ES2338490T3 - Procedimiento de diagnostico in vitro de carcinoma broncopulmonar mediante deteccion de transcritos mayoritarios alternativos del gen klk8 que codifica kalicreina 8 y su utilizacion para el pronostico de supervivencia. - Google Patents
Procedimiento de diagnostico in vitro de carcinoma broncopulmonar mediante deteccion de transcritos mayoritarios alternativos del gen klk8 que codifica kalicreina 8 y su utilizacion para el pronostico de supervivencia. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de diagnóstico in vitro de carcinoma broncopulmonar, particularmente de carcinoma bronquial no microcítico, caracterizado porque comprende la etapa de detección, en una muestra biológica procedente de un paciente sospechoso de estar aquejado de dicho carcinoma broncopulmonar, de al menos uno de los transcritos mayoritarios alternativos del gen KLK8 que codifica kalicreína 8.
Description
Procedimiento de diagnóstico in vitro de
carcinoma broncopulmonar mediante detección de transcritos
mayoritarios alternativos del gen KLK8 que codifica
kalicreína 8 y su utilización para el pronóstico de
supervivencia.
La presente invención se refiere al ámbito de la
oncología. Más particularmente, la presente invención tiene por
objeto un procedimiento de diagnóstico in vitro del carcinoma
broncopulmonar primitivo en un paciente ser humano, mediante
determinación de la presencia, más allá de un umbral predeterminado,
de un transcrito mayoritario del gen KLK8 de kalicreína 8 en
una muestra biológica procedente de este paciente.
El carcinoma broncopulmonar primitivo es la
primera causa de muerte por cáncer en el hombre y esto en todos los
países desarrollados. Datos recientes muestran un claro aumento de
la incidencia en las mujeres. Se estima el número de nuevos casos
al año en 25.000 en Francia y en más de 160.000 en los Estados
Unidos, conllevando la muerte anual de aproximadamente 22.000
individuos en Francia y 155.000 en los Estados Unidos. A nivel
mundial, el carcinoma broncopulmonar sería responsable de
aproximadamente 900.000 muertes cada año, lo que correspondería
aproximadamente al 18% de las muertes por cáncer. La etiología
principal del carcinoma broncopulmonar es el tabaquismo.
Aproximadamente el 90% de los carcinomas bronquiales en el hombre y
aproximadamente el 50% en la mujer son atribuibles al tabaco. Otros
factores ambientales o profesionales también pueden reconocerse en
la carcinogénesis bronquial.
La Organización Mundial de la Salud (OMS)
distingue los carcinomas bronquiales microcíticos (CBM), que
representan aproximadamente el 20% de los casos, y los carcinomas
bronquiales no microcíticos (CBNM) que agrupan, entre otros, los
carcinomas epidermoides, adenocarcinomas, y carcinomas macrocíticos,
y que representan aproximadamente el 80% de los casos. Los
carcinomas epidermoides y los adenocarcinomas son los cánceres más
extendidos.
Hoy en día, el diagnóstico del carcinoma
broncopulmonar se realiza esencialmente mediante radiografía
pulmonar y escáner torácico. Una endoscopia bronquial que permite
la realización de biopsias confirma a continuación el diagnóstico.
Por desgracia, los síntomas evocadores son desafortunadamente
tardíos y poco específicos, y el diagnóstico interviene de forma
tardía, reduciendo de este modo en gran medida la eficacia y la
factibilidad de los tratamientos existentes. Además, este tipo de
diagnóstico requiere un material eficaz y personal cualificado, lo
que es costoso.
Actualmente están disponibles diferentes métodos
de tratamiento: cirugía, quimioterapia, radioterapia. Estos
tratamientos pueden realizarse, de manera aislada, o de manera
secuencial o combinada.
La tasa de supervivencia del cáncer de pulmón
depende en gran medida del grado de diseminación del tumor en el
momento del diagnóstico. La tasa global de supervivencia a 5 años es
del orden del 15%. Esta tasa enmascara sin embargo disparidades
importantes. La tasa de supervivencia de los pacientes que tienen un
cáncer metastatizado a distancia durante el diagnóstico es inferior
al 5%, mientras que los pacientes cuyo carcinoma "no
microcítico" (CBNM) está localizado en el momento de su
descubrimiento presentan tasas de supervivencia próximas al
50%^{1}. Estos últimos son tratados esencialmente mediante
resección quirúrgica del tumor, enfoque que, por el momento,
representa la única solución curativa para este tipo de cáncer. Sin
embargo, menos de un paciente de cada 3 puede ser objeto de dicho
tratamiento y un paciente de cada 2 tratados mediante cirugía
fallece en los meses siguientes a la operación, después de una
recidiva tumoral. Los avances recientes en el campo de la
quimioterapia moderna del CBNM permiten prever tratamientos
adyuvantes o neo-adyuvantes que mejoran la esperanza
de vida de los pacientes operados^{2}. Dichos tratamientos no
son, sin embargo, anodinos con una tasa de mortalidad asociada no
despreciable. En este contexto, es importante poder identificar a
los pacientes operables que presentan un alto riesgo de muerte por
recidiva, para facilitar la decisión de aplicar o no una
quimioterapia neo-adyuvante o adyuvante.
Desde hace años se investigan y estudian
marcadores que permitan distinguir las células tumorales de las
células sanas para todos los cánceres y particularmente del
carcinoma broncopulmonar. Estos permitirían diagnosticar
precozmente la enfermedad, establecer su pronóstico y su
sensibilidad al tratamiento, y supervisar su evolución. En los
últimos años, más de 100 candidatos se han sugerido como marcadores
moleculares de diagnóstico del carcinoma broncopulmonar. Los
estudios han previsto de este modo, el papel de diagnóstico de
proto-oncogenes, de factores implicados en el ciclo
celular, apoptosis o angiogénesis. Sin embargo, pocas correlaciones
entre los resultados obtenidos mediante diferentes técnicas y de
validaciones entre diferentes cohortes de pacientes pudieron
obtenerse de acuerdo con la técnica empleada (inmunohistoquímica,
dosificación inmunológica, chips de ADN que utilizan diferentes
algoritmos) y la gran diversidad de tumores (tipo histológico,
estadio, grado de diferenciación).
Otros marcadores, que pertenecen a una
sub-familia de serina proteasas, las kalicreínas, de
las que se enumeran 15, también se han ensayado. De este modo, en
un estudio con chips de ADN, el gen hKLK11 se ha identificado
como marcador de los adenocarcinomas endocrinos de tipo C2^{3}.
Un estudio similar mostró que los genes hKLK5 y
hKLK10 se sobre-expresan en los carcinomas
epidermoides^{4}. Del mismo modo, se ha mostrado que los genes
hKLK5 et hKLK7, que codifican respectivamente las
proteínas hK5 y hK7, estaban sobre-expresados en
los tejidos tumorales de carcinomas epidermoides, mientras que una
sub-expresión del gen hKLK7 en los tejidos
tumorales se observa generalmente en los pacientes que presentan un
adenocarcinoma^{5}. Sin embargo, no se ha podido establecer
ningún vínculo entre la expresión diferencial de estos genes
hKLK y un pronóstico vital para los pacientes aquejados de
un carcinoma broncopulmonar.
Los genes de las 15 kalicreínas presentan
características comunes, entre ellas la presencia de varios
transcritos para el mismo gen. Los transcritos de estos genes
también se han estudiado como marcadores. De este modo, se ha
indicado que tres transcritos alternativos de los genes
hKLK4^{6}, hKLK5^{7}, un transcrito del gen
hKLK7^{7} estaban sobre-expresados en
tumores y/o en líneas celulares ováricas comparativamente al tejido
no canceroso.
Se conoce que el perfil de expresión del gen
hKLK8 da lugar a al menos 4 transcritos diferentes, llamados
NT1 a NT4. El transcrito NT1 o "neuropsina de tipo 1",
identificada por Yoshida S. et al^{8}, codifica una
preproenzima de 260 aminoácidos que contiene un péptido señal de
secreción de 28 aminoácidos y un prosegmento muy corto de 4 restos
que debe escindirse para liberar la forma activa de la kalicreína 8.
El NT1 está considerado como la forma regular de expresión del gen.
El transcrito NT2 o "neuropsina-T2",
identificado por Mitsui S. et al^{9}, se diferencia de la
forma NT1 por la inserción de una secuencia que codifica 45
aminoácidos suplementarios en la región
carboxi-terminal del péptido señal. Los transcritos
NT3 y NT4 fueron identificados por Magklara A. et al^{10}
y codifican proteínas que contienen respectivamente 119 y 32 restos.
La forma proteica predicha a partir de NT3 solamente posee una
parte del péptido señal de kalicreína 8 y no conserva la zona de
escisión de éste. La proteína predicha a partir de NT4 está
constituida por los 23 primeros restos del péptido señal de
kalicreína 8 y por 9 restos suplementarios sin identidad con
kalicreína 8. Magklara A. et al^{10} mostraron que, aunque
la forma regular de expresión del gen KLK8, NT1, tenga un
valor de pronóstico en el marco del cáncer de ovario, las formas
NT3 y NT4 no tienen ningún valor.
Los Solicitantes han demostrado ahora de forma
sorprendente que los transcritos mayoritarios alternativos del gen
KLK8 que codifica kalicreína 8, seleccionados entre NT3 y
NT4, en una tasa elevada, eran un buen marcador de diagnóstico, y
particularmente de pronóstico desfavorable, en el marco de los
carcinomas broncopulmonares, y en particular de los carcinomas
bronquiales no microcíticos.
De este modo, la presente invención tiene como
primer objeto un procedimiento de diagnóstico in vitro del
carcinoma broncopulmonar, particularmente del carcinoma bronquial no
microcítico, caracterizado porque comprende o consiste en la
etapa de detección, en una muestra biológica procedente de un
paciente sospechoso de estar afectado por dicho carcinoma
broncopulmonar, de al menos uno de los transcritos mayoritarios
alternativos del gen KLK8 de kalicreína 8.
El procedimiento de la invención permite, por lo
tanto, establecer un diagnóstico en el marco del carcinoma
broncopulmonar mediante un simple ensayo que consiste en detectar
los transcritos mayoritarios alternativos del gen KLK8,
particularmente en una tasa elevada.
Por transcrito alternativo del gen KLK8,
se entiende los productos de transcripción del gen KLK8.
Dichos transcritos son tales como se han descrito anteriormente y se
denominan, particularmente, NT1, NT2, NT3 y NT4. Como se observará
a continuación, los Solicitantes han descubierto dos nuevos
transcritos denominados NT5 y NT6.
Por transcrito mayoritario, se entiende los
transcritos producidos en su mayoría a partir del gen de expresión
de kalicreína 8. De acuerdo con una realización, los transcritos
mayoritarios alternativos del gen KLK8 se seleccionan entre
los transcritos NT3 y NT4.
Por tasa elevada de transcrito mayoritario, se
entiende una tasa superior a un valor umbral determinado.
Se sabe que, de forma general, los resultados de
los ensayos de detección de analitos dependen en gran parte de las
características de los socios de unión utilizados. De este modo, por
ejemplo, en el caso de la detección de ARN mediante hibridación con
sondas nucleotídicas, los resultados dependen en particular de las
características de tamaño, de composición y de porcentaje de
complementariedad de las sondas, y estas características influyen
sobre los valores medidos con estas sondas. Se comprende por lo
tanto que no es posible dar valores umbral precisos y que pueden
determinarse valores umbral adaptados a cada socio de unión
utilizado en cada caso, mediante sencillos experimentos
rutinarios.
Es preciso comprender bien que en este documento
se le llama valor umbral ya sea un valor discreto, ya sea un
intervalo de valores correspondiente a una zona de indeterminación.
Por supuesto, cuando el valor medido está incluido en el intervalo
de indeterminación, o está muy próximo al valor umbral en el caso de
un valor discreto, no se puede llegar a una conclusión definitiva y
es conveniente realizar investigaciones suplementarias.
Las muestras biológicas en las que se emplea el
procedimiento de la invención son cualquier muestra biológica
susceptible de contener transcritos mayoritarios alternativos del
gen KLK8. Como ejemplo de dichas muestras, pueden
mencionarse las muestras sólidas tales como el tejido procedente de
la biopsia del tumor, de ganglios linfáticos, metástasis del
paciente, fluidos biológicos tales como la sangre, suero, plasma y
expectoraciones, y las células purificadas a partir de estas
muestras sólidas o líquidas.
Se entiende por detección de transcrito, en
particular del transcrito mayoritario alternativo, la detección
directa del transcrito, o la detección indirecta del transcrito, o
cualquier otro procedimiento de determinación de la presencia de un
ARN en una muestra, conocido por el experto en la materia.
Por detección directa del transcrito, en
particular del transcrito mayoritario alternativo, se entiende la
demostración de la presencia de dicho propio transcrito en la
muestra biológica.
La detección directa del transcrito mayoritario
alternativo en la muestra biológica puede realizarse mediante
cualquier medio conocido por el experto en la materia, como por
ejemplo mediante hibridación con un socio de unión específico del
transcrito mayoritario alternativo, llegado el caso después de
amplificación mediante la técnica de PCR o NASBA.
Por hibridación, se entiende el proceso durante
el cual, en condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotídicos se
unen mediante puentes de hidrógeno estables y específicos para
formar un complejo de cadena doble. Estos puentes de hidrógeno se
forman entre las bases complementarias Adenina (A) y timina (T) (o
uracilo (U)) (se habla de enlace A-T) o entre las
bases complementarias Guanina (G) y citosina (C) (se habla de enlace
G-C). La hibridación de dos fragmentos
nucleotídicos puede ser total (se habla entonces de fragmentos
nucleotídicos o de secuencias complementarias), es decir que el
complejo de cadena doble obtenido durante esta hibridación
comprende únicamente enlaces A-T y enlaces
C-G. Esta hibridación puede ser parcial (se habla
entonces de fragmentos nucleotídicos o de secuencias
suficientemente complementarias), es decir que el complejo de cadena
doble obtenido comprende enlaces A-T y enlaces
C-G que permiten formar el complejo de cadena doble,
pero también bases no unidas a una base complementaria. La
hibridación entre dos fragmentos nucleotídicos depende de las
condiciones operatorias que se utilizan, y particularmente de la
rigurosidad. La rigurosidad se define particularmente en función de
la composición en bases de los dos fragmentos nucleotídicos, así
como por el grado de emparejamiento erróneo entre dos fragmentos
nucleotídicos. La rigurosidad también puede estar en función de los
parámetros de la reacción, tales como la concentración y el tipo de
especies iónicas presentes en la solución de hibridación, la
naturaleza y la concentración de los agentes desnaturalizantes y/o
la temperatura de hibridación. Todos estos datos son bien conocidos
y las condiciones apropiadas pueden ser determinadas por el experto
en la materia. En general, de acuerdo con la longitud de los
fragmentos nucleotídicos que se desea hibridar, la temperatura de
hibridación está comprendida entre aproximadamente 20 y 70ºC, en
particular entre 35 y 65ºC en una solución salina a una
concentración de aproximadamente 0,5 a 1 M. Una secuencia, o
fragmento nucleotídico, u oligonucleótido, o polinucleótido, es una
sucesión de motivos nucleotídicos unidos entre sí mediante enlaces
éster fosfórico, caracterizada por la secuencia informativa de los
ácidos nucleicos naturales, susceptibles de hibridarse a un
fragmento nucleotídico, pudiendo contener la sucesión monómeros de
estructuras diferentes y obtenerse a partir de una molécula de
ácido nucleico natural y/o mediante recombinación genética y/o
mediante síntesis química. Un motivo se deriva de un monómero que
puede ser un nucleótido natural de ácido nucleico cuyos elementos
constitutivos son un azúcar, un grupo fosfato y una base
nitrogenada; en el ADN el azúcar es la
desoxi-2-ribosa, en el ARN el
azúcar es la ribosa; Según sea ADN o ARN, la base nitrogenada se
selecciona entre adenina, guanina, uracilo, citosina, timina; o
bien el monómero es un nucleótido modificado en al menos uno de los
tres elementos constitutivos; como ejemplo, la modificación puede
intervenir a nivel de las bases, con bases modificadas tales como
inosina, metil-5-desoxicitidina,
desoxiuridina,
dimetilamino-5-desoxiuridina,
diamino-2,6-purina,
bromo-5-desoxiuridina o cualquier
otra base modificada capaz de hibridación, a nivel del azúcar, por
ejemplo la sustitución de al menos una desoxirribosa por una
poliamida^{11}, o incluso a nivel del grupo fosfato, por ejemplo
su sustitución por ésteres particularmente seleccionados entre
difosfatos, alquil- y aril-fosfonatos y
fósforotioatos.
Los socios de unión específicos del transcrito
mayoritario alternativo son cualquier socio susceptible de unirse
al transcrito mayoritario alternativo. Como ejemplo, pueden
mencionarse las sondas nucleicas, los cebadores de amplificación, y
cualquier otra molécula capaz de unirse al transcrito mayoritario
alternativo.
Por sonda de hibridación, se entiende un
fragmento nucleotídico que comprende de 5 a 100 motivos nucleicos,
particularmente de 10 a 35 motivos nucleicos, que posee una
especificidad de hibridación en condiciones determinadas para
formar un complejo de hibridación con el material específico de un
gen diana. En la presente invención, el material específico del gen
diana puede ser una secuencia nucleotídica comprendida en un ARN
mensajero procedente del gen diana (se habla entonces de ARNm
específico del gen diana), una secuencia nucleotídica comprendida
en un ADN complementario obtenido mediante transcripción inversa de
dicho ARN mensajero (se habla entonces de ADNc específico del gen
diana), o incluso una secuencia nucleotídica comprendida en un ARN
complementario obtenido mediante transcripción de dicho ADNc, tal
como se ha descrito anteriormente (se hablará entonces de ARNc
específico del gen diana). La sonda de hibridación puede comprender
un marcador que permite su detección.
Se entiende por cebador de amplificación, un
fragmento nucleotídico que comprende de 5 a 100 motivos nucleicos,
preferentemente de 15 a 30 motivos nucleicos que permite el inicio
de una polimerización enzimática, tal como particularmente una
reacción de amplificación enzimática. Por reacción de amplificación
enzimática, se entiende un proceso que genera múltiples copias de
un fragmento nucleotídico mediante acción de al menos una enzima.
Dichas reacciones de amplificación son bien conocidas por el experto
en la materia y pueden mencionarse particularmente las siguientes
técnicas:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\newpage
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Cuando la amplificación enzimática es una PCR,
el reactivo específico comprende al menos 2 cebadores de
amplificación, específicos de un gen diana, y que permiten la
amplificación del material específico del gen diana. El material
específico del gen diana comprende entonces preferentemente un ADN
complementario obtenido mediante transcripción inversa de ARN
mensajero procedente del gen diana (se habla entonces de ADNc
específico del gen diana) o un ARN complementario obtenido mediante
transcripción de ADNc específico de un gen diana (se habla entonces
de ARNc específico del gen diana). Cuando la amplificación
enzimática es una PCR realizada después de una reacción de
transcripción inversa, se habla de RT-PCR.
Por detección, se entiende un método físico, o
un método químico con un agente colorante intercalante tal como
SYBR® Green I o bromuro de etidio, o un método de detección con
ayuda de un marcador. Existen muchos métodos de detección para la
detección de los ácidos nucleicos^{12-13}.
Por marcador, se entiende un indicador capaz de
generar una señal que se puede detectar. Una lista no limitante de
estos indicadores comprende las enzimas que producen una señal
detectable por ejemplo por colorimetría, fluorescencia o
luminescencia, como peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa
alcalina, beta-galactosidasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa;
los cromóforos como los compuestos fluorescentes, luminescentes o
colorantes; los grupos de densidad electrónica detectables mediante
microscopía electrónica o por sus propiedades eléctricas como la
conductividad, mediante métodos de amperimetría o de voltimetría, o
mediante mediciones de impedancia; los grupos detectables mediante
métodos ópticos como difracción, resonancia del plasmón superficial,
variación del ángulo de contacto o mediante métodos físicos como
espectroscopía de fuerza atómica, efecto túnel, etc.; las moléculas
radiactivas como ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I.
La sonda de hibridación puede ser una sonda
llamada de detección. En este caso, la sonda llamada de detección
está marcada por medio de un marcador tal como se ha definido
anteriormente. Gracias a la presencia de este marcador, puede
detectarse la presencia de una reacción de hibridación entre una
sonda de detección dada y el transcrito a detectar.
La sonda de detección puede ser particularmente
una sonda de detección de tipo "molecular beacons" (sondas
fluorescibles)^{14}. Estas "molecular beacons" se
vuelven fluorescentes durante la hibridación. Estas poseen una
estructura de tipo varilla-bucle y contienen un
fluoróforo y un grupo "quencher" (inhibidor de fluorescencia).
La fijación de la secuencia de bucle específica con su secuencia
complementaria de ácido nucleico diana provoca un desenrollado de
la varilla y la emisión de una señal fluorescente durante la
excitación a la longitud de onda conveniente.
La sonda de hibridación también puede ser una
sonda llamada de captura. En este caso, la sonda llamada de captura
está inmovilizada o es inmovilizable en un soporte sólido mediante
cualquier medio apropiado, es decir directa o indirectamente, por
ejemplo mediante covalencia o adsorción. Como soporte sólido, pueden
utilizarse materiales de síntesis o materiales naturales,
eventualmente modificados químicamente, particularmente los
polisacáridos tales como los materiales a base de celulosa, por
ejemplo papel, derivados de celulosa tales como acetato de celulosa
y nitrocelulosa o dextrano, polímeros, copolímeros, particularmente
a base de monómeros de tipo estireno, fibras naturales tales como
algodón, y fibras sintéticas tales como Nylon; materiales minerales
tales como sílice, cuarzo, vidrios, cerámicas; látex; partículas
magnéticas; derivados metálicos, geles etc. El soporte sólido puede
estar en forma de una placa de microvaloración, de una membrana como
se describe en la solicitud
WO-A-94/12670, de una partícula.
También pueden inmovilizarse sobre el soporte varias sondas de
captura diferentes, siendo cada una específica de un transcrito
diana. En particular, puede utilizarse como soporte un biochip
sobre el que pueden inmovilizarse gran número de sondas. Por
biochip, se entiende un soporte sólido de dimensión reducida en el
que se fija una multitud de sondas de captura en posiciones
predeterminadas. El concepto de biochip, o chip de ADN, data de
principios de los años 90. Este concepto se basa en una tecnología
multidisciplinar que integra la micro-electrónica,
la química de los ácidos nucleicos, el análisis de imágenes y la
informática. El principio de funcionamiento se basa en un fundamento
de la biología molecular: el fenómeno de hibridación, es decir el
apareamiento por complementariedad de las bases de dos secuencias
de ADN y/o de ARN. El método de los biochips se basa en el empleo de
sondas de captura fijadas sobre un soporte sólido sobre las que se
hace actuar una muestra de fragmentos nucleotídicos diana marcados
directa o indirectamente con fluorócromos. Las sondas de captura se
sitúan de manera específica sobre el soporte o chip y cada
hibridación da una información particular, en relación con el
fragmento nucleotídico diana. Las informaciones obtenidas son
acumulativas, y permiten por ejemplo cuantificar el nivel de
expresión de un gen/transcrito o de varios genes/transcritos diana.
Después de la hibridación, el soporte o chip se lava, y los
complejos de ADNc o ARNc marcados/sondas de captura se revelan
mediante un ligando de gran afinidad unido, por ejemplo, a un
marcador de tipo fluorócromo. La fluorescencia se lee, por ejemplo,
mediante un escáner y el análisis de la fluorescencia se trata
informáticamente. Pueden mencionarse a título indicativo, los chips
de ADN desarrollados por la compañía Affymetrix ("Accessing
Genetic Information with High-Density DNA
arrays")^{15,16}, para los diagnósticos moleculares. En esta
tecnología, las sondas de captura son generalmente de tamaños
reducidos, alrededor de 25 nucleótidos. Otros ejemplos de biochips
se dan en muchas publicaciones^{17, 18, 19, 20, 21} o en las
patentes US-A-4.981.783,
US-A-5.700.637,
US-A-5.445.934,
US-A-5.744.305 y
US-A-5.807.522. La característica
principal del soporte sólido debe ser conservar las características
de hibridación de las sondas de captura en los fragmentos
nucleotídicos diana al tiempo que se genera un ruido de fondo mínimo
para el método de detección.
Para la inmovilización de las sondas sobre el
soporte, se distinguen tres grandes tipos de fabricación.
Existe, en primer lugar, una primera técnica que
consiste en un depósito de sondas presintetizadas. La fijación de
las sondas se realiza mediante transferencia directa, por medio de
micropipetas, de micro-puntas o mediante un
dispositivo de tipo chorro de tinta. Esta técnica permite la
fijación de sondas de tamaño que varía entre algunas bases (5 a 10)
y tamaños relativamente importantes de 60 bases (impresión) a varios
cientos de bases (micro-deposición).
- \quad
- La impresión es una adaptación del procedimiento utilizado por las impresoras de chorro de tinta. Ésta se basa en la propulsión de esferas de fluido muy pequeñas (volumen < 1 nl) y a un ritmo que puede alcanzar 4000 gotas/segundo. La impresión no implica ningún contacto entre el sistema que libera el fluido y la superficie sobre la que se deposita.
- \quad
- La micro-deposición consiste en fijar sondas largas de varias decenas a varios cientos de bases en la superficie de una lámina de vidrio. Estas sondas se extraen generalmente de bases de datos y se presentan en forma de productos amplificados y purificados. Esta técnica permite realizar chips denominados micromatrices [microarrays] que portan aproximadamente diez mil puntos [spots], llamados zonas de reconocimiento, de ADN sobre una superficie de poco menos de 4 cm^{2}. No hay que olvidar, sin embargo, el empleo de membranas de Nylon, llamadas macromatrices [macroarrays], que portan productos amplificados, generalmente por PCR, con un diámetro de 0,5 a 1 mm y cuya densidad máxima es de 25 puntos/cm^{2}. Esta técnica muy flexible es utilizada por muchos laboratorios. Se considera que esta última técnica forma parte de los biochips. Puede depositarse, sin embargo, en el fondo de la placa de microvaloración cierto volumen de muestra en cada pocillo, como es el caso en las solicitudes de patente WO-A-00/71750 y FR 00/14896, o depositar en el fondo de una misma placa de Petri cierto número de gotas separadas entre sí, de acuerdo con otra solicitud de patente FR00/14691.
La segunda técnica de fijación de las sondas
sobre el soporte o chip se denomina síntesis in situ. Esta
técnica conduce a la elaboración de sondas cortas directamente en la
superficie del chip. Esta técnica se basa en la síntesis de
oligonucleótidos in situ (véase particularmente las
solicitudes de patente WO 89/10977 y WO 90/03382), y está
fundamentada en el procedimiento de los sintetizadores de
oligonucleótidos. Ésta consiste en desplazar una cámara de
reacciones, en la que se desarrolla la reacción de elongación de
oligonucleótidos, a lo largo de la superficie de vidrio.
Finalmente, la tercera técnica se denomina
fotolitografía, que es un procedimiento originalmente de los
biochips desarrollados por Affymetrix. También se trata de una
síntesis in situ. La fotolitografía se deriva de las
técnicas de los microprocesadores. La superficie del chip se
modifica mediante la fijación de grupos químicos fotolábiles que
pueden ser activados por la luz. Una vez iluminados, estos grupos
son susceptibles de reaccionar con el extremo 3' de un
oligonucleótido. Al proteger esta superficie mediante máscaras de
formas definidas, pueden iluminarse y, por lo tanto, activarse
selectivamente las zonas del chip en las que se desea fijar uno u
otro de los cuatro nucleótidos. La utilización sucesiva de máscaras
diferentes permite alternar ciclos de protección/reacción y, por lo
tanto, realizar sondas de oligonucleótidos sobre puntos de
aproximadamente varias decenas de micrómetros cuadrados
(\mum^{2}). Esta resolución permite crear hasta varios cientos
de miles de puntos sobre una superficie de varios centímetros
cuadrados (cm^{2}). La fotolitografía presenta ventajas:
masivamente paralela, permite crear un chip de
N-meros en solamente 4 x N ciclos. Todas estas
técnicas son, por supuesto, utilizables.
La muestra biológica utilizada para la detección
directa del transcrito mayoritario alternativo, susceptible de
contener el transcrito mayoritario alternativo como tal, puede estar
constituida por fluido biológico o un tejido procedente de la
biopsia del tumor de ganglios linfáticos o de las metástasis del
paciente en cuestión.
Para detectar el transcrito de la muestra
biológica, generalmente es necesaria una etapa de extracción. Éste
también puede detectarse sin extracción en cortes de tejido mediante
técnicas de hibridación in situ. La extracción se realiza
mediante todos los protocolos de extracción y de purificación de
ácidos nucleicos bien conocidos por el experto en la materia. A
título indicativo, la extracción de ácidos nucleicos puede
realizarse mediante:
- \sqbullet
-
\vtcortauna
- \circ
-
\vtcortauna
- \circ
-
\vtcortauna
- \circ
-
\vtcortauna
El experto en la materia podrá utilizar otros
métodos de lisis bien conocidos, tales como los choques térmicos u
osmóticos o las lisis químicas mediante agentes caotrópicos tales
como las sales de guanidio (US 5.234.809).
- \sqbullet
-
\vtcortauna
Cuando se desea extraer específicamente los ARN
de una muestra biológica, puede realizarse particularmente una
extracción con fenol, cloroformo y alcohol para eliminar las
proteínas y precipitar los ARN con etanol al 100%. Los ARN pueden
precipitarse entonces mediante centrifugado, lavarse y
resuspenderse.
El fluido biológico puede necesitar un
tratamiento particular. El transcrito mayoritario alternativo puede
encontrarse en éste en solución o contenido en células tumorales
circulantes. Si la búsqueda del transcrito alternativo apunta a la
fracción contenida en las células tumorales, entonces, el fluido
biológico se tratará previamente para aislar las células tumorales
circulantes contenidas en dicho fluido.
Por aislar las células tumorales circulantes, se
entiende obtener una fracción celular enriquecida en células
tumorales circulantes.
El tratamiento del fluido para aislar las
células tumorales circulantes puede realizarse mediante
clasificación celular en un citómetro de flujo, mediante
enriquecimiento en Ficoll, mediante enriquecimiento con perlas
magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos, o mediante
cualquier otro método de enriquecimiento específico conocido por el
experto en la materia.
Las células tumorales circulantes pueden
aislarse gracias a una técnica de separación celular en Ficoll
asociada a un agotamiento de las células sanguíneas utilizando
anticuerpos anti-CD45 acoplados a perlas magnéticas
(Dynal Biotech ASA, Noruega).
La detección directa del transcrito mayoritario
alternativo puede realizarse entonces directamente a partir de
células tumorales circulantes aisladas del fluido biológico. Por
ejemplo, las células tumorales circulantes depositadas sobre una
lámina por citocentrifugado pueden ponerse en contacto con una sonda
específica del transcrito mayoritario alternativo para realizar una
hibridación in situ.
Un ejemplo de método indirecto consiste en
traducir in vitro los ARN extraídos de las muestras de
proteínas, por ejemplo con ayuda de sistemas de expresión tales
como E. coli, y después detectar el producto de traducción
específica del ARN alternativo mediante un ensayo inmunológico tal
como los ensayos de "sándwich", por ejemplo ELISA, o
competitivos. Estos métodos son ampliamente conocidos por el experto
en la materia y utilizan particularmente anticuerpos monoclonales
y/o policlonales como socio específico de unión del péptido
traducido del ARN.
El procedimiento de la invención puede emplearse
mediante las etapas que consisten en:
- i)
- determinar la cantidad de transcrito mayoritario alternativo en la muestra biológica,
- ii)
- comparar la cantidad de transcrito mayoritario alternativo en la muestra biológica con un valor umbral predeterminado, seleccionado de acuerdo con el tipo de dosificación utilizado y representativo del límite de detección de la patología y
- iii)
- establecer el diagnóstico.
La cuantificación de la concentración de
transcrito mayoritario alternativo puede realizarse mediante
cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia para
cuantificar un marcador en una muestra biológica, tal como
utilizando un ensayo de hibridación, como se ha descrito
anteriormente.
También como se ha indicado anteriormente, se
sabe que, de forma general, los resultados de los ensayos de
detección de los ácidos nucleicos dependen en gran parte de las
características de los socios de unión utilizados, de forma que no
es posible dar valores umbral precisos y que pueden determinarse
valores umbral adaptados a cada socio de unión utilizado en cada
caso, mediante sencillos experimentos rutinarios.
El procedimiento de diagnóstico de la invención
se puede mejorar incluyendo también una etapa suplementaria de
detección de al menos otro transcrito del gen KLK8, lo que
constituye una realización particular de la invención.
Por otro transcrito del gen KLK8, se
entiende:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Los nuevos transcritos NT5 y NT6, de secuencia
SEC ID Nº 7 y SEC ID Nº 8, respectivamente, son nuevos y constituyen
otro objeto de la invención.
El procedimiento de diagnóstico de la invención
que incluye una etapa suplementaria de detección de otro transcrito
alternativo del gen KLK8 puede realizarse con las etapas que
consisten en:
- i)
- determinar la cantidad de transcrito mayoritario alternativo del gen KLK8 y de otro transcrito, llegado el caso alternativo, del gen KLK8 en la misma muestra biológica, y
- ii)
- comparar la cantidad obtenida con un valor umbral predeterminado, seleccionado de acuerdo con el tipo de dosificación utilizado y representativo del límite de detección de la patología y
- iii)
- establecer el diagnóstico.
La determinación de la cantidad de transcrito
mayoritario alternativo de KLK8 y de otro transcrito, llegado
el caso alternativo, del mismo gen KLK8 puede realizarse
secuencial o simultáneamente, de acuerdo con los procedimientos
convencionalmente conocidos por el experto en la materia, como se ha
indicado anteriormente.
Por misma muestra biológica, se entiende una
muestra de la misma naturaleza tomada del mismo sujeto, a saber dos
fracciones de una misma toma, o dos muestras procedentes de dos
tomas diferentes, pero que deben ser de la misma naturaleza, por
ejemplo de tejido canceroso. Se prefiere utilizar dos fracciones de
una misma toma.
El procedimiento de diagnóstico de la invención
también puede comprender una etapa suplementaria de detección de al
menos un transcrito de un gen de otra kalicreína, lo que constituye
otra realización de la invención.
El procedimiento detecta de este modo al menos
un transcrito de un gen de otra kalicreína, así como:
- (a)
- al menos un transcrito mayoritario alternativo del gen KLK8 o
- (b)
- al menos un transcrito mayoritario alternativo del gen KLK8 y al menos un transcrito minoritario, llegado el caso alternativo, del gen KLK8.
Este procedimiento puede realizarse mediante las
etapas que consisten en:
- i)
- determinar la cantidad de transcrito mayoritario alternativo del gen KLK8, y eventualmente del otro transcrito, llegado el caso alternativo, del gen KLK8, en la muestra biológica Q1,
- ii)
- determinar la cantidad del transcrito del otro gen de kalicreína en la misma muestra Q2,
- iii)
- calcular la proporción Q1/Q2 o Q2/Q1,
- iv)
- comparar dicha proporción con un valor umbral predeterminado, seleccionado de acuerdo con el tipo de dosificación utilizado y representativo del límite de detección de la patología y
- v)
- establecer el diagnóstico.
Como ejemplo de otro gen de kalicreína apropiado
para los fines de la invención, pueden mencionarse los genes de
kalicreínas que se expresan en el pulmón, tales como KLK5, KLK6,
KLK7, KLK10, KLK11, KLK13 y KLK14. Estos genes de
kalicreínas se han descrito ampliamente en la bibliografía, de modo
que son conocidos por el experto en la materia. Se prefieren los
genes de kalicreínas KLK5, KLK11 y KLK13,
prefiriéndose particularmente KLK11.
Como se ha indicado anteriormente, la
determinación de la cantidad de los transcritos de diferente
naturaleza puede realizarse secuencial o simultáneamente, de
acuerdo con los procedimientos convencionalmente conocidos por el
experto en la materia, tales como los descritos anteriormente, y,
por misma muestra biológica, se entiende una muestra de la misma
naturaleza tomada del mismo sujeto.
\newpage
Además de la detección del transcrito
mayoritario alternativo del gen KLK8, el procedimiento de
diagnóstico de la invención también puede comprender la etapa de
detección de al menos un transcrito de otro gen que se expresa en
el pulmón, sobreentendiéndose que es diferente de un gen que
codifica una kalicreína.
Como ejemplo de otros genes que se expresan en
el pulmón, pueden mencionarse los genes que codifican las cadherinas
desmosomales, tales como desmocolina 2 o Dsc2 y desmogleína 2 o
Dsg2.
El procedimiento que comprende además la etapa
de detección de al menos un transcrito de otro gen que se expresa
en el pulmón puede realizarse mediante las etapas que consisten
en:
- i)
- determinar la cantidad de transcrito mayoritario alternativo del gen KLK8 en la muestra biológica Q1,
- ii)
- determinar la cantidad del transcrito del otro gen que se expresa en el pulmón en la misma muestra biológica Q4,
- iii)
- calcular la proporción de Q1/Q4 o Q2/Q4,
- iv)
- comparar dicha proporción con un valor umbral predeterminado, seleccionado de acuerdo con el tipo de dosificación utilizado y representativo del límite de detección de la patología y
- v)
- establecer el diagnóstico.
Como se ha indicado anteriormente, la
determinación de la cantidad de los transcritos de diferente
naturaleza puede realizarse secuencial o simultáneamente, de
acuerdo con los procedimientos convencionalmente conocidos por el
experto en la materia tales como los descritos anteriormente, y, por
misma muestra biológica, se entiende una muestra de la misma
naturaleza tomada del mismo paciente.
En cada realización de la invención, la última
etapa consiste en establecer el diagnóstico.
Por diagnóstico, se entiende tanto el
diagnóstico en el sentido amplio del término, a saber tanto el
diagnóstico precoz como el cribado, el seguimiento terapéutico, el
pronóstico y el diagnóstico de las recaídas.
El tipo de diagnóstico dependerá de la
naturaleza de la muestra biológica en la que se realiza el
procedimiento de la invención. De este modo, los fluidos biológicos
se utilizarán preferentemente en el marco del diagnóstico precoz,
del cribado, del diagnóstico de las recaídas y eventualmente del
seguimiento terapéutico. Al tratarse de muestras sólidas, tales
como el tejido canceroso, ganglios linfáticos o las metástasis, el
cáncer ya está probado. El procedimiento de la invención será, por
lo tanto, útil en el marco del pronóstico y eventualmente del
seguimiento terapéutico.
El procedimiento de la invención es
particularmente apropiado en el pronóstico de supervivencia de los
pacientes aquejados de carcinoma broncopulmonar. En efecto, los
Solicitantes demostraron qua una tasa elevada de transcrito
mayoritario alternativo del gen KLK8, en particular de NT3 y
NT4, es un factor de pronóstico desfavorable del cáncer y
particularmente del CBNM.
De este modo, otro objeto consiste en la
utilización del procedimiento de diagnóstico de la invención en el
pronóstico de supervivencia de los pacientes aquejados de carcinoma
broncopulmonar.
Como anteriormente, el pronóstico mejora
mediante asociación de una de las siguientes etapas:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Para la realización del procedimiento de
diagnóstico de la invención, la invención tiene como otro objeto un
kit de diagnóstico que comprende las herramientas necesarias para la
detección de los transcritos mayoritarios alternativos del gen
KLK8.
A título no limitante de herramientas necesarias
para la detección de los transcritos mayoritarios alternativos del
gen KLK8, pueden mencionarse los socios de unión de dichos
transcritos mayoritarios, tales como las sondas de hibridación y de
detección.
La invención también se refiere a la utilización
de al menos uno de los transcritos mayoritarios alternativos del
gen KLK8 que codifica kalicreína 8 en la producción de un
agente utilizado en un procedimiento de detección en el marco del
carcinoma broncopulmonar, particularmente del carcinoma bronquial no
microcítico, estando el procedimiento caracterizado porque
consiste en poner en contacto a dicho al menos un transcrito
mayoritario alternativo del gen KLK8 con una muestra
biológica procedente de un paciente sospechoso de estar aquejado de
dicho carcinoma broncopulmonar.
La invención se comprenderá mejor con ayuda de
los siguientes ejemplos que se dan a título ilustrativo y no
limitante, así como con ayuda de las figuras 1 y 2 adjuntas, en las
que:
- la figura 1 es la fotografía de un gel de
electroforesis que muestra los diferentes transcritos alternativos
del gen KLK8, NT1 a NT6 obtenidos a partir de tejidos
cancerosos de pacientes aquejados de adenocarcinoma (Ad) o de
carcinoma epidermoide (C. EPI), correspondiendo la pista de la
izquierda a la pista de los marcadores de peso molecular y
- la figura 2 es la fotografía de un gel de
electroforesis que muestra la presencia de transcrito NT4 en la
sangre de un paciente aquejado de carcinoma, correspondiendo la
pista de la izquierda a la pista de los marcadores de peso
molecular (MM).
Se extrajeron ARN totales a partir de tejidos
cancerosos de pacientes aquejados de adenocarcinoma o de carcinoma
epidermoide utilizando el sistema "RNAeasy Midi kit" (Qiagen
S.A., Courtaboeuf, Francia) de acuerdo con las recomendaciones del
proveedor. Los ARN totales se transcribieron de forma inversa a ADNc
con ayuda de la Transcriptasa Inversa de PowerScript
[PowerScript Reverse Transcriptase] (BD Biosciences Clontech,
Palo Alto, CA).
Para cada muestra, se realizó una reacción de
transcripción inversa a 42ºC durante una hora en un volumen final
de 20 \mul. El medio de reacción estaba compuesto por 2 \mug de
ARN totales, 5 \muM de oligonucleótidos decámeros aespecíficos
(Random decamers RETROscript, Ambion, Cambridgeshire), de dNTP a la
concentración cada uno de 1 mM, de 20 U de inhibidor de ARNasa
(Roche Diagnostics, Meylan), por tampón de reacción concentrado una
vez y por una unidad de Transcriptasa Inversa de PowerScript (BD
Biosciences Clontech, Palo Alto, CA).
Los ADNc se amplificaron por PCR. La mezcla de
reacción de 25 \mul contenía: 50 ng de ARN total transcrito de
forma inversa, 1 unidad de Taq ADN Polimerasa de FastStart
[FastStart Taq DNA Polymerase] (Roche Diagnostics, Meylan),
tampón de reacción concentrado una vez (Tris-HCl 50
mM pH 8,3, KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5 mM,
MgCl_{2} 2 mM), dNTP a la concentración de 0,3 mM y 0,2 \muM de
los cebadores específicos.
Estos cebadores se seleccionaron de uno y otro
lado de la secuencia que codifica la kalicreína KLK8 (NT1) y
comportarían un punto de corte por una enzima de restricción (Not 1
o EcoR V). Estos cebadores eran:
- -
- K8Not_for: TGG AGG GCG GCC GCA TGG GAC GCC CCC GAC (SEC ID Nº 1) y
- -
- K8Eco_rev: TCC TAG ATA TCG CCC TTG CTG CCT ATG (SEC ID Nº 2).
Las reacciones de PCR se realizaron en un
termociclador con gradiente de temperatura (Master cycler Gradient,
Eppendorf). Las condiciones de amplificación eran las siguientes: un
ciclo de desnaturalización de 5 minutos a 95ºC seguido de 45 ciclos
que comprenden una etapa de desnaturalización a 95ºC durante 20
segundos, una etapa de hibridación a 56ºC durante 20 segundos y una
etapa de elongación a 72ºC durante 1,30 minutos. La reacción
finalizó mediante un ciclo suplementario de elongación de 1,30
minutos a 72ºC.
Diez microlitros de la reacción se depositaron
sobre un gel de agarosa al 0,8% que contenía bromuro de etidio a
0,5 \mug/ml. Los productos se separaron mediante electroforesis y
se visualizan en luz UV. El marcador de tamaño utilizado (Gene
Ruler DNA Ladder mix) fue suministrado por la compañía
MBI-Fermentas.
La fotografía del gel de electroforesis que se
da en la figura 1, demuestra la presencia de los diferentes
transcritos procedentes de la expresión pulmonar del gen KLK8
y la caracterización de transcritos mayoritarios de los NT3 y NT4.
Debe observarse que estos transcritos fueron identificados mediante
secuenciación nucleotídica (véase el ejemplo 2) como los
transcritos ya descritos con el vocablo Neuropsina de tipo 1 a 4
(NT1 a NT4), habiéndose identificado los dos nuevos transcritos y
denominados NT5 y NT6.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de PCR obtenidos en el ejemplo 1
se clonaron en el vector
pcDNA5-FRT-V5-His
TOPO (Invitrogen, Cergy Pontoise) de acuerdo con las
recomendaciones del proveedor. La preparación de ADN plasmídico se
realizó a partir de diferentes clones utilizando el sistema
"Qiaprep MiniPrep" (Qiagen S. A, Courtaboeuf). El ADN
plasmídico purificado se cuantificó a continuación mediante
espectrofotometría a 260 nm, y después se secuenció en las 2
direcciones con ayuda del par de cebadores T7 y pCR 3.1 (BGH_rev).
Las secuencias obtenidas, que se dan a continuación, se compararon
con las secuencias que se encuentran en los bancos de datos. La
estructura de los transcritos clonados, que se da en la tabla 1, se
determinó mediante alineamiento con la secuencia del gen
KLK8 con ayuda del programa CLUSTAL W.
- -
- Secuencia del ADNc pulmonar YC170310.03 idéntica al transcrito NT1 (NM_007196): SEC ID Nº 3
- -
- Secuencia del ADNc pulmonar YC140710.03 idéntica al transcrito NT2 (NM_144505): SEC ID Nº 4
- -
- Secuencia del ADNc pulmonar YC090310.03 idéntica al transcrito NT3 (NM_144506): SEC ID Nº 5
- -
- Secuencia del ADNc pulmonar YC100310.03 idéntica al transcrito NT4 (NM_144507): SEC ID Nº 6
- -
- Secuencia del ADNc pulmonar YC210710.03 correspondiente a un nuevo transcrito (NT5): SEC ID Nº 7
- -
- Secuencia del ADNc pulmonar YC050710.03 correspondiente a un nuevo transcrito (NT6): SEC ID Nº 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como muestra la Tabla 1, los transcritos
pulmonares solamente se distinguen unos de otros por combinaciones
diferentes de exones idénticos. Por lo tanto, no es posible fijarlos
como objetivo individualmente actuando sobre nuevas secuencias
(salvo NT2 que posee una secuencia adicional en 5' del exón 2). El
conocimiento del transcriptoma pulmonar del gen KLK8 permite
determinar, para cada transcrito, la combinación de exones que le
distingue de los otros transcritos presentes en ese tejido, como se
indica en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La utilización en las sondas de hibridación o de
detección de las secuencias de unión de los exones presentes en
estas combinaciones es, por lo tanto, el único medio para fijar como
objetivo específica e individualmente los transcritos pulmonares.
Esto se ha aprovechado para generar el cebador de amplificación que
otorga la especificidad de cuantificación de los transcritos
mayoritarios NT3 y NT4 en ese órgano (véase la Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los transcritos NT3 y NT4 se dosificaron por PCR
cuantitativa en tiempo real en presencia del fluoróforo intercalante
"SYBR Green" en un termociclador iCycler iQ Detection
System (Biorad, Marnes la Coquette). Cada ensayo incluía dos
mediciones de cuantificación de los ADNc procedentes de muestras
pulmonares tumorales, dos mediciones de controles sin ADN y una
curva de calibrado construida utilizando diferentes diluciones de
ADN plasmídico patrón aislado de los clones YC090310.03 (NT3) e
YC100310.03 (NT4) (véase el ejemplo 2). Los valores encontrados
para cada muestra se normalizaron con el determinado durante la
cuantificación de los transcritos que codifican la
sub-unidad ribosómica 18S. En este último caso, las
curvas de calibrado se realizaron a partir de diferentes diluciones
de una secuencia de este gen (853 pb) amplificada por PCR
convencional y purificada directamente utilizando el kit Macherey
Nagel de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Los
oligonucleótidos utilizados para la obtención de esta secuencia
eran:
- -
- el oligonucleótido 18S_for: CTA CCA CAT CCA AGG AAG GCA GCA (SEC ID Nº 11) y
- -
- el oligonucleótido 18S_rev: GCT ATC AAT CTG TCA ATC CTG TCC (SEC ID Nº 12).
La mezcla de reacción para la amplificación
cuantitativa de NT3 y NT4 comprendía: 100 ng de ARN total transcrito
de forma inversa (véase el ejemplo 1), 1 unidad de Taq ADN
Polimerasa de FastStart [FastStart Taq DNA Polymerase], SYBR
Green (Roche Diagnostics, Meylan) concentrado 0,2 veces, tampón de
reacción concentrado una vez (Tris-HCl 50 mM pH
8,3, KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5 mM, MgCl_{2} 2
mM), dNTP a la concentración cada uno de 0,2 mM y 0,2 \muM de
cada cebador oligonucleotídico sentido (Tabla III, ejemplo 2) y
antisentido del transcrito estudiado. Los cebadores antisentido de
los transcritos NT3 y NT4 eran respectivamente: el cebador NT3_rev
(CCT CCA GAA TCG CCC T - SEC ID Nº 13) que hibrida con la secuencia
de unión de los exones 5 y 6, y el cebador NT4_rev (CAG TCC AGG TAG
CGG CAG - SEC ID Nº 14) cuya secuencia fijada como objetivo se
encuentra en el exón 6.
Las mediciones de cuantificación del gen
doméstico que codifica la sub-unidad ribosómica 18S
se realizaron en el siguiente medio de reacción: 0,5 ng de ARN
total transcrito de forma inversa, 1 unidad de Taq ADN Polimerasa
de FastStart [FastStart Taq DNA Polymerase], SYBR Green
concentrado 0,2 veces, tampón de reacción concentrado una vez
(Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KCl 10 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 5 mM, MgCl_{2} 2 mM) a los que se
añadieron MgCl_{2} 2 mM, dNTP a la concentración cada uno de 0,2
mM y 0,56 \muM de cada cebador sentido (CGC GGT TCT ATT TTG TTG
GTT TT - SEC ID Nº 15) y antisentido (TTC GCT CTG GTC CGT CTT GC -
SEC ID Nº 16).
Las condiciones de amplificación para la PCR
cuantitativa de los diferentes transcritos se indican en la Tabla
4.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las cuantificaciones se realizaron a partir de
muestras de tejidos tumorales tomadas de pedazos de exéresis
quirúrgica de pacientes operados de un carcinoma broncopulmonar
entre enero de 2002 y junio de 2004. La cohorte estudiada
comprendía 60 pacientes cuya edad variaba entre 45 y 83 años con una
edad media igual a 65 años (véase la Tabla 5).
Treinta y ocho pacientes tenían un cáncer de
estadio 1 ó 2 de acuerdo con la clasificación pTNM^{24}, y 24
pacientes, un cáncer de estadio 3 ó 4. El análisis de supervivencia
se realizó recogiendo las informaciones relativas a su estado de
salud en enero de 2006. Se registraron 26 muertes en el periodo del
estudio.
Para los valores normalizados de NT3 y NT4
expresados en unidades arbitrarias (UA), se determinó, con ayuda de
un test de \chi^{2}, un valor umbral que permite predecir mejor
la supervivencia global de la población. El valor umbral es de 50
UA para NT3 (\chi^{2} = 7,54; P = 0,006) y de 1000 UA para NT4
(\chi^{2} = 7,54; P = 0,006). Estos valores, que representan
los 45º y 46º percentiles, se utilizaron para los análisis
posteriores.
Los pacientes se clasificaron en dos grupos: un
grupo corresponde a los individuos que presentan un nivel de
expresión inferior al valor umbral determinado (Expresión débil; se
habla de NT3 o NT4 débil), y un grupo que tiene un nivel de
expresión superior (Expresión fuerte; se habla de NT3 o NT3 débil).
Para cada grupo, se construyó una curva de supervivencia de acuerdo
con el método de Kaplan-Meier y la significación de
las diferencias entre las curvas se evaluó mediante el test de
log-rank. El impacto de la expresión de los
transcritos (comparación de Expresión fuerte frente a Expresión
débil) sobre la supervivencia global de los pacientes se evaluó
mediante el HR (riesgo relativo de muerte) que se calculó con el
modelo de Cox (Cox proportional hazards regression model).
El análisis se realizó de manera univariada. Éste también se realizó
después del ajuste con el estadio tumoral (lo que permite eliminar
la variable "estadio") ya que esta variable está fuertemente
vinculada a la supervivencia de los pacientes (se habla entonces de
NT3 o NT4 fuerte ajustada).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los resultados se indican en la tabla 6.
Las curvas de supervivencia de
Kaplan-Meier demuestran diferencias significativas
de supervivencia (test de log-rank, Tabla 6) entre
los pacientes que expresan fuertemente NT3 o NT4 (NT3 o NT4 fuerte)
y los pacientes que expresan débilmente estos transcritos (P
calculado con respecto a NT3 o NT4 débil).
El modelo de Cox permite concluir que los
pacientes que expresan fuertemente los transcritos tienen una
supervivencia significativamente inferior a los otros pacientes. En
efecto, el análisis de Cox muestra que el aumento del riesgo de
muerte vinculado a una expresión fuerte de NT3 (aumentado en un
factor 2,860; HR, Tabla 6) o de NT4 (aumentado en un factor 3,608;
HR, Tabla 6) es estadísticamente significativo. Los niveles de
expresión de estos transcritos constituyen, por lo tanto,
indicadores de pronóstico de la supervivencia de los pacientes para
el cáncer de pulmón.
Después del ajuste con el estadio tumoral (NT3 o
NT4 fuerte ajustada), se constata que el aumento del riesgo de
muerte vinculado a "NT3 fuerte" pierde la significación
estadística (P = 0,0779). Esto indica que las dos variables
(expresión de NT3 y estadio tumoral) estarían vinculadas en este
estudio.
Sin embargo, la fuerte tendencia a la
significación de "NT3 fuerte ajustada" sugiere que las dos
variables podrían mostrarse independientes en un estudio más
robusto que comprende un mayor número de eventos.
La situación es diferente para la variable
"NT4 fuerte", ya que el ajuste con el estadio tumoral no
modifica la significación estadística del aumento del riesgo de
muerte. Este resultado demuestra que la variable NT4 es un
indicador de pronóstico independiente del estadio tumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
La estrategia de dosificación de los transcritos
de otros genes de las kalicreínas que se expresan en el pulmón
(KLK5, KLK6, KLK7, KLK10, KLK11, KLK13 y KLK14) es
idéntica a la descrita en el ejemplo 3. En resumen, la cantidad de
productos procedentes de la amplificación de los ADNc y de los
controles se determinó después de cada ciclo con ayuda de la
incorporación de SYBR green. Se realizaron curvas patrón a partir de
ADN plasmídico procedente de clones de ADNc de los diferentes
genes. Los valores encontrados para cada paciente y cada gen se
normalizaron con los valores del 18S ribosómico y se expresaron en
unidades arbitrarias. Las condiciones de reacción eran
idénticas a las descritas para NT3 y NT4 (Ejemplo 3). Los cebadores de PCR utilizados se describen en la Tabla 7.
idénticas a las descritas para NT3 y NT4 (Ejemplo 3). Los cebadores de PCR utilizados se describen en la Tabla 7.
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Las cohortes utilizadas para la dosificación de
los transcritos de los diferentes genes proceden de la población
estudiada en el ejemplo 3. La distribución de los tipos histológicos
tumorales en las cohortes estudiadas se da en la Tabla 9.
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Para cada paciente, se determinó el nivel de
expresión de los diferentes transcritos y después sirvió para
calcular una proporción con NT3 o con NT4 (Tabla 10 para NT3 y Tabla
11 para NT4). Para cada proporción, a continuación se determinó un
valor umbral que permite predecir mejor la supervivencia global de
la población con ayuda del método descrito en el ejemplo 3.
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Como en el ejemplo 3, los pacientes se
clasificaron en dos grupos: un grupo corresponde a los individuos
que presentan un nivel de expresión inferior al valor umbral
determinado (Expresión débil), y un grupo que tiene un nivel de
expresión superior (Expresión fuerte). Para cada grupo, se construyó
una curva de supervivencia de acuerdo con el método de
Kaplan-Meier y la significación de las diferencias
entre las curvas se evaluó mediante el test de
log-rank. El riesgo relativo de muerte (HR) se
calculó con el modelo de Cox (Cox proportional hazards
regression model). El análisis se realizó después del ajuste con
el estadio tumoral, ya que esta variable está fuertemente vinculada
a la supervivencia de los pacientes.
Los resultados para NT3 se dan en la Tabla
12.
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Este estudio establece que los pacientes que
tienen proporciones de NT3/KLKx superiores al valor umbral presentan
una tasa de supervivencia significativamente reducida con respecto
a aquellos cuyo valor de la proporción es inferior al valor umbral
(con excepción de NT3/KLK7; test de log-rank).
Los resultados del test de Cox muestran que las
proporciones de NT3/KLK5, NT3/KLK11, NT3/KLK13 son indicadores de
pronóstico independientes del estadio tumoral (P < 0,05 para la
variable ajustada). La constitución de una proporción de la
expresión de NT3 sobre la expresión de los genes KLK5, KLK11 y KLK13
mejora, por lo tanto, el poder predictivo de NT3, ya que esta
variable sola no es totalmente independiente de la variable
"estadio tumoral" en la población estudiada (véase el ejemplo
3).
Los resultados para NT4 se dan en la Tabla
13.
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Como muestra la Tabla 13, los pacientes que
tienen proporciones de NT4/KLKx superiores al valor umbral presentan
una tasa de supervivencia significativamente reducida con respecto
a aquellos cuyo valor de la proporción es inferior al valor umbral
(con excepción de NT3/KLK6; test de log-rank). Los
resultados del test de Cox muestran que, excepto la proporción de
NT3/KLK6, todas las demás proporciones constituyen indicadores de
pronóstico independientes del estadio tumoral (P < 0,05 para la
variable ajustada). En este estudio, la proporción de NT4/KLK11
parece particularmente efectiva, puesto que el riesgo relativo de
muerte calculado con esta variable es superior al obtenido con el
estadio tumoral.
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En los ejemplos anteriores, los transcritos NT3
y NT4 se dosificaron por separado gracias a la utilización de
cebadores de PCR discriminantes. Este ejemplo pretende evaluar el
valor de pronóstico de estos transcritos cuando se dosifican con
ayuda de cebadores de PCR no discriminantes. Hemos utilizado
oligonucleótidos dirigidos a los exones 5 y 6 y que permiten, de
este modo, la cuantificación global de los transcritos NT1, NT2,
NT3, NT5 y NT6. La variable medida se denominó "KLK8". Las
secuencias de estos cebadores son:
- -
- 719.K8_for: CCA GAA GAA GTG TGA GGA TG (SEC ID Nº 31) y
- -
- 890.K8_rev: GGT ATA GAC GCC AGG TTT G (SEC ID Nº 32).
La mezcla de reacción utilizada era idéntica la
del ejemplo 3 mientras que las condiciones de amplificación eran: 1
ciclo de 5 minutos a 95ºC y después 50 ciclos que comprenden una
etapa de desnaturalización de 20 segundos a 95ºC, una etapa de
hibridación de 20 segundos a 60ºC, una etapa de elongación de 20
segundos a 72ºC y una etapa de adquisición de fluorescencia de 15
segundos a 84ºC. El procedimiento fue idéntico al de los ejemplos
anteriores, a saber: (1) cuantificación de la variable con ayuda de
una curva patrón, (2) normalización con el nivel de expresión del
ARN ribosómico 18S, (3) expresión en forma de valor arbitrario y
eventualmente establecimiento de una proporción con la expresión de
otro gen, (4) definición mediante test de \chi^{2} de un valor
umbral (Tabla 14), (5) binarización de la población (Expresión
fuerte > umbral; Expresión débil < umbral), (6) tests
estadísticos (Tabla 15).
Las cohortes estudiadas eran las mismas que en
el ejemplo 3 para la variable "KLK8", y que en el ejemplo 4
para la expresión en forma de proporción con otros genes de
kalicreína.
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Los pacientes que tienen un fuerte valor de la
variable "KLK8" presentan una supervivencia inferior a los
demás (test de log-rank, P = 0,0353); sin embargo,
esta variable está vinculada a la variable "estadio tumoral"
como muestra el P no significativo de la variable ajustada
(Tabla 17).
La variable "KLK8 " se vuelve independiente
cuando se combina en forma de proporción con los niveles de
expresión de otros genes de kalicreína (P < 0,05; Tabla 17).
Éste es el caso de las proporciones KLK8/KLK10, KLK8/KLK11 y
KLK8/KLK13. Estas variables constituyen, por lo tanto, indicadores
de pronóstico desfavorables e independientes para el cáncer de
pulmón.
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Una detección sensible de carcinoma latente a
partir de la sangre periférica de pacientes que tienen un cáncer
podría tener implicaciones de pronóstico o terapéuticas importantes.
Hemos realizado, por lo tanto, este experimento para verificar que
era posible detectar la presencia de los transcritos NT4 en la
sangre y que esta detección podía estar asociada a un cáncer de
pulmón.
Se extrajo sangre de sujetos aquejados de un
cáncer de pulmón en tubos "PAXgene^{TM} Blood RNA" (Europe
BD) y después los ARN totales se prepararon con ayuda del sistema
PAXgene Blood RNA System (Qiagen, Francia) de acuerdo con
las recomendaciones de los proveedores. Estos ARN totales se
transcribieron de forma inversa a ADNc de acuerdo con el
procedimiento descrito en el ejemplo 1. La búsqueda del transcrito
NT4 se realizó con ayuda de una "PCR anidada" [Nested
PCR] (2 PCR consecutivas). En la primera PCR, hemos utilizado
los cebadores K8Not_for y K8Eco_rev descritos en el ejemplo 1. El
medio de reacción era idéntico al de ese ejemplo, así como las
condiciones de PCR. Sin embargo, solamente se realizaron 30 ciclos
de amplificación. Para la segunda PCR, hemos utilizado los
cebadores NT4-2/6 y NT4_rev descritos
respectivamente en el ejemplo 2 y 3. El medio de reacción (que
contiene 1 \mul de la primera PCR) y el programa de amplificación
eran idénticos al ejemplo 1, excepto por el hecho de que la fase de
hibridación de los cebadores se realizó a 62ºC. Se realizaron
cincuenta ciclos y se depositaron 10 \mul del medio de PCR sobre
un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.
Los resultados se indican en la figura 2, que es
una fotografía del gel de electroforesis obtenido de este modo a
partir de dos pacientes aquejados de cáncer y de dos pacientes
sanos.
Como muestra la figura 2, no es posible detectar
el transcrito NT4 en la sangre de sujetos sanos. Esta observación
indica la ausencia de este transcrito en las células sanguíneas
normales. El transcrito NT4 se detectó en uno de los pacientes
aquejados de un cáncer de pulmón. Este enfoque permite, por lo
tanto, detectar la presencia de células tumorales circulantes en
algunos sujetos que tienen un cáncer de pulmón.
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<110> bioMérieux
\hskip1cmUniversité François Rabelais
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<120> Procedimiento de diagnóstico in
vitro de carcinoma broncopulmonar mediante detección de
transcritos mayoritarios alternativos del gen KLK8 que codifica
kalicreína 8 y su utilización para el pronóstico de
supervivencia
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<130> Trans KLK8
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<160> 32
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador de amplificación
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskiptggagggcgg ccgcatggga cgcccccgac
\hfill30
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<210> 2
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador de amplificación
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskiptcctagatat cgcccttgct gcctatg
\hfill27
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<210> 3
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<211> 806
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Transcrito NT1 de kalicreína 8
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<400> 3
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<211> 940
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Transcrito NT2 de kalicreína 8
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 383
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Transcrito NT3 de kalicreína 8
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 248
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Transcrito NT4 de kalicreína 8
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 645
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Transcrito NT5 de kalicreína 8
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 542
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Transcrito NT5 de kalicreína 8
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador de amplificación
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipggagcctggg cagagaat
\hfill18
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<210> 10
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador de amplificación
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\hskip-.1em\dddseqskiptgggcagggc gattct
\hfill16
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<210> 11
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<212> ADN
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipctaccacatc caaggaaggc agca
\hfill24
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<210> 12
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<211> 24
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\hfill24
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\hskip-.1em\dddseqskipcgcggttcta ttttgttggt ttt
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccactactc cctgtcacca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatcctcgc accttttctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatggtggt gctgagt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagtggatg gataaggac
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcccagat gtgacctt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccttgtaaa ccttcgtgc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaccccgaa gcctatg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgagccct ggtggta
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggatcatc aaggggttcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattgcggtg gtctttgttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgccaacat ccaacttcg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctcacagg agtctttgc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggtcatca ctgctgctc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcctcaggt tgtgcttgc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagaagaag tgtgaggatg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtatagacg ccaggtttg
\hfill19
Claims (16)
1. Procedimiento de diagnóstico in vitro
de carcinoma broncopulmonar, particularmente de carcinoma bronquial
no microcítico, caracterizado porque comprende la etapa de
detección, en una muestra biológica procedente de un paciente
sospechoso de estar aquejado de dicho carcinoma broncopulmonar, de
al menos uno de los transcritos mayoritarios alternativos del gen
KLK8 que codifica kalicreína 8.
2. Procedimiento de pronóstico in vitro
de carcinoma broncopulmonar, particularmente de carcinoma bronquial
no microcítico, caracterizado porque comprende la etapa de
detección, en una muestra biológica procedente de un paciente
sospechoso de estar aquejado de dicho carcinoma broncopulmonar, de
al menos uno de los transcritos mayoritarios alternativos del gen
KLK8 que codifica kalicreína 8.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los transcritos
mayoritarios alternativos del gen 1 KLK8 se seleccionan
entre los transcritos NT3 y NT4.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 ó 3, caracterizado porque emplea las
etapas que consisten en:
- i)
- determinar la cantidad de transcrito mayoritario alternativo en la muestra biológica,
- ii)
- comparar la cantidad de transcrito mayoritario alternativo en la muestra biológica con un valor umbral predeterminado, seleccionado de acuerdo con el tipo de dosificación utilizado y representativo del límite de detección de la patología y
- iii)
- establecer el diagnóstico.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 ó 3, caracterizado porque comprende
también la etapa de detección de al menos otro transcrito del gen
KLK8.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizado porque el al menos otro
transcrito del gen KLK8 es el transcrito que codifica
kalicreína KLK8, también llamado NT1.
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizado porque el al menos otro
transcrito del gen KLK8 es un transcrito alternativo.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizado porque el o los transcritos
alternativos se seleccionan entre NT2, NT3, NT4, NT5 y NT6.
9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado porque emplea
las etapas que consisten en:
- i)
- determinar la cantidad de transcrito mayoritario alternativo del gen KLK8 y la cantidad del otro transcrito del gen KLK8 en la misma muestra biológica, y
- ii)
- comparar la cantidad obtenida con un valor umbral predeterminado, seleccionado de acuerdo con el tipo de dosificación utilizado y representativo del límite de detección de la patología y
- iii)
- establecer el diagnóstico.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 ó 5, caracterizado porque comprende
también la etapa de detección de al menos un transcrito de un gen
que codifica otra kalicreína.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, caracterizado porque emplea las etapas que
consisten en:
- i)
- determinar la cantidad de transcrito mayoritario alternativo del gen KLK8 y eventualmente del otro transcrito del gen KLK8 en la muestra biológica Q1,
- ii)
- determinar la cantidad del transcrito del gen que codifica la otra kalicreína en la misma muestra Q2,
- iii)
- calcular la proporción Q1/Q2 o Q2/Q1,
- iv)
- comparar dicha proporción con un valor umbral predeterminado, seleccionado de acuerdo con el tipo de dosificación utilizado y representativo del límite de detección de la patología y
- v)
- establecer el diagnóstico.
\newpage
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 ó 3, caracterizado porque comprende
también la etapa de detección de al menos un transcrito de otro gen
que se expresa en el pulmón, gen que no codifica una kalicreína.
13. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, caracterizado porque emplea las etapas que
consisten en:
- i)
- determinar la cantidad de transcrito mayoritario alternativo del gen KLK8 en la muestra biológica Q1,
- ii)
- determinar la cantidad del transcrito del otro gen que se expresa en el pulmón en la misma muestra Q3,
- iii)
- calcular la proporción Q1/Q3 o Q3/Q1,
- iv)
- comparar dicha proporción con un valor umbral predeterminado, seleccionado de acuerdo con el tipo de dosificación utilizado y representativo del límite de detección de la patología y
- v)
- establecer el diagnóstico.
14. Utilización de un kit de diagnóstico que
comprende socios de unión de los transcritos mayoritarios
alternativos del gen KLK8, preferentemente sondas nucleicas
o cebadores de amplificación, para la realización del procedimiento
tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3
a 12.
15. Transcrito NT5 alternativo del gen
KLK8 que codifica kalicreína 8, caracterizado porque
tiene la secuencia SEC ID Nº 7.
16. Transcrito NT6 alternativo del gen
KLK8 que codifica kalicreína 8, caracterizado porque
tiene la secuencia SEC ID Nº 8.
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