ES2341252T3

ES2341252T3 - Composiciones que comprenden polipeptidos.

Info

Publication number: ES2341252T3
Application number: ES04803302T
Authority: ES
Inventors: Robert Hofmeister; Nadja Prang; Andreas Wolf; Frank Hanakam; Thomas Urbig; Christian Itin; Patrick Baeuerle
Original assignee: Micromet GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2003-11-28
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2010-06-17
Anticipated expiration: 2024-11-26
Also published as: CA2544532C; EP1691833B1; AU2004293182B2; CY2016010I1; WO2005052004A3; US20070249529A1; CA2544532A1; CY1110689T1; NL300807I2; PL1691833T3; HUS1600019I1; EP2186527A1; ATE459374T1; WO2005052004A2; LU93067I2; PT1691833E; DE602004025840D1; FR16C1000I1; DK1691833T3; AU2004293182A1

Abstract

Una composición que comprende un polipéptido que comprende al menos dos sitios de unión a antígeno, en la que dichos al menos dos sitios de unión a antígeno están localizados en una cadena polipeptídica sencilla, y en la que - uno de dichos al menos dos sitios de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD3 humano; - dicho polipéptido puede existir tanto en forma monomérica como en forma multimérica, siendo dicha forma monomérica dicha cadena polipeptídica sencilla y comprendiendo dicha forma multimérica al menos dos de dichas cadenas polipeptídicas sencillas asociadas no covalentemente entre sí; y - dicha forma multimérica de dicho polipéptido constituye no más del 5% del peso total de las formas monomérica y multimérica combinadas de dicho polipéptido.

Description

Composiciones que comprenden polipéptidos.

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden polipéptidos, especialmente polipéptidos capaces de unirse específicamente a antígenos predeterminados por medio de epítopes en dichos antígenos. Una composición preferida es una composición farmacéutica. La presente invención también se refiere a un procedimiento de producción de una composición enriquecida en la que la cantidad de un polipéptido en forma monomérica se ha enriquecido respecto a otras formas multiméricas del polipéptido. La presente invención también se refiere a una composición enriquecida producida por el procedimiento anterior. La presente invención se refiere además a procedimientos para la prevención, tratamiento o mejora de diversas enfermedades. Por último, la presente invención se refiere al uso de composiciones para producir un medicamento para la prevención, tratamiento o mejora de estas diversas enfermedades.

Con la llegada de procedimientos normalizados de producción de polipéptidos y proteínas recombinantes, dichas especies recombinantes se están empleando cada vez más como agentes terapéuticos activos en composiciones farmacéuticas para el tratamiento de patologías humanas. Dado el número de compañías, organizaciones de investigación y laboratorios universitarios que se están embarcando en el desarrollo de polipéptidos y proteínas terapéuticas recombinantes, sólo cabe esperar que el número de composiciones medicinales en las que el efecto terapéutico sea atribuible a un polipéptido o proteína producida de forma recombinante aumente en el futuro.

Debido a su alta afinidad y selectividad de unión, las inmunoglobulinas ("Ig") o anticuerpos representan una clase especialmente relevante de proteínas de alto potencial terapéutico. Han sido de un interés particular en los últimos años los anticuerpos de cadena sencilla producidos de forma recombinante tanto en formas monoespecíficas como biespecíficas. Se desvelan anticuerpos monoespecíficos de cadena sencilla, por ejemplo, en el documento US 4.946.778. Se desvela un anticuerpo de cadena sencilla biespecífico, por ejemplo, en el documento US 5.091.513. Dichos anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos pueden ser de una importancia terapéutica particular, puesto que las dos funcionalidades diferentes dentro de dicha especie pueden reunir espacialmente in vivo de forma selectiva y eficaz dos epítopes diferentes, es decir, en la mayoría de los casos dos antígenos diferentes. Debido al hecho de que una molécula de cadena sencilla biespecífica une dos sitios de unión a antígeno en una sola cadena polipeptídica contigua, dichas moléculas superan los problemas de la capacidad de producción recombinante experimentados por Ig completas debido, por ejemplo, a que estas últimas comprenden una parte Fc.

Ha sido de un interés terapéutico particular el desarrollo de anticuerpos producidos de forma recombinante, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que son capaces de unirse específicamente al antígeno CD3 humano.

El antígeno CD3 está presente tanto en células T auxiliares como en células T citotóxicas. Estas últimas, en concreto las células T citotóxicas, son responsables de la destrucción de células invasoras o infectadas contra las que se han activado las células T citotóxicas. El CD3 humano denota un antígeno que se expresa en células T como parte del complejo multimolecular de células T y que comprende tres cadenas diferentes: CD3-épsilon, CD3-delta y CD3-gamma.

La activación del potencial citotóxico de las células T es un fenómeno complejo que requiere la interacción de múltiples proteínas. La proteína receptora de célula T ("TCR") es un heterodímero unido a disulfuro unido a membrana constituido por dos subunidades glucoproteicas diferentes. El TCR reconoce y se une a un antígeno peptídico extraño que por sí mismo se ha unido por un miembro de la muy diversa clase de proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad ("MHC") y se ha presentado, unido al MHC, en la superficie de células presentadoras de antígeno ("APC").

Aunque el TCR variable se une a un antígeno extraño como se ha resumido anteriormente, la señalización a la célula T de que esta unión ha tenido lugar depende de la presencia de otras proteínas de señalización invariantes asociadas con el TCR. Estas proteínas

\hbox{de señalización en forma asociada se
denominan en su conjunto el complejo  CD3.}

En resumen, la activación de la citotoxicidad de células T depende normalmente en primer lugar de la unión del TCR con una proteína de MHC, unida por sí misma a un antígeno extraño, localizada en una célula separada. Sólo cuando ha tenido lugar esta unión inicial TCR-MHC puede seguirse de la cascada de señalización dependiente de CD3 responsable de la expansión clonal de células T y, en última estancia, de la citotoxicidad de células T.

Sin embargo, se ha descubierto anteriormente que ciertos sitios de unión a antígeno polipeptídicos producidos de forma recombinante que se unen específicamente a al menos parte del antígeno CD3 humano tienen la capacidad de activar células T para ejercer un efecto citotóxico sobre otras células en ausencia de unión TCR-MHC independiente. Esto significa que las células T pueden activarse citotóxicamente de una forma clonalmente independiente, es decir, de una forma que es independiente del clon de TCR específico que lleva la célula T. Esto permite una activación de todo el compartimento de células T en lugar de sólo células T específicas de una identidad clonal determinada. Dichas moléculas se han desvelado en los documentos EP 1348715; WO 99/54440; Mack, J. Immunol. (1997) 158, 3965-70; Mack, PNAS (1995) 92, 7021-5; Kufer, Cancer Immunol. Immunother. (1997) 45, 193-7; Löffler, Blood (2000) 95, 2098-103; Brühl, J. Immunol. (2001) 166, 2420-6.

El tipo de actividad biológica descrito anteriormente, es decir, la capacidad de un polipéptido para (re)dirigir selectivamente el potencial citotóxico de células T citotóxicas contra células diana predeterminadas de modo que se lisen estas últimas puede ser de una gran importancia terapéutica. En concreto, composiciones de polipéptidos tales como los descritos en el párrafo anterior pueden usarse y se han usado eficazmente como parte de un régimen de terapia que supone la destrucción de células diana asociadas con enfermedades particulares. En particular, dichas enfermedades incluyen estados cancerosos en los que las células transformadas son las células diana destinadas a su destrucción.

Además de tener la clase de actividad biológica descrita anteriormente, es decir, la capacidad de dirigir la citotoxicidad de células T a las células diana destinadas a su destrucción, las composiciones que comprenden polipéptidos de la clase descrita anteriormente manifestarán a menudo otros tipos adicionales de actividades biológicas no relacionadas con la lisis de células diana. Dichas actividades biológicas adicionales pueden o no ser beneficiosas y, si dicha composición está destinada a la administración a un paciente, es posible que compliquen la construcción de un régimen terapéutico. Por lo tanto, sería deseable eliminar dichos tipos adicionales de actividades biológicas en la mayor medida en que sea posible en dicha composición, de modo que el tipo de actividad biológica manifestada por la composición resultante permanezca tan homogéneo como sea posible.

Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar una composición que supere las dificultades anteriores.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición con un polipéptido. El polipéptido comprende al menos dos sitios de unión a antígeno, en el que dichos al menos dos sitios de unión a antígeno se localizan en una sola cadena polipeptídica y en el que

\bullet: uno de dichos al menos dos sitios de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD3 humano;

\bullet: dicho polipéptido puede existir tanto en forma monomérica como en forma multimérica, siendo dicha forma monomérica dicha cadena polipeptídica sencilla (con los al menos dos sitios de unión a antígeno) y comprendiendo dicha forma multimérica al menos dos de dichas cadenas polipeptídicas sencillas asociadas no covalentemente entre sí, comprendiendo de este modo al menos cuatro sitios de unión a antígeno; y

\bullet: dicha forma multimérica de dicho polipéptido constituye no más del 5% del peso total de las formas monomérica y multimérica combinadas de dicho polipéptido.

Las expresiones "polipéptido multimérico", "polipéptido en forma multimérica", "multímero", etc., como se usan en el presente documento, son expresiones equivalentes y se contempla que se refieren a (i) diferentes isoformas dentro de una población de moléculas polipeptídicas multiméricas en el mismo grado (por ejemplo, isoformas diméricas diferentes) y/o (ii) una población de moléculas polipeptídicas que son multiméricas en diferentes grados (por ejemplo, dímeros, trímeros, etc.).

La expresión "sitio de unión a antígeno" debe entenderse como una parte de la estructura polipeptídica secundaria y/o terciaria que se une específicamente a un antígeno de interés de una forma no covalente por medio de un epítope del antígeno. En lo sucesivo en el presente documento, debería tenerse en cuenta que los antígenos se unen por medio de un epítope específico o por medio de epítopes específicos de dichos antígenos. La unión "específica" denota la capacidad para distinguir entre antígenos diferentes como compañeros de unión potenciales en la medida en que, de una combinación de una pluralidad de antígenos diferentes como compañeros de unión potenciales, sólo se una, o se una significativamente, el antígeno de interés. Dentro del significado de la invención, un antígeno está unido "significativamente" cuando de entre una combinación de antígenos diferentes igualmente accesibles como compañeros de unión potenciales, el antígeno de interés se une al menos 10 veces, preferentemente 50 veces, más preferentemente 100 veces o más veces más frecuentemente (en un sentido cinético) que otros antígenos que no sean el antígeno de interés.

Mientras que uno de los al menos dos sitios de unión a antígeno del polipéptido comprendido en la composición de la invención se une específicamente al antígeno CD3 humano, se permite que el al menos otro sitio de unión a antígeno de este polipéptido se una específicamente a cualquier otro antígeno (o epítope) de interés ("antígeno diana"). Preferentemente, el antígeno diana es un antígeno expresado en la superficie de una célula, donde la célula que expresa el epítope/antígeno diana puede ser una célula libre, tal como un linfocito en el torrente sanguíneo, o puede formar parte de un tejido sólido. De esta forma, el polipéptido comprendido en la composición de la invención puede, con un brazo (es decir, un sitio de unión a antígeno o el "sitio de unión a antígeno diana"), unirse específicamente al antígeno diana, mientras que un/el segundo brazo (es decir, otro/el otro sitio de unión a antígeno o el "sitio de unión a antígeno efector") del polipéptido comprendido en la composición se une específicamente a y activa, por medio del antígeno CD3 humano, una célula T citotóxica de una forma clonalmente independiente como se ha descrito anteriormente. De esta forma, el polipéptido comprendido en la composición de acuerdo con la invención puede emplearse en general como parte de un régimen terapéutico para destruir específicamente, por medio de la célula T citotóxica, un tipo celular determinado.

Como se ha insinuado anteriormente, el polipéptido comprendido en la composición de acuerdo con la invención es, por tanto, biológicamente activo. Las expresiones "biológicamente activo" y "actividad biológica", como se usan en el presente documento, denotan la naturaleza de un efecto causado por el polipéptido comprendido en la composición de acuerdo con la invención cuando dicho polipéptido se pone en un entorno in vitro, ex vivo o in vivo. Como se usa en el presente documento, la actividad biológica se refiere por lo tanto a los tipos de efectos biológicos generados más que a la magnitud de un efecto determinado.

Se ha descubierto sorprendentemente que la actividad biológica de la forma monomérica del polipéptido comprendido en la composición de la invención es mucho más homogénea que la de la forma multimérica de este polipéptido. Es decir, la forma monomérica del polipéptido demuestra un solo tipo de actividad biológica (es decir, activación y redireccionamiento de la actividad citotóxica de células T contra células diana destinadas a su destrucción), mientras que la forma multimérica, por ejemplo, la forma dimérica del polipéptido, demuestra múltiples tipos de actividad biológica que son diferentes de los manifestados por la forma monomérica del polipéptido.

Sin quedar ligado a teoría alguna, se piensa que la mayor diversidad de la actividad biológica observada para la forma multimérica del polipéptido comprendido en la composición de la invención podría deberse al menos en parte al mayor número de modos de asociación molecular disponibles para el multímero en comparación con el monómero. Es decir, que estadísticamente, existe un mayor número de formas por las que una especie multimérica compuesta por una pluralidad de cadenas polipeptídicas sencillas puede asociarse y plegarse de las que existen para las especies monoméricas correspondientes compuestas por una sola cadena polipeptídica sencilla. Esta idea se confirma por varios descubrimientos de los inventores y se analizan en detalle en lo sucesivo en el presente documento.

Las especies monoméricas del polipéptido comprendido en la composición de la invención presentan una sola actividad biológica. Como se ha explicado anteriormente, ésta es la capacidad para reclutar las células T citotóxicas ("CTL") contra otras células que no son CTL y que llevan en su superficie un antígeno que se une específicamente por el/un sitio de unión a antígeno diana.

Aunque también manifiesten parcialmente una actividad biológica como la observada para las especies monoméricas, una o más de las especies multiméricas de dicho polipéptido dan origen también a actividades biológicas adicionales. Por ejemplo, se observó que la especie polipeptídica multimérica conducía a una disminución en el número de CTL presentes en una muestra. Aunque sin quedar ligado a teoría alguna, los inventores piensan que esta actividad biológica se debe probablemente a la asociación intermolecular de al menos dos moléculas de polipéptido monomérico por medio de sus sitios de unión a antígeno respectivos. De esta forma, se forma una especie multimérica en la que, por ejemplo, los sitios de unión a antígeno diana se acoplan mutuamente entre sí y, por lo tanto, dejan de estar disponibles para la unión al antígeno diana, mientras que cada sitio de unión a antígeno efector específico para el antígeno CD3 humano permanece libre para unirse a un antígeno CD3 respectivo. De esta forma, se forma una especie que es capaz de unirse específicamente a al menos dos moléculas diferentes del antígeno CD3 humano por epítopes idénticos. Dichas especies serían capaces de unirse simultáneamente a al menos dos CTL separados, un escenario en el que uno de estos al menos dos CTL podría ejercer su efecto citotóxico sobre cualquier otro de los al menos dos CTL. Este tipo de actividad biológica, en la que se lisan otras células distintas a las células diana destinadas a su destrucción (es decir, las propias células T citotóxicas), podrían disminuir el número total de CTL presentes en una muestra. Esto podría disminuir el número de dichas células T citotóxicas disponibles para participar en el tipo de actividad biológica manifestada por las especies monoméricas, en concreto la destrucción selectiva, por medio de lisis mediadas por células T, de células diana enfermas.

Además, los inventores han reconocido que las formas multiméricas del polipéptido como está comprendido en la composición de la invención son capaces de activar CTL incluso en ausencia de otros tipos de células que no son CTL. Normalmente, las especies monoméricas del polipéptido comprendido en la composición de la invención activan el potencial citotóxico de CTL sólo en presencia de las células ("células diana") que presentan el antígeno que está unido por el sitio de unión a antígeno diana, estando por consiguiente dichas células destinadas a su destrucción por los CTL. La activación del CTL por el polipéptido de la presente composición sólo en presencia de dichas células diana evita ventajosamente un posible direccionamiento erróneo de la actividad citotóxica de CTL hacia células no diana no destinadas a su destrucción.

Los inventores han descubierto también que la tendencia a formar una especie multimérica, especialmente una especie dimérica, es una propiedad de esta clase de polipéptidos en general, en concreto cadenas polipeptídicas sencillas que comprenden tanto un sitio de unión para el antígeno CD3 humano como un sitio de unión para otro antígeno diana distinto del antígeno CD3 humano. Las actividades biológicas adicionales anteriores pueden esperarse por lo tanto para cualquier polipéptido de esta clase, independientemente de la especificidad del sitio de unión a antígeno
diana.

Como se desprende de las explicaciones anteriores, una composición que comprende solamente una cantidad mínima controlada de polipéptido en forma multimérica y en la que el polipéptido total está sustancialmente en forma monomérica demostrará una actividad biológica más homogénea que una composición que contenga una mayor cantidad de polipéptido multimérico. Al establecer un límite superior para la cantidad de polipéptido multimérico en la composición de la invención, se obtiene una composición para la que el grado de homogeneidad en la actividad biológica está controlado y es previsible. La capacidad de control y la previsibilidad de la actividad biológica son dos características que son preferibles para la composición contemplada para la administración como parte de un régimen terapéutico.

\newpage

De acuerdo con una realización de la composición de acuerdo con la invención, la forma multimérica del polipéptido constituye no más del 4%, preferentemente no más del 3%, más preferentemente no más del 2%, aún más preferentemente no más del 1%, aún más preferentemente no más de 0,5% del peso total combinado del polipéptido tanto en forma monomérica como multimérica en la composición. Más preferentemente, las formas multiméricas del polipéptido constituyen solamente, o incluso menos que, el límite detectable de las formas multiméricas del polipéptido en la composición, estando la inmensa mayoría del polipéptido presente en la composición en forma
monomérica.

Las expresiones "límite detectable" y "límite de detección", como se usan en el presente documento, son expresiones equivalentes y debe entenderse que denotan una cantidad de polipéptido multimérico en la presente composición por debajo de la cual no es posible en absoluto la detección de dicho polipéptido multimérico, aun cuando se aplica el ensayo más riguroso con sus condiciones más rigurosas. Los procedimientos adecuados para determinar la cantidad de polipéptido multimérico en la presente composición incluyen cualquier procedimiento de detección de especies polipeptídicas, por ejemplo, por electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, en la que las proteínas se tiñen en el gel con azul brillante de Coomassie o nitrato de plata, por análisis de transferencia de Western o procedimientos cromatográficos tales como HPLC de exclusión por tamaño. Preferentemente, el control de la cantidad de polipéptido multimérico presente en la composición puede efectuarse mejor por HPLC analítica de exclusión por tamaño. Por la naturaleza de la expresión, el "límite detectable" dependerá de la sensibilidad del procedimiento de detección particular usado para ensayar la cantidad de forma multimérica del polipéptido presente en una composición dada. Además, el límite "detectable" dependerá claramente de cómo de rigurosamente se apliquen los parámetros de ensayo para un procedimiento de elección dado.

En una realización adicional, la forma multimérica del polipéptido como se ha descrito anteriormente es exclusivamente la forma dimérica del polipéptido. La forma "dimérica" debe entenderse como una especie que comprende dos cadenas polipeptídicas sencillas, en la que las dos cadenas polipeptídicas sencillas están asociadas no covalentemente entre sí.

Se contempla una composición que comprende un polipéptido que por sí mismo comprende dos sitios de unión a antígeno y en el que cada sitio de unión a antígeno comprende una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo (VH) y una región variable de una cadena ligera de un anticuerpo (VL), teniendo cada par de VH/VL especificidad por un epítope diferente, preferentemente por un antígeno diferente, siendo uno de ellos el antígeno CD3 humano. Las regiones VH y VL dentro de un sitio de unión a antígeno dado pueden proceder del mismo anticuerpo o de anticuerpos diferentes. El sitio de unión anti-CD3 puede localizarse en el extremo N- o C-terminal del polipéptido. Dentro del significado de la presente invención, debe entenderse que "VH/VL" o "par VH/VL" denotan cualquier orden de conectividad; VH-VL o VL-VH. Aunque teóricamente es posible la unión covalente directa (peptídica) del aminoácido C-terminal de una región VH o VL con el aminoácido N-terminal de una región VL o VH, respectivamente, un experto en la materia entenderá que dicha unión peptídica directa confiere a menudo demasiados pocos grados de libertad espacial para permitir que la región VH y VL se asocien de modo que sus regiones CDR respectivas puedan formar un solo sitio de unión a antígeno unificado. Un experto en la materia entenderá por lo tanto que dicha asociación no covalente de regiones VH y VL que concuerda con el mantenimiento de la capacidad para unirse específicamente a un antígeno de elección hará a menudo preferible la inclusión de un enlazador peptídico interpuesto entre las regiones VH y VL. Dicho enlazador peptídico puede adoptar la forma de enlazadores desvelados en la técnica, por ejemplo, en los documentos EP 0 623 679 B1, US 5.258.498, EP 0 573 551 B1 y US
5.525.491.

Un experto en la materia apreciará que podría esperarse que una molécula de este tipo forme varias formas diméricas diferentes. Por ejemplo, podría esperarse que las regiones VH y VL que componen el sitio de unión a antígeno diana de una molécula polipeptídica monomérica se asocien de una forma lineal antiparalela con las regiones VL y VH respectivas que componen el sitio de unión a antígeno diana de otra molécula polipeptídica monomérica. Esto produciría un polipéptido dimérico en el que los dos sitios de unión a antígeno específicos para el antígeno CDE3 humano permanecerían libres para unirse específicamente a dos antígenos CD3 humanos distintos. También podría esperarse que las regiones VH y VL que componen la especificidad de unión a antígeno CD3 de una molécula polipeptídica monomérica se asocien de una forma lineal antiparalela con las regiones VL y VH respectivas que componen la especificidad de unión a antígeno CD3 de otra molécula polipeptídica monomérica. Esto produciría un polipéptido dimérico en el que los dos sitios de unión a antígeno específicos para el antígeno diana permanecerían libres para unirse específicamente a dos antígenos diana distintos. También se contemplan emparejamientos entre regiones VH y/o VL del sitio de unión a antígeno diana en una molécula polipeptídica monomérica con regiones VH y/o VL del sitio de unión a antígeno efector específico para el antígeno CD3 humano en otra molécula polipeptídica monomérica. Aquí, uno esperaría que la molécula polipeptídica dimérica resultante conservase la capacidad para unirse al menos parcialmente a cada uno de el antígeno CD3 humano y el antígeno diana de una forma específica. Los ejemplos anteriores no son limitantes en términos de las especies diferentes de polipéptidos diméricos que pueden formarse por el polipéptido comprendido en la composición de la invención. Claramente, pueden contemplarse una pluralidad de especies diméricas diferentes, explicando posiblemente la actividad biológica heterogénea observada para un polipéptido multimérico, en particular para un polipéptido dimérico.

De acuerdo con otra realización de la invención, la composición puede comprender polipéptidos en los que un solo sitio de unión a antígeno comprende dos regiones VH asociadas no covalentemente en la misma cadena polipeptídica, estando las dos regiones VH separadas por un enlazador peptídico como se ha descrito anteriormente, o dos regiones VL asociadas no covalentemente en la misma cadena polipeptídica, estando las dos regiones VL separadas por un enlazador peptídico como se ha descrito anteriormente.

Está previsto que las regiones VH y/o VL de un sitio de unión a antígeno dado pueden proceder de fuentes diferentes, por ejemplo de dos anticuerpos monoclonales diferentes que pueden o no tener su origen en dos organismos de la misma especie, o pueden estar modificados (es decir, quiméricos, truncados, humanizados, desinmunizados,
etc.).

En una realización especialmente preferida, el polipéptido comprendido en la presente composición comprende dos sitios de unión a antígeno, en el que cada sitio de unión a antígeno comprende una región VH y una región VL. En esta realización, los dos sitios de unión a antígeno están conectados covalentemente entre sí a través de un espaciador peptídico corto, y cada sitio de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno diferente. Como tal, un polipéptido de acuerdo con esta realización estaría representado por la fórmula genérica:

N-(VH_{a}/VL_{a})-L-(VL_{a}/VH_{a})-S-(VH_{b}/VL_{b})-L-(VL_{b}/VH_{b})-C,

en la que:

\bullet: un par respectivo "VH/VL" o "VL/VH" representa una opción mutuamente excluyente de escoger VH o VL en esa posición;

\bullet: "a" y "b" (en subíndice) representan la especificidad por el antígeno a y b, respectivamente;

\bullet: "L" representa un enlazador peptídico que conecta covalentemente una VH y VL o una VL y VH respectivas dentro de un solo sitio de unión a antígeno dado, como se ha analizado anteriormente;

\bullet: "S" representa un espaciador peptídico, que es una región polipeptídica que conecta covalentemente el sitio de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno a con el sitio de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno b; y

\bullet: "N" y "C" representan los extremos N- y C-terminales respectivos del polipéptido.

Como tal, la presente realización prevé una composición como se expone en el presente documento, que comprende un polipéptido con dos sitios de unión a antígeno diferentes, en el que cada sitio de unión a antígeno comprende una región VH y una región VL conectadas por un enlazador peptídico, y en el que los dos sitios de unión a antígeno están conectados a través de un solo espaciador polipeptídico. Por lo tanto, se genera una cadena polipeptídica sencilla en la que se localizan dos sitios de unión a antígeno de especificidades diferentes. Un experto en la materia reconocerá una especie de esta forma general como un "anticuerpo biespecífico de cadena sencilla".

Se incluye en el alcance de la composición de la invención que el polipéptido comprendido en la misma, y como se representa por la fórmula genérica anterior, puede incluir opcionalmente otras funcionalidades tales como un marcador His o un marcador Flag u otras formas de marcadores funcionales.

En una realización particularmente preferida de la invención, la composición comprende un polipéptido en el que el otro de los al menos dos sitios de unión a antígeno, es decir, el sitio de unión a antígeno diana, se une específicamente al antígeno CD19 humano. El antígeno CD19 se expresa en todo el linaje B humano, desde la célula pro-B hasta la célula B madura, no está protegido, se expresa uniformemente en todas las células de linfoma y está ausente en células madre. Por lo tanto, una composición de acuerdo con esta realización, en concreto una que comprende un polipéptido con un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno CD3 humano, así como un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno CD19 humano, es de gran valor potencial como producto terapéutico. La actividad biológica de la forma monomérica del polipéptido comprendido en una composición recluta ventajosamente el potencial citotóxico de células T contra células B en un sujeto (como se ha explicado anteriormente). Mediante el control de la proporción de multímero:monómero de polipéptido como se ha expuesto anteriormente, se obtiene una composición que puede usarse ventajosamente para tratar trastornos relacionados con células B de una forma extremadamente controlada y, por lo tanto, terapéuticamente eficaz.

Se prefiere especialmente una composición en la que el polipéptido con especificidades de unión tanto por el antígeno CD3 humano como por el antígeno CD19 humano tiene una secuencia de aminoácidos equivalente a, o sustancialmente equivalente a, cualquiera de las expuestas en las SEC ID Nº: 1-6 siguientes:

\bullet: Representación esquemática de la SEC ID Nº 1: VL(CD19)-L-VH(CD19)-S-VH(CD3)-L-VL(CD3);

\bullet: Representación esquemática de la SEC ID Nº 2: VH(CD19)-L-VL(CD19)-S-VH(CD3)-L-VL(CD3);

\bullet: Representación esquemática de la SEC ID Nº 3: VH(CD3)-L-VL(CD3)-S-VH(CD19)-L-VL(CD19); o

\bullet: Representación esquemática de la SEC ID Nº 4: VH(CD3)-L-VL(CD3)-S-VL(CD19)-L-VH(CD19),

\bullet: Representación esquemática de la SEC ID Nº 5: VL(CD3)-L-VH(CD3)-S-VH(C19)-L-VL(CD19),

\bullet: Representación esquemática de la SEC ID Nº 6: VL(CD3)-L-VH(CD3)-S-VL(CD19)-L-VH(CD19),

en las que:

\bullet: VH(CD19) y VL(CD19) representan una región VH y una región VL, respectivamente, que se asocian entre sí para formar un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno CD19 por medio de un epítope del antígeno CD19;

\bullet: VH(CD3) y VL(CD3) representan una región VH y una región VL, respectivamente, que se asocian entre sí para formar un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno CD3 por medio de un epítope del antígeno CD3 humano;

\bullet: "L" y "S" son como se han definido anteriormente.

Dentro de esta realización, se entiende que la expresión "sustancialmente equivalente a" comprende secuencias de aminoácidos homólogas a cualquiera de las SEC ID Nº: 1-6 en al menos el 70%, basándose en una comparación de la secuencia de aminoácidos primaria. Dichos grados de homología pueden determinarse mediante programas de alineamiento de secuencias convencionales tales como Vector NTI (InforMax^{TM}, Maryland, Estados Unidos). Dichos programas comparan las secuencias alineadas en base a aminoácido por aminoácido y pueden ajustarse a diversos niveles de rigurosidad para la comparación (por ejemplo, aminoácido idéntico, sustitución de aminoácido conservativa, etc.). Dentro del significado de esta realización, se considera que dos aminoácidos en cuestión son "homólogos" cuando son idénticos entre sí o sustituciones conservativas el uno del otro. A modo de ejemplo no limitante, dos aminoácidos diferentes que pertenecen a la clase de aminoácidos lipófilos se considerarían homólogos en el sentido de esta realización, incluso si estos dos aminoácidos no fueran idénticos, mientras que un aminoácido lipófilo por un lado y un aminoácido ácido cargado por otro lado no se considerarían homólogos.

En otra realización preferida de la invención, la composición comprende un polipéptido en el que el otro de los al menos dos sitios de unión a antígeno, es decir, el sitio de unión a antígeno que no se une específicamente al antígeno CD3 humano, se une específicamente al antígeno EpCAM humano ("molécula de adhesión celular epitelial", también denominada antígeno 17-1A, KSA, EGP40, GA733-2, ks1-4 o esa). La EpCAM es una glucoproteína integral de membrana de 40 kDa de 314 aminoácidos con expresión específica en ciertos epitelios y en muchos carcinomas humanos. Se ha demostrado en diversos estudios que la EpCAM es beneficiosa en el diagnóstico y la terapia de diversos carcinomas. Además, en muchos casos, se observó que las células tumorales expresaban EpCAM en un grado mucho mayor que sus formas epiteliales precursoras o menos agresivas de dichos cánceres.

Para obtener una composición de acuerdo con la invención partiendo de una composición que comprende polipéptido tanto en forma monomérica como multimérica, a menudo es necesario ajustar la cantidad (es decir, peso presente en la composición) de polipéptido en forma monomérica respecto a la cantidad (es decir, peso presente en la composición) de polipéptido en forma multimérica. Como el peso del polipéptido en forma multimérica en composiciones sin tratar, por ejemplo, lisados de la recogida de células obtenidos después de la expresión de proteínas, superará a menudo el 5% del peso total de las formas monomérica y multimérica combinadas del polipéptido, a menudo será necesario enriquecer el contenido del polipéptido en forma monomérica respecto al contenido del polipéptido en forma multimérica para obtener la composición de la invención. En general, las posibilidades incluyen HPLC de intercambio iónico de alta resolución, cromatografía de exclusión por tamaño de alta resolución, purificación en gel, control de las condiciones de expresión de proteínas (por ejemplo, elección de huésped de expresión, condiciones de cultivo aplicadas al huésped, vector de expresión usado, tipo de promotor usado, etc.). Se proporcionan detalles ventajosos en los ejemplos adjuntos al presente documento.

Para efectuar el enriquecimiento mencionado anteriormente, otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento de producción de una composición en el que la cantidad de polipéptido en forma monomérica se ha enriquecido respecto a la cantidad de dicho polipéptido en forma multimérica. El procedimiento comprende las siguientes etapas:

a): proporcionar la composición que comprende dicho polipéptido tanto en forma multimérica como monomérica;

b): aislar dicho polipéptido tanto en forma multimérica como monomérica de dicha composición, efectuándose dicho aislamiento por

(b1): aplicación de dicha composición a un primer material cromatográfico que comprende un ión metálico, que es el ión Zn^{2+} o Ni^{2+};

(b2): eliminación de cualquier componente de dicha composición que no se haya unido a dicho primer material cromatográfico por lavado de dicho primer material cromatográfico con un primer tampón; y

(b3): elución de dicho polipéptido, tanto en forma multimérica como monomérica, de dicho primer material cromatográfico por aplicación de imidazol a dicho primer material cromatográfico en una concentración que varía de 60 mM a 300 mM;

(b4): recogida de un primer eluido que comprende dicho polipéptido en forma multimérica y dicho polipéptido en forma monomérica;

c): realizar una etapa precursora, es decir, preparatoria para que se produzca la separación de dicho polipéptido en forma multimérica de dicho polipéptido en forma monomérica en la etapa (d), efectuándose dicha etapa precursora por

(c1): aplicación de dicho primer eluido a un segundo material cromatográfico, que es un material de intercambio iónico;

(c2): eliminación de cualquier componente del primer eluido que no se haya unido a dicho segundo material cromatográfico por lavado de dicho segundo material cromatográfico con un segundo tampón;

(c3): elución de dicho polipéptido en forma multimérica y monomérica de dicho segundo material cromatográfico por aplicación de cloruro sódico a dicho segundo material cromatográfico en una concentración que varía de 200 mM a 500 mM;

(c4): recogida de un segundo eluido;

d): realizar una separación de dicho polipéptido en forma multimérica de dicho polipéptido en forma monomérica, efectuándose dicha separación por

(d1): aplicación de dicho segundo eluido a un tercer material cromatográfico que permita la separación basándose en el peso molecular;

(d2): translocación de los componentes del segundo eluido aplicado a lo largo de dicho tercer material cromatográfico por aplicación de un tampón de procesamiento a dicho tercer material cromatográfico;

(d3): recogida de un tercer eludido en fracciones;

e): analizar dichas fracciones de dicho tercer eluido individualmente para obtener una medida de la cantidad de dicho polipéptido en forma monomérica respecto a la cantidad de polipéptido en forma multimérica en cada fracción; y

f): combinar las fracciones de dicho tercer eluido que (casi) exclusivamente contienen el polipéptido en forma monomérica para obtener una composición enriquecida en el polipéptido en forma monomérica.

Dentro del significado de la invención, la expresión "una composición que está enriquecida en la forma monomérica del polipéptido" y similares es cualquier composición cuya proporción de monómero:multímero se ha ajustado para adaptarse a la presente invención. Ésta podría ser un lisado celular sin tratar según se obtiene después de la producción de polipéptido recombinante o una composición que ya se ha sometido a cierto grado de enriquecimiento, pero que todavía no cumple los criterios deseados en relación con la proporción de formas monoméricas respecto a multiméricas de polipéptido presentes.

Se contempla que el "primer material cromatográfico" y el "segundo material cromatográfico" se usen como parte de un procedimiento discontinuo o en una columna cromatográfica. Preferentemente, se usarán columnas de cromatografía. Un experto en la materia estará familiarizado con la selección, rellenado y preparación de dichas columnas de cromatografía antes de la cromatografía de proteínas.

De acuerdo con el procedimiento anterior, el primer material cromatográfico que comprende un ión metálico es un material cromatográfico que comprende un ión metálico divalente, por ejemplo, el ión Ni^{2+} o Zn^{2+}. Un primer material cromatográfico ventajoso es Fractogel® EMD Chelating (Merck), que se ha cargado previamente con Zn^{2+}. Usando dicho primer material cromatográfico, es ventajosamente posible aislar el polipéptido, ya sea en forma monomérica o multimérica, de los componentes extraños presentes típicamente, por ejemplo, en un lisado celular sin tratar. La coexpresión de un marcador funcional como parte del polipéptido, por ejemplo un marcador His o un marcador Flag, puede facilitar este asilamiento.

De acuerdo con otra realización preferida, el segundo material cromatográfico permite la separación basándose en el intercambio aniónico. Un segundo material cromatográfico ventajoso a este respecto es Q Sepharose HP (Amersham Biosciences).

Como es típico en la cromatografía de proteínas, es ventajoso equilibrar los materiales cromatográficos, preferentemente introducidos en columnas, con un tampón antes de realizar realmente la cromatografía de proteínas. Después de la aplicación de la composición o eluido a asilar o separar en el material cromatográfico, este mismo tampón se usa para eliminar por lavado cualquier material que no se haya unido al material cromatográfico. El volumen del primer y segundo tampones usados para lavar las sustancias no unidas del primer y segundo materiales cromatográficos respectivamente se corresponde ventajosamente con de 6 a 10 veces, preferentemente 6 veces el volumen del material cromatográfico respectivo usado. El volumen del tampón de procesamiento usado para translocar sustancias a lo largo del tercer material cromatográfico se corresponde ventajosamente con de 1 a 2 veces, preferentemente 1 vez el volumen del material cromatográfico usado. El tampón fosfato (pH 8) es ventajoso como tanto el primer tampón como el segundo tampón, mientras que el tampón fosfato (pH 7,0-7,5) o el tampón citrato/lisina (pH 6,0-7,5) es ventajoso como el tampón de procesamiento.

De acuerdo con una realización preferida del procedimiento de la invención, dicho procedimiento comprende la etapa adicional de analizar la composición obtenida en la etapa (e). De este forma, se puede obtener una medida de la cantidad de dicho polipéptido en forma monomérica respecto a la cantidad de polipéptido en forma multimérica en la composición. Si se desea o se determina necesario, puede seguir un enriquecimiento adicional por repetición de las etapas (d) a (e). En dicha repetición, la composición que se obtiene como resultado de la vuelta de enriquecimiento anterior se aplica al tercer material cromatográfico en lugar del segundo eluido. Por lo tanto, el procedimiento de enriquecimiento de la forma monomérica del polipéptido de modo que esta forma no esté presente más que en la proporción establecida o deseada dentro de la composición puede ser un procedimiento iterativo que puede repetirse tan a menudo como sea necesario o se desee hasta que se haya alcanzado un grado de enriquecimiento dado en la cantidad del polipéptido en forma monomérica. Típicamente, sin embargo, debería ser suficiente una vuelta de enriquecimiento para generar una composición que se adapte a los criterios fijados para la composición como se ha definido en el presente documento.

Es ventajoso realizar dicho análisis opcional usando un procedimiento cromatográfico que separe sustancias basándose en su peso molecular. Preferentemente, dicho procedimiento cromatográfico es una cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento realizada en un aparato de HPLC. Un experto en la materia entenderá cómo ajustar parámetros de HPLC tales como el flujo, la presión y la naturaleza del tampón de fase móvil usado. El análisis posterior mediante HPLC de exclusión por tamaño tiene la ventaja de que pueden determinarse cantidades relativas de formas monoméricas y multiméricas de polipéptido con un alto grado de exactitud y sensibilidad.

En el procedimiento de la invención, dicho imidazol de la etapa (b3) puede aplicarse como una sola concentración o puede aplicarse como un gradiente de concentración que varía de 60 a, por ejemplo, 300 mM. Asimismo, dicho cloruro sódico de la etapa (c3) puede aplicarse al segundo material de cromatografía como una sola concentración o puede aplicarse como un gradiente de concentración que varía de 200 a, por ejemplo, 500 mM. Dichos gradientes de concentración pueden ser un gradiente por etapas, es decir, un gradiente en el que la concentración de, por ejemplo, imidazol 60 mM/cloruro sódico 200 mM se mantiene durante un periodo de tiempo antes de cambiar a una concentración de, por ejemplo, 70 mM/cloruro sódico 220 mM, que se mantiene durante un periodo de tiempo antes de cambiar a la siguiente concentración, y así sucesivamente. El gradiente de concentración también puede ser un gradiente que no sea por etapas, es decir, un gradiente en el que la concentración de imidazol/cloruro sódico se aumente a una velocidad lineal constante con el tiempo. En el caso de que se use una sola concentración de imidazol, son concentraciones ventajosas 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM o 120 mM. En el caso de que se use una sola concentración de cloruro sódico, son concentraciones ventajosas 370 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM o 420 mM.

En una realización especialmente ventajosa de la invención, el imidazol se aplica en una sola concentración de 80 mM al primer material cromatográfico. En otra realización ventajosa de la invención, el cloruro sódico se aplica en una sola concentración de 400 mM al segundo material cromatográfico. Se prefiere particularmente una combinación de estas realizaciones ventajosas. La aplicación de imidazol y cloruro sódico en las concentraciones respectivas anteriores tiene el efecto ventajoso de que la distribución de la forma monomérica del polipéptido y la especie de elución más próximas de la forma multimérica del polipéptido, en concreto la forma dimérica del polipéptido, se resuelven como dos picos distintos, es decir, no superpuestos, de polipéptido en la segunda etapa de separación posterior (d). La separación de dos especies polipeptídicas, aquí las formas monomérica y dimérica del polipéptido, con dicha resolución basal permite que se obtenga la forma monomérica del polipéptido en un mayor rendimiento libre de impurezas de la forma dimérica correspondiente del polipéptido. Esto a su vez aumenta la probabilidad de obtener fracciones de la segunda separación que contengan exclusivamente o predominantemente el polipéptido en forma monomérica. Como tal, la resolución ventajosa conseguida mediante las dos concentraciones anteriores de imidazol y cloruro sódico usadas juntas aumenta la eficacia con la que puede obtenerse una composición enriquecida en lo que respecta a la forma monomérica del polipéptido.

Un aspecto adicional de la invención es una composición (que puede obtenerse mediante el procedimiento anterior de obtención de una composición) que está enriquecida en la forma monomérica respecto a la forma multimérica del polipéptido. Por lo tanto, el procedimiento y uso de las reivindicaciones 20 a 25 adjuntas puede realizarse/producirse ventajosamente con la composición obtenida por dicho procedimiento anterior.

Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa, de un cáncer mínimo residual, de una enfermedad tumoral, de una enfermedad inflamatoria, de un trastorno inmunológico, de una enfermedad autoinmune, de una enfermedad infecciosa, de una enfermedad vírica, de una reacción alérgica, de una reacción parasitaria, de una enfermedad de injerto contra huésped, de una enfermedad de huésped contra injerto o de un tumor maligno de células B. De acuerdo con este aspecto, la composición, como se ha desvelado en el presente documento anteriormente, se administra a un sujeto que necesite dicha prevención, tratamiento o mejora.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un uso de la composición, como se ha desvelado anteriormente en el presente documento, para la producción de un medicamento para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa, de un cáncer mínimo residual, de una enfermedad tumoral, de una enfermedad inflamatoria, de un trastorno inmunológico, de una enfermedad autoinmune, de una enfermedad infecciosa, de una enfermedad vírica, de una reacción alérgica, de una reacción parasitaria, de una enfermedad de injerto contra huésped, de una enfermedad de huésped contra injerto o de un tumor maligno de células B.

De acuerdo con una realización preferida, la prevención, tratamiento o mejora se produce en un ser humano. La enfermedad tumoral se selecciona preferentemente del grupo constituido por un linfoma, un linfoma de células B y un linfoma de Hodgkin. En una realización preferida, el linfoma de células B es linfoma no Hodgkin. En una realización adicional, la enfermedad autoinmune se selecciona de artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1, enfermedad inflamatoria del intestino, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, esclerodermia y enfermedades tiroideas autoinmunes.

En toda la presente solicitud, debe entenderse que el uso de un término en singular puede implicar, cuando sea apropiado, el uso del término en plural respectivo. De forma similar, el uso de un término en plural puede implicar, cuando sea apropiado, el uso del término en singular respectivo.

La invención se describirá ahora adicionalmente mediante las figuras y ejemplos adjuntos.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1A: Modelo de un polipéptido que comprende dos sitios de unión a antígeno, en el que un sitio de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD3 humano y en el que el polipéptido existe en forma monomérica.

Fig. 1B: Modelo de un polipéptido que comprende dos sitios de unión a antígeno, en el que un sitio de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD3 humano y en el que el polipéptido existe en forma multimérica (aquí, dimérica) debido a la asociación de dos sitios de unión a antígeno diana individuales.

Fig. 1C: Modelo de un polipéptido que comprende dos sitios de unión a antígeno, en el que un sitio de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD3 humano y en el que el polipéptido existe en forma multimérica (aquí, dimérica) debido a la asociación de dos sitios de unión a antígeno efectores individuales específicos para el antígeno CD3 humano.

Fig. 2: Regulación positiva del marcador temprano de células T CD69 en función de la concentración de polipéptido en forma monomérica y multimérica (aquí, dimérica).

Fig. 3A: Lisis mutua de células T en función de la concentración de polipéptido en forma monomérica y multimérica (aquí, dimérica) usando PBMC como células efectoras.

Fig. 3B: Lisis mutua de células T en función de la concentración de polipéptido en forma monomérica y multimérica (aquí, dimérica) usando células MC15 como células efectoras.

Ejemplos y descripción detallada de las figuras

Ejemplo 1

Producción de polipéptido

Partiendo de vectores de expresión eucariotas adecuados, la expresión de un polipéptido que comprende dos sitios de unión a antígeno se realiza en células CHO en un biorreactor de tanque agitado usando un medio sin suero y sin proteína. La fermentación se realiza en un modo semicontinuo a 37ºC con suministro de glucosa. Tras la finalización del procedimiento de fermentación, se recoge el sobrenadante que contiene el polipéptido secretado por filtración frontal y se concentra 10 veces por filtración de flujo cruzado.

Lo siguiente describe cómo puede ajustarse la proporción de la cantidad de polipéptido en forma monomérica respecto a la cantidad de polipéptido en forma multimérica. Como modelo para dicho ajuste, se usa el polipéptido anti-CD19 x anti-CD3 de acuerdo con la SEC ID Nº: 1 (en lo sucesivo en el presente documento "Construcción 1") y la forma multimérica de la Construcción 1 es la forma dimérica de la Construcción 1.

La captura de la Construcción 1 a partir de la recogida de células se realiza usando una columna de cromatografía por afinidad con metal inmovilizado (Fractogel EMD Chelating, Merck) cargada con cinc (Zn^{2+}-IMAC). La columna se equilibra con 2 volúmenes de columna (CV) de tampón fosfato, se aplica la recogida de células a 120-180 cm/h y se elimina por lavado el material no unido con 6 CV de tampón. La aplicación de un gradiente por etapas con imidazol 60-300 mM en tampón fosfato a lo largo de 5 CV eluye el producto. Como alternativa, puede usarse para este fin una concentración individual de imidazol 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM 0 120 mM. Se realiza una purificación intermedia de Construcción 1 empleando cromatografía de intercambio aniónico (AIEX, Q Sepharose HP, Amersham Biosciences). La columna se equilibra con 2 CV de tampón fosfato pH 8,0 y el eluido de la columna IMAC se aplica directamente a la columna. La proteína no unida se elimina por lavado con 6 CV de tampón. El producto se eluye posteriormente con un gradiente por etapas de 6 CV de cloruro sódico 200-500 mM en tampón. Como alternativa, puede usarse para este fin una concentración individual de cloruro sódico 370 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM o 420 mM. El ajuste final se realiza mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) incluyendo una separación de formas monoméricas y diméricas de Construcción 1. Se equilibra una columna de uso de 200 preparaciones Superdex (Amersham Biosciences, altura de lecho >600 mm) con al menos 4 CV de tampón fosfato pH 7,0-7,5 o tampón citrato/lisina pH 6,0-7,5. La muestra (correspondiente a un volumen del 1-5% del CV) se aplica a la columna y se realiza una elución isocrática usando el tampón de equilibrado. El dímero se eluye a aproximadamente 0,5-06 CV, mientras que el monómero se eluye a aproximadamente 0,6 a 0,7 CV (las condiciones de elución exactas puedan variar dependiendo de la longitud de columna, del volumen de muestra y de la calidad del relleno de la columna). El polipéptido eluido está fraccionado y se combinan las fracciones deseadas. Las últimas fracciones contienen una mayor cantidad de Construcción 1 en forma monomérica que las primeras fracciones. La proporción de la cantidad de Construcción 1 monomérica respecto a la cantidad de Construcción 1 dimérica puede estar influenciada por lo tanto por la elección de la fracción usada.

Se ha demostrado que son muy ventajosas combinaciones específicas de los parámetros de elución. En concreto, la elución del polipéptido, por ejemplo, Construcción 1, de la columna de Zn^{2+}-IMAC con una sola concentración de imidazol 80 mM seguida en la etapa siguiente de elución de este polipéptido de la columna de intercambio aniónico con una sola concentración de cloruro sódico 400 mM produce una mezcla de polipéptido que, cuando se resuelve por cromatografía de exclusión por tamaño como se ha descrito anteriormente, da como resultado que la forma monomérica del polipéptido se resuelva a nivel basal de la siguiente mayor forma multimérica del polipéptido, en concreto la forma dimérica del polipéptido. Esta ausencia de superposición de los salientes de picos correspondientes a las formas monomérica y dimérica del polipéptido facilita la obtención de fracciones que contienen exclusivamente o predominantemente la forma monomérica del polipéptido; estas fracciones pueden combinarse posteriormente para obtener una mezcla en la que el contenido de la forma monomérica del polipéptido se ha enriquecido respecto al contenido de forma multimérica o, aquí, forma dimérica del polipéptido.

Como alternativa, puede usarse cromatografía de intercambio catiónico o aniónico o cromatografía sobre hidroxiapatita para separar el polipéptido monomérico del multimérico, especialmente del polipéptido dimérico. Tanto en la cromatografía de intercambio catiónico como aniónico, la forma dimérica del polipéptido se eluye posteriormente durante la elución por gradiente. Para la separación de monómero y dímero usando intercambio iónico, el eluido de la columna de intercambio aniónico debería diluirse. Para el intercambio catiónico, el pH debería ajustarse para permitir la unión del polipéptido. Cuando se usa una cromatografía de hidroxiapatita, debería usarse un tampón fosfato de baja conductividad.

El análisis de la proporción de las cantidades relativas de polipéptido monomérico respecto a multimérico en una mezcla dada puede realizarse mediante SEC-HPLC usando, por ejemplo, un sistema de HPLC de serie 1100 de Agilent (o similar). La columna usada es una columna Tosoh Biosep TSKgel G3000SWXL con columna de guardia a un caudal de 0,6-0,75 ml/minuto a una presión máxima de 75 bar (7,5 x 10^{6} Pa). Como fase móvil se usa un tampón de KH_{2}PO_{4}/KOH 100 mM, Na_{2}SO_{4} 200 mM pH 6,6. Se aplican 100 \mul de muestra. El tiempo de procesamiento total es de 27 minutos. La longitud de onda de detección se ajusta a 210 nm.

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Ejemplo 2

Actividades biológicas adicionales atribuibles al polipéptido en forma multimérica pero no al polipéptido en forma monomérica

Un polipéptido que comprende dos sitios de unión a antígeno, uniéndose uno de ellos específicamente al antígeno CD3 humano, es capaz de unirse (y activar la actividad citotóxica de) células T citotóxicas por medio del antígeno CD3 localizado en la superficie de dichas células T citotóxicas. Al mismo tiempo, dicho polipéptido puede unir específicamente con su sitio de unión diana una diana superficial en, por ejemplo, células tumorales, que normalmente no sería reconocida por células T citotóxicas. De esta forma, la actividad citotóxica de células T puede dirigirse a, por ejemplo, células tumorales como parte de un régimen terapéutico para eliminar dichas células. Idealmente, las células T citotóxicas sólo se activan tras la interacción con una célula diana mediada por la molécula polipeptídica descrita anteriormente. Aunque el mecanismo de activación descrito anteriormente parece ser la única actividad biológica observada para el polipéptido en forma monomérica (como se ha definido anteriormente en el presente documento), se ha observado que el polipéptido en forma multimérica (como se ha definido anteriormente en el presente documento) presenta actividades biológicas adicionales.

Los polipéptidos que comprenden dos sitios de unión a antígeno, uniéndose uno de dichos sitios de unión a antígeno específicamente al antígeno CD3 humano, tienen tendencia a dimerizar.

Por lo tanto, los siguientes ejemplos analizan la naturaleza de estas actividades biológicas adicionales observadas para el polipéptido en forma multimérica, usando el polipéptido en forma dimérica como un ejemplo concreto.

La Figura 1A representa un polipéptido en forma monomérica como está comprendido en la composición de la presente invención. Los sitios de unión a antígeno del polipéptido proceden cada uno de diferentes anticuerpos y cada uno comprende una región VH y VL. Las denominaciones "VH/VL" y "VL/VH" denotan una opción mutuamente excluyente de VH o VL en la región así designada. Por lo tanto, se esperaría que una región designada "VH/VL" se asociara con una región designada "VL/VH", puesto que las dos asociaciones posibles darían como resultado, del extremo amino- al carboxi-terminal, que la VH se asocie con VL o que la VL se asocie con VH. Se esperaría que el polipéptido en forma monomérica representado en la Figura 1A se uniera específicamente al antígeno CD3 humano con el sitio de unión a antígeno a la izquierda y a otro antígeno diana con el sitio de unión a antígeno a la derecha. Por lo tanto, el polipéptido puede actuar como un puente que une específicamente una célula T citotóxica con una célula diana de interés al tiempo que dirige la actividad citotóxica de la célula T citotóxica contra la célula diana, como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

La Figura 1B representa un modelo posible para el polipéptido comprendido en la presente invención, en el que este polipéptido está en forma multimérica. Aquí, el polipéptido específico mostrado está en forma dimérica, lo que significa que dos cadenas polipeptídicas sencillas se han asociado no covalentemente para formar una especie homodimérica. La Figura 1B representa el escenario en el que las dos cadenas polipeptídicas sencillas se han asociado no covalentemente de una forma antiparalela a través de sus sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a un antígeno diana. Debería señalarse que en este modelo de formación de dímeros los sitios de unión a antígeno que se unen específicamente al antígeno CD3 humano (denominados cada uno "anti-CD3") están libres para unirse a dos antígenos CD3 humanos distintos (un antígeno CD3 humano se une específicamente por cada sitio de unión anti-CD3). Por el contrario, el sitio de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno diana (denominado "anti-diana") presente en una cadena polipeptídica sencilla se asocia no covalentemente con el sitio de unión "anti-diana" presente en la otra cadena polipeptídica sencilla, de modo que ninguno de estos dos sitios de unión a antígeno diana puede unirse específicamente al antígeno diana. Como tal, el polipéptido en forma dimérica representado en la Figura 1B sería capaz de unirse simultáneamente y específicamente a dos antígenos CD3 humanos individuales, pero sería menos más capaz de unirse a un antígeno diana.

La Figura 1C representa otro modelo posible para el polipéptido comprendido en la presente invención, en el que este polipéptido está en forma multimérica. Aquí, el polipéptido específico mostrado está en forma dimérica, lo que significa que dos cadenas polipeptídicas sencillas se han asociado no covalentemente para formar una especie homodimérica. La Figura 1B representa el escenario en el que las dos cadenas polipeptídicas sencillas se han asociado no covalentemente de una forma antiparalela a través de sus sitios de unión efectores que se unen específicamente al antígeno CD3 humano. Debería señalarse que en este modelo de formación de dímeros, los sitios de unión a antígeno que se unen específicamente al antígeno diana (denominado cada uno "anti-diana") están libres para unirse a los antígenos diana distintos (un antígeno diana se une específicamente por cada sitio de unión anti-diana). Por el contrario, el sitio de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno CD3 humano (denominado "anti-CD3") presente en una cadena polipeptídica sencilla se asocia no covalentemente con el sitio de unión "anti-CD3" presente en la otra cadena polipeptídica sencilla, de modo que ninguno de estos dos sitios de unión a antígeno puede unirse específicamente al antígeno CD3 humano. Como tal, el polipéptido en forma dimérica representado en la Figura 1C sería capaz de unirse simultáneamente y específicamente a dos antígenos diana individuales, pero sería menos capaz de unirse a un antígeno CD3 humano.

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Ejemplo 2a

Activación de células T por polipéptido en forma multimérica (aquí, dimérica) en ausencia de células diana

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre de un donante sano mediante centrifugación por densidad en Ficoll. Para investigar si el polipéptido de la composición de la invención en forma multimérica (aquí, dimérica) es capaz de activar células T en ausencia de células diana, se incubaron PBMC con un polipéptido que comprendía dos sitios de unión a antígeno. Un sitio de unión a antígeno (el sitio de unión efector) del polipéptido se unía específicamente al antígeno CD3 humano y el otro sitio de unión a antígeno (el sitio de unión a antígeno diana) del polipéptido se unía específicamente al antígeno EpCAM humano. Se escogió este polipéptido particular para el estudio ya que podía excluirse la interacción con células diana debido a la ausencia de células positivas para EpCAM en la población de PBMC; cualquier efecto observado en el uso del polipéptido anterior con PBMC sería atribuible únicamente al sitio de unión que se une específicamente al antígeno CD3 humano.

Para comparar el efecto de polipéptido en forma monomérica con el efecto de polipéptido en forma dimérica, el polipéptido se había resuelto previamente en fracciones que contenían exclusivamente polipéptido monomérico (como se modela por ejemplo en la Figura 1A) o exclusivamente polipéptido dimérico (como se modela por ejemplo en las Figuras 1B y 1C). La resolución de polipéptido en estas fracciones se efectuó como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1.

En placas de microtitulación de pocillos redondos, se incubaron 2 x 10^{5} PBMC/pocillo en un volumen de 200 \mul con fracciones de monómero puro o de dímero puro del polipéptido a las concentraciones indicadas en la Figura 2. Usando citometría de flujo, los niveles de expresión de CD69 se analizaron en cada muestra después de un periodo de incubación de 24 horas. El CD69 es un marcador en la superficie de células T, cuya regulación positiva puede servir como un indicador temprano de activación de células T. Mediante el control de los niveles de expresión de CD69 en las diversas muestras, es posible obtener una medida temprana de grado en el que ha tenido lugar la activación de células T. Se identificaron células T con un anticuerpo específico anti-CD3. Las muestras se analizaron por duplicado. Como puede observarse en la Figura 2, la incubación con el polipéptido en forma dimérica daba como resultado que se activasen más del 20% de células T a una concentración de polipéptido de 1 \mug/ml. La menor concentración de polipéptido en forma dimérica que generaba una expansión de células T positivas para CD69 era de 10 ng/ml. Por el contrario, el polipéptido en forma monomérica inducía la expresión de CD69 de sólo aproximadamente el 3% de las células T a la mayor concentración ensayada (1 \mug/ml de polipéptido en forma monomérica). El grado de activación mínimo observado en respuesta al polipéptido en forma monomérica a una concentración de 1 \mug/ml podría ser el resultado de polipéptido residual en forma dimérica todavía presente en la preparación de polipéptido en forma monomérica. Estos datos demuestran que el polipéptido en forma dimérica es capaz de activar células T en ausencia de células diana mientras que el monómero no lo es. Esta capacidad representa una actividad distinta de la destrucción de células diana que es atribuible al polipéptido en forma dimérica pero no al polipéptido en forma monomérica.

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Ejemplo 2b

Lisis mutua de células T por polipéptido en forma multimérica (aquí, dimérica)

Para analizarse si el polipéptido en forma multimérica (aquí, dimérica) es capaz de destruir células T se realizaron dos conjuntos de experimentos en los que se coincubaron células efectoras con la línea de células T HPBALL (DSMZ Nº ACC 483; DMSZ = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) en presencia de polipéptido. En el primer conjunto de experimentos, se usaron PBMC como células efectoras, mientras que las células efectoras usadas en el segundo conjunto de experimentos eran células MC15 (Biensinger B., Müller-Fleckenstein I., Stimmer B., Lang G., Wittmann S., Plater E. Desrosiers R. C. y Fleckenstein B.; 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3116-3119).

El polipéptido usado para este experimento comprendía dos sitios de unión a antígeno. Un sitio de unión a antígeno (el sitio de unión efector) se unía específicamente al antígeno CD3 humano y el otro sitio de unión a antígeno se unía específicamente al antígeno CD19 humano, un marcador de células pan-B descrito anteriormente en el presente documento. Se ha descrito que las células HPBALL son positivas para CD3. Las células sanguíneas se eliminaron por lavado de los filtros de leucocitos. Se prepararon PBMC mediante centrifugación por densidad en Ficoll. Se cultivaron células MC15 como se ha descrito en las referencias bibliográficas anteriores en este párrafo. Para distinguir las células efectoras de las células diana, las células HPBALL se tiñeron con el colorante fluorescente Calceína AM de acuerdo con el protocolo del fabricante.

En placas de microtitulación de fondo redondo, se incubaron 5 x 10^{5} células efectoras con 5 x 10^{4} células HPBALL durante 4 horas en presencia de fracciones de monómero altamente puro o dímero altamente puro del polipéptido anterior a las concertaciones indicadas en la Figura 3A (para células efectoras PBMC) y en la Figura 3B (para células efectoras MC15). Se incubaron controles apropiados que contenían células HPBALL y células efectoras en ausencia de polipéptido. Después del periodo de incubación se recogieron los sobrenadantes. La cantidad de colorante fluorescente liberado por células muertas se midió usando un espectrofluorímetro. Como puede observarse en cada una de la Figuras 3A y la Figura 3B, el polipéptido en forma dimérica inducía la lisis de células HPBALL a concentraciones superiores a 10 ng/ml. Por el contrario, no se observó lisis de células diana por el polipéptido en forma monomérica en condiciones idénticas. Este descubrimiento demuestra que se ha producido la lisis de células positivas para CD3 y es atribuible al polipéptido en forma dimérica pero no al polipéptido en forma monomérica.

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Ejemplo 3

Propensión general de los polipéptidos a formar dímeros

Se deseaba mostrar la propensión a formar una especie multimérica es común a la clase general de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla en los que una especificidad de unión es por el antígeno CD3 humano. Con este fin, se produjeron varios anticuerpos biespecíficos de este tipo en células de ovario de hámster chino (CHO) de acuerdo con procedimientos conocidos en general (Sambrook y col., 1989). Cada anticuerpo biespecífico de cadena sencilla producido contenía dos sitios de unión a antígeno, conteniendo cada sitio de unión a antígeno una región de anticuerpo VH y una región VL. Uno de los dos sitios de unión a antígeno en cada molécula era específico para el antígeno CD3 humano. El otro sitio de unión a antígeno ("sitio de unión a antígeno diana") era específico para un antígeno diana deseado distinto del antígeno CD3 humano. Se determinaron las proporciones de polipéptido en forma monomérica y multimérica (aquí, dimérica) mediante una combinación de SDS-PAGE realizado en condiciones reductoras, transferencia de Western realizada usando anticuerpos Penta-His (Qiagen) y de cabra anti-ratón con AP (Sigma) y filtración en gel realizada en una columna Sephadex S200. Las proporciones relativas de polipéptido biespecífico de cadena sencilla presente en forma dimérica se muestran a continuación en la Tabla 1 para los polipéptidos que comprenden especificidades de antígeno diana contra el antígeno CD19 humano, el antígeno EpCAM humano, el antígeno Wue1 humano (un antígeno altamente específico de mieloma múltiple) y el antígeno sTn humano (un carbohidrato presentado en el epitelio de células tumorales malignas en cánceres de mama, próstata y colon).

TABLA 1

1

Como puede observarse claramente en la Tabla 1, cada anticuerpo biespecífico de cadena sencilla con especificidad de unión anti-antígeno CD3 humano forma espontáneamente cantidades significativas de especies multiméricas (es decir, aquí, diméricas) cuando se deja sin control. Por lo tanto, la propensión a formar espontáneamente homodímeros parece ser una característica genérica de la clase a la que pertenecen los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla examinados en el presente documento.

<110> Micromet AG

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<120> Composiciones que comprenden polipéptidos

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<130> MIC-017 PCT

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<150> EP 03 027 511.9

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<151> 28-11-2003

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<160> 6

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 504

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción 1: VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)

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<400> 1

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\hskip0,8cm

2

\hskip0,8cm

3

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<210> 2

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<211> 505

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción 2: VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)

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<400> 2

\hskip0,8cm

4

\hskip0,8cm

5

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<210> 3

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<211> 504

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción 6: VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)

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<400> 3

\hskip0,8cm

6

\hskip0,8cm

7

\hskip0,8cm

8

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<210> 4

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<211> 503

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción 8: VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)

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<400> 4

\hskip0,8cm

9

\hskip0,8cm

10

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<210> 5

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<211> 504

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción 5: VL(CD3)-VH(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)

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<400> 5

\hskip0,8cm

11

\hskip0,8cm

12

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<210> 6

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<211> 503

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción 7: VL(CD3)-VH(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)

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<400> 6

\hskip0,8cm

13

\hskip0,8cm

14

\hskip0,8cm

15

Claims

1. Una composición que comprende un polipéptido que comprende al menos dos sitios de unión a antígeno, en la que dichos al menos dos sitios de unión a antígeno están localizados en una cadena polipeptídica sencilla, y en la que

\bullet: dicho polipéptido puede existir tanto en forma monomérica como en forma multimérica, siendo dicha forma monomérica dicha cadena polipeptídica sencilla y comprendiendo dicha forma multimérica al menos dos de dichas cadenas polipeptídicas sencillas asociadas no covalentemente entre sí; y

2. La composición de la reivindicación 1, en la que al menos uno de los dos sitios de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo (VH) y una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo (VL).

3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que el otro sitio de unión a antígeno de dichos al menos dos sitios de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD19 humano o al antígeno EpCAM humano.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que el otro sitio de unión a antígeno de dichos al menos dos sitios de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD19 humano y en la que dicho polipéptido tiene una secuencia como se representa en cualquiera de las SEC ID Nº: 1-6 o una secuencia que tiene una homología de al menos el 70% con cualquiera de las SEC ID Nº: 1-6.

5. Un procedimiento de producción de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la cantidad de un polipéptido en forma monomérica se ha enriquecido respecto a la cantidad de dicho polipéptido en forma multimérica, en el que

\bullet: dicho polipéptido comprende al menos dos sitios de unión a antígeno en una cadena polipeptídica sencilla y uno de dichos al menos dos sitios de unión a antígeno se une específicamente al antígeno CD3 humano;

\bullet: dicho polipéptido en forma monomérica es dicha cadena polipeptídica sencilla; y

\bullet: dicho polipéptido en forma multimérica comprende al menos dos de dichas cadenas polipeptídicas sencillas asociadas no covalentemente entre sí;

comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

(c4): recogida de un segundo eluido;

(d3): recogida de un tercer eludido en fracciones;

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que las etapas (b2) y/o (c2) se realizan por medio de cromatografía en una columna o por medio de un procedimiento discontinuo, en el que se prefiere que las etapas (b2) y (c2) se realicen en una columna.

7. El procedimiento de la reivindicación 5 ó 6, en el que dicho segundo material cromatográfico permite la separación basándose en el intercambio aniónico.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que dicho lavado de las etapas b2 y c2 se realiza usando un volumen de primer y/o segundo tampón que es de 6 a 10 veces superior al volumen del primer y/o segundo material cromatográfico, respectivamente.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que dicha translocación de la etapa d2 se realiza por aplicación de un volumen de dicho tampón de procesamiento equivalente a de 3 a 7 veces el volumen del tercer material cromatográfico.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en el que dicho primer y segundo tampón son cada uno tampón fosfato a pH 8.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en el que dicho tampón de procesamiento de la etapa d2 se selecciona de tampón fosfato a pH 7,0-7,5 y tampón citrato/lisina a pH 6,0-7,5.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-11, que comprende además la etapa o etapas de analizar la composición enriquecida en el polipéptido en forma monomérica obtenida en la etapa f para obtener una medica de la cantidad de dicho polipéptido en forma monomérica respecto a la cantidad de polipéptido en forma multimérica en dicha composición y, opcionalmente, que comprende además la etapa de enriquecer el contenido de polipéptido en forma monomérica respecto al contenido de polipéptido en forma multimérica por repetición de las etapas d a f en dicha composición enriquecida en el polipéptido en forma monomérica.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-12, en el que dicho análisis se realiza usando un procedimiento cromatográfico que separa sustancias basándose en su peso molecular.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho procedimiento cromatográfico es cromatografía de exclusión por tamaño, en particular, cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-14, en el que

\bullet: dicho imidazol se aplica como un gradiente de concentración o como una sola concentración y/o

\bullet: dicho cloruro sódico se aplica como un gradiente de concentración o como una sola concentración.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que

\bullet: dicho imidazol se aplica en una sola concentración seleccionada de las siguientes concentraciones: 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM y 120 mM; y

\bullet: dicho cloruro sódico se aplica en una sola concentración seleccionada de las siguientes concentraciones: 370 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM y 420 mM.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho imidazol se aplica en una concentración de 80 mM y/o dicho cloruro sódico se aplica en una concentración de 400 mM.

18. Una composición que puede obtenerse por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5-17.

19. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o de la reivindicación 18 para producir un medicamento para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa, de un cáncer mínimo residual, de una enfermedad tumoral, de una enfermedad inflamatoria, de un trastorno inmunológico, de una enfermedad autoinmune, de una enfermedad infecciosa, de una enfermedad vírica, de una reacción alérgica, de una reacción parasitaria, de una enfermedad de injerto contra huésped, de una enfermedad de huésped contra injerto o de un tumor maligno de células B.

20. El uso de la reivindicación 19, en el que la prevención, tratamiento o mejora de la enfermedad o trastorno se produce en un ser humano.

21. El uso de la reivindicación 19 ó 20, en el que dicha enfermedad tumoral se selecciona del grupo constituido por un linfoma, una leucemia de células B o un linfoma de Hodgkin.

22. El uso de la reivindicación 19 ó 20, en el que dicho tumor maligno de células B es un linfoma no Hodgkin.

23. El uso de la reivindicación 19 ó 20, en el que dicha enfermedad autoinmune se selecciona de artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1, enfermedad inflamatoria del intestino, lupus eritematoso sistemático, psoriasis, esclerodermia y enfermedades tiroideas autoinmunes.