ES2334890T3 - Tubo de reaccion y metodo de uso para minimizar la contaminacion. - Google Patents
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Abstract
Un método para amplificar y detectar materiales de ácido nucleico, que comprende las etapas de: a. añadir una muestra sospechosa de contener un material de ácido nucleico objetivo a un recipiente de amplificación (10) junto con reactivos marcados para amplificación de dicho ácido nucleico objetivo sospechoso para formar una mezcla de reacción; b. sellar la mezcla de reacción dentro de dicho recipiente, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3 (30), cerrando una tapa herméticamente sellada, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3, (20), que tiene una membrana, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3, (28), que es penetrable por una sonda de pipeta, donde el recipiente de amplificación, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3 (10), tiene una bisagra replegable, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3, (30); c. amplificar el material de ácido nucleico objetivo dentro de dicho recipiente (10); d. retirar una porción de la mezcla de reacción desde el recipiente de amplificación (10) para detección; y e. detectar la presencia de ácido nucleico objetivo amplificado por detección de dichos reactivos marcados; en el que la retirada se realiza perforando la membrana (28) de la tapa con una sonda de pipeta, aspirando la porción de la mezcla de reacción en la pipeta y dispersando la porción en un compartimiento de detección distinto sin destapar el recipiente de amplificación (10), evitando de esta manera que gotas o aerosoles del material amplificado puedan contaminar el medio ambiente, muestras no reaccionadas o reactivos.
Description
Tubo de reacción y método de uso para minimizar
la contaminación.
Esta invención se refiere a tubos de reacción
adecuados para reacciones de amplificación y, en particular, a
tubos para uso en instrumentos automáticos de ciclo térmico y
detección. La invención se refiere también a método para uso
automático de tales tubos.
Esta solicitud se refiere a la solicitud
co-propietaria de los Estados Unidos N° de serie
08/141.243, presentada el 22 de Octubre de 2003, titulada Sistema
de transporte de tubos y método de uso (expediente 5453 US 01),
ahora abandonada.
Las técnicas de amplificación para la detección
de ácidos nucleicos objetivos en muestras biológicas ofrecen alta
sensibilidad y especificidad para la detección de organismos
infecciosos y defectos genéticos. Copias de secuencias especificas
de ácidos nucleicos son sintetizadas a una tasa exponencial a través
de un proceso de amplificación. Ejemplos de estas técnicas son la
reacción de la cadena de polimerasa (PCR), descrita en las patentes
de los Estados Unidos N° 4.683.202 y 4.683.195 (Mullis); la reacción
de la cadena de ligasa (LCR) descrita en la patente
EP-A-320 308 (Backman y col.); y LCR
de relleno del intersticio (GLCR) o variaciones de las mismas, que
se describen en los documentos WO 90/01069 (Segev),
EP-A-439.182 (Backman y col.), GB
2.225.112A (Newton y col.) y WO 93/0047 (Birkenmeyer y col.). Otras
técnicas de amplificación incluyen Q-Beta Replicasa,
como se describe en la literatura; Amplificación por Desplazamiento
de la Trenza (SDA), como se describe en la patente
EP-A-497 272 (Walter),
EP-A-500 224 (Walter, y col.) y en
Walter, y col. en Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992);
Replicación de Secuencia Auto-sostenida (3SR), como
se describe por Fahy, y col. en PCR Methods and Applications 1:25
(1991); Y Amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico
(NASBA), como se describe en Kievits, y col. J. Virol. Methods,
35:273-286 (1991).
Estas reacciones, particularmente donde se
requiere ciclo térmico, se realizan habitualmente en tubos del tipo
micrófugo, tales como tubos SlickSeals^{TM} disponibles de
Nacional Scientific (San Rafael, CA) o en tubos GeneAmp^{TM} de
pared fina disponibles de Perkin-Elmer (Norwalk,
CT). Otro tipo de recipiente de reacción es una tira de vasos de
reacción micrófugos combinada con una tira de caperuzas de bóveda
como se describe en la patente
EP-A-488 769 y comercializadas por
Perkin-Elmer (Norwalk, CT) como MicroAmp^{TM}
para uso con un ciclador térmico Perkin-Elmer 9600.
En un procedimiento típico, después de la realización de la
reacción de amplificación, los tubos son abiertos y una porción del
producto de reacción amplificada es transferida a un aparato de
detección, tal como una placa de microtitulación u otro aparato de
detección.
Un problema principal con tales procedimientos
de amplificación de ácido nucleico es el riesgo de contaminación
cuando se abren los vasos de amplificación. Se puede generar
derrame, formación de gotitas y/o aerosoles cuando se retiran las
tapa con el fin de retirar una porción del producto de reacción
amplificado para análisis de detección. Esto puede dispersar el
producto amplificado a través del laboratorio por gotitas
transportadas por el aire o sobre equipo y puede contaminar
muestras no amplificadas y/o reactivos. Esto conducirá rápidamente
a resultados positivos falsos. Deben tomarse precauciones extremas
para prevenir tal contaminación. La separación física entre zonas
de preparación de las muestras, de amplificación y de detección se
ha utilizado habitualmente en la técnica. Es bastante engorroso,
costoso y requiere entrenamiento riguroso para prevenir la
transferencia de prendas de vestir del laboratorio, guantes,
pipetas o equipo del laboratorio entre tales zonas.
La patente de los Estados Unidos 5.229.297 y la
patente correspondiente EP-A-0 381
501 (Kodak) describe una cubeta para realizar la amplificación y
detección de material de ácido nucleico en un entorno cerrado para
reducir el riesgo de contaminación. La cubeta es un dispositivo
cerrado que tiene compartimientos que están interconectados por una
serie de pasillos. Algunos de los compartimientos son
compartimientos de reacción para amplificar trenzas de ADN, y
algunos de los compartimientos son compartimientos de detección que
tienen un sitio de detección para detectar ADN amplificado. Se
pueden prever también compartimientos de almacenamiento para
conservar reactivos. Las muestras de materiales de ácidos nucleicos,
junto con reactivos de los departamentos de almacenamiento, son
cargadas en los compartimientos de reacción a través de los
pasillos. Los pasillos que conducen desde el compartimiento de
almacenamiento están provistos con válvulas de retención
unidireccionales para prevenir que productos amplificados refluyan
de retorno al compartimiento de almacenamiento. Las muestra es
amplificada en el compartimiento de reacción, y los productos
amplificados son transferidos a través de los pasillos de
interconexión hasta los sitios de detección en el compartimiento de
detección aplicando presión externa a las paredes flexibles del
compartimiento para aplastar el producto amplificado desde los
compartimientos de reacción a través de los pasillos y dentro de
los compartimientos de detección. De manera alternativa, la cubeta
puede estar provista con una disposición de pistón para bombear
reactivos y/o productos amplificados desde los compartimientos de
reacción hasta el compartimiento de detección.
Aunque la cubeta descrita en el documento EP 0
381 501 A2 (Kodak) proporciona un entorno de reacción y de
detección cerrado, tiene varios inconvenientes significativos. Por
ejemplo, los compartimientos múltiples, los pasillos múltiples, las
válvulas de retención y los mecanismos de bombeo presentan una
estructura relativamente complicada que requiere mucho esfuerzo de
fabricación. Además, la forma y la configuración de la cubeta
descrita en el documento EP 0 381 501 A2 no permiten una inserción
fácil en dispositivos de ciclo térmico convencionales. Además, los
métodos de transferencia de fluido utilizados por a cubeta requieren
una fuente de presión mecánica externa, tal como un dispositivo de
rodillo aplicado a paredes laterales flexibles o el desplazamiento
de pistones pequeños. Los dispositivos de ciclo térmico
convencionales no se adaptan fácilmente para incluir tales fuentes
de presión externa, y la presión mecánica aplicada a las paredes
flexibles puede romper estas paredes, especialmente si la cubeta
está desalineada. La rotura de la pared flexible de un
compartimiento externo que contiene el producto de reacción
amplificado conduciria a contaminación del interior del instrumento
y posiblemente de todo el laboratorio. Finalmente, el aparato
descrito en esta referencia es bastante limitado en términos de
rendimiento de los dispositivos descritos. El sistema no proporciona
la flexibilidad deseada para la fabricación.
La publicación de patente francesa N° FR 2 672
301 (a nombre de Larzul) describe un dispositivo de ensayo
herméticamente cerrado similar para amplificación de ADN. Tiene
también múltiples compartimientos y pasos a través de los cuales se
transfieren muestra y/o reactivos. Las fuerzas motrices para
transferir fluido se describen como desplazamiento hidráulico,
magnético, capilaridad pasiva, gradiente térmico, bomba peristáltica
y diferencial de presión inducida mecánicamente (por ejemplo,
aplastamiento).
Otros métodos aplicados en la técnica para
abordar las cuestiones de contaminación son de naturaleza química.
Un método de este tipo se describe en la patente de los Estados
Unidos 5.035.996 (Hartley, Life Techologies, Inc.). Implica
incorporar en el producto de amplificación una base de
ribonucleosido trifosfato (rNTP) o deoxiribonucleosido trifosfato
(dNTP) que no se encuentra generalmente en la muestra a analizar:
por ejemplo dUTP en el caso de análisis de ADN. El producto
amplificado tendrá, por lo tanto, una secuencia que tiene Uracilo en
posiciones múltiples. La enzima uracilo ADN glicosilasa (UDG) se
añade a muestras antes de la amplificación. Esto provocará la
digestión de cualquier producto de reacción contaminante (que
contiene uracilo) sin afectar al ADN natural en la muestra.
Este método trabajará para PCR, pero tiene
potencial limitado para LCR. Se puede aplicar a LCR de extremo sin
punta, y tiene un potencial muy limitado para LCR de intersticio. En
LCR de intersticio, no es práctico incorporar más que unas pocas
bases de uracilo para rellenar el intersticio. La acción de UDG será
solamente en un sitio, en oposición a un gran número de sitios en
amplificación PCR. Aunque este método ha sido comercializado por
Roche Diagnostics como una manera de in activación de ensayos de
amplificación de ADN Amplicor^{TM}, no se puede aplicar a una
variedad de reacciones de amplificación.
Otros métodos utilizados para reducir al mínimo
el riesgo de contaminación incluyen la destrucción del producto de
reacción amplificado así como de cualquier reactivo polinucleótido
después de la terminación de la reacción de detección. Tal método
ha sido descrito por Celebuski en la solicitud de patente de los
Estados Unidos publicada co-propietaria 07/863.662,
titulada "Methods for Inactivating Nucleotide Sequences and Metal
Chelotes for use Therein", presentada el 3 de Abril de 1992. El
método de inactivación utiliza un quelato metálico divalente, tal
como un completo de fenantrolina de cobre y una solución diluida de
peróxido de hidrógeno adicionado a los productos de reacción y
opcionalmente a todo el equipo. Esta composición es muy efectiva en
la disociación de todos los ADN en fragmentos pequeños que son
incapaces de amplificación. De acuerdo con ello, se utiliza después
de la detección de producto de amplificación en lugar de antes de la
amplificación.
Las medidas técnicas, tales como UDG y quelatos
metálicos son efectivas en la prevención de la contaminación menor,
pero son menos satisfactorias en el caso de contaminación mayor que
implica gotitas de producto de reacción. Por lo tanto, la necesidad
de realizar la reacción de amplificación en un sistema cerrado ha
sido realizara en la técnica, en documentos tales como EP 0 381 501
A2, EP 0 550 090 A1 y US 5.229.297. Estos documentos describen
desechables de reacción cerrados.
Adicionalmente, la publicación PCT WO
91(12342 (Cetus) describe composiciones de reacción PCR a
partir de las cuales se segregan varios componentes, que incluyen
magnesio. Por ejemplo, en una forma de reacción se separa magnesio
de otros componentes de la reacción por una capa oleosa o cerosa; en
otra forma de realización, el magnesio (como la sal de ácido graso
estearato) es un componente de la capa de barrera de cera. En
cualquier caso, los componentes segregados se combinan cuando la
mezcla de reacción se calienta para disociar el ácido nucleico o
para iniciar PCR, y la cera se funde. Sin embargo, este sistema no
conduce a automatización, especialmente donde se requiere el
pipetado automático. Después de la refrigeración para detección, la
cera puede congelarse y obstruir el orificio de una pipeta. La cera
interferirá también con sistemas de detección del nivel de líquido
que se emplean comúnmente en sistemas de detección automática. Por
estas razones, se desean composiciones y métodos mejorados para
combinar reactivos inicialmente segregados (por ejemplo,
magnesio).
Con estas limitaciones de la técnica anterior,
por lo tanto, un objeto importante de la invención es buscar
recipientes y métodos de reacción de amplificación de uso que
reduzcan al mínimo el riesgo de contaminación. Otro objeto es
proporcionar un recipiente de reacción deseable y un método, por el
que la muestra de reacción amplificada se puede eliminar sin
retirar una tapa de sellado; puesto que la retirada de la tapa
conduce a la dispersión de contaminación aerosol. Otro objeto de la
invención es proporcionar un recipiente de reacción desechable
sellado y un método, por el que se puede introducir una muestra de
reacción amplificada con mínima perturbación de la obturación del
recipiente.
Otro objeto de la invención es proporcionar una
formulación que es adecuada para la preparación de dosis unitarias
de recipientes de reacción, tal como se ha descrito aquí;
particularmente para recipientes de dosis unitarias que son
compatibles con instrumentación de detección automática utilizando
pipetas automáticas.
Todavía otro objeto de la invención es
proporcionar un recipiente de reacción que es compatible al mismo
tiempo con cicladotes térmicos comerciales, por ejemplo el
Perkin-Elmer 480, así como con instrumentación de
detección automática, tal como la que utiliza tecnología de
InmunoEnsayo de Enzima de Micropartículas (MEIA).
Éstos y otros objetivos se cumplen en la
presente invención, como se describe a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer aspecto, la invención se refiere a
un método para amplificar y detectar materiales de ácido nucleico,
que comprende las etapas de:
a. añadir una muestra sospechosa de contener un
material de ácido nucleico objetivo a un recipiente de amplificación
junto con reactivos marcados para amplificación de dicho ácido
nucleico objetivo sospechoso para formar una mezcla de
reacción;
b. sellar la mezcla de reacción dentro de dicho
recipiente cerrando una tapa herméticamente sellada que tiene una
membrana que es penetrable por una sonda de pipeta;
c. amplificar el material de ácido nucleico
objetivo dentro de dicho recipiente;
d. retirar una porción de la mezcla de reacción
desde dicho recipiente para detección; y
e. detectar la presencia de ácido nucleico
objetivo amplificado por detección de dichos reactivos marcados;
en el que dicha retirada se realiza perforando
dicha membrana de la tapa con una sonda de pipeta, aspirando dicha
porción de la mezcla de reacción en dicha pipeta y dispersando dicha
porción en un compartimiento de detección distinto sin destapar
dicho recipiente, evitando de esta manera que gotas o aerosoles del
material amplificado puedan contaminar el medio ambiente, muestras
no reaccionadas o reactivos.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de amplificación puede ser PCR o LCR u
otro proceso de amplificación.
El método comprende, además, con preferencia
inactivar todo el material de ácido nucleico dejado en el
recipiente y en el compartimiento de detección distribuyendo allí un
reactivo de inactivación de ácido nucleico desde una pipeta. La
inactivación puede incluir la adición consecutiva de un quelato de
fenantrolina de cobre y solución de peróxido de Hidrógeno.
Con preferencia, el recipiente de reacción es un
y tubo que tiene una tapa con una membrana con un espesor que varia
desde 0,002 hasta 0,015 pulgadas, más preferentemente desde 0,005
hasta 0,009 pulgadas.
La sonda de pipeta puede ser un tubo metálico
con un borde biselado o achaflanado, que tiene con preferencia un
diámetro exterior que no excede de 0,050 pulgadas.
Típicamente, el recipiente de amplificación
sellado se utiliza en un instrumento automático de sonda de pipeta
para detección automática, y dichas etapas de retirada y detección
se realizan ambas por el instrumento automático. Más
preferentemente, el método comprende, además, una etapa de
inactivación de todo el material de ácido nucleico dejado en el
recipiente y en el compartimiento de detección y dichas etapas de
retirada, de detección y de inactivación se realizan todas por el
instrumento automático de pipeta.
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
kits que contienen composiciones estables para reacciones de
amplificación PCR o LCR que omiten iones de magnesio desde la
composición, junto con una fuente auxiliar de magnesio. Las
composiciones se utilizan típicamente para rellenar recipientes de
reacción de dosis unitaria. Por lo tanto, una composición de
amplificación contiene todos los reactivos necesarios para
amplificación, excepto el cofactor de magnesio; y una segunda
composición de preparación de la muestra incluye magnesio. Por
ejemplo una composición para preparar recipientes de reacción de
dosis unitaria para amplificación por la reacción de la cadena de
polimerasa (PCR), que consta esencialmente de:
- \quad
- al menos una pareja de cebadores de oligonucleótido para amplificación por PCR de un ácido nucleico objetivo deseado, estando presente cada cebador por encima de 1,6 nM, con preferencia entre 1,6 nM y 160 nM;
- \quad
- un suministro de trifosfatos deoxinucleótido (dNTPs), presentes por encima de 1,0 \muM, con preferencia entre 1,0 \muM y 200 \muM;
- \quad
- un reactivo que tiene una actividad de polimerasa termoestable, con preferencia una enzima de polimerasa de un organismo de la especie Thermus;
\newpage
- \quad
- opcionalmente, detergentes y ácido nucleico portador inerte; y
- \quad
- una concentración de iones de Mg^{2+}, que es suficientemente baja, con preferencia inferior a 10^{-4} M, para desactivar de manera eficiente dicha actividad de polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra composición para preparar recipientes de
reacción de dosis unitarias para amplificación por reacción de la
cadena de ligasa (LCR) o reacción de la cadena de ligasa de
intersticio (GLCR), que consta dicha composición esencialmente
de:
- \quad
- al menos dos parejas de muestras de oligonucleótidos complementarios para amplificación por LCR o GLCR de un ácido nucleico objetivo deseado, estando presente cada muestra por encima de aproximadamente 1,6 nM, con preferencia entre 1,6 nM y 16 nM;
- \quad
- un reactivo que tiene una actividad ligasa termoestable, con preferencia una enzima ligasa de un organismo de la especie Thermus;
- \quad
- opcionalmente, un suministro de menos de todos los cuatro trifosfatos deoxinucleótidos (dNRPs), presentes por encima de 1,0 \muM y un reactivo que tiene una actividad polimerasa termoestable, con preferencia de una enzima polimerasa Thermus sp;
- \quad
- opcionalmente, detergentes y ácido nucleico portador inerte; y
- \quad
- una concentración de iones de Mg^{2+}, que es suficientemente baja, con preferencia inferior a 10^{-4} M, para desactivar de manera eficiente dicha actividad de polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Más preferentemente, la composición no incluye
dNTPs y un reactivo que tiene una actividad polimerasa termoestable
para realización de LCR de intersticio. En cualquier caso, el
suministro auxiliar de magnesio procede de una fuente desde el
exterior de la composición. Con preferencia, el magnesio se
encuentra en un diluyente de la muestra o tampón incluido en el kit
en concentración suficiente, de tal manera que la adición de n
volumen adecuado de muestra diluida proporciona el cofactor de
magnesio necesario en una concentración final que varía desde
aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 40 mM.
En aspectos finales, la invención se refiere a
dispositivos desechables sellables para uso en reacciones de
amplificación, como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Un dispositivo de recipiente de reacción para
realizar un ensayo de amplificación de ácido nucleico, que
comprende:
- \quad
- un tubo de material polimérico térmicamente estable que tiene un diámetro exterior dimensionado para ajustar dentro de un aparato de ciclo térmico, teniendo dicho tubo un orificio hacia un interior;
- \quad
- una tapa para sellar herméticamente el orificio del tubo, incluyendo dicha tapa una membrana que puede ser perforada de no más de 0,0015 pulgadas de espesor, de manera que la membrana permite el muestreo del producto de reacción amplificado a partir del tubo sellado con una pipeta automática sin abrir el tubo; y
- \quad
- una bisagra flexible que retiene la tapa en el tubo y permite plegar la tapa en el orificio.
\vskip1.000000\baselineskip
Con preferencia, el espesor de la membrana que
puede ser perforada está entre 0,002 y 0,015 pulgadas;
especialmente entre 0,005 y 0,009 pulgadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Un dispositivo de recipiente de reacción para
realizar un ensayo de amplificación de ácido nucleido, que
comprende:
- \quad
- un tubo de material polimérico térmicamente estable que tiene un diámetro exterior dimensionado para ajustar dentro de un aparato de ciclo térmico, teniendo dicho tubo un orificio hacia un interior;
- \quad
- una tapa para sellar herméticamente el orificio del tubo, incluyendo dicha tapa una membrana que puede ser perforada, de manera que la membrana permite el muestreo del producto de reacción amplificado a partir del tubo sellado con una pipeta automática sin abrir el tubo; y
- \quad
- una bisagra flexible que retiene la tapa en el tubo y permite plegar la tapa en el orificio, de manera que la bisagra comprende una bisagra replegable.
\vskip1.000000\baselineskip
Con preferencia, el espesor de la membrana que
puede ser perforada está entre 0,002 y 0,015 pulgadas;
especialmente entre 0,005 y 0,009 pulgadas.
El recipiente de reacción puede tener una
bisagra que define un radio máximo del tubo sellado y la distancia
desde el diámetro exterior del tubo hasta dicho radio máximo es
menor que aproximadamente 0,154 pulgadas. Opcionalmente, la
articulación replegada comprende, además, dos muescas cortadas en el
material de la bisagra y la relación g/h es aproximadamente 0,8
\pm 20%, donde g es la distancia entre las líneas centrales de
las dos muescas, con preferencia entre 2 y 2,5 mm, y h es la altura
total del conjunto de bisagra desde el punto de fijación al tubo
hasta la parte superior de la tapa medida cuando la tapa está en una
posición sellada.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 es una sección transversal
longitudinal de un recipiente de reacción deseable SlickSeal^{TM}
de la técnica anterior con la tapa articulada abierta.
La figura 2 es una sección transversal
longitudinal de un recipiente de reacción desechable de acuerdo con
la presente invención. Se muestra con la tapa articulada abierta y
la sección está tomada a lo largo de la línea a-a'
de la figura 3.
La figura 3 es una vista en planta superior del
recipiente de reacción de la figura 2.
La figura 4 es una vista en planta lateral del
recipiente de reacción de las figuras 2 y 3.
La figura 5 es una vista lateral parcial
compuesta de los recipientes de reacción de la figura 1 (parte
superior) y de la figura 2 (parte inferior), ambas mostradas con la
tapa articulada en la posición cerrada para ilustrar la estructura
de la bisagra.
La figura 6 es una vista en planta lateral del
recipiente de reacción de la figura 2, parcialmente cortada en la
sección transversal para claridad y que muestra la tapa articulada
en una posición parcialmente cerrada.
La figura 7 es una vista en perspectiva superior
de un soporte de recipiente de reacción adaptado para retener el
recipiente de reacción de la figura 2 para uso en un aparato de
detección automático.
La figura 8 es un grafo del resultado del
ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención es un recipiente de reacción
desechable para realizar ensayo de amplificación de ácido nucleico.
El recipiente de reacción desechable tiene una tapa penetrable, que
puede ser penetradas por una pipeta automática para aspirar una
porción de un producto de reacción amplificado. El recipiente de
reacción desechable contiene los reactivos necesarios para realizar
un ensayo de amplificación de ácido nucleico, tal como una Reacción
de la Cadena de Ligasa (LCR) o una Reacción de la Cadena de
Polimerasa (PCR). Una muestra de un paciente es añadida a los
reactivos de dosis unitaria en el recipiente de reacción desechable
y se cierra la tapa que puede ser perforada. El recipiente de
reacción desechable que contiene la mezcla de reacción y la muestra
es sometida a amplificación, típicamente colocándolo en un ciclador
térmico. Después de la amplificación, el recipiente de reacción
desechable intacto es transferido a un analizador automático, donde
una pipeta automática penetra la membrana de cierre y aspira una
porción de la muestra amplificada para procesamiento posterior, sin
retirar la tapa del recipiente de reacción. Esto evita la generación
de aerosoles o gotitas potencialmente contaminantes.
Una "reacción de amplificación" es una
reacción, en la que se generan múltiples copias de una secuencia de
ácido nucleico original, típicamente repitiendo un proceso de
duplicación enzimático para un número de ciclos. Cuando se pueden
realizar copias adicionales desde cada una de las copias duplicadas
realizadas en un ciclo anterior, se dice que el proceso de
amplificación es exponencial con respecto al número de ciclos.
Aunque la amplificación exponencial es deseable para mejorar la
sensibilidad del ensayo, este grado elevado de sensibilidad es
también un inconveniente si los productos de la amplificación no
están retenidos cuidadosamente, resultando problemas de
contaminación y en los antecedentes se han mencionado
específicamente varios métodos de amplificación.
Algunas reacciones de amplificación, por ejemplo
PCR y LCR, implican ciclos de altas y bajas temperaturas
alternativas, un proceso conocido como "ciclo térmico" PCR o
"Reacción de la Cadena de Polimerasa" es una reacción de
amplificación en la que una enzima de polimerasa, habitualmente
termoestable, genera múltiples copias de la secuencia original por
extensión de un cebador que utiliza el ácido nucleico original como
una plantilla. PCR se describe con más detalle en las patentes de
los Estados Unidos N° 4.683.202 y 4.683.195. LCR o "Reacción de
la Cadena de Ligasa" es una reacción de amplificación de ácido
nucleico, en la que una enzima de ligasa, habitualmente
termoestable, genera múltiples copias de la secuencia original
ligando dos o más muestras de oligonucleótidos, al mismo tiempo que
son hibridizadas con el objetivo. LCR, y su variación, LCR de
intersticio, se describen con más detalle en la patente
EP-A-320308 (Backman y col.),
EP-A-439.182 (Backman y col.) y WO
93/100447 (Birkenmeyer y col.) y en otros lugares.
"Ciclador térmico" es un dispositivo
utilizado para calentar, enfriar y/o retener una mezcla de reacción
de amplificación de ácido nucleico entre y a una temperatura
ajustaba durante un periodo de tiempo establecido.
"Dosis unitaria" se refiere a sistemas, en
los que un recipiente de reacción individual contiene todos o casi
todos los reactivos necesarios para realizar una reacción, a
excepción de la muestra propiamente dicha. Generalmente, el usuario
solamente tiene que añadir la muestra e iniciar la reacción.
Típicamente, los recipientes de reacción de dosis unitarias son
desechables, y se desechan después de un solo uso.
El recipiente de reacción 10 de la presente
invención se muestra en las figuras 2 a . El recipiente de reacción
10 es referido de manera alternativa aquí como un "tubo", un
"desechable", y un "recipiente", cuyos términos se
utilizan de forma intercambiable. Puesto que muchas porciones del
tubo de la técnica anterior son similares, se describen utilizando
el mismo número de referencia añadiendo una "a"; por ejemplo,
el tubo de la técnica anterior de la figura 1 se designa con
10a.
El recipiente incluye un barril longitudinal que
comprende una porción inferior 12 estrechada cónicamente que tiene
un extremo cerrado 13, y una porción cilíndrica 14. El cono y la
longitud de la porción cónica 12 están adaptados para ajustar en un
bloque calefactor de ciclador térmico comercial (no mostrado). Por
ejemplo, el cono tiene 9° desde la línea central; la altura de la
porción cónica 12 tiene aproximadamente 13 mm y el diámetro del
punto más ancho de la porción cónica 12 tiene aproximadamente 7 mm.
Estas dimensiones no son críticas de ninguna manera para el
funcionamiento del dispositivo. Simplemente facilitan un ajuste
estrecho en un ciclador térmico comercial, tal como el Perkin Elmer
480. Un buen ajuste en el ciclador térmico y en las paredes finas
del tubo favorecen la transferencia más eficiente de la energía
térmica entre el bloque calefactor y la mezcla de reacción.
Generalmente, las paredes del tubo tienen menos de aproximadamente
0,040 pulgadas, con preferencia menor de aproximadamente 0,030
pulgadas. La forma de realización particular descrita aquí
reivindica paredes de 0,024 \pm 0,004 pulgadas.
El barril del recipiente comprende también una
porción cilíndrica 14 unida con la porción cónica. La porción
cilíndrica tiene el mismo diámetro exterior que la parte más ancha
de la porción cónica, a saber, aproximadamente 7 mm en la forma de
realización preferida. La longitud de la porción cilíndrica no es
crucial y está regida por el volumen necesario en el interior del
recipiente, por la altura y el tipo de mecanismo de tapa, y por el
hecho de si se utiliza o no algún tipo de caperuza sobre el ciclador
térmico. La longitud general puede oscilar entre aproximadamente 5
hasta 30 mm, con preferencia entre 10 y 20 mm. En la forma de
realización preferida, la porción cilíndrica 14 tiene
aproximadamente 17 mm de largo para permitir la fijación de una
etiqueta, tal como una etiqueta de código de barras, al barril del
recipiente.
El extremo superior de la porción cilíndrica 14
se ensancha radialmente hacia fuera para definir una abertura 16.
La porción cónica 12 y la porción cilíndrica 14 definen juntas un
interior 15, en el que la muestra de reacción y los reactivos
pueden estar colocados. La abertura 16 incluye un borde redondeado
18 para facilitar el sellado hermético con la tapa 20.
La tapa 20 incluye un medio de lengüeta 22 para
facilitar la apertura y el cierre de la tapa. La tapa incluye,
además, un miembro de sellado 24 generalmente cilíndrico que tiene
una circunferencia exterior 26 adaptada para ajustar herméticamente
en la abertura 16 y para crear un sellado efectivo contra el borde
redondeado 18 o la pared interior justo debajo del borde
redondeado. Por esta razón, el miembro de sellado 24 puede ser
ligeramente cónico, como se muestra mejor en las figuras 2 a 4 para
tener una circunferencia exterior mayor 26 en el extremo más
alejado del cuerpo de la tapa 20.
Cerrando un extremo del miembro de sellado
cilíndrico 24 se encuentra una cubierta superior. En la figura 2,
ésta se muestra como la membrana fina 28; aunque en la figura 1 la
cubierta de la técnica anterior se muestra como 29, puesto que
difiere significativamente de la membrana 28 de la invención. La
finalidad de la cubierta 29 del tubo de la técnica anterior es
simplemente cerrar la cámara para prevenir la fuga de su contenido.
Por lo tanto, está moldeada del mismo material y tiene
aproximadamente el mismo espesor que el resto de las paredes del
tubo 10a. En contraste, la membrana 28 del recipiente 10 de acuerdo
con la invención es significativamente más fina, de manera que
puede ser perforada por una sonda de instrumento, como se describe
en conexión con los métodos descritos a continuación.
Aunque la cubierta preferida 28 tiene 0,005
\pm 0,001 pulgada (0,125 \pm 0,025 mm) de espesor, el espesor
puede variar desde 0,002 hasta 0,015 pulgadas (0,05 hasta 0,375 mm),
con preferencia entre 0, 002 y 0,01 pulgada (0,05 hasta 0,25 mm) y
más preferentemente entre 0,005 y 0,009 pulgadas (0,125 y 0,225
mm). En esencia, la membrana 28 debe ser suficientemente robusta
para no desgarrarse o romperse durante la manipulación normal, pero
no tan robusta que resista la perforación por la sonde del
instrumento. Por lo tanto, la resistencia/espesor máximos están
regidos por la resistencia a la tracción de la composición de la
membrana, la geometría de soporte de la membrana, y la resistencia
y la fuerza de empuje hacia debajo de la sonda de instrumento
particular. Estos criterios dependen en gran medida de la
composición del tubo y del sistema de instrumento en uso. El
espesor preferido actualmente fue seleccionado para resina Himont
PD701 (Himont USA, Inc. Wilmington, DE) sujeto a no más de 900
gramos de fuerza por una sonda de acero inoxidable de 0,040 pulgadas
de diámetro con una punta cónica de 45 grados en un instrumento
IMx® modificado (ver la sección 4 siguiente). La evaluación y
optimización de estos parámetros con otras composiciones o en otros
sistemas de instrumentos son fáciles dentro de la capacidad de un
técnico ordinario en la material.
Una bisagra, mostrada generalmente como 30 en la
figura 2 y 31 en la figura 1, retiene la tapa 20 en el barril del
recipiente a través de un istmo flexible fino. La bisagra 30, 31
mantiene la tapa 20 accesible, pero tiene suficiente flexibilidad
para permitir el plegamiento de la bisagra hacia atrás sobre sí
misma para permitir la inserción del miembro de sellado cilíndrico
2 6 en la abertura 16 del tubo. Se comprenderá inmediatamente que
una junta hermética entre la circunferencia exterior 26 y la
abertura del tubo 16 requiere tolerancias estrechamente adaptadas
entre estas partes, y que cualquier bisagra de este tipo tiene una
tendencia a la flexión para desalojar la tapa fuera de la abertura
del tubo. Dado el ajuste cerrado de estas partes, será evidente
también que se producirá la inserción más fácil de la tapa cuando
los lados del sello cilíndrico 24 están aproximadamente paralelos a
las paredes de la porción longitudinal 14 o, en otras palabras,
cuando el "ángulo de ataque" \theta (ver la figura 6) es
aproximadamente cero. Por lo tanto, existe un compromiso de
consideraciones en la construcción de la bisagra. Por una parte, es
deseable reducir al mínimo el material de la bisagra y mantener el
cuerpo de la tapa 20 cerrado en el barril del tubo 14, pero esto
provoca que el miembro de sellado de la tapa 24 entre en la
abertura 16 en un ángulo severo y no óptimo de ataque \theta,
como se muestra en la figura 6. Por otra parte, la optimización del
ángulo de ataque requiere que se utilice una sección de bisagra
mucho más larga, derrochando de esta manera material e incrementando
la magnitud del radio máximo efectivo del recipiente de
reacción.
La presente invención soluciona estos problemas
de compromiso proporcionando una bisagra "replegable" 30
nueva, que difiere significativamente de la bisagra 31 de la técnica
anterior. Una bisagra "replegable" se caracteriza por la
presencia de dos o más lugares de pliegue o "esquinas", la suma
de los ángulos de estos pliegues es aproximadamente 180 grados,
puesto que éste es el arco a través del cual debe plegarse la tapa
hacia atrás con el fin de sellar el tubo. La bisagra 30 incluye una
extensión 32 de la porción ensanchada de la porción longitudinal 14
y una extensión 34 del cuerpo de la tapa 20. Las dos extensiones 32
y 34 están separadas por muescas 36 y 38, respectivamente, desde un
borde de espina central 35. Las dos muescas están espaciadas una
distancia g una de la otra (ver las figuras 2 y 3). Como se muestra
mejor en la figura 5, la construcción replegada permite dos (o más)
puntos de flexión en las muescas 36, 38 y facilita un ángulo de
ataque más favorable, reduciendo realmente al mismo tiempo el radio
general efectivo en la cantidad d en la figura 5. En las formas de
realización reales, a partir de las cuales se ha generado la figura
5, d es aproximadamente 0,02 pulgadas.
La distancia x representa la cantidad máxima en
la que la bisagra se extiende más allá del lado exterior de la
porción de barril 14 cuando la tapa está en la posición cerrada. Se
supone que la lengüeta de la tapa 22 no se extiende más que la
bisagra 30, de manera que la bisagra representa el radio general
máximo. En la forma de realización preferida de la invención, x es
menor o igual que aproximadamente 0,154 pulgadas, con preferencia
aproximadamente 0,149 pulgadas. La distancia r es otra medida del
radio general efectivo, pero r variará con el diámetro de la
porción cilíndrica 14.
La distancia h es la altura total del conjunto
de bisagra con la tapa cerrada, incluyendo el cuerpo de tapa 20 y
la pestaña vuelta hacia fuera de la porción cilíndrica 14, donde la
bisagra se une al tubo. Tiene típicamente aproximadamente la misma
altura que la región de la espina 35. La distancia h se refiere
también a la distancia g entre las dos muescas 36 y 38. En el
recipiente preferido mostrado, h tiene aproximadamente 0,103
pulgadas; y la distancia g tiene aproximadamente 0,087 pulgadas. Por
lo tanto, la relación g/h de la presente forma de realización es
0,84, pero puede variar en más del 20%, con preferencia no más del
10% desde una relación de 0,8. Como se ve en la figura 5, cuando
las extensiones 32 y 34 son aproximadamente iguales, la espina 35
está sustancialmente perpendicular a las extensiones y paralela al
eje longitudinal del barril del tubo, definiendo cada punto de
flexión o "esquina" aproximadamente un ángulo de 90 grados.
Las relaciones de g/h que son mucho mayores que
aproximadamente 0,8 tienden a corresponder con diferencias en
longitud de las extensiones 32 y 34 para producir un ángulo agudo y
un ángulo obtuso en las "esquinas". Esto tiende también a
producir espinas anguladas 35.
El recipiente desechable 10 de esta invención
está fabricado de un material polimérico que es inerte con respecto
a la interacción con componentes de la mezcla de reacción o los
productos de la reacción de amplificación. El material debería ser
algo flexible para permitir la operación de articulación y la
penetración de la membrana 28 por la sonda y con preferencia apto
para tratar en autoclave. Un polímero preferido es polipropileno, a
partir del cual se puede moldear todo el dispositivo, incluyendo la
membrana 28. Muchos grados de polipropileno están disponibles en el
comercio. Una resina del tipo Himont PD701 natural (Himont USA,
Inc., Wilmington, DE). Todo el dispositivo puede ser moldeado por
inyección, aunque se puede requerir presiones de inyección altas
y/o una técnica conocida como "acuñamiento" para conseguir un
relleno uniforme de la cavidad en la zona de la membrana fina
28.
Se pueden emplear compuestos de liberación del
molde, tales como aceite de silicona o aceite mineral, pero es
importante evitar compuestos de liberación del molde que contienen
iones divalentes, tales como estearato o palmitato de magnesio o de
cinc, donde tales iones afectan a las actividades de las enzimas
utilizadas en el proceso de amplificación.
Los recipientes de reacción descritos
anteriormente son útiles en reacciones de amplificación,
particularmente reacciones de amplificación de ciclo térmico, donde
se crea una gran cantidad de ácido nucleico potencialmente
contaminante. Un método preferido de esta invención es el uso con
reacciones LCR, y esto se describirá en detalle aquí, pero debería
comprenderse que los métodos son igualmente útiles con otros métodos
de amplificación.
De acuerdo con el método referido, los tubos de
reacción son colocados en primer lugar en un instrumento de
amplificación, tal como un ciclador térmico, y se incuban a (una)
temperatura(s) apropiadas durante un tiempo predeterminado.
LCR utiliza un conjunto de cuatro muestras en dos parejas
complementarias, estando colocadas las parejas sustancialmente
adyacentes una a la otra cuando se hibridizan con el objetivo. Una
enzima ligasa, con preferencia termoestable, se une covalentemente
a las muestras adyacentes. Después de la separación, las muestras
unidas sirven como plastilla u objetivo para las muestras
complementarias de un ciclo siguiente. Las temperaturas de
desnaturalización típicas varían desde 75 hasta 90°C y las
temperaturas de recocido típicas varían desde 50 hasta 65°C, en
función de las características de fundición de la muestra, como se
conoce en la técnica.
En una variación particularmente preferida, se
proporciona un kit que tiene tubos desechables de "dosis
unitaria", lo que significa que contienen cantidades adecuadas
previamente medidas de los cebadores o muestras, tampones y ligasa
u otras enzimas. Típicamente sólo la muestra del paciente tiene que
ser añadida al tubo de reacción. No obstante, en una variación, se
ha encontrado que la omisión de iones de metales divalentes,
especialmente Mg^{2+} desde la composición de dosis unitaria puede
prolongar la estabilidad y reducir la incidencia de eventos de
ligación de fondo independientes del objetivo. Un tubo de dosis
unitaria típica contiene aproximadamente 100 \muL de mezcla de
reacción LCR o PCR. Para PCR, ésta comprende una mezcla de cebadores
para flanquear la secuencia objetivo a ampliar (con preferencia al
menos un cebador está marcado para detección), deoxinucleótido
trifosfatos (dNTPs), polimerasa termoestable, ADN de no
interferencia, tal como ADN de esperma se salmón, detergentes y
tampón. Para LCR, la composición comprende típicamente muestras de
LCR que son específicas para la secuencia objetivo a detectar,
ligasa termoestable, ADN de no interferencia, tal como ADN de
esperma de salmón, detergentes y tampón. En el caso de LCR de
intersticio, específicamente dNTPs y polimerasa termoestable están
presentes también en PCR, LCR y GLCR, sin embargo es preferible
omitir el cofactor de iones de Mg^{2+}, que se puede añadir
entonces desde una solución auxiliar suministrada también en el kit.
La concentración de iones de Mg^{2+} en la formulación de dosis
unitaria debería ser cero o al menos suficientemente baja para que
sea insuficiente para permitir la actividad de la enzima. Una
concentración de 10^{-4} M o menor es generalmente suficiente
para inhibir la actividad de la enzima.
Los tubos de reactivo de dosis unitarias se
almacenan cerrados en sus cajas por debajo de temperatura ambiente,
con preferencia a 2-8°C o congelados, pero se dejan
que se equilibren a temperatura ambiente antes del uso. El tubo de
dosis unitaria se abre y se añaden 100 \muL de muestra pretratada
al mismo (para un volumen de reacción total de 200 \muL). En esta
forma de realización, el ion de Mg^{2+} está presente en el
tampón de dilución de la muestra. En uso, la muestra se mezcla en el
tampón o diluyente que contiene una cantidad adecuada de magnesio.
Cuando se extrae la muestra (por ejemplo, 100 \muL) y se añade a
la dosis unitaria de amplificación, se añade también magnesio. La
concentración de magnesio en el tampón de tratamiento de la muestra
depende del volumen de la muestra a añadir al mismo, y del volumen
que se puede extraer. Como una alternativa, y cuando debe añadirse
magnesio a reacciones de control que no recibirán tampón de muestra,
se puede añadir el magnesio (u otro cofactor omitido de la dosis
unitaria) a la solución de reacción desde una solución auxiliar de
iones de magnesio. En general, la cantidad añadida debería ser
suficiente para proporcionar actividad enzimática óptima;
aproximadamente 30 mM en las reacciones LCR
actuales.
actuales.
Las muestras biológicas a ensayar por estos
métodos incluyen tampones endocervicales, tampones uretrales,
orina, sangre, frotis, piel y extractos capilares y similares.
Entonces se cierra el tubo y se transfiere a un
aparato de ciclo térmico, tal como el ciclador de ácido nucleico
Perkin-Elmer 480, donde tiene lugar la reacción de
amplificación. Un método y sistema para transportar los tubos desde
una estación de trabajo hasta el ciclador térmico (y de retorno de
nuevo) se describe en la solicitud de los estados Unidos
co-propietaria N° de serie 08/141.243, presentada el
22 de Octubre de 1993, titulada Tube Transport System and Method of
Use (expediente 5453 US 01), ahora abandonada.
Después de la amplificación, los tubos son
transferidos a un aparato de detección, con preferencia automático.
Un método preferido de detección es el uso de inmuno ensayos de
enzimas de captura de micropartículas (MEIA) para la detección
automática de los productos de amplificación. MEIA se describe por
Fiore y col. Clin. Chem. 34(9): 1726-1732
(1988) y en la patente EP-A-288 793,
y un analizador clínico comercial que utiliza este método es el
instrumento IMx®, comercializado por Abbott Laboratories (Abbott
Park, IL). Para detección MEIA de productos de amplificación, ambos
haptenos de captura (hapteno 1) y haptenos de detección (hapteno 2)
deben asociarse (por ejemplo, fijarse covalentemente) a cada
producto de amplificación. La incorporación de haptenos en
productos de reacción LCR o PCR se conoce en la técnica, por
ejemplo, a partir de las patentes
EP-A-0 357 011 y
EP-A-0 439 182. Brevemente, el
método emplear cebadores (en una reacción PCR) que tienen parejas
de miembros reactivos unidos a ellos. Las parejas de miembros
reactivos se pueden fijar a una base sólida y/o se pueden detectar
por conjugados marcados. Las parejas reactivas fueron seleccionadas
a partir del grupo de hapteno y anticuerpo, biotina y avidina,
enzima y receptor de enzima, carbohidrato y lecitina, y parejas de
trenzas de ADN complementarias.
Se conocen muchos haptenos diferentes, y
virtualmente se puede utilizar cualquier hapteno con la presente
invención. Se conocen muchos métodos de adición de haptenos a
muestras en la literatura. Enzo Biochemical (Nueva York) y Clontech
(Palo Alto) ambos han descrito y comercializado técnicas de
marcación de muestras. Por ejemplo, se puede fijar una amina
primaria a un extremo 3' oligo utilizando
3'-amina-ON CPG^{TM}. De una
manera similar, se puede fijar una amina primaria a un extremo 5'
oligo utilizando Aminomodifier II® (clontech). Las aminas pueden
reaccionar con varios haptenos utilizando químicas de activación y
de enlace convencionales. De manera alterativa, se prepara un
reactivo fosforamidita marcado y se utiliza para añadir la marca al
oligonucleótido en cualquier posición durante su síntesis. Por
ejemplo, ver Thuong, N. T. y col. Tet. Letters, 29(46):
5905-5908 (1988); o Cohen, J. S. y col., solicitud
de patente de los Estados Unidos 07/246.688 (NTIS ORDER N°
PAT-APPL-7-2 4 6.68
8) (1989).
Algunos haptenos ilustrativos incluyen muchas
drogas (por ejemplo, digoxina, teofilina, fenciclidina (PCP),
salicilato, etc.), T3, biotina, fluoresceína (FITC), dansilo,
2,4-dinitrofenol (DNP) ; y nucleótidos modificados
tales como bromouracilo y bases modificadas por la incorporación de
un grupo
N-acetil-2-fluorenilamino
(AIF); así como muchos otros. Ciertos haptenos descritos aquí se
describen las solicitudes de patentes publicadas
co-propietarias U. S. 07/88.508 (ácidos
adamantanoacéticos), U. S. 07/808.839 (carbazoles dibenzofuranos),
ambas presentadas el 19 de Diciembre de 1991; U. S. 07/858.929
(cridinas), y U. S. 07/858.820 (quinolinas), ambas presentadas el 27
de Marzo de 1992 (referidas colectivamente aquí como las
"solicitudes de haptenos").
El recipiente de dosis unitaria cerrado que
contiene el producto amplificado de la reacción de amplificación
LCR (o PCR u otra) es transferido a un soporte en forma de cuña de
un analizador IMx® modificado. La cuña y las modificaciones al
analizador IMx se describen a continuación.
Dentro del instrumento, una muestra de taladro
hueco sobre un brazo robótico es guiada por un microprocesador y
software adecuado en posición por encima del recipiente de reacción
y la muestra es bajada al recipiente por la rotura de la membrana
28. La ausencia de cera o grasa permite la detección exacta del
nivel del líquido. Después de alcanzar el fluido de muestra, la
sonda aspira un volumen predeterminado de mezcla de reacción
amplificada y la transfiere automáticamente a un pocillo de
incubación asociado, donde es incubada con una fase de captura MEIA
que comprende micropartículas revestidas con anticuerpo de
anti-hapteno 1. La transferencia del producto de
reacción desde el tubo de amplificación hasta el pocillo de
incubación se realiza sin abrir el tubo y sin el derrame potencial
de la mezcla de reacción o la formación de aerosoles. Esto reduce, a
su vez, considerablemente al potencial de contaminación de muestras
no reaccionadas son el producto de amplificación amplificable.
Adicionalmente, la sonda no es obstruida por cera formada a partir
de la mezcla de reacción.
La muestra se mueve hasta una estación de lavado
para clararla antes de que sea penetrado otro recipiente de
reacción, y este procedimiento continúa hasta que todos los tubos de
reacción han sido muestreados y están incubando. Este procedimiento
de lavado evita transportar la contaminación desde una muestra a la
siguiente. Después de la incubación, una porción de la suspensión
de micropartículas es aspirada por la sonda y depositada sobre la
matriz de fibra de vidrio de una célula de detección asociada, donde
las partículas son separadas del resto de la solución y retenidas
sobre la matriz. Las partículas capturadas son lavadas y se añade un
conjugado de marca de enzima (fosfatasa alcalina acoplada a un
anti-hapteno 2) y es incubado como es práctica
habitual en un ensayo IMx®. El complejo de micropartículas de
captura/producto amplificado/conjugado incubado capturado sobre la
matriz es lavado y luego se añade un sustrato a la marca de enzima
del conjugado. La presencia del analito ADN es detectada a partir
de la medición de la tasa de generación de una señal de
fluorescencia a partir de la conversión del sustrato
4-metil umbeliferil fosfato en la
4-metil umbeliferona fluorescente. La "tasa"
de conversión de sustrato es expresada en recuentos/segundo/segundo
(c/s/s) y es típico un fondo de "ruido de máquina" de
8-12 c/s/s.
Después de terminada la detección, la sonda
distribuye con preferencia un reactivo de inactivación química a
todas las zonas del pocillo de incubación, de la célula de detección
y del tubo de reacción. Esto destruye químicamente todo ADN
presente para eliminar la contaminación inadvertida de futuras
muestras o reactivos. Una composición de inactivación química de
fenantrolina de cobre adecuada se describe en la solicitud de
patente de los Estados Unidos publicada
c-propietaria 07/863.662, titulada "Methods for
Inactivating Nucleotide Sequences and Metal Chelates for uso
Therein", presentada el 3 de Abril de 1992.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la invención se refiere al
soporte de recipiente 60 del tubo de reacción, que se puede
fabricar de cualquier material de plástico adecuado que tenga
suficiente rigidez para soportar las estructuras con estabilidad
dimensional. Ejemplos de plásticos son policarbonatos y
poliestirenos, tales como ABS o
estireno-acrilonitrilo (SAN). El soporte se
representa en la figura 7. Contiene una base 62 sustancialmente
plana que es más ancha en un borde 64 que en el otro borde 66. esto
produce una forma trapezoidal o de cuña adaptada de tal manera que
varios de ellos (20-40) ajustarán en sectores de un
carrusel circular (no mostrado). La base incluye una lengüeta 68
moldeada en el borde radialmente interno para facilitar el
agarre.
En la base 62 están moldeadas tres estructuras.
La forma precisa de ninguna de estas estructuras es crítica;
solamente tienen que tener un volumen suficiente para la finalidad
indicada a continuación y deben estar configuradas para no
interferir con el asiento de la cuña en el carrusel. La primera
estructura está adyacente a la lengüeta 68 y es un pocillo 70,
rectangular en la forma de realización mostrada. El pocillo 70
tiene un fondo cerrado y está adaptado para retener e incubar una
mezcla de reacción. La estructura siguiente es una abertura 72
cerca del centro de la cuña. Está reforzada con preferencia con
paredes laterales 74 que se extienden hacia abajo, cilíndricas en
este caso. La abertura 72 está adaptada para recibir el recipiente
de reacción descrito anteriormente. El área de la abertura debería
corresponder y ser solamente ligeramente mayor que el área de la
sección transversal del recipiente de reacción, para que el
recipiente de reacción no se mueve alrededor significativamente en
el soporte.
La tercera estructura es una célula o
compartimiento de detección 76. La célula de detección es
virtualmente idéntica a la célula de detección del instrumento
comercial IMx®. Incluye una estructura 78 similar a un canal
acodado para retener el depósito inicial de una muestra de reacción;
una matriz de reacción 80 típicamente de fibra de vidrio, en el
fondo del canal; y un miembro absorbente 82 dispuesto debajo de la
matriz de reacción (se muestra el interior de la célula 76 a través
de una vista parcialmente en sección en la figura 7). Como en el
instrumento IMx®, la célula de detección 76 colecciona las
micropartículas de captura en la matriz de fibra de vidrio 80 y
permite el paso de reactivos líquidos y soluciones de lavado a
través de la matriz 80 en el miembro absorbente 82.
El soporte 60 puede incluir también medios para
fijar y retener el soporte en un carrusel, así como cinta de
refuerzo entre las estructuras 70, 74 y 76 que se extienden hacia
abajo.
El soporte del recipiente 60 modificado difiere
de la cuña IMx® de la técnica anterior debido a la abertura 72
adaptada para recibir el tubo de reacción. La cuña IMx® incluye uno
o más pocillos de muestra adicionales en esta localización en lugar
de la abertura, y no está adaptada para recibir estructuras o
componentes físicos adicionales.
Se comprenderá en el caso de un tubo de reacción
cilíndrico 10 y de la abertura redonda 72 correspondiente que el
tubo de reacción puede girar en la base 62. Puesto que uno u otro de
los medios de lengüeta de la tapa 22 y la bisagra 30 define
típicamente un punto de radio máximo, es preferible asegurar que el
arco formado por estos puntos (mostrados con línea de puntos en 84
en la figura 7) define una trayectoria clara, de manera que el tubo
puede girar libremente en la abertura.
\vskip1.000000\baselineskip
Las modificaciones de hardware realizadas en el
instrumento IMx® comercial incluyen lo siguiente. Las
modificaciones de software implicaron algunos cambios, pero son
fácilmente optimizadas por los técnicos en la material y no se
describen aquí. Un instrumento modificado de esta manera se refiere
aquí como un instrumento LCx^{TM}.
- 1)
- El mecanismo de pipeta automática fue reforzado para permitir la penetración de la junta de membrana 28 sobre el tubo de amplificación 10 desechable sin dañar la muestra. Estos cambios fueron: refuerzo de las barras de guía, adición de una barra de guía y una barra transversal superior.
- 2)
- Una sonda de pipeta de punta individual, de aproximadamente 0,040 pulgadas de diámetro, fabricada de acero inoxidable y biselada en un ángulo de 45 grados para facilitar la penetración de la junta de membrana 28, sustituyó a la pipeta estándar y al electrodo de IMx.
- 3)
- Utilización de una sonda de punta individual requería el abandono del aparato de detección del nivel de líquido de modo de conducción. Se adoptó el mecanismo de selección de nivel de capacidad, que requiere que la sonda de pipeta actúe como un transmisor y que las placas de recepción estén posicionadas debajo del paquete de reactivo y del carrusel. Tales disposiciones de detección del nivel de capacidad se conocen en la técnica.
- 4)
- La estación de lavado de la sonda se realizó más profunda para permitir mayor lavado de la punta de la sonda. Puesto que la sonda penetra en la junta de membrana 28, era posible la acumulación de contaminación por encima de la punta de la sonda desde el lado inferior de la membrana.
- 5)
- Se añadió un mecanismo de retención del tubo para retener el tubo 10 asentado en el soporte 60 a medida que la punta de la sonda es extraída desde el recipiente. El dispositivo de retención comprende un pedestal giratorio desde el que un brazo saliente puede oscilar en posición sobre el tubo de reacción en la posición en la que la sonda es extraída. El brazo saliente incluye una ranura o una abertura a través de la cual pasa la sonda, así como una porción de deflector que contacta con la tapa del tubo 20 para mantener el tubo en posición en el soporte 60.
- 6)
- La botella de tampón de diluyente FPIA es sustituida por una botella que contiene diluyente de inactivación (solución de peróxido de hidrógeno al 5%) y el software está alterado para permitir el acceso tanto al diluyente MEIA estándar como también al diluyente de inactivación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un molde de inyección para moldear
tubos como se muestra en las figuras 2 a 4. la resina utilizada era
Himont PD701 natural (Himont USA, Inc.), Wilmington, DE) sin ningún
aditivo o compuestos de liberación del molde. Durante el moldeo, el
área de la membrana se estampó para conseguir mayor uniformidad en
el espesor en la membrana penetrable, que fue controlada para 0,005
\pm 0,001 pulgada. Los tubos fueron esterilizados mediante
tratamiento en autoclave para evitar la posible contaminación de
nucleasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se modificó un instrumento IMx® como se ha
descrito en la sección 4 anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Tubos de reacción de acuerdo con el ejemplo 1
fueron rellenos utilizando una pipeta múltiple o una pipeta de
repetición para distribuir 100 \muL de un reactivo maestro dentro
de cada tubo, de tal manera que cada tubo de reactivo de dosis
unitaria contenía los siguientes componentes 2n 2X CR tampón (100 mM
EPPS, 40 mM K* de KOH y KCI], 200 \muM NAD):
- \bullet
- un conjunto de 4 muestras LCR específicas para las posiciones 6917-6964 del plásmido críptico Chamydia trachomatis. Estas muestras se describen en detalle en la solicitud publicada de los Estados Unidos N° de serie 08/116.389, presentada el 3 de Septiembre de 1993 (expediente 5372 US 01), estando presente cada muestra en 1,2 x 1012 moléculas/100 \muL;
- \bullet
- 1 \mug de albúmina de suero bovino acetilado(BSA), 1,0 mM EDTA, y 0,04% en peso de azidas sódicas;
- \bullet
- 3,4 \muM dTTP y 3,4 \muM dCTP (nucleótidos de relleno del intersticio);
- \bullet
- 2 unidades de polimerasa Thermus flavus ADN; y
- \bullet
- 1,800 unidades de ligasa Thermus thermophilus ADN.
No estaba presente ningún ion de Mg^{2+} (o
Mn^{2+}) en los tubos de dosis unitaria. La tapas de los tubos se
cerraron y los tubos se almacenaron a 8°C hasta el uso.
\vskip1.000000\baselineskip
100 \muL de un calibrado Chamydia
trachomalis o una dilución 1:2 del calibrador fueron pipetados
en cada uno de los varios tubos de dosis unitaria preparados de
acuerdo con el Ejemplo 3. La cantidad de Clamydia AND en el
calibrador se estima por curvas estándar que son equivalentes a 2,0
unidades de formación de inclusión por 100 \muL; el control
negativo fue 150 ng AND de esperma de salmón. Se añadió MgCl_{2}
como un reactivo de activación hasta una concentración final de 30
mM (en 200 \muL). Para muestras de ensayo reales, se suministra
el Mg^{2+} en el tampón de transferencia de la muestra y se añade
al tubo de dosis unitaria con la muestra.
Los tubos fueron colocados en un ciclador
térmico Perkin Elmer 480. Las condiciones del ciclo fueron: 97°C
durante 1 segundo; 55°C durante 1 segundo; y 62°C durante 50
segundos para un total de 40 ciclos.
Después de la terminación del proceso de ciclo
térmico, los tubos fueron transferidos al instrumento LCx^{TM}.
Cada tubo fue montado en un soporte (cuña) colocado sobre el
carrusel, y se colocó el carrusel en el instrumento. Un dispositivo
de retención del tubo de muestra se colocó sobre la parte superior
del carrusel para prevenir la elevación a medida que la sonda de
pipetado tira hacia fuera. Se colocó un paquete de reactivo en el
instrumento. El paquete de reactivo contenía botellas de las
siguientes composiciones: 1) micropartículas revestidas con
anti-carbazol, 2) anti-adamantano
marco con fosfatasa alcalina, 3) sustrato metil umbeliferil
fosfato, y 4) fenantrolina de cobre en tampón Tris.
Los resultados se dan en la Tabla 1 para
muestras duplicadas sobre cuatro operaciones (n=8).
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\vskip1.000000\baselineskip
La solución de inactivación era 0,1 M de
fenantrolina de cobre en tampón Tris. El diluyente de inactivación
era solución de peróxido de hidrógeno al 5%. El instrumento
LCx^{TM} estaba programado para pipetar 50-60
\muL de la solución de inactivación dentro de cada pocillo de
incubación, el tubo de reacción y la célula de detección, seguido
por 60-80 \muL del diluyente de inactivación en
cada localización en todas las cuñas en el carrusel.
\vskip1.000000\baselineskip
Una población de 72 tampones endocervicales
ensayados para Clamydia trachomalis por método de cultivo
estándar fueron ensayados también por el procedimiento del ejemplo 4
utilizando los tubos de reacción del ejemplo 1. Las muestras fueron
diluidas en un tampón de muestra que contiene MgCl_{2} suficiente
para producir una concentración final de aproximadamente 30 mM (en
200 \muL). La figura 8 muestra una distribución de la frecuencia
del número de muestras con respecto a la señal de relación expresada
como recuentos/s/s. Las tres muestras que dieron resultados de
ensayo positivos por el método de cultivo dieron una señal más alta
que 500 recuentos/segundo/segundo. Las 69 muestras que dieron
resultados de ensayo negativos por el método de cultivo dieron una
señal media inferior a 30 recuentos/segundo/segundo. La media de la
población negativa más dos desviaciones estándar fue inferior a 500
recuentos/segundo/segundo.
Los ejemplos solamente deben servir para
ilustrar varias formas de realización de la invención, pero el
alcance para el que se pretende protección deberá definirse por las
reivindicaciones anexas.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se
proporciona un método para amplificar y detectar materiales de
ácido nucleico, que comprende las etapas de: a. añadir una muestra
sospechosa de contener un material de ácido nucleico objetivo a un
recipiente de amplificación junto con reactivos marcados para
amplificación de dicho ácido nucleico objetivo sospechoso para
formar una mezcla de reacción; b. sellar la mezcla de reacción
dentro de dicho recipiente, cerrando una tapa herméticamente
sellada, que tiene una membrana, que es penetrable por una sonda de
pipeta; c. amplificar el material de ácido nucleico objetivo dentro
de dicho recipiente; d. retirar una porción de la mezcla de
reacción desde el recipiente de amplificación para detección; y e.
detectar la presencia de ácido nucleico objetivo amplificado por
detección de dichos reactivos marcados; en el que dicha retirada se
realiza perforando la membrana de la tapa con una sonda de pipeta,
aspirando dicha porción de la mezcla de reacción en dicha pipeta y
dispersando dicha porción en un compartimiento de detección
distinto sin destapar dicho recipiente de amplificación, evitando de
esta manera que gotas o aerosoles del material amplificado puedan
contaminar el medio ambiente, muestras no reaccionadas o reactivos.
El método anterior comprende, además, inactivar todo el material de
ácido nucleico dejado en el recipiente y en el compartimiento de
detección dispersando allí un reactivo de inactivación de ácido
nucleico desde una pipeta, donde dicha inactivación comprende la
adición consecutiva de un quelato de fenantrolina de cobre y
solución de peróxido de hidrógeno. El recipiente de reacción en el
método anterior es un tubo que tiene una tapa con una membrana que
tiene un espesor que varía desde 0,002 hasta 0,015 pulgadas. Con
preferencia, la sonda de pipeta es un tubo metálico fino con un
borde biselado, donde el diámetro exterior de dicha sonda no excede
de 0,050 pulgadas. La etapa de amplificación es de manera ventajosa
una reacción de la cadena de polimerasa o una reacción de la cadena
de ligasa. El método anterior puede comprender, además, una etapa de
colocar el recipiente de amplificación sellado en un instrumento
automático de sonda de pipeta para la detección automática, siendo
realizada dicha etapa de colocación antes de la etapa de. De
retirada. Dichas etapas de retirada y detección se pueden realizar
de manera ventajosa por el instrumento automático. El método de la
invención anterior puede comprender, además, una etapa de
inactivación de todo el material de ácido nucleico dejado en el
recipiente y en el compartimiento de detección distribuyendo allí
un reactivo de inactivación de ácido nucleico, donde dichas etapas
de retirada, de detección y de inactivación se realizan todas por
el instrumento automático de pipeta.
De acuerdo con otro aspecto ventajoso de la
presente invención, se proporciona un kit para amplificación de una
secuencia de ácido nucleico, que comprende: a) una composición de
amplificación PCR en un envase, que consta esencialmente de: una o
más partes de cebadores de oligonucleótido para amplificación por
PCR de un ácido nucleico objetivo deseado, estando presente cada
cebador por encima de 1,6 nM; un suministro de trifosfatos
deoxinucleótido (dNTPs), presentes por encima de 1,0 \muM; un
reactivo que tiene una actividad de polimerasa termoestable;
opcionalmente, detergentes y ácido nucleico portador inerte; y una
concentración de iones de Mg^{2+}, que es suficientemente baja,
con preferencia inferior a 10^{-4} M, para desactivar de manera
eficiente dicha actividad de polimerasa; y b) una solución de
tratamiento de la muestra en un segundo envase que incluye iones de
Mg^{2+} en una concentración tal que la dilución de dicha muestra
y la mezcla de la muestra diluida con la composición de
amplificación de acuerdo con las instrucciones del kit proporciona
una concentración final de iones de Mg^{2+} en la mezcla que es
suficiente para permitir la actividad de polimerasa. El kit
anterior muestra ventajas particulares si dicha concentración de
cebadores está entre 1,6 nM y 160 nM y dicha concentración de dNTPs
está entre 1,0 y 200 \muM. Con preferencia, dicho reactivo que
tiene actividad de polimerasa termoestable es una enzima de
polimerasa a partir de un organismo de la especie Thermus. La
concentración de iones de Mg^{2+} en dicha composición de
amplificación PCR no es mayor que aproximadamente 10^{-4} M, y la
concentración final de iones de Mg^{2+} en dicha mezcla está entre
1 y 40 mM.
De acuerdo con todavía otro aspecto ventajoso de
la invención, se proporciona un kit para amplificar una secuencia
de ácido nucleico, que comprende: una composición de amplificación
LCR que consta esencialmente de: al menos dos parejas de muestras
de oligonucleótidos complementarios para amplificación por LCR o
GLCR de un ácido nucleico objetivo deseado, estando presente cada
muestra por encima de aproximadamente 1,6 nM; un reactivo que tiene
una actividad ligasa termoestable; opcionalmente, un suministro de
menos de todos los cuatro trifosfatos deoxinucleótidos (dNRPs),
presentes por encima de 1,0 \muM y un reactivo que tiene una
actividad polimerasa termoestable; opcionalmente, detergentes y
ácido nucleico portador inerte; y una concentración de iones de
Mg^{2+}, que es suficientemente baja, con preferencia inferior a
10^{-4} M, para desactivar de manera eficiente dicha actividad de
polimerasa; y b) una solución de tratamiento de la muestra en un
segundo envase que incluye iones de Mg^{2+} en una concentración
tal que la dilución de dicha muestra y la mezcla de la muestra
diluida con la composición de amplificación de acuerdo con las
instrucciones del kit proporciona una concentración final de iones
de Mg^{2+} en la mezcla que es suficiente para activar la
actividad de ligasa. En el último kit, dicha concentración de las
muestras está con preferencia entre 1,6 nM y 16 nM. Dicho reactivo
que tiene actividad de ligasa termoestable es una enzima de ligada
de un organismo de la especie Thermus. La concentración de iones de
Mg^{2+} en dicha composición de amplificación LCR no es
ventajosamente mayor que 10^{-4} M, y la concentración final de
iones de Mg^{2+} en dicha mezcla está entre 1 y 40 nM. Dicho
dNTPs y un reactivo que tiene una actividad de polimerasa
termoestable pueden estar presentes con preferencia, y la
concentración de iones de Mg^{2+} en dicha composición de
amplificación LCR es suficientemente baja para desactivar
efectivamente dicha actividad de polimerasa. De manera alternativa,
la concentración de iones de Mg^{2+} no es mayor que
aproximadamente 10^{-4} M.
Se han encontrado otras ventajas cuando la
invención se incorpora como un dispositivo de recipiente de
reacción para realizar un ensayo de amplificación de ácido acético
que comprende: un tubo de material polimérico estable térmicamente
que tiene un diámetro exterior dimensionado para ajustar dentro de
un aparato ciclo térmico, teniendo dicho tubo una abertura hacia el
interior; una tapa para sellar herméticamente la abertura del tubo,
incluyendo dicha tapa una membrana que puede ser perforada de no más
de 0,0015 pulgadas de espesor, de manera que la membrana permite el
muestreo del producto de reacción amplificado a partir del tubo
sellado con una pipeta automática sin abrir el tubo; y una bisagra
flexible que retiene la tapa en el tubo y permite plegar la tapa en
el orificio. En el recipiente de reacción anterior, el espesor de la
membrana que puede ser perforada está con preferencia entre 0,002 y
0,015 pulgadas, y más preferentemente entre 0,005 y 0,009 pulgadas,
y todavía más preferente tiene 0,005 \pm 0,001 pulgada.
Un dispositivo de recipiente de reacción
alternativo para realizar un ensayo de amplificación de ácido
nucleico comprende de acuerdo con la invención lo siguiente: un tubo
de material polimérico térmicamente estable que tiene un diámetro
exterior dimensionado para ajustar dentro de un aparato de ciclo
térmico, teniendo dicho tubo una abertura hacia un interior; una
tapa para sellar herméticamente la abertura del tubo, incluyendo
dicha tapa una membrana fina que puede ser perforada, de manera que
la membrana permite el muestro del producto de reacción amplificado
desde el tubo cerrada con una pipeta automática sin abrir del tubo;
y una bisagra flexible que retiene la tapa en el tubo y que permite
el plegamiento de la tapa en la abertura, en el que dicha bisagra
comprende una bisagra replegable. En el recipiente de reacción
alternativo indicado anteriormente, el espesor de la membrana que
puede ser perforada está con preferencia entre 0,002 y 0,015
pulgadas, o más preferido entre 0,005 y 0,009 pulgadas o tiene de
forma más preferida 0,005 \pm 0,001 pulgada. De manera ventajosa,
dicha bisagra define un radio máximo del tubo cerrado y la distancia
desde el diámetro exterior del tubo hasta dicho radio máximo es
menor que aproximadamente 0,154 pulgadas. Dicha bisagra replegable
puede comprender, además, con preferencia dos ranuras cortadas en
el material de la bisagra y la relación g/h es aproximadamente 0,8
\pm 20%, donde h es la distancia entre las líneas centrales de las
dos ranuras y h es la altura total del conjunto de articulación
desde el punto de fijación al tubo hasta la parte superior de la
tapa medida cuando la tapa está en una posición sellada. Más
preferentemente, g está entre 2 y 2,5 mm.
Claims (8)
1. Un método para amplificar y detectar
materiales de ácido nucleico, que comprende las etapas de:
a. añadir una muestra sospechosa de contener un
material de ácido nucleico objetivo a un recipiente de amplificación
(10) junto con reactivos marcados para amplificación de dicho ácido
nucleico objetivo sospechoso para formar una mezcla de
reacción;
b. sellar la mezcla de reacción dentro de dicho
recipiente, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3
(30), cerrando una tapa herméticamente sellada, como se muestra con
preferencia en las figuras 2 y 3, (20), que tiene una membrana,
como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3, (28), que es
penetrable por una sonda de pipeta, donde el recipiente de
amplificación, como se muestra con preferencia en las figuras 2 y 3
(10), tiene una bisagra replegable, como se muestra con preferencia
en las figuras 2 y 3, (30);
c. amplificar el material de ácido nucleico
objetivo dentro de dicho recipiente (10);
d. retirar una porción de la mezcla de reacción
desde el recipiente de amplificación (10) para detección; y
e. detectar la presencia de ácido nucleico
objetivo amplificado por detección de dichos reactivos marcados;
en el que la retirada se realiza perforando la
membrana (28) de la tapa con una sonda de pipeta, aspirando la
porción de la mezcla de reacción en la pipeta y dispersando la
porción en un compartimiento de detección distinto sin destapar el
recipiente de amplificación (10), evitando de esta manera que gotas
o aerosoles del material amplificado puedan contaminar el medio
ambiente, muestras no reaccionadas o reactivos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, que
comprende, además, inactivar todo el material de ácido nucleico
dejado en el recipiente de amplificación (10) y en el
compartimiento de detección dispersando allí un reactivo de
inactivación de ácido nucleico desde una pipeta.
3. El método de las reivindicaciones 1 a 2, en
el que la bisagra replegable (30) es flexible.
4. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en
el que el recipiente de amplificación (10) es un tubo (10a), donde
la membrana (28) tiene un espesor que varía desde 0,00508 cm hasta
0,0381 cm.
5. El método de una o más de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la sonda de pipeta es un tubo
metálico fino con un borde biselado.
6. El método de una o más de las
reivindicaciones 1 a 5, que comprende, además, una etapa de
colocación del recipiente de amplificación (10) sellado en un
instrumento automático de sonda de pipeta para detección automática,
en el que la etapa de colocación es anterior a la retirada de la
etapa d.
7. El método de una o más de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la membrana (28) tiene un espesor
que varía desde 0,00508 cm hasta 0,0254 cm.
8. El método de la reivindicación 7, en el que
la membrana (28) tiene un espesor que varía entre 0,0125 cm y
0,02286 cm.
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