ES2335796T3 - Metodo para la produccion de cladribina. - Google Patents
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Abstract
Método para producir cladribina (2-cloro-2''-desoxiadenosina) que comprende los pasos de: a) reacción de 2-desoxiuridina con 2-cloroadenina, en presencia de uridina fosforilasa (UPasa) y purina nucleósido fosforilasa (PNPasa) en un medio de reacción acuoso que opcionalmente contiene hasta el 40% v/v de un solvente dipolar aprótico, para obtener cladribina disuelta en dicho medio de reacción; b) aislamiento de la cladribina mediante precipitación por medio de concentración y alcalinización del medio de reacción hasta pH 11,5-12,5.
Description
Método para la producción de cladribina.
La presente invención se refiere a un método
para producir cladribina
(2-cloro-2'-desoxiadenosina).
Más específicamente, la invención se refiere a
un método para producir cladribina por medio de una reacción de
transglicosilación.
Como se sabe, la cladribina
(2-cloro-2'-desoxiadenosina)
es una molécula usada como fármaco antineoplásico en el tratamiento
de leucemia y otras neoplasias y tiene la siguiente fórmula (I):
Se han descrito varios métodos de síntesis de
cladribina; entre éstos se destacan los siguientes.
La solicitud de patente de EE.UU. No. 52080327
(Chen, R.H.K., presentada el 16 de abril de 2002) describe un método
de síntesis de cladribina empezando a partir de guanosina en 7 pasos
de síntesis química con el uso de numerosos reactivos.
La solicitud de patente de EE.UU. No. 6252061
describe una síntesis que prevé una halogenación directa de
2,6-diaminopurina desoxirribosa en una mezcla de
solventes próticos y apróticos, en presencia de un ácido de Lewis y
un nitrito orgánico. La síntesis prevé una purificación en columna
del producto final.
La solicitud de patente internacional WO
2004/028462 describe una síntesis para la halogenación directa de
2'-desoxiguanosina seguida por una separación
cromatográfica para cada intermedio.
La solicitud de patente EP 173 059 describe una
síntesis que prevé una condensación de una base de purina y una
desoxirribosa adecuadamente protegida.
La solicitud de patente de EE.UU. No.
2002/0052491 describe una síntesis que empieza a partir de
cloroadenina y desoxirribosa adecuadamente protegida, con
rendimientos mejorados con respecto a EP 173 059 y eliminación del
paso de purificación en columna.
La solicitud de patente de EE.UU. No.
2004/0039190 describe una reacción entre cloroadenina adecuadamente
protegida y desoxirribosa adecuadamente protegida, con rendimientos
mejorados con respecto a US 2002/0052491.
La producción de cladribina por medio de
procesos de síntesis química tiene limitaciones significativas, ya
que tales procesos con frecuencia consisten en reacciones de
múltiples fases, que comprenden reacciones de protección y
desprotección que empiezan a partir de compuestos que son caros y/o
difíciles de encontrar en el mercado, y algunas veces implica
reacciones no estereoespecíficas (es decir, que producen el producto
final tanto en la conformación \alpha como \beta). Tales
procesos son por lo tanto largos y costosos, y los rendimientos
raramente son satisfactorios. Por lo tanto, estos tipos de procesos,
por su naturaleza, no son aptos para ser empleados a una escala
industrial.
Por otra parte, las reacciones enzimáticas,
tales como por ejemplo las reacciones de glicosilación y
transglicosilación, se prestan mejor para su uso a un nivel
industrial y la variedad de enzimas disponibles en la naturaleza
permite seleccionar la estereoespecificidad y regioselectividad
deseada de la reacción. Tales reacciones normalmente requieren, por
lo tanto, un paso final de purificación (por ejemplo, por medio de
precipitación o filtración) de la mezcla de productos para aislar,
al nivel de pureza deseado, el producto de la enzima, el sustrato
sin reaccionar y de posibles coproductos de reacción (por ejemplo,
isómeros).
Otra ventaja de las reacciones enzimáticas con
respecto a las reacciones de síntesis es el hecho de que las
enzimas que se usan, además de estar disponibles en el mercado,
también se encuentran fácilmente en grandes cantidades y a bajo
coste, en la naturaleza, por ejemplo del cultivo de células
bacterianas.
Por lo tanto es posible cultivar las bacterias
que producen la enzima de interés y aislar la enzima de las células
bacterianas. De forma alternativa, las reacciones enzimáticas se
pueden llevar a cabo usando células bacterianas enteras,
produciendo la última solución normalmente reacciones menos
eficientes (con, por lo tanto, rendimientos menores) que sin embargo
son más convenientes y económicas.
Las reacciones enzimáticas se pueden clasificar
en reacciones de enzimas libres y reacciones de enzimas
inmovilizadas. En el primer caso, las enzimas se añaden a la mezcla
de reacción, mientras que en el segundo caso las enzimas (o las
células bacterianas) se inmovilizan en soportes adecuados.
La inmovilización de las enzimas o células
bacterianas produce la ventaja de no tener que separar las enzimas
de la mezcla de productos al final de la reacción y de permitir, por
lo tanto, la recuperación de las enzimas o las células bacterianas
y reutilizarlas para una reacción posterior. La inmovilización
permite además llevar a cabo las reacciones de forma continua o por
lotes, obteniéndose por lo tanto mayores rendimientos y alcanzándose
mayor idoneidad para su uso en una escala industrial.
Por último, las reacciones enzimáticas se pueden
optimizar por medio de manipulación genética de las bacterias que
producen la enzima. Tal manipulación normalmente tiene como fin
conferir un mayor rendimiento de enzima o actividad enzimática. Sin
embargo, se pueden considerar otros factores tales como la supresión
de la producción de otras posibles enzimas por el microorganismo,
la estereoselectividad o regioselectividad de la enzima de
interés, etc.
interés, etc.
Se describen reacciones enzimáticas para
producir cladribina en numerosos artículos y patentes. Entre ellos
se destacan los siguientes.
En Michailopulo, I A et al (1993)
Nucleosides & Nucleotides, 12 (3&4) 417-422,
se describe la síntesis bioquímica de cladribina empezando de
cloroadenina y desoxiguanosina en presencia de células de E.
coli.
La solicitud de patente de EE.UU. No.
2006/0094869 describe una reacción entre cloroadenina y
desoxirribosa-1-fosfato en presencia
de enzima purina nucleósido fosforilasa (PNP) purificada.
Los documentos mencionados anteriormente
describen procesos de producción de cladribina que mientras son
ventajosos con respecto a los métodos químicos descritos
anteriormente, implican sin embargo, varios inconvenientes,
incluyendo rendimientos bajos, sustratos (por ejemplo
desoxiguanosina y
desoxirribosa-1-fosfato) que son
difíciles de encontrar y por último pasos del proceso (tal como el
aislamiento final en cromatografía en columna) de difícil aplicación
industrial.
El último paso de aislamiento y purificación del
producto final ha sido en general el más problemático para el
proceso de producción entero de la cladribina por medios
enzimáticos.
El problema técnico que subyace a la presente
invención es por lo tanto el de hacer disponible un método para la
producción de cladribina que permita obtener rendimientos de
producto que sean iguales o mayores que los de la técnica anterior,
empezando a partir de materias primas económicas, fáciles de
encontrar, y que al mismo tiempo sea económicamente ventajoso y
permita un aislamiento fácil del producto final.
Tal problema se resuelve según la presente
invención mediante un método para producir cladribina
(2-cloro-2'-desoxiadenosina)
que comprende los pasos de:
- a)
- reacción de 2-desoxiuridina con 2-cloroadenina, en presencia de uridina fosforilasa (UPasa) y purina nucleósido fosforilasa (PNPasa) en un medio de reacción acuoso que posiblemente contenga hasta el 40% v/v de un solvente dipolar aprótico, para obtener cladribina disuelta en dicho medio de reacción;
- b)
- aislamiento de la cladribina mediante precipitación por medio de concentración y alcalinización del medio de reacción hasta un pH de 11,5-12,5.
\newpage
Las enzimas UPasa y PNPasa pueden estar
presentes en el medio de reacción en forma de enzimas libres o
enzimas inmovilizadas en soportes adecuados, o se pueden producir
in situ por células que las producen, que a su vez pueden
estar presentes en el medio de reacción en forma libre o en forma
inmovilizada.
Cuando se usan células productoras de la enzima
UPasa o células productoras de la enzima PNPasa, o cuando se usan
células productoras tanto de la enzima UPasa como de PNPasa, tales
células preferiblemente se inmovilizan mediante adsorción sobre una
resina de intercambio aniónico débil, en particular sobre una resina
de intercambio aniónico débil que tiene grupos funcionales amino.
Particularmente preferida es una resina elegida del grupo que
comprende las resinas Dowex MWA1 (Dow Chemical), Diaion WA30
(Mitsubishi), Duolite A7®, Amberlite FPA54®, Amberlyst 21 y Duolite
A568® (Rohm & Haas). La última resina es particularmente
preferida para los objetos de la presente invención.
El proceso para obtener la inmovilización de las
células productoras de UPasa y/o PNPasa en resinas de intercambio
aniónico débil se describe en la solicitud EP 06005241 del mismo
solicitante.
Según una forma de realización de la invención,
las células anteriormente mencionadas son células de la especie
Escherichia coli.
El uso de células de Escherichia coli de
la cepa DH5alfa, transformadas por medio de vectores plasmídicos que
tienen las secuencias descritas en secuencia Id No. 1 y 2, es
particularmente preferido.
El solvente dipolar aprótico anteriormente
mencionado en general está representado por dimetilformamida o por
dimetilsulfóxido o mezclas de los mismos y es preferiblemente
dimetilformamida.
El paso de alcalinización ya mencionado
preferiblemente se lleva a cabo de modo que se obtenga un pH igual a
alrededor de 12.
Preferiblemente la
2-desoxiuridina y la 2-cloroadenina
se hacen reaccionar en una relación molar que varía desde 1:1 hasta
3:1, ventajosamente alrededor de 2:1.
La reacción entre
2-desoxiuridina y 2-cloroadenina en
general se lleva a cabo en un medio tamponado, por ejemplo por medio
de un tampón fosfato, a un pH en el intervalo de
6,5-8,5, preferiblemente
7,3-7,8.
La reacción generalmente se realiza a una
temperatura en el intervalo de 50-70ºC,
adecuadamente a alrededor de 60ºC.
Según un aspecto adicional de la presente
invención, la reacción entre 2-desoxiuridina y
2-cloroadenina se lleva a cabo añadiendo
gradualmente al medio de reacción acuoso tamponado a pH
7-8 y que contiene las enzimas y la
2-desoxiuridina, una solución de
2-cloroadenina en una mezcla de agua y un solvente
dipolar aprótico, a una velocidad tal que la
2-cloroadenina permanece en solución hasta que se ha
convertido en el producto final, es decir, tal que no produce
precipitación de 2-cloroadenina durante la
reacción.
La solución de 2-cloroadenina
anteriormente mencionada se prepara preferiblemente resuspendiendo
la 2-cloroadenina en un solvente dipolar aprótico y
añadiendo una solución concentrada de un hidróxido alcalino hasta
que se obtiene la disolución completa de la
2-cloroadenina.
El solvente dipolar aprótico en cuestión es
preferiblemente dimetilformamida y el hidróxido alcalino es
preferiblemente KOH, usado en una concentración en el intervalo del
20-30% peso/volumen.
Se prevé la adición de una solución acuosa de un
ácido fuerte al mismo tiempo que la adición de la solución de
2-cloroadenina, a tal grado que se mantenga el pH de
la mezcla de reacción entre 6,5 y 8,5, preferiblemente entre 7,3 y
7,8.
Como el ácido fuerte, se pueden usar ácidos
minerales tales como HCl o H_{3}PO_{4}, o se pueden usar ácidos
orgánicos tal como, por ejemplo, ácido cítrico.
Los pasos anteriormente mencionados de
concentración y alcalinización del medio de reacción al final de la
reacción se pueden llevar a cabo en cualquier orden pero
preferiblemente la alcalinización se lleva a cabo primero, seguida
por la concentración.
Cuando se usan enzimas inmovilizadas o células
inmovilizadas, antes de proceder con los pasos de alcalinización y
concentración, se lleva a cabo un paso de filtración o
centrifugación para retirar las enzimas inmovilizadas o células
inmovilizadas de la mezcla de reacción.
El precipitado obtenido al final de tales pasos
se filtra y posiblemente se recristaliza con una mezcla
hidroalcohólica, por ejemplo con etanol/agua 95:10 v/v.
\newpage
Gracias al método según la presente invención,
es posible llevar a cabo una reacción estereoespecífica, que
produce la formación de rendimientos altos del producto deseado sólo
en su configuración \beta. Además, el método según la presente
invención resuelve los inconvenientes mencionados en la técnica
anterior y permite aislar la cladribina producida de una manera
extremadamente sencilla, eficaz y económica, haciendo de esta
manera el método fácilmente transferible a una producción
industrial. En particular, el paso de aislamiento de la cladribina
de los otros componentes de la mezcla de reacción se ejecuta
brillantemente con una sencilla variación del pH, sin tener que
recurrir a costosas separaciones cromatográficas, y permite obtener
el producto con un nivel alto de pureza.
Como se ha manifestado anteriormente, se
prefiere realizar la reacción de transglicosilación según la
invención usando, más que las enzimas UPasa y PNPasa como tales,
células productoras de UPasa y/o PNPasa inmovilizadas. Tales
células son preferiblemente células de Escherichia coli
genéticamente modificadas, capaces de expresar cantidades
considerables de UPasa o PNPasa.
Tales células se obtuvieron de la siguiente
manera:
Se construyeron las cepas recombinantes
transformando una cepa huésped de Escherichia coli con un
plásmido con un alto número de copias que contenía el gen de
interés y un marcador para la selección.
La cepa huésped usada es la cepa DH5alfa,
fácilmente encontrada en el mercado (GIBCO-BRL) y
descrita extensamente en la bibliografía. Es una cepa derivada de
Escherichia coli K12 y por lo tanto considerada de clase de
seguridad 1, adaptada de esta manera para un uso de tipo
industrial.
El gen UdP, que codifica la enzima UPasa, y el
gen deoD, que codifica la enzima PNPasa, ya se han descrito bien en
la bibliografía y sus secuencias son conocidas y están disponibles
en la base de datos del EMBL, caracterizadas por los números de
acceso X15679 para UdP y M60917 para deoD.
Los genes se amplificaron por medio de PCR
(reacción en cadena de la polimerasa) usando cebadores sintéticos
adecuadamente preparados.
Los genes se insertaron, usando las enzimas de
restricción apropiadas KpnI y SalI para UdP y EcoRI y SalI para
deoD, en la zona del poliligador del plásmido con un alto número de
copias de pUC18, bien caracterizado en la bibliografía y
comercialmente disponible.
En ambos plásmidos (el que contiene el gen UdP y
el que contiene el gen deoD), se insertó después la resistencia al
antibiótico kanamicina, obtenido por medio de digestión con la
enzima de restricción HindIII del plásmido pBSL14, que está
comercialmente disponible.
Por último, para ambos plásmidos (el que
contiene el gen UdP y el que contiene el gen deoD), se destruyó la
resistencia a ampicilina mediante deleción, por medio de digestión
con la enzima AvaII.
De forma inesperada, se encontraron dos sitios
reconocidos por la enzima de restricción AvaII, con la formación
consecuente de 3 fragmentos de plásmido más que los dos esperados,
mientras que en la bibliografía sólo se describe un sitio para esta
enzima de restricción.
Los plásmidos finales se obtuvieron recuperando
los dos fragmentos mayores y eliminando el fragmento innecesario que
se había formado. Las características principales de las nuevas
cepas genéticamente modificadas se describen en la siguiente
tabla.
Las secuencias de los plásmidos según la tabla
precedente se describen en las listas al final de la descripción y
en particular la secuencia del plásmido pUC18 que contiene el gen
UdP corresponde a secuencia Id No. 1 y la secuencia del plásmido
pUC18 que contiene el gen deoD corresponde a secuencia Id No. 2.
El biocatalizador se prepara usando las cepas
genéticamente modificadas de Escherichia coli que son capaces
de sobreexpresar las actividades fosforilasa debido a las enzimas
uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa, en el caso
específico de las cepas EXP05/03 y EXP05/04. La inmovilización de
suspensiones de células que contienen la actividad enzimática UPasa
y la actividad enzimática PNPasa se prepara empezando de una mezcla
de suspensiones celulares preparadas de modo que tengan una relación
entre la actividad enzimática debido a la enzima UPasa y la
actividad enzimática debido a la enzima PNPasa en el intervalo de
1:1-3:1. En este ejemplo, se describe la
inmovilización de una mezcla de suspensiones celulares en la que la
relación entre la actividad enzimática debido a la enzima UPasa y
la actividad enzimática debido a la enzima PNPasa es alrededor de
3:1.
Se añaden alrededor de 20 (peso seco) gramos de
resina Duolite A568 de Rohm & Haas a 200 ml de una mezcla de
suspensiones celulares compuesta de células que contienen la
actividad enzimática UPasa (EXP05/03) en la medida de alrededor de
115 unidades/ml y de células que contienen la actividad enzimática
PNPasa (EXP 05/04) en la medida de alrededor de 33 unidades/ml.
La mezcla se mantiene a temperatura ambiente con
agitación moderada durante 48 horas. La mezcla de inmovilización se
filtra después. La resina se lava con agua hasta que se obtienen
aguas de lavado transparentes (alrededor de 2 litros).
La resina con las actividades enzimáticas
inmovilizadas se conserva a 4ºC en tampón fosfato de potasio 0,1 M a
pH 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad catalítica de las enzimas UPasa y
PNPasa acopladas en la resina con células inmovilizadas se determina
con una reacción de transglicosilación llevada a cabo usando
condiciones normalizadas.
Se añaden 200 g ó 400 g de soporte sólido con
células inmovilizadas que contienen la actividad enzimática UPasa y
la actividad enzimática PNPasa (peso húmedo) como se describe en el
punto precedente a 10 ml de mezcla de reacción.
La reacción se lleva a cabo con la siguiente
solución: arabinofuranosiluracilo (Ara-U) 40 mM,
adenina 40 mM, fosfato de potasio monobásico 30 mM, pH 7,2, a una
temperatura controlada a 60ºC. Después de 60 minutos a 60ºC, la
reacción se para diluyendo la reacción 1:50 en agua. Se determina el
porcentaje de adenina convertido en arabinofuranosiladenina
(ARA-A) analizando una alícuota de la mezcla de
reacción con un cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC)
equipado con una columna Nucleosil 100-5
(Machery-Nagel) de tamaño 250 x 4,6 mm, eluyendo
con un tampón fosfato monobásico 10 mM-metanol al
6%. Las actividades catalíticas de las enzimas UPasa y PNPasa
acopladas (actividad catalítica de transglicosilación) se expresan
en unidades/g húmedo (micromoles por minuto de adenina convertida
para formar ARA-A en las condiciones del
ensayo/gramos de peso húmedo de pasta celular) y se calcula con
respecto al porcentaje de conversión de adenina.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas recombinantes EXP05/03 (que codifica
la enzima UPasa) y EXP05/04 (que codifica la enzima PNP) se
fermentaron de forma separada por lotes usando un fermentador con un
volumen útil de 15 litros, que contenía 15 de medio de cultivo con
la siguiente composición (por litro):
13,3 g de KH_{2}PO_{4};
40 g de soytona;
36 g de extracto de levadura;
1,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O;
0,02 g de kanamicina.
El fermentador se inoculó con alrededor de 150
ml de suspensión bacteriana que se había hecho crecer previamente
durante alrededor de 24 horas a 37ºC. La fermentación se llevó a
cabo usando los siguientes parámetros: 37ºC de temperatura,
agitación mecánica de alrededor de 250 r.p.m., flujo de aire
automáticamente controlado para mantener el valor de pO_{2} al
20% de la concentración de saturación, pH controlado a 7 \pm 0,2
por medio de la adición de una solución de amoniaco al 10% o una
solución de ácido fosfórico al 20%.
Una vez terminada la fermentación (completada en
alrededor de 24 horas), se recogió la pasta de células para
centrifugación, se lavó con tampón fosfato de potasio 100 mM a pH
7,0, se recogió de nuevo para centrifugación y se conservó en forma
de pasta celular húmeda a una temperatura de -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añade una cantidad conocida (100 ó 200
microlitros) de suspensión de células que expresan la enzima UPasa
(EXP05/03), diluida 1:100 ó 1:1000 como peso húmedo/volumen en
tampón fosfato de potasio a pH 7,0-7,2, a 800
microlitros de una solución de uridina 75 mM en tampón fosfato 100
mM, pH 7,0-7,2, pre-incubada a 30ºC.
Después de exactamente 5 minutos, la reacción de fosforolisis se
para con la adición de 1 ml de HCl. Se analiza una alícuota de la
mezcla de reacción con un cromatógrafo líquido de alta resolución
(HPLC) equipado con una columna Nucleosil 100-5
(Machery-Nagel) de tamaño 250 x 4,6 mm. La elución
se lleva a cabo con una solución de fosfato de potasio monobásico 10
mM-metanol al 6%.
La actividad enzimática de la pasta celular se
expresa como unidades/gramo de peso húmedo (micromoles transformados
por minuto por 1 gramo de pasta celular húmeda) y se calcula con
respecto a una curva patrón construida con las cantidades de
uracilo formadas en las mismas condiciones de ensayo, usando
cantidades crecientes de la misma pasta celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añade una cantidad conocida (100 ó 200
microlitros) de suspensión de células que expresan la enzima PNPasa
(EXP05/04), diluida 1:100 ó 1:1000 como peso húmedo/volumen en
tampón fosfato de potasio a pH 7,0-7,2, a 800
microlitros de una solución de inosina 60 mM en tampón fosfato 100
mM, pH 7,0-7,2, pre-incubada a 30ºC.
Después de exactamente 10 minutos, la reacción de fosforolisis se
para con la adición de 1 ml de HCl. Se analiza una alícuota de la
mezcla de reacción con un cromatógrafo líquido de alta resolución
(HPLC) equipado con una columna Nucleosil 100-5
(Machery-Nagel) de tamaño 250 x 4,6 mm. La elución
se lleva a cabo con una solución de fosfato de potasio monobásico
10 mM-metanol al 6%. La actividad enzimática de la
pasta celular se expresa como unidades/gramo de peso húmedo
(micromoles transformados por minuto por 1 gramo de pasta celular
húmeda) y se calcula con respecto a una curva patrón construida con
las cantidades de hipoxantina formadas en las mismas condiciones de
ensayo, usando cantidades crecientes de la misma pasta celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Se resuspendieron 0,42 g (igual a 2,5 mmoles) de
2-cloroadenina en 50 ml de DMF y se calentó mientras
se agitaba. Se añadieron alícuotas de DMF hasta que se obtuvo una
solubilización completa en caliente. Se necesitaron 100 ml de
solvente para obtener la solubilización de la
2-cloroadenina.
También se llevó a cabo una prueba de
solubilización de 2-cloroadenina en KOH al 25% para
aumentar la solubilización. Se resuspendieron 4,05 g de
2-cloroadenina en KOH que se agitaba. Se añadieron
alícuotas de KOH (al 25% peso:volumen) hasta que se obtuvo la
solubilización completa. Incluso después de la adición de 100 ml de
KOH al 25%, la 2-cloroadenina permaneció
prácticamente sin disolver. Incluso en KOH muy concentrado la
molécula era prácticamente insoluble.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una reacción de
transglicosilación usando 2-cloroadenina
solubilizada en DMF. Se resuspendieron 0,42 gramos (igual a 2,5
mmoles) de 2-cloroadenina y se solubilizaron en
caliente mientras se agitaban en 100 ml de DMF, hasta hervir,
obteniéndose una solución 25 mMolar.
A 25 ml de esta solución, controlada a 60ºC, se
añadieron 80 ml de una solución de
2'-d-uridina 18,75 mM y
KH_{2}PO_{4} 37,5 mM a pH 7,3 para el KOH, calentada a 70ºC.
Durante la adición de esta solución, se produjo la formación de un
precipitado que se mantuvo sin disolver incluso calentando de nuevo
hasta ebullición.
Se ha repetido la prueba añadiendo la solución
de 2'-d-uridina/KH_{2}PO_{4}
gota a gota. Después de una pequeña adición, se nota la formación
del precipitado, que se disuelve lentamente parando la adición. El
resto de la solución se añadió en alícuotas muy pequeñas, dejando
que se equilibrara la situación.
De esta manera, se obtuvo una solución
transparente a la que añadieron 5 gramos de resina con células
inmovilizadas con una actividad de 5 unidades/gramo húmedo de resina
(medida como el punto 3).
La mezcla final tenía una concentración de
d-uridina de 15 mM; 2-cloroadenina 5
mM; KH_{2}PO_{4} 30 mM; resina con células inmovilizadas: 250
unidades/litro de reacción.
La reacción se siguió por HPLC y después de 3
horas hubo una conversión de alrededor del 80% de la
2-cloroadenina en cladribina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aumentar la solubilidad de la
2-cloroadenina en DMF, se añadieron bases o ácidos
concentrados y en ambos casos se obtuvo una mayor
solubilización.
El ambiente ácido, sin embargo, puede degradar
los desoxinucleósidos, por lo tanto las pruebas se llevaron a cabo
sólo con la adición de KOH concentrado.
Se pesaron 4,05 gramos (igual a 24 mmoles) de
2-cloroadenina y se resuspendieron en 50 ml de DMF.
Se añadieron 30 ml de KOH al 25% (peso:volumen). Se mantuvo una
ligera opalescencia que desapareció con la adición de 10 ml de
H_{2}O, obteniéndose una solución 266 mMolar. A esta solución,
controlada a 60ºC, se añadieron 600 ml de una solución a pH 7,3 que
contenía 10,95 gramos (igual a 48 mmoles) de
2'-d-uridina y 4 g de
KH_{2}PO_{4} (igual a 30 mmoles). Se obtuvo una precipitación
incipiente de la 2-cloroadenina.
Se repitió la preparación de las dos soluciones.
Se añadieron 30 gramos húmedos de resina con células inmovilizadas
(5 U/gramo húmedo calculado como en el punto 3) a la solución de
2'-d-uridina, controlada a 60ºC.
La solución de 2-cloroadenina en
DMF/KOH se añadió muy lentamente a esta suspensión, para prevenir la
precipitación de la 2-cloroadenina. De esta manera,
si la adición se produce a una velocidad adecuada, la mayoría de la
2-cloroadenina se transforma en cladribina antes de
alcanzar una concentración tal que produzca precipitación.
Con la adición de la
2-cloroadenina en DMF/KOH, el pH de la reacción
empezó a aumentar, y puesto que las actividades enzimáticas
funcionaban de manera óptima a valores fisiológicos de pH, fue
necesario añadir ácido clorhídrico para mantener el pH a los valores
deseados.
Al final de las adiciones, había las siguientes
concentraciones:
2-cloroadenina 35 mMolar;
2-desoxiuridina 70 mMolar; KH_{2}PO_{4} 37,5 mM;
resina con células inmovilizadas: 220 U/litro de reacción.
En estas condiciones, se obtuvo una conversión
del 80% de la 2-cloroadenina en cladribina.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de haber llevado a cabo diferentes
pruebas preliminares de optimización, se llevó a cabo una reacción
para preparar cladribina, añadiendo el sustrato
2-cloroadenina y el corrector de pH de una manera
controlada.
Se pesaron 6,75 gramos (igual a 40 mmoles) de
2-cloroadenina y se resuspendieron mientras se
agitaba en 50 ml de DMF. La solubilización se produjo con la
adición de 70 ml de KOH al 25% (peso:volumen), obteniéndose una
solución perfectamente transparente con una concentración de 333
mMolar. Se añadieron 18,25 gramos (igual a 80 mmoles) de
2'-desoxiuridina y 4 gramos (igual a 30 mmoles) de
fosfato de potasio monobásico anhidro y se solubilizó en 600 ml de
agua desionizada, obteniéndose una concentración de 133 mM para la
2-desoxiuridina y de 50 mM para KH_{2}PO_{4}.
El pH se corrigió a un valor de 7,5 con KOH al 25% (peso:volumen)
según se requirió.
La solución de 2'-desoxiuridina
en tampón fosfato se cargó en un reactor de 1 litro controlado a
60ºC con agitación mecánica.
Se añadieron al reactor 30 gramos húmedos de
resina recién filtrada con células inmovilizadas, preparada como en
el punto 2.
La actividad específica de la resina con células
inmovilizadas (medida como se describe en el punto 3) era de 5
U/gramo húmedo.
La solución de 2-cloroadenina en
KOH/DMF se añadió lentamente a la suspensión de
2'-desoxiuridina en tampón fosfato y resina con
células inmovilizadas. La adición se llevó a cabo por medio de una
bomba peristáltica con tubo de silicona con un diámetro interno de
1,5 mm, a una velocidad de flujo de alrededor de 1 ml/min (igual a
0,33 mmoles/minuto).
Para mantener el pH a valores óptimos, se añadió
una solución de ácido clorhídrico 2 N simultáneamente a la solución
de 2-cloroadenina en DMF/KOH, de modo que se
mantuviera el valor de pH en el intervalo de
6,5-8,5, preferiblemente en el intervalo de
7,3-7,8.
La adición de HCl 2 N se llevó a cabo con una
bomba peristáltica equipada con un tubo de silicona con un diámetro
interno de 1,5 mm y una velocidad de flujo de alrededor de 1
ml/min.
\newpage
Con respecto al volumen final, hubo las
siguientes concentraciones:
2-cloroadenina 50 mMolar;
2-desoxiuridina 100 mMolar; KH_{2}PO_{4} 37,5
mM; resina con células inmovilizadas: 187,5 U/litro de reacción.
Al final de la adición, la reacción se filtró en
papel. La resina se recuperó y almacenó en tampón fosfato 100 mM a
pH 7,4, a una temperatura de 4ºC, mientras que el filtrado se
procesó para el aislamiento de la cladribina. En estas condiciones,
alrededor del 80% de la 2-cloroadenina se convirtió
en cladribina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la misma reacción de acuerdo con
el punto 8 usando dimetilsulfóxido como solvente para la
solubilización de la 2-cloroadenina en lugar de
dimetilformamida.
Se pesaron 5,4 gramos (igual a 32 mmoles) de
2-cloroadenina y se resuspendieron mientras se
agitaba en 50 ml de DMSO. La solubilización se produjo con la
adición de 70 ml de KOH al 25% (peso:volumen), obteniéndose una
solución perfectamente transparente con una concentración de 266
mMolar de 2-cloroadenina. Se disolvieron 14,6
gramos (igual a 64 mmoles) de 2'-desoxiuridina y 4
gramos (igual a 30 mmoles) de fosfato de potasio monobásico anhidro
en alrededor de 600 ml de agua desionizada, obteniéndose 106 mM para
la 2'-desoxiuridina y de 50 mM para
KH_{2}PO_{4}. El pH se corrigió a un valor de 7,5 con KOH al 25%
(peso:volumen) según se requirió.
La solución de 2'-desoxiuridina
en tampón fosfato se cargó en un reactor de 1 litro controlado a
60ºC con agitación mecánica.
Se añadieron al reactor 30 gramos húmedos de
resina recién filtrada con células inmovilizadas, preparada como en
el punto 2.
La actividad específica de la resina con células
inmovilizadas (medida como se describe en el punto 3) era de 5
U/gramo húmedo.
La solución de 2-cloroadenina en
KOH/DMF se añadió después lentamente a la suspensión de
2'-desoxiuridina en tampón fosfato y resina con
células inmovilizadas. La adición se llevó a cabo por medio de una
bomba peristáltica con tubo de silicona con un diámetro interno de
1,5 mm, a una velocidad de flujo de alrededor de 1 ml/min (igual a
0,26 mmoles/minuto).
Para mantener el pH a valores óptimos, se añadió
una solución de ácido clorhídrico 2 N simultáneamente a la solución
de 2-cloroadenina en DMF/KOH, de modo que se
mantuviera el valor de pH en el intervalo de
6,5-8,5, preferiblemente en el intervalo de
7,3-7,8.
La adición de HCl 2 N se llevó a cabo con una
bomba peristáltica equipada con un tubo de silicona con un diámetro
interno de 1,5 mm y una velocidad de flujo de alrededor de 1
ml/min.
Con respecto al volumen final, se habrían
obtenido las siguientes concentraciones:
2-cloroadenina 40 mMolar;
2-desoxiuridina 80 mMolar; KH_{2}PO_{4} 37,5 mM;
resina con células inmovilizadas: 187,5 U/litro de reacción.
Al final de la adición, la reacción se filtró en
papel. La resina se recuperó y almacenó en tampón fosfato 100 mM a
pH 7,4, a una temperatura de 4ºC, mientras que el filtrado se
procesó para el aislamiento de la cladribina. En estas condiciones,
alrededor del 80% de la 2-cloroadenina se convirtió
en cladribina.
\vskip1.000000\baselineskip
El pH se puede controlar y mantener constante
alrededor de los valores óptimos usando también ácido fosfórico,
además de ácido clorhídrico, lo que permite la terminación de la
reacción sin encontrar problemas de precipitación de la
2-cloroadenina. Se obtuvieron resultados
equivalentes usando una solución de ácido fosfórico al 5% en lugar
de ácido clorhídrico 2 N.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina con células inmovilizadas usada para
una reacción, después de haber sido filtrada y separada de la mezcla
de reacción, se almacenó a 4ºC en tampón fosfato o se usó
inmediatamente para una reacción posterior.
Se usó la resina con células inmovilizadas
(preparada como en el punto 2), con rendimientos finales
equivalentes, para al menos 4 reacciones posteriores.
La presencia de DMF en la solución de
2-cloroadenina, la temperatura relativamente alta y
la adición de soluciones concentradas de ácido y base no produjeron
disminuciones drásticas de la actividad biocatalizadora.
\vskip1.000000\baselineskip
Se procesó la mezcla de reacción filtrada para
poder aislar y purificar la cladribina de los otros componentes de
la reacción.
La mezcla de reacción filtrada se concentró en
un rotavapor hasta que el volumen inicial se redujo en
aproximadamente 3 veces, y se transfirió primero a temperatura
ambiente y después a 4ºC. Se formó un precipitado que se separó
mediante filtración y que estaba compuesto esencialmente de
2-cloroadenina sin reaccionar y por uracilo formado
durante la reacción.
Se llevaron a cabo pruebas de precipitación en
las aguas madre resultantes variando los valores de pH.
Las pruebas se realizaron a pH
4,0-7,0-10,0-12,0.
A un pH ácido, se produjo la formación de
precipitado, que estaba formado sólo por sales inorgánicas.
A valores de pH de 7,0 y 10,0, se obtuvo el
precipitado compuesto esencialmente de cladribina y uracilo, el
último en cantidades considerables.
Sólo con la prueba de pH 12,0 se obtuvo un
precipitado, que se determinó que era cladribina con gran pureza.
Para aumentar el rendimiento, se repitió el cambio de pH en una
solución que estaba 5 veces más concentrada, obteniéndose siempre un
producto de gran pureza.
Concentrando 10 veces, se obtuvo una
coprecipitación, esencialmente de cladribina y uracilo residual.
La cladribina obtenida de esta manera se
recristalizó en condiciones de reflujo a 90ºC en 20 volúmenes de
mezcla EtOH:H_{2}O, obteniéndose un producto anhídrido con gran
pureza (mayor del 99,0%). El rendimiento cuantitativo de la
cladribina después de la purificación y recristalización está en el
intervalo de 4-5 gramos por cada litro de mezcla de
reacción, tanto para las reacciones con DMF como para aquellas con
DMSO.
Para mejorar el proceso desde un punto de vista
industrial, se llevó a cabo una prueba en la que la mezcla de
bioconversión se llevó a pH 12,0 una vez que se había terminado la
reacción y el biocatalizador se había separado. Posteriormente, la
concentración de la solución se llevó a cabo reduciendo el volumen
5-6 veces, obteniéndose precipitación. El
precipitado se transfirió frío y separado por filtración,
produciendo cladribina con un alto nivel de pureza.
De esta manera, se eliminaron el primer paso de
concentración y la filtración posterior, simplificando el proceso y
se obtuvo un producto de calidad comparable.
<110> Explora Laboratories SA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para la producción de
cladribina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EXP002BEP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (49)...(843)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resistencia a kanamicina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1285)...(2046)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> UDP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4393
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<223> Plásmido
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<220>
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<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (438)...(1232)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resistencia a kanamicina
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<220>
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<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1277)...(1977)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DEOD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Método para producir cladribina
(2-cloro-2'-desoxiadenosina)
que comprende los pasos de:
- a)
- reacción de 2-desoxiuridina con 2-cloroadenina, en presencia de uridina fosforilasa (UPasa) y purina nucleósido fosforilasa (PNPasa) en un medio de reacción acuoso que opcionalmente contiene hasta el 40% v/v de un solvente dipolar aprótico, para obtener cladribina disuelta en dicho medio de reacción;
- b)
- aislamiento de la cladribina mediante precipitación por medio de concentración y alcalinización del medio de reacción hasta pH 11,5-12,5.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en donde
dichas enzimas UPasa y PNPasa se producen in situ por células
capaces de producirlas.
3. Método según la reivindicación 2, en donde
dichas células productoras de UPasa y PNPasa se inmovilizan en un
soporte adecuado.
4. Método según la reivindicación 3, en donde
dicho soporte está compuesto de una resina de intercambio aniónico
débil, sobre la que se adsorben dichas células.
5. Método según la reivindicación 4, en donde
dicha resina tiene grupos funcionales amino y se elige
preferiblemente del grupo que comprende las resinas Dowex MWA1 (Dow
Chemical), Diaion WA30 (Mitsubishi), Duolite A7®, Amberlite FPA54®,
Amberlyst 21 y Duolite A568® (Rohm & Haas).
6. Método según la reivindicación 5, en donde
resina es Duolite A568® (Rohm & Haas).
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 3-6, en donde dichas células
productoras de UPasa y PNPasa son células de la especie
Escherichia coli.
8. Método según la reivindicación 7, en donde
dichas células son células de Escherichia coli de la cepa
DH5alfa, transformadas por medio de vectores plasmídicos que tienen
las secuencias descritas en Secuencia Id. No. 1 y 2.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dicho solvente dipolar
aprótico consiste en dimetilformamida y/o dimetilsulfóxido.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dicho paso de alcalinización
produce un pH final de alrededor de 12.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la
2-desoxiuridina y la 2-cloroadenina
se hacen reaccionar en una relación molar que varía de 1:1 a
3:1.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la reacción entre
2-desoxiuridina y 2-cloroadenina se
lleva a cabo en un medio tamponado a un pH en el intervalo de
6,5-8,5, preferiblemente en el intervalo de
7,3-7,8.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la reacción entre
2-desoxiuridina y 2-cloroadenina se
realiza a una temperatura en el intervalo de
50-70ºC, preferiblemente alrededor de 60ºC.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la reacción entre
2-desoxiuridina y 2-cloroadenina se
lleva a cabo añadiendo gradualmente una solución de
2-cloroadenina en una mezcla de agua y un solvente
dipolar aprótico al medio de reacción acuoso tamponado a pH
6,5-8,5 y que contiene las enzimas y la
2-desoxiuridina.
15. Método según la reivindicación 14, en donde
dicha solución de 2-cloroadenina se prepara
resuspendiendo la 2-cloroadenina en un solvente
dipolar aprótico y añadiendo una solución concentrada de un
hidróxido alcalino hasta que la disolución de
2-cloroadenina es completa.
16. Método según la reivindicación 15, en donde
dicho solvente dipolar aprótico es dimetilformamida o
dimetilsulfóxido y el hidróxido alcalino es KOH, usado a una
concentración en el intervalo del 20-30%
peso/volumen.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 14-16, en donde, al mismo tiempo
que la adición de la solución de 2-cloroadenina, se
lleva a cabo la adición de una solución acuosa de un ácido fuerte, a
tal velocidad que se mantenga el pH de la mezcla de reacción entre
6,5-8,5, preferiblemente entre
7,3-7,8.
18. Método según la reivindicación 17, en donde
dicho ácido fuerte se elige entre ácido clorhídrico y ácido
fosfórico.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dicho paso de concentración
sigue a dicho paso de alcalinización.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende los pasos adicionales de
recuperación de la cladribina precipitada por medio de filtración y
posterior recristalización de la misma.
21. Método según la reivindicación 20, en donde
dicha recristalización se lleva a cabo mediante una mezcla
hidroalcohólica, preferiblemente etanol:agua 95:10.
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