ES2331298T3 - Procedimiento para que las plantas vuelvan a ser tolerantes a herbicidas inhibidores de hppd por circunvalacion de la via metabolica de hppd. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para volver a plantas tolerantes a un herbicida inhibidor de la ácido hidroxifenilpirúvico dioxigenasa (HPPD), caracterizado porque se expresan en dichas plantas al menos una enzima insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierte el ácido hidroxifenilpirúvico (HPP) en ácido 4-hidroxifenilacético (4-HPA) y una HPAH y una HPAC insensibles a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierten el 4-HPA en homogentisato y de las que al menos una de estas enzimas es heteróloga, y para el cual la HPAH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo constituido por la SEC ID NO 8 y sus fragmentos, y la HPAC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo constituido por las SEC ID NO 10, SEC ID NO 12 y SEC ID NO 14 y sus fragmentos.

Description

Procedimiento para que las plantas vuelvan a ser tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD por circunvalación de la vía metabólica de HPPD.

La presente invención se refiere a un nuevo método que permite volver a plantas tolerantes a herbicidas, en particular a herbicidas inhibidores de HPPD, a las secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas susceptibles de emplearse en este método, a los módulos de expresión que las contienen y a las plantas transgénicas que comprenden al menos uno de estos módulos de expresión.

Las hidroxifenilpiruvato dioxigenasas son enzimas que catalizan la reacción de transformación del para-hidroxifenilpiruvato (HPP) en homogentisato. Esta reacción tiene lugar en presencia de hierro (Fe^{2+}) en presencia de oxígeno (Crouch N.P. et al., Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, 1997).

Se conocen por otro lado ciertas moléculas inhibidoras de esta enzima, que van a fijarse a la enzima para inhibir la transformación de HPP en homogentisato. Algunas de estas moléculas han encontrado uso como herbicidas, en la medida en que la inhibición de la reacción en plantas conduce a un blanqueamiento de las hojas de las plantas tratadas, y a la muerte de dichas plantas (Pallett K. E. et al. 1997 50, 83-84). Dichos herbicidas que tienen como diana la HPPD descritos en el estado de la técnica son especialmente isoxazoles (documentos EP 418.175, EP 470.856, EP 487.352, EP 527.036, EP 560.482, EP 682.659, US 5.424.276), particularmente isoxaflutol, herbicida selectivo del maíz, dicetonitrilos (documentos EP 496.630, EP 496.631), en particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO_{2}CH_{3}-4-CF_{3}fenil)propano-1,3-diona y 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO_{2}CH_{3}-4-2,3-Cl_{2}-fenil)propano-1,3-diona, tricetonas (documentos EP 625.505, EP 625.508, US 5.506.195), en particular sulcotriona o mesotriona, o también pirazolinatos.

Se han efectuado ensayos en laboratorio para confirmar que la HPPD es la diana de dicetonitrilos (DKN) y para poner en evidencia que la HPPD es, al menos a ciertas dosis, la diana única de dicetonotrilos haciendo germinar granos de Arabidopsis sobre tres tipos de medio en condiciones estériles in vitro:

1.

medio Murashige y Skoog (Murashige, T. y Skoog, F. 1962. "A revised medium for a rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture". Physiol. Plant. 15, 473-479), experimento de control de la germinación

2.

medio MS más DKN a la dosis de 1 ppm

3.

medio MS más DKN a la misma dosis + homogentisato a una concentración 5 mM.

Resulta muy claro que sobre el medio 1 la germinación se realiza normalmente, desarrollando cada plántula dos cotiledones bien verdes. El desarrollo se realiza normalmente a continuación. Sobre el medio 2, la germinación tiene lugar, pero la plántula que emerge es blanca, no presentando los dos cotiledones ninguna pigmentación. Las plantas mueren a continuación en algunos días. Sobre el medio 3, la germinación se realiza normalmente, los cotiledones son bien verdes. Aunque las plántulas se desarrollan muy rápidamente, al disminuir la cantidad de homogentisato en el medio, aparecen los primeros síntomas de blanqueamiento y se detiene el crecimiento de las plantas, acabando por morir como en el ensayo efectuado sobre el medio nº 2.

Esto permite confirmar que la HPPD es ciertamente la diana de DKN en plantas y que parece ser la diana única. Esto muestra también que el homogentisato se transporta del medio de cultivo hasta el sitio celular, donde es necesario para el buen funcionamiento de la célula y la supervivencia de la planta.

Para volver a plantas tolerantes a herbicidas, se dispone actualmente de tres estrategias: (1) la detoxificación del herbicida mediante una enzima que va a transformar el herbicida, o su metabolito activo, en productos de degradación no tóxicos como, por ejemplo, enzimas de tolerancia al bromoxinilo o al basta (documentos EP 242.236, EP 337.899); (2) la mutación de la enzima diana a una enzima funcional menos sensible al herbicida, o su metabolito activo como, por ejemplo, las enzimas de tolerancia a glifosato (documento EP 293.356, Padgette S. R. et al., J. Biol. Chem., 266, 33, 1991); o (3) la sobreexpresión de la enzima sensible, de manera que se produzcan en la planta cantidades suficientes de enzima diana con respecto a las constantes cinéticas de esta enzima frente al herbicida, de manera que haya suficiente enzima funcional a pesar de la presencia de su inhibidor.

Es esta tercera estrategia la que se ha descrito para obtener plantas tolerantes a los inhibidores de HPPD con éxito (documento WO 96/38567), entendiéndose que por primera vez se empleaba con éxito una estrategia de sobreexpresión simple de la enzima diana sensible (no mutada) para conferir a plantas una tolerancia a un nivel agronómico de herbicida. La identificación de HPPD mutadas en su parte C-terminal que presentan una tolerancia mejorada a los inhibidores de HPPD ha permitido obtener una mejora de la tolerancia de las plantas para la aplicación de la segunda estrategia (documento WO 99/24585).

La presente invención se refiere a un nuevo método que permite volver a plantas tolerantes a un herbicida que aplica una nueva o cuarta estrategia de tolerancia a herbicida, comprendiendo esta nueva estrategia el rodeo de la vía metabólica inhibida por dicho herbicida. Este rodeo metabólico puede resumirse como sigue:

\ding{226}

sea un herbicida "H" activo para inhibir la actividad de una enzima "E" que transforma el sustrato "S" en el producto "P", siendo esenciales dicho producto P y sus metabolitos para la vida de la planta,

\ding{226}

el rodeo metabólico consiste en expresar en la planta al menos una nueva enzima "NE" heteróloga insensible a "H" que permite la conversión de "S" en un producto intermedio "I", el cual se transforma a continuación en "P" mediante las vías de biosíntesis naturales de la planta o bien mediante la expresión de al menos otra enzima heteróloga "AE" igualmente insensible a "H",

\ding{226}

consistiendo igualmente el rodeo metabólico en expresar al menos otra enzima heteróloga "AE" insensible a "H" que permita la conversión de "I" en "P", siendo "I" un intermedio producido naturalmente por la planta o bien obtenido mediante la expresión de al menos una nueva enzima heteróloga "NE" insensible a "H" que permite la conversión de "S" en "I".

La presente invención se refiere más particularmente a un nuevo método que permite volver a plantas tolerantes a inhibidores de HPPD, comprendiendo dicho método el rodeo metabólico de la HPPD.

No se ha descrito hasta el momento ninguna vía de rodeo metabólico en plantas.

Se conoce por la bibliografía que puede obtenerse la conversión de HPP en homogentisato efectuando en primer lugar una conversión de HPP en ácido 4-hidroxifenilacético (4-HPA) mediante un extracto enzimático que presenta actividad HPP oxidasa seguido de conversión del 4-HPA en homogentisato mediante un extracto enzimático que presenta actividad 4-HPA 1-hidrolasa (documento WO 99/34008). Esta vía de rodeo está representada por la Figura 1.

Un estudio bibliográfico revela que las actividades enzimáticas necesarias para la construcción de la vía de rodeo de HPPD se han caracterizado sobre extractos bacterianos brutos en los años 70. Así, las actividades HPP oxidasa (HPPO, E.C. 1.2.3.) y 4-HPA 1-hidroxilasa (HPAH, E.C. 1.14.13.18.) se han identificado respectivamente en Arthrobacter globiformis (Blakley, 1977) y en Pseudomonas acidovorans (Hareland et al., 1975). Desde entonces, sólo se ha purificado la HPAH por Suemori et al. (1996), sin embargo, no se han publicado ni la secuencia proteica ni la secuencia nucleica. Por tanto, hay que identificar los genes que codifican estas actividades enzimáticas.

En la vía de rodeo, la conversión de HPP en HGA se hace a través del 4-HPA. Ahora bien, el 4-HPA es un compuesto raramente identificado en plantas. Está presente en Astilbe chinensis (Kindl, 1969), en Plantago sp. (Swiatek, 1977), diente de león (Taraxacum officinale; Dey y Harborne, 1997), en Artemisia (Swiatek et al., 1998), en el fruto de Forsythia suspensa (Liu et al., 1998) y por último en el alga marina Ulva lactuca (Flodin et al., 1999). Hay pocos datos sobre su origen. Parece poder provenir de tirosina, shikimato y tiramina. No hay más información sobre su conversión y papel en la planta. Kindl (1969) ha mostrado su degradación mediante ácido 3,4-dihidroxifenilacético, mientras que Flodin et al. (1999) han demostrado su conversión a través de ácido 4-hidroximandélico en 2,4,6-tribromofenol, que se acumula en el alga verde Ulva lactuca. Gross (1975) sugiere que el 4-HPA podría ser un regulador del crecimiento en ciertas plantas superiores y Abe et al. (1974) le consideran como un análogo de auxina en las algas.

Para aplicar la vía de rodeo metabólico de HPPD, hará falta identificar y aislar previamente los genes y las secuencias de ácido nucleico que codifican la o las enzimas responsables de las dos actividades anteriores.

Es objeto de la presente invención un procedimiento para volver a plantas tolerantes a un herbicida inhibidor de la ácido hidroxifenilpirúvico dioxigenasa (HPPD), caracterizado porque se expresan en dichas plantas al menos una enzima insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierte el ácido hidroxifenilpirúvico (HPP) en ácido 4-hidroxifenilacético (4-HPA) y una HPAH y una HPAC insensibles a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierten el 4-HPA en homogentisato y de las que al menos una de estas dos enzimas es heteróloga, y para el cual la HPAH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo constituido por la SEC ID NO 8 y sus fragmentos, y la HPAC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo constituido por las SEC ID NO 10, SEC ID NO 12 y SEC ID NO 14 y sus fragmentos.

Es igualmente objeto de la presente invención un procedimiento para volver a plantas tolerantes a un herbicida inhibidor de la ácido hidroxifenilpirúvico dioxigenasa (HPPD), caracterizado porque se expresan en dichas plantas al menos una enzima insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierte el ácido hidroxifenilpirúvico (HPP) en ácido 4-hidroxifenilacético (4-HPA) y una HPAH y una HPAC insensibles a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierten el 4-HPA en homogentisato y de las que al menos una de estas dos enzimas es heteróloga, y para el cual la HPAH está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 7 y SEC ID NO 17, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 7 o 17, y la HPAC está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 9, SEC ID NO 11, SEC ID NO 13 y SEC ID NO 19, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 9, 11, 13 ó 19.

Según un modo particular de realización del procedimiento según la invención, la enzima insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierte el ácido hidroxifenilpirúvico (HPP) en ácido 4-hidroxifenilacético (4-HPA) es una HPP oxidasa.

Según otro modo particular de realización del procedimiento según la invención, la enzima insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierte el ácido hidroxifenilpirúvico (HPP) en ácido 4-hidroxifenilacético (4-HPA) es una HPP oxidasa que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID NO 2, SEC ID NO 4 y SEC ID NO 6 y sus fragmentos.

Según otro modo particular de realización del procedimiento según la invención, la enzima insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierte el ácido hidroxifenilpirúvico (HPP) en ácido 4-hidroxifenilacético (4-HPA) es una HPP oxidasa que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 1, SEC ID NO 3, SEC ID NO 5 y SEC ID NO 15, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 1, 3, 5 ó 15.

Definiciones según la invención

"Secuencia de ácido nucleico": una secuencia nucleotídica o polinucleotídica que puede ser de tipo ADN o ARN, preferiblemente de tipo ADN, especialmente bicatenaria. La secuencia de ácido nucleico puede ser de origen natural, en particular ADN genómico o ADNc, o también una secuencia sintética o semisintética, habiéndose elegido los ácidos nucleicos que la comprenden para optimizar los codones de una secuencia codificante en función del organismo hospedador en el que se expresará, o bien para introducir o eliminar uno o varios sitios de restricción. Los métodos de preparación de las secuencias de ácido nucleico sintéticas o semisintéticas son bien conocidos por el experto en la técnica.

"Secuencia capaz de hibridar de manera selectiva": las secuencias de ácido nucleico que hibridan con una secuencia de ácido nucleico de referencia a un nivel superior al ruido de fondo de manera significativa. El ruido de fondo puede estar ligado a la hibridación de otras secuencias de ADN presentes, especialmente de otros ADNc presentes en un banco de ADNc. El nivel de señal generada por la interacción entre la secuencia capaz de hibridar de manera selectiva y las secuencias definidas por las secuencias ID anteriores según la invención es generalmente 10 veces, preferiblemente 100 veces, más intenso que el de la interacción de las otras secuencias de ADN que generan el ruido de fondo. El nivel de interacción puede medirse, por ejemplo, mediante el marcaje de la sonda con elementos radiactivos como ^{32}P. La hibridación selectiva se obtiene generalmente empleando condiciones de medio muy rigurosas (por ejemplo, NaCl 0,03 M y citrato de sodio 0,03 M aproximadamente a 50ºC-60ºC). La hibridación puede efectuarse ciertamente según los métodos habituales del estado de la técnica (especialmente Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual)".

"Homólogo de una secuencia de ácido nucleico": secuencia de ácido nucleico que presenta una o varias modificaciones de secuencia con respecto a una secuencia de ácido nucleico de referencia. Estas modificaciones pueden obtenerse según las técnicas habituales de mutación, o también eligiendo los oligonucleótidos sintéticos empleados en la preparación de dicha secuencia mediante hibridación. Con respecto a las múltiples combinaciones de ácidos nucleicos que pueden conducir a la expresión de un mismo aminoácido, las diferencias entre la secuencia de referencia según la invención y el homólogo correspondiente pueden ser importantes. Ventajosamente, el grado de homología será de al menos un 60% con respecto a la secuencia de referencia, preferiblemente de al menos un 70%, más preferiblemente de al menos un 80%, aún más preferiblemente de al menos un 90%. Estas modificaciones son general y preferiblemente neutras, es decir, que para una secuencia codificante no afectan a la secuencia primaria de la proteína o péptido codificado. No obstante, pueden introducir modificaciones no silenciosas, o mutaciones que no afectan a la función de la secuencia de ácido nucleico con respecto a la secuencia de referencia. Los métodos de medida e identificación de homologías entre las secuencias de ácidos nucleicos son bien conocidos por el experto en la técnica. Se pueden emplear, por ejemplo, los programas PILEUP o BLAST (especialmente Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10).

"Fragmentos": fragmento de una secuencia de ácido nucleico o polipeptídica de referencia para la que se han eliminado partes pero que conserva la función de dicha secuencia de referencia.

"Heterólogo": secuencia de ácido nucleico diferente de la secuencia de ácido nucleico que tiene la misma función en un organismo natural. Una secuencia heteróloga puede consistir en una secuencia de ácido nucleico modificada in situ en su entorno natural. Puede tratarse igualmente de una secuencia de ácido nucleico aislada de su organismo natural y reintroducida después en ese mismo organismo. Puede tratarse igualmente de una secuencia de ácido nucleico heteróloga con respecto a otra secuencia de ácido nucleico, es decir, una secuencia asociada a otra secuencia, no encontrándose esta asociación en la naturaleza. Este es especialmente el caso de módulos de expresión constituidos por diferentes secuencias de ácido nucleico que no se encuentran generalmente asociadas en la naturaleza.

"Homólogo de una secuencia proteica": secuencias proteicas cuya secuencia primaria es diferente de la secuencia primaria de la proteína de referencia, pero que cumple la misma función que esta secuencia de referencia. Los métodos de medida e identificación de homologías entre polipéptidos o proteínas son igualmente conocidos por el experto en la técnica. Se pueden emplear, por ejemplo, el "paquete" UWGCG y el programa BESTFITT para calcular las homologías (Deverexu et al., 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395).

"Módulo de expresión": secuencia de ácido nucleico que comprende diferentes elementos funcionales necesarios para la expresión de una secuencia codificante en un organismo hospedador. Estos elementos funcionales comprenden en el sentido de la transcripción una secuencia de regulación promotora, igualmente llamada promotor, ligada de manera funcional a una secuencia codificante y a una secuencia de regulación terminadora, igualmente llamada terminador o terminación. El módulo de expresión puede comprender igualmente entre la secuencia de regulación promotora y la secuencia codificante elementos de regulación tales como activadores de la transcripción o "potenciadores" y/o intrones.

"Organismo hospedador": se entiende esencialmente según la invención células vegetales o plantas. Para los vectores de clonación, los organismos hospedadores pueden ser igualmente bacterias, hongos o levaduras.

"Célula vegetal": célula procedente de una planta y que puede constituir tejidos indiferenciados tales como callos, tejidos diferenciados tales como embriones, partes de plantas, plantas o semillas.

"Planta": organismo multicelular diferenciado capaz de fotosíntesis, en particular monocotiledóneo o dicotiledóneo, más particularmente plantas de cultivo destinadas o no a la alimentación animal o humana, como arroz, maíz, trigo, cebada, caña de azúcar, colza, soja, remolacha, patata, tabaco, algodón, trébol, césped o plantas ornamentales como petunias, o también bananos, vides, frambuesas, fresas, tomates, lechugas, etc.

"Secuencia de regulación promotora": como secuencia de regulación promotora en plantas, se puede utilizar cualquier secuencia de regulación promotora de un gen que se exprese naturalmente en plantas, en particular un promotor que se exprese especialmente en las hojas de las plantas como, por ejemplo, promotores denominados constitutivos de origen bacteriano, vírico o vegetal o también promotores denominados fotodependientes como el de un gen de la subunidad pequeña de ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa (RuBisCO) de planta o cualquier promotor conveniente conocido que pueda utilizarse. Entre los promotores de origen vegetal, se citarán los promotores de histona tales como los descritos en la solicitud EP 0.507.698, o el promotor de actina de arroz (US 5.641.876). Entre los promotores de un gen de virus de planta, se citará el del mosaico de la coliflor (19S o 35S de CAMV), de CsVMV (documento US...) o el promotor del circovirus (documento AU 689.311). Se puede utilizar también una secuencia de regulación promotora específica de regiones o de tejidos particulares de plantas, y más particularmente promotores específicos de granos ([22] Datla, R. et al., Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3, 269-296), especialmente los promotores de napina (documento EP 255.378), faseolina, glutenina, heliantinina (documento WO 92/17580), albúmina (documento WO 98/45460), oelosina (documento WO 98/45461), ATS1 o ATS3 (documento PCT/US98/06978, presentado el 20 de octubre de 1998). Se puede emplear igualmente un promotor inducible elegido ventajosamente entre los promotores de fenilalanina-amoniaco liasa (PAL), HMG-CoA reductasa (HMG), quitinasas, glucanasas, inhibidores de proteinasa (PI), genes de la familia PR1, nopalina sintasa (nos) o del gen vspB (documento US 5.670.349, tabla 3), el promotor HMG2 (documento US 5.670.349), el promotor de beta-glucosidasa (ABG1) de manzana o el promotor de aminociclopropanocarboxilato sintasa (ACC sintasa) de manzana (documento WO 98/45445).

"Activadores de transcripción ("potenciadores")": se citará, por ejemplo, el activador de transcripción del virus del mosaico del tabaco (VMT) descrito en la solicitud WO 87/07644, o del virus del grabado del tabaco (TEV) descrito por Carrington y Freed.

"Intrones": secuencias de ácido nucleico no traducidas. Se citará, por ejemplo, el intrón 1 del gen de histona de Arabidopsis tal como se describe en la solicitud de patente WO 97/04114 para expresión en plantas dicotiledóneas, el primer intrón de actina de arroz descrito en la solicitud de patente WO 99/34005, o el intrón adh1 de maíz para expresión en plantas monocotiledóneas.

"Secuencia codificante": secuencia de ácido nucleico traducida. Comprende una secuencia codificante de una proteína o péptido de interés, eventualmente fusionada en 5' o 3' con una secuencia codificante de un péptido señal o de orientación hacia un compartimento celular particular.

"Péptido señal o de orientación": péptidos fusionados con una proteína o péptido de interés en su parte N o C-terminal, reconocidos por la maquinaria celular que permiten la orientación de la proteína o el péptido de interés hacia un compartimento celular particular. Se trata en particular de péptidos de tránsito cloroplásticos que permiten la orientación de la proteína o péptido de interés a los cloroplastos, o de péptidos señal hacia diversos compartimentos celulares, por ejemplo, vacuola, mitocondrias, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, etc. El papel de dichas secuencias proteicas se describe especialmente en el número 38 de la revista Plant Molecular Biology (1998) dedicada en gran parte a los transportes de proteínas en los diferentes compartimentos de la célula vegetal ("Sorting of proteins to vacuoles in plant cells", pág. 127-144; "the nuclear pore complex", pág 145-162; "protein translocation into and across the chloroplastic enveloppe membranes", pág. 91-207; "multiple pathways for the targeting of thylakoid proteins in chloroplasts", pág. 209-221; "mitochondrial protein import in plants", pág. 311-338).

"Péptido de tránsito cloroplástico": el péptido de tránsito cloroplástico está codificado por una secuencia de ácido nucleico en 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o péptido de interés, de manera que permita la expresión de una proteína de fusión péptido de tránsito/proteína (péptido) de interés. El péptido de tránsito permite orientar la proteína o péptido de interés a los plastos, más particularmente a los cloroplastos, escindiéndose la proteína de fusión entre el péptido de tránsito y la proteína o péptido de interés al pasar la membrana de los plastos. El péptido de tránsito puede ser sencillo, como un péptido de tránsito de EPSPS (documento US 5.188.642) o un péptido de tránsito de la subunidad pequeña de ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa (ssuRuBisCO) de una planta, que comprende eventualmente varios aminoácidos de la parte N-terminal de la ssuRuBisCO madura (documento EP 189.707) o también un péptido de tránsito múltiple que comprende un primer péptido de tránsito de planta fusionado con una parte de la secuencia N-terminal de una proteína madura de localización plastídica, fusionado con un segundo péptido de tránsito de planta tal como se describe en la patente EP 508.909, y más particularmente el péptido de tránsito optimizado que comprende un péptido de tránsito de ssuRuBisCO de girasol fusionado con 22 aminoácidos del extremo N-terminal de ssuRuBisCO de maíz fusionada con el péptido de tránsito de ssuRuBisCO de maíz tal como se describe con su secuencia codificante en la patente EP 508.909.

"Péptido señal": estas secuencias peptídicas se describen especialmente en el número 38 de la revista Plant Molecular Biology (1998) dedicada en gran parte a los transportes de proteínas en los diferentes compartimentos de la célula vegetal ("Sorting of proteins to vacuoles in plant cells", pág. 127-144; "the nuclear pore complex", pág 145-162; "protein translocation into and across the chloroplastic enveloppe membranes", pág. 91-207; "multiple pathways for the targeting of thylakoid proteins in chloroplasts", pág. 209-221; "mitochondrial protein import in plants", pág. 311-338). Los péptidos de orientación hacia la vacuola se describen ampliamente en la bibliografía (Neuhaus J.M. y Rogers J.C "Sorting of proteins to vacuoles in Plant cells", Plant Molecular Biology 38: 127-144, 1998). Preferiblemente, el péptido vacuolar es el péptido vacuolar de la proteína descrita en J.M. Ferullo y col. (Plant Molecular Biology 33: 625-633, 1997), fusionado con la parte C-terminal de la proteína o péptido de interés.

"Secuencia de regulación terminadora": que comprende igualmente las secuencias de poliadenilación, se entiende cualquier secuencia funcional en células vegetales o plantas que sea de origen bacteriano como, por ejemplo, el terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, de origen vírico como, por ejemplo, el terminador de 35S de CaMV, o también de origen vegetal como, por ejemplo, un terminador de histona tal como se describe en la solicitud EN 0.633.317.

"Vector": vector de clonación y/o de expresión para la transformación de un organismo hospedador que contiene al menos un módulo de expresión. El vector comprende, además del módulo de expresión, al menos un origen de replicación. El vector puede estar constituido por un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un virus, transformados mediante la introducción del módulo de expresión. Dichos vectores de transformación en función del organismo hospedador a transformar son bien conocidos por el experto en la técnica y se describen ampliamente en la bibliografía. Para la transformación de células vegetales o plantas, se tratará especialmente de un virus que puede emplearse para la transformación de plantas desarrolladas y que contiene además sus propios elementos de replicación y expresión. Preferiblemente, el vector de transformación de células vegetales o de plantas es un plásmido.

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HPP oxidasa

El procedimiento según la invención puede usar una secuencia de ácido nucleico codificante de una HPP oxidasa y el polipéptido correspondiente. La HPP oxidasa usada es insensible a los inhibidores de HPPD, en particular a los isoxazoles como isoxaflutol y sus dicetonitrilos, especialmente aquellos definidos anteriormente. La HPP oxidasa es especialmente una HPP oxidasa de origen bacteriano, por ejemplo, de Arthrobacter, en particular de Arthrobacter globiformis. La HPP oxidasa es ventajosamente una proteína cuya secuencia primaria de aminoácidos está representada por el identificador de secuencia nº 2 (SEC ID NO 2), sus secuencias homólogas y sus fragmentos.

Las secuencias proteicas de HPP oxidasas homólogas de la SEC ID NO 2 se representan especialmente por las SEC ID NO 4 y 6, sus secuencias homólogas y sus fragmentos.

La HPP oxidasa representada por la SEC ID NO 4 corresponde a la HPP oxidasa de la SEC ID NO 2 en la que se reemplaza una glicina por una alanina.

La presente invención se refiere igualmente a una secuencia de ácido nucleico codificante de una HPP oxidasa tal como se define anteriormente.

Preferiblemente, la secuencia codificante de HPP oxidasa es una secuencia de ADN, especialmente ADN genómico o ADNc, en particular una secuencia heteróloga o aislada.

La secuencia codificante de una HPP oxidasa según la invención se elige especialmente entre las secuencias codificantes de secuencias de ADN representadas por las SEC ID NO 1, 3, 5 ó 15, sus secuencias homólogas, sus fragmentos y las secuencias capaces de hibridar de manera selectiva con las SEC ID 1, 3, 5 ó 15.

La secuencia codificante de SEC ID NO 5 comprende tres mutaciones en posiciones 463, 602 y 1511 con relación a la SEC ID NO 1 que son silenciosas, es decir, no introducen ninguna modificación del polipéptido correspondiente.

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4-HPA 1-hidroxilasa

El procedimiento según la invención usa igualmente los medios necesarios para la expresión de la 4-HPA 1-hidroxilasa. Contrariamente a lo que se esperaba por la bibliografía sobre la actividad de ciertos extractos proteicos, se ha comprobado que la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa en bacterias, en particular Pseudomonas, resultaba de la suma de la actividad de dos enzimas denominadas de aquí en adelante HPAH y HPAC.

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HPAH

La HPAH permite la conversión del HPA en el metabolito intermedio denominado de aquí en adelante Z, cuya estructura queda indeterminada. Puede considerarse seriamente que la HPAH permite la hidroxilación del núcleo aromático del HPA, estabilizándose el metabolito Z en forma de una cetona. Esta hipótesis de actividad enzimática está representada por la figura 2.

El procedimiento según la invención usa por lo tanto una secuencia de ácido nucleico codificante de una HPAH y el polipéptido correspondiente. La HPAH usada es insensible a los inhibidores de HPPD, en particular a los isoxazoles como isoxaflutol y sus dicetonitrilos, especialmente los definidos anteriormente. La HPAH es especialmente una HPAH de origen bacteriano, por ejemplo de Pseudomonas, en particular de Pseudomonas acidovorans. La HPAH es ventajosamente una proteína cuya secuencia primaria de aminoácidos está representada por los identificadores de secuencia nº 8 y 18 (SEC ID NO 8 y SEC ID NO 18), sus secuencias homólogas y sus fragmentos.

Preferiblemente, la secuencia codificante de HPAH es una secuencia de ADN, especialmente ADN genómico o ADNc, en particular una secuencia heteróloga o aislada.

La secuencia codificante de una HPAH según la invención se elige especialmente entre las partes codificantes de secuencias representadas por las SEC ID NO 7 ó 17, sus secuencias homólogas, sus fragmentos y las secuencias capaces de hibridar de manera selectiva con las SEC ID NO 7 ó 17.

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HPAC

La HPAC es la segunda enzima que permite la conversión del metabolito Z en homogentisato.

El procedimiento según la invención usa por lo tanto una secuencia de ácido nucleico codificante de una HPAC y el polipéptido correspondiente. La HPAC usada es insensible a los inhibidores de HPPD, en particular a los isoxazoles como isoxaflutol y sus dicetonitrilos, especialmente aquellos definidos anteriormente. La HPAC es especialmente una HPAC de origen bacteriano, por ejemplo de Pseudomonas, en particular de Pseudomonas acidovorans. La HPAC es ventajosamente una proteína cuya secuencia primaria de aminoácidos está representada por el identificador de secuencia nº 10 (SEC ID NO 10), sus secuencias homólogas y sus fragmentos.

Las secuencias proteicas de HPAC homólogas de SEC ID NO 10 se representan especialmente por las SEC ID NO 12, 14 y 20, sus secuencias homólogas y sus fragmentos.

La secuencia codificante de una HPAC según la invención se elige especialmente entre las partes codificantes de secuencias representadas por las SEC ID NO 9, 11, 13 ó 19, sus secuencias homólogas, sus fragmentos y las secuencias capaces de hibridar de manera selectiva con las SEC ID NO 9, 11, 13 ó 19.

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Módulos de expresión

El procedimiento según la invención usa módulos de expresión cuya secuencia codificante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAH, una HPAC y eventualmente una HPP oxidasa, tal como se definen anteriormente.

La secuencia codificante puede comprender igualmente en 5' o 3' una secuencia codificante de un péptido señal o un péptido de tránsito. Ventajosamente, la secuencia codificante comprende en 5' de la secuencia codificante de HPP oxidasa, HPAH o HPAC, una secuencia codificante de un péptido de tránsito de orientación cloroplástica, en particular un péptido de tránsito múltiple, más particularmente el péptido de tránsito optimizado.

El procedimiento según la invención puede usar igualmente por lo tanto una proteína de fusión péptido de tránsito/HPP oxidasa, péptido de tránsito/HPAH o péptido de tránsito/HPAC, estando definida anteriormente la secuencia del péptido de tránsito, en particular la secuencia del péptido de tránsito optimizada tal como se describe en la solicitud de patente EP 508.909.

Preferiblemente, la secuencia de regulación promotora se elige entre las secuencias de regulación promotora que permiten una expresión constitutiva de la secuencia codificante. Se tratará en particular de secuencias de promotores de 35S de CaMV, CsVMV, actina de arroz o histona.

Se puede elegir igualmente expresar las secuencias codificantes según la invención a un nivel de expresión cercano al nivel de expresión del gen que se intenta rodear. Se podrá emplear en el módulo de expresión según la invención una secuencia de regulación promotora elegida entre las secuencias de regulación promotoras de HPPD de plantas.

Para la expresión de las tres enzimas HPPC oxidasa, HPAH y HPAC en una misma planta, se podrán elegir los módulos de expresión de las secuencias codificantes correspondientes, de secuencias de regulación promotoras diferentes que presentan perfiles de expresión diferentes por su fuerza y/o su localización en los diferentes órganos funcionales de la planta.

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Se podrán elegir las secuencias de regulación promotora que permitan un gradiente de expresión
HPAC>HPAH>HPP oxidasa o al contrario.

Para la expresión de HPP oxidasa, HPAH y HPAC, la secuencia de regulación promotora se elige ventajosamente del grupo que comprende los promotores de HPPD de planta, de histona H3 o H4, especialmente de Arabidopsis o de maíz, en particular aquellos descritos en la solicitud de patente EP 507.698, de SSU de RuBisCO de planta, en particular de girasol o de maíz como se describe en la solicitud de patente WO 99/25842, de 35S de CaMV o de CsVMV, y sus combinaciones, en particular los promotores híbridos histona/35S tal como se describen en los ejemplos de la solicitud de patente EP 507.698. Para expresión en plantas monocotiledóneas, se asociarán ventajosamente estas secuencias de regulación promotoras con el primer intrón de actina de arroz.

Según un modo de realización de la invención, el módulo de expresión que codifica una HPP oxidasa comprende un promotor de histona, una secuencia codificante de una HPP oxidasa y un terminador de histona (Figura 12; SEC ID NO 15).

Según otro modo de realización de la invención, el módulo de expresión que codifica una HPAH comprende un promotor 35S de CaMV, una secuencia codificante de una HPAH y un terminador NOS (Figura 11; SEC ID NO 17).

Según otro modo de realización de la invención, el módulo de expresión que codifica una HPAC comprende un promotor de CsVMV, una secuencia codificante de una HPAC y un terminador NOS (Figura 10; SEC ID NO 19).

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Vectores

El procedimiento según la invención puede usar igualmente un vector de clonación y/o expresión que comprenda módulos de expresión tal como se definen anteriormente.

Según un modo de realización particular de la invención, el vector comprende dos módulos de expresión que comprenden una secuencia codificante de una HPAH y una HPAC tal como se definen anteriormente asociadas dos a dos en un mismo vector. Un vector que comprende un módulo de expresión que codifica HPAH y otro que codifica HPAC puede comprender la combinación de los dos módulos de expresión definidos anteriormente (SEC ID NO 17 y 19). Dicho módulo de expresión se representa en la Figura 13 y la SEC ID NO 21.

Según otro modo particular de realización de la invención, el vector comprende tres módulos de expresión según la invención, un primer módulo de expresión de HPP oxidasa, un segundo módulo de expresión de HPAH y un tercer módulo de expresión de HPAC. Dicho módulo de expresión puede comprender la combinación de los tres módulos definidos anteriormente (SEC ID NO 15, 17 y 19). Dicho vector está representado en la figura 14 y la SEC ID NO 22.

Los vectores tal como se definen anteriormente pueden comprender igualmente módulos de expresión de otras proteínas o péptidos de interés.

Cuando el vector comprende varios módulos de expresión, estos últimos pueden tomar diferentes orientaciones de dos en dos entre sí, colineares, divergentes o convergentes.

Los módulos de expresión de otras proteínas o péptidos de interés comprenden una secuencia de ácido nucleico codificante de proteínas o péptidos de interés diferentes de las HPP oxidasa, HPAH y HPAC definidas anteriormente.

Puede tratarse de secuencias de un gen que codifican un marcador de selección como un gen que confiere a la planta transformada nuevas propiedades agronómicas, o de un gen de mejora de la calidad agronómica de la planta transformada.

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Marcadores de selección

Entre los genes que codifican marcadores de selección, se pueden citar genes de resistencia a antibióticos, los genes de tolerancia a herbicidas (bialafos, glifosato o isoxazoles), genes que codifican enzimas informadoras fácilmente identificables como la enzima GUS, genes que codifican pigmentos o enzimas que regulan la producción de pigmentos en células transformadas. Dichos genes marcadores de selección se describen especialmente en las solicitudes de patente EP 242.236, EP 242.246, GB 2.197.653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 o WO 97/04103.

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Genes de interés

Entre los genes que confieren nuevas propiedades agronómicas a las plantas transformadas, se pueden citar los genes que confieren tolerancia a ciertos herbicidas, los que confieren resistencia a ciertos insectos, los que confieren tolerancia a ciertas enfermedades, etc. Dichos genes se describen especialmente en las solicitudes de patente WO 91/02071 y WO 95/06128.

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Tolerancia a herbicida

La presente invención es particularmente apropiada para la expresión de genes que confieren tolerancia a ciertos herbicidas a células vegetales y a plantas monocotiledóneas transformadas. Entre los genes que confieren tolerancia a ciertos herbicidas, se pueden citar el gen Bar que confiere tolerancia al bialafos, el gen que codifica una EPSPS apropiada que confiere resistencia a los herbicidas que tienen como diana la EPSPS, como el glifosato y sus sales (documentos US 4.535.060, US 4.769.061, US 5.094.945, US 4.940.835, US 5.188.642, US 4.971.908, US 5.145.783, US 5.310.667, US 5.312.910, US 5.627.061, US 5.633.435 y FR 2.736.926), el gen que codifica la glifosato oxidorreductasa (documento US 5.463.175), o también un gen que codifica una HPPD que confiere tolerancia a los herbicidas que tienen como diana la HPPD, como los isoxazoles, especialmente el isoxafutol (documentos FR 95 06800 y FR 95 13570), los dicetonitrilos (documentos EP0496630 y EP0496631) o las tricetonas, especialmente la sulcotriona (documentos EP0625505, EP0625508 y US 5.506.195). Dichos genes que codifican una HPPD que confiere tolerancia frente a los herbicidas que tienen como diana la HPPD se describen en la solicitud de patente WO 96/38567.

Entre los genes que codifican una EPSPS apropiada que confiere resistencia a herbicidas que tienen la EPSPS como diana, se citará más particularmente el gen que codifica una EPSPS vegetal, en particular de maíz, que presenta dos mutaciones 102 y 106, descrito en la solicitud de patente FR 2.736.926, denominado a continuación EPSPS doble mutante, o también el gen que codifica una EPSPS aislada de Agrobacterium descrito por las secuencias de ID 2 e ID 3 de la patente US 5.633.435, denominado a continuación CP4.

Entre los genes que codifican una HPPD que confieren tolerancia a herbicidas que tienen como diana la HPPD, se citarán más particularmente la HPPD de Pseudomonas y la de Arabidopsis, descritas en la solicitud de patente WO 96/38567.

En los casos de genes que codifican EPSPS o HPPD, y más particularmente los genes anteriores, la secuencia que codifica estas enzimas está precedida ventajosamente por una secuencia que codifica un péptido de tránsito, en particular el péptido de tránsito denominado péptido de tránsito optimizado descrito en las patentes US 5.510.471 o US 5.633.448.

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Resistencia a insectos

Entre las proteínas de interés que confieren nuevas propiedades de resistencia a insectos, se citarán más particularmente las proteínas Bt ampliamente descritas en la bibliografía y bien conocidas por el experto en la técnica. Se citarán también las proteínas extraídas de bacterias como Photorabdus (documentos WO 97/17432 y WO 98/08932).

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Resistencia a enfermedades

Entre las proteínas o péptidos de interés que confieren nuevas propiedades de resistencia a enfermedades, se citarán especialmente las quitinasas, glucanasas y oxalato oxidasa, estando todas estas proteínas y sus secuencias codificantes ampliamente descritas en la bibliografía, o también los péptidos antibacterianos y/o antifúngicos, en particular los péptidos de menos de 100 aminoácidos ricos en cisteína, como las tioninas o defensinas de las plantas, y más particularmente los péptidos líticos de cualquier origen que comprenden uno o varios puentes de disulfuro entre las cisteínas y regiones que comprenden aminoácidos básicos, especialmente los péptidos líticos siguientes: la androctonina (documentos WO 97/30082 y PCT/FR98/01814, presentado el 18 de agosto de 1998) o la drosomicina (documento PCT/FR98/01462, presentado el 8 de julio de 1998).

Según un modo particular de realización de la invención, la proteína o péptido de interés se elige entre los péptidos elicitores fúngicos, en particular las elicitinas (Kamoun et al., 1993; Panabières et al., 1995).

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Modificación de la calidad

Se pueden citar igualmente los genes que modifican la constitución de plantas modificadas, en particular el contenido y la calidad de ciertos ácidos grasos esenciales (documento EP 666.918) o también el contenido y la calidad de las proteínas, en particular en las hojas y/o los granos de dichas plantas. Se citarán en particular los genes que codifican proteínas enriquecidas en aminoácidos azufrados (Korit, A.A. et al., Eur. J. Biochem. (1991) 195, 329-334; documentos WO 98/20133; WO 97/41239; WO 95/31554; WO 94/20828; y WO 92/14822). Estas proteínas enriquecidas en aminoácidos azufrados tendrán igualmente como función atrapar y almacenar la cisteína y/o metionina excedente, permitiendo evitar los problemas eventuales de toxicidad ligados a una sobreproducción de estos aminoácidos azufrados al atraparlos. Se pueden citar igualmente genes que codifican péptidos ricos en aminoácidos azufrados y más particularmente cisteínas, teniendo igualmente dichos péptidos una actividad antibacteriana y/o antifúngica. Se citarán más particularmente las defensinas de plantas, al igual que los péptidos líticos de cualquier origen, y más particularmente los péptidos líticos siguientes: la androctonina (documentos WO 97/30082 y PCT/FR98/01814, presentado el 18 de agosto de 1998) o la drosomicina (documento PCT/FR98/01462, presentado el 8 de julio de 1998).

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Células vegetales y plantas transgénicas

La presente invención se refiere igualmente a células vegetales y a plantas transformadas que comprenden una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima insensible a un herbicida inhibidor de HPPD que convierte el HPP en 4-HPA, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAH funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID NO 8 y sus fragmentos, y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAC funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID NO 10, SEC ID NO 12 y SEC ID NO 14 y sus fragmentos, y para la que al menos una de las enzimas HPAH o HPAC es heteróloga.

La presente invención se refiere igualmente a células vegetales y a plantas transformadas que comprenden una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima insensible a un herbicida inhibidor de HPPD que convierte el HPP en 4-HPA, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAH funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 7 y SEC ID NO 17, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 7 o 17, y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAC funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 9, SEC ID NO 11, SEC ID NO 13 y SEC ID NO 19, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 9, 11, 13 o 19, y para la que al menos una de las enzimas HPAH o HPAC es heteróloga.

Según un modo particular de realización de la invención, la enzima insensible a un herbicida inhibidor de HPPD que convierte el HPP en 4-HPA es una HPP oxidasa.

Según otro modo particular de realización de la invención, la HPP oxidasa comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID NO 2, SEC ID NO 4 y SEC ID NO 6 y sus fragmentos.

Según otro modo particular de realización de la invención, la HPP oxidasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 1, SEC ID NO 3, SEC ID NO 5 y SEC ID NO 15, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 1, 3, 5 ó 15.

Las células vegetales o las plantas según la invención tal como se definen anteriormente pueden comprender igualmente módulos de expresión de otras proteínas o péptidos de interés definidos anteriormente.

Preferiblemente, los módulos de expresión se integran de manera estable en el genoma de células vegetales o plantas. Más preferiblemente, las plantas según la invención son fértiles, transfiriéndose los módulos de expresión según la invención a su descendencia.

La presente invención se refiere igualmente a granos de las plantas transgénicas anteriores, caracterizados porque comprenden una célula vegetal según la invención.

Los diferentes módulos de expresión en plantas transformadas según la invención pueden provenir de la misma planta transformada parental, y en este caso la planta procede de un solo procedimiento de transformación/regeneración con los diferentes módulos de expresión contenidos en un mismo vector, o mediante cotransformación mediante varios vectores. Puede obtenerse igualmente mediante el cruzamiento de plantas parentales que contienen cada una al menos un módulo de expresión según la invención.

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Transformación de células vegetales y plantas

La invención tiene también como objeto un procedimiento de transformación de células vegetales y plantas mediante la introducción de al menos un módulo de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAH funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID NO 8 y sus fragmentos, o al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una HPAC funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID NO 10, SEC ID NO 12 y SEC ID NO 14 y sus fragmentos.

La invención tiene también como objeto un procedimiento de transformación de células vegetales y plantas mediante la introducción de al menos un módulo de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAH funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 7 y SEC ID NO 17, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 7 o 17, o al menos una secuencia de ácido nucleico codificante de una HPAC funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 9, SEC ID NO 11, SEC ID NO 13 y SEC ID 19, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 9, 11, 13 ó 19.

Una serie de métodos consiste en bombardear células, protoplastos o tejidos con partículas a las que se fijan secuencias de ADN. Otra serie de métodos consiste en utilizar como medio de transferencia a la planta un gen quimérico insertado en un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o Ri de Agrobacterium rhizogenes. Pueden utilizarse otros métodos tales como microinyección o electroporación, o también la precipitación directa mediante PEG. El experto en la técnica hará la elección del método apropiado en función de la naturaleza del organismo hospedador, en particular de la célula vegetal o de la planta.

Cuando se desea introducir varias secuencias de ácido nucleico o módulos de expresión, se puede hacer mediante un solo vector según la invención que comprende los diferentes módulos de expresión. Pueden introducirse igualmente en el organismo hospedador mediante cotransformación mediante varios vectores, comprendiendo cada uno al menos un módulo de expresión.

De manera general, las plantas transgénicas según la invención se obtienen mediante transformación de células vegetales y después regeneración de una planta, preferiblemente fértil, a partir de la célula transformada. La regeneración se obtiene mediante cualquier procedimiento apropiado que depende de la naturaleza de la especie como, por ejemplo, se describe en las referencias anteriores. Para los procedimientos de transformación de células vegetales y de regeneración de plantas, se citarán especialmente las patentes y solicitudes de patente siguientes: US 4.459.355, US 4.536.475, US 5.464.763, US 5.177.010, US 5.187.073, EP 267.159, EP 604.662, EP 672.752, US 4.945.050, US 5.036.006, US 5.100.792, US 5.371.014, US 5.478.744, US 5.179.022, US 5.565.346, US 5.484.956, US 5.508.468, US 5.538.877, US 5.554.798, US 5.489.520, US 5.510.318, US 5.204.253, US 5.405.765, EP 442.174, EP 486.233, EP 486.234, EP 539.563, EP 674.725, WO 91/02071 y WO 95/06128.

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Escarda selectiva

La invención tiene también como objeto un procedimiento de escarda selectiva de plantas, especialmente de cultivos, con la ayuda de un inhibidor de HPPD, especialmente un herbicida definido con anterioridad, caracterizado porque se aplica este herbicida sobre plantas transformadas según la invención tanto en presembrado, preemergencia como postemergencia del cultivo.

La presente invención se refiere igualmente a un procedimiento de control de las malas hierbas en una superficie de un campo que comprende granos o plantas transformados según la invención, comprendiendo dicho procedimiento la aplicación en dicha superficie del campo de una dosis tóxica para dichas malas hierbas de un herbicida inhibidor de HPPD, sin afectar no obstante de manera sustancial a los granos o plantas transformados según la invención.

La presente invención se refiere igualmente a un procedimiento de cultivo de plantas transformadas según la invención, comprendiendo dicho procedimiento la siembra de granos de dichas plantas transformadas en una superficie de un campo apropiado para el cultivo de dichas plantas, la aplicación sobre dicha superficie de dicho campo de una dosis tóxica para las malas hierbas de un herbicida que tiene como diana la HPPD definido anteriormente en caso de presencia de malas hierbas, sin afectar de manera sustancial a dichos granos o dichas plantas transformadas, y después la recolección de las plantas cultivadas cuando llegan a la madurez deseada y eventualmente la separación de los granos de las plantas recolectadas.

Por "sin afectar de manera sustancial a dichos granos o dichas plantas transformadas", se entiende según la invención que las plantas transformadas según la invención sometidas a la aplicación de una dosis de herbicida tóxica para las malas hierbas presentan una fitotoxicidad leve o nula. Por dosis tóxica para las malas hierbas, se entiende según la invención una dosis de aplicación del herbicida para la que las malas hierbas mueren. Por fitotoxicidad leve, se entiende según la invención un porcentaje de hojas blancas inferior al 25%, preferiblemente inferior al 10%, más preferiblemente inferior al 5%. Se entiende igualmente según la presente invención que la aplicación de la misma dosis tóxica sobre una planta por lo demás comparable no transformada, es decir, que no comprende al menos un módulo de expresión según la invención, conduciría a observar sobre dicha planta síntomas de fitotoxicidad superiores a los observados para la planta transformada según la invención.

En los dos procedimientos anteriores, la aplicación de herbicida que tiene como diana la HPPD puede hacerse según la invención tanto en presiembra, preemergencia como postemergencia del cultivo.

Por herbicida en el sentido de la presente invención se entiende una materia activa herbicida sola o asociada a un aditivo que modifica su eficacia como, por ejemplo, un agente aumentador de la actividad (sinergista) o limitante de la actividad (protector). Los herbicidas inhibidores de HPPD se definen en particular con anterioridad. Ciertamente, para su aplicación práctica, los herbicidas anteriores están asociados de manera en sí conocida a coadyuvantes de formulación utilizados habitualmente en agroquímica.

Cuando la planta transformada según la invención comprende otro gen de tolerancia a otro herbicida (como, por ejemplo, un gen que codifica una EPSPS mutada o no que confiere a la planta tolerancia a glifosato), o cuando la planta transformada es naturalmente insensible a otros herbicidas, el procedimiento según la invención puede comprender la aplicación simultánea o por etapas de un inhibidor de HPPD en asociación con dicho herbicida, por ejemplo glifosato.

Los diferentes aspectos de la invención se comprenderán mejor con la ayuda de los ejemplos experimentales siguientes.

Todos los métodos y operaciones descritos a continuación en estos ejemplos se dan a modo de ejemplos y corresponden a una elección, efectuada entre los métodos disponibles para llegar al mismo resultado. Esta elección no tiene ninguna incidencia sobre la calidad del resultado y, por consiguiente, cualquier método adaptado puede ser utilizado por el experto en la técnica para llegar al mismo resultado. La mayoría de los métodos de ingeniería de fragmentos de ADN se describen en Coligan et al. (1995), Ausubel et al. (1995); Maniatis et al. (1982), Sambrook et al.

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Ejemplo I Identificación del gen que codifica la HPP oxidasa de Arthrobacter globiformis

La HPP oxidasa (HPPO) convierte el HPP en 4-HPA mediante una reacción de descarboxilación. Esta enzima cataliza por tanto la primera actividad enzimática necesaria para la construcción de la vía metabólica que rodea la HPPD. La actividad HPP oxidasa se ha caracterizado en extractos brutos de S1 de Rhodococcus erythropolis (Suemori et al., 1995) o en un extracto parcialmente purificado de Arthrobacter globiformis (Blakley, 1977). Al parecer, la proteína no se ha purificado. Con el fin de poder introducir esta actividad enzimática en la planta, es necesario identificar el gen de la misma. Son factibles diferentes enfoques: (1) la mutagénesis de inserción y por lo tanto la identificación del gen mediante la pérdida de actividad enzimática, (2) la complementación funcional de un microorganismo utilizando un banco genómico, (3) la purificación de la proteína para remontarse a la secuencia nucleica.

Se utilizaron los tres enfoques. La complementación funcional y la mutagénesis de inserción serán poco desarrolladas, al no permitir estas técnicas identificar al gen de HPPO.

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I.1 Materiales y métodos I.1.1- Condiciones de cultivo I.1.1.1- Medios ricos

Se utiliza el medio Luria-Bertani (LB; comercializado por Bio101) para cultivar las bacterias (E. coli, P. fluorescens) en los experimentos de biología molecular. Para el cultivo de A. globiformis, se preferirá el medio Columbia-ANC enriquecido con 5% de sangre de carnero (BioMérieux). Este medio rico contiene dos antibióticos (ácido nalidíxico y colimicina) inhibidores de los gérmenes gramnegativos. Aunque las tres bacterias broten en medio rico a 37ºC, se cultivan en general A. globiformis y P. fluorescens a 29ºC.

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I.1.1.2- Medio de cultivo M^{Ag}

El medio de cultivo descrito por Blakley (1977) precipita, por lo tanto hace falta filtrarlo antes de su utilización. Se ha cambiado progresivamente el medio con el fin de alcanzar un medio "mínimo" óptimo. Los factores considerados son la velocidad de crecimiento de A. globiformis y la actividad enzimática HPPO. El medio considerado (M^{Ag}) es un medio M9 (Maniatis et al., 1982) ligeramente modificado: Na_{2}HPO_{4} 12 H_{2}O (6 g/l); KH_{2}PO_{4} (3 g/l); NH_{4}Cl (1 g/l); NaCl (0,5 g/l); CaCl_{2} (6 mg/l); FeSO_{4} 7 H_{2}O (6 mg/l); extracto de levadura (20 mg/l); y por último sustrato (HPP o tirosina o citrato) a una concentración de 1 g/l. Se somete a autoclave el medio. Antes de su utilización, se añade 1 ml de MgSO_{4} 1 M estéril por litro de medio.

Este medio mínimo se utiliza también para cultivar P. fluorescens.

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I.1.2- Construcción de un banco genómico de Arthrobacter globiformis

No existe una técnica fiable que permita hacer un banco de ADNc bacterianos completos. Por lo tanto, se ha decidido crear un banco genómico de Arthrobacter globiformis. Para realizarlo, se eligió el sistema cosmídico. Se realizó el banco cosmídico para los experimentos de complementación funcional, después se utilizó más tarde para buscar el o los cósmidos que contienen el gen hppO.

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I.1.2.1- Vector cosmídico pLAFR5 I.1.2.1.1- Descripción del vector

Se eligió el vector cosmídico conjugativo pLAFR-5 (Keen et al., 1988) que puede recibir un inserto de aproximadamente 20 kb. Provisto de un origen de transferencia y de un origen de replicación de amplio espectro de hospedador gramnegativo, puede transmitirse a otros géneros bacterianos mediante conjugación triparental, lo que puede ser útil para comprobar la complementación funcional en diferentes géneros bacterianos. Confiere resistencia a tetraciclina.

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I.1.2.1.2- Preparación del vector

El plásmido pLAFR-5 se purifica mediante un protocolo de lisis alcalina (Maniatis et al., 1982), se trata con ARNasa y después se digiere con BamHI y ScaI. La digestión con BamHI permite abrir el sitio en el que se "ligarán" los insertos de ADN genómico digerido con Sau3A. La digestión con ScaI permite liberar los sitios cos que permiten la encapsidación. Después de extracción fenólica y después clorofórmica, se precipita el ADN con etanol. Se solubiliza el ADN seco en agua. Se conserva el vector así preparado a -20ºC.

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I.1.2.1- Preparación de ADN genómico de A. globiformis

Se centrifuga un cultivo de 24 horas (200 ml, 180 rpm, 29ºC) realizado en el medio (200 ml) descrito por Blakley (1977) a 3.000 g a 4ºC durante 15 minutos. Se incuba el sedimento celular, recogido con 10 ml de disolución de lisis (TE pH 8; 0,5% de SDS; 1 mg de proteinasa K), a 37ºC en baño de agua con agitación suave cada 20 minutos. Al cabo de 90 minutos, se vierte la suspensión de células lisadas en un tubo JA-20 de polipropileno. Se añaden entonces 10 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25/24/1) y después se centrifuga a 6.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Se transfiere entonces el sobrenadante a un nuevo tubo JA20 al que se añaden 1,8 ml de acetato de amonio 10 M y 10 ml de isopropanol. Después de centrifugar a 20.000 g durante 20 minutos a 4ºC, se aclara el sedimento con etanol al 70%. Se recoge el sedimento con 1 ml de TE a pH 8 y después se transfiere a un tubo Eppendorf de 2 ml, al que se añaden 10 \mul de ARNasa (10 mg.ml^{-1}). Después de 30 min a 37ºC, se vuelven a añadir 800 \mul de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Después de centrifugar, se transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf y se extrae con 0,8 ml de cloroformo. Se transfiere entonces el sobrenadante a un último tubo Eppendorf al que se añaden 200 \mul de acetato de amonio 10 M y 800 \mul de isopropanol. Después de centrifugar, se aclara el sedimento con etanol al 70% y después, una vez seco, se recoge con 500 \mul de agua. Se almacena entonces el ADN genómico a -20ºC.

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I.1.2.3- Digestión parcial del ADN genómico de A. globiformis

Sólo los cósmidos que tienen 40-45 kb pueden encapsidarse. Al tener el vector 21,5 kb, los insertos de ADN genómico de A. globiformis deben tener un tamaño comprendido entre 19 y 22 kb. Estos fragmentos se obtienen realizando una digestión parcial del ADN genómico de Arthrobacter globiformis. Para definir las condiciones óptimas de la digestión parcial, se realizaron digestiones del ADN genómico de A. globiformis con cantidades variables de la enzima de restricción Sau 3A. Parece que la mejor condición de digestión utiliza 0,08 unidades enzimáticas de Sau 3A durante 30 minutos a 37ºC. El ADN genómico así digerido presenta un tamaño comprendido entre 15 y 22 kb. El ADN genómico así digerido se extrae con fenol y después con cloroformo y finalmente se precipita con etanol.

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I.1.2.4- Ligamiento del ADN genómico de A. globiformis en el vector cosmídico

La reacción de ligamiento se hace en un volumen final de 10 \mul, que contiene 500 ng de pLAFR-5 digerido con BamHI y ScaI, 650 ng de ADN genómico digerido con Sau3A, 320 unidades de ADN ligasa T_{4} (N.E.B.) y ATP 5 mM. El ligamiento se desarrolla a 12ºC durante una noche (aproximadamente 16 horas). El ATP 5 mM permite evitar los ligamientos entre extremos romos (ScaI) (Feretti y Sgaramella, 1981) de tal manera que los dímeros de vectores que no tienen inserto no puedan encapsidarse en la cabeza de fagos \lambda.

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I.1.2.5- Encapsidación de cósmidos y amplificación del banco cosmídico

La encapsidación de cósmidos, realizada utilizando el kit GIGAPACK II XL (Stratagène) respetando las instrucciones del fabricante, asegura una eficacia de transfección superior a las obtenidas con las técnicas clásicas de transformación. Para amplificar el banco cosmídico, Keen et al. (1988) aconsejan utilizar DH-1 y HB101 de Escherichia coli. Efectivamente, cuando se cultivan estas cepas sobre maltosa, producen una proteína de membrana que permite una mejor fijación del fago y por lo tanto una transfección más eficaz de los cósmidos. Se conserva el banco, amplificado según las recomendaciones de Stratagène, a -80ºC. Para evaluar el banco cosmídico, se digiere el ADN plasmídico aislado de una treintena de clones con ApaI o EcoRI. Se observan los perfiles de restricción sobre gel de agarosa al 0,8%.

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I.1.3- Purificación de HPP oxidasa I.1.3.1- Ensayo colorimétrico de la actividad HPP oxidasa

Con el fin de poder controlar las etapas de purificación, se sigue la actividad HPP oxidasa utilizando el ensayo colorimétrico descrito por Blakley (1977). Se detiene la reacción enzimática mediante la adición de 2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4-DNPH) en disolución en HCl 2 M. La 2,4-DNPH reacciona con la función cetona en alfa de una función carboxílica (ej: HPP). Se forma así una hidrazona que se puede revelar alcalinizando el medio. Cuando se convierte el HPP en su totalidad en 4-HPA durante la reacción enzimática, la hidrazona no puede formarse, obteniéndose por lo tanto en medio básico el color amarillo característico del 2,4-DHPA. Si el HPP no se convierte enteramente en 4-HPA en la reacción enzimática, es posible la formación de hidrazona. Estas hidrazonas toman un color pardo en medio básico. Se obtiene una variación de coloración entre estos dos extremos en función de la cantidad de HPP consumida. Las medidas de absorción se hacen a 445 ó 450 nm. Con el fin de volver este ensayo más fácilmente manipulable, se ha adaptado al formato de microplaca de 96 pocillos. La mezcla de reacción comprende GSH (900 \muM); HPP (135 \muM); TPP (1,8 mM); MgCl_{2} (4,5 mM); FAD (4 \muM); tampón fosfato de potasio (90 mM) a pH 7,4. Se conserva la mezcla en hielo. Se depositan en cada pocillo 50 \mul de la fracción a ensayar y 150 \mul de mezcla de reacción. Después de 20 min a 30ºC, se detiene la reacción enzimática con 13 \mul de disolución de 2,4-DNPH (0,1% en HCl 2 M). Se deja reaccionar durante 20 min a temperatura ambiente. Se revela la formación de hidrazona añadiendo 13 \mul de disolución de NaOH 10 M. Para realizar el intervalo patrón, se preparan mezclas de reacción con concentraciones variables de HPP. Se reemplazan los 50 \mul de fracción proteica por 50 \mul de tampón de extracción de proteína. Se realiza la curva patrón para cada nueva disolución de 2,4-DNPH (la disolución de 2,4-DNPH es estable 6 meses en la oscuridad). La ventaja de este ensayo es su rapidez y su simplicidad, pero tiene el defecto de medir una desaparición de sustrato y no una aparición de producto. Además, existe la posibilidad de tener falsos positivos: una actividad tirosina aminotransferasa dará el mismo resultado que la actividad de HPPO. Efectivamente, en los dos casos desaparece la función cetona. Se ha desarrollado por tanto un método de HPLC rápido y sensible que permite confirmar la producción de 4-HPA.

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I.1.3.2- Ensayo de actividad analizado mediante HPLC

Se ha puesto a punto un método de HPLC que utiliza una pequeña columna Sphérisorb ODS2 50 x 4,6 mm y de granulometría 3 \mum. Se realiza la cromatografía de forma isocrática A: 90%. B: 10% (en que el tampón A: H_{2}O + TFA al 0,1% y el tampón B: acetonitrilo), caudal 0,8 ml.min^{-1} y la elución se sigue a 230 nm. En estas condiciones, es posible separar 4-HPA, HGA, 3,4-DHPA y HPP en 5 minutos después de la inyección. Se ha realizado la columna a medida por Merck.

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I.1.3.3- Purificación de proteína

En la puesta a punto de este protocolo, se ha buscado el deseo de simplicidad.

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I.1.3.3.1- Ensayos preliminares

Los ensayos preliminares tienen como objeto determinar la influencia de compuestos (NaCl, KCl, 1-propanol, etilenglicol, etc.) y del pH sobre la actividad enzimática. Se realizan las reacciones con extractos brutos de A. globiformis cultivado sobre medio M^{Ag} que contiene tirosina como única fuente de carbono (M^{Ag}-tirosina). Se añade el compuesto a ensayar al medio de reacción. Para medir la influencia del pH sobre la actividad enzimática HPPO, se realizan diferentes tampones fosfato.

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I.1.3.3.2- Protocolo de purificación

Se extiende la cepa de Arthrobacter globiformis sobre medio LB gelosado o sobre medio Columbia-ANC gelosado. Después de 16 horas de cultivo a 29ºC, se toma una colonia y se siembra en 5 ml de medio LB, en crecimiento durante 8 horas a 29ºC, 180 rpm. Se inoculan entonces 50 \mul de este precultivo en 1,5 l de medio M^{Ag}-tirosina o M^{Ag}-HPP, y se realiza entonces el cultivo a 29ºC, 180 rpm, en Erlenmeyer con aspas (Belco). Después de 48 horas de cultivo, se recogen las células mediante centrifugación a 5.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Se retoman las células en suspensión en tampón Tris-HCl 50 mM a pH 7,4 y después se centrifugan como anteriormente. Se recoge el sedimento en 2 ml de tampón Tris-HCl 50 mM a pH 7,4. Se someten a sonicación las células (Vibra Cell, Sonic Materials INC., Connecticut, EE.UU.) durante 15 minutos, potencia 4, pulso de 30%, en hielo fundido. Se eliminan los desechos insolubles mediante una centrifugación de 25 min a 20.000 g, 4ºC. Se recupera el sobrenadante, constituye "el extracto bruto". Puede congelarse en nitrógeno líquido y después conservarse a -80ºC (durante 6 meses sin pérdida aparente de actividad). Se carga el extracto bruto, sin desalado previo, sobre una columna de intercambio pobre en aniones "EMD/DEAE 650 S" (Merck) equilibrada en tampón fosfato 50 mM a pH 7,4. Se obtiene la elución de la actividad enzimática aplicando un gradiente de concentración de NaCl (en disolución en un tampón fosfato 50 mM a pH 7,4. Se combinan las fracciones que contienen actividad enzimática. Se diluye la disolución proteica obtenida por un factor de 2,7 con tampón fosfato 50 mM a pH 7,4. Se cargan entonces las proteínas sobre una columna (XK16, Pharmacia) de intercambio rica en aniones "Source Q" (30 ml, Pharmacia) previamente equilibrada con un tampón fosfato 50 mM a pH 7,4. Se combinan las fracciones proteicas interesantes, identificadas mediante la actividad enzimática, y después se concentran sobre una membrana UVIKON de 10 kDa. Se desala entonces el extracto proteico resultante mediante la técnica de filtración en gel utilizando una columna "PD10" (Pharmacia) equilibrada con tampón fosfato 10 mM a pH 7,4 y eluida con este mismo tampón. Se depositan entonces las proteínas sobre una columna (XK9/15, Pharmacia) de hidroxiapatito (2 ml; Hydroxyapatite DNA grade Bio-Gel®HTP gel; Bio-Rad) equilibrada con tampón fosfato 10 mM a pH 7,4. Se eluye la actividad enzimática aplicando un gradiente de fosfato. Se combinan las fracciones que contienen actividad enzimática y se concentran. Se conservan las proteínas activas cuando la concentración de proteína es superior a 1 mg/ml añadiendo FAD, GSH y glicerol con el fin de obtener las concentraciones finales siguientes: FAD 27 \muM,
GSH 110 \muM, 0,8% de glicerol. Las proteínas así preparadas pueden congelarse a -80ºC durante al menos 6 meses.

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I.1.3.3.3- Valoración de proteínas

La valoración de proteínas se hace según el procedimiento de Bradford (1976) utilizando \gamma-globulina como patrón.

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I.1.3.3.4- Coloración de geles de proteínas

Se analizan las fracciones proteicas sobre gel de poliacrilamida al 10% según el método de Laemmli (1970). Después de la migración, se colorean las proteínas del gel utilizando el método de azul de Coomasie (Chua, 1980) o bien utilizando el método de nitrato de plata (Schoenle et al., 1984).

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I.1.4- Microsecuenciación proteica del extremo N-terminal y de péptidos internos

Se realiza la microsecuenciación de la proteína utilizando el método de Edman (Laursen, 1971). Para obtener los mejores resultados en la secuenciación, se prepara el gel el mismo día.

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I.1.4.1- Preparación de gel de acrilamida y su electroforesis

Se realizan los geles (al 8,5%, 10% ó 12%) según el método de Laemmli (1970) utilizando el sistema de minigeles de Hoefer®. Se diluyen las proteínas a un tercio con una disolución de "azul de deposición desnaturalizante" (Tris-HCl 150 mM a pH 6,8; 4% de SDS; 2% de \beta-mercaptoetanol (v/v); 3,3% de glicerol (v/v); 0,03% de azul de bromofenol y 10 ml de agua miliQ csp). Después de hervir durante 5 minutos, se cargan las proteínas sobre gel de acrilamida. Se realiza la migración a temperatura ambiente utilizando un tampón de migración desnaturalizante (base Tris 25 mM; glicina 250 mM; 0,014% de \beta-mercaptoetanol (v/v); 0,1% de SDS) y aplicando una intensidad de 15 mA por gel.

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I.1.4.2- Preparativos para la secuenciación del extremo N-terminal

Con el fin de poder realizar la secuenciación del extremo N-terminal, se transfiere el gel sobre membrana PVDF (PROBLOTT® - Applied Biosystems) utilizando la técnica de transferencia semiseca. Se hace la electrotransferencia de los polipéptidos en 30 minutos a 300 mA con el aparato "Semy Dry Electroblotter" (Bio-Rad) y en un medio basado en CAPS (tampón de transferencia: CAPS 10 mM a pH 11,0; 10% de metanol (v/v)). El tampón de transferencia no contiene glicina que amenazaría con "contaminar" la secuenciación. Después de la transferencia, se aclara la membrana durante varios segundos con agua miliQ. Se sumerge entonces durante varios segundos en una disolución de coloración basada en Amidoschwarz (Aldrich; ref: 19.524-3). La disolución está constituida por 45% de metanol (v/v), 1% de ácido acético (v/v), 0,1% de Amidoschwarz (m/v) y 63,9% de agua (v/v). Cuando la banda correspondiente a la proteína de interés es visible, se aclara abundantemente la membrana con agua miliQ y después se seca al aire. Se corta la parte de la membrana que contiene la proteína de interés (60 kDa) y se envía a secuenciación.

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I.1.4.3- Preparativos con vistas a la secuenciación de péptidos internos

Para visualizar las proteínas en el gel, se utiliza un protocolo de coloración con Amidoschwarz ligeramente diferente del utilizado para colorear la membrana PVDF. Después de la migración, se fija el gel dos veces durante 30 minutos con una disolución constituida por 50% de metanol, 10% de ácido acético y 40% de agua miliQ. Se realiza la coloración con una disolución constituida por 45% de metanol, 10% de ácido acético, 45% de agua, 0,003% de Amidoschwarz (p/v). Las proteínas aparecen progresivamente. Cuando la coloración es suficiente para identificar la proteína, se aclara abundantemente el gel con agua miliQ. Se corta la banda de interés y después se deshidrata con Speed-vac (Savant). Se envía a secuenciación la banda de gel, que ha perdido aproximadamente un tercio de su longitud. Se obtienen los péptidos internos después de digestión de la proteína con endoproteasa Lys-C (pureza de secuenciación de Boehringer). Se digiere la proteína en el gel de poliacrilamida en 150 \mul de tampón Tris-HCl pH 8,6 (0,1 M) que contiene 0,03% de SDS a 35ºC durante 18 horas en presencia de 0,4 \mug de endoproteasa Lys-C. Se inyecta la proteína digerida sobre la columna HPLC DEAE-C18 (1 mm de diámetro) y se eluyen los péptidos utilizando un gradiente de acetonitrilo (de 2 a 75%) que contiene TFA al 0,1%. La endoproteasa Lys-C escinde específicamente los polipéptidos del lado carboxílico de las lisinas.

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I.1.5.1- Validación teórica utilizando el gen MndD de Arthrobacter globiformis

Se amplifica una parte (867 pb) del gen MndD mediante PCR utilizando los cebadores "OZ-MndD-S711": ACGTCACCGA AGAGGATGAA AAC y "OZ-MndD-AS1578": ACGGCCATTT CGGACTTTTC. Se realiza la PCR utilizando el programa siguiente: 95ºC 5 min; 25 ciclos: 95ºC 45 s, 56ºC 45 s; 72ºC 1 min; 72ºC 5 min; 4ºC en espera. La mezcla de reacción comprende 200 a 500 \muM de dNTP, 20 a 200 ng de ADN cosmídico o genómico y 100 pmol de cada cebador en un volumen final de 50 \mul.

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I.1.5.2- Identificación mediante PCR de una parte del gen que codifica la HPP oxidasa

Se realiza la PCR utilizando el kit "Advantage®-GC Genomic PCR" (Clontech). Este kit comprende, entre otros, un coadyuvante basado en betaína "GC-melt" y una mezcla de polimerasas termorresistentes, principalmente con la Thermus thermophilus (Tth). Se realiza la amplificación sobre ADN genómico de Arthrobacter globiformis, utilizando la programación siguiente: 94ºC 5 min; 30 ciclos: 94ºC 20 s, 60ºC 30 s, 72ºC 3 min; 72ºC 6 min; 4ºC en espera. Las condiciones de reacción son dNTP 400 \muM, 50 ng de ADN genómico, 100 pmol de cada cebador, "GC melt" 1X, para un volumen de reacción de 50 \mul. En estas condiciones, se amplifica una banda de 937 pb que se denomina Z2.

La amplificación mediante PCR puede realizarse también utilizando la Tth de Epicentre o la Tbr (Thermus brockianus - Finnzyme). La Tbr es la única polimerasa termorresistente ensayada que puede realizar la PCR sin aditivos (DMSO, glicerol, betaína); además, es una enzima de alta fidelidad.

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I.1.6- Cribado del banco cosmídico

Se realiza el cribado del banco cosmídico utilizando la técnica de sondas frías marcadas con digoxigenina (Boehringer Mannheim, 1995).

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I.1.6.1- Preparación de la sonda Z2-Dig

Se hace el marcaje de la sonda con digoxigenina mediante PCR en un volumen final de 50 \mul, en las condiciones definidas en el apartado II.5.2, excepto por la mezcla de dNTP, constituida por: dUTP-Dig 90 \muM; dTTP 135 \muM; dATP 225 \muM; dCTP 225 \muM; dGTP 225 \muM. Se cuantifica la sonda amplificada depositando 3 \mul de la reacción sobre un gel de agarosa al 0,8%. Aparece un ligero ruido de fondo, es decir, que la PCR no es suficientemente específica. Con el fin de evitar cualquier problema posterior, se deposita la totalidad de la PCR sobre el gel y se extrae la banda de interés utilizando el kit Qiaex II (Qiagen).

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I.1.6.2- Transferencia del banco cosmídico sobre membrana Hybond N

Se utiliza el almacenamiento en glicerol del banco cosmídico realizado en HB101 de E. coli HB101 para inocular 2 ml de medio LBT^{15}. Después de 8 horas de crecimiento, se estima la DO_{600}; se realizan diluciones en cascada con el fin de extender aproximadamente 1000 clones por cubeta (144 cm^{2}). Después de 16 horas de crecimiento a 37ºC, se transfieren las bacterias sobre membranas Hybond N (Amersham) y se lisan siguiendo las recomendaciones de Boehringer Mannheim (1995). Se fija a la membrana el ADN liberado mediante exposición a UV (120 mJ suministrados en 45 s - Stratalinker; Stratagène). Se liberan las membranas de desechos celulares realizando el tratamiento con proteinasa K como se postula por Boehringer Mannheim (1995).

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I.1.6.3- Prehibridación-hibridación-detección

Se hacen las etapas de prehibridación e hibridación en una bolsa dispuesta sobre una plataforma basculante utilizando la técnica de hibridación con sonda marcada con digoxigenina (Boehringer Mannheim, 1995). Se realiza la prehibridación (5x SSC; 0,5% de SDS; 0,1% de N-laurilsarcosina; 1% de agentes bloqueantes (Boehringer Mannheim, ref: 1096-176. 100 \mug.ml^{-1} de esperma de salmón sometido a sonicación y desnaturalizado) durante 4 horas a 65ºC. Se hace la hibridación de la membrana durante una noche a 68ºC (medio de prehibridación fresco que contiene 20 ng.ml^{-1} de sonda marcada con digoxigenina y desnaturalizada durante 5 min a 100ºC). Al día siguiente, se eliminan el exceso de sonda y las hibridaciones específicas mediante cuatro lavados con tampón A (0,5xSSC; 0,1% de SDS, 65ºC). Se equilibran entonces las membranas durante 5 min a temperatura ambiente en tampón B (ácido málico 138 mM, NaCl 142 mM, ajustado a pH 7,5 con lentejas de sosa, 0,3% de Tween 20). Después, se saturan con agentes bloqueantes (Boehringer Mannheim) durante 30 minutos antes de hibridar con el anticuerpo anti-digoxigenina acoplado a fosfatasa alcalina ("Antidigoxigenina-AP, fragmentos Fab"; Boehringer Mannheim) diluido a 1/10000 en una disolución reciente de agentes bloqueantes. Después de 30 minutos, se aclaran las membranas dos veces durante 15 minutos en tampón B, y después se equilibran durante 5 minutos en tampón de reacción de fosfatasa alcalina (Tris 0,1 M; NaCl 0,1 M; MgCl_{2} 0,05 M pH 9,5). Se recuperan las membranas con 1 ml de CSPD listo para emplear y después se incuban durante 15 min a 37ºC. Esta etapa a 37ºC permite una activación rápida de la fosfatasa alcalina acoplada al anticuerpo. Se revelan las membranas exponiendo las Hyperfilm® ECL (Amersham) durante 1 a 15 minutos.

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I.1.6.4- Análisis de cósmidos positivos mediante Southern y PCR

Los cósmidos identificados en la hibridación sobre membrana se confirman mediante PCR y mediante la técnica Southern. En este caso, el ADN cosmídico, purificado mediante lisis alcalina (Maniatis et al., 1982), se digiere con enzimas de restricción y después se separa sobre gel de agarosa al 0,8%. Se transfieren los geles sobre membrana Hybond N^{+} (Amersham) mediante la técnica Southern en 20 x SSC (Ausubel et al., 1995). Después de la transferencia, se aclara la membrana con 2x SSC y después se fija el ADN a la membrana gracias a UV (120 mJ suministrados en 45 s - Stratalinker; Stratagène). Se revela entonces la membrana utilizando la técnica de sonda fría descrita anteriormente.

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I.1.7- Vectores de clonación y bacterias hospedadoras

Se clonan las secuencias de ADN amplificadas mediante PCR generalmente en el plásmido pGEMT-easy (Proméga) que permite un cribado mediante la técnica "azul-blanco". Para la sobreexpresión, se utiliza el plásmido pKK223-3 (Pharmacia) que coloca al gen bajo la dependencia de un promotor tac. Las clonaciones se realizan generalmente utilizando DH5\alpha de E. coli (New England Biolabs) o XL1 Blue de E. coli (Stratagène). Para la sobreexpresión, se preferirá BL21 (DE3) de E. coli.

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I.1.8- Actividad enzimática de la acetolactato sintasa (ALS)

Se mide la actividad acetolactato sintasa (ALS) utilizando el método colorimétrico descrito por Chang y Duggleby (1997). Se conducen las reacciones en microplacas con un volumen total de 250 \mul. Para cada reacción, se incuban 25 \mul de enzima durante 30 min a 37ºC en 225 \mul de medio de reacción constituido por KPi 50 mM pH 7,0; piruvato de sodio 50 mM; TPP 1 mM; MgCl_{2} 10 mM; FAD 10 \muM; Se detiene la reacción mediante la adición de 25 \mul de H_{2}SO_{4} al 10%. Se incuban entonces las microplacas a 60ºC durante 15 min. Después, se añaden 250 \mul de creatina al 0,5% y 250 \mul de \alpha-naftol al 5% en NaOH 4 M (la disolución de \alpha-naftol debe prepararse menos de 10 minutos antes del uso). Se incuba entonces la microplaca durante 15 minutos a 60ºC y después durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aparece un color rojo cereza. Se realiza la lectura a 525 nm (\varepsilon_{M}= 22.700 M^{-1}cm^{-1}).

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I.2- Resultados-discusión

La HPP oxidasa es la primera actividad enzimática que se desea introducir en la planta en el marco de la creación de la vía metabólica que rodea la HPPD. Con el fin de poder identificar el gen que codifica la actividad HPP oxidasa, se desarrollaron diferentes enfoques: (1) la mutagénesis de inserción y por lo tanto la identificación del gen mediante la pérdida de actividad enzimática, (2) la complementación funcional de un microorganismo utilizando un banco genómico, (3) la purificación de la proteína para remontarse a la secuencia nucleica. Es la tercera vía la preferida.

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I.2.1- Purificación de HPPO I.2.1.1- Optimización de las condiciones de cultivo

Antes de comenzar a purificar la proteína, es útil determinar cuáles son las condiciones de cultivo que permiten su expresión en la bacteria. Los resultados de optimización de las condiciones de cultivo muestran que la actividad HPP oxidasa no es detectable cuando el crecimiento de A. globiformis se hace depender de una fuente de carbono tal como succinato, fumarato o glucosa. En contraposición, se detecta actividad HPP oxidasa cuando se cultiva A. globiformis utilizando HPP, tirosina o fenilalanina como única fuente de carbono. Si se aumenta la cantidad de extracto de levadura (por ejemplo, 200 mg.l^{-1} en lugar de 20 mg.l^{-1}), se observa una disminución de la actividad enzimática producida. Basándose en estas observaciones, se define el medio M^{Ag}. Por último, se observa que un cultivo de alta densidad (al inicio de la fase estacionaria; DO_{600}\sim 1) presenta una actividad enzimática HPP oxidasa menor que en el caso de un cultivo en fase exponencial de crecimiento (DO_{600}\sim 0,4).

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I.2.1.2- Ensayos preliminares

Acaba de definirse el medio óptimo para la producción de HPPO, se van a buscar ahora las condiciones que no alteren la estabilidad de la actividad HPP oxidasa en los procesos de purificación. Para las cromatografías que implican a resinas intercambiadoras de aniones y cromatografías en función del pH, es importante conocer la sensibilidad de la enzima al pH y a las sales. Se observa que el pH óptimo está comprendido entre pH 7,0 y 7,8, como ya había demostrado Blakley (1977). La enzima parece poco sensible a las sales (NaCl y KCl) ya que hacen falta concentraciones superiores a 750 mM para observar una bajada de la actividad enzimática. Se conocen ahora las condiciones que permiten una buena expresión de la actividad enzimática y se ha determinado la sensibilidad de la actividad HPP oxidasa a factores que pueden intervenir en la purificación. Por lo tanto, puede comenzar la purificación de HPPO.

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I.2.2.3- Purificación de HPPO

Para purificar la HPPO, se aplica el protocolo descrito anteriormente. Se eluye la actividad enzimática de la DEAE EMD 650S con NaCl 150 a 200 mM en disolución en tampón fosfato 50 mM pH 7,4. Se combinan las fracciones que contienen la actividad enzimática y se conservan durante una noche a 4ºC. Efectivamente, la congelación en esta etapa conlleva una pérdida de actividad. Se cargan a continuación las proteínas sobre una resina Source Q. Se eluye entonces la actividad enzimática con una concentración de NaCl comprendida entre 150 y 200 mM en disolución en tampón fosfato 50 mM pH 7,4. Se combinan las fracciones que contienen actividad enzimática y después se concentran sobre membrana UVIKON de 10 kDa, y se conservan a 4ºC durante una noche. Por último, se purifica la HPPO en una tercera etapa aplicando un gradiente de fosfato sobre columna de hidroxiapatito. Se eluye la actividad con una concentración de fosfato cercana a 30 mM. Se analizan entonces las fracciones que contienen la actividad enzimática HPP oxidasa, a la salida de la columna de hidroxiapatito, sobre un gel PAGE-SDS al 8,5%, coloreado con nitrato de plata. El gel presenta la evolución de dos bandas proteicas. Mediante comparación entre el perfil de actividad enzimática y el perfil de elución de proteínas, se considera que la HPPO corresponde a la proteína de más alto peso molecular (aproximadamente 60 kDa). En el presente ensayo, se inicia la purificación con 1,5 g de proteínas solubles extraídas de A. globiformis y se han recuperado 150 \mug de una mezcla de proteínas (de las que aproximadamente 70 \mug de HPPO). No se ha determinado el factor de purificación en términos de actividad específica. Efectivamente, se utilizan condiciones de reacción total para seguir la elución de la actividad enzimática. Además, el problema era más la identificación de la proteína que la puesta a punto de un protocolo de purificación. El análisis de HPLC de las reacciones realizadas al término de cada etapa de purificación muestra la aparición de un producto que presenta el mismo tiempo de retención que el 4-HPA patrón (SIGMA). Se transfieren 40 pmol de la proteína HPPO (60 kDa) sobre una membrana de PVDF y se envían a secuenciación al mismo tiempo que 40 pmol de la proteína incluida en el gel de acrilamida. Las proteínas transferidas sobre membranas sirven para determinar la secuencia N-terminal, mientras que las proteínas incluidas en el gel se utilizan para determinar la secuencia de péptidos internos.

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I.2.2.4- Resultados de secuenciación de HPPO

Se obtienen pocos péptidos internos al término de la HPLC después de la digestión de HPPO con la endoproteasa Lys-C. Este resultado sugiere que la proteína contiene poca lisina, efectivamente la endopeptidasa Lys-C corta después de las lisinas. Si la lisina es poco frecuente, la digestión con endopeptidasa K genera fragmentos peptídicos largos que quedan adsorbidos en la columna y no pueden eluirse, aunque se utilicen condiciones muy hidrófobas. Basándose en la forma de los picos cromatográficos, así como en la cantidad aparente, se seleccionan a continuación tres péptidos en secuencia. Su denominación es función de su orden de salida de la columna de HPLC: péptido Nº 4, péptido Nº 6, péptido Nº 11. Su secuencia es, respectivamente: (A) WWAEALK, AAAGRILRLL DDAAGANASK, XDNRFTAVDF XT (en la que X es un aminoácido no determinado). La secuencia de los 30 primeros aminoácidos N-terminales se obtiene con un rendimiento inicial del 40%: TSLTVSGRVA QVLSSYVSD VFGVMGNGNV Y. No se encuentra el aminoácido (metionina o valina) correspondiente al codón de inicio (ATG o GTG). El rendimiento inicial obtenido (15 pmol de BSA equivalente), comparado con el obtenido para los péptidos internos (30 a 35 pmol de BSA equivalente), sugiere que una parte de las proteínas estaban bloqueadas en el extremo N. La secuencia N-terminal y las secuencias internas obtenidas no presentan ninguna homología en las bases de datos. Basándose en las secuencias peptídicas obtenidas, se sintetizan oligonucleótidos degenerados con el fin de identificar el gen HPPO mediante PCR.

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I.2.3- Validación de técnicas de PCR e identificación de una parte del gen hppO I.2.3.1- Validación de técnicas de PCR

El contenido de bases de guanina y citosina (% GC) de la mayoría de los ADN genómicos de Arthrobacter sp. está comprendido entre 59 y 66%, sin embargo, es de 67 a 69% para A. agilis (antiguamente Micrococcus agilis) (Koch et al., 1995), de 70% para A. atrocyaneus (Jones et al., 1991) y de 73% para un Arthrobacter sp. identificado en los hielos árticos (Junge et al., 1998). Estos altos contenidos de guanina y citosina pueden volver más difícil la aplicación de la PCR. Por esta razón, se han validado estos métodos de PCR (ADN genómico, polimerasas, ...) utilizando el gen que codifica la "dioxigenasa dependiente de manganeso" (MndD) de Arthrobacter globiformis (Boldt et al., 1995). Esta enzima de la vía de degradación de HPP cataliza la apertura del ciclo aromático del acetato de 3,4-dihidroxifenilo. Para el control de la amplificación del gen MndD, se han ensayado polimerasas termorresistentes de Thermophilus aquaticus (Taq) comercializadas por diferentes fabricantes (Perkin Elmer, ATGC, Appligène, Qiagen, Sigma). En todos los casos, se obtiene la amplificación del gen MndD. Sin embargo, en condiciones equivalentes, utilizando los cebadores degenerados que codifican los péptidos de HPPO, no se obtiene la amplificación del gen hppO aunque se utilicen aditivos (DMSO, glicerol).

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I.2.3.2- Identificación mediante PCR de la parte N-terminal del gen hppO

Se amplifica de manera específica una secuencia de ADN de 936 pb que podría corresponder a la parte N-terminal del gen hppO. Se obtiene la amplificación utilizando por un lado los cebadores degenerados Ox3: TTNGCNCCNG CNGCRTCRTC y OZ10N: GAYGTNTTYG GNGTNATGGG NAAYGG correspondientes respectivamente a una parte del péptido nº 6 y a una parte de la secuencia peptídica N-terminal y por otro lado el kit "Advantage GC Genomic PCR" (Clontech). El kit de Clontech está concebido para realizar PCR sobre genomas ricos en bases GC. Contiene una mezcla de polimerasas termorresistentes (entre ellas Tth) y un aditivo basado en betaína. La Tth es una polimerasa termorresistente purificada a partir de Thermus thermophilus. La degeneración de cada cebador es de 1024, es decir, que un cebador de cada 1024 presenta la secuencia nucleica exacta del gen buscado. La degeneración proviene del hecho de que un aminoácido puede estar codificado por varios codones, por ejemplo, la alanina está codificada por cuatro codones (GCA, GCC, GCG, CGT). El código de degeneración utilizado para los cebadores se define como sigue: N = A o T o G o C; R = A o G; Y = T o C. Las temperaturas teóricas de hibridación son respectivamente de 55,4ºC y 57,6ºC. A pesar de una temperatura de hibridación de 60ºC utilizada en la PCR, el cebador OX3 sólo permite amplificaciones no específicas. Se ha amplificado mediante PCR un fragmento de ADN de 936 pb de manera específica utilizando dos cebadores degenerados. Se debe asegurar que este ADN amplificado corresponde exactamente al gen hppO buscado.

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I.2.4- Características del fragmento de ADN de 936 pb

Se purifica el fragmento de ADN de 936 pb, amplificado por PCR, sobre gel de agarosa. Se clona entonces en pGEM-T easy, según las instrucciones del fabricante, y después se secuencia. Cuando se traduce la secuencia nucleica obtenida, se observa que codifica por los dos extremos la totalidad del péptido nº 6 y una buena parte de la secuencia N-terminal. Por lo tanto, se asegura haber amplificado una parte del gen que codifica la proteína purificada y microsecuenciada, HPPO. Al contener la secuencia nucleica un 73% de bases de guanina (G) y citosina (C), se observa además la posible formación de estructuras secundarias denominadas "en horquilla" (stem-loop( en las 250 primeras bases del ARN mensajero. Este alto contenido en bases G y C, así como la existencia de estas estructuras secundarias, pueden explicar en parte las dificultades encontradas para llegar a la amplificación mediante PCR de una parte de este gen. La secuencia nucleica de 936 pb, así como la secuencia proteica correspondiente, no presentan homologías con las secuencias registradas en las bases de datos. Se posee ahora una secuencia de 936 pb con orientación N-terminal hacia el péptido interno nº 6. La proteína comprende aproximadamente 60 kDa, mientras que se busca un gen de aproximadamente 1650 pb. Quedan por lo tanto por identificar aproximadamente 700 pb. Para esto, se va a cribar el banco genómico de A. globiformis realizado en el cósmido pLAFR5 y amplificado en HB101 de E. coli.

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I.2.5- Cribado del banco cosmídico de A. globiformis

Se transfiere a membrana el banco genómico realizado y después se criba utilizando, como sonda, el fragmento de ADN de 936 pb marcado con digoxigenina. El protocolo estándar está adaptado para un ADN "clásico" (60% de AT), mientras que el fragmento de 936 pb presenta una proporción estimada de 23% de AT. Si se mantiene la misma relación de dUTP-Dig/dTTP que en el caso de un ADN clásico, se obtiene una sonda débilmente marcada cuya detección es menos sensible. Por lo tanto, se ha optimizado la proporción de dUTP-Dig/dTTP necesaria para el marcaje de la sonda (apartado II.7.1). El cribado del banco genómico ha permitido identificar cuatro cósmidos (Cos1A, Cos2A, Cos4A, Cos17A1) que tienen perfiles de restricción diferentes. Al comparar los resultados de hibridación Southern obtenidos a partir de cósmidos con los obtenidos a partir de ADN genómico de Arthrobacter globiformis, se selecciona el cósmido 2A. La figura nº 14 ilustra el paso utilizado tomando como ejemplo la digestión de cósmidos por la enzima de restricción NotI. Se observa en primer lugar que el vector cosmídico pLAFR5, digerido con NotI, no hibrida con la sonda Z2-Dig. En contraposición, se observa que el cósmido 1A presenta una sola banda de hibridación a 2,3 kb mientras que los cósmidos 2A, 4A y 17A presentan dos bandas de hibridación a 4,3 y 2,3 kb. Ahora bien, la digestión del genoma de A. globiformis con NotI produce dos bandas de 4,3 y 2,3 kb; de hecho se considera que el cósmido 1A no contiene toda la información que se busca. Basándose en otras restricciones y utilizando un paso equivalente, se eliminan los cósmidos 4A y 17A. Se secuencia entonces el cósmido 2A sobre una distancia de aproximadamente 3 kb a ambos lados del sitio NotI identificado a mitad de la sonda Z2-Dig. Los resultados de hibridación del ADN genómico muestran además que el gen está presente en una sola copia. Se ha identificado el cósmido 2A que se ha secuenciado sobre 6,2 kb. Ahora, se va a poder analizar esta secuencia de ADN procedente del genoma de Arthrobacter globiformis.

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I.2.6- Análisis global de 6,2 kb de ADN genómico de Arthrobacter globiformis

Al utilizar el software Vector Nti, se define la posición de los genes potenciales a partir de la secuencia nucleica de 6255 pb obtenida secuenciando el cósmido 2A. Se encuentra que la secuencia de 936 pb, identificada mediante PCR, forma parte de un gen potencial. Este gen potencial corresponde por lo tanto probablemente al gen hppO. Se identifican potencialmente otros cuatro genes (A, B, C, D) (Figura 3) efectuando una búsqueda por homología utilizando el algoritmo BLASTX. El gen A codificaría un transportador de aminoácidos, el gen B codificaría una fosfato de histidinol aminotransferasa; sin embargo, trabajos precedentes muestran que esta enzima posee la actividad tirosina aminotransferasa en la bacteria grampositiva Bacillus subtilis (Nester y Montoya, 1976), el gen C codificaría un regulador de la transcripción, mientras que el gen D codificaría un regulador de operón.

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I.2.7- Análisis del gen hppO I.2.7.1- Descripción general

Sobre la secuencia obtenida de 6256 pb, el gen hppO (en verde) está delimitado en 5' por el codón de inicio ATG en posición 3143 y en 3' por el codón de terminación ATG (en rojo) en posición 4823. El gen presenta por lo tanto una longitud real de 1680 pb. Presenta un alto contenido de bases G y C (71,4% de GC). La búsqueda de homologías al nivel de secuencias nucleicas (BLASTN) no permite ninguna identificación. Con el fin de caracterizar mejor el gen, se buscan los elementos específicos de la transcripción y la traducción.

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I.2.7.2- Elementos que caracterizan la transcripción y traducción del gen hppO

Se identifican las secuencias promotoras potenciales de la transcripción (Figura 4). La secuencia "-10", denominada "secuencia de Pribnow", está situada entre las posiciones 3082 a 3088 (AAAAATA) y la secuencia "-35" está situada en la posición 3055 a 3059 (TTGCA). Las secuencias así definidas son ligeramente diferentes de las secuencias canónicas (respectivamente TATAAT y TTGACA; Singer y Berg, 1992). Esto puede reflejar una interacción débil con los factores que permiten la transcripción constitutiva o bien la interacción necesaria con factores de transcripción diferentes. La adenina en posición 3096 podría ser la base de inicio de la transcripción. Por último, se identifica entre las posiciones 3068 a 3072 (TGTGA) una secuencia correspondiente al sitio de fijación de la proteína CAP (proteína activadora de gen catabólico). El hecho de encontrar este sitio de fijación de la proteína CAP va en la dirección de los resultados obtenidos en la optimización de las condiciones de cultivo. En conclusión, la transcripción del gen hppO está probablemente bajo el control de un promotor débil, especialmente regulado por glucosa. La secuencia de Shine-Dalgarno (Singer y Berg, 1992) permite la fijación de la subunidad ribosómica pequeña. Se identifica (GACGAT; en posición 3131 a 3136) 12 bases cadena arriba del codón de inicio (ATG) de la traducción, por analogía con la secuencia consenso AGGA. Se observa además que la parte 5' terminal (aproximadamente 250 bases) del ARN mensajero es capaz de estructurarse en horquilla (stem-loop). Ahora bien, la estructura secundaria de la región del ARNm flanqueante del ATG iniciador influye en la etapa de inicio de la traducción. Así, el inicio es nulo o poco eficaz cuando el ATG iniciador o la secuencia de Shine-Dalgarno están implicados en un apareamiento intramolecular. Por tanto, puede plantearse la pregunta de un eventual papel regulador de la traducción de estructuras en horquilla observadas.

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I.2.7.3- Expresión de HPPO dependiente del promotor tac

La sobreexpresión de HPPO es interesante para definir las características cinéticas, para permitir la producción de anticuerpos, pero también con vistas al análisis estructural. Se clona el gen en un vector pKK223-3 en dos etapas. Se clona el gen, amplificado mediante PCR, en las condiciones definidas para la identificación del gen hppO y utilizando los cebadores HPP-N-sens (CATGACTTCA CTTACAGTGT CC) y HPP-C-term (CAAACTGAGT AGCAGCTCAG G), en el vector pGEMT-easy. Se selecciona el clon que presenta el gen hppO en dirección contraria al promotor lac. Se digiere entonces con EcoRI. Al hacer esto, se recupera el gen hppO que se inserta en el vector pKK223-3 digerido con EcoRI. Se mantiene el clon pKK3-2, que presenta el gen hppO bajo el control del promotor tac. Cuando se induce la expresión del clon pKK3-2 mediante la adición de IPTG, se puede detectar una actividad HPP oxidasa. Sin embargo, la proteína sobreexpresada (57,4 kDa) no es detectable en un extracto bruto separado sobre gel de acrilamida desnaturalizante. Queda por lo tanto mejorar el protocolo de sobreexpresión. Se considera además clonar HPPO fusionada con una secuencia marcadora (GST, polihistidina, proteína A, ...) con el fin de facilitar la purificación de la proteína sobreexpresada. Se acaba de mostrar definitivamente que el gen identificado codificaba una actividad HPP oxidasa. Sin embargo, al realizar las búsquedas de homología al nivel de secuencias proteicas (BLASTX o BLASTP), se observa que la proteína HPPO presenta hasta un 25% de identidad con acetolactato sintasas (ALS), piruvato oxidasas (POX) y piruvato deshidrogenasas (PDH). Es así posible identificar motivos muy conservados tales como los referentes a la fijación del cofactor TPP (Figura 5). Además, el perfil de hidrofobicidad de HPPO es muy cercano al obtenido para ALS (no mostrado). Con el fin de asegurar que el gen identificado codifica realmente la HPPO y no una ALS, POX o PDH que tiene una actividad adjunta de tipo HPP oxidasa, se decide ensayar en HPPO una eventual actividad adjunta.

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I.2.8- HPPO frente a ALS

Las búsquedas de homología proteica muestran que la HPPO presenta hasta un 25% de identidad con ALS. Este resultado, aunque sorprendente a primera vista, presenta una cierta lógica. Efectivamente, estas dos enzimas utilizan FAD y TPP como cofactores de reacción. Realizan las dos una descarboxilación. Por otro lado, uno de los sustratos de ALS es el piruvato, ahora bien, nuestro sustrato es un piruvato \beta sustituido: el hidroxifenilpiruvato. Por lo tanto, es posible que la estructura del sitio activo sea cercana y como consecuencia que estas proteínas compartan actividades enzimáticas comunes. Se ha utilizado la subunidad grande recombinante y purificada de ALS de Arabidopsis thaliana (Chang y Duggleby, 1997) y de E. coli (Hill y Duggleby, 1998) para servir como control positivo en los experimentos realizados para buscar una actividad ALS en HPPO. Los resultados obtenidos muestran que la HPPO no presenta actividad ALS. Se muestra también en esta ocasión que las dos ALS ensayadas no tienen actividad HPP oxidasa. Por último, se observa que la HPPO no es inhibida por 115 ppm de imazapir (inhibidor de ALS, Cyanamid). Estos resultados muestran que, a pesar de puntos comunes (secuencia proteica e hidrofobicidad), las ALS y la HPPO son enzimas bien distintas, que no tienen actividades enzimáticas secundarias.

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Ejemplo 2 Identificación de genes que codifican la 4-HPA 1-hidroxilasa

La 4-HPA 1-hidroxilasa (HPAH) convierte el 4-HPA en HGA mediante una reacción de hidroxilación acompañada por un desplazamiento de la cadena acetilo. Su actividad se ha caracterizado sobre extractos brutos de S1 de Rhodococcus erythropolis (Suemori et al., 1995) o sobre extractos parcialmente purificados de P. acidovorans (Hareland, 1975). Se ha purificado por Suemori et al. (1996), sin embargo las secuencias proteica y genética no se han publicado. Con el fin de poder introducir esta actividad enzimática en la planta, es necesario identificar el gen.

Son factibles diferentes enfoques: (1) la complementación fenotípica y/o funcional utilizando un banco genómico, (2) la mutagénesis de inserción y por lo tanto la identificación del gen mediante la pérdida de actividad enzimática, (3) la purificación de la proteína para remontarse a la secuencia nucleica. Se ha elegido desarrollar estos tres enfoques con Pseudomonas acidovorans puesto que hay numerosas herramientas de biología molecular cuya eficacia se ha demostrado sobre diferentes especies y cepas de Pseudomonas. A modo de ejemplos, se pueden citar el transposón mini-Tn5 (De Lorenzo et al., 1990), los vectores de amplio espectro de hospedador, tales como pBBRIMCS (Kovach et al., 1994, 1995; D'Souza et al., 2000) y las técnicas de transferencia por conjugación. El transposón mini-Tn5 puede utilizarse para perturbar un gen (de Lorenzo et al., 1990; Fedi et al., 1996; Campos-García et al., 2000) o bien para introducir un gen en el genoma bacteriano (Prieto et al., 1999). Se ha comenzado por el enfoque de complementación fenotípica puesto que parecía el más rápido y el más sencillo. Este enfoque se ha seguido por los otros dos simultáneamente. Sin embargo, no se abordará aquí el enfoque por mutagénesis de inserción, no habiéndose explotado esta vía a continuación.

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II.1 Materiales y métodos II.1.1- Construcción de un banco genómico de P. acidovorans en E. coli

Para construir el banco, se utiliza el cósmido pLAFR5 y el ADN genómico de P. acidovorans. Se utiliza la cepa HB101 del hospedador E. coli.

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II.1.2- Purificación de 4-HPA 1-hidroxilasa II.1.2.1- Ensayo de actividad espectrofotométrica

En la reacción catalizada por 4-HPA 1-hidroxilasa, descrita por Hareland et al. (1975), hay un consumo de oxígeno molecular y de NADH,H^{+}. Se ha elegido medir la actividad enzimática siguiendo la oxidación del NADH,H^{+} a NAD^{+}. El medio de reacción comprende: NADH,H^{+} 300 \muM; FAD 6,7 \muM; KPi 100 mM; DTT 1 mM; 10 a 50 \mug de proteínas. La reacción se desencadena mediante la adición de sustrato: 4-HPA 1 mM. Se sigue la reacción a 340 nm o a 292 nm durante 2 a 10 min. Efectivamente, el consumo de NADH,H^{+} se traduce en una reducción de la absorbancia a 340 nm, mientras que la producción de homogentisato se traduce en un aumento de la absorbancia a 292 nm. El ensayo espectrofotométrico es muy rápido, se utiliza rutinariamente para seguir la elución de proteínas en las etapas de purificación.

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II.1.2.1- Ensayo de actividad mediante HPLC

El análisis de las reacciones enzimáticas mediante HPLC permite confirmar la producción de HGA (tiempo de retención, espectros UV). Se realiza el ensayo enzimático en las mismas condiciones que anteriormente. Sin embargo, se detiene la reacción mediante la adición de un tercio de volumen de ácido perclórico al 20%. Se analizan entonces las reacciones mediante HPLC en elución isocrática con 90% de fase A y 10% de fase B, o 92% de fase A y 8% de fase B. La fase A es agua miliQ que contiene 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) y la fase B corresponde a acetonitrilo. En la elución isocrática a 90%-10%, eluye el HGA en 1,2 min, mientras que en el sistema isocrático a 92%-8% eluye en 1,4 min. La elución se registra generalmente a 230 nm. Van den Tweel et al. (1986) han utilizado 2,2'-bipiridilo (inhibidor de proteína de hierro no hémico) para inhibir la homogentisato dioxigenasa y permitir así la acumulación de HGA. Por esta razón, se añaden en ciertos medios de reacción 2,2-bipiridilo 2 mM. En estas condiciones cromatográficas, es posible identificar 4-HPA y HGA. El equipo de HPLC está constituido por una HPLC Alliance 2690 (Waters) y un detector de fila de diodos 996 (Waters).

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II.1.2.3- Purificación de la proteína HPAH

Se cultiva Pseudomonas acidovorans 48 horas en medio M63 que contiene 4-HPA como única fuente de carbono, a 29ºC y 220 rpm. Se centrifugan las bacterias a 3.000 g durante 15 min a 6ºC (centrífuga J2/21 M/E de Beckmann). Se retoma el sedimento bacteriano en el tampón de sonicación (KPi 0,1 M pH 7,2; MgSO4 1 mM; DTT 1 mM; hidrocloruro de benzamidina 1 mM; ácido caproico 5 mM). El hidrocloruro de benzamidina y el ácido caproico son inhibidores de proteasas. Se realiza la sonicación durante 9 minutos sonicando cada 40 s durante 20 s a potencia 5 (Vibra Cell, Sonic Materials INC., Connecticut, EE.UU.). Durante la sonicación, se mantiene la muestra a la temperatura del hielo fundido. Se centrifuga el extracto sonicado a 15.000 g durante 15 min a 4ºC. Se precipita el sobrenadante recuperado con 1% de sulfato de estreptomicina. Se elimina el precipitado por centrifugación a 15.000 g durante 15 min a 4ºC. Se desala el sobrenadante sobre columna PD10 (Pharmacia) y después se carga sobre columna DEAE/EMD 650 S equilibrada en tampón A (KPi 20 mM pH 7,2, glicerol al 10%, MgSO_{4} 1 mM, DTT 1 mM). Se hace la elución utilizando un tampón B (tampón A; KCl 1 M; FAD 100 \muM). Se eluye la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa por una concentración de KCl cercana a 150 mM. Las fracciones activas, concentradas sobre membrana UVIKON de 10 kDa y desaladas después sobre columna PD10, se depositan entonces sobre una columna de afinidad Red (Red 120 de tipo agarosa 3000 CL, SIGMA Ref R-0503) equilibrada con tampón A (anteriormente). La elución se realiza en dos etapas. La primera es un lavado de la columna Red utilizando el tampón A enriquecido con FAD 50 \muM final. La segunda permite la elución de la proteína; para esto se enriquece el tampón A en FAD (3 mM) y en NADH,H^{+} (10 mM). Se combinan las fracciones que contienen la proteína, se concentran y se congelan a -80ºC.

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II.1.3- Microsecuenciación proteica del extremo N-terminal y de péptidos internos

Se ha utilizado el mismo protocolo que el descrito en el caso de HPP oxidasa para realizar la secuenciación de la proteína purificada. Sin embargo, para producir péptidos internos, se ha digerido la proteína con tripsina en lugar de endopeptidasa Lys-C. La tripsina corta después de argininas y lisinas. La digestión con tripsina conduce generalmente a la obtención de fragmentos más pequeños que los obtenidos en una digestión con endopeptidasa Lys-C. Con el fin de poder secuenciar con precisión los péptidos recuperados, es a veces necesario repurificar mediante HPLC los péptidos recuperados.

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II.1.4- Identificación de una parte del gen que codifica HPAH mediante PCR degenerada

Para la síntesis de cebadores degenerados, se utiliza el código de degeneración presentado en la página 43. Se realiza la PCR en un volumen final de 50 \mul, en tubos de 200 \mul. La disolución de reacción contiene el tampón Perkin Elmer, dNTP 250 \muM, 50 ng de ADN genómico de P. acidovorans y 2 unidades enzimáticas de AmpliTaq (Perkin Elmer). Se realiza la reacción utilizando un termociclador "Hybrid Touchdown": 3 min a 94ºC y después 45 ciclos: 30 s a 94ºC, 1 min a 50ºC, 1 min y 30 s a 72ºC, seguido de una elongación final de 5 min a 72ºC antes de volver a 4ºC. Se evalúa la PCR después de la deposición de 10 \mul sobre gel de agarosa al 1%. En estas condiciones, se identifica una banda de 536 pb.

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II.1.5- Cribado del banco cosmídico de P. acidovorans

Expansión del banco cosmídico sobre medio LBT^{15} y crecimiento durante 16 h a 37ºC. Se transfieren entonces las cubetas a 4ºC. Al cabo de una hora, se transfieren las colonias sobre membranas Hybond N (Amersham) según el método de Grunstein y Hogness (1975). Se hibridan las membranas utilizando el fragmento PCR de 536 pb previamente identificado y purificado. Se realiza la detección con ^{32}P. Se marca la sonda utilizando el kit "DNA Ready to Go" (Pharmacia). Se realizan la prehibridación, hibridación y lavados en matraces. Se prehibridan las membranas en una disolución compuesta por SSC 5x, 6% de Denhardt, 0,5% de SDS durante 4 horas a 68ºC. Se realiza la hibridación durante 16 horas a 68ºC. Se efectúan los lavados a 65ºC en SSC 2x, 0,1% de SDS. Se revelan las membranas exponiendo películas Kodak o Amersham.

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II.1.6- Medio de crecimiento de P. putida

Se cultiva Pseudomonas putida sobre medio rico de Luria-Bertani (LB) o 2YT que contiene 100 \mug.ml^{-1} de rifampicina. En función de las necesidades, se añaden otros antibióticos (ejemplo: tetraciclina 15 \mug.ml^{-1}). Se utiliza el medio mínimo M63 que contiene 1,5 g.l^{-1} de 4-HPA como única fuente de carbono para ensayar la complementación funcional. En este caso, se omiten los antibióticos. Se realizan todos los cultivos a 29ºC.

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II.1.7- Transformación de P. putida mediante electroporación

Se inocula 1 l de medio LB con rifampicina (100 \mug.ml^{-1}) con un cultivo de P. putida puesto en crecimiento a 29ºC durante aproximadamente 16 horas con agitación a 180 rpm. Cuando la DO_{600 \ nm} es cercana a 1,2, se recogen las células mediante centrifugación durante 15 min a 3.000 g, 4ºC. Se elimina el medio de cultivo y se retoman las células con 400 ml de glicerol al 10% a 4ºC. Se centrifugan las células de nuevo a 3.000 g, 20 min, 4ºC. Se efectúan dos nuevas etapas de lavado respectivamente con 200 y después 100 ml de glicerol al 10%, 4ºC. Por último, se retoman las bacterias con 3 a 10 ml de glicerol al 10% y después se reparten en alícuotas de 100 \mul inmediatamente congeladas en nitrógeno líquido. Se conservan las bacterias así preparadas al menos 6 meses a -80ºC. En la preparación, se observa una pérdida de bacterias debido a la lisis. Se introduce el ADN cosmídico (Tet^{R}) mediante electroporación en P. putida (Rif^{R}). La electroporación (Gene Pulser^{TM} de Bio-Rad) de 80 ng de ADN cosmídico en 100 \mul de P. putida electrocompetentes se hace en cubeta de electroporación de 2 mm bajo una tensión de 0,9 V con una resistencia del electroporador de 200 \Omega. En estas condiciones, la constante de tiempo \tau es de aproximadamente 4,5 ms. Después del choque eléctrico, se retoman las células con 900 \mul de LB y se ponen en cultivo durante 1,5 h a 29ºC, 180 rpm. Se seleccionan las P. putida transformadas sobre medio LB Rif^{100} Tet^{15} gelosado.

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II.1.8- Modificación del vector de amplio espectro de hospedador pBBR1MCS-Gm^{R}

Se han utilizado los vectores de amplio espectro de hospedador gramnegativo de la serie pBBR1MCS (Kovach et al., 1994, 1995). Estos plásmidos, que poseen un origen de replicación de Bordetella bronchiseptica, replican a aproximadamente 20-30 copias por célula en E. coli. Contienen dos sitios NotI. Con el fin de facilitar las clonaciones ulteriores, se suprime el sitio NotI presente en el multisitio de clonación (MCS) sobre el plásmido pBBR1MCS-Gm^{R}. Para esto, se corta el plásmido con SfiI (50ºC) y después se trata con ADN polimerasa T4 con el fin de obtener extremos romos. Se religa el plásmido sobre sí mismo (ADN ligasa T4 - New England Biolabs). Después del ligamiento (16 horas, 16ºC), se realiza una digestión con SfiI con el fin de eliminar los eventuales plásmidos "salvajes" y después se electropora DH5\alpha de E. coli. Se aísla el ADN plasmídico de los clones seleccionados sobre medio LB Gm^{20}. Se caracterizan los ADN plasmídicos con dos digestiones: NotI y NotI/BglII. Se mantiene un clon: pBBR1MCS-Gm-Not-U.

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II.1.9- Subclonación de Ccos8 en pBBR1MCS-Gm-U

Se restringe el cósmido Ccos8 con NotI y después se deposita sobre gel de agarosa. Después de la migración, se visualizan 6 bandas de ADN: 1,7-3-4-5-8-10 kpb. Se purifican las bandas por Quiaex II. Por otro lado, se restringe pBBRIMCS-Gm-Not-U con NotI, desfosforilado utilizando fosfatasa alcalina de gamba (S.A.P.; shrimp alkaline phosphatase). Se ligan entonces las diferentes bandas (ADN ligasa T4, 16 horas, 16ºC) en el vector utilizando relaciones "inserto/vector" variables. Se transforman los productos de ligamiento en DH5\alpha de E. coli.

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II.1.10- Conjugación triparental entre E. coli y P. putida

Con el fin de transferir diferentes subclones de Ccos8 (Gm^{R}) de DH5\alpha de E. coli a P. putida (Rif^{R}), se opera mediante conjugación triparental sobre filtro utilizando el protocolo descrito por De Lorenzo et al. (1990). Se extienden las bacterias recuperadas sobre LB Rif^{100}Gm^{20} y sobre M63 que tiene a 4-HPA como única fuente de carbono.

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II.1.11- Eliminación del plásmido p5kbC

Para eliminar rápidamente el plásmido p5kbC de P. putida, se utiliza la estrategia de los orígenes de replicación incompatibles y se fuerza la pérdida de p5kbC con la ayuda de antibióticos. Se transforma P. putida (Rif^{100}) complementada con el plásmido p5kbC (Gm^{R}) con pBBR1MCS Kn^{R}. Se verifica en los clones obtenidos (Rif^{100} Gm^{R} Kn^{R}) su actividad de complementación. Se cultivan entonces los clones sobre dos medios: LB Rif^{100} Kn^{150} Gm^{20} y LB Rif^{100} Kn^{150}. Al hacer esto, se mantiene la presión de selección para p5kbC y pBBR1MCS Kn^{R} o bien solamente para pBBR1MCS Kn^{R}. Se realizan los crecimientos a 29ºC. Se realiza el repicado cada tres días. Al octavo repicado, se repican las colonias sobre 4 medios diferentes (M63, M63 + 4-HPA, LB Rif^{100} Kn^{150} Gm^{20} y LB Rif^{100} Kn^{150}) cualquiera que sea la placa de origen. Se señala el estado de crecimiento al cabo de 2 y 7 días.

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II.1.12- Identificación de proteínas que participan en la actividad enzimática II.1.12.1- Preparación de extractos brutos de P. putida

Se cultivan dos clones de P. putida sobre LB Gm^{20} durante 24 horas. El primero comprende el plásmido pBBRIMCS-Gm-Not-U, mientras que el segundo contiene el plásmido de complementación p5kbC. Después de sonicación en un tampón (KPi 0,1 M; MgSO_{4} 1 mM; DTT 1 mM; hidrocloruro de benzamidina 1 mM; ácido caproico 5 mM) y después de centrifugación a 20.000 g durante 10 min a 4ºC, se ensaya en el sobrenadante su actividad 4-HPA 1-hidroxilasa utilizando los dos métodos de medida de la actividad enzimática. Se analizan además los extractos brutos mediante PAGE-SDS al 10%.

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II1.12.2- Transferencia sobre membrana, secuenciación N-terminal

Se realiza la secuenciación como en el ejemplo I.

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II.1.12.3- Filtración en gel S75

Se concentra el eluido (5 ml) por un factor de 10 utilizando un Macrosep^{TM} 10 K (Pall Filtron) durante 2 horas a 4ºC. Se inyectan los 500 \mul concentrados sobre una columna de filtración en gel Superdex^{TM} 75 prep grade (HiLoad 16/60, Pharmacia) previamente equilibrada con 700 ml de tampón (KPi 0,02 M pH 7,2; 10% de glicerol; MgSO_{4} 1 mM; DTT 1 mM; 4ºC) a un caudal de 0,7 ml.min^{-1}. Se realiza la cromatografía a 4ºC con un caudal de 1 ml.min^{-1}. Se recogen las fracciones cada minuto y se conservan a 4ºC.

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II1.12.4- Construcción de pBBR1MCS FT12\Delta1

Para construir el plásmido pBBR1MCS FT12\Delta1, se utiliza una estrategia de clonación en dos etapas. Se digiere el plásmido p5kbC con NsiI y NotI. Se clona entonces el inserto obtenido, que codifica los genes 1, hpaH y 3, en pBBRIMCS-Gm-Not-U digerido con PstI y NotI. El clon resultante, denominado pBBR1MCS FT12, se restringe con HindIII y AscI, y después se hacen romos los extremos y por último se religan. Al hacer esto, se destruyen los genes 1 y 3 y el gen hpaH se encuentra dependiendo del promotor lac del vector original. Se obtiene así el plásmido pBBR1MCS FT12\Delta1 (Figura 6).

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II.1.12.5- Construcción de pL1lac2

El laboratorio posee un plásmido denominado "clon L". Esta construcción corresponde a la clonación del promotor y del gen de HPPD de P. fluorescens en el vector pBBR1MCS-Kn^{R}. El promotor del gen HPPD es funcional en P. putida y en E. coli. Se digiere el plásmido "clon L" con BamHI y HindIII, lo que permite recuperar el inserto que contiene el promotor y el gen de HPPD de P. fluorescens. Se liga entonces este inserto en el vector pBBR1MCS-Gm^{R} digerido con BamHI y HindIII. Se denomina al clon resultante pBBRG-L-HPPD. Se liga el plásmido obtenido, digerido con NcoI para eliminar el gen que codifica HPPD, con el gen hpaC amplificado mediante PCR y digerido con AflIII. Se llama a la construcción obtenida pBBRG-L-ORF1. Para la amplificación del gen hpaC mediante PCR, se utilizan cebadores que permiten introducir un sitio AflIII al inicio y al final del gen (el sitio AflIII es compatible con el sitio NotI). Los cebadores utilizados son: en 5' del gen: GCAGGATGCA CATGTCCACC AAGAC y en 3' del gen: CGGACGCCGA CATGTATCAG CCTTC. Se realiza la PCR utilizando 1 unidad de polimerasa KlenTaq (Sigma), dNTP 250 \muM, 200 nM de cada cebador y 50 ng del plásmido p5kbC. Se define el programa de PCR como sigue en Perkin Elmer 9600: 3 min a 95ºC; y después 20 ciclos: 94ºC durante 1 min, 60ºC durante 30 s, 68ºC durante 3 min; por último, se realiza una última etapa de 10 min a 68ºC. Se restringe el plásmido pBBR1MCS FT12\Delta1 obtenido anteriormente con SspI y NotI. Se vuelve romo el sitio NotI mediante tratamiento con Pfu. Se liga el fragmento recuperado (2468 pb), que contiene el gen hpaH dependiente del promotor lac, en pBBRG-L-ORF1 digerido con SspI. El clon que presenta los genes hpaC y hpaH en dirección contraria se denomina pL1lac2. Todas estas clonaciones se realizan en DH5\alpha de E. coli.

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II.2- Resultados

Son factibles diferentes enfoques para identificar el gen que codifica la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa de P. acidovorans. Se decide en un primer momento utilizar un enfoque mediante coloración fenotípica. Este enfoque parece sencillo y rápido. Efectivamente, se posee en el laboratorio una herramienta de cribado fenotípico para detectar la producción de HGA. Ahora bien, la enzima que se busca convierte el 4-HPA en HGA.

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II.2.1- Enfoque mediante coloración fenotípica

Se ha observado en laboratorio que K12 de E. coli no puede crecer utilizando tirosina o 4-HPA como única fuente de carbono. Por otra parte, se sabe que K12 de E. coli posee actividad tirosina aminotransferasa que permite la síntesis de tirosina a partir de HPP. Esta actividad enzimática es reversible, pudiendo por tanto la célula producir HPP a partir de tirosina. Si el medio de cultivo rico se enriquece en tirosina (1 g.l^{-1}), se importa la tirosina en las bacterias, que la acumulan y después la transforman en HPP, según la constante de equilibrio de la reacción de conversión entre HPP y tirosina. En el laboratorio, se ha observado ya que si se introduce HPPD de P. fluorescens en K12 de E. coli, entonces el producto HPP en la desaminación de tirosina se transforma en homogentisato (HGA). Al ser irreversible la reacción catalizada por HPPD, se acumula el HGA en la célula, donde se oxida y después de polimeriza espontáneamente formando un pigmento ocronótico que presenta una coloración marrón. Se tiene así por lo tanto un medio para detectar la producción de HGA. La 4-HPA 1-hidroxilasa buscada convierte el 4-HPA en HGA. Se extienden por lo tanto las HB101 de E. coli que contienen el banco genómico de Pseudomonas acidovorans sobre medio 2YT gelosado enriquecido en 4-HPA. Después de 2 días, se ennegrecen dos colonias: producen por lo tanto homogentisato. Sin embargo, las actividades enzimáticas percibidas sobre los extractos brutos de estos dos clones revelan una actividad enzimática de tipo HPPD, mientras que la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa buscada es escasa, hasta inexistente. A priori, este enfoque ha permitido seleccionar clones cuyo cósmido contiene el gen que codifica una HPPD de P. acidovorans y no la 4-HPA 1-hidroxilasa. En el estudio preliminar in vitro sobre los extractos brutos de P. acidovorans, no se ha identificado actividad HPPD. Se puede suponer que la actividad HPPD de P. acidovorans se expresaría cuando la bacteria se cultivara sobre medio rico, mientras que la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa se expresaría cuando el 4-HPA fuera la única fuente de carbono. Al no permitir este enfoque la identificación de 4-HPA 1-hidroxilasa, se decidió purificar la enzima. Una vez identificada la proteína, será posible remontarse al gen correspondiente.

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II.2.2- Purificación de la 4-HPA 1-hidroxilasa

Para seguir la purificación de la proteína, se utiliza la valoración de su actividad NADH,H^{+} oxidasa dependiente de 4-HPA. Se purifica así la proteína hasta casi homogeneidad aplicando el protocolo de purificación descrito anteriormente. El factor de enriquecimiento de la actividad específica de NADH,H^{+} oxidasa está generalmente comprendido entre 50 y 100 según las preparaciones. Sobre PAGE-SDS, la proteína presenta un peso molecular aparente de 60 kDa. De hecho, se observa que la actividad NADH,H^{+} oxidasa y la producción de HGA son bien visibles a la salida de DEAE/EMD 650S. En contraposición, a la salida de la columna de afinidad, la producción de HGA es muy difícilmente detectable; la actividad NADH,H^{+} oxidasa queda sin embargo dependiente de la adición de 4-HPA en el medio de reacción. Si se parte de la hipótesis de que la enzima es monomérica, la pérdida de actividad catalítica que permite la producción de HGA se puede explicar suponiendo que una parte de la proteína se ha dañado (ej: pérdida de un cofactor fuertemente ligado) en su paso por la columna Red. El sitio que cataliza la oxidación de NADH,H^{+} no se habría afectado. Se puede suponer también que la enzima buscada es un heterodímero. La pérdida de actividad catalítica se explicaría entonces por la pérdida del monómero responsable de la producción de HGA. En la bibliografía, se han identificado numerosas monooxigenasas heterodiméricas de flavina, teniendo todas un sustrato aromático, en especies bacterianas variadas (Adachi et al., 1964; Arunachalam et al., 1992, 1994; Prieto et al., 1993; Prieto y García, 1994; Arunachalam y Massey, 1994; Takizawa et al., 1995; Xun, 1996; Xun y Sandvik, 2000). Sin embargo, existen dos hipótesis para explicar el funcionamiento de estas enzimas heterodiméricas:

1.

Arunachalam et al. (1992, 1994) proponen que la 4-hidroxifenilacetato 3-hidroxilasa de P. putida está constituida por una flavoproteína homodimérica de 65 kDa así como una proteína de acoplamiento de 38,5 kDa. La flavoproteína sola es capaz de oxidar NADH,H^{+} independientemente de la presencia de 4-HPA. Esta oxidación de NADH,H^{+} permite renovar el "conjunto" de NAD^{+}, pero produce H_{2}O_{2} en proporciones estequiométricas. Si se añade la proteína de acoplamiento, el complejo proteico se vuelve capaz de hidroxilar el 4-HPA a ácido 3,4-dihidroxifenilacético. Así, no se desperdicia la oxidación de NADH,H^{+} y permite la síntesis de un metabolito. La proteína de acoplamiento sola no tiene actividad enzimática.

2.

Prieto et al. (1993, 1994) y Xun y Sandvik (2000) sugieren que la 4-HPA 3-hidroxilasa de W de E. coli (ATCC 11105) sea considerada como un nuevo miembro de las monooxigenasas de flavina de dos componentes móviles (TC-FDM). Los dos componentes serían por un lado la 4-hidroxifenilacetato 3-hidroxilasa, una enzima monomérica de 59 kDa codificada por el gen HpaB, y por otro lado una flavina: NADH oxidorreductasa monomérica de 19 kDa, codificada por el gen HpaC. En este caso, se reduce el FAD a expensas de NADH,H^{+} por la flavina:NADH,H^{+} oxidorreductasa. Se utiliza entonces el FADH_{2} por la oxigenasa para permitir la oxidación del sustrato utilizando el oxígeno molecular.

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La enzima que se ha purificado oxida fuertemente el NADH,H^{+}, pero produce muy poco homogentisato. Además, la oxidación del NADH,H^{+} depende de la adición de 4-HPA. Esto sugiere que se posee una enzima del tipo descrito por Prieto et al. Se considera por lo tanto que la enzima purificada es la 4-HPA 1-hidroxilasa (HPAH) buscada. Es posible que, a continuación, sea necesario identificar una proteína de acoplamiento para optimizar la actividad enzimática. Por lo tanto, el enfoque bioquímico puede proseguirse con la proteína purificada.

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II.2.3- Obtención de péptidos internos y de la secuencia N-terminal

Se envía la proteína purificada al Instituto Pasteur para microsecuenciarse. Es así como se obtiene la secuencia N-terminal SHPAISLQAL RGSGADIQSI HIPYER y 6 péptidos internos llamados respectivamente péptidos nº 11C, 12D, 20A, 22B, 23, 24 en función de su orden de salida de la columna: ATDFITPK, LGVGQPMVDK, VVFAGDSAHG VSPFX, VTALEPQAEG AL, IDFQLGWDAD PEEEK, LSVPATLHGS ALNTPDTDTF. Sobre la secuencia N-terminal, no se encuentra el aminoácido (metionina o valina) correspondiente normalmente al codón de inicio del gen (ATG o GTG). Los análisis de homología en las bases proteicas utilizando el algoritmo BLASTP no permiten identificar proteínas homólogas. Basándose en las secuencias proteicas obtenidas, se hacen sintetizar los correspondientes oligonucleótidos degenerados. Estos se utilizan en reacciones de PCR con el fin de identificar una parte del gen que codifica la proteína HPAH purificada y parcialmente secuenciada.

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II.2.4- Obtención del fragmento de PCR

Se obtiene la amplificación mediante PCR de una porción (536 pb) del gen que codifica la 4-HPA 1-hidroxilasa utilizando los cebadores degenerados Hy4R: TCYTCNGGRT CNGCRTCCCA y Hy5F: GGNGTNGGNC ARCCNATGGT que codifican respectivamente los péptidos 23 y 12D. Estos cebadores tienen una temperatura de hibridación de 55,4ºC y presentan una degeneración de 128 y 512, respectivamente. Se clona la secuencia amplificada en el vector pGEMT-easy y después se secuencia. El análisis de la secuencia obtenida permite encontrar, además de las secuencias que codifican los péptidos Hy4R y Hy5F, la secuencia nucleica que codifica el péptido interno 22B. Este último elemento permite confirmar que se ha amplificado bien una parte del gen que codifica la proteína HPAH purificada. En esta etapa, las búsquedas de homología en las bases proteicas, utilizando el algoritmo BLASTX, hacen surgir algunas homologías débiles con hidroxilasas, oxidasas y monooxigenasas. Utilizando la secuencia de 536 pb amplificada mediante PCR, se puede cribar un banco cosmídico de P. acidovorans con el fin de buscar el cósmido que contiene el gen completo.

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II.2.5- Cribado del banco cosmídico de P. acidovorans

El cribado del banco cosmídico, utilizando como sonda la secuencia obtenida anteriormente, ha permitido identificar 4 grupos de cósmidos considerados como diferentes basándose en sus perfiles de restricción e hibridación después de transferencia por la técnica Southern. Los cósmidos nº 1, 2 y 6 forman el primer grupo, los cósmidos nº 3, 7 y 9 forman el segundo, mientras que los cósmidos nº 5 y 8 forman el tercero. El último grupo está representado por el cósmido nº 4. Los resultados de hibridación sugieren además que el gen hpaH buscado está presente en un solo ejemplar en el genoma de Pseudomonas acidovorans. Se han identificado cósmidos que comprenden al menos una parte del gen que codifica la proteína HPAH purificada. Entre tanto, se ha observado que la P. putida era incapaz de crecer sobre 4-HPA, pero que podría crecer utilizando HGA como única fuente de carbono. Se posee por tanto ahí un excelente cribado para la complementación funcional; se podría definir así cuál de estos cósmidos comprende el gen funcional que codifica la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa.

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II.2.6- Complementación funcional con cósmidos

Se introducen los nueve cósmidos identificados anteriormente en P. putida mediante electroporación. Se repican entonces los clones obtenidos sobre medio M63 que contiene 4-HPA como única fuente de carbono. Al cabo de 7-8 días, sólo las bacterias que poseen el cósmido nº 8 han conseguido crecer. Es decir, que sólo el cósmido nº 8 contiene toda la información expresable que permite la conversión de 4-HPA en HGA utilizable por P. putida. El cósmido se denomina entonces Ccos8. Se repite la transformación con el conjunto de cósmidos. Sigue siendo el cósmido 8 el que permite la complementación después de un cierto retardo (6-10 días). Con el fin de poder avanzar en el enfoque de determinación del fragmento de ADN mínimo que expresa la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa, hay que subclonar el Ccos8. La selección del subclón interesante se hará utilizando el cribado de la complementación funcional.

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II.2.7- Subclonación mediante complementación funcional

La digestión con NotI del cósmido permite obtener 6 fragmentos de ADN de tamaño comprendido entre 1,7 y 10 kb. Estos fragmentos se clonan en pBBR1MCS-Gm-Not-U. Se obtienen 5 subclones de Ccos8. El análisis por restricción muestra que los fragmentos de 4 y 10 kb no están subclonados. En contraposición, se observa que la banda de 5 kb observada inicialmente era de hecho una banda doble de 5,1 y 5,2 kb. Estos clones se pasan, por conjugación triparental, de E. coli a P. putida. Al cabo de 5 días, sólo la P. putida que contiene el subclón correspondiente a la banda de 5,2 kb del cósmido Ccos8 ha brotado sobre M63 que contiene 4-HPA como única fuente de carbono. Se acaba por tanto de identificar el fragmento mínimo que comprende actividad 4-HPA 1-hidroxilasa. Los clones correspondientes a la banda de 5,2 kb se llaman 5kbC. Para confirmar el resultado de la complementación funcional, se provoca la eliminación del plásmido p5kbC utilizando la estrategia de orígenes de replicación incompatibles y forzando la eliminación del plásmido p5kbC por la presión de selección de los antibióticos utilizados. Se observa que la P. putida pierde la capacidad de crecer sobre 4-HPA como única fuente de carbono cuando ha perdido el plásmido p5kbC. Se concluye que la actividad enzimática 4-HPA 1-hidroxilasa está portada por el plásmido p5kbC. Puede hacerse secuenciar por lo tanto el inserto de 5,2 kb, lo que debería permitir identificar el gen hpaH funcional.

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II.2.8- Análisis de la secuencia de 5,2 kb

Se secuencia el inserto de 5,2 kb del plásmido p5kbC. Una búsqueda de homología nucleica (BLASTN) permite identificar así tres partes en el inserto. La primera parte comprendida entre las bases nº 1 y 1465 es perfectamente homóloga de una parte del plásmido Birmingham IncP-alfa. Se trata por lo tanto probablemente de una secuencia procedente de pLAFR5. Una segunda parte nucleica comprendida entre las bases nº 1466 y 1695 presenta una homología perfecta con una parte del plásmido de clonación M13mp8/pUC8. Esta secuencia forma parte por lo tanto de pLAFR-5; efectivamente, el multisitio de clonación de pLAFR-5 proviene de pUC8 (Keen et al., 1988). Así, los sitios EcoRI y SmaI (Figura 7) en posición respectiva 1689 y 1695 son probablemente los sitios de clonación de pLAFR-5. La tercera parte, comprendida entre las bases 1696 y 5264 (o sea 3568 pb) no presenta homologías altas. Esta parte de ADN proviene del genoma de P. acidovorans. Cuando se analiza la secuencia de 5,2 kb utilizando el algoritmo BLASTX, se identifican las proteínas probables (Figura 7). Así, la proteína codificada por el gen 1 presenta bajas homologías con beta-lactamasas, deshidrasas y ciclasas. La proteína purificada está codificada por el gen 2, ya que se encuentran las secuencias que codifican los péptidos internos anteriormente obtenidos; por lo tanto, es probablemente la 4-HPA 1-hidroxilasa. Los alineamientos proteicos muestran que esta proteína presenta varias homologías con oxigenasas e hidroxilasas. La proteína potencialmente codificada por el gen 3 no presenta homologías con las bases de datos. Por último, el gen 4 codifica probablemente un regulador de operón.

Se hace entonces un análisis más fino del gen hpaH. Según la secuencia proteica N-terminal obtenida, el codón de inicio ATG de la proteína 4-HPA 1-hidroxilasa se encuentra de hecho 78 pb cadena abajo de un codón iniciador GTG en fase con ATG. La secuencia Shine-Dalgarno AGGA, que permite la fijación de ribosomas, se encuentra cadena arriba del ATG iniciador pero no cadena arriba del codón iniciador GTG, lo que confirma que la región de codificación comienza en el codón iniciador ATG. La porción comprendida entre los codones GTG y ATG no corresponde por lo tanto probablemente a una preproteína. Así definido, el gen hpaH es de 1737 pb de longitud y termina con el codón de terminación TGA. El gen está constituido por un 70,9% de bases GC.

Ahora que se han definido con precisión los límites del gen hpaH, se analiza el producto de su traducción: la proteína HPAH

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II.2.9- Análisis de la proteína HPAH

Se traduce la secuencia de hpaH utilizando el sistema universal de codones. Se obtiene así una proteína de 563 aminoácidos, lo que representa un peso molecular de 62,2 kDa. Las búsquedas de homologías proteicas (BLASTP) muestran que la HPAH presenta aproximadamente 15 a 25% de identidad esencialmente con proteínas de organismos grampositivos que codifican actividades enzimáticas aparentemente muy diferentes de la buscada Así, se encuentra una oxigenasa de Streptomyces argillaceus, la 3-(3-hidroxifenil)propionato hidroxilasa (EC 1.14.13.) de. E. coli, la 2,4-dihidroxibenzoato monooxigenasa de Sphingomonas sp., la enzima que cataliza la 6-hidroxilación de tetraciclina en Streptomyces aureofaciens y una oxigenasa potencial de Streptomyces fradiae. De hecho, la HPAH presenta homologías con las proteínas de la familia de fenol monooxigenasas (phe A) y las de la familia de 2,4-diclorofenol hidroxilasas (tfdB). El alineamiento correspondiente a las proteínas anteriormente citadas se realiza utilizando el algoritmo ClustalW (Figura 8). Permite poner en evidencia las secuencias muy conservadas. Se revelarán entre otros tres motivos de interacción con FAD. El primero (GXGXXG) corresponde al motivo estructural \beta-\alpha-\beta que permite la interacción de la parte ADP de FAD con la proteína. El segundo motivo (A/C)DG está implicado en la fijación de FAD, mientras que el tercer motivo G (R) VXX (A) GD (A) XH permite la interacción con la parte de flavina de FAD. Aunque la enzima utiliza NADH,H^{+}, el sitio de fijación correspondiente (GDH) no se ha identificado. Esta ausencia de sitio de fijación a NADH,H^{+} es una característica observada a menudo en otras monooxigenasas de FAD. Por último, se observa un motivo (DXXXLXWKLX XXXXXXXXXX LLXXYXXER) que se encuentra también en otras hidroxilasas (Ferrández et al., 1997), pero cuyo significado no está aclarado. Aunque la propionato de 3-(3-hidroxifenilo) hidroxilasa de E. coli cataliza una reacción de hidroxilación sobre un sustrato sustancialmente cercano a 4-HPA, las informaciones adquiridas por estos análisis bioinformáticos no permiten asegurar que se haya identificado bien la 4-HPA 1-hidroxilasa. La única manera de hacerlo es expresar el gen hpaH y estudiar su actividad enzimática.

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II.2.10- Identidad de las proteínas implicadas en la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa II.2.10.1- Expresión del gen hpaH que codifica la 4-HPA 1-hidroxilasa

Con el fin de confirmar que el gen hpaH codifica la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa, es necesario expresar el gen. Para hacer esto, se utiliza una estrategia de clonación en dos etapas que permite eliminar los genes nº 1 y 3 y disponer el gen hpaH bajo la dependencia del promotor lac del vector original pBBR1MCS-Gm-Not-U. El plásmido obtenido se denomina pBBR1MCS FT12\Delta1. Se realiza un extracto bruto a partir de un cultivo sobre medio rico de P. putida transformado con este plásmido. La búsqueda de actividad por espectrofotometría (a 340 y 292 nm) muestra que el clon posee ciertamente la actividad NADH,H^{+} oxidasa inducida por la adición de 4-HPA, pero no posee la capacidad de síntesis de homogentisato a partir de 4-HPA. En contraposición, se observa la aparición de una molécula Z que tiene un tiempo de retención muy próximo (tr= 1,2 minutos frente a 1,4 minutos) pero un espectro UV muy diferente al del HGA. Se plantea la hipótesis de que la HPAH oxida el NADH,H^{+} para reducir su cofactor FAD. La reoxidación de FAD se hace en detrimento del 4-HPA, puesto que es la adición de 4-HPA lo que inicia la reacción. El 4-HPA se convierte por lo tanto en el metabolito Z. El espectro de este metabolito sugiere que el ciclo no es aromático sino que sin embargo puede ser insaturado. Se presenta en la figura 2 una hipótesis estructural del metabolito Z. Este experimento muestra que el promotor lac es funcional en P. putida en ausencia del inductor IPTG, lo que sugiere que el represor lacI está naturalmente ausente en P. putida. Se demuestra además que la proteína inicialmente purificada (HPAH) es realmente una NADH,H^{+} oxidasa dependiente de 4-HPA que convierte el 4-HPA en metabolito Z. La HPAH no produce HGA. Por lo tanto, es necesario identificar la o las proteínas asociadas de esta NADH,H^{+} oxidasa dependiente de 4-HPA y cuya adición permite restaurar la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa.

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II.2.10.2- Identificación de la proteína HPAC por filtración en gel

Se ha visto que la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa desaparecía en la purificación de HPAH sobre columna de afinidad Red. Se plantea por lo tanto la hipótesis de que la o las proteínas asociadas a NADH,H+ oxidasa dependiente de 4-HPA no se han retenido por la resina de afinidad Red 120 de agarosa y por lo tanto se recuperan en el "flujo continuo". Se decide por lo tanto purificar el "flujo continuo" y buscar la o las proteínas que añadidas a la HPAH permitan restaurar la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa. Para hacer esto, se concentra el "flujo continuo" mediante ultrafiltración (Macrosep^{TM} 10K) y después se carga sobre una columna de filtración en gel S75. Se aplica un caudal de 1 m.min^{-1} y se recogen fracciones de 1 ml. Se realizan entonces las reacciones enzimáticas introduciendo 50 \mul de cada fracción y 10 \mul de HPAH previamente purificada sobre una columna Red, en las condiciones de reacción normales. Se analizan entonces las reacciones detenidas mediante HPLC. Se observa que las fracciones 90 a 107, cuando se añaden a la proteína HPAH, permiten producir más metabolito Z. La producción de metabolito Z se detecta en estas mismas fracciones en ausencia de aporte de HPAH. Por otro lado, sobre los geles de acrilamida correspondientes a estas fracciones, se observa una proteína de peso molecular equivalente a HPAH. Se concluye que el "flujo continuo" contenía todavía un poco de proteína HPAH. Cuando se añaden las fracciones 109 a 143 a la proteína HPAH, se observa la producción de HGA. Cuanto mayor es la producción de HGA, menor es la del metabolito Z. Se obtiene el máximo de producción de homogentisato por las fracciones 116 a 128. La deposición sobre gel de acrilamida de las fracciones comprendidas entre 95 y 145 muestra que una proteína está muy enriquecida en las fracciones 109 a 143, es decir, que el perfil cromatográfico de esta proteína coincide con el perfil de producción de HGA. Se decide denominar a esta proteína HPAC. Se corta la proteína HPAC del gel y después se microsecuencia por el extremo N-terminal. La secuencia obtenida, MTTKTFA, muestra que esta proteína está codificada por el gen 1 (Figura 7) que se denomina de aquí en adelante hpaC. Este experimento muestra que la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa implica dos proteínas, HPAH y HPAC. Sin embargo, no se ha definido la naturaleza de la interacción entre estas dos proteínas: (1) HPAH y HPAC son las dos enzimas o bien (2) es HPAH la que posee una actividad enzimática modificable en función de la interacción con HPAC.

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II.2.10.3- Naturaleza de las interacciones entre HPAH y HPAC

El experimento precedente demuestra que las proteínas HPAH y HPAC son necesarias para reconstituir la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa. Se plantean dos hipótesis para explicar el papel respectivo de estas proteínas. En este apartado, se presentan resultados que sugieren que la HPAC es una enzima de pleno derecho. Se combinan las fracciones 100, 101 y 102 de la filtración en gel. Contienen la HPAH, es decir, la actividad NADH,H+ oxidasa que permite producir el metabolito Z a partir de 4-HPA. Por otro lado, se combinan las fracciones 123, 124 y 125 de la filtración en gel. Contienen la HPAC. Se realizan diferentes reacciones enzimáticas utilizando HPAH y/o HPAC. Se realizan estas reacciones en dos tiempos. Se realiza una primera reacción con HPAH (respectivamente HPAC) y, se detiene al cabo de 30 minutos mediante un tratamiento térmico (100ºC, 10 min). Se añade entonces HPAC (respect. HPAH) y se prosigue la reacción durante 30 minutos. Se detiene finalmente la reacción mediante la adición de ácido perclórico. Se realizan también reacciones reemplazando una de las enzimas por agua. Por último, se realizan experimentos equivalentes filtrando las reacciones sobre Nanosep^{TM} 10 kD (Pall Filtron) en lugar de hervirlas.

La tabla nº 1 sintetiza los resultados obtenidos.

1

Se observa que la única manera de producir HGA es tener las dos proteínas HPAH y HPAC simultánea o sucesivamente en ese orden. Cuando la HPAH está sola, o cuando la HPAC se introduce antes que la HPAH, es detectable sólo el metabolito Z. Por último, la proteína HPAC no tiene ninguna actividad enzimática sobre el 4-HPA. Estos resultados sugieren que el metabolito Z es un intermedio de reacción. La HPAH convertiría el 4-HPA en metabolito Z, permitiendo esta reacción la oxidación de NADH,H^{+}. Se convertiría entonces el metabolito Z en HGA por la HPAC. Las interacciones físicas entre las dos proteínas no parecen necesarias, ya que la proteína HPAH puede estar desnaturalizada o eliminarse por filtración antes de la adición de la HPAC. Se ha mostrado in vitro que la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa dependía de las proteínas HPAC y HPAH. Sin embargo, la proteína HPAC no es pura a la salida de la filtración en gel, solamente está enriquecida. Sigue siendo posible por lo tanto que en realidad sea otra proteína contenida en este extracto enriquecido la que convierta el metabolito Z en HGA. Para eliminar dudas, se decidió clonar los dos genes (hpaC y hpaH) sobre un mismo vector, en este caso se debería producir la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa y por lo tanto ser capaz de hacer crecer P. putida sobre medio mínimo que contiene 4-HPA como única fuente de carbono.

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II.2.10.4- Complementación funcional de P. putida por hpaH y hpaC

El plásmido pL1lac2 (Figura 9) es un vector pBBR1MCS-Gm^{R} que contiene el gen hpaC dependiente del promotor de HPPD de P. fluorescens y, en oposición, el gen hpaH dependiente de un promotor lac. Se introduce el plásmido en P. putida mediante electroporación. Se extienden entonces las bacterias sobre medio mínimo que contiene o no 4-HPA como única fuente de carbono. Después de 5 días, las colonias son visibles solamente sobre cubetas que contienen 4-HPA como única fuente de carbono. Al cabo de 8 días, las colonias son de buen tamaño. El ADN plasmídico extraído a partir de estas colonias confirma la presencia del plásmido pL1lac2 íntegro. Por otro lado, la P. putida es incapaz de crecer sobre 4-HPA cuando la bacteria se transforma con el vector pBBR1MCS-GM^{R} que contiene o bien el gen hpaC o bien el gen hpaH. La complementación funcional obtenida en este experimento confirma que los genes hpaC y hpaH son necesarios y suficientes para instaurar la actividad 4-HPA 1-hidroxilasa buscada.

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Ejemplo III Construcciones de diferentes módulos de expresión citosólica III.1 HPAC

Se ha aislado el gen HPAC de Pseudomonas acidovorans mediante PCR sobre un plásmido derivado (p5kbC) de un banco cosmídico de ADN genómico utilizando los oligonucleótidos siguientes:

Inicio de ORF1 (AflIII):

GCAGGATGCA CATGTCCACC AAGAC

Fin de ORF1 (HindIII):

CGGACGCAAG CTTGCATCAG CCTTC

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Se ha efectuado la reacción según condiciones estándar. Se ha subclonado el fragmento amplificado de un tamaño de 993 pb en el plásmido pGEMTeasy (Promega) según el protocolo del fabricante. Se ha secuenciado el plásmido pOZ150 así obtenido. Se ha clonado el módulo obtenido mediante digestión con EcoRI + SpeI en el plásmido pBluescriptII-KS+ abierto por las mismas enzimas para dar el plásmido pEPA13. Se aísla el promotor de CsVMV del plásmido pCH27, derivado del plásmido pUC19 que contiene el módulo de expresión de un gen de tolerancia a herbicida bajo el control de CsVMV. Para ello, se ha realizado una PCR estándar sobre termociclador con Pfu polimerasa generando extremos romos; 1 ciclo de 5 min a 95ºC, 30 ciclos [95ºC 30 s, 57ºC 30 s, 72ºC 1 min], 72ºC 3 min. Los cebadores utilizados son:

N-CsVMV:

GCCCTCGAGG TCGACGGTAT TGATCAGCTT CC que introduce los sitios XhoI y BclI

C-CsVMV:

CGCTCTAGAA TTCAGATCTA CAAAC (EcoRI)

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Se digiere el fragmento de 565 pb generado con XhoI+EcoRI antes de insertar en el plásmido pEPA13 previamente digerido con XhoI+EcoRI; se obtiene el plásmido pEPA14. Se aísla el terminador Nos del plásmido pRD11, derivado de pBlueScript II-SK(-) en el que se clona el terminador Nos, mediante digestión con HindII+NotI. Se clona el fragmento de 292 pb obtenido en el plásmido pEPA14 abierto por las mismas enzimas, dando pEPA15.

Módulo pEPA15 = promotor CsVMV-hpa C- terminador Nos (Figura 10; SEC ID NO 19).

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III.2. HPAH

Se ha aislado el gen de HPAH de Pseudomonas acidovorans mediante PCR sobre un plásmido derivado (p5kbC) de un banco cosmídico de ADN genómico utilizando los oligonucleótidos siguientes:

Inicio de ORF2 (AflIII):

CAGAGGACGA ACAACATGTC CCACC

Fin de ORF2 3 (HindIII):

CTGTGGATGA AGCTTAAGAG GTTCAGGC

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Se ha efectuado la reacción según condiciones estándar. Se ha subclonado el fragmento amplificado de un tamaño de 1729 pb con extremos romos en el plásmido pBlueScript II SK digerido con EcoRV. Se ha secuenciado el plásmido pEPA16 así obtenido. Se aísla el promotor de 35S de CaMV del plásmido pCH14, derivado del plásmido pBI 121 que contiene el módulo de expresión GUS: promotor 35S de CaMV-GUS-terminador Nos. Para ello, se ha realizado una PCR estándar sobre termociclador con Pfu polimerasa generando extremos romos; 1 ciclo de 5 min a 95ºC, 30 ciclos [95ºC 30 s, 63ºC 30 s, 72ºC 1 min], 72ºC 3 min. Los cebadores utilizados son:

N-CaMV:

GCATGCCTCG AGCCCACAGA TGG que introduce el sitio XhoI

C-CaMV:

CCACCCGGGG ATCCTCTAGA G que introduce el sitio BamHI

\newpage

Se digiere el fragmento de 839 pb generado con XhoI+BamHI antes de insertar en el plásmido pEPA16 previamente digerido con XhoI+BclII; Se obtiene así el plásmido pEPA17. Se aísla el terminador Nos del plásmido pRD11 mediante PCR, en las mismas condiciones que anteriormente, para 1 ciclo de 5 min a 95ºC, 30 ciclos [95ºC 30 s, 57ºC 30 s, 72ºC 1 min], 72ºC 3 min, con los cebadores siguientes:

N-Nos:

CAAGCTTATC GATACCGTCG ACG que introduce HindIII

C-Nos:

GAATTGCGGC CGCAATTCCC GACCTAGGA ACATAG que introduce NotI y AvrII.

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Se digiere el fragmento de 305 pb obtenido con NotI + HindIII antes de clonar en el plásmido pEPA17 abierto con las mismas enzimas, dando pEPA18.

Módulo pEPA18 = promotor de 35S de CaMV-hpa H- terminador Nos (Figura 11; SEC ID NO 17).

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III.3. HPPO

Se ha aislado el gen de HPPO de Arthrobacter globiformis mediante PCR sobre el cósmido 2A procedente de un banco cosmídico de ADN genómico utilizando los oligonucleótidos siguientes:

HPPO-ScaI N-term:

GAATTCAGTA CTTCACTTAC AGTGTCCGGC que introduce los sitios de restricción EcoRI y ScaI.

HPPO-AsuII-XhoI C-term:

GAATTCTCGA GTTCGAACAA ACTGAGTAGC AGCTCA que introduce los sitios EcoRI, XhoI y AsuII

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Se ha efectuado la reacción según condiciones estándar. Se clona el fragmento de 1800 pb obtenido en el vector pGEMT-easy (Promega) según el protocolo del fabricante. Se ha secuenciado el plásmido pOZ151 así obtenido. Se ha clonado el módulo obtenido mediante digestión con SphI + XhoI en el plásmido pBBR1-MCS (Gm) abierto con las mismas enzimas para dar el plásmido pEPA20. Se aísla el promotor de histona simple del plásmido pCH9, derivado del plásmido pUC 19 que contiene el módulo de expresión de EPSPS: promotor de histona simple-intrón 2-OTP-EPSPS-terminador de histona. Para ello, se ha realizado una PCR estándar con Pfu polimerasa que genera extremos romos; 1 ciclo de 5 min a 95ºC, 5 ciclos [95ºC 30 s, 45ºC 30 s, 72ºC 1 min], 30 ciclos [95ºC 30 s, 65ºC 30 s, 72ºC 1 min], 72ºC 3 min. Los cebadores utilizados son:

N-SH:

GCTTGCATGC CTAGGTCGAG GAGAAATATG que introduce los sitios SphI y AvrII

C-SH:

CATGAGGGGT TCGAAATCGA TAAGC

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Se digiere el fragmento de 970 pb con SphI antes de insertarse en el plásmido pEPA20 previamente digerido con SphI + ScaI. En el plásmido pEPA21 obtenido, se recrea el ATG de inicio del gen de HPPO detrás del promotor de histona simple. Se aísla el terminador de histona del mismo plásmido pCH9 mediante PCR, en las mismas condiciones que anteriormente, para 1 ciclo de 5 min a 95ºC, 35 ciclos [95ºC 30 s, 55ºC 30 s, 72ºC 1 min], 72ºC 3 min, con los cebadores siguientes:

N-Hister:

CTAGACCTAG GGGATCCCCC GATC que introduce AvrII

C-Hister:

CCCACTAGTG TTTAAATGAT CAGTCAGGCC GAAT que introduce SpeI y BclI.

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Se digiere el fragmento de 726 pb obtenido con SpeI + AvrII antes de clonar en el plásmido pEPA21 abierto con SpeI, dando pEPA22.

Módulo pEPA22 = promotor de histona simple-hppO-teminador de histona (Figura 12; SEC ID NO 15).

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III.4. Asociación de genes

Se extrae el módulo que contiene el gen de HPAC de pEPA15 mediante digestión con NotI y se clona en pEPA18 (NotI+Bsp120I) para formar pEPA19 (Figura 13; SEC ID NO 21). Este último se digiere con AvrII para clonar el módulo extraído en los sitios AvrII+SpeI de pEPA22. El plásmido que contiene las tres construcciones es pEPA23 (Figura 14; SEC ID NO 22).

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III.5. Vector binario

Con el fin de transformar las plantas con Agrobacterium, las tres construcciones son extraíbles con BclI con el fin de introducirlas en un vector binario de Agrobacterium.

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Abreviaturas

3,4-DHPA

ácido 3,4-dihidroxifenilacético

4-HPA

ácido 4-hidroxifenilacético

ADN

ácido desoxirribonucleico

IQPA

ionización química a presión atmosférica

ARN

ácido ribonucleico

ARNm

ácido ribonucleico mensajero

BET

bromuro de etidio

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

BSA

albúmina de suero bovina

C^{100}

carbenicilina (100 \mug/ml)

CRLD

Centro de Investigación La Dargoire

Da

dalton

DKN

dicetonitrilo de isoxaflutol

DMSO

dimetilsulfóxido

dATP

5'-trifosfato de 2'-desoxiadenosina

dCTP

5'-trifosfato de 2'-desoxicitidina

dGTP

5'-trifosfato de 2'-desoxiguanosina

dNTP

5'-trifosfato de 2'-desoxinucleótidos

dTTP

5'-trifosfato de 2'-desoxitimidina

DTE

ditioeritritol

DTT

1,4-ditioeritritol

EDTA

ácido etilendiaminotetraacético

FAD

dinucleótido de flavina y adenina

FPLC

"cromatografía líquida de proteína rápida"

Gm^{20}

gentamicina (20 \mug/ml)

HGA

ácido homogentísico

HPLC

cromatografía líquida de alta resolución

HPP

ácido hidroxifenilpirúvico

HPPD

ácido hidroxifenilpirúvico dioxigenasa

HPPO

hidroxifenilpiruvato oxidasa

IFT

isoxaflutol

IPTG

\beta-tiogalactopiranósido de isopropilo

Kn^{50}

kanamicina (50 \mug/ml)

kb

kilobases

Km

constante de Michaelis-Menten

L-DOPA

3,4-dihidroxifenilalanina

LB

medio de Luria Bertani

min

minutos

mJ

milijulios

MNDD

dioxigenasa dependiente de manganeso

MndD

gen que codifica la MNDD

NAD^{+}(H,H^{+})

dinucleótido de nicotinamida y adenina (forma oxidada/forma reducida)

OGM

organismo modificado genéticamente

OTP

Optimised Transit Peptid; péptido de tránsito optimizado

pb

par de bases

pBBR1MCS-Gm

plásmido pBBR1MCS resistente a gentamicina

PCR

reacción en cadena de la polimerasa

ppm

parte por millón; mg.l^{-1}

PVDF

poli(difluoruro de vinileno)

csp

cantidad suficiente para

c.r.

coeficiente respiratorio

Rif^{100}

rifampicina (100 \mug/ml)

RMN

resonancia magnética nuclear

SDS

dodecilsulfato de sodio

s

segundo

TBE

trisborato de EDTA

TEV

"virus del grabado del tabaco"

TFA

ácido trifluoroacético

TrEMBL

banco genómico

EMBL

traducido (translated EMBL bank)

Tris

tris(hidroximetil)aminometano

U.V.

ultravioleta

vs

frente a

X-gal

5-bromo-4-cloro-3-\beta-D-galactopiranósido

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Referencias

Abe, H.; Uchiyama, M.; Sato, R. (1974) Isolation of phenylacetic acid and its p-hydroxyderivative as auxin-like substances from Undaria pinnatifida. Agric. Biol. Chem. 38: 897-898

Adachi, K.; Takeda, Y.; Senoh, S.; Kita, H. (1964) Metabolism of p-hydroxyphenylacetic acid in Pseudomonas ovalis. Biochem. Biophys. Acta 93: 483-493

Appert, C.; Logemann, E.; Hahlbrock, K.; Schmid, J.; Amrhein, N.; (1994) Structural and catalytic properties of the four phenylalanine ammonia-lyase isoenzymes from parsley (Petroselinum crispum Nym.); Eur. J. Biochem.; 225:491-499

Arunachalam, U.; Massey, V.; Vaidyanathan, C.S. (1992) p-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase. J. Biol. Chem. 267: 25848-25855

Arunachalam, U.; Massey, V. (1994) Studies on the oxidative half-reaction of p-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase. J. Biol. Chem. 269: 11795-11801

Arunachalam, U.; Massey, V.; Miller, S.M. (1994) Mechanism of p-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase. J. Biol. Chem. 269: 150-155

Aubert, S. (1994) Effet multiples du glycérol sur le métabolisme de la cellule végétale non chlorophylienne. These. Université Joseph Fourier - Grenoble - France

Aubert, S.; Gout, E.; Bligny, R.; Marty-Mazars, D.; Barrieu, F.; Alabouvette, J; Marty, F.; Douce, R. (1996a) Ultrastructural and biochemical characterization of autophagy in higher plant cells subjected to carbon deprivation: control by the supply of mitochondria with respiratory substrates. J. Cell Biol. 133: 1251-1263

Aubert, S.; Alban, C.; Bligny, R.; Douce, R. (1996b) Induction of beta-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase in higher plant cells during carbohydrate starvation: evidence for a role of MCCase in leucine metabolism. FEBS Lett. 383: 175-180

Aubert, S.; Bligny, R.; Douce, R. (1996c). NMR studies of metabolism in cell suspensions and tissue cultures, in " Nuclear Magnetic Resonance in Plant Physiology " (Y. Shachar-Hill and P. Pfeffer, Eds.), pp.109-154, American Society of Plant Physiologists, Rockville, USA.

Aubert, S.; Bligny, R.; Day, D.A.; Whelan, J.; Douce, R. 1997. Induction of alternative oxidase synthesis by herbicides inhibiting branched-chain amino acid synthesis. Plant J. 11:649-657

Aubert, S.; Curien, G.; Bligny, R.; Gout, E.; Douce, R. (1998) Transport, compartimentation and metabolism of homoserine in higher plant cells. Carbon-13 and phosphorus-31-nuclear magnetic resonance studies. Plant Physiol. 116: 547-557

Aubert, S.; Pallett, K. (2000) Combined use of 13C- and 19F-NMR to analyse the mode of action and the metabolism of the fluoride herbicide isoxaflutole. Plant Physiol. Biochem., 38: 517-523

Ausubel, F.M.; Brent, R.; Kingston, R.E.; Moore, D.D.; Seidman, J.G.; Smith, J.A.; Struhl, K. (1995) Current protocols in molecular biology(volume 1-4). Wiley ed., Massachusetts General Hospital & Harward Medical School.

Bate, N.J.; Orr, J.; Ni, W.; Meromi, A.; Nadler-Hassar, T.; Doerner, P.W.; Dixon, R.A.; Lamb, C.J.; Elkind, Y. (1994) Quantitative relationship between phenylalanine ammonia-lyase levels and phenylpropanoid accumulation in transgenic tobacco identifies a rate-determining step in natural product synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7608-12

Battersby, A.R.; Chrystal, E.J.; Staunton, J. (1980) Studies of enzyme-mediated reactions. Part 12. Stereochemical course of the decarboxylation of (2S)-tyrosine to tyramine by microbial, mammalian and plant systems. J. Chem. Soc. 1: 31-42

Bickel, H.; Palme, L.; Schultz, G. (1978) Incorporation of shikimate and other precursors into aromatic amino acids and prenylquinones of isolated spinach chloroplasts. Phytochemistry. 17: 119-124

Bickel, H.; Buchholz, G.; Schultz, G. (1979) On the compartimentation of the biosynthesis of aromatic amino acids and prenylquinones in higher plants. In Advances in the biochemistry and physiology of plant lipids, Appelqvist, L.A. Liljenberg, C., eds. Elsevier, Amsterdam pp 369-375

Biswas, I.; Gruss, A.; Ehrlich, S.D.; Maguin, E. (1993) High-efficiency gene inactivation and replacement system for Gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 175: 3628-3635

Blakley, E.R. (1977) The catabolism of L-tyrosine by an Arthrobacter sp., Can. J. Microbiol. 23: 1128-1139

Bligny, R.; Leguay, J.J. (1987) Techniques of cell cultures. Meth. Enzymol. 148: 3-16

Boehringer Mannheim (1995) The DIG system user's guide for filter hybridization

Boldt, Y.R.; Sadowsky, M.J.; Ellis, L.B.M.; Que, L.; Wackett, L.P. (1995) A Manganese-dependent Dioxygenase from Arthrobacter globiformis CM-2 belongs to the major extradiol dioxygenase family. J. Bacteriol. 177: 1225-1232

Borresen, T; Klausen, N.K.; Larsen, L.M.; Sorensen, H. (1989) Purification and characterisation of tyrosine decarboxylase and aromatic-L-amino-acid decarboxylase. Biochem. Biophys. Acta 993: 108-115

Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254

Brouquisse, R.; James, F.; Pradet, A.; Raymond, P. (1992) Asparagine metabolism and nitrogen distribution during protein degradation in sugar-starved maize root tips. Planta. 188: 384-395

Callis, J. (1995) regulation of proteine degradation. Plant Cell. 7: 845-857

Campos-Garcia J., Najera R., Camarena L., Soberon-Chavez G. (2000) The Pseudomonas aeruginosa motR gene involved in regulation of bacterial motility. FEMS Microbiol Lett. 184: 57-62

Chan, M.T.; Chao, Y.C.; Yu, S.M. (1994) Novel gene expression system for plant cells based on induction of alpha-amylase promoter by carbohydrate starvation. J. Biol Chem. 269: 17635-17641

Chang, A.K.; Duggleby, R.G. (1997) Expression, purification and characterization of Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase. Biochem. J. 327: 161-169

Chevalier, C.; Bourgeois, E.; Just, D.; Raymond, P.; (1996) Metabolic regulation of asparagine synthetase gene expression in maize (Zea mays L.) root tips. Plant J. 9: 1-11

Chua, N.H. (1980) electrophoretic analysis of chloroplast proteins. Methods Enzymol. 69: 434-446

Coligan, J.E.; Dunn, B.M.; Ploegh, H.L.; Speicher, D.W.; Wingfield, P.T. Current protocols in protein science. Wiley ed.

Coligan, J.E. (1997) Chapter 11: Chemical analysis in Current Protocols in Protein Science. Coligan, J.E.; Dunn, B.M.; Ploegh, H.L.; Speicher, D.W.; Wingfield, P.T. (eds.) Wiley. Vol. 1.

David, C.; Daro, A.; Szalai, E.; Atarhouch, T.; Mergeay, M. (1996) Formation of polymeric pigments in the présence of bacteria and comparison with chemical oxidative coupling-II. Catabolism of tyrosine and hydroxyphenylacetic acid by Alcaligenes eutrophus CH34 and mutants. Eur. Polym. J., 32: 669-679

De Lorenzo V., Herrero M., Jakubzik U., Timmis K.N. (1990) Mini-Tn5 transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of cloned DNA in gram-negative eubacteria. J Bacteriol. 172: 6568-6572

D'Souza LM, Willson RC, Fox GE (2000) Expression of marker RNAs in Pseudomonas putida Curr Microbiol. 40: 91-95

Despeghel, J.P.; Delrot, S. (1983) Energetics of amino acids uptake by Vicia faba leaf tissue. Plant Physiol. 71: 1-6

Dey & Harborne (1997) Plant Biochemistry, page 389, Ed. P.M. Dey &J.B. Harborne, Academic Press

Fedi S., Brazil D., Dowling D.N., O'Gara F. (1996) Construction of a modified mini-Tn5 lacZY non-antibiotic marker cassette: ecological evaluation of a lacZY marked Pseudomonas strain in the sugarbeet rhizosphere. FEMS Microbiol Lett. 135: 251-257

Feretti, L.; Sgaramella, V. (1981) Specific and reversible inhibition of the blunt end joining activity of the T4 DNA ligase. Nucleic Acid Res. 9: 3695-3705

Ferrandez, A.; Garcia, J.L.; Diaz, E. (1997) Genetic characterization and expression in heterologous hosts of the 3-(3-hydroxyphenyl)-propionate catabolic pathway of Escherichia coli K12. J. Bacteriol. 179: 2573-2581

Filleur, S.; Daniel-Vedele, F. (1999) Expression analysis of a high affinity nitrate transporter isolated from Arabidopsis thaliana by differential display. Planta 207: 461-469

Flodin, C.; Whitfield, F.B. (1999) 4-hydroxybenzoic acid: a likely precursor of 2,4,6-tribromophenol in Ulva lactuca. Phytochemistry. 51: 249-255

Flügge, U.-I. (1998) Metabolite transporters in plastids. Curr. Opinion Plant Biotech., 1: 201-206

Folch, J.; Lees, M.; Sloane-Stanley, G.H. (1957) A simple method for the isolation and purification of lipids from animal tissues. J Biol Chem 226: 497-509

Frommer, W.B.; Kwart, M.; Himer, B.; Fischer, W.N.; Hummel, S.; Ninnemann, O. (1994) Transporters for nitrogenous compounds in plants. Plant Mol. Biol. 26: 1651-1670

Gaines, C.G.; Byng, G.S.; Whitaker, R.J.; Jensen, R.A. (1982) L-tyrosine regulation and biosynthesis via arogenatedehydrogenase in suspension-cultured cells of Nicotiana silvestris speg. et comes. Planta, 156: 233-240

Galan, B.; Diaz, E.; Prieto, M.A. (2000) Functional analysis of the small component of the 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase of Escherichia coli W: a prototype of a new flavin: NAD(P)H reductase subfamily. J. Bacteriol. 182: 627-636

Garcia, I.; Rodgers, M.; Lenne, C.; Rolland, A.; Sailland, A.; Matringe, M. (1997) Subcellular localisation and purification of a p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase from cultured carrot cells and characterisation of the corresponding cDNA. Biochem. J.; 325: 761

Garcia, I.; Rodgers, M.; Pépin, R.; Ksieh, T.-F., Matringe, M. (1999) Characterization and subcellular compartmentation of recombinant 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase from Arabidopsis in transgenic tobacco. Plant Physiol. 119: 1507-1516

Gazzarini, S.; Lejay, L.; Gojon, A.; Ninnemann, O.; Frommer, W.B.; von Wiren, N. (1999) Three functional transporters for constitutive, diurnally regulated and starvation-induced uptake of ammonium into Arabidopsis roots. Plant Cell. 11: 937-948

Genix, P.; Bligny, R.; Martin, J.B.; Douce, R. (1990) Transient accumulation of asparagine in sycamore cells after a long period of sucrose starvation. Plant Physiol. 94: 717-722

Georgalaki, M.D.; Sarantinopoulos, P.; Ferreira, E.S.; De Vuyst, L.; Kalantzopoulos, G.; Tsakalidou, E. (2000) Biochemical properties of Streptococcus macedonicus strains isolated from Greek Kasseri cheese. J. Appl. Microbiol. 88: 817-825

Goodchild, J.A.; Givan, C.V. (1990) Influence of ammonium and extemal pH on the amino and organic acid content of suspension culture cells of Acer pseudoplatanus L. Physiol. plant 78: 29-37

Goodwin & Mercer (1988) Introduction to plant biochemistry, 2nd edition. Pergamon Press p. 356

Gout, E.; Bligny, R.; Genix, P.; Tissut, M.; Douce, R. (1992). Effect of glyphosate on plant cell metabolism. 31P and 13C NMR studies. Biochimie. 74: 875-882

Greenberg, D.M. ( ) Metabolic pathways. Amino acids and tetrapyrroles, 3rd edition, Academic Press, vol. III: p. 148

Gross, D. (1975) Growth regulating substances of plant origin. Phytochemistry. 14: 2105-2112

Grunstein, M.; Hogness, D.S. (1975) Colony hybridization: a method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961-3965

Hahlbrock, K.; Scheel, D.; (1989) Physiology and molecular biology of phenylpropanoid metabolism. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.; 40: 347-369

Hareland, W.A.; Crawford, R.L.; Chapman, P.J.; Dagley, S. (1975) Metabolic function and properties of 4-hydroxyphenylacetic acid 1-hydroxylase from Pseudomonas acidovorans. J. Bacteriol.,121: 272-285

Hess, J.L. (1993) Vitamine E, \alpha-Tocophérols. In Antioxidans in Higher Plants Edited by Alscher, R.; Hess, J.; Boca Raton: CRC: p.:111-134

Hill, C.M.; Duggleby, R.G. (1998) Mutagenesis of Escherichia coli acetohydroxyacid synthase isoenzyme II and characterization of three herbicide-insensitive forms. Biochem. J. 335: 653-661

Homeyer, U.; Litek, K.; Huchzermeyer, B.; Schultz, G. (1989) Uptake of phenylalanine into isolated barley vacuoles is driven by both tonoplast adenosine triphosphatase and pyrophosphatase. Plant Physiol. 89: 1388-1393

Jones, D.; Keddie, R.M. (1991) The genus Arthrobacter. In: Thé procaryotes (Balows, A.; Trüper, H.G.; Dworkin, M;; Harder, W.; Schleifer, K.H., eds.) 2nd eds., Springer-Verlag, New-York

Journet E.P., Bligny R., Douce R. (1986) Biochemical changes during sucrose deprivation in higher plant cells. J. Biol. Chem. 261: 3193-3199

Junge, K.; Gosink, J.J.; Hoppe, H.-G.; Staley, J.T. (1998) Arthrobacter, Brachybacterium and Planococcus isolates identified from antarctic sea ice brine. Description of Planococcus mcmeekinii, sp. nov.. System. Appl. Microbiol., 21: 306-314

Kaiser, G.; Martinoia, E.; Wiemken, A. (1982) Rapid appearance of photosynthetic products in the vacuoles isolated from barley mesophyll protoplasts by a new fast method. Z. Pflanzenphysiol. 107: 103-113

Keen, N.T., Tamaki, S., Kobayashi, D., Trollinger, D., (1988), Improved broad-host-range plasmids for DNA cloning in gram-negative bacteria, Gene, 70, 191-197

Kindl, H. (1969) Biosynthesis and metabolism of hydroxyphenylacetic acids in higher plants. Eur. J. Biochem., 7: 340-347

Koch, C.; Schumann, P.; Stackebrandt, E. (1995) Reclassification of Micrococcus agilis (Ali-Cohen 1889) to the genus Arthrobacter as Arthrobacter agilis comb. nov. and emendation-of the genus Arthrobacter. Int. J. Syst. Bacteriol. 45: 837-839

Kovach ME, Phillips RW, Elzer PH, Roop RM 2nd, Peterson KM (1994) pBBR1MCS: a broad-host-range cloning vector. Biotechniques 16: 800-802

Kovach ME, Elzer PH, Hill DS, Robertson GT, Farris MA, Roop RM 2nd, Peterson KM (1995) Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene 166: 175-176

Kruk, J.; Strzalka, K. (1998) Identification of plastoquinone-C in spinach and maple leaves by reverse-phase high-performance liquid chromatography. Phytochemistry 49: 2267-2271

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-683

Lamport, D.T.A.; Northcote, D.H. (1960) Hydroxyproline in primary cell walls of higher plants. Nature: 188: 665-666

Laursen, R.A. (1971) Solid-phase Edman degradation. An automatic peptide sequencer. Eur. J. Biochem. 20: 89-102.

Li, Z.-C; Bush, D.R. (1990) \DeltapH-dependent amino acid transport into plasma membrane vesicles isolated from sugar beet leaves. I. Evidence for carrier-mediated, electrogenic flux through multiple transport systems. Plant Physiol. 94: 268-277

Li, Z.-C; Bush, D.R. (1991) \DeltapH-dependent amino acid transport into plasma membrane vesicles isolated from sugar beet (Beta vulgaris L.) leaves. II. Evidence for multiple aliphatic, neutral amino acid symports. Plant Physiol. 96: 1338-1344

Liu, D.-L.; Xu, S.-X.; Wang, W.-F. (1998) a novel lignan glucoside from Forsythia suspensa Vahl. J. Chin. Pharmaceut. Sci. 7: 49-51

Löffelhardt, W. (1977) The biosynthesis of phenylacetic acids in blue-green alga Anacystis nidulans: evidence for the involvement of a thylakoïd-bound L-amino acid oxidase. Z. Naturforsch. 32: 345-350

Luscombe, B.M.; Palett, K.E.; Loubierre, P.; Millet, J.-C.; Melgarejo, J.; Vrabel, T.E. (1995) RPA 201772 a novel herbicide for broad leaf and grass weeds control in maize and sugar cane, Proc. Brighton Crop Prot. Conf Weeds, 1: 35

Luscombe, B.M.; Pallett, K.E.; (1996) Isoxaflutole for weed control in maize, Pesticide Outlook, December, 29

Lutterbach, R.; Stöckigt, J. (1994) in vivo investigation of plant cell metabolism by means of natural-abundance 13C-NMR spectroscopy. Helv. Chim. Acta, 77: 2153-2161

Lutterbach, R.; Stöckigt, J.; (1995), Dynamics of the biosynthesis of methylursubin in plant cells employing in vivo 13C-NMR without labelling: Phytochemistry, 40: 801-806

MacLaughlin, P.J.; Weihrauch, J.L. (1979) Vitamine E content of foods. J. Am. Diet. Assoc.75: 647-665

Maniatis, T.; Fritsch, E.F.; Sambrook, J. (1982) Molecular cloning - A laboratory manual eds Cold Spring Harbor Laboratory

Martin, M.; Gibello, A.; Femandez, J.; Ferrer, E.; Garrido-Pertierra, A. (1991) Catabolism of 3- and 4-hydroxyphenylacetic acid by Klebsiella pneumoniae. J. Gen. Microbiol. 132: 621-628.

Mayer, M.P.; Beyer, P.; Kleinig, H. (1990) Quinone compounds are able to replace molecular oxygen as terminal electron acceptor in phytoen desaturation in chromoplasts of Narcissus pseudonarcissus L. Eur. J. Biochem. 191: 359-363

Mayer, M.P.; Nievelstein, V.; Beyer, P. (1992) Purification and characterization of a NADPH dependent oxidoreductase from chromoplasts of Narcissus pseudonarcissus: a redox-mediator possibly involved in carotene desaturation. Plant Physiol. Biochem. 30: 389-398

Mazelis, M. (1980) Amino acid metabolism. In "the biochemistry of plants" (Stumpf, PK, Conn, E.E; eds.), vol.5: amino acids and derivatives. Academic press, London, New York, pp: 1-55

Michal, G. - ed.- (1999) Biochemical Pathways, An atlas of biochemistry and molecular biology, Wiley & Spektrum eds., p. 60

Miflin, B.J.; Lea, P.J. (1982) Ammonium assimilation and amino acid metabolism. In A.B. Boulter, B. Parthiers, eds, Encyclopedia of Plant Physiology, Vol. 14, Nucleic Acids and Proteins in Plants 1. Springer Verlag, Berlin, PP: 5-64

Moreno-Arribas, V.; Lonvaud-Funel, A. (1999) Tyrosine decarboxylase activity of Lactobacillus brevis IOEB 9809 isolated from wine and L. brevis ATCC 367. FEMS Microbiology Letters. 180: 55-60

Moreno-Arribas, V.; Torlois, S.; Joyeux, A.; Bertrand, A.; Lonvaud-Funel, A. (2000) Isolation, properties and behaviour of tyramine-producing lactic acid bacteria from wine. J. Appl. Microbiol. 88: 584-593

Morot-Gaudry, J.F. (1997) Assimilation de l'azote chez les plantes. Aspects physiologique, biochimique et moléculaire. INRA Editions.

Mouillon, J.M.; Aubert, S.; Bourguignon, J.; Gout, E.; Douce, R.; Rebeillé, F. (1999) Glycine and serine catabolism in non-photosynthetic higher plant cells: their role in C1 metabolism. Plant J. 20: 197-205

Murashige, T.; Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tabacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473

Negrel, J.; Javelle, F.;(1995); Induction of phenylpropanoid and tyramine metabolism in pectinase or pronase elicited cell suspension cultures of tabacco (Nicotiana tabacum); Physiologia Plantarum, 95: 569-574

Nester, E.W.; Montoya, A.L. (1976) An enzyme common to histidine and aromatic amino acid biosynthesis in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 126: 699-705

Norris, S.R.; Barette, T.R.; DellaPenna, D. (1995) Genetic dissection of carotenoid synthesis in Arabidopsis defines plastoquinone as an essential component of phytoene desaturation. Plant Cell 7: 2139-2149

Pallett, K.E.; Little, J.P.; Sheekey, M.; Veerasekaran, P. (1998) The mode of action of Isoxaflutole. I. Physiological effects, metabolism and selectivity. Pestic. Biochem. Physiol. 62: 113-124

Prieto, M.A.; Perez-Randa, A.; Garcia, J.L. (1993) Characterization of an Escherichia coli aromatic hydroxylase with a broad substrat range. J. Bacteriol. 175: 2162-2167

Prieto, M.A.; Garcia, J.L.; (1994) Molecular characterization of 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 269: 22823-22829

Prieto, M.A.; Diaz, E.; Garcia, J.L. (1996) Molecular characterization of the 4-hydroxyphenylacetate catabolic pathway of Escherichia coli W: engineering a mobile aromatic degradative cluster. J. Bacteriol. 178: 111-120

Prieto M.A., Kellerhals M.B., Bozzato G.B., Radnovic D., Witholt B., Kessler B. (1999) Engineering of stable recombinant bacteria for production of chiral medium-chain-length poly-3-hydroxyalkanoates. Appl Environ Microbiol. 65: 3265-3271

Roberts, J.K.M. (2000) NMR adventures in the metabolic labyrinth within plants. Trends Plant Sci. 5: 30-34

\global\parskip0.950000\baselineskip

Roby, C.; Martin, J.B.; Bligny, R.; Douce, R. (1987) Biochemical changes during sucrose deprivation in higher plant cells. Phosphorus-31 nuclear resonance magnetic studies. J. Biol. Chem. 262: 5000-5007

Sailland, A.; Matringe, M.; Rolland, A.; Pallett, K. (1995) Gène de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase et obtention de plantes contenant ce gène résistantes aux herbicides. WO 96/38567

Sailland, A., Derose, R. (1999) Method for enzymatic preparation of homogentisate. WO9934008 A 19990708

Sambrook; Fritsch; Maniatis. Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd edition

Schroeder, C.; Sommer, J.; Humpfer, E.; Stöckigt, J. (1997) Inverse correlated 1H-13C in vivo NMR as a probe to follow the metabolism of unlabelled vanillin by plant cell cultures. Tetrahedron, 53: 927-934

Schoenle, E.J.; Adams, L.D.; Sammons, D.W. (1984) Insulin-induced rapid decrease of a major protein in fat cell plasma membranes. J. Biol. Chem. 259: 12112-12116

Shachar-Hill, Y.; Pfeffer, P.E.; Germann, M.W. (1996) Following plant metabolism in vivo and in extracts with heteronuclear two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. Analytic. Biochem., 243: 110-118

Singer, M.; Berg, P. (1992) Genes & Genomes. Ed. VIGOT, Paris

Sparnins, V.L.; Dagley, S. (1975) Alternative routes of aromatic catabolism in Pseudomonas acidovorans and Pseudomonas putida: Gallic acid as a substrate and inhibitor of dioxygenases. J. Bacteriol. 124: 1374-1381

Stafford, H.A.; (1994) Anthocyanins and betalains: evolution of the mutually exclusive pathways. Plant Sci.; 101: 91-98

Suemori, A.; Nakajima, K.; Kurane, R.; Nakamura, Y. (1995) L-Phenylalanine and L-Tyrosine degradative pathways in Rhodococcus erythropolis. Report Nat. Inst. Biosci. Hum. Tech. 3: 33-36

Suemori, A.; Nakajima, K.; Kurane, R.; Nakamura, Y. (1996) Purification and characterization of o-hydroxyphenylacetate 5-hydroxylase, m-hydroxyphenylacetate 6-hydroxylase and p-hydroxyphenylacetate 1-hydroxylase from Rhodococcus erythropolis. Journal of Fermentation and Bioengineering, 81: 133-137

Swiatek, L.; Grabias, B.; Kalemba, D. (1998) Phenolic acids in certain medicinal plants of the genus Artemisia. Pharm. Pharmacol. Lett. 4: 158-160

Swiatek, L. (1977) kwasy fenolowe I Glukozydy irydoidowe w niektorych krajowych gatunkach leczniczych z rodzaju Plantago. Herba Polonica XXIII (3): 201-209

Takizawa, N.; Yokoyama, H.; Yanagihara, K.; Hatta, T.; Kiyohara, H. (1995) A locus of Pseudomonas pickettii DTP0602. had, that encodes 2,4,6-trichlorophenol 4-dechlorinase with hydroxylase activity, and hydroxylation of various chlorophenols by the enzyme. J. Ferment. Bioeng. 80: 318-326

Trieu-Cuot, P.; Carlier, C.; Poyart-Salmeron, C.; Courvalin, P. (1991) An integrative vector exploiting the transposition properties of Tn1545 for insertional mutagenesis and cloning of genes from Gram-positive bacteria. Gene 106: 21-27

Tseng, T.C.; Tsai, T.H.; Lue, M.Y.; Lee, H.T. (1995) Identification of sucrose-regulated genes in cultured rice cells using mRNA differential display. Gene. 161: 179-1782

Vertes, A.; Asai, Y.; Inui, M.; Kobayashi, M.; Kurusu, Y.; Yukawa, H., (1994) Transposon mutagenesis of Coryneform bacteria, Mol. Gen. Genet., 245, 397-405

Vierstra, R.D. (1993) Protein degradation in plants. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44: 385-410

Viviani, F.; Little, J.; Pallett, K.E. (1998) Mode of action of Isoxaflutole - 2-Characterisation of the inhibition of the carrot 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase by the diketonitrile derivative of isoxaflutole; Pestic. Biochem. Physiol. 62: 125-134

Whistance, G.R.; Threlfall, D.R. (1970) Biosynthesis of phytoquinones. Homogentisic acid: a precursor of plastoquinones, tocopherols and alpha-tocopherolquinone in higher plants, green algae and blue-green algae. Biochem. J. 117: 593-600

Xun, L.Y. (1996) Purification and characterization of chlorophenol 4-monooxygenase from Burkholderia cepacia AC1100. J. Bacteriol. 178: 2645-2649

Xun, L. & Sandvik, E.R. (2000) Characterization of 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase (HpaB) of Escherichia coli as a reduced Flavin Adenine Dinucleotide-utilizing monooxygenase. Appl. Env. Microbiol. 66: 481-486.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Aventis CropScience S.A.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Plantas que toleran los herbicidas por circunvalación de la vía metabólica

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<130> genes del shunt

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<140>

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<141>

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<160> 22

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1683

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<212> ADN

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<213> Arthrobacter globiformis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1683)

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<400> 1

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<211> 561

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<213> Arthrobacter globiformis

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<211> 1944

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: mutante de HPPO de A. globiformis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (55)..(1737)

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<213> Secuencia artificial

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<211> 1962

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: mutante de HPPO de A. globiformis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (111)..(1793)

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: mutante de HPPO de A. globiformis

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<400> 6

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<210> 7

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<211> 1692

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<212> ADN

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<213> Pseudomonas acidovorans

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1692)

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<211> 564

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<213> Pseudomonas acidovorans

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<400> 8

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<211> 966

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<212> ADN

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<213> Pseudomonas acidovorans

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<221> CDS

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<222> (1)..(966)

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<400> 9

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25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212>

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pseudomonas acidovorans

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 966

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: mutante de HPAC de P. acidovorans

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(966)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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29

30

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<210> 12

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<211> 322

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<212>

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: mutante de HPAC de P. acidovorans

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 12

31

310

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 966

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: mutante de HPAC de P. acidovorans

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(966)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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32

33

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<210> 14

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<211> 322

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<212>

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: mutante de HPAC de P. acidovorans

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 14

34

340

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<210> 15

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<211> 3549

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: caja de expresión

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> promotor

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<222> (1)..(928)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (965)..(2647)

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<220>

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<221> terminador

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<222> (2811)..(3549)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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35

36

37

\newpage

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<210> 16

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<211> 241

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<212>

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: caja de expresión

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<400> 16

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38

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<210> 17

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<211> 2838

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: caja de expresión

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

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<222> (1)..(807)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (847)..(2538)

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<220>

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<221> terminador

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<222> (2539)..(2838)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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39

40

41

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<210> 18

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<211> 284

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<212>

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: caja de expresión

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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42

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<210> 19

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<211> 1839

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: caja de expresión

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(547)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (574)..(1539)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

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<222> (1540)..(1839)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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43

44

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<210> 20

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<211> 142

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<212>

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: caja de expresión

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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45

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 4677

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: caja de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

48

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

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<211> 8187

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: caja de expresión

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<400> 22

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49

50

51

52

53

Claims (18)

1. Procedimiento para volver a plantas tolerantes a un herbicida inhibidor de la ácido hidroxifenilpirúvico dioxigenasa (HPPD), caracterizado porque se expresan en dichas plantas al menos una enzima insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierte el ácido hidroxifenilpirúvico (HPP) en ácido 4-hidroxifenilacético (4-HPA) y una HPAH y una HPAC insensibles a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierten el 4-HPA en homogentisato y de las que al menos una de estas enzimas es heteróloga, y para el cual la HPAH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo constituido por la SEC ID NO 8 y sus fragmentos, y la HPAC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo constituido por las SEC ID NO 10, SEC ID NO 12 y SEC ID NO 14 y sus fragmentos.

2. Procedimiento para volver a plantas tolerantes a un herbicida inhibidor de la ácido hidroxifenilpirúvico dioxigenasa (HPPD), caracterizado porque se expresan en dichas plantas al menos una enzima insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierte el ácido hidroxifenilpirúvico (HPP) en ácido 4-hidroxifenilacético (4-HPA) y una HPAH y una HPAC insensibles a dicho herbicida inhibidor de HPPD que convierten el 4-HPA en homogentisato y de las que al menos una de estas dos enzimas es heteróloga, y para el cual la HPAH está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por secuencias que codifican las SEC ID NO 7 y SEC ID NO 17, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 7 o 17, y la HPAC está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 9, SEC ID NO 11, SEC ID NO 13 y SEC ID NO 19, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 9, 11, 13 ó 19.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se expresa en la planta una HPP oxidasa que convierte HPP en 4-HPA.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la HPP oxidasa comprende la secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por las SEC ID NO 2, SEC ID NO 4 y SEC ID NO 6 y sus fragmentos.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la HPP oxidasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias que codifican las SEC ID NO 1, SEC ID NO 3, SEC ID NO 5 y SEC ID NO 15, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 1, 3, 5 ó 15.

6. Célula vegetal que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima insensible a un herbicida inhibidor de HPPD que convierte HPP en 4-HPA, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAH funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID NO 8 y sus fragmentos, y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAC funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID NO 10, SEC ID NO 12 y SEC ID NO 14 y sus fragmentos, y para la que al menos una de las enzimas HPAH o HPAC es heteróloga.

7. Célula vegetal que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima insensible a un herbicida inhibidor de HPPD que convierte HPP en 4-HPA, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAH funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 7 y SEC ID NO 17, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 7 o 17, y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAC funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 9, SEC ID NO 11, SEC ID NO 13 y SEC ID NO 19, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 9, 11, 13 o 19, y para la que al menos una de las enzimas HPAH o HPAC es heteróloga.

8. Célula vegetal según la reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque la enzima que convierte HPP en 4-HPA es una HPP oxidasa.

9. Célula vegetal según la reivindicación 8, caracterizada porque la HPP oxidasa comprende la secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por las SEC ID NO 2, SEC ID NO 4 y SEC ID NO 6 y sus fragmentos.

10. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la HPP oxidasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 1, SEC ID NO 3, SEC ID NO 5 y SEC ID NO 15, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 1, 3, 5 ó 15.

11. Planta transformada que comprende una célula vegetal según una de las reivindicaciones 6 a 10.

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12. Grano de planta transformada según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende una célula vegetal según una de las reivindicaciones 6 a 10.

13. Procedimiento de obtención de una planta transformada tal como se define en la reivindicación 11, caracterizado porque se introduce en su genoma al menos un módulo de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAH funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende la secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº 8 y sus fragmentos, o al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAC funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende la secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por las SEC ID NO 10, SEC ID NO 12 y SEC ID NO 14 y sus fragmentos.

14. Procedimiento de obtención de una planta transformada tal como se define en la reivindicación 11, caracterizado porque se introduce en su genoma al menos un módulo de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAH funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPDD que comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 7 y SEC ID NO 17, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 7 ó 17, o al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPAC funcional insensible a dicho herbicida inhibidor de HPPD que comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por las secuencias codificantes SEC ID NO 9, SEC ID NO 11, SEC ID NO 13 y SEC ID NO 19, sus fragmentos y secuencias capaces de hibridar de manera selectiva en condiciones de medio muy rigurosas con dichas SEC ID NO 9, 11, 13 ó 19.

15. Procedimiento de escarda selectiva de plantas, especialmente de cultivos, que comprende las etapas siguientes:

a) se hacen brotar las plantas transformadas en una zona de cultivo,

b) se aplica sobre esta zona de cultivo un inhibidor de HPPD, caracterizado porque las plantas transformadas son tal como se describen en la reivindicación 11.

16. Procedimiento de control de malas hierbas en una superficie de un campo donde están presentes granos o plantas transformados, que comprende la aplicación en dicha superficie del campo de una dosis de herbicida inhibidor de HPPD tóxico para dichas malas hierbas y que no afecta de manera sustancial a granos o plantas transformados, caracterizado porque los granos transformados son tales como los descritos en la reivindicación 12 o las plantas transformadas son tales como las descritas en la reivindicación 11.

17. Procedimiento de cultivo de plantas transformadas que comprende la siembra de granos transformados en una superficie de un campo apropiado para el cultivo de dichas plantas, la aplicación sobre dicha superficie de dicho campo en caso de presencia de malas hierbas de un herbicida que tiene como diana la HPPD tóxico para las malas hierbas y que no afecta de manera sustancial a dichos granos o dichas plantas transformados, y después la recolección de las plantas cultivadas cuando llegan a la madurez y eventualmente la separación de los granos de las plantas recolectadas, caracterizado porque los granos transformados son tal como se describen en la reivindicación 12.

18. Procedimiento según las reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado porque el herbicida se aplica en presiembra y/o en postemergencia.