó para proteínas. Carril 1: estándares proteicos; ribonucleasa, pl=9,5; mioglobina de ballena (recombinante), pl=8,3; mioglobina de caballo, pl=7,3; conalbúmina, pl=5,9; albúmina sérica bovina, pl=4,7; amiloglucosidasa pl=3,5. Carril b: sialidasa de CHO purificada, S_{a} y S_{b}, un total de 2 \mug cargados. Carril C: gel teñido con sustrato fluorogénico. Antes de la tinción de proteínas, el gel se impregnó con 4-MU-Neu5Ac y se incubó a 37ºC. El gel se visualizó con luz ultravioleta con el fin de detectar aquellas bandas con actividad sialidasa.

Figura 4: pH-dependencia de la actividad enzimática. Los ensayos se llevaron a cabo bien con la enzima purificada (puntos rellenos) o bien con los lisados celulares crudos (puntos vacíos) utilizando 4-MU-Neu5Ac como sustrato (ver Métodos). Tampón fosfato: cuadrados. Tampón acetato: triángulos.

Figura 5: Detección del inmunoblot de carbohidratos en sialidasa de células CHO sobre membrana de fluoruro de polivinilideno. La sialidasa (1,5 \mug) y la transferrina (0,8 \mug) se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron electroforéticamente a la membrana. Carriles A y B: tinción para proteínas de sialidasa y transferrina, respectivamente. Carriles C y D: tinción para carbohidratos de sialidasa y transferrina, respectivamente. La membrana se trató con metaperyodato sódico y los carbohidratos se hicieron reaccionar con digoxigenina-3-O-succinil-ácido \gammaaminocapróico hidracida. Después del tratamiento con el anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina las glucoproteínas se detectaron mediante incubación con sustratos de fosfatasa alcalina.

Figura 6: Derivados de Neu5Ac2en analizados como inhibidores de sialidasa. Los compuestos se sintetizaron como se describe en Métodos.

Figura 7: Detección del inmunoblot de sialidasa en extractos celulares crudos. Los homogeneizados de varias líneas celulares CHO se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa como se describe en Métodos. La sialidasa en cada preparación se visualizó utilizando un anticuerpo peptídico, cubriéndolo con conjugado de peroxidasa de rábano-IgG de cabra anti conejo. Carril A: 0,03 \mug de sialidasa purificada. Carril B: CHO 14.16 (200 \mug de proteína), carril C: CHO 12 (200 \mug de proteína), carril D: Lec 2 (200 pg de proteína).

Figura 8: Muestra las secuencias de aminoácidos de los péptidos obtenidos mediante digestión tríptica de la sialidasa (SEQ. ID. NOS. 3-13).

Figura 9: Muestra las secuencias de aminoácidos de los péptidos obtenidos mediante digestión con tripsina, lisina, lisina C y proteasa V8 de la sialidasa purificada a partir de la fracción 2 de la etapa de cromatografía de S-Sepharose. (SEQ. ID. NOS. 3, 5-6, 8-9, 14-24).

Figura 10: Muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de la sialidasa de células CHO (SEQ. ID. NO. 25) (ver Ejemplo 9, clon 15) y la secuencia de aminoácidos predecida (SEQ. ID. NO. 26) codificada por el ADNc. Estas porciones de la secuencia de aminoácidos que corresponden a los fragmentos derivados de la proteasa mostrados en la Figura 9 están subrayadas. La porción de secuencia aminoacídica que corresponde a la sonda 14/17 de PCR está doblemente subrayada.

Descripción detallada de la invención A. Definiciones Sialidasa

Este término hace referencia a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 10 para la sialidasa de células CHO, así como las variantes de secuencia aminoacídica de dicho polipéptido, y las formas modificadas de lo mismo, en donde la variante de secuencia aminoacídica o polipeptídica se ha modificado covalentemente mediante sustitución con una porción distinta a la aminoacídica que se produce de forma natural, siempre que dichas variantes y formas modificadas del polipéptido tengan una actividad biológica que esté incluida en la sialidasa de células CHO natural. Ejemplos de dichas variantes activas biológicamente y formas modificadas de la sialidasa incluyen los polipéptidos que son inmunológicamente reactivos con anticuerpos anti-sialidasa de células CHO natural, o que tengan actividad glucohidrolítica con sustratos adecuados.

Las variantes de secuencia aminoacídica de la sialidasa son polipéptidos que tienen una secuencia aminoacídica que difiere de la que se muestra en la Figura 10 para la sialidasa de células CHO gracias a la inserción, deleción y/o sustitución de uno o más residuos aminoacídicos en la secuencia de la Figura 10. Las variantes de secuencia aminoacídica serán homólogas en un 75%, generalmente, (y a menudo homólogas en más de un 85%) a la sialidasa de células CHO basado en una comparación de los aminoácidos presentes en cada posición entre las secuencias, después de alinear las secuencias para proporcionar el máximo de homología.

Las variantes de secuencia aminoacídica de la sialidasa pueden ser naturales o se pueden preparar sintéticamente, tales como mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en un ADN que codifica sialidasa previamente aislado, o mediante síntesis in vitro del polipéptido variante deseado. Tal como se ha indicado anteriormente, dichas variantes comprenderán deleciones, inserciones o sustituciones de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia aminoacídica para la sialidasa de células CHO mostrada en la figura 10. Con cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se llegará a una variante de secuencia aminoacídica de la sialidasa y se encuentra dentro del alcance de la presente invención, siempre que el polipéptido variante resultante sea biológicamente activo, tal como se ha descrito anteriormente.

Línea celular recombinante

Esta expresión hace referencia a las células establecidas en cultivo ex vivo y que tienen cierta modificación genética respecto a las células parentales originales de las que derivan. Dicha modificación genética puede ser el resultado de la introducción de un gen heterólogo para la expresión del producto génico, o puede ser mediante la introducción de un gen, posiblemente con elementos promotores, para la producción de ARN antisentido en las células para regular la expresión de otro gen. Igualmente, la modificación genética puede ser el resultado de la mutación, adición o deleción de uno o más nucleótidos de un gen, o incluso la deleción de un gen entero, mediante cualquier mecanismo. Las células de una línea celular recombinante utilizadas en la producción de un producto proteico deseado tienen los medios para la glucosilación de proteínas mediante la adición de cadenas laterales de oligosacáridos. Dichas células también tienen la capacidad de eliminar y/o modificar enzimáticamente una parte o el total de las cadenas laterales de oligosacáridos de glucoproteínas.

Expresión funcional y términos relacionados gramaticalmente

La expresión funcional de un gen hace referencia a la producción del producto proteico codificado por el gen en una forma o en la extensión requerida por el producto para realizar su función normal dentro del entorno celular. Por ello, un gen que codifica para una enzima implicada en la glucosilación proteica, o la desglucosilación, se expresa de forma funcional cuando se produce suficiente enzima en una forma que funcione para glucosilar, o desglucosilar, a un nivel de proteína normal producido en la célula. La expresión funcional de un gen se puede alterar mediante modificación de la secuencia nucleotídica del gen, de modo que el producto proteico del gen sea defectuoso en su función, o mediante deleción o modificación de una parte o de todas las secuencias promotoras asociadas con el gen e implicadas en la transcripción del gen, o mediante deleción del propio gen del genoma de la célula, o mediante interferencia con la traducción del ARNm transcrito a partir del gen, por ejemplo, mediante interferencia con ARN antisentido, o mediante cualquier combinación de cualquiera de estos con cada uno de los otros o bien mediante cualquier otro medio conocido por el experto en la materia para alterar la función del gen.

Los términos "secuencia de ADN que codifica para", "ADN que codifica para" y "ácido nucleico que codifica para" hacen referencia al orden o a la secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica. Así, la secuencia del ADN codifica para la secuencia aminoacídica.

Los términos "vector de expresión replicable" y "vector de expresión" hacen referencia a un fragmento de ADN, generalmente doble cadena, que puede ser insertado en un fragmento de ADN foráneo. El ADN foráneo se define como ADN heterólogo, que es ADN que no se halla de forma natural en la célula huésped. El vector se utiliza para transportar el ADN foráneo o heterólogo en una célula huésped adecuada. Una vez en la célula huésped, el vector puede replicarse de modo independiente del ADN cromosómico del huésped, y se pueden generar diversas copias del vector y su inserto de ADN (foráneo). Además, el vector contiene los elementos necesarios que permiten la traducción del ADN foráneo en un polipéptido. Así, se pueden sintetizar rápidamente muchas moléculas del polipéptido codificado por el ADN foráneo.

Los términos "célula huésped transformada" y "transformada" hacen referencia a la introducción de ADN en una célula. La célula se denomina una "célula huésped", y puede ser una célula procariota o eucariota. Las células huésped procariotas típicas incluyen varias cepas de E. coli. Células huésped eucariotas típicas son las células de mamífero, como las células de ovario de hámster chino o las células 293 de riñón embrional humano. El ADN introducido está generalmente en la forma de un vector que contiene un fragmento de ADN insertado. El ADN introducido está generalmente en la forma de un vector que contiene un fragmento insertado de ADN. La secuencia de ADN introducida puede ser de la misma especie que la célula huésped o de una especie diferente a la de la célula huésped, o puede ser una secuencia de ADN híbrida, que contiene ADN foráneo y ADN homólogo.

"Digestión", "corte" o "rotura" de ADN hacen referencia al corte catalítico del ADN con una enzima que actúa sólo en particulares localizaciones específicas en el ADN. Estas enzimas se denominan endonucleasas de restricción, y el sitio a lo largo de la secuencia de ADN donde cada enzima corta se denomina sitio de restricción. Las enzimas de restricción están disponibles comercialmente y se utilizan de acuerdo con las instrucciones suministradas por los fabricantes. Las enzimas de restricción se designan con abreviaciones compuestas de una letra mayúscula seguida de dos o tres letras minúsculas que representan el microorganismo a partir del cual se obtuvo cada enzima de restricción. Las letras se continúan por uno o más números romanos que identifican la enzima específica. En general, alrededor de 1 pg de plásmido o fragmento de ADN se utiliza con unas 2 unidades de enzima en unos 20 \mul de solución tampón. El tampón adecuado, concentración del sustrato, temperatura de incubación y tiempo de incubación para cada enzima se especifica por el fabricante. Después de la incubación, la enzima y otros contaminantes se eliminan del ADN mediante extracción con una solución de fenol-cloroformo, y se recupera el ADN digerido de la fracción acuosa mediante precipitación con etanol. La digestión con una enzima de restricción puede proseguirse con el tratamiento por fosfatasa alcalina bacteriana o fosfatasa alcalina intestinal. Esto evita la "circularización" o formación de un bucle cerrado, que impediría la inserción de otro fragmento de ADN en el sitio de restricción, por los dos extremos cortados por restricción de un fragmento de ADN. Salvo que se indique lo contrario, la digestión de plásmidos no se prosigue por la desfosforilación terminal 5'. Estos procedimientos y reactivos para la desfosforilación se describen en las secciones 1.60-1.61 y las secciones 3.38-3.39 de Sambrook y col., (Molecular Cloning:A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989]).

"Recuperación" o "aislamiento" de un fragmento dado de ADN de un producto de digestión por restricción significa la separación del fragmento de ADN resultante en un gel de poliacrilamida o agarosa mediante electroforesis, la identificación del fragmento de interés mediante comparación de su movilidad respecto a la de fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocido, la recuperación de la sección del gel que contiene el fragmento deseado y la separación del ADN del gel. Este procedimiento es generalmente conocido. Ver, por ejemplo, R. Lawn y col., 1981, Nucleic Acids Res., 9:6103, y D. Goeddel y col., 1980, Nucleic Acids Res., 8:4057.

"Análisis de Southern" o "transferencia de Southern" es un procedimiento por el cual la presencia de secuencias de ADN en un producto de digestión o composición que contiene ADN se confirma mediante hibridación con un oligonucleótido marcado o fragmento de ADN conocidos. El análisis de Southern hace referencia a la separación del ADN digerido en un gel de agarosa, la desnaturalización del ADN y la transferencia del ADN desde el gel a una membrana de nitrocelulosa o nylon mediante la utilización de procedimientos descritos originalmente por Southern (J. Mol. Biol., 98:503[1975]) y modificados como se describe en las secciones 9.31-9.57 de Sambrook y col., supra.

"Transformación" significa la introducción del ADN en un organismo de modo que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosómico o un integrante cromosómico. El procedimiento que se utiliza para la transformación depende de si la célula huésped es una célula eucariota o procariota. Un procedimiento preferido utilizado para transformar procariotas es el método del cloruro de calcio como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., supra. Los eucariotas se pueden transformar utilizando el método del fosfato cálcico como se describe en las secciones 16.32-16.37 de Sambrook y col., supra.

La "ligación" hace referencia al proceso de formación de enlaces fosfodiésteres entre fragmentos de ADN de doble cadena utilizando la enzima ligasa en un tampón adecuado que también contiene ATP.

Los "oligonucleótidos" hacen referencia a secuencias de cadena doble o sencilla de corto tamaño de desoxirribonucleótidos unidos por enlaces fosfodiésteres. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar químicamente por procedimientos conocidos y purificarse en geles de poliacrilamida.

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Abreviaciones

Neu5Ac2en, ácido 5-acetamida-2,6-anhidro-3,5-dideoxi-D-glicero-D-galacto-no-2-enónico; ácido 9-azido-Neu5
Ac2en, 5-acetamido-2,6-anhidro-9-azido-3,5,9-trideoxi-D-glicero-D-galacto-no-2-enónico; ácido 9-PANP-Neu5Ac2
en, 9-S-(4'-azido-2'-nitro-fenil)-5-acetamido-2,6 anhidro-9-tio-2,5,9-trideoxi-D-glicero-D-galacto-no-2-enónico; ácido 4MU-Neu5Ac, (4-metilumbeliferil-5-acetamido-3,5-dideoxi-D-glicero-\alpha-D-galacto-nonulopiranósido)ónico;
HPLC, cromatografía de alta resolución; SDS, sodio dodecil sulfato; CHO, ovario de hámster chino; EDTA, ácido etilén diamino tetraacético; DEAE, dietilaminoetil-; G_{M1}, Il^{3}NeuAc-GgOse_{4}cer;G_{M2}, Il^{3}NeuAcGgOse_{3}cer; GM^{3}, Il^{3}NeuAc-LacCer; G_{D1a}, IV^{3}NeuAc,Il^{3}NeAc-GgOse_{4}Cer; G_{D1b}, Il^{3}(NeuAc)_{2}-GgOse_{4}Cer;G_{T1b},IV^{3}NeuAc, Il^{3}(Neu
Ac)_{2}-GgOse_{4}Cer. Los aminoácidos se designan como:

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B. Procedimientos generales del ADN recombinante

La sialidasa proporcionada por la presente invención se puede utilizar y manipular de muchas maneras. La digestión de la proteína con una enzima proteolítica como la tripsina, por ejemplo, proporciona polipéptidos relativamente cortos que pueden secuenciarse utilizando técnicas estándares. El conocimiento de la secuencia aminoacídica permite la construcción de sondas oligonucleotídicas para el gen codificante de interés. Las diversas aproximaciones para la generación de sondas para un gen son conocidas por el experto en la materia.

Procedimientos ilustrativos son la aproximación de "agrupado mezclado" de Wallace y col., Nucleic. Acid. Res, 6, 3543 (1979), en donde se utiliza un juego completo de todas las secuencias de nucleótidos posibles que codifican para una pequeña porción de la proteína, y la técnica de "sonda larga" de Ullrich y col., The EMBO Journal 3, no. 2, 361-364, (1984), también la EPO Pub. 128.042 publicada el 12 de diciembre de 1984. En la técnica de Wallace, uno de los juegos de sondas debe tener una secuencia complementaria a la secuencia de ADN de interés. La técnica preferida, de Ullrich, utiliza una sonda sencilla mayor de aproximadamente 30 nucleótidos de tamaño, que puede sintetizarse en base a la información de aminoácidos sin tener en cuenta la degeneración del código genético.

Se puede secuenciar la proteína sialidasa completa y utilizar la información en el diseño y síntesis de sondas oligonucleotídicas. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en la materia, como las que se describen por Crea y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978) o Kunkel y col., Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987).

La hibridación con sondas se puede utilizar para obtener el gen de la sialidasa a partir de una biblioteca genómica o de una biblioteca de ADNc, construida utilizando técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, como se describe por Maniatis y col., Molecular Cloning- A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory.

La secuencia de ADN que codifica para la sialidasa es de utilidad para la producción de la proteína, mediante la utilización de tecnología del ADN recombinante, y también variantes y formas modificadas de la sialidasa. También, se pueden utilizar procedimientos conocidos para mutar o alterar el ADN que codifica para la sialidasa, bien in vivo o in vitro, para producir un gen de sialidasa que no será expresado de forma funcional en una célula. Tal gen modificado se puede utilizar en la creación de una línea celular recombinante con un gen sialidasa que no se expresa de modo funcional, por ejemplo, mediante un proceso que implica la recombinación homóloga, como se discute más adelante.

1. Deleciones simples e inserciones

La digestión por endonucleasas de restricción del ADN seguido por la ligación se puede utilizar para generar deleciones, como se describe en la sección 15.3 de Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989]). Para utilizar este método, es preferible que el ADN foráneo se inserte en un vector plasmídico. Un mapa de restricción de ambos ADNs, el ADN foráneo (insertado) y el ADN del vector, debe estar disponible, o debe conocerse la secuencia del ADN foráneo o del ADN del vector. El ADN foráneo debe tener sitios únicos de restricción que no estén presentes en el vector. Las deleciones se realizan entonces en el ADN foráneo mediante digestión entre los sitios únicos de restricción, utilizando las endonucleasas de restricción adecuadas en las condiciones sugeridas por el fabricante de las enzimas. Si las enzimas de restricción utilizadas crean extremos romos o extremos cohesivos, los extremos se pueden ligar directamente utilizando una ligasa como la ligasa de ADN del bacteriófago T4 e incubar la mezcla a 16ºC durante 1-4 horas en la presencia de ATP y tampón de ligasa como se describe en la sección 1.68 de Sambrook y col., supra. Si los extremos no son cohesivos, primero se deben hacer romos mediante la utilización del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I o la ADN polimerasa del bacteriófago T4, ambas requieren los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato para rellenar los extremos de cadena sencilla colgantes del ADN digerido. Alternativamente, los extremos pueden hacerse romos utilizando una nucleasa como la nucleasa S1 o la nucleasa de judía Mung, ambas funcionan recortando las cadenas sencillas colgantes de ADN. El ADN se religa entonces mediante la utilización de una ligasa.

Una estrategia similar se puede utilizar para construir variantes de inserción, como se describe en la sección 15.3 de Sambrook y col., supra. Después de la digestión del ADN foráneo en el sitio(s) único de restricción, se liga un oligonucléotido en el sitio donde el ADN foráneo se ha cortado. El oligonucleótido se diseña para codificar para los aminoácidos que se desea insertar, y adicionalmente tiene extremos 5' y 3' que son compatibles con los extremos del ADN foráneo que se ha digerido, a fin de que sea posible la ligación directa.

2. Mutagénesis mediada por oligonucleótidos

La mutagénesis dirigida por oligonucleótidos puede también utilizarse para preparar de manera práctica variantes por sustitución, deleción e inserción de la presente invención. Esta técnica es bien conocida en la materia como se describe por Adelman y col., (DNA, 2:183 [1983]).

Generalmente, se utilizan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud para insertar, delecionar o sustituir dos o más nucleótidos en la molécula. Un oligonucléotido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos perfectamente apareados en cada lado de los nucleótidos que codifican para la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido se hibridará correctamente a la molécula molde de ADN de cadena sencilla. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en la materia como las descritas por Crea y col., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765 [1978]).

La molécula molde de ADN es la forma de cadena sencilla del vector con su inserto de ADNc de tipo nativo. El molde de cadena sencilla sólo puede ser generado por aquellos vectores que se derivan de vectores del bacteriófago M13 (los vectores M13mp18 y M13mp19 disponibles comercialmente son adecuados), o aquellos vectores que contienen un origen de replicación de fago de cadena sencilla como se describe por Veira y col., (Meth. Enzymol., 153:3). Así, el ADNc que se ha de mutar debe insertarse en uno de estos vectores con el fin de generar el molde de cadena sencilla. La producción del molde de cadena sencilla se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook y col., supra.

En tales técnicas, para mutagenizar la sialidasa de tipo nativo, el oligonucleótido se anilla a la molécula molde de ADN de cadena sencilla en condiciones de hibridación adecuadas. Luego se añade una enzima polimerizante del ADN, generalmente el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli. Esta enzima utiliza el oligonucleótido como un cebador para completar la síntesis de la cadena de ADN portadora de la mutación. Así, se forma una molécula heterodúplex de modo que una cadena del ADN codifica para la sialidasa de tipo nativo insertada en el vector, y la segunda cadena del ADN codifica la forma mutada insertada en el mismo vector. Esta molécula heterodúplex se transforma luego en una célula huésped adecuada, generalmente una procariota como E. coli JM101. Después de crecer las células, se plaquean en placas de agarosa y se rastrean utilizando el cebador oligonucleotídico marcado isotópicamente con 32-P para identificar las colonias que contienen la forma mutada. Estas colonias se seleccionan, y el ADN se secuencia para confirmar la presencia de mutaciones en la molécula.

Mutantes con más de un aminoácido sustituido se pueden generar de muchas maneras. Si los aminoácidos están localizados muy cerca en la cadena polipeptídica, se pueden mutar simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica para todas las sustituciones aminoacídicas deseadas. Si al contrario, los aminoácidos se localizan a cierta distancia uno de otro (separados por más de 10 aminoácidos, por ejemplo) es más difícil generar un oligonucleótido de cadena sencilla que codifique para todos los cambios deseados. De preferencia, se puede emplear uno de los dos procedimientos alternativos. En el primer procedimiento, se genera un oligonucléotido por separado para cada aminoácido a sustituir. Entonces, se anillan los oligonucléotidos al ADN molde de cadena sencilla simultáneamente, y se sintetiza la segunda cadena de ADN a partir del molde que codificará para todas las sustituciones aminoacídicas deseadas. El procedimiento alternativo implica dos o más tandas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera tanda es la misma descrita para los mutantes de cadena sencilla: el ADN de tipo nativo se utiliza para el molde, un oligonucleótido que codifica para la primera sustitución(es) aminoacídica deseada se anilla a este molde, y entonces se genera la molécula de ADN heteroduplex. La segunda tanda de mutagénesis utiliza el ADN mutado producido en la primera tanda de mutagénesis como el molde. Así, este molde también contiene una o más mutaciones. Luego el oligonucleótido que codifica para la sustitución(es) aminoacídica deseada se anilla a este molde, y la cadena resultante de ADN codifica ahora para las mutaciones procedentes tanto de la primera tanda como de la segunda tanda de mutagénesis. Este ADN resultante se puede utilizar como un molde en una tercera tanda de mutagénesis, y así sucesivamente.

C. Cultivos de células huésped y vectores 1. Células procariotas

Las procariotas son las células huésped preferidas para las etapas iniciales de clonaje. Son de particular utilidad para la producción rápida de grandes cantidades de ADN, para la producción de moldes de ADN de cadena sencilla utilizados para la mutagénesis dirigida, para el rastreo simultáneo de muchos mutantes, y para la secuenciación del ADN de los mutantes generados. Células huésped procariotas adecuadas incluyen la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC nº 31.446), la cepa W3110 de E. coli (ATCC nº 27.325), E. coli X1776 (ATCC nº 31.537) y E. coli B; sin embargo muchas otras cepas de E. coli como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 y muchas otras especies y géneros de procariotas pueden asimismo utilizarse.

Las procariotas se pueden también utilizar como huéspedes para la expresión de secuencias de ADN. Se pueden también utilizar como huéspedes las cepas de E. coli. citadas anteriormente, bacilos como Bacillus subtilis, otras enterobacterias como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans y diversas especies de Pseudomonas.

Los vectores plasmídicos que contienen las secuencias del replicón y secuencias control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped se utilizan con estos huéspedes. El vector tiene generalmente un sitio de replicación, genes marcadores que proporcionan la selección fenotípica en las células transformadas, uno o más promotores y una región poliengarce que contiene diversos sitios de restricción para la inserción del ADN foráneo. Los plásmidos que se utilizan típicamente para la transformación de E. coli incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 y Bluescript M13, todos ellos se describen en las secciones 1.12-1.20 de Sambrook y col., supra. Sin embargo, otros muchos vectores adecuados están también disponibles. Estos vectores contienen genes que codifican para la resistencia a la ampicilina y/o tetraciclina, lo que permite a las células transformadas con estos vectores crecer en la presencia de estos antibióticos.

Los promotores más comúnmente utilizados en vectores procariotas incluyen los sistemas del promotor de la \beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (Chang y col., Nature, 375:615 [1978]; Itakura y col., Science, 198:1056 [1977]; Goeddel y col., Nature, 281:544 [1979]) y un sistema del promotor del triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids. Res., 8:4057 [1980]; EPO Appli. Publ. nº. 36.776) y los sistemas de fosfatasa alcalina. Mientras que éstos son los más comúnmente utilizados, otros promotores microbianos se han utilizado, y se han publicado los detalles concernientes a sus secuencias nucleotídicas que permiten a un experto en la materia ligarlos de modo funcional en los vectores plasmídicos (ver Siebenlist y col., Cell, 20:269 [1980]).

2. Microbios eucariotas

Los microbios eucariotas como las levaduras se pueden utilizar para la práctica de esta invención. La levadura del pan, Saccharomyces cerevisiae, es un microorganismo eucariota utilizado comúnmente, aunque también otras cepas están disponibles. El plásmido YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282:39 [1979]; Kingsman y col., Gene, 7:141 [1979]; Tschemper y col., Gene, 10:157 [1980]) se utiliza comúnmente como un vector de expresión en Saccharomyces. Este plásmido contiene el gen trp1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura carente de la capacidad para crecer en triptófano, como las cepas ATCC nº. 44.076 y PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). La presencia de la lesión trp1 como una característica del genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno efectivo para la detección de la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano.

Secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255:2073 [1980]) u otras enzimas glucolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968]; Holland y col., Biochemistry, 17:4900 [1978]), como la enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. En la construcción de plásmidos de expresión adecuada, las secuencias de terminación asociadas con estos genes se ligan también en el vector de expresión en 3' de la secuencia que se desea expresar, para proporcionar la poliadenilación del ARNm y la terminación. Otros promotores que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento son la región promotora para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la anteriormente mencionada gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Cualquier vector plasmídico que contenga el promotor compatible de levadura, origen de replicación y secuencias de terminación es adecuado.

Organismos multicelulares eucariotas

Los cultivos celulares derivados de organismos multicelulares se pueden utilizar como huéspedes para la práctica de esta invención. Cuando tanto los cultivos de células de vertebrados como de invertebrados son aceptables, se prefiere los cultivos de células de vertebrados, en particular los cultivos de células de mamíferos. Ejemplos de líneas celulares adecuadas incluyen la línea CVI de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrional humano 293S (Graham y col., J. Gen. Virol., 36:59 [1977]); las células renales de bebé de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:4216 [1980]); células de sertoli murinas (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243); células renales de mono (CVI-76, ATCC CCL 70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamario murino (MMT 060562, ATCC CCL 51); células de hepatoma de rata (HTC, MI.54, Baumann y col., J. Cel Biol., 85:1 [1980]); y células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44 [1982]). Los vectores de expresión para estas células incluyen generalmente (si es necesario) secuencias de ADN para un origen de replicación, un promotor localizado delante del gen a expresar, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de ayuste del ARN, un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción.

Los promotores utilizados en los vectores de expresión en mamíferos son a menudo de origen viral. Estos promotores virales se derivan comúnmente del virus del polioma, adenovirus 2 y más frecuentemente del Simian Virus 40 (SV40). El virus SV40 contiene dos promotores que se denominan los promotores temprano y tardío. Estos promotores son de particular utilidad porque se obtienen fácilmente a partir del virus como un fragmento de ADN que también contiene el origen de replicación viral (Tiers y col., Nature, 273:113 [1978]). También se pueden utilizar fragmentos menores o mayor de ADN de SV40, siempre que contengan la secuencia de aproximadamente 250-pb que se extiende desde el sitio HindIII hacia Bgl-I localizada en el origen viral de replicación.

Alternativamente, se pueden utilizar promotores que están asociados de forma natural con el gen foráneo (promotores homólogos), siempre que sean compatibles con la línea celular huésped seleccionada para la transformación.

Se puede obtener un origen de replicación de una fuente exógena, como el SV40 u otro virus (p.ej., Polioma, Adeno, VSV, BpV) e insertarse en el vector de clonaje. Alternativamente, el origen de replicación puede ser proporcionado por el mecanismo de replicación cromosómica de la célula huésped. El último mecanismo es a menudo suficiente, si el vector que contiene el gen foráneo se integra en el cromosoma de la célula huésped.

La utilización de una secuencia codificante de ADN secundaria puede incrementar los niveles de producción. La secuencia codificante secundaria comprende de modo característico la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). La forma de tipo nativo de DHFR se inhibe normalmente por el compuesto químico metotrexato (MTX). El nivel de expresión de DHFR en una célula variará dependiendo de la cantidad de MTX añadido a las células en cultivo. Un hecho adicional de la DHFR que la hace particularmente útil como una secuencia secundaria es que puede utilizarse como un marcador de selección para identificar células transformadas.

Dos formas de DHFR están disponibles para su utilización como secuencias secundarias, DHFR de tipo nativo y DHFR resistente a MTX. El tipo de DHFR que se utiliza en una célula huésped determinada depende de si la célula huésped es deficiente en DHFR (de modo que produce muy bajos niveles de DHFR de modo endógeno, o no produce DHFR funcional). Las líneas celulares deficientes en DHFR como la línea celular CHO descrita por Urlaub y Chasin (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77:4216 [1980]) se transforman con secuencias codificantes para DHFR de tipo nativo. Después de la transformación, estas líneas celulares deficientes en DHFR expresan DHFR funcional y son capaces de crecer en un medio de cultivo carente de los nutrientes hipoxantina, glicina y timidina. Las células no transformadas no sobrevivirán en este medio.

La forma MTX-resistente de DHFR se puede utilizar como un medio de selección, para las células huésped transformadas, en aquellas células huésped que endógenamente producen cantidades normales de DHFR funcional sensible a MTX. La línea celular CHO-K1 (ATCC número CL 61) posee estas características, y por ello es una línea celular útil para este propósito. La adición de MTX al medio de cultivo celular permitirá crecer sólo a aquellas células transformadas con el ADN que codifica para DHFR resistente a MTX. Las células no transformadas serán incapaces de sobrevivir en este medio.

Las células huésped de mamífero se pueden cultivar en diversos medios. Medios disponibles comercialmente como F10 de Ham (Sigma), Medio Mínimo Esencial ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio Mínimo Esencial modificado de Dulbecco ([DMEM], Sigma) son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace (Meth. Enz., 58:44 [1979]), Barnes y Sato (Anal. Biochem., 102:255 [1980]), patentes americanas U.S. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655; solicitud de patente internacional WO 90/03430; WO87/00195; patente americana U.S. 30.985; o patente americana U.S. 5.122.469, se pueden utilizar como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede suplementar cuanto sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, transferrina, o el factor de crecimiento epitelial), sales (como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleósidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como Gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos generalmente presentes a concentraciones finales del orden micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Se pueden también incluir otros suplementos a concentraciones apropiadas que se serían conocidas por aquellos expertos en la materia.

Sistemas de secreción

Muchas proteínas eucariotas que se secretan normalmente de la célula contienen una secuencia señal endógena como parte de la secuencia aminoacídica. Esta secuencia dirige la proteína para su exportación de la célula vía el retículo endoplasmático y aparato de Golgi. La secuencia señal está localizada de modo característico en el extremo amino de la proteína, y varía en longitud desde unos 13 a 36 aminoácidos. Aunque la secuencia real varía entre proteínas, todas las secuencias señal eucariotas conocidas contienen al menos un residuo cargado positivamente y un fragmento altamente hidrofóbico de 10-15 aminoácidos (generalmente rico en los aminoácidos leucina, isoleucina, alanina, valina y fenilalanina) cerca del centro de la secuencia señal. La secuencia señal está normalmente ausente de la forma secretada de la proteína, ya que se corta por una peptidasa localizada en el retículo endoplasmático durante el paso de la proteína al retículo endoplasmático. La proteína con su secuencia señal todavía unida se la denomina como la "preproteína" o forma inmadura de la proteína.

Sin embargo, no todas las proteínas secretadas contienen una secuencia señal amino terminal que se corte. Algunas proteínas, como la ovoalbúmina, contienen una secuencia señal que se localiza en una región interna de la proteína. Esta secuencia generalmente no se corta durante el paso de la proteína.

Las proteínas que se hallan normalmente en el citoplasma pueden ser dirigidas para su secreción mediante la unión de una secuencia señal. Esto se logra fácilmente mediante ligación del ADN que codifica para una secuencia señal al extremo 5' del ADN que codifica para la proteína, y la expresión de esta proteína de fusión en una célula huésped apropiada. El ADN que codifica para la secuencia señal se puede obtener como un fragmento de restricción a partir de cualquier gen que codifique para una proteína con una secuencia señal. Así, se pueden utilizar secuencias señal procariotas, de levaduras y eucariotas, dependiendo del tipo de célula huésped utilizado para la práctica de la invención. El ADN que codifica para la porción de secuencia señal del gen se excisa utilizando endonucleasas de restricción apropiadas y luego se liga al ADN que codifica para la proteína que se va a secretar.

La selección de una secuencia señal funcional requiere que la secuencia señal se reconozca por la peptidasa señal de la célula huésped, de modo que tendrá lugar el corte de dicha secuencia señal y la secreción de la proteína. Se conoce el ADN y la secuencia aminoacídica que codifica para el fragmento de secuencia señal de diversos genes eucariotas que incluyen, por ejemplo, la hormona de crecimiento humano, proinsulina y la proalbúmina (ver Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman y Company, New York [1988], pág. 769), y éstos se pueden utilizar como secuencias señal en células huésped eucariotas adecuadas. Las secuencias señal de levadura, como por ejemplo la fosfatasa ácida (Arima y col., Nuc. Acids. Res., 11:1657 [1983]), el factor alfa, la fosfatasa alcalina y la invertasa se pueden utilizar para la secreción directa de las células huésped de levadura. Las secuencias señal procariotas de genes que codifican para, por ejemplo, LamB o OmpF (Wong y col., Gene 68:193), MaIE, PhoA, o beta-lactamasa, así como otros genes, se pueden utilizar para dirigir las proteínas diana de las células procariotas al medio de cultivo.

Una técnica alternativa para proporcionar una proteína de interés con una secuencia señal, tal que se pueda secretar, es sintetizar químicamente el ADN que codifica para la secuencia señal. En este procedimiento, se sintetizan químicamente ambas cadenas de un oligonucleótido que codifica para la secuencia señal seleccionada y luego se anillan una a otra para formar un dúplex. El oligonucleótido de cadena doble se liga entonces al extremo 5' del ADN que codifica para la proteína.

La construcción que contiene el ADN que codifica para la proteína con la secuencia señal ligada a éste, se puede entonces ligar en un vector de expresión adecuado. Este vector de expresión se transforma en una célula huésped adecuada y la proteína de interés se expresa y secreta.

D. Procedimientos de transformación

Generalmente, los cultivos de células huésped de mamífero y otras células huésped, que no tienen barreras de membrana celular rígida, se transforman utilizando el método del fosfato de calcio, como se describió originalmente por Graham y Van der Eb (Virology, 52:546 [1978]) y modificado como se describe en las secciones 16.32-16.37 de Sambrook y col., supra. Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para la introducción de ADN en las células como el Polibreno (Kawai y Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4:1172 [1984]), la fusión de protoplastos (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2163 [1980]), electroporación (Neumann y col., EMBO J., 1:841 [1982]) y la microinyección directa en el núcleo (Capecchi, Cell, 22:479 [1980]).

Las células huésped de levadura se transforman generalmente utilizando el procedimiento del polietilén glicol, como se describe por Hinnen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929 [1978]).

Las células huésped procariotas u otras células huésped con membranas celulares rígidas se transforman preferentemente utilizando el método del cloruro de calcio como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., supra. Alternativamente, se puede utilizar la electroporación para la transformación de estas células.

E. Procedimientos de clonaje

La construcción de vectores adecuados que contienen ADN que codifica para secuencias de replicación, secuencias reguladoras, genes de selección fenotípica y el ADN foráneo de interés se preparan utilizando procedimientos del ADN recombinante estándares. Los plásmidos aislados y los fragmentos de ADN se cortan, se les eliminan sus extremos y se ligan juntos en un orden específico para generar los vectores deseados.

El ADN se corta utilizando la enzima de restricción apropiada o las enzimas en un tampón adecuado. En general, se utilizan unos 0,2-1 pg de plásmido o fragmentos de ADN con unas 1-2 unidades de la enzima de restricción adecuada en unos 20 \mul de solución tampón. (Tampones, concentraciones de ADN y tiempos y temperaturas de incubación adecuados se especifican por los fabricantes de las enzimas de restricción). Generalmente, son adecuados tiempos de incubación de una a dos horas a 37ºC, aunque algunas enzimas requieren temperaturas mayores. Después de la incubación, las enzimas y otros contaminantes se eliminan mediante extracción de la solución de digestión con una mezcla de fenol y cloroformo, y el ADN se recupera de la fracción acuosa mediante precipitación con etanol.

Para ligar los fragmentos de ADN para formar un vector funcional, los extremos de los fragmentos de ADN deben ser compatibles uno con otro. En algunos casos, los extremos serán directamente compatibles después de la digestión con endonucleasa. Sin embargo, puede ser necesario convertir en primer lugar los extremos cohesivos, comúnmente producidos por la digestión con endonucleasa, a extremos romos para hacerlos compatibles para la ligación. Para producir extremos romos, el ADN se trata en un tampón adecuado durante al menos 15 minutos a 15ºC con 10 unidades del fragmento Klenow de la ADN polimerasa (Klenow) en la presencia de los cuatro deoxinucleótidos trifosfato. Entonces se purifica mediante extracción por fenol-cloroformo y precipitación con etanol.

Los fragmentos de ADN cortados se pueden separar por tamaño y seleccionar mediante la utilización de electroforesis en gel del ADN. El ADN puede migrar en la electroforesis a través de una matriz de agarosa o poliacrilamida. La selección de la matriz dependerá del tamaño de los fragmentos del ADN a separar. Después de la electroforesis, el ADN se extrae de la matriz mediante electroelución, o, si se ha utilizado agarosa de bajo punto de fusión como matriz, mediante fusión de la agarosa y extracción del ADN de ésta, como se describe en las secciones 6.30-6.33 de Sambrook y col., supra.

Los fragmentos de ADN que se han de ligar juntos (previamente digeridos con las enzimas de restricción adecuadas de modo que los extremos de cada fragmento a ligar sean compatibles) están presentes en solución en cantidades equimolares. La solución también contendrá ATP, tampón de ligasa y una ligasa como la T4 ADN ligasa a unas 10 unidades por cada 0,5 \mug de ADN. Si el fragmento de ADN se ha de ligar en un vector, en primer lugar se lineariza el vector mediante corte con la endonucleasa(s) de restricción adecuada y luego se elimina el grupo fosfato libre bien con la fosfatasa alcalina bacteriana o la fosfatasa intestinal vacuna. Esto evita la propia ligación del vector durante la etapa de ligación.

Después de la ligación, el vector con el gen foráneo insertado se transforma en una célula huésped adecuada, más frecuentemente un procariota como la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC número 31.446) u otra cepa de E. coli adecuada. Las células transformadas se seleccionan mediante crecimiento con un antibiótico, generalmente tetraciclina (tet) o ampicilina (amp), contra los cuales se ha vuelto resistente debido a la presencia de genes de resistencia tet y/o amp en el vector. Si la mezcla de ligación se ha de transformar en una célula huésped eucariota, las células transformadas pueden seleccionarse por el sistema DHFR/MTX descrito anteriormente. Las células transformadas se crecen en cultivo y luego se aísla el ADN del plásmido (plásmido hace referencia al vector ligado al gen foráneo de interés). El ADN del plásmido se analiza entonces mediante mapeo por restricción y/o secuenciación del ADN. La secuenciación del ADN se realiza generalmente por el procedimiento de Messing y col., Nucleic Acids. Res., 9:309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam y col., Methods of Enzymology, 65:499 (1980).

Después de que las células huésped de mamífero se han transformado de modo estable con el ADN, las secuencias que codifican para la proteína-DHFR se amplifican mediante crecimiento de los cultivos de la célula huésped en la presencia de aproximadamente 200-500 mM de metrotexato. El margen efectivo de concentraciones de MTX es altamente dependiente de la naturaleza del gen DHFR y la proteína y de las características de la célula huésped. Obviamente, no se pueden determinar los límites superiores e inferiores. También se pueden utilizar concentraciones adecuadas de otros análogos del ácido fólico u otros compuestos que inhiben el DHFR. Aunque, el MTX, por sí mismo, es adecuado, está disponible fácilmente y es efectivo.

F. Anticuerpos anti-sialidasa

Los anticuerpos policlonales contra la sialidasa se producen en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de sialidasa y un adyuvante. Puede ser útil el conjugar la sialidasa o un fragmento de lo mismo a una proteína que sea inmunogénica en las especies a inmunizar, p.ej., la hemocianina de la lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o el inhibidor de la tripsina de soja mediante la utilización de un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugación a través de los residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina), glutaraldehido, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N = C = NR. También se pueden generar conjugados adecuados mediante procedimientos del ADN recombinante, mediante expresión de una denominada "proteína de fusión" que comprende las secuencias aminoacídicas de la sialidasa y de la proteína inmunogénica. La sialidasa, o el conjugado inmunogénico o derivado, también puede combinarse con un adyuvante como el adyuvante de Freund o el alumbre para la inyección en el animal, para incrementar la respuesta inmune.

Por ejemplo, los animales se inmunizan contra conjugados inmunogénicos o derivados mediante combinación de 1 mg o 1 \mug de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyección de la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde, los animales se estimulan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. De 7 a 14 días más tarde los animales se sangran y se analiza el suero para la titulación de anti-sialidasa. Los animales se estimulan hasta que la titulación alcanza la meseta. Preferentemente, los animales se estimulan con el conjugado de la misma sialidasa, pero conjugado a proteínas diferentes y/o a través de un agente de acoplamiento diferente.

Preferentemente, los anticuerpos anti-sialidasa son anticuerpos monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal" (y su plural) como se utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para posibles mutaciones que suceden de modo espontáneo, que pueden estar presentes en cantidades menores.

Los anticuerpos monoclonales incluidos dentro del ámbito de la invención incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes (p.ej., "anticuerpos humanizados") independientemente de la especie de origen o la designación de clase o subclase de inmunoglobulina, así como de los fragmentos de anticuerpo (p.ej., Fab, F(ab')2. y Fv), en tanto que sean capaces de unirse específicamente a la sialidasa. Cabilly, y col., patente americana U.S. 4.816.567; Mage & Lamoyi, en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Por ello, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de tal población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no necesita construirse a requerimiento de la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden producir utilizando el procedimiento del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975), o puede producirse mediante procedimientos del ADN recombinante. Cabilly y col., patente americana U.S.
4.816.567.

En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal adecuado con sialidasa o una porción inmunogénica de ello por vía subcutánea, intraperitoneal o intramuscular para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la sialidasa. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos se fusionan entonces con las células de mieloma utilizando un agente fusionante adecuado, como el polietilén glicol, para formar una célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986). Los anticuerpos monoclonales se recuperan de los cultivos de las células de hibridoma resultantes mediante la utilización de técnicas estándares.

En una realización preferida de la invención, el anticuerpo monoclonal anti-sialidasa tendrá una afinidad de unión a la sialidasa de por lo menos aproximadamente 10^{9} litros/mol, tal como se determinó, por ejemplo, por el análisis Scatchard de Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980).

En otra realización preferida de la invención, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo neutralizante. El término "anticuerpo neutralizante" tal como se utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente a la sialidasa, y que es capaz de inhibir sustancialmente o eliminar la actividad enzimática de la sialidasa. Habitualmente, un anticuerpo neutralizante inhibirá la actividad enzimática de la sialidasa por lo menos en aproximadamente un 50%, y preferentemente por encima del 80%, tal como se determina, por ejemplo, por los ensayos de sialidasa descritos infra. Los anticuerpos neutralizantes de la invención son especialmente útiles en aplicaciones terapéuticas, para prevenir o tratar actividad sialidasa no deseada en un ser humano u otro mamífero.

Los anticuerpos anti-sialidasa son de utilidad en los ensayos de diagnóstico para sialidasa. Los anticuerpos anti-sialidasa se marcan con radioisótopos, enzimas, fluoróforos, cromóforos y similares, y/o se inmovilizan en una matriz insoluble y pueden emplearse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tales como los ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pág. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un estándar marcado (por ejemplo, sialidasa recombinante, o una porción de ésta reactiva inmunológicamente) para competir con la sialidasa, que está presente en una muestra del test, por la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de sialidasa en la muestra del test es inversamente proporcional a la cantidad del estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de modo que el estándar y la muestra del test de sialidasa que están unidos a los anticuerpos pueden separarse convenientemente del estándar y la sialidasa de la muestra del test que permanecen no unidos.

Los ensayos de sándwich implican la utilización de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica diferente, o epitopo, de la proteína a detectar. En un ensayo de sándwich, la sialidasa de la muestra del test se une por un primer anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido, y luego un segundo anticuerpo se une a la sialidasa, formando así un complejo de tres partes insoluble. David & Greene, patente americana U.S. 4.376.110. El segundo anticuerpo puede, él mismo, estar marcado con una porción detectable (ensayos de sándwich directos) o se puede cuantificar mediante la utilización de un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con una porción detectable (ensayo de sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo de sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso la porción detectable es una enzima.

Los anticuerpos de la invención también son útiles para la obtención de imágenes in vivo, donde un anticuerpo marcado con un grupo detectable se administra a un huésped, preferiblemente en el torrente sanguíneo, y se analiza la presencia y localización del anticuerpo marcado en el huésped. El anticuerpo se puede marcar con cualquier grupo que es detectable en un huésped, ya sea por resonancia magnética nuclear, radiología u otros medios de detección conocidos en el sector.

Los anticuerpos anti-sialidasa también se utilizan para la purificación por afinidad de la sialidasa a partir de fuentes naturales o de un cultivo de células recombinantes. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan sobre un soporte sólido, como la resina de Sephadex o el papel de filtro, mediante la utilización de procedimientos conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto entonces con una muestra que contiene la proteína sialidasa a purificar, y luego se lava el soporte con un solvente adecuado que retirará sustancialmente todo el material en la muestra, excepto la proteína sialidasa, que se une al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado, que liberará la proteína sialidasa del anticuerpo.

G. Composiciones farmacéuticas

Para aplicaciones terapéuticas, la sialidasa o anticuerpo anti-sialidasa se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, incluyendo aquellos que se pueden administrar a un ser humano intravenosamente como un bolo o mediante perfusión continua durante un periodo de tiempo, mediante las rutas intramuscular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación, para ejercer efectos terapéuticos locales, así como sistémicos.

Dichas formas de dosificación comprenden composiciones farmacéuticas que comprenden la sialidasa o anticuerpo anti-sialidasa y opcionalmente un excipiente o portador que es por sí solo no es ni tóxico ni terapéutico. Entre los ejemplos de dichos portadores se incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias tamponadoras, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicérido de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno fosfato de potasio, sodio, cloruro, zinc, sales, sales, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, sustancias de base celulosa y polietilenglicol. Los portadores para formulaciones tópicas o con base gel de la sialidasa incluyen polisacáridos, tales como carboximetilcelulosa o metilcelulosa sódica, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros en bloque de polioxietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y alcoholes de cera de madera. Para todas las administraciones, se utilizan de manera adecuada formas de depósito convencionales. Dichas formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, tiritas, formas de inhalación, pulverizadores nasales, pastillas sublinguales y preparaciones de liberación sostenida. La sialidasa o anticuerpo anti-silaidasa se formularán habitualmente en dichos vehículos en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml.

Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la sialidasa, cuyas matrices están en forma de artículos con formas determinadas, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), tal como se describe por Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547 (1983), acetato de etileno-vinilo no degradable (Langer et al., supra), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido poli-D-(-)3-hidroxibutírico. Mientras polímeros como el acetato de etileno-vinilo y el de ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un tiempo prolongado, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Deben idearse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación se produce a través de la formación de un enlace S-S intermolecular a través de un intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos sulfhidrilos, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados, y desarrollando composiciones específicas de matrices poliméricas.

Las composiciones de liberación sostenida también incluyen sialidasa o anticuerpo anti-sialidasa encapsuladas en liposomas. Los liposomas que contienen la sialidasa se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3.688-3.692 (1985); Hwang y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4.030-4.034 (1980); patentes de Estados Unidos US 4.485.045 y US 4.544.545. Normalmente, los liposomas son del tipo unilaminar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en los que el contenido en lípidos es superior al 30% molar en colesterol, ajustando la proporción seleccionada para la terapia HRG óptima. Los liposomas con un mayor tiempo de circulación se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.013.556.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de sialidasa o anticuerpo anti-sialidasa dependerá del tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el polipéptido se administra para fines preventivos o terapéuticos antes de la terapia, el historial clínico del paciente y la respuesta a la administración o administraciones previas del polipéptido, y la discreción del médico a cargo. La sialidasa o anticuerpo anti-sialidasa se administra de manera adecuada al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos.

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Por ejemplo, la sialidasa es útil en el tratamiento o la prevención de la inflamación y trastornos inflamatorios, tales como la artritis reumatoide o la enfermedad de Crohn. Se ha observado que el grupo ácido siálico de glyCAM (molécula de adhesión celular dependiente de glicosilación) y moléculas similares están implicadas en el tratamiento o prevención de trastornos pulmonares, caracterizados por un sobreproducción o exceso de moco, tales como fibrosis quística, bronquitis crónica, bronquiectasias, asma, tuberculosis o pneumonía, y en el tratamiento o la prevención de infecciones virales, tales como por el virus de la gripe, donde un residuo de ácido siálico de un receptor celular está implicado en la unión del virus y la infección por éste. Stone, Australian J. Exp. Biol. 26:287-298 (1948). La sialidasa se puede administrar sola o conjuntamente con otros agentes terapéuticos conocidos, tales como antibióticos, agentes antivirales o mucolíticos, tales como la desoxirribonucleasa (DNasa).

Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 \mug/kg a 15 mg/kg de sialidasa o anticuerpo anti-sialidasa es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante perfusión continua. Una dosis diaria habitual podría variar desde aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se repite hasta que tenga lugar la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y pruebas convencionales.

G. Células huésped deficientes en sialidasa para el control de la glucosilación intracelular de proteínas

Una secuencia de ADN derivada del ADN que codifica para la sialidasa pero que no puede expresarse de forma funcional, se puede utilizar para "Knock out", o dicho de otra manera, alterar la función del gen de sialidasa de una línea celular mediante la utilización de una técnica de recombinación homóloga. También es posible utilizar esta aproximación para alterar la función del gen de sialidasa utilizando como diana el promotor del gen. Una modificación que altera la función del gen puede denominarse una "lesión" y puede ser una inserción, deleción, reemplazamiento o combinación de esto, aunque es quizás más simple utilizar un fragmento de ADN que tenga una deleción parcial de la secuencia que codifica para la sialidasa. Una deleción adecuada puede ser de unas 50 pb o más. Una construcción que contenga el gen modificado se introduce en la célula y la recombinación tiene lugar entre la construcción y el ADN genómico de la célula.

Para facilitar la detección de un suceso de recombinación se incorpora un gen marcador en la construcción. El gen marcador puede hallarse bajo el control regulador de un promotor incorporado en la construcción, que puede ser inducible bajo condiciones adecuadas. Sin embargo, se necesita el análisis de ADN para determinar si la recombinación se ha producido en el sitio genómico correcto. Tales análisis de ADN pueden realizarse mediante hibridación con el inserto y secuenciación de regiones flanqueantes al inserto, por lo que se determina la presencia de la secuencia codificante para la sialidasa en aquella región, o hibridar con el gen de la sialidasa y detectar la modificación que se realizó en el inserto de ADN.

En la aplicación de patente internacional WO91/01140 y en Hasty y col., Molecular and Cellular Biology, Junio de 1992, 2464-2474, se describen las técnicas adecuadas, que son conocidas por los expertos en la materia.

Si las células diana son diploides y tienen dos copias del gen de la sialidasa, las dos copias se pueden alterar a su vez, las células con una copia mutada se amplifican y luego se utilizan en una segunda etapa que implica la inactivación o la alteración de la segunda copia del gen. Cuando ninguna copia se expresa de modo funcional, tales células pueden detectarse examinando la ausencia de actividad de la sialidasa.

Otra técnica, que puede utilizarse en la alteración de la expresión funcional de una sialidasa de una línea celular, implica el ARN antisentido. El ADN que codifica para la sialidasa se puede introducir en las células bajo el control de un promotor que asegure la transcripción de la cadena de ADN diferente a la utilizada normalmente en la producción de ARNm, el cual se transcribe para producir la proteína sialidasa.

El gen antisentido se puede introducir en las células en un vector de expresión que se mantiene en las células sin integrarse en el genoma. Vectores de expresión adecuados se describieron anteriormente en el pasaje relacionado con el clonaje y expresión en organismos multicelulares eucariotas. Alternativamente, el gen se puede incorporar en el genoma de las células mediante recombinación. Es conveniente colocar el gen antisentido bajo el control de un promotor que asegure la transcripción al mismo tiempo que la transcripción del gen de sialidasa constitutivo. El promotor puede ser inducible de modo que su actividad se pueda controlar de modo preciso.

El modo de acción exacto del ARN antisentido en la alteración de la función normal del gen no se conoce completamente, aunque implica al menos parcialmente la hibridación del ARN antisentido con el ARNm complementario para formar ARN de doble cadena.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar solamente la invención, y no deberían tenerse en cuenta como una limitación del ámbito de la invención. Todas las citas literarias presentes están expresamente incorporadas por referencia.

Procedimiento experimental

Los procedimientos utilizados en los Ejemplos se describen a continuación.

Materiales: el ácido 4-metilumberiferil-N-acetil neuramínico, el ácido N-acetil neuramínico, la 2,3 sialil lactosa, 2,6 sialil lactosa, los gangliósidos, el ácido cólico, ácido colomínico y la apotransferrina son de Sigma Chem. Co. (St. Louis, Mo). El dímero y el tetrámero del ácido siálico son de E.Y. Labs, Inc., (San Mateo, CA). Los inhibidores de sialidasa; Neu5Ac2en, 9-azidoNeu5Ac2en y 9-NANP-Neu5Ac2en se preparan como se describió anteriormente [Warner Biochem. Biophys. Res. Commun., 148:1323 [1987] y Warner y col., Carbohydr. Res., 215:315 [1991]).

Ensayos de sialidasa fluorescente: las condiciones de ensayo estándares para la monitorización de la actividad enzimática durante la purificación utilizando el análogo de sustrato fluorescente son: 4-MUNeu5AC 1,3 mM, tampón fosfato 50 mM, pH 6,8, 0,3 mg de albúmina sérica bovina y cantidades variables de enzima en un volumen total de 30 \mul. Después de la adición de la enzima, las muestras se incuban a 37ºC en un baño de agua agitador durante 5 minutos. La reacción se finaliza y la fluorescencia de la umbeliferona liberada se incrementa mediante la adición de 2 ml de tampón carbonato-glicina 80 mM, pH 9,7. La cuantificación del producto se realiza mediante medición de la fluorescencia de las muestras con excitación a 365 nm y emisión a 450, nm utilizando un estándar de la 4-metil umbeliferona. Una unidad de actividad enzimática se define como un pmol/min de ácido siálico liberado.

Ensayos de sialidasa con sustratos naturales: Cuando se analizan sustratos naturales con la enzima purificada, la cantidad de ácido siálico liberado se cuantifica utilizando el ensayo de ácido tiobarbitúrico como se modificó por Uchida [Uchida y col., J. Biochem., 82:1245 (1977)] mediante la utilización de ácido siálico como estándar. La cantidad de ácido siálico en las muestras control, que incluye una mezcla de ensayo completa incubada sin enzima añadida se sustrae de cada determinación. Todas las muestras se clarifican por centrifugación (1.000 x G, 10 min) antes de determinar la absorbancia a 540 nm.

Ensayos de proteínas: Las determinaciones proteicas durante la purificación se determinan utilizando el equipo de ensayo proteico comercial que contiene ácido bicinchónico (reactivo BCA) obtenido de Pierce Chem. Co. (Rockford, IL). En las muestras que contienen glicerol, las determinaciones proteicas se llevan a cabo con el equipo de ensayo de unión G-250 con colorante azul de Coomassie de BioRad Labs (Richmond, CA) que se basa en el ensayo proteico de Bradford [Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248 (1976)]. La albúmina sérica bovina es un estándar para ambos ensayos.

Parámetros de la cinética enzimática: Condiciones de ensayo (tiempo y enzima añadida) se modifican para cada sustrato de modo que se cuantifican las tasas de la reacción inicial. Los parámetros cinéticos se obtienen a partir de dos trazados recíprocos dobles de las curvas de saturación del sustrato [Segel, I.H. John Wiley, New York, Enzyme Kinetics, 18 (1975)].

Electroforesis en gel de acrilamida: La electroforesis en gel de acrilamida se llevó a cabo como se describió por Laemmli (Laemmli, U.K. Nature 227:680 [1970]) utilizando geles de acrilamida al 12,5% en condiciones desnaturalizantes. Los marcadores de peso molecular son de BioRad.

Electroforesis en gel de isoelectroenfoque: El análisis de isoelectroenfoque de la sialidasa purificada se llevó a cabo utilizando geles de poliacrilamida preparados comercialmente (Pharmacia, Inc.), de plástico horneado, impregnados con tampones de amfolina, pH 3,9. Después de la electroforesis, los geles se fijaron, se tiñeron y se destiñeron como se describió por el fabricante, excepto que el azul de Coomassie, G250 se utilizó para la tinción de proteínas en lugar del Coomassie R-250. Los marcadores proteicos con valores de pI conocidos se obtuvieron de Serva (Heidelberg, Alemania).

En algunas ocasiones, la localización de la sialidasa se determinó mediante ensayo enzimático del gel.

Después de la electroforesis, el gel se mantuvo a 4ºC en hielo y cubierto con un papel de filtro saturado con tampón fosfato 50 mM, pH 6,8, que contenía 4-Neu5Ac 1,3 mM.

El gel se incubó en un baño de agua agitador a 37ºC durante 10 min. Después de retirar el papel de filtro, la localización de la enzima se determinó mediante inspección del gel, monitorizando el producto fluorescente con una lámpara de mano de luz ultravioleta. (Mineralight model UVGL-25, UVP, Inc. San Gabriel, CA). Las bandas que presentaban actividad se marcaron cortando el gel y luego se procedió a realizar la tinción de proteínas. Los puntos isoeléctricos de las muestras proteicas analizadas se determinaron basándose en la migración anodal de cada banda, que se comparó con la migración de los estándares proteicos con puntos isoeléctricos conocidos.

Aislamiento de péptidos trípticos de sialidasa: Una muestra de sialidasa purificada, 18 pg, en 180 \mul de tampón fosfato se diluyó mediante adición de 20 \mul de bicarbonato amónico 0,1 M. Se añadió TPCK-tripsina, 1,6 \mug (Worthington, Inc. Freehold, NJ) en 20 \mul de HCl 0,01 N y luego se incubó la mezcla durante 18 h a 37ºC. La reacción se finalizó por la adición de ácido trifluoroacético al 0,2% en volumen y el solvente se redujo a unos 250 \mul al vacío.

Los péptidos resultantes se aislaron mediante HPLC de fase reversa en una columna de sílice C-18 Vydac, 2,1 x 250 mm (The Separations Group, Inc., Hesperia, CA). La columna se equilibró en ácido trifluoroacético al 0,1% y los péptidos se resolvieron uno de otro utilizando un gradiente lineal con cantidades incrementadas de acetonitrilo que contenía 0,1% de ácido trifluoroacético, hasta el 100% en 76 min a una velocidad de flujo de 0,25 ml/min a 30ºC, mediante la utilización de un sistema de HPLC Hewlett-Package 1090. El efluente se monitorizó a 214 y 280 nm. Se recogieron unas veinte fracciones que contenían péptidos.

Análisis de la secuencia aminoterminal: Alícuotas de diversas fracciones de péptidos se sometieron al análisis de secuencia N-terminal mediante la utilización de un secuenciador ABI 447A/120A. En general, las muestras analizadas están en el rango de 100-200 pmol.

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Bancos de datos de secuencia proteica: La secuencia de los péptidos trípticos se examinó para conocer las homologías con otras secuencias peptídicas. La base de datos analizada incluía secuencias proteicas de la fuente de information del National Biomedical Research Foundation Protein, la base de datos SWISSPROT de EMBL y el Brookhaven Protein Data Bank.

Preparación de péptidos sintéticos y anticuerpos policlonales: Los antisueros policlonales se generaron en conejos hembras de la raza New Zealand White contra péptidos sintéticos preparados según secuencias del péptido tríptico como se describió en otra parte [Bennett y col., J. Biol. Chem., 266:23060 (1991)]. La fracción de IgG se aisló del suero total mediante cromatografía en columna utilizando las columnas comercialmente preparadas HiTrap Proteína A de 1,0 ml, según el protocolo suministrado por el fabricante (Pharmacia, Inc.). La fracción de IgG resultante contiene unos 2 mg de proteína/ml.

Análisis de inmunoblot: Los extractos celulares de diversas células de ovario de hámster chino, que crecieron tanto en medio con suero o exento de él, se prepararon mediante suspensión de las células, 10% p/v, en agua, seguido de irradiación sónica de tres pulsos de cinco segundos en un sonicador Fisher Sonic Dismembrator modelo 300 (Fisher Scientific, Springfield, NJ). Los extractos libres de células se sometieron a un análisis en gel de poliacrilamida-SDS y se transfirieron electroforéticamente a una membrana de difluoruro de polivinilideno [Matsudaria, P. J. Biol. Chem., 262:10035 (1987)]. Después de finalizarse la transferencia, la membrana se lavó e incubó con la fracción de IgG del antisuero peptídico diluido en tampón bloqueante como se describe por Burnette [Burnette, W.N. Anal. Biochem., 112:195 (1981)]. La detección de la sialidasa mediante análisis por inmunoblot se realizó utilizando la fracción IgG del anticuerpo contra el péptido, dilución 1:1000, y un conjugado de anticonejo de cabra-pèroxidasa de rábano, dilución 1:2000, (BioRad) con el sustrato 4-cloro-naftol.

Análisis de carbohidratos por inmunoblot: Los carbohidratos unidos a proteínas se detectan mediante la utilización de un sistema comercial de detección de glucanos (Boehringer) que se basa en el procedimiento de inmunoblot oxidativo descrito por Haselbeck y Hosel [Haselbeck y col., Glycoconjugate J., 7:63 (1990)]. Se sigue el protocolo de tinción recomendado por el fabricante, excepto que la proteína se transfiere a una membrana de difluoruro de poliviniledeno en lugar de una membrana de celulosa, y los tampones bloqueantes contienen albúmina sérica bovina al 5% en tampón Tris 10 mM, pH 7,4 con cloruro sódico al 0,9%. La detección se realiza con anticuerpos anti-digoxigenina unidos a un conjugado de fosfatasa alcalina (Boehringer), dilución 1:1000 en solución salina tamponada con Tris, mediante la utilización de los sustratos de fosfatasa, 4-nitroblue tetrazolium cloruro al 0,03% (p/v) y 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato al 0,03% (p/v) en tampón Tris 100 mM, pH 9,5, que contiene cloruro sódico 100 mM y cloruro magnésico 50 mM. Las bandas proteicas que contienen el carbohidrato se visualizan generalmente al cabo de unos 10 a 15 min.

Digestión con péptido-N-glucosidasa F: La sialidasa purificada (3 pg) o la transferrina, como un control, se dializa de forma extensa frente a bicarbonato amónico 0,1 M y se retira el solvente al vacío. El residuo se resuspende en 14 \mul de un tampón que contiene SDS al 0,18%, beta-mercaptoetanol 18 mM, fosfato 90 mM, EDTA 3,6 mM, a pH 8,6 y se calienta a 100ºC durante 3 min. Después de enfriarlo a temperatura ambiente, la muestra se dividió en dos partes iguales. Una alícuota no se trató y sirvió como un control. La segunda fracción se ajustó a aproximadamente el 1% con NP-40 seguido de 0,2 unidades de péptido-N-glucosidasa F (Boehringer). Ambas muestras se calentaron a 37ºC durante 2 h y se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.

Condiciones del cultivo celular: Las células de ovario de hámster chino, CHO 14.16 y CHO 12 se derivan de la línea celular CHO-DUX (dhfr-) [Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 77:4216 (1980)]. Las células Lec2 (ATCC número CRL 1736) son células de ovario de hámster chino obtenidas de American Type Culture Collection (Rockville, MD). Las células se crecieron en cultivos en monocapa o en suspensión en un medio MEM de alta concentración de glucosa suplementado con suero vacuno fetal (10%). Los cultivos en monocapa crecieron hasta casi la confluencia y se cosecharon mediante raspado de la placa. Los cultivos en suspensión se cosecharon a una densidad celular de unos 1,2-1,4x10^{6} células/ml. La viabilidad celular se determinó mediante exclusión con azul de Tripan y sólo los cultivos con una viabilidad del 90% o más se utilizaron para el análisis.

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Ejemplo 1 Purificación de Sialidasa

El protocolo para la purificación de la sialidasa a partir de unos 100 L de medio de cultivo celular se resume en la Tabla I. El líquido se obtuvo de cultivos de células CHO 14.16 crecidas en medio exento de suero. Después de eliminar los restos celulares, el líquido se filtró y se concentró a aproximadamente 10 veces mediante la utilización de una membrana de polisulfona de 10 KD (Millipore), reduciendo la concentración de sal isotónica del líquido a aproximadamente 50 mM a pH 7,0. El líquido del cultivo celular concentrado se sometió directamente a una cromatografía DEAE-Sepharose. En estas condiciones de cromatografía, la sialidasa no se adhiere a la columna y aparece en el eluído. El líquido eluído de la columna se concentró unas 30 veces mediante la utilización de un filtro de membrana de celulosa de 10 KD (Millipore). El material concentrado se conservó congelado a -20ºC y sirvió como material de inicio para la purificación de la sialidasa.

TABLA 1

3

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La purificación de la enzima se monitorizó en cada paso utilizando 4-MU-Neu5Ac como sustrato. El material final purificado se analizó con diversos sustratos conjugado con sialil que se generan de forma natural. Todas las etapas de purificación se llevaron a cabo a 4ºC.

Paso 1: Precipitación con sulfato de amonio: Un L, aproximadamente, de concentrado de DEAE-Sepharose (equivalente a 100 L de líquido de cultivo celular) se clarificó mediante centrifugación a 13.000xg a 4ºC durante 20 min. Tras la eliminación del sedimento, el sobrenadante se ajustó al 47% de saturación mediante adición de sulfato de amonio sólido. Después de la centrifugación (17.000xg, 20 min, 4ºC) el sobrenadante se desechó y se resuspendió el sedimento mediante aspiración repetida con una pipeta utilizando 30 ml de fosfato 2,5 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM (Tampón A). (Salvo que se indique lo contrario, todos los tampones utilizados durante la purificación contienen EDTA 1 Mm). La solución se dializó durante toda la noche con 3 cambios de 4 L de tampón A.

Paso 2: Cromatografía de DEAE: Después de la diálisis, la preparación enzimática se aplicó a una columna (5 x 15 cm) que contenía DEAE-Sepharose FF (Pharmacia) equilibrada en tampón A. La columna se eluyó con 225 ml de Tampón A, y este eluído se descartó. Otra elución se llevó a cabo con 250 ml de fosfato 10 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, (4x Tampón A) seguido de 600 ml de fosfato 20 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, recogiéndose fracciones de 8 ml. Las fracciones que contenían la actividad enzimática se agruparon y el pH se ajustó a pH 6,0 con HCl diluido.

Paso 3: Cromatografía de S-Sepharose: La preparación enzimática del paso previo se aplicó con una bomba peristáltica a una columna (2,5 x 7,5 cm) que contenía S-Sepharose de flujo lento (Pharmacia) en Tampón A 4X a pH 6,0. La columna se lavó con aproximadamente 25 ml de tampón fosfato 10 mM, pH 6,0. Otra elución se llevó a cabo con un gradiente lineal de un tampón incrementando la concentración de fosfato desde 10 a 150 mM en un total de 400 ml, recogiendose fracciones de 5 ml. La velocidad de flujo de la columna se mantuvo con una bomba peristáltica a unos 2 ml/min. La actividad se eluyó en un amplio margen del gradiente. Con algunas preparaciones, el mayor pico de actividad se resolvió parcialmente en dos fracciones con niveles de sialidasa casi iguales. El examen de estas fracciones con isoelectroenfoque en poliacrilamida indicó que cada una contenía diversas formas isoeléctricas enzimáticas. Ya que ninguna fracción contenía una forma enzimática única, ambas fracciones se combinaron y purificaron juntas como una mezcla.

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Paso 4: Cromatografía de interacción hidrofóbica: El material de la S-Sepharose se recogió en sulfato amónico 2M, se ajustó a pH 6,0, y entonces se aplicó a una columna Phenyl-Toyopearl 650S, 1,5 x 7 cm, equilibrada en un tampón que contenía fosfato 50 mM, pH 6,0, EDTA 1mM y sulfato amónico 2 M. Después de cargarlo, la columna se lavó con 20 ml de tampón de equilibrio y luego se eluyó con un gradiente lineal de sulfato amónico decreciente en el tampón. Se utilizaron unos 55 g aproximadamente de cada tampón o unos 100 ml del gradiente total, y se recogieron fracciones de dos ml. Después de identificar las fracciones que contenían actividad enzimática, ésta se agruparon y luego se dializaron durante toda la noche frente a 1 L de fosfato 5 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM con glicerol al
10%.

Paso 5: Cromatografía de heparina-agarosa: La muestra dializada del paso previo se aplicó directamente a una columna de 1,0 x 7 cm que contenía heparina-agarosa (Sigma) equilibrada en fosfato 5 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM que contenía NaCl 50 mM. Después de cargar la muestra con ayuda de una bomba peristáltica, la columna se lavó con 8 ml de tampón de equilibrio y la enzima se diluyó con un total de 120 ml de gradiente lineal de tampón de equilibrio e incrementando la concentración de cloruro sódico hasta 500 mM. Se recogieron fracciones de 1,5 ml. Las fracciones que contenían actividad se agruparon y concentraron posteriormente ajustandolas a sulfato de amonio 2 M y aplicandolas a una columna de Phenyl-Toyopearl de 0,5x10 cm, y se eluyeron con 2 ml de fosfato 5 mM, EDTA 1 mM. La solución de enzima concentrada se dializó frente a 1 L del tampón de elución con glicerol al
10%.

Paso 6: Cromatografía de cromatoenfoque: La preparación de enzima concentrada del paso previo se diluyó con un volumen igual de Tris-HCl, 25 mM, pH 8,0 y cloruro sódico 25 mM. La mezcla se ajustó a pH 8,0 con hidróxido diluido y entonces se aplicó a una columna de DEAE-Sepharose de 1,0 x 18 cm equilibrada en el tampón Tris. Después de cargar la mezcla, la columna se lavó con 8 ml de tampón de equilibrio. La enzima se eluyó con Politampón 96 (Pharmacia), diluido 1:12 y se ajustó a pH 6,0 con HCl. Se recogieron fracciones de 2 ml, con una velocidad de flujo de unos 0,5 ml/min con ayuda de una bomba peristáltica. La enzima se eluyó como un pico agudo a pH 7,0-7,4, en un volumen total de unos 9,0 ml (Fig. 1). Las fracciones agrupadas se ajustaron inmediatamente a sulfato de amonio 2M y pH 6,0 con HCl y luego se concentraron aplicándolas a una columna Phenyl-Toyopearl de 1,0 x 1,0 cm, equilibrada con fosfato 5 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, con glicerol al 10% y sulfato de amonio 2 M. Después de la aplicación de la muestra, la columna se lavó con 5 ml de tampón de equilibrio para eliminar el Politampón. La enzima se eluye mediante lavado de la columna con 1,5 ml de fosfato 5 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM con glicerol al 20% y se dializó durante toda la noche frente a 1 L de tampón de elución.

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Ejemplo 2 Evaluación de la pureza enzimática y la caracterización de la enzima

Análisis con electroforesis de poliacrilamida y SDS: La preparación de sialidasa purificada final proporciona una banda proteica mayor única de un peso molecular de 43 KD cuando se analiza por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en condiciones reductoras (Fig. 2). Se detectó un contaminante menor a unas 60KD, que se estimó era inferior al 1% de la muestra total analizada. Un resultado similar se obtuvo cuando la muestra se dializó en la ausencia de un reactivo reductor excepto que la banda proteica a 43 KD es considerablemente más difusa.

Análisis de isoelectroenfoque: Cuando la preparación de sialidasa purificada se sometió a isolectroenfoque en gel de poliacrilamida, se detectaron al menos dos bandas de proteína mayores junto con unas cinco bandas menores (Fig. 3, panel B). Las dos bandas de proteínas mayores, S_{a} y S_{b}, tienen puntos isoeléctricos de pI = 6,8 y 7,0, respectivamente. Todos las bandas de proteínas tienen actividad de sialidasa cuando el gel se visualiza impregnándolo con un sustrato fluorogénico (Fig. 3, panel C). El nivel de actividad en cada banda es proporcional a la intensidad de la tinción
proteica.

pH óptimo y estabilidad: La enzima purificada exhibe actividad considerable en un amplio margen de pH, que se extiende desde pH 4,5 a 7,5, con el óptimo a pH aproximado de 5,9 (Fig. 4). Un resultado similar se obtiene cuando la enzima se analiza en homogeneizados celulares crudos, excepto que el nivel de actividad en el rango acídico, pH 3,5-4,5 es ligeramente superior al de la enzima purificada (Fig. 4). Se asume que esta actividad es debida a la presencia de la sialidasa lisosomal en el homogeneizado crudo que tiene un pH óptimo en la región acídica [Warner y col., Biochemistry, 18:2783 (1979)].

La proteína es estable durante la purificación y las fracciones se guardan, cuando sea necesario, congeladas a
-20ºC entre los pasos de purificación. Sin embargo, después del cromatoenfoque, la preparación enzimática final era termolábil y requirió la presencia de glicerol al 20% para mantener su actividad durante la diálisis. Incluso cuando se incluye glicerol al 20%, se pierde aproximadamente el 15% de la actividad tras un sólo ciclo de congelación-descongelación. El material final es estable durante tres meses si se conserva congelado a -70ºC.

Como resultado de la termolabilidad de la enzima purificada, la albúmina sérica bovina (0,3 mg/ml) se incluye en el ensayo para asegurar que las condiciones de ensayo lineal se mantienen cuando se evalúan los parámetros cinéticos de los diversos sustratos.

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Especificidad de sustrato: Se analizaron diversas clases de sialil glucoconjugados como sustratos, Tabla II. Los oligosacáridos como sialil lactosa se cortaron rápidamente; aunque la enzima muestra una preferencia de aproximadamente 4 veces por los residuos de ácido siálico unidos en posición 2,3-. Esto no es sorprendente ya que las glucoproteínas derivadas de roedor contienen, casi exclusivamente, ácido siálico en uniones en posición 2,3-. Las cadenas laterales de oligosacáridos en las glucoproteínas intactas también fueron sustratos. El ácido siálico unido a la transferrina de suero humano se corta mucho más lentamente que el unido a la deoxiribunucleasa I humana recombinante. La diferencia en los valores de Vmax entre estos dos sustratos proteicos es también debida a las diferencias de unión del ácido siálico. La transferrina se aísla del suero humano y contiene sólo residuos de ácido siálico unidos en posición 2,6 [Baenziger, J.U. The Plasma Proteins 2^{nd} Ed. (Putnam, F.W., ed.) 272-398, Academic Press, New York (1984)]. Por el contrario, la desoxirribonucleasa I, aunque codificada por una secuencia de nucleótidos derivados del hombre, se expresaba en células de ovario de hámster chino y por ello contiene, seguramente, sólo ácidos siálicos unidos en posición 2,3. Los valores de Km para ambas proteínas fueron casi idénticos. Los dímeros de ácido siálico (aislados de hidrolizados del ácido colomínico) en uniones en posición 2,8- también fueron sustratos para la enzima. Ácidos siálicos oligoméricos superiores como los tetrámeros del ácido siálico y ácido colomínico también fueron hidrolizados pero a tasas sustancialmente reducidas.

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TABLA II

4

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Algunos gangliósidos se degradan por la sialidasa (Tabla III), aunque estos sustratos requieren la presencia del ácido cólico como un agente solubilizante en el ensayo para actividad óptima. Los gangliósidos, G_{M3}, G_{D1a} y G_{T1b} se hidrolizaron a velocidades comparables mientras que G_{M1}, G_{M2} y G_{D1b} no eran sustratos. Estos resultados son consistentes con la exhibición por parte de la enzima de una preferencia por los residuos de ácido siálico unidos al extremo terminal de la cadena de oligosacáridos. Residuos de ácido siálico unidos internamente como aquellos en G_{M1} y otros gangliósidos no son aparentemente accesibles a la enzima.

TABLA III

5

Detección de carbohidratos: La presencia de múltiples formas electroforéticas (Fig. 3) sugiere que la sialidasa puede ser una glucoproteína que contiene una mezcla heterogénea de cadenas laterales de oligosacáridos con diferentes grupos cargados. Por esta razón, la proteína se analizó por sus carbohidratos utilizando el procedimiento de inmunoblot oxidativo descrito por Haselbeck y Hosel (supra) (Fig. 5). Con este ensayo, no se detectaron carbohidratos en la sialidasa (1,5 \mug), (Fig. 5, carril C). Al contrario, se observó una señal más fuerte con las cadenas laterales de oligosacáridos de transferrina (0,8 \mug), incluso se analizó una cantidad más pequeña de esta glucoproteína (Fig. 5, carril D). En experimentos no mostrados, se estimó con el ensayo de inmunoblot que los límites de detección eran de aproximadamente 80 ng de glucoproteína transferida.

En otros experimentos (resultados no mostrados), la sialidasa se digirió con péptido-N-glucosidasa F, una endoglucohidrolasa que corta casi todos los tipos de asparagina unidos a las cadenas de carbohidratos de las proteínas desnaturalizadas [Tarentino, A. L., y col., Biochemistry, 24:4665 (1985)]. Este tratamiento no tuvo efecto en la enzima, como se analizó por electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS, indicando además que la sialidasa no contenía cadenas laterales de carbohidratos.

Las múltiples formas electroforéticas observadas de la enzima purificada deben producirse debido a la heterogeneidad de carga introducida en la proteína por otros medios, posiblemente por degradación proteolítica o deamidación de los residuos de asparagina [Wright, H.T., Crit. Rev. Biochem. and Mol. Biol., 26:1 (1952)].

Estudios de inhibidores: Se evaluó la potencia de varios inhibidores de sialidasa con la enzima purificada y se compararon sus valores Ki con sialidasas de otras fuentes (Fig. 6, Tabla IV). El conocido inhibidor de la sialidasa microbiana, Neu5Ac2en, fue un potente inhibidor de la sialidasa de células CHO, con una Ki de aproximadamente 10 \muM. Derivados de Neu5Ac2en que contienen sustituyentes en lugar del grupo hidroxilo C-9, también se evaluaron como inhibidores enzimáticos. Las modificaciones incluyen la sustitución con grupos azida y nitrofenil azida, dando lugar al 9-azido-Neu5Ac2en y 9-PANP-Neu5Ac2en, respectivamente, (Fig. 6). Al contrario que la sialidasa lisosomal y plasmática, que se inhibía fuertemente por ambas moléculas Neu5Ac2en modificadas, la sialidasa de células CHO se inhibe moderadamente por 9-azido-Neu5Ac2en (K_{i} = 45 \muM), y se inhibe débilmente por el 9-PANP-Neu5Ac2en (K_{i} = 300 \muM). Análisis previos de la sialidasa citosólica del músculo de rata dio resultados similares a los obtenidos con la sialidasa de células CHO (Warner, T.G., Louie, A, Potier, M. y Ribeiro, A. (1991) Carbohydr. Res. 215:315).

TABLA IV

6

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Ejemplo 3 Detección por anticuerpos de sialidasa en homogeneizados de células CHO

La sialidasa descrita se purificó del medio de cultivo celular de la producción de una sola línea celular (CHO 14,16), y los lisados de ésta, así como otras células CHO se examinaron por su presencia de enzima con el fin de conocer mejor su frecuencia de expresión en el linaje de células CHO. Se utilizó el inmunoensayo porque los ensayos enzimáticos directos de los homogeneizados para la sialidasa pueden ser complicados debido a la presencia de sialidasa lisosomal y quizás de otras sialidasas celulares que puede que tengan actividad prolongada en la zona de pH neutro.

Como una primera etapa en al preparación de anticuerpo anti-sialidasa, la sialidasa purificada se digirió con tripsina y los péptidos trípticos resultantes se secuenciaron. La Figura 8 muestra las secuencias de 11 péptidos trípticos de la sialidasa. En la comparación de la secuencia de aminoácidos de fragmentos trípticos con las secuencias de sialidasas microbianas y otras proteínas de mamífero utilizando bases de datos de secuencia, no se hallaron homologías de secuencia significativas para el péptido 11 (Fig. 8).

Se prepararon anticuerpos altamente específicos contra un péptido sintético que tiene la secuencia de aminoácidos del péptido 11, CRVQAQSPNSGLDFQDN, (SEQ. ID. NO. 13), y se utilizaron para la determinación de la presencia de sialidasa en inmunoblots de extractos celulares, (Fig. 7). La enzima purificada dio una señal fuerte a aproximadamente 43 KD con un anticuerpo peptídico. Un resultado similar también se obtuvo con extractos celulares de la línea celular CHO 14.16 y extractos de otras diversas líneas celulares CHO. Estos resultados demuestran que la sialidasa de células CHO no está limitada a la línea celular específica empleada para esta purificación. Aunque, los niveles de sialidasa varían ligeramente entre diferentes líneas celulares.

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Ejemplo 4 Síntesis de sondas oligonucleotídicas

La unicidad de la SEC. ID. NO. 11 la hace útil para la construcción de una sonda oligonucleotídica para el gen de la sialidasa para utilizarse en la técnica de "sonda larga", como se describe en Ullrich, A. Berman, C.H., Dull, T.J., Gray, A., y Lee, J.M., The EMBO Journal 3, nº 2, 361-364, (1984), también en la publicación de patente europea E.P. Pub. 128.042 publicada el 12 de diciembre de 1984. Esta técnica requiere la síntesis de una sonda única, que tiene una secuencia de nucleótidos que es una de las muchas secuencias posibles que codifican para las secuencias aminoacídicas (como una sonda basada en la secuencia de aminoácidos del péptido 11, Fig. 8).

Un oligonucleótido se sintetiza utilizando el procedimiento de Crea, R., y Hom, T., Nucleic Acids Research, 8, 2231 (1908). El oligonucleótido se sintetiza sobre un soporte de celulosa sólido mediante adición secuencial de bloques de monómeros, dímeros o trímeros protegidos. El polímero nucleotídico final se trata con una base (amoníaco concentrado acuoso) y un ácido (ácido acético acuosos al 80%) para liberar el oligonucleótido del polímero, el polímero se retira mediante centrifugación, y el sobrenadante que contiene el oligonucleótido se evapora hasta convertirlo en polvo seco. El residuo, disuelto en amoníaco acuoso al 4% se lava con éter (3x) y se utiliza para el aislamiento del fragmento desprotegido completamente. La purificación se logra en un gel de poliacrilamida al 15% y se recupera mediante electroelución y precipitación con etanol.

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Ejemplo 5 ADN que codifica para la sialidasa aislado de una biblioteca genómica

El ADN de las células de ovario de hámster chino (CHO) se prepara de acuerdo con el procedimiento de Blin y Stafford, Nucleic Acid Research, 3:2303 (1976) y se somete a una digestión no limitada con endonucleasas de restricción HaeIII y AluI. Los productos se fraccionan por tamaño mediante centrifugación en gradiente de sacarosa. Ver Maniatis y col., Cell, 15:1157 (1978). Fragmentos grandes (15-20 Kb) se aíslan y se tratan con EcoRI metilasa para dar sitios EcoRI en el ADN resistentes al corte con EcoRI. Las moléculas de ADN dodecamérico sintético que portan un sitio de corte EcoRI (adaptadores EcoRI) se ligan al ADN metilado y se digieren con EcoRI para generar extremos cohesivos EcoRI. Tras una selección por tamaño (15-20Kb), el ADN es adecuado para la inserción en el bacteriófago vector de clonaje, Charon 4A (\lambdaCH4A).

El ADN foráneo se puede insertar en el vector \lambdaCH4A después de la eliminación de dos fragmentos EcoRI que contienen genes no esenciales para la fase de crecimiento. Los dos "brazos" del ADN del bacteriófago se anillaron a través de sus extremos cohesivos de 12 pares de bases y se unieron al ADN mediante ligación de los extremos cohesivos EcoRI. La reacción de ligación se realiza a una elevada concentración de ADN para promover la formación de moléculas de ADN concataméricas, que son los sustratos para el empaquetamiento in vitro. Aproximadamente, 1x10^{6} de fagos empaquetados in vitro se amplifican 10^{6} veces mediante crecimiento a baja densidad en placas de agar para establecer una biblioteca permanente de los fragmentos de ADN clonados.

Rastreo de la biblioteca genómica

La biblioteca HaeIII-Alu se rastrea utilizando la técnica de hibridación en placa in situ de Benton y Davis, Science, 196: 180 (1977). 100.000 fagos recombinantes se plaquean sobre 3,1x10^{8} células bacterianas en fase exponencial en placas de Petri NZCYM de 15 cm. Para evitar que el agar de la capa superior ("top agar" en inglés) se adhiera al filtro de nitrocelulosa cuando se retira de la placa (lo que tiende a incrementar el ruido de fondo de la hibridación), las placas se secan a 37ºC en un incubador durante varias horas, o se dejan invertidas durante toda la noche para drenar el exceso de líquido. La utilización de agarosa al 0,7 por ciento en lugar de agar en la capa superior también minimiza este problema. Las placas se incubaron a 37ºC durante 14-16 horas, tiempo en que las placas son confluentes. Las placas se refrigeraron durante una hora o más antes de aplicar los filtros. Los filtros de nitrocelulosa (tamaño del poro 0,45 \mum) se colocaron fácilmente sobre la placa de agar. El fago y el ADN se adsorbieron por duplicado a estos filtros, 1a y 1b, 2a y 2b, etc., colocando dos filtros en cada placa secuencialmente, 5 min para cada una, a temperatura ambiente. Se realizaron pequeños agujeros con una aguja llena de tinta para orientar los filtros en las placas. El ADN se desnaturalizó y se unió a los filtros como se describe en Benton y Davis, supra.

Para preparar los filtros para la hibridación con una sonda sintética marcada, se mojan en unos 10 ml por filtro de 5XSSC, solución de Denhardt 5X (solución de Denhardt 5X = albúmina sérica bovina al 0,1 por ciento, polivinilpirrolidona al 0,1 por ciento, Ficoll al 0,1 por ciento), Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm., 23:641 (1966), 50 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, pirofosfato sódico al 0,1 por ciento y formamida al 2 por ciento. Los filtros se prehibridan con agitación continua a 42ºC durante 14-16 horas. Los filtros se hibridan con agitación a 42ºC en solución de prehibridación que contiene una sonda marcada con ^{32}P. La sonda sintética para la sialidasa se marca utilizando el procedimiento de Taylor y col., Biochem. Biophys. Acta., 442:324 (1976). Después de la hibridación, los filtros se lavan 6 veces en agitación en unos 15 ml por filtro de SDS al 0,1 por ciento, pirofosfato sódico al 0,1 por ciento, 0,2XSSC a 37ºC durante 45 min. los filtros se transfieren secos, se montan en una casete y se exponen a una película de rayos X Kodak XR5 con pantallas intensificadoras Dupont Cronex 11R Xtra Life Lihtning-plus a -70ºC durante 1-2 días.

Purificación de calvas de fagos recombinantes

Las calvas de la región de una placa que corresponde a un positivo en el autoradiograma se pican y se resuspende en 0,5 ml de PBS (gelatina al 0,05 por ciento, NaCl 0,10 M, Tris 0,01 M pH 7,4, MgCl_{2} 0,01 M). La suspensión de fagos se titula y la placa que contiene aproximadamente 1.000 calvas se rastrea. El proceso de picar las positivas y de rerastrear se repite hasta que el 90 por ciento de las calvas de una placa den señales positivas después del rastreo. Fagos únicos se resuspenden en 1,0 ml de PBS a 37ºC durante 2 h. Se añade 50 \mul de la suspensión a 0,2 ml de células bacterianas en fase exponencial + 0,2 ml de MgCl_{2} 10 mM, CaCl_{2} 10 mM y el cultivo se incuba a 37ºC durante 15 minutos. Este cultivo se añade entonces a 50 ml de medio NZYDT y se incuba a 37ºC durante 14-16 horas. Se añade cloroformo y 3 g de NaCl y se eliminan las bacterias mediante sedimentación a 5000 rpm durante 15 min. Se añade 3,5 g de polietilénglicol al sobrenadante, y la mezcla se incuba 1 h a 0ºC. Entonces se sedimenta el fago precipitado mediante centrifugación a 5000 rpm durante 20 min. El sedimento se resuspende en 2,0 ml de PBS + 1,0 g de CsCl y se le dispone sobre capas de 0,9 ml de 1,7, 1,5 y 1,45 g/ml de CsCl en PBS. El gradiente se centrifuga a 25.000 rpm en un rotor Sorvall 50 Ti durante 3 h. La banda del fago se recoge y se dializa de 14-16 horas frente a NaCl 0,1 M, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y MgSO_{4} 10 mM. El ADN del fago se extrae con fenol equilibrado con Tris 10 mM, EDTA 1 mM. El fenol se retira con cloroformo y el ADN se precipita con etanol al 100 por ciento. El ADN se resuspende en agua y se digiere con EcoRI a 37ºC. El ADN digerido se migra en un gel de agarosa al 1 por ciento. El análisis de hibridación de la transferencia de las digestiones del ADN se lleva a cabo como se describe por Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975). Estos filtros se hibridan en las mismas condiciones que las de la biblioteca de fagos con la sonda del gen de sialidasa sintética. El fragmento que hibrida se clona en M13 (ATCC 15669-B1). La extracción de calvas se realiza como se describió previamente y el ADN se obtiene a partir de las calvas que hibridan.

El ADN que se aísla mediante los procedimientos anteriores codifica para la sialidasa, y cuando se expresa en las células huésped recombinantes, produce la proteína sialidasa. La expresión de proteína sialidasa recombinante se determina fácilmente, por ejemplo, utilizando un ensayo de sialidasa fluorescente descrito supra.

El ADN que codifica para la sialidasa se secuencia utilizando la técnica de Maxam y Gilbert, descrita en Methods in Enzymology (1980) 65 (apartado 1), 497-559.

La transcripción del ADN que codifica para la sialidasa produce ARNm para utilizar en la síntesis de ADNc carente de intrones. El ADNc se sintetiza como se describe en Maniatis y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory.

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Ejemplo 6 Producción de células recombinantes en las que un gen de sialidasa constitutivo no se expresa de modo funcional, mediante recombinación homóloga

La técnica utilizada aquí se describe en la solicitud de patente internacional WO 91/01140.

Un vector para utilizar en la inactivación de la expresión de sialidasa funcional se construye a partir de un fragmento de restricción del ADN que codifica para la sialidasa obtenido en el Ejemplo 5. El fragmento de restricción carece de una parte del gen de sialidasa de modo que su expresión no conduce a la producción de una sialidasa funcional. El fragmento de restricción se clona en el plásmido pBR322 y se introduce un gen marcador seleccionable en el fragmento.

El ADN que comprende el gen de sialidasa defectuoso y el gen marcador seleccionable se introduce en las células de ovario de hámster chino mediante microinyección (Capecchi, Cell 22, 479-488 (1980)) y las células se crecen en medio selectivo para el marcador. El crecimiento en el medio establece que el gen sialidasa defectuoso se haya integrado en el genoma de las células. Las células de las colonias que crecen se aíslan y se analizan para identificar aquellas en los que ha tenido lugar la integración del gen de sialidasa defectuoso mediante recombinación homóloga con el gen de tipo nativo en oposición a la integración por recombinación no homóloga en otro sitio en el genoma. Esto se realiza utilizando sondas oligonucleotídicas para el inserto, un ensayo de transferencia de Southern y luego la secuenciación de las regiones 5' y 3' del ADN obtenido para saber si la presencia de la secuencia codificante para la sialidasa se prolonga más allá del ADN insertado.

Las células que demuestran la inactivación de una copia del gen de la sialidasa se utilizan para la inactivación de la segunda copia.

La introducción de un gen de sialidasa defectivo con un marcador seleccionable se repite. Las células en donde se hallan inactivado ambas copias del gen de sialidasa se identifican por la ausencia de expresión funcional de la actividad de sialidasa, que se determina utilizando el ensayo de sialidasa fluorescente descrito supra.

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Ejemplo 7 Producción de células recombinantes en donde el gen de sialidasa no se expresa de modo funcional, mediante la utilización de ARN antisentido

El ADN que codifica para la sialidasa se inserta en un vector de expresión en mamíferos bajo el control de un promotor que asegura la transcripción de la cadena de ADN que no es la que se transcribe en ARNm. El vector se introduce en las células de ovario de hámster chino en condiciones en que la transcripción tiene lugar.

La actividad de sialidasa se analiza utilizando las técnicas de fluorescencia que se utilizan en los ejemplos precedentes. Poca o ninguna actividad de sialidasa se halla, como resultado de la interacción del ARN antisentido con el ARNm de la sialidasa. La actividad de sialidasa constitutiva se altera de modo que no hay expresión funcional.

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Ejemplo 8 Expresión de glucoproteína recombinante

Las células producidas en el Ejemplo 6 y Ejemplo 7 se transforman utilizando una técnica descrita supra con un vector de expresión recombinante que contiene el ADN que codifica para una glucoproteína deseada. La glucoproteína se expresa y se halla que tiene cadenas laterales de carbohidratos intactas, residuos de ácido siálico que no se han cortado.

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Ejemplo 9 Clonaje y expresión del gen de sialidasa Purificación de la sialidasa

La enzima sialidasa de células CHO se purificó como se describe en el Ejemplo 1, excepto que las dos fracciones de actividad enzimática que se obtuvieron en la etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre Sepharose-S no se combinaron. La fracción que se eluyó de la columna de S-Sepharose a la mayor concentración de sal ("fracción"), que tiene un pI que se estimó a aproximadamente pH=7,0, se procesó independientemente a través de los pasos de purificación subsiguientes descritos en el Ejemplo 1. Una preparación de la enzima sialidasa de células CHO se obtuvo por ello a partir de la fracción 2, y se utilizó como una fuente de péptidos para el análisis de la secuencia de aminoácidos.

Secuenciación peptídica

El análisis de secuencia amino-terminal se llevó a cabo mediante degradación de Edman utilizando un secuenciador Applied Biosystems 477A/120A. No se observaron señales cuando la proteína intacta se sometió a un análisis de secuencia que indicaba que se bloqueaba el extremo amino-terminal. Por ello, la sialidasa se trató con proteasas diversas para generar péptidos para la secuenciación. Antes de la digestión con proteasa, la enzima se redujo y se S-carboximetiló (RCM) con ácido yodoacético como se describe en Harris y col., Eur. J. Biochem., 188:291 [1990]. Después del tratamiento RCM, tres muestras de 20 pg de sialidasa se sometieron separadamente a la degradación proteolítica utilizando TPCK-tripsina (Worthington, Inc. Freehold, N.J.), endoproteinasa Lisina C (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), y proteasa V8 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), respectivamente. En cada caso. la concentración de proteasa se ajustó a aproximadamente 1/20 de la cantidad de sialidasa presente en la muestra.

Después de la digestión, los péptidos resultantes se aislaron mediante HPLC de fase reversa en una columna de silicio Vydac C-18, de 2,1 x 250 mm (The Separations Group, Inc., Hesperia, CA). La elución de la columna y la detección de los péptidos se llevó a cabo como se publicó por Harris y col., Biochemistry, 32:6539 [1993]. Alícuotas de fracciones de diversos péptidos se sometieron al análisis de secuencia N-terminal. Las secuencias aminoacídicas determinadas para los péptidos se muestran en la Figura 9. En algunos casos, la identidad del péptido se confirmó además mediante la determinación del peso molecular del fragmento mediante la utilización del análisis de espectrometría de masas, utilizando un instrumento "electrospray/cuatripolar PE sciex AP III" (Perkin Elmer, Ontario, Canadá) que operaba en el modo positivo.

Preparación de una sonda oligonucleotídica derivada por PCR

Una sonda oligonucleotídica única, que codifica para una porción de la secuencia de sialidasa, se obtuvo como un producto de reacción de PCR, utilizando ADNc de cadena sencilla de células CHO como molde y cebadores olinucleotídicos sintéticos degenerados deducidos a partir de la secuencia aminoacídica de dos de los péptidos derivados proteolíticamente. Se aisló el ARN poli(A+) (5 pg) de aproximadamente 10^{8} células CHO en fase logarítmica, mediante la utilización del equipo de ARNm Fast Track^{TM} (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) y se convirtió a ADNc de cadena sencilla utilizando cebadores hexanucleotídicos aleatorios y transcriptasa inversa murina (Pharmacia, Piscataway, NJ).

Cebadores oligonucleotídicos sintéticos degenerados completamente se prepararon según la secuencia de aminoácidos del péptido derivado de lisina C, LC18. La secuencia de LC18 fue una composición de péptidos trípticos TP14 y TP17, y se la denomina TP14/17. Los cebadores que codifican para el extremo 5' del péptido se prolongaron para contener un sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción XbaI y una secuencia de tetranucleótidos adicional para incrementar el reconocimiento del sitio por la endonucleasa XbaI. De modo similar, los cebadores que codifican para el extremo 3 del péptido se prolongaron para contener un sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción HindIII, y una secuencia de tetranucleótidos adicional para incrementar el reconocimiento de este sitio por la endonucleasa HindIII. El conjunto de cebadores sentido oligonucleotídicos (5'GTCATCTAGAACNGAYGAR
CAYGCNGAY3') (SEC. ID.NO.1) que codifica para los residuos de seis aminoácidos en el extremo 5' de TP14/17, y el conjunto de cebadores antisentido (5'CTAGAAGCTTNGTNACNACYTCYTCNGC YTG3') (SEC. ID.NO.2) que codifica para los siete aminoácidos en el extremo 3' de TP14/17. (En las secuencias de los cebadores oligonucleotídicos identificados anteriormente, "R" representa A o G, "Y" representa C o T, "W" representa A o T, "S" representa C o G, y "N" representa cualquier nucleótido).

Utilizando ADNc de cadena sencilla como molde (6% de la mezcla de reacción de síntesis de ADNc o unos 2 \mug de ADNc), la amplificación por PCR se llevó a cabo utilizando AmpliTaq^{TM} ADN polimerasa (Perkin Elmer Cetus) mediante 35 ciclos de, 1 min a 94ºC, 1 min a 42ºC y 5 min a 72ºC, con una extensión final de 5 min a 72ºC, mediante la utilización de un termociclador de ADN, modelo 489 (Perkin-Elmer-Cetus, Emeryvill, CA). Utilizando los cebadores sentido y antisentido de TP14/17, se obtuvieron varios productos de reacción, incluyendo un fragmento de 113 pares de bases que se esperaba codificara para el péptido TP14/17 completo incluyendo las extensiones de sitios de restricción.

El producto de reacción de PCR de 113 pb, PCR 14/17, se resolvió en un gel de poliacrilamida al 1% y se purificó luego machacando el trozo de poliacrilamida que contenía la banda de PCR 14/17 y mojándolo en tampón Tris durante toda la noche. Después de eliminar los contaminantes del gel mediante filtración en gel, el fragmento de ADN se ligó al plásmido linearizado pUC19 mediante ligación con T4 ADN ligasa (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Las células E. coli C600 se transformaron con la mezcla de ligación y se crecieron en placas de agar con ampicilina (50 \mug/ml). El ADN plasmídico se purificó a partir de varias colonias resistentes a la ampicilina resultantes, y la secuencia de nucleótidos del ADN insertado se determinó en cada una.

Se halló que el ADN insertado en cada uno de los plásmidos codificaba para una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia aminoacídica del péptido LC18. Sin embargo, la secuencia nucleotídica del ADN insertado varió entre los diferentes plásmidos aislados en las posiciones denominadas "bamboleantes" de los codones en los extremos 5' y 3' de los ADNs insertados.

Preparación de la sonda marcada isotópomicamente

Dos oligonucleótidos sintéticos, cada uno de 57 nucleótidos de longitud, se prepararon según la secuencia del producto de PCR que tenía el mayor contenido en timidina en las posiciones bamboleantes en los extremos 5' y 3' del producto de PCR de 113 pb, PCR 14/17. Los dos oligonucleótidos tenían secuencias que solapaban parcialmente, para permitir el anillamiento complementario entre ellos, y juntos comprendían la secuencia nucleotídica que se muestra en la Figura 10. Para preparar una sonda de cadena doble para rastrear una biblioteca, se mezcló 1 \mug de cada uno de los oligonucleótidos y se anillaron juntos a 45ºC, y la sonda se generó radioactiva utilizando una reacción de llenado con Klenow ADN polimerasa (New England Biolabs, Boston, MA) con nucleótidos ^{32}P marcados en posición gamma (5000 Ci/mmol; Amersahm, Airlington Heights, IL). La sonda marcada se separó de los nucleótidos no incorporados mediante filtración en gel utilizando columnas de cromatografía Bio-Spin (Bio-Rad, Richmond, CA). La actividad específica de la sonda de PCR 14/17 resultante se estimó que era de 10^{6} dpm/pmol.

Rastreo de la biblioteca de ADNc de células CHO

Una biblioteca de ADNc en lambda gt 10 de células de ovario de hámster chino (JL 1001a, obtenida de Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) se plaqueó sobre células E. coli C600 crecidas en placas de agar, y se rastrearon las calvas fágicas resultantes mediante la utilización de los procedimientos de hibridación de clavas estándares. Aproximadamente, se rastrearon 450.000 calvas utilizando la sonda PCR 14/17 marcada radioactivamente. Una calva, referida como el clon 15, dio una fuerte señal de hibridación con la sonda, y se eligió para caracterización posterior.

Subclonaje y análisis de secuencia nucleotídica

El ADN del bacteriófago del clon 15 se aisló de los lisados de cultivos de calvas o cultivos líquidos de células E. coli infectadas. El ADN se digirió con la endonucleasa de restricción EcoRI y se analizó por electroforesis en un gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADNc de 1,4 KB se extrajo del fragmento de agarosa mediante la utilización del equipo de aislamiento de ADN Geneclean^{TM} (Biolab, La Jolla, CA), se trató con fosfatasa alcalina bacteriana, y luego se unió al plásmido linearizado pUC 19 mediante ligación con T4 ADN ligasa. Las células E. coli C600 se transformaron con la mezcla de ligación y se crecieron en placas de agar con ampicilina 150 \mug/ml. El ADN del plásmido se purificó a partir de las dos colonias bacterianas resistentes a ampicilina resultantes, y se determinó la secuencia nucleotídica del ADN insertado en cada una. La secuencia nucleotídica se muestra en la Figura 10.

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Ejemplo 10 Expresión de la sialidasa de células CHO en células de insecto. Construcción del vector recombinante y transfección

La expresión del ADNc de sialidasa se llevó a cabo utilizando un sistema modificado de vector de expresión de baculovirus (BaculoGold^{TM}, Pharmigen, Inc. San Diego, CA) y células de ovario de insecto de Spodoptera frugiperda (células Sf9) como huésped. El inserto de ADNc del clon 15 se liberó del plásmido pUC19 recombinante por tratamiento con endonucleasa de restricción BglII y EcoRI. El corte en el único sitio BglII dio como resultado la deleción de los 174 primeros nucleótidos en el extremo 5' del inserto de ADNc, con la retención del codón ATG en la posición 187 (Figura 10). El ADNc truncado se ligó en los múltiples sitios de clonaje del vector de transferencia pVL 1392 (Pharmigen, Inc. San Diego, CA). Las células de E. coli C600 se transformaron con la mezcla de ligación, y las células transformadas se crecieron en cultivos líquidos pequeños. El plásmido recombinante resultante, p1392S, se purificó de los cultivos celulares mediante la utilización de procedimientos estándares. Se obtuvieron aproximadamente 135 \mug de ADN de p1392S.

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2x10^{6} células Sf9 se cotransfectaron con una mezcla de 5 \mug de ADN de p1392S y 0,5 \mug de ADN del virus BaculoGold^{TM}, como se describe por el fabricante. Al cabo de cuatro días de crecimiento, las células Sf9 se recogieron mediante centrifugación, se rompieron mediante adición de 50 \mul de solución de saponina acuosa al 2% (Sigma), y se rastrearon para conocer la presencia de sialidasa de células CHO mediante análisis de inmunoblot.

El virus BaculoGold^{TM} contiene una deleción letal en el gen de la polihedrina que sólo puede ser recuperada mediante recombinación homóloga con el vector de transferencia. Con este sistema, la frecuencia de recombinación después de la cotransfección es casi del 100%. Así, el medio del cultivo celular de las células transfectadas sirve como fuente de virus recombinantes formados de nuevo directamente sin amplificación adicional y purificación por selección de calvas.

Detección mediante análisis de inmunoblot de la sialidasa de células CHO recombinantes en células Sf9 transfectadas

La expresión de sialidasa en células de insecto se determinó mediante análisis de inmunoblot de las proteínas presentes en los homogeneizados de las células Sf9 transfectadas. El antisuero utilizado en estos experimentos se generó contra un péptido sintético cuya secuencia se realizó según la secuencia aminoacídica parcial del péptido TP8 (Fig.9), como se describe por Waner, y col., Glycobiology, 3:455 [1993]. Las muestras de proteínas de las células Sf9 transfectadas se separaron mediante electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, y entonces se transfirieron electroforéticamente a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Immobilon). La membrana se incubó con el antisuero anti-péptido, y la proteína sialidasa inmunoreactiva se detectó utilizando un anticuerpo secundario, de cabra anti-conejo, conjugado a peroxidasa de rábano, y el sustrato 4-cloronaftol. Este ejemplo demuestra la utilidad de la presente invención para la producción de sialidasa en células huésped recombinantes.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Sialidasa de células CHO mediante tecnología del ADN recombinante

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 26

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

A QUIÉN SE HA DE DIRIGIR: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 460, Point San Bruno Blvd.

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(C)

CIUDAD: Southe San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 94080

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(v)

FORMATO DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: 5,25 pulgadas, disco blando de 360 Kb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: patin (Genentech)

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/062586

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 17-Mayo-1993

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Johnston, Sean A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: P35.910

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE ACTA/REFERENCIA:826P1PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELEFONO: 415/225-3562

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415/952-9881

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 910/371-7168

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATCTAGA ACNGAYGARC AYGCNGAY

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAAGCTT NGTNACNACY TCYTCNGCYT G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC N: 4

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 5

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 6

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 7

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 8

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 9

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 10

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 11

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 12

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 13

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 14

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 15

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 16

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC N: 16

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 17

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 18

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 19

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 20

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 21

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 22

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 22

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 23

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC N: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 24

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1366 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 25

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\hskip0.3cm33

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 379 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº: 26

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

Claims (9)

1. Secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una sialidasa obtenible a partir de fluido de cultivo celular de una línea celular de hámster chino, cuya secuencia se obtiene mediante un proceso que comprende:

(a)

preparar una sonda de oligonucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos CRVQAQSPNSGLDF QDN (SEC ID No. 13);

(b)

hibridar la sonda con ácido nucleico en una biblioteca de ADN de mamífero para formar híbridos;

(c)

aislar híbridos, obteniendo de este modo dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una sialidasa.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1.

3. Célula huésped transformada con una secuencia de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1.

4. Proceso que comprende transformar una célula huésped con un vector de expresión según la reivindicación 2, capaz de expresar la sialidasa en la célula huésped transformada con el vector.

5. Proceso según la reivindicación 4 que comprende además las etapas de cultivar la célula huésped transformada y de recuperar la sialidasa del cultivo de células huésped.

6. Polipéptido sustancialmente homogéneo que es una sialidasa y tiene la secuencia de aminoácidos codificada por ácido nucleico según la reivindicación 1 o una variante de la misma por inserción, deleción y/o sustitución de uno o más aminoácidos, cuya variante es una sialidasa y a la que se une un anticuerpo obtenido utilizando un péptido de secuencia de aminoácidos CRVQAQSPNSGLDFQDN (SEC ID No. 13).

7. Sialidasa según la reivindicación 6 que tiene un peso molecular de aproximadamente 43 kDa.

8. Sialidasa según la reivindicación 6 de la que un fragmento tríptico tiene la secuencia de aminoácidos CRVQAQS
PNSGLDFQDN (SEC ID No. 13).

9. Sonda de oligonucleótidos útil en la obtención de un gen que codifica una sialidasa y que tiene una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos CRVQAQSPNSGLDFQDN (SEC ID No. 13).