ES2335711T3 - Polvos para inhalacion que contienen fenilalanina. - Google Patents

Abstract

Polvo que contiene una proteína y fenilalanina, caracterizado porque, el polvo contiene por lo menos un 30% (p/p) de fenilalanina, de preferencia por lo menos un 40% (p/p) de fenilalanina.

Description

Polvos para inhalación que contienen fenilalanina.

Antecedentes de la invención Ámbito técnico

La invención se refiere a polvos que contienen fenilalanina, en particular, polvos secados por pulverización, los cuales contienen fenilalanina y una proteína, en donde la proteína es de preferencia una substancia activa, y en particular una substancia activa farmacéutica. Los polvos de la invención contienen una proporción de fenilalanina de por lo menos el 30% (p/p), de preferencia el 40% (p/p) y opcionalmente por lo menos una segunda substancia farmacéutica auxiliar compatible, a saber, un azúcar, el cual aumenta la estabilidad de la proteína.

La invención se refiere además, a un procedimiento para la obtención de estos polvos que contienen fenilalanina, así como a su empleo en particular como medicamento para inhalación. Proteínas preferidas son las substancias activas farmacéuticas como los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas de fusión con anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, hormonas, factores de crecimiento, enzimas, citocinas, interferones o similares, para el tratamiento local de las vías respiratorias o para tratamiento sistémico.

Antecedentes

Las preparaciones de proteínas o respectivamente substancias activas/preparaciones de substancias activas, formuladas en soluciones acuosas, están sujetas a parciales inestabilidades, las cuales pueden conducir a una disminución de la actividad o respectivamente bioactividad, y a un aumento de la toxicidad o respectivamente incompatibilidad. Esto vale tanto para los productos farmacéuticos clásicos como también para las proteínas y en particular, para substancias activas que contienen péptidos o respectivamente proteínas. La estabilidad de las proteínas o respectivamente de las substancias activas farmacéuticas puede verse influida positivamente por las variaciones en la estructura (interna) o por adición de substancias auxiliares adecuadas (externas).

Un procedimiento habitual para la estabilización externa de proteínas o substancias activas farmacéuticas, es el empleo de substancias auxiliares apropiadas. Las substancias auxiliares pueden clasificarse groseramente en las siguientes clases: azúcares y polioles, aminoácidos, aminas, sales, polímeros y tensioactivos.

Los azúcares y polioles se emplean a menudo como estabilizadores no específicos. Su efecto estabilizante se atribuye principalmente en las proteínas o substancias activas biológicas, a la "exclusión preferencial" (Xie y Timasheff, 1997, Biophysical Chemistry, 64(1-3), 25-43; Xie y Timasheff, 1997, Protein Science ("Ciencia de las proteínas"), 6(1), 211-221; Timasheff, 1998, Advances in protein chemistry ("Progresos en la química de las proteínas"), 51, 355-432). En la selección de los azúcares, las proteínas o substancias activas biológicas, deben evitarse al máximo los azúcares reductores. De preferencia, se emplean la sacarosa y la trehalosa como azúcares no reductores. Otros ejemplos de substancias auxiliares apropiadas son la glucosa, sorbitol, glicerina (Boctor y Mehta, 1992, Journal of Pharmacy and Pharmacology ("Revista de Farmacia y Farmacología"), 44 (7), 600-3; Timashefff, 1993, Annual review of biophysics and biomolecular structure ("Revisión anual de la estructura biofísica y biomolecular"), 22, 67-97; Chang et al., 1993, Pharmaceutical Research ("Investigación Farmacéutica"), 10(10), 1478-83) y Mannitol (Hermann et al.,1996, Pharmaceutical Biotechnology ("Biotecnología Farmacéutica"), 9 ("Formulation, Characterization and Stability of Protein Drugs" ("Formulación, caracterización y estabilidad de los fármacos de proteína"), 303-328; Chan et al., 1996, Pharmaceutical Research ("Investigación Farmacéutica"), 13(5), 756-761). Además es conocido, que los más diferentes polímeros, que son estabilizadores de las proteínas o substancias activas farmacéuticas, actúan como por ejemplo, los anticuerpos. La albúmina de suero humano (HSA) empleada a menudo en el pasado dispone de muy buenas propiedades estabilizadoras, aunque sin embargo, debido a su potencial contaminación con agentes patógenos "blood-bourne" ("de transmisión sanguínea") es hoy en día, inadecuada. Entre los polímeros conocidos hasta el momento destaca la hidroxi-propil-\beta-ciclodextrina (HP-\beta-CD) como particularmente adecuada, dado que se aplica por vía parenteral sin peligro alguno. Otros ejemplos son los dextranos de alto peso molecular (18 a 82 kD), la polivinilpirrolidona (PVP), la heparina, la gelatina tipo A y B así como el hidroxietilalmidón (HES), la heparina, el sulfato de dextrano, el ácido polifosfórico, el ácido poli-L-glutamínico, y la poli-L-lisina.

Con los azúcares y polioles pueden emplearse también aminoácidos estabilizantes, solos o en combinación con otras substancias auxiliares. De preferencia, se emplean los aminoácidos para la estabilización de las proteínas. Por ejemplo, la adición de histidina, glicina, aspartato de sodio (Na-Asp), glutamato e hidrocloruro de lisina (Lys-HCl), inhibe la agregación del rhKGF en 10 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7,0) juntamente con 5% de manitol (Zhang et al., 1995, Biochemistry, 34 (27), 8631-41). La combinación de aminoácidos y propilenglicol mejora por ejemplo, la estabilidad estructural del rhCNTF (Dix et al., 1995, Pharmaceutical Research (Supplement) ("Investigación Farmacéutica (Suplemento)"), 12, pág. 97). La lisina y la arginina aumenta la termoestabilidad de la IL-1R (aumento de Tm), mientras que por el contrario, la glicina y la alanina actúan como desestabilizantes (Remmele et al., 1998, Pharmaceutical Research ("Investigación Farmacéutica"), 15(2), 200-208).

Además, puede aumentarse la estabilidad de los polvos con un contenido de proteína o substancias activas farmacéuticas mediante diferentes procedimientos de secado. El secado tiene lugar asimismo la mayoría de las veces en presencia de substancias auxiliares, las cuales dan estabilidad a las proteínas o substancias activas, y deben mejorar las propiedades de los polvos secos. Un factor decisivo en la estabilización por secado es la inmovilización de la proteína o de la substancia activa en una matriz amorfa. El estado amorfo posee una alta viscosidad con escasa movilidad molecular y pequeña reactividad. Las substancias auxiliares ventajosas deben pues, estar en situación de formar una matriz amorfa a la temperatura de transición vítrea lo más alta posible, en la cual la proteína o la substancia activa está incrustada. La selección de las substancias auxiliares depende por lo tanto en particular, de su capacidad de estabilización. Además, juegan también un papel decisivo, factores como la inocuidad farmacéutica de las substancias auxiliares así como su influencia sobre la formación de partículas, la dispersibilidad y la propiedad de fluidez, en particular cuando se trata de un procedimiento de secado por pulverización.

El secado por pulverización representa un procedimiento particularmente adecuado para aumentar la estabilidad química y física de las proteínas o substancias activas farmacéuticas del tipo péptido/proteína (Maa et al., 1998, Pharmaceutical Research ("Investigación Farmacéutica"), 15 (5), 768-775). Particularmente, en el campo de la terapia pulmonar se emplea de forma creciente el secado por pulverización (US 5.626.874; US 5.972.388; Broadhead et al., 1994, J. Pharm. Pharmacol., 46(6), 458-467), dado que la aplicación por inhalación representa también actualmente una alternativa al tratamiento de las enfermedades sistémicas (WO 99/07340). Es premisa indispensable que el tamaño medio de partícula aerodinámico (MMDA = diámetro aerodinámico de la masa media), de la partícula de polvo esté en el margen de 1-10 \mum, de preferencia 1-7,5 \mum, de manera que las partículas puedan llegar a las partes más profundos del pulmón y con ello al torrente circulatorio sanguíneo. La patente DE-A-179 22 07 describe como ejemplo, la obtención de las correspondientes partículas de secado por pulverización. Entre tanto se han descrito un gran número de procedimientos para la obtención de los polvos correspondientes (WO 93/31479; WO 96/09814; WO 96/32096; WO 96/32149; WO 97/41833; WO 97/44013; WO 98/16205; WO 98/31346; WO 99/66903; WO 00/10541; WO 01/13893; Maa et al., 1998, supra; Vidgrén et al., 1987, Int. J. Pharmaceutics, 35, 139-144; Niven et al., 1994, Pharmaceutical Research ("Investigación Farmacéutica") 11, (8), 1101-1109).

Como substancias auxiliares en el secado por pulverización son apropiadas asimismo los azúcares y sus alcoholes (por ejemplo, la trehalosa, la lactosa, la sacarosa o el manitol), así como diferentes polímeros (Maa et al., 1997, Pharm. Development and Technology ("Desarrollo Farmacéutico y Tecnología"), 2(3), 213-223; Maa et al., 1998, supra; Dissertation Adler ("Tesis Adler"), 1998, Universidad de Erlangen; Costantino, et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87 (11), 1406-1411). Las substancias auxiliares predominantemente empleadas tienen sin embargo diferentes desventajas. La adición de trehalosa y manitol por ejemplo, empeora las propiedades de fluidez de las formulaciones de secado por pulverización (C. Bosquillon et al., 2001 Journal of Controlled Release ("Revista de la Liberación Controlada"), 70 (3), 329-339). La trehalosa secada por pulverización ocasiona a menudo una fuerte adhesividad de las partículas resultantes (L. Mao et al., 2004 Respiratory Drug Delivery ("Administración de Fármacos para la Respiración"), IX, págs. 653-656). Junto a ello existen problemas técnicos de procedimiento respecto a la producción de polvo y a la robustez del procedimiento, así como un empeoramiento de la biodisponibilidad del polvo en aplicaciones pulmonares provocado por una reducción de la fracción de partículas finas obtenidas. El manitol tiende además a un contenido de más del 20 por ciento en peso para la recristalización (Costantino et al., 1998, supra), por lo cual los efectos estabilizadores disminuyen espectacularmente. La lactosa, una substancia auxiliar a menudo empleada, mejora en verdad las propiedades de fluidez de las formulaciones secadas por pulverización (C. Bosquillon et al., 2001, supra), es sin embargo problemática, en particular en la formulación de proteínas o substancias activas que contienen péptido/proteína, puesto que la lactosa debido a su propiedad reductora puede emprender con los péptidos/proteínas reacciones Maillard de desestabilización.

Junto a la estabilización de las proteínas mediante substancias auxiliares, tiene lugar también la optimización de las propiedades físicoquímicas del polvo secado por pulverización, en el foco central de desarrollo de recetas. En particular, los polvos tienden, en especial los polvos secados por pulverización, a un comportamiento cohesivo y adhesivo. Una causa importante está en el tamaño de partícula necesario de < 10 \mum para el empleo pulmonar. En estos tamaños pequeños de partícula predominan particulares acciones recíprocas, como por ejemplo, fuerzas de Van der Waals, fuerzas capilares, acciones recíprocas dipolares, e interacciones electrostáticas, frente a fuerzas de gravitación [I. Zimmermann, Pharmazeutische Industrie ("Industria Farmacéutica"), ediciones Springer]. Mientras que las fuerzas capilares debido a la condensación del vapor de agua mediante un almacenamiento apropiado del polvo son controlables en una reducida humedad, las fuerzas de Van der Waals así como las acciones recíprocas electrostáticas, se muestran entre las partículas (secadas por pulverización), como un gran desafío.

Las acciones recíprocas entre partículas pueden reducirse mediante una hidrofobización de la superficie de las partículas. Para ello pueden disolverse y secarse por pulverización substancias hidrófobas como aditivo con la proteína o substancias activas de otras substancias auxiliares apropiadas. En el estado actual de la técnica se emplea para la hidrofobización de las superficies, entre otros, el aminoácido hidrófobo L-leucina (L. Mao et. al., 2004 Respiratory Drug Delivery ("Administración de Fármacos Respiratorios") IX, S. 653-656, AR. Najafabadi et al., 2004, Int J Pharm. 2004 Nov 5; 285 (1-2): 97-108). Dado que en este procedimiento solamente debe ser modificado el recubrimiento de la superficie, la proporción necesaria de L-leucina para ello es solamente del 5-10 por ciento en peso (% p/p). Un aumento de la proporción de aminoácido conduce a menudo a efectos de cristalización no deseados, por lo cual la proteína resulta dañada (Tesis de Richard Fuhrherr, 2005 Uni LMU Munich). La adición de otros aminoácidos como por ejemplo, la DL-asparagina, DL-arginina, DL-metionina, DL-fenilalanina y DL-triptófano (N.Y.K. Chew et al., 2002, Respiratory Drug Delivery ("Administración de Fármacos Respiratorios") VIII, págs. 743-745), a la proteína y de preferencia a la solución de pulverización, puede tener una influencia positiva sobre el comportamiento aerodinámico de las partículas. Junto a la directa adición de las substancias hidrófobas a la proteína y en particular a la solución de pulverización, pueden recubrirse las partículas de polvo en otra etapa del proceso con aditivos. Para ello son particularmente apropiados la L-leucina, los fosfolípidos, así como el estearato de Mg (WO 2004093848). Potenciales procedimientos para el recubrimiento son el mezclador de caída libre, por ejemplo, el mezclador de tambor (US 2005152849), aunque también los procedimientos mecánicos de mezcla, como por ejemplo la molienda por chorro (WO 2004093848).

Un método habitual para la administración de proteínas y péptidos es la aplicación parenteral. A este respecto, la substancia activa puede aplicarse por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular así como subcutánea. El estado actual de la técnica consiste en la administración del medicamento mediante una cánula, por ejemplo, en combinación con una jeringa, una "pluma", (en inglés, pen), como infusión con una bolsa de infusión. A este respecto, es una desventaja que las formulaciones en polvo deban ser reconstituidas antes de la aplicación, en forma de un líquido. La forma de aplicación parenteral además, debido a la fobia existente a menudo contra las inyecciones, no gusta a los pacientes. Por estos motivos las aplicaciones parenterales deben ser aplicadas a menudo por el médico. Por el contrario la forma de aplicación sistémica por inhalación puede ser aplicada por los mismos pacientes.

Las proteínas/péptidos pueden alcanzar el torrente circulatorio mediante una difusión pasiva o mediante un transporte activo a través de los pulmones. En el transporte pasivo, la velocidad de absorción es una función del tamaño de la molécula de la substancia activa [J.S. Patton, Nature Biotechnology ("Biotecnología de la Naturaleza"),16, 141ff, 1998].

Mientras que en las proteínas pequeñas, como por ejemplo la insulina, pueden comprobarse buenas biocompatibilidades (J.S. Patton, 1999 Advanced Drug Delivery Review ("Revisión Moderna de la Administración de Fármacos"), 35, 235, 227), las grandes proteínas muestran en general, y en particular los anticuerpos, una muy pequeña proporción de absorción. Para desarrollar sin embargo una forma de medicación eficiente, las grandes proteínas deben ser transportadas mediante mecanismos activos específicos a través del epitelio pulmonar. Una posibilidad de un transporte activo de anticuerpos a través del epitelio pulmonar es el receptor Fc neonatal (A. Bitonti, 2 2004, Respiratory Drug Delivery ("Suministro de fármacos respiratorios"), IX, 79-85). Pudo comprobarse que este receptor pulmonar, no solamente está disponible en un suficiente gran número en los recién nacidos, sino también en los niños y adultos, y puede ser aprovechado para el transporte activo de las substancias activas.

En la obtención de polvos con un contenido dado de proteínas para aplicaciones médicas, en particular de polvos o respectivamente composiciones de proteínas, secados por pulverización, existe un particular desafío para lograr junto a una buena estabilidad de las proteínas también un comportamiento aerodinámico lo más ventajoso posible, con lo cual los polvos o respectivamente sus partículas, en particular el polvo y partículas secados por pulverización, pueden acceder profundamente en los pulmones y con ello fácilmente al torrente circulatorio sanguíneo.

En la actualidad, se desarrollan cada vez más composiciones farmacéuticas inhalables (insulina inhalable como producto de desarrollo de las firmas Aradigm, Mannkind ó Kos, K. Corkery, Respiratory Care ("Higiene respiratoria"), 45, 831ff, 2000) ó respectivamente, ya están en el mercado (por ejemplo el Pulmozyme® como forma para inhalar de la desoxirribonucleasa humana recombinante I (rhDNasa), ó Exubera, como forma para inhalar la insulina humana, véase US 5997848), y para el tratamiento de diferentes enfermedades. Se ha visto que determinados medicamentos son absorbidos fácilmente por los pulmones mediante los alveolos directamente al torrente circulatorio sanguíneo. La aplicación por inhalación es particularmente poderosa para la administración de macromoléculas como proteínas, polipéptidos y ácidos nucleicos, los cuales por otro medio (por ejemplo, oral) son muy difíciles de administrar. Una aplicación por inhalación de este tipo puede emplearse con eficacia tanto para enfermedades sistémicas como también para enfermedades locales de los pulmones.

La aplicación pulmonar de medicamentos puede lograrse mediante diferentes procedimientos, por ejemplo, mediante nebulizadores líquidos (en inglés: liquid nebulizers), inhaladores a base de un gas propulsor (en inglés: aerosol-based metered dose inhaler ("inhalador de dosis medidas a base de un aerosol") = MDI), y un aparato de dispersión de polvo seco (en inglés: dry power dispersion device). El desarrollo de formas de aplicación a base de un gas propulsor va unido a un gran número de problemas. Así por ejemplo, los clorofluorohidrocarburos (CFC) establecidos, han dejado de emplearse, debido a sus propiedades perjudiciales para el ozono. Como sustitutivos pueden utilizarse gases de propulsión alternativos (HFA-143a/HFA227). Los gases propulsores alternativos muestran sin embargo a menudo una reducida solubilidad de la substancia activa en comparación con los CFC. Adicionalmente, la estabilidad de la suspensión es crítica en la obtención de la suspensión, de manera que son necesarias otras substancias auxiliares como mediadores entre el gas propulsor y las partículas. Precisos ajustes de dosificación, como a menudo son necesarios en los anticuerpos, puede lograrse en los MDI sólo difícilmente. Estos citados factores condicionan que los MDI sean menos preferidos en las recetas de péptidos y proteínas. Los aparatos de dispersión de polvo seco que no dependen de la tecnología aerosol con gas propulsor, son muy prometedores en la aplicación de medicamentos que pueden ser formulados sin problemas como polvo seco.

Muchas macromoléculas, por el contrario, lábiles, pueden ser estabilizadas en forma de polvo, en particular, polvos liofilizados o secados por pulverización, solos o en combinación con substancias auxiliares apropiadas. La capacidad de administración de composiciones farmacéuticas en forma de polvos secos encierra sin embargo algunos problemas. La dosificación de muchas composiciones farmacéuticas es a menudo crítica. Por este motivo es necesario que todo sistema de administración de polvo seco administre la dosis propuesta efectivamente exacta, precisa y fidedigna. Los sistemas actuales no son fidedignos. Además muchas composiciones farmacéuticas son muy caras. Por este motivo la capacidad de una eficiente aplicación del polvo seco es importante. Es asimismo importante que el polvo antes de la inhalación por el paciente sea fácilmente dispersable (que vuele), para asegurar una distribución adecuada y una absorción sistémica. Tampoco estos puntos se satisfacen óptimamente en la mayor parte de polvos convencionales con un contenido en proteína o substancia activa farmacéutica.

Por lo tanto, se genera el problema de que en los polvos empleados actualmente con una proporción de proteína, en particular en polvos secos por pulverización o respectivamente composiciones de proteínas con substancia activa farmacéutica, no es posible una eficiente y óptima administración pulmonar. Podría lograrse en los polvos empleados actualmente una buena estabilidad de las proteínas, pero ningunas propiedades aerodinámicas óptimas. Por ejemplo, altas proporciones de anticuerpos en el polvo, en particular en los polvos secados por pulverización, provocan una fuerte aglomeración de las partículas primarias. Estos aglomerados pueden dispersarse solamente con mucha dificultad, por lo cual el comportamiento aerodinámico es influido negativamente (tesis doctoral de Stefanie Schüle, Uni LMU 2005).

Por ello, la dosificación de la proteína o de la substancia activa farmacéutica que hay que administrar, debe efectuarse necesaria y claramente más alta, puesto que de la substancia activa empleada, solamente fracciones alcanzan el verdadero objetivo en el pulmón. Por ello, existe también el peligro de mayores efectos secundarios que en una dosificación eficiente.

Aparece con ello el objetivo de poner a punto un polvo alternativo, en particular un polvo seco por pulverización o respectivamente composiciones de proteína, los cuales junto a una suficiente estabilidad a las proteínas, presenten también unas muy buenas, o respectivamente mejoradas, propiedades aerodinámicas.

Otro objetivo de la invención consiste en la preparación de polvos alternativos correspondientes, en particular polvos secados por pulverización, o respectivamente composiciones de proteínas para la aplicación por inhalación, en particular para aplicaciones farmacéuticas o respectivamente aplicaciones médicas.

Los objetivos que toman su fundamento de la invención, se solucionan mediante las siguientes versiones así como mediante los objetivos y procedimientos descritos en las reivindicaciones de la patente.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un polvo, en especial, un polvo secado por pulverización, que contiene una proteína y fenilalanina así como opcionalmente un azúcar, caracterizado porque el polvo contiene por lo menos un 30% (p/p) de fenilalanina, de preferencia por lo menos un 40% (p/p) de fenilalanina.

La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica en particular, una composición secada por pulverización, que contiene una proteína y fenilalanina así como opcionalmente otra substancia auxiliar como un azúcar o un poliol, caracterizada porque, el polvo contiene por lo menos un 30% (p/p) de fenilalanina, de preferencia por lo menos un 40% (p/p) de fenilalanina.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para la obtención de un polvo, caracterizado porque,

a)

se obtiene una solución de fenilalanina,

b)

se añaden por lo menos una proteína y óptimamente por lo menos otra substancia auxiliar como un azúcar o un poliol,

c)

se pulveriza la solución o suspensión así obtenida a una temperatura de entrada, de preferencia 90-200ºC y una temperatura de salida, de preferencia 40-150ºC, y

d)

se separan las partículas obtenidas, del gas de secado.

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La presente invención se refiere además a polvos para el empleo como medicamentos y en particular como medicamento para inhalar, para el tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias o de enfermedades sistémicas, así como al empleo del polvo descrito para la obtención de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias o enfermedades sistémicas como el cáncer de pulmón, inflamación del pulmón, fibrosis quística, COPD (enfermedad obstructiva crónica del pulmón), asma, enfermedades antiinflamatorias, enfermedades víricas, por ejemplo por el virus sincitial respiratorio (RSV).

Pudo demostrarse que los polvos binarios y ternarios con una proporción de proteína, son muy adecuados en lo que se refiere a su comportamiento aerodinámico y a la estabilización de las proteínas después del secado por pulverización, para la obtención alternativa, de preferencia un polvo o respectivamente composiciones de proteína secadas por pulverización, con magníficas propiedades aerodinámicas. A este respecto, el principal componente, la fenilalanina, y los otros componentes opcionales, son en comparación con la fenilalanina substancias auxiliares con buena solubilidad al agua, como un azúcar o un poliol.

Para la obtención del polvo es decisiva una alta proporción de fenilalanina. A causa de su poca solubilidad y su alta hidrofobicidad, la fenilalanina se enriquece en la superficie de las partículas y es por lo tanto responsable de la estructura de la superficie y de la morfología de las partículas. Los componentes con buena solubilidad al agua, como por ejemplo el azúcar lactosucrosa (LS90P) ó la sacarosa, así como la proteína, deben precipitarse en consecuencia principalmente en el interior del núcleo, y formar una matriz amorfa.

Pudo mostrarse además, que otros aminoácidos con propiedades similares con respecto a la hidrofobicidad y solubilidad (por ejemplo, valina, leucina o isoleucina), no proporcionan ningún correspondiente buen comportamiento aerodinámico del polvo, y por lo tanto son inapropiados para la obtención de dichas formulaciones de polvo con por lo menos un 30% (p/p) de fenilalanina, de preferencia por lo menos un 40% (p/p) de fenilalanina o respectivamente del llamado en adelante, partes en % (p/p) de fenilalanina.

Pudo mostrarse además, que la morfología de las partículas depende en gran manera de la proporción de fenilalanina en el polvo secado por pulverización. En el caso de un 50% (p/p), 40% (p/p) y 30% (p/p) de proporción de fenilalanina, las partículas están en forma fuertemente arrugada, similar a pasas de uva (figuras 10a-10c). En el caso de una reducción de la proporción de fenilalanina a un 20%, la intensidad del arrugado disminuye fuertemente. El cambio de morfología de las partículas va correlativo con el empeoramiento del comportamiento aerodinámico del polvo. Esto significa que el efecto positivo de la fenilalanina en el secado por pulverización de las soluciones de pulverización, sólo es evidente a partir del 30% (p/p).

Los ensayos con otros aminoácidos aromáticos proporcionaron los siguientes resultados:

La tirosina presenta una solubilidad en agua demasiado pequeña como para considerarlo como componente de la formulación en cuestión.

En el caso del triptófano se pudo obtener solamente una formulación del polvo con el 20% de proporción de triptófano. En estas pequeñas proporciones no pudo comprobarse ninguna ventaja técnica del triptófano para el secado por pulverización y en especial en el comportamiento aerodinámico.

El polvo conteniendo histidina es, comparado con el polvo que contiene fenilalanina, muy sensible frente a la humedad del aire. Por ese motivo existe una ventaja esencial del polvo que contiene fenilalanina frente al polvo que contiene histidina, en lo que se refiere a la poca sensibilidad a la humedad. Mientras que la FPF del polvo que contiene histidina, después de una exposición con una humedad relativa del aire del 50%, se destruye, el polvo que contiene fenilalanina después de la exposición a la humedad, incluso muestra una optimización de la FPF. Se observa también un correspondiente comportamiento de la masa producida. En el polvo que contiene histidina la masa producida disminuye con la exposición a la humedad, mientras que en el polvo que contiene fenilalanina por el contrario, aumenta.

En resumen, puede comprobarse que las propiedades positivas de la fenilalanina en el secado por pulverización no pueden obtenerse con otros aminoácidos aromáticos.

Además, los inhibidores de la cristalización, como la HSA, pueden mejorar las propiedades de las partículas de los polvos. Los inhibidores de la cristalización apoyan la formación de una matriz amorfa en el interior del núcleo de las partículas donde se encuentran los componentes fácilmente solubles en agua, como por ejemplo los azúcares, así como la proteína.

Pudo mostrarse además que mediante una hábil selección de las substancias auxiliares el efecto positivo de la fenilalanina sobre el proceso de secado por pulverización, puede mejorarse todavía más. A este respecto, la otra substancia auxiliar no está limitada a una clase de substancia. Puede tratarse, como se muestra en este ejemplo, de un azúcar o un alcohol de azúcar, un aminoácido o también un polímero. Es decisivo para el empleo de la otra substancia auxiliar, la estabilización de la proteína en el secado por pulverización. Se muestra además, que mediante la adición de otra substancia auxiliar, la proteína comparada con la mezcla binaria de fenilalanina e IgG1, puede ser estabilizada.

La invención no resulta del actual estado de la técnica.

Para la mejora de las propiedades de las partículas de los polvos farmacéuticos para la aplicación pulmonar, en particular después del secado por pulverización, se conocen procedimientos del estado actual de la técnica como, por ejemplo, la posibilidad de hidrofobización de la superficie de las partículas de las patentes US 6.372.258 y US 2005/0152849. La patente US 6.372.258 emplea aminoácidos hidrófobos, entre los cuales se encuentra la fenilalanina, para la obtención de polvos para el secado por pulverización.

En este procedimiento, se añaden a la solución de pulverización junto a la proteína o substancia activa, aminoácidos hidrófobos, se pulverizan en forma disuelta y se seca. Debido a las propiedades hidrófobas del aminoácido tiene lugar en las gotas pulverizadas un enriquecimiento del aminoácido en la superficie de las gotas y con ello finalmente también un enriquecimiento en la superficie de las partículas. Mediante la hidrofobización se reduce la afinidad del agua para el polvo. Con ello va unida una disminución de las fuerzas capilares condicionada por una más pequeña condensación del vapor de agua así como una disminución de las acciones recíprocas dipolares.

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La patente 6.372.258 no describe sin embargo ni el efecto aerodinámico particularmente ventajoso de la fenilalanina en cantidades más pequeñas del 30% (p/p), o respectivamente 40% (p/p), en comparación con otros aminoácidos hidrófobos como la leucina o el triptófano, ni los efectos particularmente ventajosos de los complejos ternarios del 30% (p/p), de preferencia el 40% (p/p) de la fenilalanina, sobre otra substancia auxiliar, de preferencia un azúcar o un poliol, y sobre una proteína, en particular una substancia activa proteínica.

En el caso de las patentes WO 970364 ó respectivamente US 2005/0152849, el punto crítico está en la mezcla de la substancia activa con el llamado antiadherente.

Las solicitudes describen, entre otros, el empleo de la leucina como material antiadherente, el cual sirve para el recubrimiento de las partículas para evitar la aglomeración de las mismas. Según la patente US 2005/0152849 la substancia auxiliar no debe representar más del 10% del polvo.

En la patente EP 0913177 se describe un procedimiento para la obtención de productos secos, amorfos, biológicamente activos que contienen materiales biológicamente activos mediante secado por convección, en particular secado por pulverización. En la mezcla publicada de proteína (EPO), azúcar y aminoácidos (en parte también con Tween 20) la proporción de azúcar es siempre más alta que la proporción de los aminoácidos. Además se emplean siempre 2 aminoácidos. Además, contrariamente a las pruebas de la patente EP 0913177, en la presente invención los aminoácidos no se titulan en su punto isoeléctrico. El comportamiento aerodinámico particularmente ventajoso (FPF, masa desprendida) del polvo presente según la invención, no está limitado al punto isoeléctrico de la fenilalanina. Los polvos obtenidos con diferentes valores del pH estaban siempre cristalizados en parte. Por lo tanto el valor del pH de la solución de pulverización no es decisivo para las propiedades del polvo (dispersibilidad/facilidad de inhalación), y la propiedad de pulverización de la fenilalanina. La estabilización de la proteína depende realmente del valor del pH de la solución de pulverización (el anticuerpo empleado es estable en valores bajos del pH), aunque puede también alcanzarse en valores altos del pH de 9,0, una estabilización de la proteína, en particular si se compara con composiciones binarias.

En la patente WO0033811 se obtienen en particular partículas que contienen aminoácidos de pequeña densidad (no mayor de 0,1 g/cm^{3}). Un posible procedimiento es el secado por pulverización. Sin embargo, por una parte, la proporción de aminoácidos no sobrepasa en este caso la tasa del 20%, y por otra parte el punto crítico de la publicación de WO 0033811 está en la leucina. La fenilalanina no se menciona en la patente WO 0033811.

En la patente WO 0211695 se describen polvos para inhalación secados por pulverización, que contienen proteína, que contiene menos del 30% de una substancia adicional. La substancia adicional descrita en la patente WO 0211695 puede ser un aminoácido cualquiera. Una particularidad o respectivamente una preferencia en el empleo del aminoácido fenilalanina no se describe en la patente WO 0211695.

En la patente WO 9632096 se describen polvos para inhalación, los cuales contienen una proteína, una substancia activa y el 50-99,9% de una substancia auxiliar. También en la patente WO 0211695 la substancia adicional descrita puede ser un aminoácido cualquiera. Una directa mención del aminoácido fenilalanina no está contenida en la patente WO 0211695.

En la patente JP 62281847 se efectúan secados por pulverización con fenilalanina pura. El foco de atención no está sin embargo en la inhalación. Los tamaños de partículas obtenidos son además esencialmente más altos.

El estado actual de la técnica conoce además la pulverización de los aminoácidos asparagina, arginina, leucina, metionina, fenilalanina y triptófano con una proteína (N.Y.K. Chew et al., 2002 Respiratory Drug Delivery ("Administración de Fármacos Respiratorios"), VII, págs. 743-745). La proporción de aminoácido es por regla general del 5% (p/p). La excepción fue la leucina, que aquí se pulverizó adicionalmente todavía en una proporción del 10% (p/p) de aminoácido. Según la proporción del flujo y el aparato, se comprobó que todos los aminoácidos habían experimentado una mejora de la FPF. El mejor efecto se produjo sin embargo en la leucina. Mediante el empleo de un inhalador Dinkihaler y una proporción de flujo de 120 litros/minuto, pudo medirse también en las FPF de fenilalanina entre 55-60% (p/p). Una limitación para la invención de servicio está de nuevo en la proporción de fenilalanina. Además, no se empleó en el trabajo de Chew et al. ninguna mezcla ternaria.

Descripción de las figuras

Todos los datos en tanto por ciento citados en las descripciones se refieren a datos de concentraciones y composiciones de substancias sólidas secas en un polvo obtenido por secado por pulverización (p/p).

Figura 1

Fotografía REM del polvo secado por pulverización que contiene un anticuerpo IgG1 y un aminoácido:

Las fotografías fueron tomadas con un microscopio de electrones reticular (supra 55 VP, de la firma Zeiss SMT, Oberkochen). Para ello, las muestras de polvo se pulverizaron directamente sobre un plato de muestras adecuado. El material en exceso se sacudió y se despreció. A continuación se recubrieron las muestras para seguridad, con una capa de oro-paladio de 10 nm con una suficiente conductividad eléctrica.

La detección para representación de las imágenes se efectuó mediante electrones secundarios.

a) Composición del polvo secado por pulverización: 90 % de valina/10% de IgG1

Aumento: 5000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 8 mm

Tamaño del diafragma: 20 \mum

Tensión de aceleración: 6 kV

Vacío: 5,73 e-005 Pa

\vskip1.000000\baselineskip

b) Composición del polvo secado por pulverización: 90% de isoleucina/10% de IgG1

Aumento: 3000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 8 mm

Tensión de aceleración: 6 kV

Vacío: 5,74 e-005 Pa

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c) Composición del polvo secado por pulverización: 90% de fenilalanina/10% de IgG1

Aumento: 5000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 8 mm

Tensión de aceleración: 6 kV

Vacío: 5,73 e-005 Pa.

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Figura 2

Comparación de la hidrofobicidad de diferentes amino-ácidos y del contenido del monómero de proteína después del secado por pulverización de mezclas binarias en función de la concentración de substancia sólida en la solución de pulverización (50% y 90%, límite de solubilidad del aminoácido alcanzada):

En esta figura se compara la estabilización de la proteína después del secado por pulverización, con la proporción hidrófoba de los aminoácidos empleados. Para el dato de la hidrofobicidad de los aminoácidos existen varios anexos (P. Andrew Karplus, Hydrophobicity regained, Protein science ("Hidrofobicidad recuperada, Ciencia de las Proteínas") (1997), 6: 1302-1307)). Una vía corriente es el dato de la entalpía libre en la transferencia de una substancia de un disolvente en agua (por ejemplo, \DeltaG^{o}_{trans \ Okt/agua}). El inconveniente de este método es la fuerte dependencia de los resultados de las condiciones de la medición (por ejemplo, la elección del disolvente). Particularmente en las substancias polares pueden tener lugar grandes diferencias en los resultados. La pura consideración de las superficies hidrófobas es por el contrario independiente de las condiciones de la medición. Por este motivo hay que tener en consideración en esta imagen solamente las partes hidrófobas o respectivamente superficies de los radicales aminoácidos. A este respecto, se asigna a los grupos -CH_{2} alifáticos una entalpía de 25 cal/\ring{A}^{2} y a los grupos -CH aromáticos una entalpía de 16 cal/\ring{A}^{2}. Esta consideración no tiene en cuenta ninguna parte polar así como ningún efecto inductivo producido por la electricidad negativa.

La tendencia a formar agregados de proteína se determinó con una cromatografía de exclusión (HP-SEC). La exclusión se efectuó mediante el tamaño de molécula de la proteína o respectivamente de sus agregados (por ejemplo, dímeros). Ya es sabido que una imagen de un agregado va acompañada de una desestabilización de la proteína.

Composiciones de polvos secados por pulverización:

Lote 1: 10% de IgG1/90% de isoleucina, proporción de substancia sólida: 3,5%

Lote 2: 10% de IgG1/90% de glicina, proporción de substancia sólida: 20,2%

Lote 3: 10% de IgG1/90% de valina, proporción de substancia sólida: 5,8%

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Lote 4: 10% de IgG1/90% de fenilalanina, proporción de substancia sólida: 3,2%

Lote 5: 10% de IgG1/90% de asparagina, proporción de substancia sólida: 2,4%

Lote 6: 10% de IgG1/90% de glicina, proporción de substancia sólida: 11,18%

Lote 7: 10% de IgG1/90% de isoleucina, proporción de substancia sólida: 1,95%

Lote 8: 10% de IgG1/90% de valina, proporción de substancia sólida: 3,21%

Lote 9: 10% de IgG1/90% de fenilalanina, proporción de substancia sólida: 1,79%

Lote 10: 10% de IgG1/90% de asparagina, proporción de substancia sólida: 1,3%

Columnas: hidrofobicidad del aminoácido

Rombos: contenido del monómero del anticuerpo IgG1.

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Figura 3

Fotografía REM de diferentes mezclas ternarias de polvos, los cuales contienen fenilalanina, lactosucrosa y un anticuerpo IgG1.

Las fotografías se efectuaron como se ha descrito en la figura 1.

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a) Composición del polvo secado por pulverización:

80% de fenilalanina/10% de LS90P/10% de IgG1

Aumento: 5000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 9 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 3 kV

Vacío: 1,72e-005 Pa

\vskip1.000000\baselineskip

b) Composición del polvo secado por pulverización:

80% de fenilalanina/15% de LS90P/5% de IgG1

Aumento: 5000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 7 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 4 kV

Vacío: 9,18e-005 Pa

\vskip1.000000\baselineskip

c) Composición del polvo secado por pulverización:

60% de fenilalanina/30% de LS90P/10% de IgG1

Aumento: 5000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 8 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 4 kV

Vacío: 9,18e-005 Pa

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d) Composición del polvo secado por pulverización:

70% de fenilalanina/25% de LS90P/5% de IgG1

Aumento: 5000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 8 mm

Tamaño del diafragma: 9 \mum

Tensión de aceleración: 4 kV

Vacío: 9,3e-005 Pa.

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Figura 4

Contenido relativo de monómero, referido al valor original. El contenido en monómero se determinó como se ha descrito en la figura 2. El contenido relativo en monómero está referido al valor de partida, al cual correspondientemente se le da el valor del 100%. Esta representación relativiza la modificación del contenido de monómero al valor de partida, y refleja con ello la modificación con el tiempo de almacenamiento.

Rombos: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina/10% de LS90P/30% de IgG1

Cuadrados: polvo secado por pulverización: 80% de fenilalanina/10% de LS90P/10% de IgG1

Triángulos: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina/30% de LS90P/10% de IgG1.

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Figura 5

Comparación de las fracciones de partículas finas de diferentes composiciones de polvo.

La fracción de partículas finas se determinó con un impactor de una etapa (impactor Inlet, TSI), en combinación con un medidor aerodinámico de partículas (APS, TSI). El límite de separación de la tobera de impacto es de 5,0 \mum. Además de la fracción de partículas finas se determinó con el APS el tamaño aerodinámico de las partículas así como la distribución por tamaños de las partículas mediante una determinación del tiempo de vuelo. Para ello se dividió el polvo después de que la muestra pasara el portal de inducción. Una porción del 0,2% se aspiró a un pequeño capilar en condiciones isocinéticas y se introdujo en la unidad de medición del tiempo de vuelo. La parte restante se utilizó para la determinación de la fracción de partículas finas.

Para la medición, se envasó el polvo en cápsulas del tamaño 3 y se aplicó a un inhalador (HandiHaler®, Boehringer Ingelheim). La proporción de fluido para la aplicación del polvo se ajustó de manera que mediante el HandiHaler se generó una caída de presión de 4 kPa. El volumen de aire fue de 4 litros en correspondencia con la PharmEur. Para evitar un "rebouncing" (rebote) de las partículas separadas en la etapa del impactor, se recubrió en las mediciones, la placa del impactor con una solución de Brij de alta viscosidad.

Columnas obscuras: polvo secado por pulverización: 65% de dextrano 1/5% de isoleucina/30% de IgG1

Columnas claras: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina/10% de LS90P/30% de IgG1.

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Figura 6

Comparación de las fracciones relativas de partículas finas de diferentes composiciones de polvos.

La fracción relativa de partículas finas se refiere a la fracción de partículas finas del valor inicial y refleja la modificación de la FPF durante el almacenamiento. La fracción de partículas finas se determina correspondientemente como en la descripción de la figura 5.

Columnas obscuras: polvo secado por pulverización: 65% de dextrano 1/5% de isoleucina/30% de IgG1

Columnas claras: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina/10% de LS90P/30% de IgG1.

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Figura 7

Fotografía REM de un polvo secado por pulverización que contiene fenilalanina o respectivamente isoleucina: las fotografías se han obtenido como se ha descrito en la figura 1.

a) Composición del polvo secado por pulverización:

60% de fenilalanina/10% de LS90P/10% de IgG1

Aumento: 250 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 7 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 6 kV

Vacío: 5,35e-005 Pa

\vskip1.000000\baselineskip

b) Composición del polvo secado por pulverización:

60% de fenilalanina/10% de LS90P/10% de IgG1

Aumento: 5000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 7 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 6 kV

Vacío: 5,60e-005 Pa.

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Figura 8

Fotografía REM de un polvo secado por pulverización, de la composición 65% de dextrano 1, 5% de isoleucina, y 30% de IgG1:

Las fotografías se obtuvieron como se ha descrito en la figura 1.

a) Composición del polvo secado por pulverización:

65% de dextrano 1/5% de isoleucina/30% de IgG1

Aumento: 250 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 9 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 4 kV

Vacío: 6,70e-005 Pa

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b) Composición del polvo secado por pulverización:

65% de dextrano 1/5% de isoleucina/30% de IgG1

Aumento: 7500 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 5 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 5 kV

Vacío: 7,17e-005 Pa.

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Figura 9

Determinación de la fracción de partículas finas (FPF) y el polvo secado por pulverización de la masa aplicada contenido en diferentes proporciones de fenilalanina.

La fracción de partículas finas se determinó con un impactor de una etapa (impactor Inlet, TSI), en combinación con un medidor de tamaño de partículas aerodinámicas (APS, TSI) (ver para ello también la descripción de la figura 5). La masa aplicada se refiere a la masa de la cápsula empleada, y después de la aplicación por el impactor Inlet/APS. La diferencia de masas de la cápsula corresponde a la masa aplicada. El método de aplicación está descrito en el
ejemplo 5.

Columnas: fracción de partículas finas (FPF) en tanto por ciento referido al peso neto de la cápsula

Rombos: masa aplicada de polvo en la aplicación con el impactor Inlet/TSI

Polvo 1: polvo obtenido mediante secado por pulverización a partir de una solución de pulverización de la siguiente composición: ,29 g/100 ml de fenilalanina, 1,15 g/100 ml de IgG1, 383 mg/100 ml de LS90P, tampón: 1,6 mM de glicina, 25 mM de histidina, pH 4,2.

Polvo 2: polvo obtenido mediante secado por pulverización a partir de una solución de pulverización de la siguiente composición: ,29 g/100 ml de fenilalanina, 1,15 g/100 ml de IgG1, 383 mg/100 ml de LS90P, tampón: 25 mM de TRIS, pH 7,4.

Polvo 3: polvo obtenido mediante secado por pulverización a partir de una solución de pulverización de la siguiente composición: ,29 g/100 ml de fenilalanina, 1,15 g/100 ml de IgG1, 383 mg/100 ml de LS90P, tampón: 25 mM de TRIS, pH 9,0.

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Figura 10

Fotografía REM de un polvo secado por pulverización.

Las fotografías se obtuvieron como se ha descrito en la figura 1.

a) Composición del polvo secado por pulverización:

50% de fenilalanina/20% de LS90P/30% de IgG1

Aumento: 2000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 10 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 5 kV

Vacío: 2,23e-004 Pa

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b) Composición del polvo secado por pulverización:

40% de fenilalanina/30% de LS90P/30% de IgG1

Aumento: 3000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 10 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 5 kV

Vacío: 2,23e-004 Pa

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c) Composición del polvo secado por pulverización:

30% de fenilalanina/40% de LS90P/30% de IgG1

Aumento: 3000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 10 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 5 kV

Vacío: 2,23e-004 Pa

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d) Composición del polvo secado por pulverización:

20% de fenilalanina/50% de LS90P/30% de IgG1

Aumento: 3000 aumentos

Distancia polvo-cátodo: 8 mm

Tamaño del diafragma: 10 \mum

Tensión de aceleración: 5 kV

Vacío: 2,26e-004 Pa.

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Figura 11

Determinación de la fracción de partículas finas (FPF) y el polvo secado por pulverización de la masa aplicada.

La fracción de partículas finas se determinó con un impactor de una etapa (impactor Inlet, TSI), en combinación con un medidor de tamaño de partículas aerodinámicas (APS, TSI) (ver para ello también la descripción de la figura 5). La masa aplicada se refiere a la masa de la cápsula empleada, antes y después de la aplicación por el impactor Inlet/APS. La diferencia de masas de la cápsula corresponde a la masa aplicada. El método de aplicación está descrito en el ejemplo 5.

Columnas: fracción de partículas finas (FPF) en tanto por ciento referido al peso neto de la cápsula

Rombos: masa aplicada de polvo en la aplicación en el impactor Inlet/TSI

Polvo 1: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina, 10% de IgG1, 30% de LS90P

Polvo 2: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina, 10% de lisozima, 30% de LS90P

Polvo 3: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina, 10% de calcitonina, 30% de LS90P.

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Figura 12

Determinación de la fracción de partículas finas (FPF) y del polvo secado por pulverización de la masa aplicada.

La fracción de partículas finas se determinó con un impactor de una etapa (impactor Inlet, TSI), en combinación con el medidor aerodinámico de partículas (APS, TSI) (véase también la descripción de la figura 5). La masa aplicada se refiere a la masa de la cápsula empleada antes y después de la aplicación mediante el Impactor Inlet/APS. La diferencia de las masas de la cápsula corresponde a la masa aplicada. El método de la aplicación está descrito en el ejemplo 5.

Columnas: fracción de partículas finas (FPF) en tanto por ciento, referido al peso neto de la cápsula

Rombos: masa de polvo aplicada en la aplicación en el impactor Inlet/TSI

Polvo 1: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina, 10% de IgG1, 30% de sacarosa

Polvo 2: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina, 10% de IgG1, 30% de manitol

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Polvo 3: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina, 10% de IgG1, 30% de glicina

Polvo 4: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina, 10% de IgG1, 30% de PVP.

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Figura 13

Mediciones DSC para la determinación de la entalpía de cristalización de la LS90P.

La entalpía de cristalización se determinó mediante la determinación del flujo de calor al calentar el polvo. Cuando se calienta un polvo amorfo las partes componentes de la partícula tienen después de sobrepasar la temperatura de transformación vítrea una movilidad aumentada y pueden cristalizar. El sobrepaso de la temperatura de transformación vítrea es un proceso endotérmico. La subsiguiente cristalización es por el contrario exotérmica. En un posterior calentamiento puede tener lugar la fusión o la descomposición del polvo.

Para las mediciones DSC se comprimen ligeramente unos pocos miligramos de polvo en un crisol, de manera que se obtenga un lecho de polvo lo más homogéneo y compacto posible.

A continuación se cierra el crisol mediante una soldadura en frío.

Las mediciones se efectuaron con un crisol sin agujerear. Los demás parámetros fueron:

Aparato de medición: DSC 821/Mettler Toledo

Programa de evaluación: STAR versión 4.20

Gas de estufa: nitrógeno/40 ml/minuto

Gas de barrido: nitrógeno/150 ml/minuto

Crisol: Alutiegel, 40 \mul

Velocidad de escaneado: 10ºC de temperatura/minuto

Polvo 1: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina/40% de LS90P

Polvo 2: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina/30% de LS90P/10% de IgG1

Polvo 3: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina/30% de LS90P/10% de lisozima

Polvo 4: polvo secado por pulverización: 60% de fenilalanina/30% de LS90P/10% de calcitonina

Polvo 5: polvo liofilizado seco: 100% de LS90P.

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Figura 14

Determinación de la fracción de partículas finas (FPF) de un polvo secado por pulverización.

La fracción de partículas finas se determinó con un impactor de una etapa (impactor Inlet, TSI), en combinación con el medidor de tamaño de partículas aerodinámicas (APS, TSI) (véase para ello también la descripción de la figura 5).

La masa aplicada resulta de la diferencia de pesos de la cápsula antes y después de la aplicación mediante el inhalador (HandiHaler®, Boehringer Ingelheim).

Columnas blancas: determinación de la FPF directamente después del secado por pulverización

Columnas punteadas: determinación de la FPF después de la exposición a la humedad (50% de h.r. a temperatura ambiente durante 20 horas)

Triángulos: masa aplicada directamente después del secado por pulverización

Cuadrados: masa aplicada después de la exposición a la humedad (50% de h.r. a temperatura ambiente durante 20 horas).

Polvo 1: polvo secado por pulverización: 20% de triptófano/50% de LS90P/30% de IgG1

Polvo 2: polvo secado por pulverización: 20% de histidina/50% de LS90P/30% de IgG1

Polvo 3: polvo secado por pulverización: 20% de fenilalanina/50% de LS90P/30% de IgG1.

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Descripción detallada de la invención Definiciones

En el marco de esta descripción de la invención los conceptos y denominaciones tienen los siguientes significados definidos en el anexo. Los datos de peso y tantos por ciento en peso se refieren siempre, en tanto no se diga otra cosa, a la masa en seco de las composiciones o del contenido en materia sólida de las soluciones/suspensiones. Las expresiones generales "conteniendo" o "contiene" comprenden la expresión especial "compuesto de". Además se emplean "un número singular de" y "la mayor parte de" sin que sean limitantes.

"Polvo" significa una substancia triturada muy fina. "Polvo secado por pulverización" significa un polvo que ha sido obtenido mediante secado por pulverización.

"Partícula" significa una parte pequeña de una substancia. En la presente invención se designan como partículas las partículas de los polvos según la invención. Los conceptos partícula y polvo se emplean en la presente invención como temporalmente intercambiables. Con el término polvo se designan también sus componentes, a saber, las partículas. Partículas indican también la cantidad total de partículas, a saber, el polvo.

El concepto "mezcla" o "mezclas" en el sentido de esta invención significa tanto aquellas mezclas generadas por todos los componentes de una solución verdadera como una solución en la cual uno o varios de los componentes está(n) en suspensión. El concepto "mezclas" en el sentido de esta invención significa sin embargo también aquellas mezclas que resultan de un proceso físico de mezclado a partir de partículas sólidas de estos componentes, o que resultan por la aplicación de una solución o suspensión de estos componentes sobre uno o varios componentes sólidos.

La expresión "composición" significa mezclas líquidas, semisólidas o sólidas de por lo menos dos substancias de partida.

La expresión "composición farmacéutica" significa una composición para aplicación en pacientes.

El concepto "substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables" se refiere a substancias auxiliares que pueden estar contenidas opcionalmente en la formulación en el marco de la invención. Las substancias auxiliares pueden ser aplicadas por ejemplo a los pulmones sin producir efectos significativos toxicológicos indeseables, sobre los probandos o los pulmones de probandos.

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" comprende por ejemplo las siguientes sales, aunque no está limitada a las mismas: sales de ácidos inorgánicos, como cloruro, sulfato, fosfato, difosfato, bromuro y nitrato. Además, sales de ácidos orgánicos, como malato, maleato, fumarato, tartrato, succinato, etilsuccinato, citrato, acetato, lactato, metansulfonato, benzoato, ascorbato, paratoluensulfonato, palmoato, salicilato y estearato, como asímismo estolato, gluceptato y lactobionato.

Con el concepto "substancia activa", se denominan aquellas substancias que provocan en un organismo una acción o respectivamente una reacción. Cuando una substancia activa se utiliza para fines terapéuticos para el cuerpo humano o animal, recibe el nombre de fármaco o medicamento.

Con el nombre de "substancia activa proteínica" o respectivamente "substancia activa de proteína", se designa en la presente invención una substancia activa que estructuralmente es una proteína o respectivamente representa estructuralmente una proteína, polipéptido o péptido.

Ejemplos de substancias activas son, la insulina, el factor de crecimiento similar a la insulina, la hormona humana del crecimiento (hGH) y otros factores de crecimiento, el activador plasminogénico de tejidos (tPA), la eritropoyetina (EPO), las citocinas, por ejemplo, las interleucinas (IL) como las IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, el interferón(IFN)-alfa, beta, gamma, omega o tau, el factor de necrosis tumoral (TNF) como por ejemplo los TNF-alfa, beta o gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 y VEGF. Otros ejemplos son los anticuerpos monoclonales, policlonales, multiespecíficos y de cadena única (single chain), y fragmentos de los mismos, como por ejemplo Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fc y fragmentos Fc', cadenas de inmunoglobulina ligeras (L) ó pesadas (H), y sus regiones constantes, variables o hipervariables, así como los fragmentos Fv y Fd (Chamov et al., 1999). Los anticuerpos pueden ser de origen humano o no-humano. También entran en cuestión los anticuerpos humanizados y quimeras. Asimismo se refiere éste a proteínas y anticuerpos conjugados, los cuales por ejemplo, están unidos a una substancia radiactiva o a un medicamento químicamente definido.

Los fragmentos Fab (Fragment antigen-binding = Fab) ("fragmentos de unión a un antígeno"), se componen de las regiones variables de ambas cadenas, las cuales se mantienen juntas mediante las regiones constantes fronterizas. Pueden obtenerse por ejemplo, por tratamiento con una proteasa, como por ejemplo la papaína, a partir de anticuerpos convencionales o también mediante la clonación de ADN. Otros fragmentos de anticuerpos son los fragmentos F(ab')_{2}, los cuales pueden obtenerse mediante digestión proteolítica con pepsina.

Mediante la clonación de genes pueden obtenerse también fragmentos de anticuerpos acortados, que constan solamente de la región variable de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL). Estos reciben el nombre de fragmento Fv (fragmento variable = fragmento de la parte variable). Puesto que en estos fragmentos Fv no es posible la unión covalente mediante los radicales cisteína, de las cadenas constantes, estos fragmentos Fv se estabilizan a menudo dispuestos de otra manera. Para ello la región variable de la cadena pesada y ligera se unen entre sí a menudo mediante un fragmento del péptido corto de aproximadamente 10-30 aminoácidos, con particular preferencia 15 aminoácidos. De esta forma aparece una única cadena polipeptídica en la cual están unidos entre sí mediante un engarce peptídico, el VH y el VL. Dichos fragmentos de anticuerpo reciben también el nombre de fragmento Fv de cadena única (scFv). Ejemplos de anticuerpos scFv son ya conocidos y están descritos, véase por ejemplo Huston et al. (1988).

En los últimos años se han desarrollado diferentes estrategias para obtener derivados multímeros de scFv. La idea consiste en la producción de anticuerpos recombinantes con propiedades fármacocinéticas mejoradas y una mayor avidez de unión. Para lograr la multimerización de los fragmentos scFv, se obtienen éstos como proteínas de fusión con dominios de multimerización. Como dominio de multimerización pueden actuar por ejemplo, la región CH3 de una IgGs o estructuras helicoidales ("coiled coil structure") ("estructura en espiral espiralizada"), como los dominios cremallera de leucina. En otras estrategias se aprovecha la interacción entre las regiones VH y VL del fragmento scFv para una multimerización (por ejemplo, dia-, tri- y pentabodies) ("dia, tri y pentacuerpos").

Como "diabody" (diacuerpo), los expertos designan un derivado bivalente homodímero de scFv. El acortamiento del engarce peptídico en la molécula scFv de 5-10 aminoácidos da como resultado la formación de homodímeros mediante la sobreposición de cadenas VH/VL. Los diacuerpos pueden estabilizarse además mediante la introducción de puentes de disulfuro. Ejemplos de díacuerpos se encuentran en la literatura, por ejemplo, en Perisic et al., (1994).

Como "minibody" (minicuerpo) los expertos designan un derivado bivalente homodímero de scFV. Consiste en una proteína de fusión que contiene la región CH3 de una inmunoglobulina, de preferencia la IgG, con particular preferencia la IgG1, como región de dimerización. Esta une los fragmentos scFv mediante una región "bisagra", igualmente de IgG, y una región "eslabón". Ejemplos de dichos minicuerpos están descritos por Hu et al., (1996).

Con "triabody" (triacuerpo) los expertos designan un derivado trivalente homotrímero de scFv (Kortt et al., 1997). La fusión directa de VH-VL sin empleo de una secuencia eslabón conduce a la formación de trímeros.

En los fragmentos designados por el experto como minianticuerpos, que tienen una estructura bi, tri o tetravalente, se trata asimismo de derivados de fragmentos scFv. La multimerización se logra mediante estructuras di, tri, ó tetrámeras de "espiral espiralizada" (Pack et al., 1993 y 1995; Lovejoy et al., 1993).

Con la expresión "substancias auxiliares" se denominan aquellas substancias que se añaden a una formulación, en la presente invención un polvo, en particular un polvo secado por pulverización. Las substancias auxiliares no tienen habitualmente por sí mismas ninguna acción, en particular ninguna acción farmacéutica, y sirven para mejorar u optimizar respectivamente un determinado aspecto (por ejemplo la estabilidad al almacenamiento) de la formulación de la propia substancia contenida, por ejemplo una substancia activa. Una "substancia activa" farmacéutica significa una parte de un medicamento o de una composición farmacéutica, y cuida entre otros, de que la substancia activa alcance el lugar en donde ha de actuar, y allí sea liberada. Las substancias activas tienen tres objetivos fundamentales: la función de transporte, la regulación de la liberación de la substancia activa, y el aumento de la estabilidad. Las substancias activas sirven también para la obtención de formas medicamentosas, las cuales modifican la duración o la velocidad de la acción.

La expresión "aminoácido" significa aquellos compuestos que por lo menos contienen un grupo amino y por lo menos un grupo carboxilo. Aunque el grupo amino esté habitualmente en la posición \alpha con respecto al grupo carboxilo, es posible cualquier otra colocación en la molécula. El aminoácido puede contener también otros grupos funcionales, como por ejemplo los grupos amino, carboxamido, carboxilo, imidazol, tio y otros grupos. Se emplean aminoácidos de origen natural o sintético, racémicos u ópticamente activos (D ó L) inclusive diferentes proporciones estereoisoméricas. Por ejemplo, el término isoleucina comprende tanto la D-isoleucina como la L-isoleucina, isoleucina racémica y diferentes proporciones de ambos enantiómeros.

Con el término "péptido", "polipéptido" o "proteína", se denominan los polímeros de aminoácidos compuestos de más de dos radicales aminoácido.

Además, se denominan con el término "péptido", "polipéptido" o "proteína", los polímeros de aminoácidos compuestos de más de 10 radicales aminoácidos.

El término péptido, polipéptido o proteína se emplean como pseudónimos y comprende tanto los homo- como también los heteropéptidos, o sea polímeros de aminoácidos que se componen de idénticos o diferentes radicales aminoácidos. Un "dipéptido" está formado por lo tanto de dos aminoácidos unidos peptídicamente, un "tripéptido" está formado de tres aminoácidos unidos peptídicamente.

El término aquí empleado de "proteína", significa polímeros de aminoácidos con más de 20 y en particular más de 100 radicales de aminoácido.

La expresión "proteína pequeña" designa aquellas proteínas que están por debajo de los 50 kD ó respectivamente 30 kD, ó respectivamente entre 5 y 50 kD. La expresión "proteína pequeña" designa además los polímeros de radicales aminoácido con menos de 500 radicales de aminoácido o respectivamente menos de 300 radicales de aminoácido o respectivamente de polímeros con 50-500 radicales de aminoácido. Pequeñas proteínas preferidas son por ejemplo los factores de crecimiento como la "hormona/factor de crecimiento humano"), la insulina, la calcitonina, o similares.

La expresión "oligosacárido" o "polisacárido" significa un azúcar múltiple que por lo menos está formado por tres moléculas monómeras de azúcar.

La expresión "% (p/p)" significa la proporción de una substancia activa o respectivamente de una substancia auxiliar con respecto a la masa del polvo secado por pulverización. En el caso actual la proporción en cuestión está referida a la substancia seca del polvo. La humedad residual en el polvo no se tiene en cuenta por lo tanto.

El término "amorfo" significa que la formulación en forma de polvo contiene menos del 10% de parte cristalina, de preferencia menos del 7%, con mayor preferencia menos del 5% y con particular preferencia menos del 4, 3, 2, ó 1%.

El término "inhalable" significa que los polvos son adecuados para la aplicación pulmonar. Los polvos inhalables pueden dispersarse e inhalarse con la ayuda de un aparato de inhalación, de manera que las partículas alcanzan el pulmón y eventualmente pueden desplegar su acción sistémica sobre los alveolos. Las partículas inhalables presentan por ejemplo un tamaño medio de partícula entre 0,4-30 \mum (MMD = diámetro medio de la masa), la mayor parte entre 0,5-20 \mum, de preferencia entre 1-10 y/o un diámetro medio de partícula aerodinámica (MMAD = diámetro aerodinámico medio de la masa) entre 0,5-10 \mum, de preferencia entre 0,5-7,5 \mum, con mayor preferencia entre 0,5-5,5 \mum, todavía con mayor preferencia 1-5 \mum, y con particular preferencia entre 1-4,5 \mum ó respectivamente
3-10 \mum.

El "diámetro medio de la masa" o "MMD" es una magnitud de medida de la distribución por tamaño de partículas, puesto que los polvos de la invención están generalmente polidispersados. Los resultados están expresados como el diámetro de la distribución de las sumas de volúmenes en el 50% de la suma total. Los valores MMD se pueden determinar por ejemplo mediante la difractometría de láser, en donde naturalmente también puede emplearse cualquier otro método habitual (por ejemplo, microscopía de electrones, sedimentación por centrifugación).

La expresión "diámetro medio de partículas aerodinámicas" (= diámetro aerodinámico de la masa media (MMAD)) representa el tamaño de partículas aerodinámicas en el que normalmente el 50% de las partículas referidas a la masa del polvo presentan un diámetro aerodinámico más pequeño. Como método de referencia para la determinación del MMAD sirve en caso de duda el método citado en esta descripción de patente.

El MMD y el MMAD pueden ser distintos entre sí, por ejemplo, una esfera vacía que se ha formado en el secado por pulverización puede presentar un mayor MMD en comparación con el MMAD.

El término "fracción de partículas finas" (FPF) describe la parte inhalable de un polvo compuesto de partículas con un tamaño de partícula de \leq 5 \mum de MMAD. En polvos bien dispersados, la FPF es mayor del 20%, de preferencia mayor del 30%, con particular preferencia mayor del 40%, todavía con más preferencia más del 50% y todavía con más preferencia, más del 55%. La expresión empleada a este respecto "Cut Off Diameter" (diámetro de corte) significa aquellas partículas que hay que tener en cuenta en la determinación de la FPF. Una FPF del 30% en un diámetro de corte de 5 \mum (FPF_{5}) significa que por lo menos el 30% de todas las partículas del polvo presentan un diámetro de partícula aerodinámica menor de 5 \mum.

La expresión "time of flight" (tiempo de vuelo) es la denominación para un método estándar de medición como se describe con más detalle en el capítulo EJEMPLOS. En una medición del "tiempo de vuelo" se determina el MMAD mediante la determinación del tiempo de vuelo de una partícula para un determinado tramo de medición. El MMAD correlaciona con el tiempo de vuelo. Es decir, que las partículas con un gran MMAD necesitan un tiempo de vuelo mayor que una partícula correspondientemente más pequeña (comparar con: capítulo Ejemplos, Métodos).

La expresión "masa aplicada" se refiere a la cantidad de polvo que se aplica cuando se emplea un inhalador. La aplicación se determina en este caso por ejemplo, mediante una cápsula, en el cual la cápsula se pesa antes y después de la aplicación. La masa aplicada corresponde a la diferencia de masas de la cápsula antes y después de la aplicación.

"Dispersable" significa apto para el vuelo. Una premisa esencial para una aptitud para el vuelo de un polvo es el desaglomerado del polvo en partículas individuales y la distribución de las partículas individuales en el aire. Los aglomerados de partículas son demasiado grandes para alcanzar los pulmones y por lo tanto no son apropiados para la terapia por inhalación.

La expresión "temperatura ambiente" designa una temperatura de aproximadamente 20-25ºC (\pm 10%). La expresión temperatura ambiente designa en particular una temperatura de 25ºC.

La expresión "contenido en monómero" y "monómero", designa la proporción en tanto por ciento de proteínas compuestas de una única subunidad de la proteína. Para limitar el contenido en monómeros, existen los fragmentos de trozos rotos del monómero y del di o respectivamente oligómero, compuestos de varias subunidades. El contenido en monómeros se determina por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión.

La expresión "agregados" significa la proporción en di y oligómeros de proteínas, los cuales se componen en estado nativo, de una única subunidad.

Composiciones según la invención

Los factores que influyen en el comportamiento a la volatilidad de las partículas secadas por vaporización (es importante aquí la fracción de partículas finas FPF), son el tamaño de las partículas (MMD ó respectivamente en particular MMAD, el cual se determina mediante mediciones del "tiempo de vuelo"), y el comportamiento del polvo a la dispersión. Es decisivo para el comportamiento a la dispersión del polvo, la composición química de la superficie de las partículas así como la morfología de las partículas. Mediante la adecuada selección de los componentes del polvo y en particular de las substancias auxiliares se puede por lo tanto influir decisivamente en el comportamiento del polvo a la dispersión.

El tamaño y morfología de una partícula viene dada por el secado de una gota individual después de la pulverización en el secador por pulverización, de la siguiente manera:

Para la obtención del polvo inhalable se emplean habitualmente toberas de dos substancias. El tamaño de las gotitas (MMD) que es importante como punto de partida para el posterior tamaño de partícula, es según la proporción de pulverización, de aproximadamente 8-20 \mum. El secado de la gota tiene lugar en 2 etapas. En la primera fase, se evapora el agua sin que se forme substancia sólida. La evaporación no está limitada por la difusión. Después de alcanzar el límite de la solubilidad de la substancia contenida en la solución, tiene lugar la formación de dos fases sólido/líquido y se forma finalmente una capa de substancia sólida cerrada. En el núcleo de las partículas en formación están contenidas además, agua y substancias disueltas con un límite de solubilidad correspondientemente más alto que las substancias ya precipitadas.

La segunda fase de la formación de partículas empieza después de la formación de la capa cerrada de substancia sólida. Mediante la capa de substancia sólida se reduce fuertemente la proporción de evaporación de agua. La proporción de evaporación del agua depende en la 2^{a} fase, de la velocidad de difusión del agua a través de la capa de partículas. Si la difusión del vapor de agua está fuertemente inhibida aparece, debido al aumento de la temperatura en el núcleo de la partícula que se está formando, una mayor presión de vapor. Para compensar la misma, las partículas se hinchan, con lo que aparecen unas esferas huecas. Después de la evaporación del agua o respectivamente del enfriamiento de las partículas, aparece en el núcleo de las partículas una baja presión. Según la estabilidad de la capa de partículas, la partícula se solidifica, bien sea en la forma hinchada, o bien la partícula se colapsa.

La tendencia a que las partículas se colapsen depende no solamente del tamaño de la substancia o respectivamente del tamaño del proceso. Tanto más, es una función compleja de la hidrofobicidad de la substancia sólida, el que se alcance el límite de la solubilidad y la proporción de substancia sólida de la solución de pulverización. La combinación del límite de solubilidad y la proporción de substancia sólida de la solución de pulverización regula además el grueso de la capa de partículas. Otras magnitudes de influencia como por ejemplo, la temperatura de transición vítrea y la viscosidad del polvo derivado de la misma en el secador por pulverización, podrían asimismo influenciar la tendencia al colapsado.

En resumen, puede comprobarse que de forma grosera la tendencia a hincharse de las partículas en formación, aumenta con la hidrofobicidad y con la disminución de la solubilidad de las substancias auxiliares. La tendencia a colapsar de las partículas hinchadas parece ser por el contrario una propiedad específica de la substancia. Podría demostrarse que a este respecto la fenilalanina comunica una sorprendente buena e inesperada morfología del polvo, en particular en los polvos que contienen proteína y en los polvos secados por pulverización. Este efecto es particularmente ventajoso para la inhalación de dichos polvos.

Las substancias auxiliares con similares hidrofobicidades o respectivamente solubilidades (valina, isoleucina), no mostraron un morfología comparable y por lo tanto ningún comportamiento aerodinámico comparable.

La presente invención se refiere a un polvo que contiene proteína y fenilalanina, caracterizado porque, el polvo contiene por lo menos un 30% (p/p) de fenilalanina (por lo menos un complejo binario).

La invención se refiere en particular a un polvo que contiene una proteína, fenilalanina y por lo menos otras substancias auxiliares como un azúcar o un poliol, caracterizado porque, el polvo contiene por lo menos un 30% (p/p) de fenilalanina (por lo menos un complejo ternario).

La presente invención se refiere a un polvo que contiene una proteína y fenilalanina, caracterizado porque, el polvo contiene por lo menos un 40% (p/p) de fenilalanina (por lo menos un complejo binario).

La invención se refiere en particular a un polvo que contiene una proteína, fenilalanina y por lo menos otra substancia auxiliar como un azúcar o un poliol, caracterizado porque, el polvo contiene por lo menos un 40% (p/p) de fenilalanina (por lo menos un complejo ternario).

En una versión preferida, el polvo en cuestión (por lo menos binario o por lo menos ternario) es un polvo secado por pulverización.

En una versión especial, la invención se refiere a un polvo que contiene una proteína o una substancia activa de proteína y fenilalanina como substancia auxiliar así como opcionalmente otras substancias auxiliares como un azúcar o un poliol, en donde el polvo se caracteriza porque contiene por lo menos un 30% (p/p) de fenilalanina, de preferencia por lo menos un 40% (p/p) de fenilalanina. Ocasionalmente pueden estar contenidas también otras substancias, en particular otras substancias auxiliares en el polvo. Además esta versión especial de la presente invención se refiere también a una composición farmacéutica la cual contiene un polvo, que consta de una proteína o una substancia activa de proteína y fenilalanina como substancia auxiliar así como opcionalmente otras substancia auxiliar como un azúcar o un poliol, en donde el polvo consta por lo menos de un 30% (p/p) de fenilalanina, de preferencia por lo menos un 40% (p/p) de fenilalanina.

En otra versión, el polvo en cuestión contiene por lo menos un 30% (p/p), 31% (p/p), 32% (p/p), 33% (p/p), 34% (p/p), 35% (p/p), 36% (p/p), 37%(p/p), 38%(p/p), 39%(p/p), 40% (p/p), 41% (p/p), 42% (p/p), 43% (p/p), 44% (p/p), 45% (p/p), 46% (p/p), 47% (p/p), 48% (p/p), 49% (p/p), 50% (p/p), 51%(p/p), 52% (p/p), 53% (p/p), 5 4% (p/p), 55% (p/p), 56% (p/p), 57% (p/p), 58% (p/p), 59% (p/p), 60% (p/p), 61%(p/p), 62% (p/p), 63% (p/p), 64% (p/p), 65% (p/p), 66% (p/p), 67% (p/p), 68% (p/p), 69% (p/p), 70% (p/p), 75% (p/p), 80% (p/p), 85% (p/p), 90% (p/p), 95% (p/p), 99% (p/p) ó 99,99% (p/p) de fenilalanina. Se prefieren altas proporciones en tanto por ciento de fenilalanina, en particular proteínas de alta potencia como las citocinas y los interferones (IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, IFN-omega, IFN peguilado, etc), puesto que de esta proteína solamente son necesarias pequeñas cantidades (de un 0,01% (p/p) a un 10% (p/p), en particular de un 0,01% (p/p) a un 5% (p/p) y en particular de un 0,01% (p/p) a un 1% (p/p)).

En una versión preferida, el polvo en cuestión contiene una proporción de fenilalanina en el margen de un 30% (p/p) a un 99, 99% (p/p), de preferencia de un 40% (p/p) a un 99, 99% (p/p), de preferencia de un 40% (p/p) a un 70% (p/p), 60%-90% ó con particular preferencia, de un 60% a un 80%.

En otra versión, el polvo en cuestión contiene un azúcar no reductor seleccionado del grupo formado por un disacárido y un oligosacárido. Preferentemente, el disacárido es la sacarosa o la trehalosa, y el oligosacárido un trisacárido como por ejemplo, la lactosucrosa.

En otra versión, la proporción de azúcar es como máximo el 50% (p/p), de preferencia el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45% (p/p), y con particular preferencia, del 10 al 20% (p/p).

En otra versión, el polvo en cuestión contiene un poliol. Preferentemente el poliol es el manitol.

En otra versión, la proporción de masas de azúcar y proteína es de 1:10 a 10:1, de preferencia 1:3 a 5:1.

En otra versión preferida, el polvo en cuestión contiene un inhibidor de cristalización como la HSA (albúmina de suero humano). De preferencia el polvo contiene por lo menos un 0,1% (p/p) de HSA, por lo menos un 0,5% (p/p) de HSA, por lo menos un 1% (p/p) de HSA, por lo menos un 5% (p/p) de HSA, por lo menos un 10% (p/p) de HSA, por lo menos un 15% (p/p) de HSA. Además, el polvo contiene de preferencia entre 0,1% (p/p)-60% (p/p) de HSA, 0,5% (p/p)-60% (p/p) de HSA, 1% (p/p)-60% (p/p) de HSA, 10% (p/p)-60% (p/p) de HSA, 0,1% (p/p)-40% (p/p) de HSA, 0,5% (p/p)-40% (p/p) de HSA, 1% (p/p)-40% (p/p) de HSA, 10% (p/p)-40% (p/p) de HSA, 0,1% (p/p)-20% (p/p) de HSA, 0,5% (p/p)-20% (p/p) de HSA, 1% (p/p)-20% (p/p) de HSA, 10% (p/p)-20% (p/p) de HSA, 0,1% (p/p)-1% (p/p) de HSA, 0,5% (p/p)-1% (p/p) de HSA, 0,1% (p/p)-0,90% (p/p) de HSA, 0,5% p/p)-0,9% (p/p) de HSA, 0,1% (p/p)-3% (p/p) de HSA, 0,5% (p/p)-3% (p/p) de HSA. Además, el polvo contiene de preferencia, menos del 1% (p/p) de HSA ó menos del 0,9% (p/p) de HSA.

En otra versión preferida, el polvo en cuestión tiene un valor del pH >6,0, >6,5, >7,0, >7,4, > 8. En particular, se prefiere un margen de pH entre 6,0 y 9,0 ó respectivamente entre 7,0 y 8,0.

En otra versión particularmente preferida, el polvo en cuestión está dentro del valor del pH fisiológico. En otra versión particularmente preferida el polvo en cuestión está en el pH de 7,0 a 7,4. En otra versión preferida, el polvo en cuestión tiene un valor del pH que no corresponde al punto isoeléctrico de la fenilalanina.

En una versión preferida, la proteína es una substancia activa, de preferencia una substancia activa farmacéutica como por ejemplo un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de fusión con partes de anticuerpo o un anticuerpo conjugado, un factor de crecimiento, una hormona, una enzima, una citocina, o un interferón. En una versión particularmente preferida, la substancia activa farmacéutica es la insulina o la calcitonina.

En otra versión, la substancia activa farmacéutica es una proteína de fusión o un fragmento de anticuerpo el cual está unido al receptor Fc neonatal.

En otra versión, el contenido en proteína es de 0,01-70% (p/p), 0,01-60% (p/p), 0,01-50% (p/p), 0,01-40% (p/p), 1-50% (p/p), 10-50% (p/p) y de preferencia 30-50% (p/p).

En una versión preferida, la proporción de fenilalanina/azúcar/proteína es de 40/10/50, 99,89/0,1/0,01, 90/9/1, 90/1/9, 80/10/10, 30/10/60, de preferencia 60/10/30 ó 50/10/40.

\newpage

En una versión particularmente preferida, el polvo está compuesto de fenilalanina/lactosucrosa o sacarosa/y una proteína pequeña en la relación de masas 60/10/30.

En otra versión, el tamaño de partícula aerodinámico medio (MMAD) = diámetro aerodinámico mediano de la masa) de la partícula de polvo más pequeña es de 10 \mum, de preferencia más pequeña de 7,5, todavía con más preferencia en el margen entre 1-6 \mum ó respectivamente 3-6 \mum ó 5-7 \mum.

La invención se refiere en otra versión, a una composición farmacéutica la cual contiene el polvo según la invención.

En otra versión, la composición farmacéutica contiene además substancias auxiliares farmacéuticamente compatibles, o respectivamente substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como sales farmacéuticamente aceptables, tampones, detergentes, y similares.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para la obtención de un polvo según la invención, en donde

a) se obtiene una solución de fenilalanina,

b) se añade por lo menos una proteína y opcionalmente por lo menos otra substancia auxiliar como un azúcar o un poliol,

c) se pulveriza la solución o suspensión así obtenida a una temperatura de entrada de preferentemente 90-200ºC y una temperatura de salida de preferencia 40-150ºC, y

d) se separan las partículas formadas del gas de secado.

En una versión preferida del procedimiento según la invención, el disolvente es agua, etanol, isopropanol, etc.

En una versión particularmente preferida del presente procedimiento, se trata en el caso de la proteína, de una substancia activa farmacéutica. La substancia activa farmacéutica es de preferencia una proteína pequeña, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de fusión con partes de anticuerpos o un anticuerpo conjugado, un factor de crecimiento, una hormona, una enzima, una citocina o un interferón. En una versión particularmente preferida, la substancia activa farmacéutica es la insulina o la calcitonina. En otra versión muy particularmente preferida la substancia farmacéutica es un anticuerpo de la clase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, un fragmento de anticuerpo, un interferón o similar.

En otra versión preferida del presente procedimiento se añade en el paso b) en primer lugar la otra substancia auxiliar como un azúcar o un poliol, y a continuación la substancia activa.

En otra versión del presente procedimiento, se efectúan entre el paso a) y b) los siguientes otros pasos:

- un calentamiento de la solución de fenilalanina, de preferencia a 80ºC,

- un enfriamiento de la solución de fenilalanina hasta por debajo de la temperatura de desnaturalización de la proteína que hay que añadir cada vez, en donde el enfriamiento se efectúa de preferencia a temperatura ambiente.

En una versión preferida del presente procedimiento, se pulveriza la solución o suspensión en el paso c) mediante por lo menos una tobera de presión o por lo menos un pulverizador de rotación o por lo menos una tobera venturi o por lo menos un nebulizador de ultrasonidos o por lo menos una tobera de dos substancias. En una versión particularmente preferida, la solución o suspensión se pulveriza en el paso c) mediante por lo menos una tobera de dos substancias.

En otra versión preferida del presente procedimiento, tiene lugar la separación de las partículas en el paso d) mediante por lo menos un separador de partículas, de preferencia mediante por lo menos un ciclón.

La presente invención, se refiere además al empleo de un polvo según la invención o una composición farmacéutica según la invención, como medicamento (1^{a} indicación médica).

En un empleo médico preferido, el medicamento contiene un polvo secado por pulverización según la invención.

La presente invención se refiere además al empleo de un polvo según la invención o una composición farmacéutica según la invención como un medicamento para inhalación.

En un empleo médico preferido, el medicamento para inhalación contiene un polvo secado por pulverización según la invención.

La invención se refiere además al empleo de un polvo según la invención o una composición farmacéutica según la invención para la obtención de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias o enfermedades sistémicas (2ª indicación médica).

En una versión preferida, se seca por pulverización el polvo empleado según la invención o la composición farmacéutica empleada según la invención, para la obtención de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias o enfermedades sistémicas.

En una versión particularmente preferida, la enfermedad de las vías respiratorias o enfermedad sistémica, se selecciona del grupo formado por cáncer pulmonar, inflamación pulmonar, fibrosis quística, COPD (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), asma, enfermedades antiinflamatorias, enfermedades víricas, por ejemplo, la causada por el virus respiratorio sincitial (RSV).

Una versión preferida de la presente invención se refiere a un polvo según la invención, de preferencia un polvo secado por pulverización, en donde este polvo no contiene ninguna adición de estearato de magnesio. Para la hidrofobización de la superficie de las partículas mediante secado por pulverización, el estearato de magnesio no es apropiado puesto que esta substancia es prácticamente insoluble en agua y por lo tanto deben emplearse las suspensiones de estearato de magnesio. En este caso son necesarias concentraciones comparativamente altas de estearato de magnesio para garantizar el deseado recubrimiento de las partículas. Procedimientos más apropiados son por ello los pasos del proceso separados, por ejemplo, la mezcla del polvo (secado por pulverización) con estearato de magnesio.

En otra versión preferida, el polvo de la invención, el cual de preferencia está secado por pulverización, o la composición farmacéutica de la invención, no contiene ningún otro aminoácido a excepción de la fenilalanina. El polvo (secado por pulverización), contiene pues de preferencia exclusivamente, el aminoácido fenilalanina. Esta versión es preferida, puesto que los otros aminoácidos disminuyen o respectivamente diluyen el sorprendente efecto aerodinámico de la fenilalanina.

Otra versión preferida de la presente invención se refiere a un polvo de la invención, de preferencia un polvo secado por pulverización, en donde este polvo no contiene ninguna adición de valina. El polvo preferido está exento de valina.

Otra versión preferida de la presente invención se refiere a un polvo de la invención, de preferencia un polvo secado por pulverización, en donde este polvo no contiene ninguna adición de isoleucina. El polvo preferido está exento de isoleucina.

Otra versión preferida de la presente invención se refiere a un polvo de la invención, de preferencia un polvo secado por pulverización, en donde este polvo no contiene ninguna adición de leucina. El polvo preferido está exento de leucina.

En otra versión preferida, el polvo el cual está secado de preferencia por pulverización, no contiene ninguna adición de tensioactivos como el Tween 20. Esta versión es preferida, puesto que los tensioactivos actúan más bien desestabilizando el polvo de proteína, en particular el polvo de proteína secado por pulverización.

Otra versión preferida de la presente invención se refiere a un polvo de la invención, de preferencia un polvo secado por pulverización, en donde este polvo no contiene ninguna adición de dextrano. El polvo preferido está exento de dextrano. Los polvos que contienen dextrano presentan una mala dispersibilidad, y por ello son poco preferidos.

A partir de los siguientes experimentos, se deduce que los aminoácidos hidrofobizantes ocasionan un hinchamiento de las partículas. La tendencia al colapsado en dependencia de los aminoácidos contenidos no es por el contrario, previsible, y no sigue ninguna ley basada en la estructura. En los ejemplos siguientes la tendencia al colapsado aumenta sorprendentemente en el orden valina, isoleucina, fenilalanina. Mientras que la valina forma partículas redondas, las partículas que contienen fenilalanina se colapsan casi completamente. El polvo que contiene fenilalanina tiene sorprendentemente extremadamente buenas propiedades aerodinámicas. Independientemente del grado de saturación de las fracciones de finas partículas de aminoácido (FPF) puede obtenerse un 65-72%.

Debe destacarse además, que la máxima FPF alcanzada en los polvos que contienen fenilalanina, comparada con los polvos, en particular los polvos secados por pulverización, los cuales no contienen fenilalanina sino otras substancias auxiliares, es muy alta. La máxima FPF alcanzable resulta, de la comparación de la FPF determinada mediante la etapa del impactor y de la proporción determinada mediante la determinación por el tiempo de vuelo, menor de 5 \mum. Según esto se deduce para un polvo que se dispersa bien, solamente una pequeña discrepancia entre la FPF de la etapa del impactor y la fracción determinada mediante la determinación del tiempo de vuelo < 5 \mum. En los polvos difícilmente dispersables se observa por el contrario que la FPF obtenida en la etapa del impactor es esencialmente más pequeña. La causa está en que en el procedimiento del impactor la fracción de finas partículas se determina mediante el conjunto de fracciones. Es decir que la pérdida debida al polvo residual, por ejemplo en la cápsula, en el inhalador así como en el "Sample Induction Port" (portal de inducción de la muestra), disminuye la FPF determinada. En la determinación por el tiempo de vuelo, el cálculo se hace por el contrario, por medio del polvo ya dispersado, lo cual significa que las pérdidas citadas más arriba no entran en la medición.

Debe aceptarse que el comportamiento aerodinámico de las partículas depende fuertemente de la morfología de las partículas y de la naturaleza de la superficie. Por lo tanto, son ideales para la invención, las múltiples depresiones de las partículas o respectivamente las partículas fuertemente colapsadas, como se comprueba en las partículas que contienen fenilalanina.

Mediante el colapsado y la forma irregular asociada al mismo, las fuerzas de Van der Waals se debilitan. Además, las partículas que contienen fenilalanina muestran contrariamente a las partículas que contienen valina e isoleucina, una estructura de la superficie esencialmente áspera. La estructura áspera de la superficie podría haber sido causada mediante una cristalización.

En los siguientes ejemplos pudo ser mostrado, que la fenilalanina sola y en particular en combinación con un azúcar, produce en el polvo muy buenas propiedades aerodinámicas, en particular después del secado por pulverización. La fenilalanina sola, no tiene sin embargo capacidad para estabilizar ninguna proteína, por ejemplo el anticuerpo IgG1 empleado en los ejemplos 1 y 2. Para dichas proteínas es posible sin embargo una estabilización mediante la adición de azúcar.

Los ejemplos aclaran que la proteína en condiciones de almacenamiento secas, tanto a 25ºC como también a 40ºC durante el tiempo de almacenamiento ensayado de 1 mes, 2 meses y 3 meses, puede almacenarse casi completamente estabilizada. En condiciones de humedad puede ocurrir un ligero daño de la proteína como sucede con el anticuerpo empleado en el ejemplo.

Los siguientes ejemplos aclaran además, que el polvo que contiene fenilalanina comparado con un polvo que contiene dextrano, tiene una FPF esencialmente mejor (59,6% frente al 33,7%). Puesto que el tamaño aerodinámico de las partículas de los dos polvos se diferencian sólo muy poco, o respectivamente el polvo que contiene fenilalanina incluso tiene un MMAD ligeramente elevado, las diferencias de la FPF respecto al comportamiento de dispersión del polvo al esparcirlo fuera de la cápsula, disminuyen. Esto significa que el polvo que contiene fenilalanina se puede dispersar esencialmente mejor y con ello las acciones recíprocas entre las partículas son menores, comparadas con el correspondiente polvo que contiene dextrano.

En los ejemplos se muestra además, que el polvo que contiene fenilalanina cuando se compara con un polvo que contiene dextrano, durante el tiempo de almacenamiento presenta esencialmente pocos daños en la FPF. Es particularmente ventajosa la fenilalanina con altas humedades del aire (por ejemplo 25ºC/60% de humedad relativa). Mientras que en el polvo que contiene dextrano la FPF disminuye hasta un 45-49% del valor de partida, el polvo que contiene fenilalanina muestra después de 2 meses de almacenamiento a 25ºC/60% de humedad relativa, incluso un aumento de la FPF y después de 3 meses, solamente una ligera disminución hasta un 89% del valor de partida.

Los resultados de los ejemplos subrayan en particular la idoneidad de las composiciones de polvos ternarios en humedades elevadas del aire. Los polvos convencionales, en particular los polvos secados por pulverización, muestran en la exposición a humedades elevadas del aire por regla general un fuerte perjuicio en el comportamiento aerodinámico. Mediante la fenilalanina tiene lugar por el contrario en un almacenamiento con una humedad del aire alta (por ejemplo 60% de humedad relativa), una estabilización de la aerodinámica, o respectivamente, como se muestra en los ejemplos, una mejora de los mismos.

Morfología del polvo:

Como aclaran los siguientes ejemplos, ambos polvos muestran, tanto el polvo que contiene fenilalanina como también el polvo que contiene dextrano, ningún gran aglomerado de polvo. Además, pueden verse múltiples depresiones en las formulaciones. Una diferencia esencial en ambas morfologías es la alta rugosidad de la superficie del polvo que contiene fenilalanina. Esta elevada rugosidad de la superficie es probablemente también un motivo para un mejor comportamiento a la dispersión.

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Ejemplos Ejemplo 1 Complejos binarios

Se prepararon soluciones binarias de una IgG1 y diferentes aminoácidos, los cuales se diferenciaban por su solubilidad e hidrofobicidad. La concentración de aminoácidos en la solución de pulverización fue del 50% de aminoácidos empleados y en otra serie de pruebas, del 90% de la máxima concentración alcanzable de los correspondientes aminoácidos (véase tabla 1). La relación de masas entre la IgG1 y los aminoácidos fue de 95/5. Condicionadas por las diferentes solubilidades de los aminoácidos, se ajustaron correspondientemente las diferentes proporciones de substancias sólidas.

TABLA 1 Disoluciones binarias de IgG1 y una substancia auxiliar

1

Las soluciones se secaron bajo las siguientes condiciones de pulverización:

Secador por pulverización: SD-Micro (de la firma Niro)

Temperatura de entrada: 120ºC

Temperatura de salida: 90ºC

Consumo de gas de pulverización: 5 kg/hora

Consumo de gas de secado: 28 kg/hora.

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Se demostró que los aminoácidos hidrófobos ocasionan un hinchamiento de las partículas. La tendencia al colapsado aumentó en el orden valina, isoleucina y fenilalanina. Mientras que la valina formaba partículas redondas, la fenilalanina se colapsaba casi completamente (véase la figura 1a-1c). El polvo que contenía fenilalanina tenía sorprendentemente extremadas buenas propiedades aerodinámicas. Podían obtenerse independientemente del grado de saturación de los aminoácidos, fracciones de las partículas finas (FPF) del 65-72% (véase tabla 2).

Hay que resaltar además que la FPF máxima alcanzada en los polvos que contenían fenilalanina comparada con la de los polvos secados por pulverización con las substancias auxiliares listadas en la tabla 1, es muy alta. La FPF máxima alcanzable se obtiene de la comparación de la FPF determinada mediante el método del impactor y la proporción determinada mediante la determinación del tiempo de vuelo, menor de 5 \mum. El método del APS se explica con detalle en la descripción de la figura 5/6. Según ello se obtiene para un polvo que dispersa bien, solamente una pequeña discrepancia entre la FPF del método del impactor y la fracción determinada mediante la determinación del tiempo de vuelo < 5 \mum. En polvos difícilmente dispersables se demuestra por el contrario que la FPF determinada mediante el método del impactor es esencialmente más pequeña. La causa reside en que en el procedimiento del impactor, la fracción de partículas finas está determinada sobre el total de fracciones. Esto significa, que la pérdida por el polvo residual por ejemplo en la cápsula, en el inhalador, así como en la muestra, así como en el "Sample Induction Port" (portal de inducción de la muestra), disminuye la FPF determinada. En la determinación por el tiempo de vuelo, se calcula por el contrario solamente sobre el polvo ya dispersado, lo cual significa que la pérdida más arriba citada no está incluida en la medición.

Debe aceptarse que el comportamiento aerodinámico de las partículas depende fuertemente de la morfología de las partículas y de la naturaleza de la superficie. Por lo tanto las múltiples depresiones de las partículas o respectivamente las partículas fuertemente colapsadas como se comprueba en las partículas que contienen fenilalanina, son ideales para la inhalación.

Mediante el colapsado y la forma irregular asociada al mismo, se debilitan las fuerzas de Van der Waals. Además, las partículas que contienen fenilalanina demuestran contrariamente a las partículas que contienen valina e isoleucina, una estructura de superficie esencialmente rugosa. La estructura rugosa de la superficie podría ser la causa de una cristalización.

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TABLA 2 Comportamiento aerodinámico del polvo secado por pulverización, medido con el medidor de tamaño de partículas aerodinámicas, impactor Inlet

2

ª El MMAD se determinó mediante la medición del "Time-of-flight" (TOF) (tiempo-de-vuelo). Para ello, el polvo se esparció con el HandiHaler con una proporción de fluido de 39,0 litros/minuto sobre un "Sample Induction Port" (portal de inducción de la muestra) (SIP). Después de pasar el SIP, el aerosol-polvo se divide. Una parte del 99,8% de la población de partículas se conduce a un impactor de una etapa. El resto del 0,2% va mediante un capilar a la célula TOF de medición.

^{b} la FPF se determina con un impactor de una etapa. El corte de la etapa del impactor es de 5,0 \mum con un flujo de 39,0 litros/minuto.

^{c} la máxima FPF alcanzable es igual a la parte < 5 \mum determinada en la célula TOF de medición. En la célula TOF de medición se mide el aerosol-polvo, que es conducido inmediatamente a la etapa del impactor. La medición TOF no tiene por lo tanto ninguna relación con las fracciones de partículas que se han separado antes del dispositivo de medición (cápsulas, HandiHaler, SIP). Por el contrario, la FPF se refiere al peso neto en la cápsula. En este caso, se incluyen las fracciones de partículas que se separaron antes de alcanzar la etapa del impactor. Cuando el FPF es igual a la proporción de partículas < 5,0 \mum determinadas en la célula TOF de medición, entonces en consecuencia el polvo se dispersa completamente y no se encuentra ningún resto de polvo en el HandiHaler ni en el SIP.

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En la figura 2 está representado el contenido de monómeros del anticuerpo después del secado por pulverización. De la misma se desprende, que los pocos aminoácidos hidrófobos (glicina, asparagina) actúan sobre el anticuerpo como estabilizadores. Los aminoácidos hidrófobos (valina, isoleucina, y fenilalanina no muestran por el contrario ningún potencial suficientemente estabilizador para los anticuerpos.

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Ejemplo 2 Complejos ternarios

Tomando como base el ejemplo 1, se prepararon mezclas ternarias de IgG1, fenilalanina y otra substancia auxiliar. En cuanto al 3^{er} componente, se trataba del trisacárido lactosucrosa LS90P muy fácilmente soluble en agua.

Se prepararon 4 soluciones para pulverización (véase la tabla 3). El disolvente fue agua pura. La proporción de substancia sólida en la solución de pulverización fue en cada caso del 3,83% (p/v).

TABLA 3 Composiciones ternarias de polvo, a partir de fenilalanina, azúcar y proteína

3

Las soluciones se secaron por pulverización bajo la siguientes condiciones de pulverización:

secador por pulverización: SD-Micro (firma Niro)

temperatura de entrada: 120ºC

temperatura de salida: 90ºC

consumo de gas de pulverización: 4 kg/hora

consumo de gas de secado: 28 kg/hora.

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Las imágenes 3a-3d muestran las fotografías REM de los diferentes polvos ternarios. Los 4 polvos muestran el mismo arrugado que la composición de polvo de fenilalanina e IgG1(véase ejemplo 1). Los 4 polvos ternarios no muestran entre sí ninguna diferencia importante.

En la tabla 4 están listadas las propiedades aerodinámicas de los 4 polvos. Mediante la adición de lactosucrosa, la FPF comparada con las composiciones binarias disminuye solamente muy poco. La estabilización de las proteínas después del secado por pulverización de las composiciones ternarias de polvo es por el contrario, muy buena. El contenido en monómero estuvo en todas las formulaciones entre 98-99% (véase la tabla 5).

TABLA 4 Comportamiento aerodinámico del polvo secado por pulverización, medido con el APS*

4

* Las mediciones se efectúan con el "Aerodynamic Particle Sizer" (medidor de tamaños de partículas aerodinámicas).

TABLA 5 Contenido en monómero de las composiciones de polvos

6

Ejemplo 3 Estabilidad al almacenamiento

En los ejemplos anteriores se ha podido mostrar que la fenilalanina sola y en particular en combinación con un azúcar, presenta unas muy buenas propiedades aerodinámicas del polvo después del secado por pulverización. La fenilalanina no puede sin embargo estabilizar todas las proteínas, por ejemplo el anticuerpo IgG1 empleado en los ejemplos 1 y 2. Para dichas proteínas es sin embargo posible una estabilización mediante la adición de azúcar.

Se investigó ahora en este ejemplo, la estabilidad al almacenamiento después del secado por pulverización. A este respecto se varió por una parte la proporción de fenilalanina (80-60% referido al polvo), y por otra parte se investigó la influencia de la proporción de LS90P sobre la estabilidad de la proteína. Se emplearon diferentes relaciones entre proteína y azúcar (véanse las tablas 5 y 6).

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TABLA 5 Solución de la composición para pulverización

7

La fenilalanina se disolvió calentando (80ºC). Después de enfriar la solución a temperatura ambiente se añadieron la proteína y el azúcar.

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TABLA 6 Composición del polvo secado por pulverización

9

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Las soluciones se secaron por pulverización bajo las siguientes condiciones de pulverización:

secador pulverización: SD Micro (firma Niro)

temperatura de entrada: 250ºC

temperatura de salida: 90ºC

consumo de gas del pulverizador: 4 kg/hora

consumo de gas de secado: 28 kg/hora.

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Condiciones de almacenamiento: los polvos se almacenaron durante 3 meses bajo diferentes condiciones de almacenamiento (25ºC/seco, 40ºC/seco, 25ºC/60% de humedad) (véanse tablas 7 y 8). Para la condición de almacenamiento de 25ºC/seco y 40ºC/seco, el polvo se envasó en condiciones secas (<30% de humedad relativa) en frascos de vidrio y se tapó con tapones de goma y una tapa bordoneada.

El almacenamiento a 25ºC y 60% de humedad relativa tuvo lugar mediante una solución saturada de sal en el desecador. El desecador se atemperó en el armario de secado.

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TABLA 7 MMAD en \mum

10

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El MMAD no mostró ninguna dependencia importante entre los lotes y las condiciones de almacenamiento.

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TABLA 8 FPF en tanto por ciento

12

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El FPF fue, directamente después de la obtención, es decir antes del almacenamiento, del 46% (polvo 3) hasta el 60% (polvo 1). Una disminución del contenido de fenilalanina del 80% (polvo 2) al 60% (polvo 3) no actúa negativamente sobre la fracción de partículas finas.

TABLA 9 Contenido de monómero del anticuerpo IgG1 en el polvo secado por pulverización

13

La estabilidad de la proteína después del secado por pulverización y almacenamiento está representada en la tabla 9. La tabla 9 muestra el contenido en tanto por ciento de monómero del anticuerpo IgG 1. En la figura 4 están representados los contenidos relativos en monómero, referidos a los valores iniciales.

El ejemplo aclara que la proteína bajo condiciones secas de almacenamiento tanto a 25ºC como también a 40ºC durante el tiempo de almacenamiento de prueba, puede permanecer almacenado casi completamente estabilizado. Bajo condiciones de humedad tiene lugar un ligero daño del anticuerpo empleado en el ejemplo.

Los polvos ternarios tienen pues, una buena fracción de partículas finas y adicionalmente también una buena estabilidad.

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Ejemplo 4 Estabilidad al almacenamiento comparada (polvo conteniendo dextrano y fenilalanina)

Se compararon las propiedades del polvo que contenía fenilalanina con las propiedades de otro polvo convencional (ver tabla 10). En ambos polvos tiene lugar durante el almacenamiento, solamente una muy pequeña modificación del tamaño aerodinámico de las partículas (tabla 11).

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TABLA 10 Las soluciones se secaron por pulverización bajo las siguientes condiciones de pulverización

14

TABLA 11 MMAD [\mum]

15

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TABLA 12 Fracciones de partículas finas

17

El polvo que contiene fenilalanina tiene, comparado con el polvo que contiene dextrano, una FPF esencialmente mejor (59,6% frente a 33,7%, véase tabla 12/figura 5). Puesto que los tamaños aerodinámicos de las partículas de ambos polvos se diferencian solamente muy poco, o respectivamente el polvo que contiene fenilalanina presenta incluso una MMAD ligeramente aumentada (véase tabla 11), las diferencias de la FPF son atribuibles al comportamiento a la dispersión del polvo cuando se esparce fuera de la cápsula. Esto significa que el polvo que contiene fenilalanina se puede dispersar esencialmente mejor, y con ello las acciones recíprocas entre las partículas son menores, si se comparan con el correspondiente polvo que contiene dextrano.

En la figura 6 se representa la FPF relativa referida al valor inicial de la estabilidad. Se muestra aquí que el polvo que contiene fenilalanina durante el tiempo de almacenamiento presenta esencialmente un deterioro menor de la FPF. La fenilalanina es particularmente ventajosa a altas humedades del aire. Mientras que en el polvo que contiene dextrano, la FPF cae un 45-49% del valor inicial, el polvo que contiene fenilalanina después de 2 meses de almacenamiento experimenta incluso un aumento de la FPF y después de 3 meses solamente una ligera caída al 89% del valor
inicial.

Este resultado subraya en particular la idoneidad de las composiciones ternarias del polvo para humedades del aire elevadas. Los polvos convencionales secados por pulverización muestran por regla general un fuerte deterioro en el comportamiento aerodinámico. Mediante la fenilalanina tiene lugar por el contrario una estabilización de la aerodinámica o respectivamente, como se muestra en este ejemplo, una mejora de la misma.

Morfología del polvo:

Como puede reconocerse en la figura 7 y la figura 8, ambos polvos (polvo conteniendo fenilalanina en la figura 7, polvo conteniendo dextrano en la figura 8), no muestran ningún aglomerado grande de polvo. Además pueden verse en ambas formulaciones múltiples depresiones. Una diferencia esencial en ambas morfologías es la mayor rugosidad de la superficie en el caso del polvo que contiene fenilalanina. Esta mayor rugosidad de la superficie es probablemente también la causa de un mejor comportamiento a la dispersión.

Debido a la adición de aminoácidos hidrófobos (isoleucina o respectivamente fenilalanina), las superficies de las partículas deben ser en ambos polvos por lo menos en parte, hidrófobas. De ello se deduce de nuevo que la sola hidrofobización de la superficie respecto a las propiedades aerodinámicas es mucho menos eficiente que la estructura rugosa inducida de la superficie, como es el caso de la fenilalanina.

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Ejemplo 5 Secado por pulverización con diferentes valores del pH

En este ejemplo se ajustaron diferentes valores del pH de la solución de pulverización de una composición definida (véase tabla 13), y se pulverizó.

Las condiciones de pulverización están representadas en la tabla 14.

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TABLA 13 Composición de las soluciones de pulverización

18

TABLA 14 Condiciones de la pulverización

19

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TABLA 15 Resultados

20

El comportamiento aerodinámico (FPF, masa producida) de los polvos representados en la tabla 15 no muestra ninguna diferencia esencial. Los polvos obtenidos fueron parcialmente cristalinos en cada caso. Por lo tanto el valor del pH de la solución de pulverización no es decisivo para las propiedades inherentes del polvo (dispersibilidad/Inhalabilidad) y la propiedad de pulverización de la fenilalanina.

La estabilización de la proteína depende del valor del pH de la solución de pulverización. El anticuerpo empleado es estable a valores bajos del pH. Sin embargo puede alcanzarse, a valores altos del pH de 9,0, una estabilización de la proteína, en particular si se compara con composiciones binarias (véase figura 2).

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Ejemplo 6 Secados por pulverización con diferentes proporciones de fenilalanina

En este ejemplo, la proporción de fenilalanina en el polvo secado por pulverización se reduce del 50% p/p al 20% p/p. Las composiciones del polvo están representadas en la tabla 16. Las condiciones de pulverización están representadas en la tabla 17.

TABLA 16 Composición del polvo secado por pulverización

21

TABLA 17 Condiciones de pulverización

22

La figura 9 muestra el comportamiento aerodinámico de los polvos secados por pulverización en función de la proporción de fenilalanina en el polvo. Según esta figura, la proporción de fenilalanina puede ser reducida en el polvo secado por pulverización a un 30% (p/p). Si se reduce el contenido de fenilalanina a un 20% (p/p) disminuye considerablemente tanto la fracción de partículas finas como también la masa producida.

La morfología de las partículas depende fuertemente de la proporción de fenilalanina en el polvo secado por pulverización. Con el 50% (p/p), 40% (p/p) y 30% (p/p) de contenido de fenilalanina existen partículas fuertemente arrugadas en forma de pasas (figuras 10a-10c). Con una reducción de la proporción de fenilalanina a un 20%, la intensidad del arrugado disminuye. La modificación de la morfología de las partículas va correlativa con el empeoramiento del comportamiento aerodinámico del polvo. Esto significa que el efecto positivo de la fenilalanina en el secado por pulverización de las soluciones de pulverización solamente se manifiesta con claridad a partir del 30% (p/p).

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Ejemplo 7 Secado por pulverización de diferentes proteínas

En este ejemplo se secaron por pulverización junto a un anticuerpo del tipo IgG, la hormona calcitonina y la enzima lisozima. Las composiciones del polvo obtenidas están representadas en la tabla 18 y las condiciones de pulverización en la tabla 19.

TABLA 18 Composición del polvo secado por pulverización

23

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TABLA 19 Condiciones de la pulverización

24

En la figura 11 está representada la fracción de partículas finas así como la masa producida del polvo secado por pulverización 1-3. El tipo de proteína no es por lo tanto decisivo en el comportamiento aerodinámico del polvo secado por pulverización.

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Ejemplo 8 Obtención de polvo secado por pulverización con otras substancias auxiliares distintas

En esta serie de ensayos se secaron por pulverización otras substancias auxiliares intercambiadas con la LS90P con la fenilalanina y un anticuerpo IgG1. Las composiciones de un polvo obtenido están representadas en la tabla 20, y las condiciones de pulverización en la tabla 21.

TABLA 20 Composición del polvo secado por pulverización

25

TABLA 21 Condiciones de pulverización

26

En la figura 12 están representadas las fracciones de partículas finas y las masas producidas. Las fracciones de partículas finas son en las substancias auxiliares ensayadas, muy altas (sacarosa: 46%, manitol: 60%, glicina: 62%, PVP: 63%). Mediante una adecuada selección de las substancias auxiliares puede mejorarse todavía más el efecto positivo de la fenilalanina sobre el proceso de secado por pulverización. A este respecto, la otra substancia auxiliar en cuestión, no está limitada a una clase de substancia. Puede tratarse, como se muestra en este ejemplo, de un azúcar o un alcohol de azúcar, un aminoácido o también un polímero. Es decisivo para el empleo de otra substancia auxiliar, la estabilización de la proteína mediante el secado por pulverización. En la tabla 22 están representados los contenidos en monómero del anticuerpo empleado. Se observa que la proteína, mediante la adición de otra substancia auxiliar, puede ser estabilizada en comparación con las mezclas binarias de fenilalanina e IgG1 (véase la figura 2).

TABLA 22

27

Ejemplo 9 Secado por pulverización con empleo de inhibidores de la cristalización

En este ejemplo se muestra que mediante el empleo de inhibidores de cristalización, los polvos secados por pulverización pueden ser optimizados. Para esta finalidad se obtienen diferentes polvos correspondientes en la tabla 23.

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TABLA 23 Composiciones de polvos

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Las condiciones de secado en el Büchi B191 y en el SDMicro están resumidas en la tabla 24.

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TABLA 24 Condiciones de secado

30

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El objetivo del secado por liofilización de una solución acuosa de LS90P fue la obtención de polvos amorfos a los rayos Röntgen. Para ello se preparó una solución acuosa con poca proporción de substancia sólida (5 g/100 ml), y correspondientemente se secó por liofilizacón como está descrito en la tabla 25.

TABLA 25 Programa de temperatura y presión del secado por liofilización

31

En la figura 13 están representadas las entalpías de recristalización de la LS90P después de calentar el polvo en un aparato DSC (DSC821/Mettler Toledo). Se muestra que la entalpía de cristalización referida a la proporción de masa de la proteína empleada depende fuertemente de la proteína. Así, la entalpía de cristalización aumenta en el orden IgG1 (6,8 J/g), lisozima (13,9 J/g), calcitonina (21,3 J/g), y con ello también la proporción de la parte amorfa de la LS90P después del secado por pulverización.

Puesto que la LS90P en las correspondientes formulaciones de polvo es el componente estabilizador de la proteína en el polvo, se desea una alta proporción de la parte amorfa de la LS90P en el polvo. Por este motivo, en otra serie de pruebas, se añadió HSA como inhibidor de la cristalización, a la solución de pulverización. El secado por pulverización tuvo lugar de forma análoga a la tabla 26. La composición del polvo fue:

60% de fenilalanina/30% de LS90P/1% de HSA/9% de IgG1.

La entalpía de cristalización de la LS90P fue de 24,3 J/g y corresponde a la LS90P amorfa a los rayos Röntgen (23,8 J/g). Con referencia al polvo 2 que contiene IgG1, pueden optimizarse, mediante la adición de pequeñas cantidades de HSA, las propiedades del polvo por lo que se refiere al carácter amorfo del polvo.

TABLA 26 Condiciones de la pulverización

33

Ejemplo 10 Comparación de diferentes aminoácidos aromáticos

En este ejemplo, los aminoácidos aromáticos triptófano e histidina deben compararse con polvos comparables que contengan fenilalanina. El aminoácido aromático tirosina se excluye como substancia auxiliar potenciadora del secado por pulverización, puesto que este aminoácido es demasiado difícil de disolver en agua. El triptófano comparado con la fenilalanina se disuelve asimismo muy mal en agua, de forma que para la preparación de polvos farmacéuticos importantes, la proporción máxima de triptófano que puede aportarse es del 20% p/p.

Para comparar las propiedades de pulverización de los aminoácidos aromáticos, se prepararon cada vez, un polvo con el 20% de proporción de aminoácidos. En la tabla 27 están resumidas las composiciones de los polvos y en la tabla 28 las condiciones de pulverización.

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TABLA 27 Composición de los polvos secados por pulverización

34

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TABLA 28 Condiciones de la pulverización

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Las fracciones de partículas finas fueron muy poco mejores después del secado por pulverización, en los polvos que contenían fenilalanina (véase la figura 14).

Una ventaja esencial de los polvos que contienen fenilalanina frente a los polvos que contienen histidina está en la poca sensibilidad a la humedad. Mientras que la FPF del polvo que contiene histidina, después de una exposición con un 50% de humedad relativa del aire, descendió desde un 28% original a un 16%, en el polvo que contiene fenilalanina después de la exposición tiene lugar incluso una optimización de la FPF. También se observa un correspondiente comportamiento de la masa obtenida. En el polvo que contiene histidina disminuye la masa obtenida, mientras que en el polvo que contiene alanina ocurre lo contrario.

El polvo que contiene triptófano no muestra ninguna modificación en la FPF ni en la masa producida, por la humedad del aire. Es desventajosa en este aminoácido comparado con la fenilalanina, como ya se ha citado más arriba, la muy pequeña solubilidad en agua.

La histidina se comparó a continuación con los correspondientes polvos conteniendo fenilalanina (véase la tabla 29). Las preparaciones tuvieron lugar de manera análoga con las condiciones de pulverización descritas en la tabla 28.

TABLA 29

36

Mientras que los polvos 4 y 6 poseen propiedades aerodinámicas similares, el polvo 7 que contiene fenilalanina muestra en comparación con el correspondiente polvo 5 que contiene histidina, una esencialmente mejor fracción de partículas finas (véase la tabla 30). Es particularmente evidente la diferencia de la aerodinámica después de una exposición a la humedad (véase la tabla 31). Debido a la influencia de la humedad, la FPF del polvo ensayado que contiene histidina, está casi completamente deteriorada. Los polvos conteniendo fenilalanina muestran por el contrario una ligera mejoría en el comportamiento aerodinámico.

TABLA 30 FPF y masa producida de polvo secado por pulverización sin acondicionar a la humedad

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TABLA 31 FPF y masa producida del polvo secado por pulverización con acondicionamiento a la humedad (50% de humedad/20 horas/temperatura ambiente)

39

En resumen, puede comprobarse que las propiedades positivas de la fenilalanina sobre el secado por pulverización no pueden conseguirse mediante otros aminoácidos aromáticos.

Claims (17)

1. Polvo que contiene una proteína y fenilalanina, caracterizado porque, el polvo contiene por lo menos un 30% (p/p) de fenilalanina, de preferencia por lo menos un 40% (p/p) de fenilalanina.

2. Polvo según la reivindicación 1, caracterizado porque, el polvo contiene por lo menos otra substancia auxiliar como un azúcar o un poliol.

3. Polvo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque, el polvo se ha secado por pulverización.

4. Polvo según una de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizado porque, el azúcar es un azúcar no reductor, seleccionado del grupo formado por un disacárido y un oligosacárido.

5. Polvo según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque, la proteína es una substancia activa, de preferencia una substancia activa farmacéutica como un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de fusión con partes de anticuerpos o un anticuerpo conjugado, un factor de crecimiento, una hormona o una enzima.

6. Polvo según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, el tamaño medio de partícula aerodinámica (MMAD = Mass median aerodynamic diameter (diámetro aerodinámico medio de la masa)), de la partícula de polvo es menor de 10 \mum, de preferencia menor de 7,5 \mum, con mayor preferencia en el margen entre 1-6 \mum ó respectivamente 3-6 \mum ó 5-7 \mum.

7. Composición farmacéutica que contiene un polvo según una de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Procedimiento para la preparación de un polvo según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque,

a) se prepara una solución de fenilalanina,

b) se añade por lo menos una proteína y opcionalmente por lo menos otra substancia auxiliar como un azúcar o un poliol,

c) la solución o suspensión así obtenida se pulveriza a una temperatura de entrada preferentemente de 90-200ºC, y una temperatura de salida preferentemente de 40-150ºC, y

d) las partículas obtenidas se separan del gas de secado.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque, en el caso de la proteína se trata de una substancia activa farmacéutica.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque, entre el paso a) y el b) se efectúan los siguientes otros pasos:

- un calentamiento de la solución de fenilalanina, de preferencia a 80ºC,

- un enfriamiento de la solución de fenilalanina hasta por debajo de la temperatura de desnaturalización de la correspondiente proteína que hay que añadir, en donde el enfriamiento tiene lugar de preferencia hasta la temperatura ambiente.

11. Procedimiento según la reivindicación 8 a 10, caracterizado porque, la solución o suspensión se pulveriza en el paso c) mediante por lo menos una tobera de presión o por lo menos un pulverizador rotativo o por lo menos una tobera venturi o por lo menos un nebulizador de ultrasonidos o por lo menos una tobera para dos substancias.

12. Procedimiento según la reivindicación 8 a 11, caracterizado porque, la separación de las partículas en el paso d) tiene lugar mediante por lo menos un separador de partículas, de preferencia mediante por lo menos un ciclón.

13. Polvo según la reivindicación 1 a 6, ó composición farmacéutica según la reivindicación 7, para emplear como medicamento.

14. Polvo según una de las reivindicaciones 1 a 6, ó una composición farmacéutica según la reivindicación 7, para el tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias o enfermedades sistémicas.

15. Polvo según una de las reivindicaciones 1 a 6, ó una composición farmacéutica según la reivindicación 7, para el tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias o enfermedades sistémicas según la reivindicación 14, en donde la enfermedad se selecciona del grupo formado por, cáncer de pulmón, inflamación de los pulmones, fibrosis quística, COPD (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), asma, enfermedades antiinflamatorias, enfermedades víricas como por ejemplo, la causada por el virus sincicitial respiratorio (RSV).

16. Empleo de un polvo según la reivindicaciones 1 al 6, ó una composición farmacéutica según la reivindicación 7, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias.

17. Empleo según la reivindicación 16, en donde la enfermedad se selecciona del grupo formado por: cáncer de pulmón, inflamación de los pulmones, fibrosis quística, COPD (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), asma, enfermedades antiinflamatorias, enfermedades víricas como por ejemplo la causada por el virus sincicitial respiratorio (RSV).