ES2345954T3 - Deteccion de la union de recombinacion de adn. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de unión en una secuencia polinucleotídica diana, comprendiendo el método, poner en contacto el polinucleótido diana con un primer cebador, un segundo cebador, un polinucleótido bloqueante, una polimerasa, y uno o más nucleótidos trifosfato, en el que: (i) el polinucleótido diana comprende una cadena polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana, (ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente, (iii) el primer cebador hibrida con una primera región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de unión, de manera que (iv) el segundo cebador hibrida con una segunda región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, de manera que cuando una secuencia de inserción integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, según lo cual se determina la presencia o ausencia del polinucleótido de inserción integrado en el sitio de unión en el polinucleótido diana.
Description
Detección de la unión de recombinación de
ADN.
La detección de secuencias de inserción de
nucleótidos integradas es importante en muchos contextos. Por
ejemplo, las secuencias de inserción de nucleótidos pueden
transportar oncogenes en mamíferos, genes de resistencia a
antibióticos en bacterias y genes que expresan rasgos identificables
en plantas. La resistencia a antibióticos bacteriana es un problema
clínico importante a nivel mundial y una preocupación de salud
pública (véanse, por ejemplo, Sheldon, Clin Lab
Sci (2005) 18:170 y French, Adv Drug Deliv Rev (2005)
57:1514). Claramente, un método eficaz, sensible y fiable para
detectar la presencia o ausencia de un nucleótido de inserción
integrado es valioso en el diagnóstico clínico y en otros
contextos.
Otros han desarrollado métodos para detectar
secuencias de inserción de nucleótidos integradas. En una
estrategia, el nucleótido de inserción integrado se detecta usando
PCR en la que un cebador hibrida con la secuencia de ácido nucleico
diana y el otro cebador hibrida con el nucleótido de inserción. La
detección positiva del amplicón indica la presencia de un
polinucleótido de inserción. Este método puede resultar en falsos
negativos, o nucleótidos de inserción no detectados, ya que las
secuencias de los nucleótidos de inserción son a menudo variables.
Los cebadores disponibles pueden o no hibridar con el polinucleótido
de inserción. Véase, por ejemplo, el Ensayo
IDI-MRSA^{TM} de GeneOhm Sciences, San Diego,
CA.
En otra estrategia, el nucleótido de inserción
integrado se detecta usando PCR en la que los dos cebadores
hibridan con el polinucleótido de inserción. De nuevo, la detección
positiva del amplicón indica la presencia de un polinucleótido de
inserción integrado. Este método también tiene la desventaja de que
puede resultar en falsos negativos, debido a la naturaleza
polimórfica de los nucleótidos de inserción integrados. Además, no
está claro si el polinucleótido de inserción está integrado en la
secuencia de ácido nucleico diana cuando hibridan con el
polinucleótido de inserción cebadores directos e inversos.
Véanse, por ejemplo, Kreiswirth, et al., J
Clin Microbiol (2005) 43:4585 y el Kit de Detección LightCycler®
MRSA de Roche Diagnostics, Alameda, CA.
En una estrategia más, la presencia o ausencia
del polinucleótido de inserción integrado se identifica usando PCR
en la que un cebador hibrida con la secuencia de ácido nucleico
diana y el otro cebador hibrida con una secuencia que se extiende a
ambos lados del sitio de integración entre la secuencia de ácido
nucleico diana y el polinucleótido de inserción. Aquí, la detección
negativa (ausencia de amplificación) del amplicón indica la
presencia de un polinucleótido de inserción integrado. Este método
tiene la desventaja de que una señal negativa indica la integración
positiva de un polinucleótido de inserción (véase, Patente de
EEUU No. 6.156.507).
Todavía existe la necesidad de métodos eficaces,
sensibles para detectar polinucleótidos de inserción integrados que
proporcionen una señal positiva indicativa de la integración del
polinucleótido de inserción.
La presente invención proporciona composiciones
(p. ej., disoluciones, mezclas de reacción), métodos y kits
para detectar la presencia o ausencia de un polinucleótido de
inserción en un ácido nucleico. Las composiciones, métodos y kits
encuentran un uso en la detección, por ejemplo, de polinucleótidos
de inserción integrados que confieren resistencia en bacterias a
antibióticos.
Respecto a los métodos, la invención proporciona
métodos para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido
de inserción integrado en un sitio de unión en una secuencia de
polinucleótido diana. En algunas realizaciones, los métodos
comprenden poner en contacto el polinucleótido diana con un primer
cebador, un segundo cebador, un polinucleótido bloqueante, una
polimerasa, y uno o más nucleótidos trifosfato, en el que:
(i) el polinucleótido diana comprende una cadena
polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un
polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un
lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda
secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,
(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la
primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el
polinucleótido de inserción integrado está ausente,
(iii) el primer cebador hibrida con una primera
región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de
unión, de manera que
(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda
región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de
unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de
una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana,
de manera que cuando una secuencia de inserción
integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo
cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una
secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el
polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda
secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación
de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana,
según lo cual se determina la presencia o ausencia del
polinucleótido de inserción integrado en el sitio de unión en el
polinucleótido diana.
Respecto a las composiciones, la invención
proporciona composiciones, incluyendo mezclas de reacción y
disoluciones para determinar la presencia o ausencia de un
polinucleótido de inserción integrado en un sitio de unión de una
primera secuencia diana y una segunda secuencia diana en un
polinucleótido diana. En algunas realizaciones, las composiciones
comprenden el polinucleótido diana, un primer cebador, un segundo
cebador y un polinucleótido bloqueante, en el que:
(i) el polinucleótido diana comprende una cadena
polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un
polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un
lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda
secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,
(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la
primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el
polinucleótido de inserción integrado está ausente,
(iii) el primer cebador hibrida con una primera
región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de
unión, de manera que
(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda
región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de
unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de
una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana,
de manera que cuando una secuencia de inserción
integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo
cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una
secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el
polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda
secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación
de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana.
Respecto a los kits, la invención proporciona
kits para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido
de inserción integrado en un sitio de unión de una primera secuencia
diana y una segunda secuencia diana en un polinucleótido diana. En
algunas realizaciones, los kits comprenden un primer cebador, un
segundo cebador y un polinucleótido bloqueante, en el que:
(i) el polinucleótido diana comprende una cadena
polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un
polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un
lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda
secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,
(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la
primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el
polinucleótido de inserción integrado está ausente,
(iii) el primer cebador hibrida con una primera
región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de
unión, de manera que
(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda
región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de
unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de
una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana,
de manera que cuando una secuencia de inserción
integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo
cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una
secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el
polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda
secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación
de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana.
Respecto a realizaciones adicionales de los
métodos, composiciones y kits, en algunas realizaciones, la longitud
completa del primer cebador hibrida con la primera secuencia diana
de manera competitiva con el bloqueante. En algunas realizaciones,
una parte del primer cebador hibrida con la primera secuencia diana
de manera competitiva con el bloqueante.
En algunas realizaciones, la primera región de
la primera secuencia diana está fuera de la región de las
repeticiones invertidas que pueden existir cerca de un sitio de
unión o integración. En algunas realizaciones, la primera región de
la primera secuencia diana está al menos a 20, 30, 40 o más bases
nucleotídicas del sitio de unión.
En algunas realizaciones, el primer cebador y el
polinucleótido bloqueante son sustancialmente complementarios a la
primera región en el polinucleótido diana y el primer cebador tiene
menos nucleótidos emparejados erróneamente que el polinucleótido
bloqueante respecto a la primera región en el polinucleótido diana.
En algunas realizaciones, el primer cebador es completamente
complementario a la primera región en el polinucleótido diana y el
polinucleótido bloqueante contiene al menos un emparejamiento
erróneo interno comparado con la primera región del polinucleótido
diana.
En algunas realizaciones, la primera secuencia
diana y la segunda secuencia diana son partes de orfX de
Staphylococcus aureus, el sitio de unión es un sitio de
integración attB, el polinucleótido de inserción es al menos
una parte de un complejo SCCmec, y el polinucleótido diana es
ADN de Staphylococcus aureus.
En algunas realizaciones, el bloqueante no es
extensible. En algunas realizaciones, el polinucleótido bloqueante
comprende un resto en su extremo 3' seleccionado del grupo que
consiste en fosfato y hexilamina. En algunas realizaciones, el
polinucleótido bloqueante comprende al menos una base análoga de
ácido nucleico.
En alguna realización, los nucleótidos
trifosfato son nucleótidos dNTP.
En algunas realizaciones, la polimerasa es una
ADN polimerasa, por ejemplo, una Taq polimerasa.
Los métodos, composiciones y kits pueden
diseñarse para la evaluación simultánea de múltiples polinucleótidos
diana para la presencia o ausencia de un polinucleótido de
inserción integrado. En algunas realizaciones, los métodos se
realizan en un formato múltiple.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden
además la etapa de exponer la mezcla de reacción o polinucleótido
diana a condiciones de amplificación. En algunas realizaciones, la
amplificación es por PCR. En algunas realizaciones, los métodos se
realizan por PCR múltiple. En algunas realizaciones, la
amplificación se detecta por PCR en tiempo real.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de
inserción tiene una longitud de al menos 10 bases nucleotídicas. En
algunas realizaciones, el polinucleótido de inserción está integrado
en el sitio de unión. En algunas realizaciones, el polinucleótido
de inserción no está integrado en el sitio de unión.
En algunas realizaciones, los kits comprenden
además un polinucleótido diana control que comprende la primera
secuencia diana y la segunda secuencia diana.
Un "polinucleótido de inserción" o
"secuencia de inserción" se refiere indistintamente a un
polinucleótido que no está localizado en su forma nativa en un
sitio de inserción particular, pero que puede insertarse en y
convertirse en una secuencia contigua en la secuencia del
polinucleótido diana. El polinucleótido de inserción puede tener su
origen en otro lugar en la misma secuencia (p. ej.,
transposones) o proceder del genoma de otro organismo (p.
ej., virus). Un polinucleótido de inserción integrado puede
transmitirse de un organismo a su progenie. Los ejemplos no
limitantes de polinucleótidos de inserción incluyen transposones,
elementos genéticos móviles y vectores retrovirales. La integración
del polinucleótido de inserción puede resultar, aunque no se
necesita, en un fenotipo detectable. Por ejemplo, un polinucleótido
de inserción también puede incluir una secuencia de ácido nucleico
que confiere resistencia a antibióticos en bacterias. Un
polinucleótido de inserción también puede crearse por un evento de
translocación de ADN (p. ej., un marcador tumoral
translocacional, incluyendo las variantes de corte y empalme de ARN
de c-erb-B2; fusión bcr/abl;
y translocaciones que afectan a Bcl-2 o
Bcl-10) o puede ser cualquier otra unión marcadora
creada por un evento de recombinación de ADN. Véanse las
Figuras 1 y 2.
"Unión" o "sitio de unión" se refiere
indistintamente a un sitio en el que la primera secuencia diana
linda con la segunda secuencia diana en una secuencia
polinucleotídica diana. Una unión también se refiere como un sitio
de integración. Una secuencia de inserción se inserta en la
secuencia polinucleotídica diana en el sitio de unión o
integración. Véanse las Figuras 1 y 2.
"Que abarca la unión" se refiere a la
capacidad de un polinucleótido para hibridar con dos polinucleótidos
que forman una unión hibridando con el extremo 5' de un
polinucleótido y el extremo 3' del otro polinucleótido. Los
polinucleótidos que abarcan la unión de dos secuencias hibridan con
el extremo 3' de la primera secuencia y el extremo 5' de la segunda
secuencia, en el que el nucleótido 3' de la primera secuencia y el
nucleótido 5' de la segunda secuencia son inmediatamente adyacentes
entre sí.
Los términos "próximo" o "adyacente"
se refieren indistintamente al posicionamiento de una región en la
secuencia polinucleotídica diana sustancialmente complementaria a y
que puede hibridar con el primer cebador respecto al sitio de unión
en la secuencia polinucleotídica diana. La región que puede hibridar
con el primer cebador y el sitio de unión pueden estar separados
por 1 a aproximadamente 20 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente
1 a 10 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región que puede
hibridar con el primer cebador y el sitio de unión lindan
directamente una con otra.
Las "condiciones de amplificación" o
"condiciones de extensión" se refieren indistintamente a
condiciones bajo las cuales una polimerasa puede añadir nucleótidos
al extremo 3' de un polinucleótido. Dichas condiciones de
amplificación o extensión son muy conocidas en la técnica, y se
describen, por ejemplo, en Sambrook y Russell, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edición, 2001, Cold Spring
Harbor Laboratory Press y Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, 1987-2007, John
Wiley & Sons.
"Sustancialmente complementaria", tal y
como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia que
tiene no más de 20% (p. ej., no más de 15, 10 ó 5%) de los
nucleótidos en la secuencia en cuestión con emparejamiento erróneo
con una secuencia diana. En algunas realizaciones, los dos
polinucleótidos tienen 1, 2, 3, 4, 5, o más emparejamientos
erróneos de nucleótidos.
Un "nucleótido con emparejamiento erróneo"
se refiere a un nucleótido en una secuencia de interés que no es el
complemento del nucleótido correspondiente en una secuencia
correspondiente cuando una secuencia de interés y la secuencia
diana se hibridan en una reacción de amplificación. El complemento
de C es G y el complemento de A es T. Los expertos en la técnica
apreciarán que se conocen varios nucleótidos sintéticos que tienen
propiedades de unión de Watson-Crick y se pretende
que los nucleótidos sintéticos complementarios estén englobados en
esta definición.
Un "polinucleótido bloqueante" se refiere a
un polinucleótido que hibrida con una secuencia polinucleotídica
diana que abarca un sitio de integración (es decir, unión) para un
polinucleótido de inserción. En ausencia de un polinucleótido de
inserción integrado, un polinucleótido bloqueante hibrida tanto con
la primera secuencia diana como con la segunda secuencia diana de
la secuencia polinucleotídica diana. En algunas realizaciones, el
polinucleótido bloqueante no es extensible por la polimerasa.
Tal y como se usa en la presente memoria, los
términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" no están
limitados por la longitud y son genéricos para polímeros lineales
de polidesoxirribonucleótidos (que contienen
2-desoxi-D-ribosa),
polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa) y
cualquier otro N-glicósido de una base purínica o
pirimidínica o bases purínicas o pirimidínicas modificadas. Estos
términos incluyen ADN bicatenario y monocatenario, así como ARN
bicatenario y monocatenario.
Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido
puede comprender uniones fosfodiéster o uniones modificadas
incluyendo, pero sin limitarse a, uniones fosfotriéster,
fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato,
carbamato, tioéter, fosforamidato con puente, fosfonato de metileno
con puente, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato,
fosforotioato con puente o sulfona, y combinaciones de dichas
uniones.
Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido
puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente
(adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas
de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir
para distintos propósitos, p. ej., para estabilizar o desestabilizar
la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la
sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de
apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención
puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar,
derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a,
N^{6}-metil-adenina,
N^{6}-terc-butil-bencil-adenina,
imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo,
5-bromouracilo, 5-clorouracilo,
5-yodouracilo, hipoxantina, xantina,
4-acetilcitosina,
5-(carboxihidroximetil)uracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouridina,
5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,
beta-D-galactosilqueosina, inosina,
N6-isopenteniladenina,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina, N6-metiladenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
beta-D-manosilqueosina,
5'-metoxicarboximetiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacético
(\gamma), wybutoxosina, pesudouracilo, queosina,
2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 2-tiouracilo,
4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es
decir, timina), éster metílico del ácido
uracil-5-oxiacético,
3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo,
(acp3)w, 2,6-diaminopurina, y
5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de
bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse
en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.611; 5.955.589; 5.844.106;
5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785.
Además, una secuencia de ácido nucleico o
polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcar
modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa,
2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.
"Temperatura de fusión de la hibridación" o
"Tm" se refiere a la temperatura bajo condiciones especificadas
a la que un dúplex de polinucleótido está en un 50% en forma de
cadena única y 50% en forma de cadena doble. La temperatura de
fusión de la hibridación se calcula usando el modelo del vecino más
próximo de dos estados, que se puede aplicar a dúplex de ADN
cortos,
Tm(ºC)=(\DeltaH^{0}/(\DeltaS^{0}
+ Rln[oligo])) -
273,15
en el que \DeltaH^{0}
(entalpía) y\DeltaS^{0} (entropía) son los parámetros de fusión
calculados a partir de la secuencia y el parámetro termodinámico
del vecino más próximo publicado, R es la constante de gas ideal
(1,987 cal K^{-1} mol^{-1}), [oligo] es la concentración molar
de un polinucleótido, y la constante -273,15 convierte la
temperatura de grados Kelvina Celsius. Los parámetros del vecino más
próximo para los pares de bases ADN/ADN se obtienen de Allawi,
et al., Biochemistry (1997) 36:10581; Allawi, et
al., Biochemistry (1998) 37:2170; Allawi, et al.,
Biochemistry (1998) 37:9435; y Peyret, et al.,
Biochemistry (1999) 38:3468. La Tm depende de la
concentración de sal monovalente ([Na^{+}]) del disolvente. La
concentración por defecto de [Na^{+}] es 50 mM. Hay programas
informáticos fácilmente disponibles para calcular la Tm, por
ejemplo, de Integrated DNA Technologies, Coralville,
IA.
Figura 1. Un esquema que muestra la relación
entre la primera secuencia diana, la segunda secuencia diana, la
unión y el polinucleótido de inserción. La primera y segunda
secuencias diana pueden ser de una secuencia no codificadora, el
mismo o diferentes marcos de lectura o secuencia génica.
Figura 2. Un esquema que muestra la relación
entre los sitios de hibridación del primer cebador, segundo cebador,
polinucleótido bloqueante, unión y polinucleótido de inserción
cuando una secuencia de inserción está ausente y cuando está
presente. El polinucleótido bloqueante puede contener uno o más
emparejamientos erróneos internos con la secuencia diana.
Figura 3. Los resultados de un experimento que
demuestran el efecto de dos polinucleótidos bloqueantes diferentes
en la detección de Staphylococcus aureus resistentes a
meticilina (MRSA) y Staphylococcus aureus sensibles a
meticilina (MSSA) usando el ensayo de 5'-nucleasa.
La fluorescencia de FAM de punto final se indica en unidades
relativas de fluorescencia (RFU).
Figura 4. Los resultados de un experimento que
demuestran el efecto de la presencia o ausencia de un polinucleótido
bloqueante en la detección de MRSA y MSSA. La fluorescencia de FAM
de punto final se indica en unidades relativas de fluorescencia
(RFU).
Figura 5. El efecto del Bloqueante GCG49 en 80
aislados clínicos diferentes de MSSA. Los datos se representan como
el cambio en el ciclo umbral (\DeltaCt; Ct_{con \ bloqueante} -
Ct_{con \ bloqueante}), para la cepa MSSA bloqueada, frente al
ciclo Umbral (C_{t}) de las cepas MSSA no bloqueadas.
La presente invención proporciona métodos,
composiciones y kits para determinar la presencia o ausencia de un
polinucleótido de inserción integrado. La invención permite la
amplificación de una secuencia de ácido nucleico adyacente a un
polinucleótido de inserción integrado proporcionando por lo tanto
una señal de detección positiva cuando el polinucleótido de
inserción integrado está presente y una señal de detección negativa
cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente.
Los métodos están dirigidos a determinar la
presencia de un polinucleótido de inserción integrado en una
secuencia polinucleotídica diana amplificando una secuencia
polinucleotídica adyacente al sitio de integración (es decir,
unión). Una señal de amplificación positiva de los cebadores que
indica la presencia de un polinucleótido de inserción integrado se
logra empleando un polinucleótido bloqueante que hibrida con una
secuencia polinucleotídica diana que abarca la unión en ausencia de
un polinucleótido de inserción integrado. Véase la Figura 2.
Preferiblemente, el bloqueante no puede ser extendido por una
polimerasa.
El polinucleótido bloqueante compite por la
hibridación con la secuencia polinucleotídica diana con el primer
cebador (es decir, "el cebador competidor", ya sea directo o
inverso) usado para amplificar la secuencia polinucleotídica
adyacente al sitio de integración. En ausencia de un polinucleótido
de inserción integrado, el polinucleótido bloqueante tiene una
temperatura de fusión de hibridación que es relativamente mayor que
la temperatura de fusión de hibridación del primer cebador (es
decir, competidor). Por lo tanto, en ausencia de un polinucleótido
de inserción integrado, el polinucleótido bloqueante hibrida con la
secuencia polinucleotídica diana y no se amplifica ninguna
secuencia polinucleotídica, lo que indica la ausencia de un
polinucleótido de inserción integrado. En presencia de un
polinucleótido de inserción integrado, el polinucleótido bloqueante
tiene una temperatura de fusión de hibridación que es relativamente
menor que la temperatura de fusión de hibridación del primer
cebador (es decir, competidor). Por lo tanto, en presencia de un
polinucleótido de inserción integrado, el primer cebador (es decir,
competidor) hibrida con la secuencia polinucleotídica diana y se
amplifica un amplicón a partir del primer cebador (es decir,
competidor) y el segundo cebador (es decir, no competidor), lo que
indica la presencia de un polinucleótido de inserción integrado.
Véase la Figura 2.
En algunas realizaciones, el primer cebador y el
polinucleótido bloqueante compiten por la hibridación con una
subsecuencia en la secuencia polinucleotídica diana que está en el
mismo lado de la unión que el sitio de hibridación del segundo
cebador. Refiriéndonos a la Figura 1, en esta realización, el primer
cebador y el polinucleótido bloqueante compiten por la hibridación
con una secuencia en la primera secuencia diana. El segundo cebador
también hibrida con la primera secuencia diana. En presencia de un
polinucleótido de inserción integrado, el amplicón no incluye la
secuencia del polinucleótido de inserción integrado.
En algunas realizaciones, el primer cebador y el
polinucleótido bloqueante compiten por la hibridación con una
subsecuencia en la secuencia polinucleotídica diana que está en el
lado opuesto de la unión del sitio de hibridación del segundo
cebador. Refiriéndonos a la Figura 1, en esta realización, el primer
cebador y el polinucleótido bloqueante compiten por la hibridación
con una secuencia en la segunda secuencia diana mientras que el
segundo cebador hibrida con la primera secuencia diana. En presencia
de un polinucleótido de inserción integrado, el amplicón incluye la
secuencia del polinucleótido de inserción integrado. En esta
realización, la secuencia polinucleotídica de inserción tiene una
longitud que puede amplificarse de manera factible, por
ejemplo, menos de aproximadamente 2 kb.
Opcionalmente, la Tm relativa de hibridación del
polinucleótido bloqueante y el primer cebador puede revertirse de
manera que la amplificación ocurra cuando el polinucleótido de
inserción integrado está ausente. En este caso, el primer cebador y
el polinucleótido bloqueante hibridan con una secuencia común en la
primera secuencia diana próxima a la unión, en la que el bloqueante
tiene una Tm mayor para hibridar con la secuencia común que el
primer cebador cuando el polinucleótido de inserción está integrado
en la unión y el polinucleótido bloqueante tiene una Tm menor para
hibridar con la secuencia común que el primer cebador cuando el
polinucleótido de inserción integrado no está presente en la unión,
permitiendo de esta manera la amplificación cuando la inserción
integrada está ausente.
Los métodos encuentran su uso en la
determinación de la presencia o ausencia en una secuencia
polinucleotídica diana de un polinucleótido de inserción integrado,
incluyendo sin limitación un elemento genético móvil, un
transposón, una secuencia de fusión translocacional (p. ej.,
un oncogén, una secuencia de fusión de marcador tumoral, un sitio
de inserción de transgén, incluyendo un sitio CRE/LOX), o una
secuencia genómica retroviral.
La secuencia polinucleotídica diana comprende
una unión de una primera secuencia diana y una segunda secuencia
diana, y opcionalmente un polinucleótido de inserción (véase
la Figura 1). En algunas realizaciones, el polinucleótido de
inserción es del mismo genoma que la secuencia polinucleotídica
diana (p. ej., un transposón, una secuencia de fusión
translocacional). En algunas realizaciones, los métodos se usan para
determinar la presencia o ausencia de una secuencia de fusión por
translocación de un marcador tumoral, por ejemplo las variantes de
corte y empalme del ARN de c-erb-B2;
fusión bcr/abl; y translocaciones que afectan a
Bcl-2 o Bcl-10.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de
inserción es de un genoma diferente que la secuencia
polinucleotídica diana (p. ej., un elemento genético móvil,
una secuencia genómica retroviral). El genoma diferente puede ser
del mismo organismo o de un organismo diferente. En algunas
realizaciones, los métodos se usan para determinar la presencia o
ausencia de un elemento genético móvil integrado en un genoma
anfitrión bacteriano que proporciona resistencia a antibiótico.
En algunas realizaciones, los métodos pueden
llevarse a cabo para identificar la presencia o ausencia de un
polinucleótido de inserción integrado en un genoma anfitrión diana.
El genoma anfitrión puede ser de cualquier fuente. El ADN genómico
puede ser procariota o eucariota. Puede ser de bacterias, hongos,
plantas o animales. El ADN genómico anfitrión puede ser de un
patógeno de un anfitrión que sea una planta o animal, por ejemplo,
viral, bacteriano, fúngico o parasítico. El ADN genómico puede ser,
por ejemplo, de géneros bacterianos patogénicos para un anfitrión
animal y capaz de desarrollar resistencia a agentes antimicrobianos,
incluyendo Staphylococcus, Streptococcus,
Escherichia coli, Mycobacterium, Bacillus,
Enterococcus, Enterobacter, Haemophilus,
Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter,
Listeria, Helicobacter, Salmonella,
Neisseria, Legionella, etc. En algunas realizaciones,
el ADN genómico anfitrión es de una especie de
Staphylococcus, por ejemplo, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus
saprophyticus, Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri,
Staphylococcus vitulinus, Staphylococcus succinus,
Staphylococcus simulans, Staphylococcus sciuri,
etc.
El ADN genómico anfitrión puede ser de un
anfitrión animal. El animal puede ser un ser humano o no humano, y
puede ser un mamífero, incluyendo animales domésticos y animales
agrícolas. Los animales domésticos incluyen canino, felino, roedor,
lagomorpha, hámster, chinchilla, rattus, murino. Los animales
agrícolas incluyen equino, bovino, ovino, porcino y pollos. El ADN
genómico puede ensayarse de células o tejidos, según sea
apropiado.
El ADN genómico anfitrión puede purificarse y/o
aislarse según técnicas muy conocidas en la técnica, por ejemplo,
las descritas en Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 3a Edición, 2001, Cold Spring Harbor
Laboratory Press y Ausubel et al, Current Protocols in
Molecular Biology, 1987-2007, John Wiley &
Sons.
El polinucleótido de inserción puede ser
cualquier secuencia de ácido nucleico que pueda insertarse entre
dos secuencias polinucleotídicas unidas. El polinucleótido de
inserción puede contener, aunque no es indispensable, un rasgo
fenotípico identificable en el anfitrión cuando se integra en la
secuencia polinucleotídica diana. Por ejemplo, como se ha descrito
anteriormente, el polinucleótido de inserción puede ser una
secuencia genómica retroviral, un transposón, una secuencia de
fusión translocacional o un elemento genético móvil.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de
inserción es un elemento genético móvil que confiere resistencia a
agentes antimicrobianos. Los elementos genéticos móviles pueden
transmitir resistencia a antibióticos a bacterias que los tienen
integrados en su ADN genómico incluyendo los que codifican
secuencias que neutralizan el mecanismo antibacteriano de los
antibióticos beta-lactama y aminoglicósido.
Por ejemplo, un elemento genético móvil que
codifica una proteína de unión a penicilina puede conferir
resistencia bacteriana a los antibióticos beta lactama. Los
antibióticos beta lactama ejemplificados incluyen meticilina,
penicilinas (p. ej., penicilina G, penicilina V),
amoxicilina, ampicilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina,
nafcilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina, azlocilina,
piperacilina, y semejantes. Los antibióticos beta lactama se
describen, por ejemplo, en el Capítulo 45 de Goodman and Gilman's
Pharmacological Basis of Therapeutics, eds., Hardman y Limbird,
2001, McGraw-Hill. Un ejemplo de un elemento
genético móvil que contiene resistencia a los antibióticos beta
lactama es el complejo mecA, que codifica una proteína de
unión a penicilina y confiere resistencia a meticilina, penicilinas
y otros antibióticos beta lactama en bacterias cuando se integra en
el genoma bacteriano anfitrión. Los números de registro de GenBank
ejemplificados para las secuencias polipeptídicas de proteínas de
unión a penicilina incluyen YP_252006; CAH17594, AAY60807; BAB07108;
CAC95693; AAK39559; NP_716793; y AAU27457. Los números de registro
de GenBank ejemplificados para secuencias nucleotídicas que
codifican polipéptidos de proteínas de unión a a penicilina incluyen
NC_007168 (GeneID 3482097); AY894415; AP006716; AM048803; Y13096;
EFY17797; EFA290435; y AE17323. Las proteínas de unión a penicilina
pueden caracterizarse por varios restos estructurales proteicos
comunes, incluyendo MecA_N (pfam05223), PBP_dímero (pfam03717) y
Transpeptidasa (pfam00905).
Un elemento genético móvil que codifica una
aminoglicósido fosfotransferasa o una aminoglicósido
acetiltransferasa puede conferir resistencia bacteriana a
antibióticos aminoglicósido. Los antibióticos aminoglicósido
ejemplificados incluyen gentamicina, tobramicina, amikacina,
netilmicina, kanamicina, estreptomicina y neomicina. Los
antibióticos aminoglicósido se describen, por ejemplo, en el
Capítulo 46 de Goodman and Gilman's, supra. Los
números de registro de GenBank ejemplificados para las secuencias
polipeptídicas aminoglicósido fosfo o acetiltransferasa incluyen
YP_253526; NP_115315; CAD60196; AAC53691; AAX82584; AAK63041;
AAT61777; AAG13458; AAK63040; y CAH19071. Los números de registro
de GenBank ejemplificados para las secuencias nucleotídicas que
codifican polipéptidos aminoglicósido fosfo o acetiltransferasa
incluyen NC_007168 (GeneID 3482424). Las aminoglicósido fosfo o
acetiltransferasas pueden caracterizarse por restos estructurales
proteicos comunes, incluyendo APH (familia de enzimas
fosfotransferasa, pfam01636) y Acetiltransf_1 (familia
acetiltransferasa (GNAT), pfam00583).
Un polinucleótido de inserción tiene una
longitud de al menos 10 bases nucleotídicas, por ejemplo, una
longitud de aproximadamente 10, 20, 50, 100, 500, 1.000, 1.500,
2.000 bases nucleotídicas, o más.
Una secuencia polinucleotídica diana que puede
integrar un polinucleótido de inserción tendrá uno o más sitios de
integración. El sitio de integración puede determinarse por la
secuencia polinucleotídica diana o por la naturaleza del
polinucleótido de inserción. Los métodos son generalmente apropiados
para detectar secuencias de integración integradas en sitios de
reconocimiento de recombinasas específicas de sitio (p. ej.,
integrasa Cre, Flip o PhiC31), incluyendo sin limitación loxP
(p. ej., loxP2, loxP3, loxP23, loxP511, loxB, loxC2, loxL,
loxR), frt, dif, flp y secuencias de integración diana att. Éstas
son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo,
Sorrell y Kolb, Biotechnol. Adv. (2005); véase
también, Fluit y Schmitz, Clin Microbiol Infect (2004)
10:272).
En Staphylococcus, un sitio para la
integración (es decir, sitio de unión) del complejo SCCmec
que porta el gen mecA es el sitio attB en el marco de
lectura abierto orfX. Las secuencias de marco de lectura
abierto orfX de Staphylococcus ejemplificadas incluyen
los números de registro de GenBank NC_007168 (GeneID 3482010);
NC_002758 (GeneID 1119986) y NC_007350 (GeneID 3615252).
Los cebadores de la invención son capaces de
actuar como un punto de inicio de la síntesis de ADN en condiciones
que permiten la amplificación, en la que se induce la síntesis de un
producto de extensión del cebador complementario a una cadena de
ácido nucleico, es decir, en presencia de cuatro diferentes
nucleósidos trifosfato y un agente para la extensión (p. ej., una
ADN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a
una temperatura adecuada (véanse, por ejemplo,
Molecular Diagnostic PCR Handbook, Viljoen, et al.,
eds., 2005 Kluwer Academic Pub.; PCR Protocols, Bartlett
et al., eds., 2003, Humana Press; y PCR Primer: A
Laboratory Manual, Dieffenbach, et al., eds., 2003, Cold
Spring Harbor Laboratory Press). Un cebador es preferiblemente un
ADN monocatenario. La longitud apropiada de un cebador depende, por
ejemplo, de la temperatura de fusión de hibridación (Tm) pretendida
y la localización del cebador pero típicamente varía de 10 a 50
nucleótidos, preferiblemente de 15-35 ó
18-22 nucleótidos. Las moléculas de cebador cortas
requieren generalmente temperaturas más bajas para formar complejos
híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no
necesita reflejar la secuencia exacta del ácido nucleico molde,
pero debe ser lo suficientemente complementario para hibridar con
el molde. En algunas realizaciones, los cebadores de la invención
pueden no tener emparejamientos erróneos, el mismo número de
emparejamientos erróneos (p. ej., 0, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) o
menos emparejamientos erróneos en comparación con el polinucleótido
bloqueante. Los cebadores de la invención también pueden carecer de
emparejamientos erróneos para la hibridación. El diseño de
cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia diana
dada es muy conocido en la técnica y se describe, por ejemplo, en la
bibliografía citada en la presente memoria.
Los primeros cebadores (directo o inverso) de la
invención compiten con el polinucleótido bloqueante para hibridar
con una secuencia común en la secuencia polinucleotídica diana
(p. ej., desplazamiento competitivo basado en la Tm
relativa). Los primeros cebadores se diseñan para tener una
temperatura de fusión de hibridación relativamente menor en
comparación con la temperatura de fusión de hibridación del
polinucleótido bloqueante cuando no está presente ningún nucleótido
de inserción. Los primeros cebadores se diseñan además para tener
una temperatura de fusión de hibridación relativamente mayor en
comparación con la temperatura de fusión de hibridación del
polinucleótido bloqueante cuando está presente un polinucleótido de
inserción.
En algunas realizaciones, la temperatura de
fusión de hibridación del primer cebador (es decir, competidor)
será entre aproximadamente 5ºC-15ºC mayor o menor en
comparación con el polinucleótido bloqueante, según sea apropiado.
En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de hibridación
del primer cebador es aproximadamente 5ºC, 6ºC, 7ºC, 8ºC, 9ºC,
10ºC, 11ºC, 12ºC, 13ºC, 14ºC ó 15ºC mayor o menor en comparación
con el polinucleótido bloqueante, según sea apropiado. En algunas
realizaciones, la diferencia en la temperatura de fusión de
hibridación puede ser más o menos que este intervalo
ejemplificado.
El primer y segundo cebadores de la invención
pueden tener una temperatura de fusión de hibridación que varía de
aproximadamente 50ºC a aproximadamente 65ºC, entre aproximadamente
55ºC a aproximadamente 60ºC, por ejemplo. En algunas realizaciones,
la temperatura de fusión de hibridación de un cebador es
aproximadamente 50ºC, 51ºC, 52ºC, 53ºC, 54ºC, 55ºC, 56ºC, 57ºC,
58ºC, 59ºC, 60ºC, 61ºC, 62ºC, 63ºC, 64ºC ó 65ºC. Si embargo, la
temperatura de fusión de hibridación del primer y segundo cebadores
puede ser mayor o menor que este intervalo de temperatura.
Los métodos para diseñar un polinucleótido para
que tenga una temperatura de fusión de hibridación deseada se
aplican tanto a los cebadores como a los bloqueantes, y son
conocidos en la técnica. La temperatura de fusión de hibridación
puede ajustarse, por ejemplo, por el número de nucleósidos guanosina
(G) o citidina, ajustando la longitud del polinucleótido, o
incorporando una o más bases que tienen emparejamiento erróneo con
la secuencia polinucleotídica diana. Generalmente, los
polinucleótidos con un mayor número de nucleósidos G o C, de mayor
longitud, o con un mayor número de nucleósidos con emparejamiento
correcto tendrán temperaturas de fusión de hibridación mayores. En
algunas realizaciones, las diferencias en la temperatura de fusión
de hibridación entre el primer cebador y el bloqueante se ajustan
por la introducción de un mayor número de bases con emparejamiento
erróneo con el polinucleótido diana en la secuencia bloqueante en
comparación con la secuencia del primer cebador. Por ejemplo, en
algunas realizaciones, el primer cebador no tiene bases con
emparejamiento erróneo con la secuencia polinucleotídica diana y el
bloqueante tiene una o más bases con emparejamiento erróneo con la
secuencia polinucleotídica diana.
En algunas realizaciones, el polinucleótido
bloqueante y el primer cebador hibridan con una secuencia común en
la primera secuencia diana próxima o adyacente a la unión que
incluye la longitud completa del primer cebador. En algunas
realizaciones, el polinucleótido bloqueante y el primer cebador
hibridan con una secuencia común adyacente a la unión que es
complementaria a una parte del primer cebador, por ejemplo 50%, 60%,
70%, 80% ó 90% del extremo 5' o el extremo 3' del primer cebador.
La secuencia común con la que hibridan de manera competitiva el
polinucleótido bloqueante y el primer cebador puede tener una
longitud de 10-30 bases, por ejemplo, una longitud
de 12-25 ó 15-20 bases, por ejemplo,
una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 bases, o ser más larga o más
corta.
Los primeros cebadores se diseñan para hibridar
con una secuencia de ácido nucleico en la secuencia polinucleotídica
diana que está próxima o adyacente al sitio de integración para el
polinucleótido de inserción. En las realizaciones en las que el
primer cebador y el polinucleótido bloqueante compiten para hibridar
con una secuencia común en la primera secuencia diana, el extremo
5' del primer cebador puede hibridar, p. ej., en
aproximadamente 30, 25 ó 20 posiciones de bases nucleotídicas del
sitio de integración, por ejemplo, en aproximadamente 15, 10 ó 5
posiciones de bases nucleotídicas del sitio de integración, o
algunas veces colindante con el sitio de integración. En las
realizaciones en las que el primer cebador y el polinucleótido
bloqueante compiten para hibridar con una secuencia común en la
segunda secuencia diana, el extremo 5' del primer cebador puede
hibridar, p. ej., en aproximadamente 40, 35 ó 30 posiciones
de bases nucleotídicas del sitio de integración, por ejemplo, en
aproximadamente 25, 20 ó 15 posiciones de bases nucleotídicas del
sitio de integración. El segundo cebador hibrida con una secuencia
de ácido nucleico en la secuencia polinucleotídica diana de manera
que el amplicón amplificado desde el primer y segundo cebadores
puede detectarse de manera fiable. En algunas realizaciones, el
amplicón tendrá una longitud de aproximadamente 100, 200, 300, 400,
500, 600, 800, 1.000, 1.500, 2.000 bases de ácido nucleico, o
cualquier número entero de bases de ácido nucleico con una longitud
de aproximadamente 100-2.000, pero puede ser más
corto o más largo, según sea apropiado.
En algunas realizaciones, el primer y segundo
cebadores hibridan con una secuencia génica orfX en una
secuencia polinucleotídica diana de Staphylococcus. En
algunas realizaciones, el primer cebador es un cebador inverso que
comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en
5'-CTTATGATACGCTTCTCCTCGC-3'
(SEQ ID NO:2)
5'-GCTTCTCCACGCATAATCTTAAATGCTCT-3'
(SEQ ID NO:9); y
5'-TACTTATGATACGCTTCTCC-3'
(SEQ ID NO:10). En algunas realizaciones, el segundo
cebador es un cedabor directo que comprende la secuencia
5'-AGGGCAAAGCGACTTTGTATTC-3'
(SEQ ID NO:1).
Los cebadores pueden incorporar características
adicionales que permitan la detección o inmovilización del cebador
pero que no alteren la propiedad básica del cebador, es decir, la de
actuar como un punto de inicio de la síntesis de ADN. Por ejemplo,
los cebadores pueden contener una secuencia de ácido nucleico
adicional en el extremo 5' que no hibrida con el polinucleótido
diana, pero que facilita la clonación del producto amplificado. La
región del cebador que es suficientemente complementaria con el
molde para hibridar se refiere en la presente memoria como la
región de hibridación. En algunas realizaciones, el primer cebador
y/o el segundo cebador comprenden aproximadamente
1-10 bases citosina o guanosina consecutivas (SEQ ID
NO:11) en su extremo 5', por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó
10 bases citosina o guanosina consecutivas que preceden a la región
de hibridación en el extremo 5'.
El primer y segundo cebadores también pueden
modificarse e incluir al menos un nucleótido que contenga un azúcar
distinto de la
2'-desoxi-D-ribosa o
D-ribosa convencional encontrada en el ADN y ARN
naturales. De manera similar, tal y como se usa en la presente
memoria, un "polinucleótido modificado" se refiere a un
polinucleótido que contiene un azúcar distinto de la
2'-desoxi-D-ribosa o
D-ribosa convencional encontrada en el ADN y ARN
naturales, y engloba a los nucleótidos en los que el azúcar está
modificado por la adición o sustitución de un grupo lateral, o en
los que el azúcar es un estereoisómero de la
2'-desoxi-D-ribosa o
D-ribosa convencional encontrada en el ADN y ARN
naturales, o ambas. Los términos no se usan para indicar que un
cebador o nucleótido modificado es el producto de un proceso de
modificación, sino para indicar la presencia de diferencias en el
núcleo del polinucleótido respecto al ADN o ARN natural. En
particular, los cebadores de la presente invención pueden
sintetizarse para contener un nucleótido modificado, aunque la
modificación química de un cebador que inicialmente sólo contiene
nucleótidos convencionales puede proporcionar una síntesis
alternativa.
Los polinucleótidos bloqueantes o de bloqueo
("bloqueantes") de la invención no operan como un punto de
extensión en condiciones de amplificación o extensión en las que el
primer y segundo cebadores operan como un punto de extensión. En
algunas realizaciones, esto es porque tienen un resto bloqueante
unido a su extremo 3' o porque carecen de un resto nucleofílico
unido a su extremo 3' (p. ej., un resto hidroxilo). Un
polinucleótido bloqueante es, preferiblemente, un ADN
monocatenario. La longitud apropiada de un polinucleótido bloqueante
depende, por ejemplo, de la temperatura de fusión de hibridación
(Tm) pretendida y de la localización del bloqueante pero
típicamente varía de 25 a 60 nucleótidos, preferiblemente de
aproximadamente 30-50 ó 35-45
nucleótidos, o cualquier número entero de bases nucleotídicas en
estos intervalos. Los polinucleótidos bloqueantes más cortos
requieren generalmente temperaturas más bajas para formar complejos
híbridos suficientemente estables con el molde. Un polinucleótido
bloqueante no necesita reflejar la secuencia exacta del ácido
nucleico molde, pero debe ser suficientemente complementario para
hibridar con el molde. Un polinucleótido bloqueante puede hibridar
con un segmento de secuencia más largo o más corto de la primera
secuencia diana respecto al primer cebador. Un polinucleótido
bloqueante puede ser más largo o más corto que un primer
cebador.
La Tm del polinucleótido bloqueante puede
variarse ajustando uno o más de varios parámetros, incluyendo por
ejemplo, su longitud, la localización y secuencia complementaria del
polinucleótido diana con el que hibrida (es decir, condición de
hibridación), y el número de emparejamientos erróneos interno. Los
polinucleótidos bloqueantes de la invención pueden tener cero, una,
dos, tres, cuatro o más bases nucleotídicas internas con
emparejamiento erróneo con la secuencia polinucleotídica diana,
por ejemplo. Las bases con emparejamiento erróneo están
localizadas preferiblemente en la región del bloqueante que hibrida
con la primera o segunda secuencia diana, es decir, la subsecuencia
en la secuencia polinucleotídica diana en la que el primer cebador
y el bloqueante compiten para hibridar. El diseño de las secuencias
polinucleotídicas para hibridar con una secuencia nucleotídica
diana es muy conocido en la técnica y se describe, por ejemplo, en
la bibliografía citada en la presente memoria.
El polinucleótido bloqueante compite con el
primer cebador de la invención para hibridar con una secuencia
común en la primera o segunda subsecuencia diana en la secuencia
polinucleotídica diana. Véanse las Figuras 1 y 2. La
secuencia diana común hibridada de manera competitiva por el
polinucleótido bloqueante y el primer cebador puede ser
complementaria a la longitud completa del primer cebador o a una
parte del primer cebador. Los polinucleótidos bloqueantes se
diseñan para tener una temperatura de fusión de hibridación
relativamente mayor en comparación con la temperatura de fusión de
hibridación del primer cebador cuando no está presente ningún
nucleótido de inserción. Los polinucleótidos bloqueantes se diseñan
además para tener una temperatura de fusión de hibridación
relativamente menor en comparación con la temperatura de fusión de
hibridación del primer cebador cuando está presente un
polinucleótido de inserción. En algunas realizaciones, la
temperatura de fusión de hibridación del polinucleótido bloqueante
será entre aproximadamente 5ºC-15ºC mayor o menor
en comparación con el primer cebador, según sea apropiado. En
algunas realizaciones, la temperatura de fusión de hibridación del
polinucleótido bloqueante es aproximadamente 5ºC, 6ºC, 7ºC, 8ºC,
9ºC, 10ºC, 11ºC, 12ºC, 13ºC, 14ºC ó 15ºC mayor o menor en
comparación con el primer cebador, según sea apropiado. En algunas
realizaciones, la diferencia en la temperatura de fusión de
hibridación puede ser más o menos que este intervalo
ejemplificado.
Por ejemplo, los polinucleótidos bloqueantes de
la invención pueden tener una temperatura de fusión de hibridación
que varía de aproximadamente 60ºC a aproximadamente 75ºC, por
ejemplo, entre aproximadamente 65ºC a aproximadamente 70ºC, cuando
no está presente ningún nucleótido de inserción. En algunas
realizaciones, la temperatura de fusión de hibridación de los
polinucleótidos bloqueantes cuando no está presente ningún
nucleótido de inserción es aproximadamente 60ºC, 61ºC, 62ºC, 63ºC,
64ºC, 65ºC, 66ºC, 67ºC, 68ºC, 69ºC, 70ºC, 71ºC, 72ºC, 73ºC, 74ºC ó
75ºC. Los polinucleótidos bloqueantes pueden tener una temperatura
de fusión de hibridación que varía de aproximadamente 40ºC a
aproximadamente 55ºC, por ejemplo, entre aproximadamente 45ºC a
aproximadamente 50ºC, cuando está presente un nucleótido de
inserción. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de
hibridación de los polinucleótidos bloqueantes cuando está presente
un nucleótido de inserción es aproximadamente 40ºC, 41ºC, 42ºC,
43ºC, 44ºC, 45ºC, 46ºC, 47ºC, 48ºC, 49ºC, 50ºC, 51ºC, 52ºC, 53ºC,
54ºC ó 55ºC.
Los polinucleótidos bloqueantes se diseñan para
hibridar con una secuencia de ácido nucleico en la secuencia
polinucleotídica diana que cubra el sitio de integración para el
polinucleótido de inserción. Los polinucleótidos bloqueantes pueden
hibridar aproximadamente 30, 25, 20, 15 ó 10 posiciones de bases
nucleotídicas que se extienden a lo largo del sitio de integración
o sitio de unión.
En algunas realizaciones, el polinucleótido
bloqueante hibrida con una secuencia génica orfX en un genoma
anfitrión de Staphylococcus, que flanquea un sitio de
integración attB. En algunas realizaciones, el
polinucleótido bloqueante comprende una o más secuencias
polinucleotídicas seleccionadas del grupo que consiste en:
5'-CA
GAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCTCGC-3' (SEQ ID NO:3); 5'-TAAAAAACTCCTCCGCTACT
TATGATACGCTTCTCCTCGC-3' (SEQ ID NO:4); 5'-CTCCTCATACAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGC
CTCTCCTCGC-3' (SEQ ID NO:6); 5'-CTCCTCATACAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCACG
CATAATC-3' (SEQ ID NO:7); y 5'-CTCCTCATACAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCACGCA
TAATCTTAAATGC-3' (SEQ ID NO:8).
GAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCTCGC-3' (SEQ ID NO:3); 5'-TAAAAAACTCCTCCGCTACT
TATGATACGCTTCTCCTCGC-3' (SEQ ID NO:4); 5'-CTCCTCATACAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGC
CTCTCCTCGC-3' (SEQ ID NO:6); 5'-CTCCTCATACAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCACG
CATAATC-3' (SEQ ID NO:7); y 5'-CTCCTCATACAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCACGCA
TAATCTTAAATGC-3' (SEQ ID NO:8).
Los pares ejemplificados de polinucleótidos
bloqueantes y primeros cebadores (aquí, cebadores inversos) que
hibridan con una secuencia de ácido nucleico común incluyen los
listados en la Tabla 1, a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los polinucleótidos bloqueantes comprenden
preferiblemente un resto bloqueante en su extremo 3', que evita su
extensión. Los restos bloqueantes ejemplificados incluyen reemplazar
el grupo hidroxilo 3'-terminal por un hidrógeno, un
amino o un grupo fosfato. En algunas realizaciones, el resto
bloqueante en el polinucleótido bloqueante es un fosfato o
hexilamina.
Tanto los cebadores como los polinucleótidos
bloqueantes contendrán generalmente enlaces fosfodiéster, aunque en
algunos casos, como se indica en la presente memoria, pueden usarse
análogos de ácidos nucleicos que pueden tener núcleos alternativos,
incluyendo, por ejemplo y sin limitación, fosforamida (Beaucage
et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925 y las
referencias citadas en él; Letsinger (1970) J. Org. Chem.
35:3800; Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem.
81:579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids. Res.
14:3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805; Letsinger
et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; y Pauwels
et al. (1986) Chemica Scripta 26:1419), fosforotioato
(Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; y Pat.
de EEUU No. 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al. (1989)
J. Am. Chem. Soc. 111:2321), uniones
O-metilfosforoamidita (véase Eckstein,
Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford
University Press (1992); y núcleo de ácido nucleico peptídico (PNA)
y núcleos de ácido nucleico bloqueado (LNA) y uniones (véanse,
Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier et al.
(1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008; Nielsen (1993)
Nature 365:566; y Carlsson et al. (1996) Nature
380:207, Demidov, Trends Biotechnol (2003)
21:4-7; y Vester y Wengel, Biochemistry
(2004) 43:13233-41.
Otros análogos de ácido nucleico incluyen
aquellos con núcleos cargados positivamente (Denpcy et al.
(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097); núcleos no
iónicos (Pat. de EEUU Nos. 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240,
5.216.141 y 4.469.863; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English
30:423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc.
110:4470; Letsinger et al. (1994) Nucleoside &
Nucleotide 13:1597; Capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580,
Ed. Y.S. Sanghvi y P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994)
Biorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395; Jeffs et
al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; y Tetrahedron
Lett. 37:743 (1996) y núcleos sin ribosa, incluyendo los
descritos en las Pat. de EEUU Nos. 5.235.033 y 5.034.506, y los
Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Ed. Y.S. Sanghvi y P.
Dan Cook, cada una de cuyas referencias se incorpora por referencia.
Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos
también están incluidos en la definición de ácidos nucleicos (véase
Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev.
p169-176). También se describen varios análogos de
ácido nucleico, p. ej., en Rawls, C & E News Jun. 2, 1997
página 35, que se incorpora por referencia. Estas modificaciones
del núcleo ribosa-fosfato pueden usarse para
facilitar la adición de restos adicionales tales como marcadores, o
para alterar la estabilidad y vida media de dichas moléculas en
entornos fisiológicos.
Además de las bases heterocíclicas naturales que
se encuentran típicamente en los ácidos nucleicos (p. ej., adenina,
guanina, timina, citosina y uracilo), los análogos de ácidos
nucleicos también pueden incluir las que tienen bases
heterocíclicas o modificadas no naturales, muchas de las cuales se
describen, o se refieren de otra manera, en la presente memoria. En
particular, muchas bases no naturales se describen adicionalmente,
por ejemplo, en Seela et al (1991) Helv. Chim. Acta
74:1790, Grein et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett.
4:971-976, y Seela et al. (1999) Helv.
Chim. Acta 82:1640. Para ilustrar adicionalmente, se incluyen
opcionalmente determinadas bases usadas en nucleótidos que actúan
como modificadores de la temperatura de fusión (Tm). Por ejemplo,
algunas de éstas incluyen 7-deazapurinas (p. ej.,
7-deazaguanina, 7-deazaadenina,
etc.), pirazolo[3,4-d]pirimidinas,
propinil-dN (p. ej., propinil-dU,
propinil-dC, etc.). Véase la Pat. de EEUU No.
5.990.303. Otras bases heterocíclicas representativas incluyen, p.
ej., hipoxantina, inosina, xantina; 8-aza derivados
de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina,
2-amino-6-cloropurina,
hipoxantina, inosina y xantina;
7-deaza-8-aza
derivados de adenina, guanina, 2-aminopurina,
2,6-diaminopurina,
2-amino-6-cloropurina,
hipoxantina, inosina y xantina; 6-azacitosina;
5-fluorocitosina; 5-clorocitosina;
5-yodocitosina; 5-bromocitosina;
5-metilcitosina;
5-propinilcitosina;
5-bromoviniluracilo;
5-fluorouracilo; 5-clorouracilo;
5-yodouracilo; 5-bromouracilo;
5-trifluorometiluracilo;
5-metoximetiluracilo;
5-etiniluracilo; 5-propiniluracilo.
Los ejemplos de bases y nucleótidos modificados también se
describen, p. ej., en las Pat. de EEUU Nos. 5.484.908, 5.645.985,
5.830.653, 6.639.059, 6.303.315 y Pub. de Solicitud de Pat. de EEUU
No. 2003/0092905.
La amplificación de un molde de ARN o ADN usando
reacciones es muy conocida (véanse las Pat. de EEUU Nos. 4.683.195
y 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications (Innis et al., eds, 1990)). Los métodos
tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la
reacción en cadena de la ligasa (LCR) pueden usarse para amplificar
secuencias de ácido nucleico de secuencias de ADN diana directamente
a a partir de ARNm, a partir de ADNc, a partir de bibliotecas
genómicas o bibliotecas de ADNc. La reacción se lleva a cabo
preferiblemente en un ciclador térmico para facilitar los tiempos de
incubación a las temperaturas deseadas. Véase, p. ej., PCR PRIMER,
A LABORATORY MANUAL (Dieffenbach, ed. 2003) Cold Spring Harbor
Press.
Las condiciones de la reacción de PCR ejemplares
que permiten la amplificación de un amplicón comprenden típicamente
ciclos bien de dos o tres etapas. Los ciclos de dos etapas tienen
una etapa de desnaturalización seguida de una etapa de
hibridación/elongación. Los ciclos de tres etapas comprenden una
etapa de desnaturalización seguida de una etapa de hibridación
seguida de una etapa separada de elongación.
En algunas realizaciones, un amplicón
amplificado en presencia de un polinucleótido de inserción integrado
en el polinucleótido diana se detecta por PCR en tiempo real. La
RT-PCR en tiempo real es un método que utiliza
secuencias de ADN específicamente obtenidas por ingeniería (dos
cebadores y una sonda marcada con fluorescencia) para detectar y
cuantificar secuencias de ADN diana. La sonda contiene un marcador
informador fluorescente en un extremo y un marcador de
apantallamiento en el otro. Durante cada ciclo de amplificación, la
sonda se une en primer lugar a la secuencia de ADN diana, seguido
de la unión de los cebadores. Al copiarse la cadena de ADN, el
marcador informador se libera de la sonda y emite una señal
fluorescente. La cantidad de fluorescencia aumenta con cada ciclo
de PCR en proporción a la cantidad de ADN diana. Esto resulta en la
detección y cuantificación directa de la secuencia de ADN diana con
un alto grado de especificidad, precisión y sensibilidad.
En algunas realizaciones, las reacciones de
amplificación múltiple se llevan a cabo por PCR múltiple. Las
reacciones de PCR múltiple se refieren a una reacción de PCR en la
que más de un conjunto de cebadores se incluye en la mezcla de
reacción lo que permite la amplificación de 2 o más ADN diana
diferentes por PCR en un único tubo de reacción. La PCR múltiple
puede ser cuantitativa y puede evaluarse en "tiempo real". Las
reacciones de PCR múltiple son útiles para propósitos de validación,
diagnóstico y pronóstico. Las reacciones de PCR múltiple pueden
llevarse a cabo usando ciclado térmico manual o automático. Puede
usarse cualquier ciclador térmico disponible comercialmente, tal
como, p. ej., el ciclador Perkin-Elmer 9600.
Usando PCR múltiple al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50,
100
o más polinucleótidos diana pueden evaluarse para la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado.
o más polinucleótidos diana pueden evaluarse para la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado.
Las reacciones de amplificación isotérmica
también son conocidas y pueden usarse según los métodos de la
invención. Los ejemplos de reacciones de amplificación isotérmica
incluyen amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) (Walker,
et al. Nucleic Acids Res.
20(7):1691-6 (1992); Walker PCR Methods
Appl 3(1):1-6 (1993)), amplificación
mediada por transcripción (Phyffer, et al., J. Clin.
Microbiol. 34:834-841 (1996); Vuorinen, et
al., J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859
(1995)), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico
(NASBA) (Compton, Nature
350(6313):91-2 (1991), amplificación por
círculo rodante (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol.
12(1):75-99 (1999)); Hatch et al.,
Genet. Anal. 15(2):35-40 (1999)) y
amplificación de la señal de ADN ramificado (bADN) (véase, p. ej.,
Iqbal et al., Mol. Cell Probes
13(4):315-320 (1999)). Otros métodos de
amplificación conocidos por los expertos en la técnica incluyen CPR
(Reacción de la Sonda Cíclica), SSR (Replicación de Secuencia
Autosostenida), SOA (Amplificación por Desplazamiento de Cadena),
QBR (Replicasa Q-Beta), Re-AMP
(anteriormente RAMP), RCR (Reacción de Reparación de Cadena), TAS
(Sistema de Amplificación Basado en Transorción), y HCS.
La concentración de la sal de magnesio en la
mezcla de reacción puede ser importante cuando se intenta copiar
diferentes secuencias de ADN diana. Así, alguna variación en la
concentración de la sal de magnesio, p. ej., cloruro de magnesio,
puede requerirse para optimizar la reacción para amplificar las
secuencias polinucleotídicas diana de interés. Un experto en la
técnica puede variar la concentración de la sal o ión de magnesio
presente en la mezcla de reacción para conseguir las condiciones
apropiadas para la amplificación.
En algunas realizaciones, se incluye un segundo
par de cebadores en la reacción de amplificación que permite la
amplificación de una secuencia control en el polinucleótido diana,
por ejemplo, para cuantificar la cantidad de polinucleótido diana
en un ensayo.
En algunas realizaciones, puede optimizarse la
relación molar de uno o más de los polinucleótidos bloqueantes
respecto al primer cebador competitivo en la reacción de
amplificación. En algunas realizaciones, la relación molar de uno o
más de los polinucleótidos bloqueantes respecto al primer cebador
competitivo en la reacción de amplificación es mayor de una
relación molar 1:1 de polinucleótido(s) bloqueante(s)
respecto al primer cebador, por ejemplo, de aproximadamente 5:1 a
aproximadamente 30:1, por ejemplo, aproximadamente una relación
molar de 5:1, 10:1, 20:1, 25:1 ó 30:1 de polinucleótido(s)
bloqueante(s) respecto al primer cebador.
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Las secuencias de ácido nucleico amplificadas
("amplicones") pueden detectarse usando cualquier método
conocido en la técnica. Por ejemplo, los amplicones pueden
detectarse en un gel de agarosa usando bromuro de etidio. La
presencia de un polinucleótido de inserción se indica por la
presencia de una señal de amplicón o la presencia incrementada de
una señal de amplicón en comparación con una secuencia
polinucleotídica diana control, por ejemplo, una secuencia
polinucleotídica diana que se sabe que no tiene un polinucleótido de
inserción, por ejemplo, un Staphylococcus aureus sensible a
meticilina (MSSA).
En algunas realizaciones, los amplicones se
detectan usando sondas que hibridan específicamente con el amplicón
y son detectables después de la hibridación con el amplicón.
Numerosos tipos de sondas son capaces de hibridar con y detectar
una secuencia polinucleotídica particular. En algunos casos, la
sonda también comprende un fluoróforo o una enzima, como se
describe a continuación, lo que permite la detección de la unión de
la sonda a su secuencia diana complementaria.
La concentración de la sonda debe ser suficiente
para unirse a la cantidad de secuencias diana o control que se
amplifican de manera que se proporciona una evaluación precisa de la
cantidad de secuencia amplificada. Los expertos en la técnica
reconocerán que la cantidad de concentración de sonda variará según
la afinidad de unión de la sonda así como la cantidad de secuencia
a unir. Las concentraciones de sonda típicas variarán de 0,01
\muM a 0,5 \muM. La longitud típica de la sonda variará de
aproximadamente una longitud de 20-40 bases
nucleotídicas, por ejemplo, aproximadamente una longitud de
25-35 bases nucleotídicas, o cualquier número
entero de bases nucleotídicas en estos intervalos.
La presente invención puede emplear muchas
clases diferentes de sondas de hibridación de ácidos nucleicos para
la detección del amplicón. Típicamente, para la generación de la
señal, las sondas utilizan un cambio en la fluorescencia de un
fluoróforo debido a un cambio en su interacción con otra molécula o
resto como consecuencia de un cambio en la distancia entre el
fluoróforo y la molécula o resto que interacciona. Alternativamente,
los amplicones pueden detectarse usando otros métodos, por ejemplo,
usando sondas marcadas radiactivamente o marcadas enzimática-
mente.
mente.
En algunos casos, se emplean marcadores
fluorescentes múltiples. En una realización preferida, se usan al
menos dos marcadores fluorescentes que son miembros de una pareja de
transferencia de energía resonante por fluorescencia (FRET). FRET
es un fenómeno conocido en la técnica en el que la excitación de un
marcador fluorescente se transfiere a otro sin la emisión de un
fotón. Una pareja FRET consiste en un fluoróforo donante y un
fluoróforo aceptor. El espectro de emisión de fluorescencia del
donante y el espectro de absorción de fluorescencia del aceptor se
superponen habitualmente, y las dos moléculas deben estar muy
próximas. La distancia entre el donante y el aceptor a la que el
50% de los donantes está desactivado (transfiere energía al aceptor)
se define por el radio de Forster (R_{o}) que es típicamente
10-100 \ring{A}. Los cambios en el espectro de
emisión de fluorescencia que comprende las parejas FRET puede
detectarse, indicando que están muy próximos (es decir, en 100
\ring{A} uno de otro). Esto resultará típicamente de la unión o
disociación de dos moléculas, una de las cuales está marcada con un
donante FRET y la otra de las cuales está marcada con un aceptor
FRET, en el que dicha unión aproxima mucho la pareja FRET. La unión
de dichas moléculas resultará en una emisión incrementada de la
fluorescencia del aceptor y/o apantallamiento de la emisión de
fluorescencia del donante.
Las parejas FRET (donante/aceptor) útiles en la
invención incluyen, pero no están limitadas a, EDANS/fluoresceína,
IAEDANS/fluoresceína, fluoresceína/tetrametilrodamina,
fluoresceína/LC Red 640, fluoresceína/Cy 5, fluoresceína/Cy 5.5 y
fluoresceína/LC Red 705.
En otro aspecto de FRET, puede emplearse una
molécula donante fluorescente y una molécula aceptora no
fluorescente ("apantallador"). En esta aplicación, la emisión
fluorescente del donante se incrementará cuando el apantallador se
desplace de la proximidad del donante y la emisión fluorescente
disminuirá cuando el apantallador esté muy próximo al donante. Los
apantalladores útiles incluyen, pero no están limitados a, DABCYL,
QSY 7 y QSY 33. Las parejas donante/apantallador fluorescentes
útiles incluyen, pero no están limitadas a EDANS/DABCYL, Texas
Red/DABCYL, BODIPY/DABCYL, Lucifer yellow/DABCYL, cumarina/DABCYL y
fluoresceína/marcador QSY 7.
\newpage
El experto en la técnica apreciará que FRET y el
apantallamiento de la fluorescencia permiten la monitorización de
la unión de moléculas marcadas en el tiempo, proporcionando una
información dependiente de ciclo respecto al curso en el tiempo de
las reacciones de unión.
En algunas realizaciones, la secuencia de ácido
nucleico amplificada se detecta usando una sonda marcada en su
extremo 5' con un fluoróforo y en su extremo 3' con un apantallador.
En una realización adicional, el fluoróforo es fluoresceína (FAM) y
el apantallador es QSY7. Alternativamente, el o los fluoróforos y/o
el o los apantalladores pueden estar localizados en un sitio
interno en la sonda.
En algunas realizaciones, la sonda detectable
hibrida con un amplicón que corresponde con una secuencia
orfX de Staphylococcus. En una realización adicional,
la sonda detectable comprende la secuencia
5'-CGGCCTGCACAAG
GACGTCTTACAACGTAG-3' (SEQ ID NO:5).
GACGTCTTACAACGTAG-3' (SEQ ID NO:5).
Otro tipo de ensayo de sonda de hibridación con
ácido nucleico utilizando una pareja FRET es el ensayo
"TaqMan®" descrito en Gelfand et al. Pat. de EUU No. 5.210.015 y Livak et al. Pat. de EEUU No. 5.538.848. La sonda es un polinucleótido monocatenario marcado con una pareja FRET. En un ensayo TaqMan®, una ADN polimerasa libera un único o múltiples nucleótidos por escisión de la sonda polinucleotídica cuando hibrida con una cadena diana. Esta liberación proporciona una manera para separar el marcador apantallador y el marcador fluoróforo de la pareja FRET.
"TaqMan®" descrito en Gelfand et al. Pat. de EUU No. 5.210.015 y Livak et al. Pat. de EEUU No. 5.538.848. La sonda es un polinucleótido monocatenario marcado con una pareja FRET. En un ensayo TaqMan®, una ADN polimerasa libera un único o múltiples nucleótidos por escisión de la sonda polinucleotídica cuando hibrida con una cadena diana. Esta liberación proporciona una manera para separar el marcador apantallador y el marcador fluoróforo de la pareja FRET.
Otro tipo más de ensayo de sonda de hibridación
con ácido nucleico utilizando parejas FRET se describe en Tyagi
et al. Pat. de EEUU No. 5.925.517, que utiliza sondas
polinucleotídicas marcadas, que se refieren como "Balizas
Moleculares". Véase Tyagi, S. y Kramer, F.R., Nature
Biotechnology 14:303-308 (1996). Una sonda de
baliza molecular es un polinucleótido cuyas regiones terminales
hibridan entre sí para formar una horquilla en ausencia de diana
pero que están separadas si la parte central de la sonda hibrida con
su secuencia diana. Cuando la sonda hibrida con una diana, esto es,
cuando la secuencia de reconocimiento de la diana hibrida con una
secuencia diana complementaria, se forma una hélice relativamente
rígida, causando que el híbrido precursor se desenrolle y que los
brazos se
separen.
separen.
También pueden usarse sondas fluorescentes no
FRET. Por ejemplo, los cambios en el espectro de absorción de la
pareja marcadora pueden usarse como una señal detectable como una
alternativa al cambio en la fluorescencia. Cuando se utiliza el
cambio en la absorción, la pareja marcadora puede incluir dos
cromóforos cualquiera, esto es, fluoróforos, apantalladores y otros
cromóforos. La pareja marcadora puede incluso estar formada por
cromóforos idénticos.
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La invención proporciona además composiciones,
incluyendo por ejemplo, disoluciones, mezclas de reacción, y
recipientes de reacción que comprenden el primer y segundo
cebadores, polinucleótidos bloqueantes y opcionalmente sondas de
detección, como se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, las composiciones
comprenden el primer y segundo cebadores, y un polinucleótido
bloqueante que cada uno hibrida con una secuencia orfX de
Staphylococcus, en el que el primer cebador y el
polinucleótido bloqueante compiten entre sí para hibridar con una
subsecuencia común adyacente a un sitio de integración attB
en la secuencia orfX. La hibridación del polinucleótido
bloqueante se ve favorecida cuando no está presente el
polinucleótido de inserción, y la hibridación del primer cebador se
ve favorecida cuando está presente el polinucleótido de inserción
(p. ej., un complejo SCCmec que comprende un gen
mecA).
En algunas realizaciones, las composiciones
incluyen una pluralidad de primer y segundo cebadores y/o una
pluralidad de polinucleótidos bloqueantes, por ejemplo, para
realizar PCR múltiple.
Las composiciones pueden incluir además una
secuencia polinucleotídica diana (p. ej., una secuencia de
ácido nucleico genómico de una célula anfitriona), bases
nucleotídicas (dNTP incluyendo dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP),
polimerasas, y tampones de reacción apropiados, sales e iones
metálicos. El algunas realizaciones, la polimerasa es una
Taq polimerasa, aunque puede incluirse cualquier polimerasa
termoestable o ADN polimerasa adecuada para la amplificación de
secuencias nucleotídicas o reacciones de extensión del ADN. Las
polimerasas termoestables son muy conocidas en la técnica y están
disponibles comercialmente (por ejemplo, de New England
Biolabs, Ipswich, MA; Promega, Madison, WI; Stratagene, La Jolla,
CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN). En algunas
realizaciones, las composiciones incluyen además una o más sondas de
detección para detectar la amplificación de un amplicón, por
ejemplo, para la detección de la amplificación en tiempo real.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona además kits que
comprenden el primer y segundo cebadores, uno o más polinucleótidos
bloqueantes y opcionalmente sondas de detección, como se ha descrito
anteriormente para las composiciones y métodos. Los kits
opcionalmente pueden comprender además un polinucleótido diana
control, por ejemplo, una secuencia genómica control de una célula
anfitriona que se sabe que tiene integrado o que se sabe que no
tiene integrado un polinucleótido de inserción. Además, el kit
puede incluir reactivos de amplificación, incluyendo nucleótidos
(p. ej., A, C, G y T), una ADN polimerasa y tampones apropiados,
sales y otros reactivos para facilitar las reacciones de
amplificación. En algunas realizaciones, los kits incluyen además
una o más sondas de detección para detectar la amplificación de un
amplicón, por ejemplo, para la detección de la amplificación en
tiempo real. En algunas realizaciones, los kits incluyen una
pluralidad de primeros y segundos cebadores y/o una pluralidad de
polinucleótidos bloqueantes, por ejemplo, para realizar PCR
múltiple. Los kits también pueden incluir instrucciones escritas
para el uso del kit para amplificar y controlar la amplificación de
una muestra diana.
En algunas realizaciones, la invención
proporciona kits que incluyen uno o más recipientes de reacción que
tienen alicuotas de alguno o todos los componentes de la reacción de
la invención en ellos. Las alicuotas pueden estar en forma líquida
o seca. Los recipientes de reacción pueden incluir cartuchos para el
procesamiento de las muestras u otros recipientes que permitan la
contención, procesamiento y/o amplificación de las muestras en el
mismo recipiente. En alguna realización, los kits comprenden además
un sustrato multipocillo (p. ej., tira con múltiples
recipientes, placa con múltiples recipientes), por ejemplo, para
amplificar simultáneamente una pluralidad de polinucleótidos diana.
Dichos kits permiten la detección fácil de los productos de la
amplificación de la invención en dispositivos de amplificación
estándar o portátiles.
En algunas realizaciones, los kits comprenden
recipientes tales como cartuchos de procesamiento de las muestras
útiles para la amplificación rápida de una muestra como se describe
en Belgrader, P., et al., Biosensors and
Bioelectronics 14:849-852 (2000); Belgrader, P.,
et al., Science, 284:449-450 (1999); y
Northrup, M.A., et al., "A New Generation of PCR
Instruments and Nucleic Acid Concentration Systems" en PCR
PROTOCOLS (Sninsky, J.J. et al (eds.)) Academic, San Diego,
Capítulo 8 (1998)).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos siguientes se ofrecen para
ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de RT-PCR en
tiempo real (RT-PCR; ensayo de
5'-nucleasa) se realizaron para determinar la
presencia o ausencia de un SCCmec integrado en el ADN
genómico de aislados de MRSA y MSSA en el sitio de inserción. La
reacción usó dos cebadores que hibridaban con secuencias
orfX, una sonda marcada fluorescentemente y uno de dos
polinucleótidos bloqueantes diseñados para acomodar polimorfismos de
secuencia que se sabe que ocurren en la región orfX de
S. aureus (a continuación).
| cebador directo orfX (F1): 5'-AGGGCAAAGCGACTTTGTATTC-3' | (SEQ ID NO:1) |
| cebador inverso orfX (R11): 5'-CTTATGATACGCTTCTCCTCGC-3' | (SEQ ID NO:2) |
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo reacciones separadas en
presencia de cada uno de las secuencias polinucleotídicas
bloqueantes siguientes:
| 5'-CAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCTCGC-PO_{3}-3' | (SEQ ID NO:12) |
| 5'-TAAAAAACTCCTCCGCTACTTATGATACGCTTCTCCTCGC-PO_{3}-3' | (SEQ ID NO:13). |
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en la
Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se puede ver en la Tabla, se amplificó una
subsecuencia de la región orfX del ADN genómico de la cepa
MSSA en ausencia del polinucleótido bloqueante. Sin embargo, la
subsecuencia orfX no se amplificó cuando cualquiera de los
dos polinucleótidos bloqueantes estaba presente en la reacción. Una
diana en la región orfX se amplificó y se detectó con una
señal positiva robusta del ADN genómico de MRSA en presencia o
ausencia de cualquiera de los dos polinucleótidos bloqueantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una RT-PCR para
determinar el efecto de un polinucleótido bloqueante en la
amplificación de un amplicón orfX de los genomas anfitriones
de cepas MRSA y MSSA. Las reacciones de PCR se realizaron usando
cebadores directos e inversos que hibridaban con orfX y la
amplificación se detectó con una sonda marcada con FAM (a
continuación).
| cebador directo orfX (F1): 5'-AGGGCAAAGCGACTTTGTATTC-3' | (SEQ ID NO:1) |
| cebador inverso orfX (R11): 5'-CTTATGATACGCTTCTCCTCGC-3' | (SEQ ID NO:2) |
| sonda orfX: 5'-FAM-CGGCCTGCACAAGGACGTCTTACAACGTAG-Apantallador 3' | (SEQ ID NO:14) |
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Tabla 3 y en la
Figura 4.
Como puede verse en la Tabla 3, la subsecuencia
orfX no se amplificó del ADN genómico de MSSA en presencia
del polinucleótido bloqueante. En ausencia del bloqueante, se
amplificó una subsecuencia orfX. La subsecuencia orfX
se amplificó con una señal positiva robusta del ADN genómico de MRSA
en presencia y ausencia de un polinucleótido bloqueante.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, el bloqueante GCG49 se ensayó
para su capacidad de bloquear la amplificación de secuencias
polinucleotídicas diana (orfX) en 80 aislados clínicos
diferentes de MSSA. Las secuencias de las regiones orfX y
attB de estos 80 aislados no se conocían, pero estos aislados
se eligieron para representar una sección transversal de cepas de
S. aureus que podrían encontrarse en el entorno clínico.
La secuencia nucleotídica de la cepa MSSA ATCC
35556 en la región orfX se muestra en la Tabla 4, junto con
las secuencias del bloqueante, cebadores y sondas.
Se obtuvieron extractos crudos de ADN de 80
aislados de MSSA en primer lugar sembrando en estrías estas cepas
bacterianas en placas Petri que contienen medio agar. Se tomó una
única colonia aislada de una cepa dada con un asa de inoculación, y
se suspendió en un mililitro de agua de grado de biología molecular.
Este proceso se repitió para los 80 aislados. Los tubos se
cerraron, y se calentaron a 95ºC durante 10-15
minutos. Después de que se enfriaran las disoluciones, estos
extractos de ADN se centrifugaron a 10.000 x g durante 5 minutos
para eliminar los restos celulares. Se diluyó una alicuota de varios
microlitros del sobrenadante que contiene el ADN 100 veces en un
tampón Tris 10 mM (pH 8,3) que contiene 1 mM EDTA. Esta alicuota
diluida de lisado se usó como la muestra de ADN de ensayo. La
cantidad de ADN presente en estas muestras no se cuantificó. Debido
al método sencillo usado para la preparación, era seguro que la
cantidad de ADN variaba de preparación a preparación. Las muestras
de ADN se sometieron a PCR cuantitativa en tiempo real con o sin la
presencia del Bloqueante GCG49.
Los resultados se representan en las Figuras 5 y
6. En ausencia del polinucleótido bloqueante GCG49, OrfX se
amplificó a partir del ADN genómico de las 80 cepas MSSA ensayadas.
El valor C_{t} observado para estas RT-PCR es
proporcional a la cantidad de ADN diana presente al comienzo de la
reacción. El valor C_{t} será menor cuando está presente una
cantidad mayor de ADN diana, y C_{t} será mayor cuando están
presentes cantidades menores de ADN, es decir, cuando están
presentes cantidades mayores de ADN la fluorescencia cruzará el
umbral de detección en menos ciclos que cuando está presente una
cantidad menor de ADN. Los valores C_{t} observados para estos
aislados no bloqueados varió de 22 a 30. Esto sugiere que la
cantidad de ADN genómico presente al comienzo de la reacción
difería tanto como 256 veces de preparación a preparación.
El bloqueo se demuestra por un valor C_{t}
incrementado para la detección de la subsecuencia orfX,
cuando está presente el bloqueante, comparado con el C_{t}
observado en ausencia del polinucleótido bloqueante. Este valor, el
C_{t} delta (C_{t} de PCR con bloqueante
presente-C_{t} de PCR sin bloqueante) indica la
eficacia del polinucleótido bloqueante frente a una cepa dada. Sin
embargo, el C_{t} delta no puede verse como un valor absoluto
porque la cantidad de material de partida variaba significativamente
de reacción a reacción.
Por ejemplo, un lisado que tiene un C_{t} de
30 en ausencia de bloqueante y un C_{t} de 45 en presencia de
bloqueante, tiene un C_{t} delta de 15. En este ejemplo, un
C_{t} delta de 15 indica la supresión completa de la
amplificación de la subsecuencia orfX porque un C_{t} de 45
indica que no detectó producto de amplificación en 45 ciclos de
PCR. Si el C_{t} de partida es 20 y el C_{t} delta es 15 esto no
representaría una completa supresión de la señal orfX sino una
reducción de \sim33.000 veces.
El impacto del polinucleótido bloqueante se
demostró en todos los aislados ensayados aunque la eficacia del
bloqueante mostró una variación considerable en los 80 aislados. En
presencia del polinucleótido bloqueante, 35% de los aislados mostró
una inhibición completa de la amplificación de orfX, 22%
mostró una reducción de 1.000 a 16.000 veces en la amplificación de
orfX, 15% mostró una reducción de 64 a 1.000 veces en la
amplificación de orfX y 28% mostró una reducción de 8 a 64
veces en la amplificación de orfX.
Las secuencias publicadas de las regiones
orfX y attB del genoma de S. aureus muestran
que existen polimorfismos de secuencia entre cepas. Por lo tanto,
es improbable que un único polinucleótido bloqueante sea eficaz
para todas las cepas de MSSA. Se requerirán múltiples
polinucleótidos bloqueantes para suprimir la amplificación de
secuencias diana en las regiones orfX presentes en el rango
de las cepas de MSSA encontradas. Por lo tanto, se espera que un
polinucleótido bloqueante bien diseñado tenga un espectro de
eficacia frente a un rango de cepas existentes, bloqueando
eficazmente la amplificación de las secuencias orfX diana en
un subconjunto particular de cepas con menos supresión completa de
las secuencias orfX diana de otras cepas.
Por lo tanto, en determinados casos, será útil
incluir una "mezcla" de dos o más bloqueantes para conseguir
el bloqueo en un espectro amplio de polimorfismos en la secuencia
polinucleotídica diana asociado con diferentes cepas de S.
aureus.
Claims (15)
1. Un método para determinar la presencia o
ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de
unión en una secuencia polinucleotídica diana, comprendiendo el
método, poner en contacto el polinucleótido diana con un primer
cebador, un segundo cebador, un polinucleótido bloqueante, una
polimerasa, y uno o más nucleótidos trifosfato, en el que:
(i) el polinucleótido diana comprende una cadena
polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un
polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un
lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda
secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,
(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la
primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el
polinucleótido de inserción integrado está ausente,
(iii) el primer cebador hibrida con una primera
región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de
unión, de manera que
(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda
región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de
unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de
una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana,
de manera que cuando una secuencia de inserción
integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo
cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una
secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el
polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda
secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación
de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana,
según lo cual se determina la presencia o ausencia del
polinucleótido de inserción integrado en el sitio de unión en el
polinucleótido diana.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la longitud completa del primer cebador hibrida con la primera
secuencia diana de manera competitiva con el bloqueante, o en el que
una parte del primer cebador hibrida con la primera secuencia diana
de manera competitiva con el bloqueante.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
los nucleótidos trifosfato son nucleótidos dNTP, y/o en el que la
polimerasa es una ADN polimerasa, y/o en el que la ADN polimerasa es
una Taq polimerasa, y/o en el que el polinucleótido de
inserción tiene una longitud de al menos 10 bases nucleotídicas.
4. El método de la reivindicación 1, (a) en el
que el método se realiza en formato múltiple; y/o (b) que comprende
además la etapa de exponer el polinucleótido diana a condiciones de
amplificación.
5. El método de la reivindicación 4(b),
en el que la amplificación se evalúa por PCR; o en el que la
amplificación se evalúa por PCR en tiempo real.
6. Una mezcla de reacción para determinar la
presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en
un sitio de unión de una primera secuencia diana y una segunda
secuencia diana en un polinucleótido diana, comprendiendo la mezcla
de reacción, el polinucleótido diana, un primer cebador, un segundo
cebador y un polinucleótido bloqueante, en el que:
(i) el polinucleótido diana comprende una cadena
polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un
polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un
lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda
secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,
(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la
primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el
polinucleótido de inserción integrado está ausente,
(iii) el primer cebador hibrida con una primera
región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de
unión, de manera que
(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda
región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de
unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de
una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana,
de manera que cuando una secuencia de inserción
integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo
cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una
secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el
polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda
secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación
de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana.
7. La mezcla de reacción de la reivindicación 6,
en la que el polinucleótido de inserción se integra en el sitio de
unión, o en la que el polinucleótido de inserción no se integra en
el sitio de unión.
8. La mezcla de reacción de la reivindicación 7,
que comprende además nucleótidos dNTP; y/o que comprende además una
ADN polimerasa, opcionalmente en la que la ADN polimerasa es una
Taq polimerasa; y/o que comprende además una sonda para
detectar el amplicón amplificado por PCR en tiempo real, y/o que
comprende una pluralidad de bloqueantes para detectar un
polinucleótido de inserción integrado en una pluralidad de
diferentes polinucleótidos diana.
9. Un kit para determinar la presencia o
ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de
unión de una primera secuencia diana y una segunda secuencia diana
en un polinucleótido diana, comprendiendo el kit, un primer
cebador, un segundo cebador y un polinucleótido bloqueante, en el
que:
(i) el polinucleótido diana comprende una cadena
polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un
polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un
lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda
secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,
(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la
primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el
polinucleótido de inserción integrado está ausente,
(iii) el primer cebador hibrida con una primera
región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de
unión, de manera que
(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda
región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de
unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de
una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana,
de manera que cuando una secuencia de inserción
integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo
cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y
segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una
secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el
polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda
secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación
de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana.
10. El método de la reivindicación 1, mezcla de
reacción de la reivindicación 7 o kit de la reivindicación 9, en el
que el primer cebador y el polinucleótido bloqueante son los dos
sustancialmente complementarios a la primera región en el
polinucleótido diana y el primer cebador tiene menos nucleótidos con
emparejamiento erróneo que el polinucleótido bloqueante respecto a
la primera región en el polinucleótido diana; o en el que el primer
cebador es completamente complementario a la primera región en el
polinucleótido diana y el polinucleótido bloqueante porta al menos
un emparejamiento erróneo interno comparado con la primera región
del polinucleótido diana.
11. El método de la reivindicación 1, mezcla de
reacción de la reivindicación 7 o kit de la reivindicación 9, en el
que la primera secuencia diana y la segunda secuencia diana son
partes de orfX de Staphylococcus aureus, el sitio de
unión es un sitio de integración attB, el polinucleótido de
inserción es al menos una parte de un complejo SCCmec, y el
polinucleótido diana es ADN de Staphylococcus aureus.
12. El método de la reivindicación 1, mezcla de
reacción de la reivindicación 7 o kit de la reivindicación 9, en el
que el polinucleótido bloqueante comprende un resto en su extremo 3'
seleccionado del grupo que consiste en fosfato y hexilamina, o en
el que el polinucleótido bloqueante comprende al menos una base
análoga de ácido nucleico.
13. El kit de la reivindicación 9, que comprende
además un polinucleótido diana control que comprende la primera
secuencia diana y segunda secuencia diana.
14. El kit de la reivindicación 13, en el que el
polinucleótido de inserción se integra en el sitio de unión, o en
el que el polinucleótido de inserción no se integra en el sitio de
unión.
15. El kit de la reivindicación 13, que
comprende además una sonda para detectar el amplicón amplificado por
PCR en tiempo real, y/o que comprende además un sustrato
multipocillo.
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