ES2331271B1 - Metodo para la internalizacion de bacterias no invasivas en celulas eucariotas. - Google Patents

Abstract

Método para la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

La presente invención se relaciona con el uso de la toxina adenilato ciclasa (ACT), o una variante funcionalmente equivalente de la misma, como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas. Gracias a la ACT, dicha bacteria no invasiva puede traslocarse a través de la membrana plasmática de una célula eucariota y transferir el ADN plasmídico a dicha célula, lo que resulta útil para liberar o introducir en el interior de la célula eucariota moléculas de interés terapéutico, por ejemplo, antígenos, desencadenado así la respuesta inmune.

Description

Método para la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas con fines terapéuticos y/o profilácticos; en particular, la invención se relaciona con el empleo de la toxina adenilato ciclasa (ACT) o una variante funcionalmente equivalente de la misma, como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

Antecedentes de la invención

El principio de la vacunación es inducir una respuesta inmune en el hospedador, protectora y duradera, frente a un microorganismo virulento. La finalidad de las vacunas es pues prevenir y controlar futuras infecciones.

Muchas de las bacterias patógenas son capaces de escapar al sistema inmune induciendo su propia internalización en células de mamífero y replicando eficazmente en su interior. La entrada de dichas bacterias al interior celular es mediada por fagocitosis típica cuando las células son fagocitos profesionales, o por fagocitosis inducida en el caso de células no fagocíticas (células epiteliales, hepatocitos, fibroblastos y células endoteliales).

Aprovechando esta propiedad, se ha desarrollado la técnica de la bactofección como herramienta que facilita la vacunación genética. La bactofección consiste en la transferencia de ADN plasmídico a células de mamífero mediada por bacterias intracelulares. Estas bacterias se caracterizan porque para su desarrollo y replicación necesitan estar en el interior de una célula. De esta manera, el uso de bacterias intracelulares se ha convertido en un método directo de transporte de ADN que consigue la expresión de proteínas heterólogas (antígenos proteicos, toxinas o enzimas) capaces de desencadenar respuestas inmunes, tanto humorales como celulares.

La estrategia de la bactofección se basa en la susceptibilidad de transformación de las bacterias patógenas intracelulares con vectores de expresión eucarióticos. De este modo, cepas atenuadas de esas bacterias pueden transportar dichos plásmidos a las células presentadoras de antígeno (APC). Una vez internalizadas, la bacterias alteran las características del compartimento fagosómico previniendo la fusión con lisosomas y garantizando así su supervivencia. También se ha descrito la capacidad, en muchas de ellas, de lisar el fagosoma y replicar en el citosol. Experimentos con Listeria monocytogenes han demostrado que el ADN plasmídico se transporta al citosol celular, tras una autodestrucción parcial de la bacteria. Una vez en el citosol, el ADN puede ser transportado al núcleo celular y, de esta manera, los antígenos codificados por el plásmido se expresan en la célula presentadora de antígeno.

Aunque se desconoce el mecanismo de transporte del ADN plasmídico desde el fagolisosoma al núcleo celular, se ha demostrado que estas cepas atenuadas pueden utilizarse como portadoras de vacunas no solo a roedores, sino también a células de primates y a células dendríticas humanas.

Uno de los principales atractivos de estos vectores bacterianos es su potencial para ser administrados oralmente, además de permitir la inducción de respuesta inmune en la mucosa, esencial en aquellas enfermedades producidas por patógenos cuya vía de entrada al organismo son las mucosas.

Otro mecanismo de vacunación alternativo empleado en los últimos años se basa en los sistemas bacterianos presentadores de antígenos recombinantes. En estos modelos, los antígenos heterólogos sintetizados por las bacterias son solamente accesibles tras la desintegración de la bacteria. Se han desarrollado alternativas para la exportación de los antígenos al citoplasma entre los que se incluyen la utilización de las señales de exportación de MalE y OmpA, o la fusión con la toxina LT-B de Escherichia coli. También se han descrito dos sistemas de secreción de antígenos heterólogos por bacterias Gram negativas, que incluyen el sistema de secreción de tipo III, que permite la "inyección" del antígeno a la célula diana y el sistema autotransportador AIDA. Sin embargo, muchos de esos sistemas solo pueden portar péptidos pequeños de los antígenos heterólogos. Para solucionar el problema del tamaño del antígeno se empieza a utilizar el sistema de secreción de hemólisina (HlyA) ya que parece no imponer ninguna limitación en el tamaño de los antígenos transportados. Este transportador permite la secreción activa de grandes antígenos heterólogos por bacterias atenuadas, lo que ha conducido al desarrollo de gran cantidad de vacunas vivas recombinantes. Muchas proteínas heterólogas presentadas mediante esta vía inducen respuestas inmunes humorales y/o celulares al organismo hospedador. Esas respuestas inmunes demuestran que existe una expresión y secreción activa de los antígenos heterólogos in vivo.

Los transportadores bacterianos pueden colonizar la superficie celular, el fagosoma especializado de las células presentadoras de antígeno (APC) o el citosol de las células infectadas y transportar un mismo antígeno a diferentes compartimientos de las APC, desencadenando así diferentes respuestas inmunes frente a un mismo antígeno.

A la vista de lo anterior, existe la necesidad de proporcionar un mecanismo alternativo a la utilización de cepas patógenas atenuadas en estas vacunas de vectores bacterianos debido al riesgo que plantean al estar formadas por microorganismos vivos. De hecho, uno de los principales escollos de estas vacunas es la posible reversión hacia la patogenicidad o que estos microorganismos mantengan su actividad patógena. A pesar del alto grado de atenuación que se consigue en este tipo de bacterias, su aplicación puede verse comprometida en pacientes con inmunodeficiencias primarias o secundarias o bien que tengan un estado de inmunosupresión provocado por fármacos o enfermedades oportunistas, así como en mujeres embarazadas.

La toxina adenilato ciclasa (ACT) es una proteína con capacidad para internalizarse al citoplasma de las células eucariotas, y, tras su activación por calmodulina, catalizar la transformación incontrolada de adenosin-trifosfato (ATP) a adenosin-monofosfato cíclico (AMPc) produciendo la intoxicación de dicha célula eucariota. Dicha ACT es un ejemplo único de toxina enzimáticamente activa capaz de translocar directamente a través de la membrana plasmática de una célula, sin que sea necesaria una endocitosis mediada por receptor. El mecanismo molecular por el que tiene lugar la translocación del dominio catalítico al citoplasma de las células es, actualmente, desconocido. Se sabe que en algunos tipos celulares es necesario un potencial de membrana negativo, aunque la toxina puede invadir de forma eficiente células con bajo potencial de membrana, como el caso de los eritrocitos, que además carecen de tráfico intracelular de membranas. En este caso, se cree que la penetración al interior del eritrocito se inicia con una adsorción inespecífica de la toxina sobre la superficie de la célula, seguida de una inserción y translocación directa del segmento de 40 kDa a través de la membrana, aunque se desconocen los eventos moleculares que tienen lugar en el proceso. La adenilato ciclasa es, al igual que la \alpha-hemolisina de E. coli, una toxina con amplia especificidad celular. Recientemente se ha descrito que la integrina \alpha_{M}\beta2 (CD11b/CD18) constituye el receptor específico para la ACT en leucocitos, así como el posible empleo de dicha ACT en el reparto de epítopos de células T hacia las rutas de presentación del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o de clase II.

Compendio de la invención

Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que cuando la toxina adenilato ciclasa (ACT) está unida a la membrana externa de una bacteria no invasiva, dicha bacteria puede internalizarse e invadir una célula eucariota.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con el uso de la ACT, o una variante funcionalmente equivalente de la misma, como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una bacteria no invasiva que comprende, unida a su membrana, ACT o una variante funcionalmente equivalente de la misma. En una realización particular, dicha bacteria comprende además

(i)

un polinucléotido que codifica un polipéptido heterólogo de interés, o

(ii)

una construcción génica que comprende un polinucléotido según (i), o

(iii)

un plásmido que comprende una construcción génica según (ii) o

(iv)

un polipéptido heterólogo de interés.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una bacteria no invasiva que comprende, unida a su membrana, ACT o una variante funcionalmente equivalente de la misma, proporcionada por esta invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Aspectos adicionales de la presente invención incluyen los distintos usos de dicha bacteria no invasiva que comprende, unida a su membrana, ACT o una variante funcionalmente equivalente de la misma, tales como el uso de dicha bacteria como medicamento y el uso de dicha bacteria en la elaboración de una vacuna.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de una bacteria no invasiva que comprende, unida a su membrana, ACT o una variante funcionalmente equivalente de la misma, que comprende incubar una bacteria no invasiva con ACT, o con una variante funcionalmente equivalente de la misma, o, alternativamente, transformar una bacteria no invasiva con un polinucleótido que codifica la ACT o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

Por último, la presente invención se relaciona con un método para inducir la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas que comprende:

(a)

incubar una bacteria no invasiva en presencia de ACT, o una variante funcionalmente equivalente de la misma, o, alternativamente, transformar la bacteria no invasiva con un polinucleótido que codifica la ACT, o una variante funcionalmente equivalente de la misma, y

(b)

poner en contacto la bacteria obtenida en el apartado (a) con un cultivo de células eucariotas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra los niveles intracelulares de AMPc en células CHO tras el tratamiento con distintas concentraciones de ACT (0,5-20 \mug/ml) o con bacterias E. coli recubiertas con ACT a diferentes concentraciones (10-100 \mug).

La Figura 2 muestra la reorganización del citoesqueleto de células CHO inducida por la ACT. La Figura 2a muestra las células CHO control teñidas con Alexa Fluoro488 phalloidin y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar las fibras de actina-F y el ADN, respectivamente. La Figura 2b muestra las células CHO tratadas con la ACT soluble a una concentración de 20 \mug/ml. La Figura 2c muestras las células CHO tratadas con ACT soluble a una concentración de 2 \mug/ml. La Figura 2d muestra las células CHO tratadas con E. coli recubiertas con ACT. La cantidad de ACT unida a la superficie celular es de 0,55 \mug toxina/10^{8} bacterias. Se utilizaron anticuerpos primarios monoclonales anti-ACT y anticuerpos secundarios unidos a Texas Red para detectar las bacterias recubiertas con la ACT.

La Figura 3 corresponde a fotografías de microscopía electrónica de barrido en las que se aprecia la interacción de las bacterias recubiertas con ACT con las células CHO. La co-incubación de las células CHO y E. coli recubiertas con ACT tiene como resultado la formación de estructuras parecidas a los pseudópodos que abrazan las bacterias previamente a su internalización.

La Figura 4 muestra las distintas etapas de la internalización de bacterias recubiertas con ACT en células CHO. En la Figura 4a se observa el contacto de las bacterias a la membrana celular. La Figura 4b muestra una fuerte adhesión de la bacteria a la membrana celular. En la Figura 4c se observa la fagocitosis de la bacteria. En la Figura 4d se muestra una bacteria invasiva rodeada de vesículas membranosas.

La Figura 5 muestra la interacción de la ACT con la actina detectada mediante la técnica del dot blotting.

La Figura 6 muestra la polimerización de actina marcada con pireno inducida por la ACT. La cinética de polimerización se detecta por el aumento de fluorescencia producido al polimerizar la actina pireno.

La Figura 7 son unas microfotografías electrónicas correspondientes a actina-F control y a filamentos de actina obtenidos mediante la incubación de actina-G con la ACT.

La Figura 8 muestra grandes halos de actina polimerizada alrededor de bacterias recubiertas con ACT e incubadas con actina G.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de la toxina adenilato ciclasa (ACT), o una variante funcionalmente equivalente de la misma, como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

Tal como se utiliza en esa descripción, el término "toxina adenilato ciclasa" o "ACT" (también conocida como CyaA) se refiere a una proteína que cataliza la transformación de ATP a AMPc y, además, es capaz de traslocar directamente a través de la membrana plasmática de una célula eucariota. En una realización particular, dicha ACT deriva de un microorganismo del género Bordetella sp., e.g., B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica, etc., o de moléculas relacionadas de otras bacterias. Moléculas relacionadas incluyen proteínas de otras bacterias con secuencias homólogas a las de la ACT En otra realización particular, dicha ACT presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, que corresponde a la secuencia de la ACT (también denominada CyaA) de B. pertussis accesible en la base de datos swissprot con el código P15318 o en la base de datos del NCBI bajo el código NP_879578. Asimismo, en otra realización particular, la ACT corresponde a la proteína recombinante expresada en E. coli K12 XL-1blue transformada con el plásmido pT7CACT1 obtenida según Osicka et al. (Osicka, RA et al. 2000 Infect. Immun 68:247-256) o Martín et al. (Martín et al., 2004. J. Bacteriol 186:3760-3765). La secuencia de ADN de CyaA carece de polimorfismos entre los aislados de B. pertussis (Packard ER, et al., 2004, J. Med. Microbiol. Vol. 53: 355-365) y presenta alta homología entre las distintas especies de Bordetella sp. con una identidad mayor del 97% entre B. pertussis y B. bronchiseptica o B. parapertussis (Parkhill, J. et al. 2003. Nat. Genet. Vol. 35: 32-40).

El término "proteína", tal como aquí se utiliza, se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no covalentes. El término incluye, además, todas las formas de modificaciones químicas post-traduccionales, relevantes fisiológicamente, por ejemplo, glicosilación, fosforilación o acetilación, siempre y cuando se mantenga la capacidad de inducir la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

La expresión "variante funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, se refiere a una proteína cuya secuencia de aminoácidos (i) es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos de una ACT determinada y (ii) mantiene, al menos, una de las actividades de dicha ACT, por ejemplo, la capacidad de catalizar la transformación de ATP a AMPc, la capacidad de actuar como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas, etc., preferentemente, al menos, esta última.

Una secuencia de aminoácidos es sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos determinada cuando presenta un grado de identidad de, al menos, un 70%, ventajosamente de, al menos, un 75%, típicamente de, al menos, un 80%, preferentemente de, al menos, un 85%, más preferentemente de, al menos, un 90%, aún más preferentemente de, al menos, un 95%, 97%, 98% ó 99%, respecto a dicha secuencia de aminoácidos determinada. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo BLAST [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10].

La capacidad de la ACT, o de una variante funcionalmente equivalente de la misma, de actuar como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en una célula eucariota, puede ser evaluada por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante un ensayo de protección con antibióticos tal como el descrito en el Ejemplo 1 (apartado 1.9 de los Materiales y Métodos).

El experto en la materia entiende que, las mutaciones en la secuencia de nucleótidos de la ACT que dan lugar a sustituciones conservativas de aminoácidos en posiciones no criticas para la funcionalidad de la proteína, son mutaciones evolutivamente neutras que no afectan a su estructura global ni a su funcionalidad. Dichas variantes caen dentro del ámbito de la presente invención. Están incluidas también dentro del ámbito de la invención aquellas variantes funcionalmente equivalentes de una ACT determinada que presenten inserciones, deleciones o modificaciones de uno o más aminoácidos respecto a dicha ACT determinada, y conserven, además, la capacidad de actuar como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

Por tanto, tal como aquí se utiliza, el término "variante funcionalmente equivalente" también incluye cualquier fragmento funcionalmente equivalente de una ACT. El término "fragmento" se refiere a un péptido que comprende una porción de una proteína. En este caso, un fragmento funcionalmente equivalente de una ACT es un péptido o proteína que comprende una porción de una ACT y mantiene la capacidad de actuar como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

Prácticamente cualquier ACT, o variante funcionalmente equivalente de la misma, puede ser utilizada para la puesta en práctica de la presente invención; no obstante, en una realización particular, dicha ACT es una ACT aislada de Bordetella sp., e.g., B. pertussis, B. brochiseptica, B. parapertussis, etc. En una realización concreta, dicha ACT tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

Dicha ACT puede ser obtenida a partir de un microorganismo productor, de forma nativa o recombinante, de dicha proteína. La obtención y purificación de la ACT puede realizarse por métodos convencionales conocidos por el experto en la materia. A modo ilustrativo, no limitativo, en el Ejemplo 1 se describe un procedimiento de obtención y purificación de una ACT con capacidad de internalizarse en células eucariotas y replicar eficazmente en su
interior.

En la presente invención, se entiende por "agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas" aquel agente que es capaz de provocar o inducir la entrada de una bacteria no invasiva en una célula eucariota. A modo ilustrativo, el empleo de la ACT como agente inductor de internalización de bacterias no invasivas va dirigido a aquellas bacterias (i) que carecen de la capacidad de internalizarse en una célula eucariota de forma natural, o bien (ii) que, a pesar de tener dicha capacidad de internalizarse en una célula eucariota de forma natural ("bacterias invasivas") han sido modificadas genéticamente para que no puedan hacerlo.

Por tanto, tal como aquí se utiliza, la expresión "bacteria no invasiva" se refiere a una bacteria que no es una bacteria invasiva. Asimismo, el término "bacteria invasiva", se refiere a una bacteria que de forma natural tiene la capacidad de inducir su propia internalización o entrada en el citoplasma de una célula eucariota y replicar eficazmente en su interior. Una definición de "bacteria invasiva" puede encontrarse en Bonazzi M. and Cossart, P. 2006. Bacterial entry into cells: a role for the endocytic machinery. FEBS Lett Vol.580(12):2962-2967. Ensayos para determinar si una bacteria es invasiva son ampliamente conocidos por el experto en la materia, véase, por ejemplo Boer, EC., et al. 1996. Cytometry. Vol. 25(4): 381-387; Burton, E.A., et al. Ab1 tyrosine kinases are required for infection by Shigella flexneriy. The EMBO Journal. Vol. 22(20): 5471-5479; y la solicitud de patente internacional WO
90/12867.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una bacteria, en adelante bacteria de la invención, no invasiva que comprende, unida a su membrana, una ACT o una variante funcionalmente equivalente de la misma. Dicha ACT, o variante funcionalmente equivalente de la misma, puede estar asociada, recubriendo, adherida o anclada a la membrana de la bacteria no invasiva, por ejemplo, puede estar asociada, recubriendo, adherida o anclada sobre la superficie externa de la membrana de la bacteria no invasiva. En los ejemplos que acompañan a la presente descripción, dicha ACT se encuentra adherida sobre la superficie externa de la membrana de una bacteria no
invasiva.

La elección del tipo de bacteria no invasiva empleada según la presente invención, dependerá, entre otros factores, del tamaño de su genoma, de la capacidad replicativa y de la estabilidad genética. Preferentemente, la bacteria no invasiva es una bacteria no patógena (es decir, que no posee suficiente capacidad metabólica para producir daño, por sí misma o en asociación con otros factores, a un sujeto y causar enfermedad) para un animal, más preferentemente, para el ser humano. A modo ilustrativo, no limitativo, bacterias no invasivas según la presente invención incluyen, por ejemplo, Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens, tal como se muestra en los Ejemplos que acompañan a la presente descripción.

Tal como se discutirá más adelante, la unión de dicha ACT a la membrana externa de la bacteria no invasiva permite a ésta internalizarse en células eucariotas, por lo que la bacteria de la invención puede ser utilizada para introducir polinucleótidos, plámidos y/o polipéptidos heterólogos de interés en las células eucariotas.

\newpage

Por tanto, en una realización particular, la bacteria de la invención comprende además

(i)

un polinucléotido que codifica un polipéptido heterólogo de interés, o

(ii)

una construcción génica que comprende un polinucléotido según (i), o

(iii)

un plásmido que comprende una construcción génica según (ii) o

(iv)

un polipéptido heterólogo de interés.

Tal como aquí se utiliza, el término "polipéptido heterólogo de interés" se refiere a cualquier polipéptido (e.g., péptido o proteína) heterólogo que se desea introducir en una célula eucariota tal como un antígeno, una toxina, una enzima, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de antígenos que pueden emplearse como "polipéptidos heterólogos de interés" en la presente invención incluyen:

\sqbulletPéptidos o proteínas capaces de (apropiados o diseñados para) inducir una respuesta inmune frente a una enfermedad infecciosa, tal como una enfermedad infecciosa en animales causada por microorganismos patógenos de animales, incluyendo al ser humano, por ejemplo, virus, bacterias, hongos y parásitos infecciosos, relevantes en sanidad humana o animal.

\quad

Las proteínas o péptidos capaces de inducir una respuesta inmune pueden ser proteínas o péptidos recombinantes, idénticos o similares a los antígenos naturales de un microorganismo específico.

\quad

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de virus infecciosos incluyen virus de las familias: Arteriviridae, Retroviridae, Picornaviridae, Calciviridae, Togaviridae, Flaviridae, Coronoviridae, Rhabdoviradae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bungaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae (parvovirus), Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Iridoviridae, etc. Ejemplos de antígenos que se pueden emplear según la presente invención incluyen, aunque no se limita a, antígenos de HIV, antígeno gp120, antígeno de superficie de la hepatitis B, antígenos de rotavirus como VP4 y VP7, antígenos del virus de la influenza como la hemaglutinina o la nucleoproteína, antígeno del herpes simplex timidina kinasa, etc.

\quad

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de bacterias incluyen tanto bacterias Gram positivas, e.g., Pasteurella sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., etc., como bacterias Gram negativas, e.g., Escherichia coli, Pseudomonas sp., Salmonella sp., etc. Ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen: Helicobacter pylori, Borelia burgdorferi, Legionella pneumoplailia, Mycobacteria sp. (e.g., M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogefáes (Grupo A de Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Grupo B de Streptococcus), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaeróbicas), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus aratracis, Corynebacteriumdiphtlzeriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pyzeunaoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponemapallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, Actinornyces israelli, Chlamydia, etc.

\quad

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de hongos infecciosos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis y Candida albicans.

\quad

Entre los parásitos infecciosos se incluyen, a modo ilustrativo, no limitativo, protozoos, tales como Plasmodium sp., causantes de la malaria, e.g. P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, etc., Leishmania sp., causantes de leishmaniasis, e.g., L. major, L. donovani, L. infantum, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, etc., Toxoplasma gondii, Schistosoma sp., etc., así como nematodos parásitos, tales como Dirofilaria immitis, etc. Ejemplos de antígenos para estos parásitos incluyen el antígeno circumsporozoito de Plasmodium spp.; el antígeno de superficie merozoito de Plasmodium spp.; el gp63 de Leishmania spp.. etc.

\sqbulletPéptidos o proteínas asociados a tumores o cánceres ("marcadores tumorales") capaces de (apropiados o diseñados para) inducir una respuesta inmune frente a una célula tumoral o cancerosa, por lo que el polipéptido heterólogo de interés puede ser utilizado en el tratamiento de cánceres mediante la estimulación de una respuesta inmune específica de antígeno frente a un antígeno tumoral.

\quad

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de cánceres que podrían ser potencialmente tratados de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen cáncer del tracto biliar, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de estómago, neoplasmas intraepiteliales, linfomas, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (e.g., cáncer de pulmón de células pequeñas y de células no pequeñas), melanoma, neuroblastomas, cáncer de boca, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de recto, sarcomas, cáncer de piel, cáncer de testículos, cáncer de tiroides y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas.

\quad

La selección de antígenos tumorales o determinantes antigénicos para el tratamiento de cánceres puede ser realizada por un experto en la materia a la vista del estado de la técnica [Renkvist et al., Cancer Immunol. Immunother. 50:3-15 (2001)], estando dichos antígenos y determinantes antigénicos incluidos dentro del ámbito de la presente invención. Ejemplos representativos de dichos antígenos o determinantes antigénicos incluyen: Her2 (cáncer de mama); GD2 (neuroblastoma); EGF-R (glioblastoma maligno); CEA (cáncer de tiroide medular); CD52 (leucemia); proteína gp100 de melanoma humano; proteína melan-A/MART-1 de melanoma humano; tirosinasa; proteína NA17-A nt; proteína MAGE-3; proteína p53; proteína HPVI6E7; y fragmentos antigénicos de dichos péptidos o proteínas.

\sqbulletPéptidos o proteínas capaces de (apropiados o diseñado para) inducir una respuesta inmune frente a un alergeno.

\quad

Tal como se utiliza en esta descripción, el término "alergeno" se refiere a un péptido o proteína a la que un sujeto es sensible y provoca una reacción inmunitaria, por ejemplo, extractos alergénicos de pólenes, extractos alergénicos de insectos, extractos alergénicos de alimentos o productos alimenticios, componentes presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, componentes presentes en plantas que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de alergenos incluyen extractos proteicos de pólenes, e.g., de Lolium perenne, Poa pratense, Phleum pratense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa, Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Plantago lanceolata, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica, Olea europea, Platanus sp., Cupressus sp., etc.; extractos proteicos de insectos, e.g., de Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Acarus siro, Blomia tropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae, etc.; extractos proteicos de hongos o de epitelios animales, e.g., Penicillium sp., Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, epitelio de perro, epitelio de gato, epitelio de caballo, etc.; extractos proteicos de alimentos o productos alimenticios, etc.

\sqbulletPéptidos o proteínas capaces de (apropiados o diseñados para) inducir una respuesta mejorada frente a un auto-antígeno. El término "auto-antígeno", tal como aquí se utiliza, se refiere a péptidos o proteínas codificados por el ADN del sujeto y productos generados por proteínas o ARN codificado por el ADN del sujeto. Ejemplos de auto-antígenos se describen en WO 02/56905.

El polipéptido heterólogo de interés está codificado por un polinucleótido que, a su vez, puede estar formando parte de una construcción génica. Dicho polinucleótido o construcción génica que lo comprende puede estar integrado en el genoma de la propia bacteria de la invención, de forma que se replica y expresa endógenamente, o puede estar comprendido en un vector o plásmido, de forma que puede replicarse y expresarse independientemente del genoma de la bacteria de la invención. En caso de que se desee que dicho polinucleótido o construcción génica esté insertado en el genoma de la bacteria de la invención, dicha inserción se realiza comúnmente mediante técnicas de recombinación genética bien conocidas en el estado de la técnica.

Dicha construcción génica que comprende el polinucléotido que codifica un polipéptido heterólogo de interés, puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3^{rd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3]. La construcción génica puede incorporar, operativamente unida, una secuencia control o reguladora de la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido heterólogo de interés, constituyendo de este modo un cassette de expresión.

Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente unida" significa que los polipéptidos codificados por el polinucleótido son expresados en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de la expresión. Cassettes de expresión múltiples pueden emplearse según la presente invención de forma que expresan cualquier combinación de genes virales, bacterianos, parásitos, o genes sintéticos que codifican el total o fragmentos de cualquiera de las combinaciones de antígenos descritos anteriormente. Los cassettes de expresión también pueden ser eucarióticos, de forma que codifican un agente terapéutico para células animales. Por ejemplo, el cassette de expresión puede codificar un antígeno específico de tumor, de transplante o un antígeno autoinmune o fragmento del mismo.

Alternativamente, el cassette de expresión eucariota puede codificar genes sintéticos, que codifican un antígeno específico de tumor, de transplante o un antígeno autoinmune o fragmento del mismo. Ejemplos de antígenos específicos de tumor incluyen el antígeno específico de próstata TAG-72 y CEA, MAGE-1 y la tirosinasa. Ejemplos de antígenos de transplante incluyen, aunque no se limita, el receptor de CD3 de células T. Así mismo, los cassettes de expresión eucariotas pueden codificar moléculas inmunoreguladoras. Dichas moléculas incluyen, aunque no se limitan, a factores de crecimiento y citoquinas como IL-2, IL-4, L-5, IL-6, IL-10, IL-12 o IFN-\gamma.

Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción de ARN mensajero al polinucleótido heterólogo de interés. Dichas secuencias de control incluyen secuencias promotoras, secuencias que codifican reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de la transcripción; y pueden ser funcionales en células y organismos procariotas, como por ejemplo, las bacterias, y/o pueden ser funcionales en células y organismos eucariotas, como por ejemplo, células de insecto, células vegetales, células de mamífero, etc.

Ventajosamente, dicha construcción génica comprende, además, un marcador o gen que codifica un motivo o un fenotipo que permite la selección de la célula hospedadora transformada con dicha construcción.

Dicha construcción génica puede ser insertada en un vector apropiado, de aquí en adelante vector de la invención, tal como un plásmido. Por tanto, dicho plásmido comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido heterólogo de interés o la construcción génica que comprende dicho polinucleótido. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo ilustrativo, el plásmido donde se introduce dicho polinucleótido o construcción génica puede ser un plásmido que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector/plámisdo puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrook et al., 2001, citado at supra]. Dicho vector/plásmido recombinante es un vector útil para transformar bacterias no invasivas. Tal como se ha citado anteriormente, el vector de la invención puede ser un plásmido que, preferiblemente, es una molécula de ADN circular que puede replicarse independientemente del genoma de la célula. Dicho plásmido, adicionalmente, puede comprender genes de resistencia a antibióticos para seleccionar aquellas células que han incorporado el plásmido, un promotor, generalmente viral, un terminador de la transcripción y otros elementos ampliamente conocidos por el experto en la materia.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica, de aquí en adelante, composición farmacéutica de la invención, que comprende la bacteria de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Generalmente, la dosis de bacterias de la invención a emplear en la composición farmacéutica de la invención variará entre 10^{3} y 10^{11} ufc (unidades formadoras de colonias), más preferiblemente, entre 10^{5} y 10^{9} ufc.

Adicionalmente, la composición farmacéutica de la invención puede contener un adyuvante con el fin de aumentar la respuesta inmune protectora frente al antígeno o antígenos que se administran al sujeto.

El término "sujeto" se refiere a un miembro de una especie de animal mamífero e incluye, pero no se limita a, un animal doméstico, un primate y un humano; el sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de cualquier raza o edad.

La dosis de la composición farmacéutica de la invención que se va a administrar al sujeto dependerá de muchos factores, entre los que se incluyen las características de la bacteria de la invención empleada en la elaboración de la composición farmacéutica, la situación clínica del sujeto, la enfermedad a ser tratada, etc. Para su administración al sujeto, la composición farmacéutica de la invención incluirá vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables en función de la forma farmacéutica de administración seleccionada y de la vía de administración elegida. A modo ilustrativo, no limitativo, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse en forma de una suspensión, etc., adecuada para su administración a través de cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, por vía parenteral, oral, etc.

La composición farmacéutica de la invención puede ser preparada por métodos convencionales conocidos por el experto en la materia. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

Gracias a la presencia de la ACT, la bacteria de la invención puede traslocarse a través de la membrana plasmática de una célula eucariota y transferir el ADN plasmídico a dicha célula. Si previamente se ha introducido (por ejemplo, por manipulación genética) un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo de interés (tal como se ha definido anteriormente) en dicho ADN plasmídico, entonces la bacteria de la invención es útil para liberar o introducir en el interior de la célula eucariota moléculas de interés terapéutico.

Por tanto, en un aspecto la presente invención va dirigida al uso de la bacteria de la invención como medicamento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la bacteria de la invención para terapia génica.

Aprovechando la propiedad de la bacteria de la invención de internalizarse en las células eucariotas, la bacteria de la invención puede emplearse como herramienta para facilitar la vacunación genética, es decir, el empleo de la bacteria de la invención para transportar ADN que codifica los polipéptidos heterólogos de interés (antígenos proteicos, toxinas o enzimas) capaces de desencadenar respuestas inmunes, tanto humorales como celulares.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la bacteria de la invención en la elaboración de una vacuna, de aquí en adelante, vacuna de la invención.

Las vacunas pueden prepararse como inyectables bien como disoluciones líquidas o bien como suspensiones; se pueden preparar también formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en líquido antes de la inyección. En caso de que se desee que la bacteria de la invención permanezca viva, se ha de tener en cuenta la preparación de la vacuna con los componentes adecuados para garantizar la supervivencia de la bacteria de la invención.

Así, la vacuna de la invención puede administrarse parenteralmente, mediante inyección, tanto de forma subcutánea como intramuscular.

Por otro lado, la vacuna de la invención puede contener un adyuvante que ayude a potenciar la respuesta inmune. Procedimientos de lograr efecto coadyuvante para la vacuna incluyen (i) el uso de agentes tales como hidróxido o fosfato de aluminio (alum), usado comúnmente como una disolución de 0,05 a 0,1% en tampón salino de fosfato, (ii) mezcla con polímeros sintéticos de azúcares (Carbopol) usada como disolución al 0,25% y (iii) agregación de la proteína en la vacuna mediante tratamiento de calor con temperaturas variando entre 70ºC y 101ºC durante periodos de 30 segundos y 2 minutos respectivamente. Otras posibilidades implican el uso de sustancias moduladoras inmunitarias tales como linfoquinas (por ejemplo, INF-\gamma, IL-2 e IL-12) o inductores INF-\gamma sintéticos tales como poli I:C en combinación con los coadyuvantes anteriormente mencionados. Prácticamente cualquier adyuvante que pueda ser administrado por la vía de administración elegida puede ser utilizado.

La vacuna proporcionada por esta invención puede contener uno o más polipéptidos heterólogos de interés. En una realización particular, dicha vacuna contiene un único polipéptido heterólogo de interés. En otra realización particular, dicha vacuna contiene de dos o más polipéptidos heterólogos de interés diferentes.

La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios, adversos significativos en las vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de los inmunógenos específicos empleados.

En una realización particular, el uso de la bacteria de la invención va dirigido a la elaboración de una vacuna para un proceso de inmunización mediante bactofección.

En otra realización particular, el uso de la bacteria de la invención va dirigido a la elaboración de una vacuna para un proceso de inmunización mediante un sistema bacteriano presentador de antígenos.

La bacteria de la invención puede obtenerse por cualquier método conocido por el experto en la materia, como por ejemplo, la incubación de la bacteria no invasiva con la ACT, o un variante funcionalmente equivalente de la misma, o la transformación de la bacteria no invasiva con el polinucleótido que codifica la ACT, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de la bacteria de la invención, de aquí en adelante procedimiento de la invención, que comprende incubar una bacteria no invasiva con una ACT, o una variante funcionalmente equivalente de la misma; o alternativamente, transformar una bacteria no invasiva con un polinucleótido que codifica la ACT, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En una realización particular del procedimiento de la invención, la ACT presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

En una realización todavía más particular, la ACT utilizada en el procedimiento de la invención comprende la señal de exportación para la maquinaria específica de secreción de dicha toxina.

Tal como se ha explicado anteriormente, los inventores de la presente invención han descubierto que, cuando dicha ACT está unida la membrana externa de una bacteria no invasiva, dicha bacteria no invasiva puede internalizarse e invadir una célula eucariota.

Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método, de aquí en adelante método de la invención, para inducir la internalización de bacterias no invasivas que comprende:

(a)

incubar una bacteria no invasiva en presencia de una ACT, o de una variante funcionalmente equivalente de la misma, o transformar una bacteria no invasiva con un polinucleótido que codifica una ACT, o una variante funcionalmente de la misma, y

(b)

poner en contacto la bacteria obtenida en el apartado (a) con un cultivo de células eucariotas.

En una realización particular del método de la invención, la ACT presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

Adicionalmente, en otra realización particular, la bacteria del método de la invención comprende

(i)

un polinucléotido que codifica un polipéptido heterólogo de interés, o

(ii)

una construcción génica que comprende un polinucléotido según (i), o

(iii)

un plásmido que comprende una construcción génica según (ii) o

(iv)

un polipéptido heterólogo de interés.

El siguiente ejemplo ilustra la invención y no debe ser considerado limitativo del alcance de la misma.

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Ejemplo 1

Internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas mediada por la toxina adenilato ciclasa (ACT) I. Materiales y Métodos 1.1 Obtención y purificación de la ACT

La ACT fue producida en células de E. coli XL1-blue (Stratagene) transformadas con el plásmido pT7CACT1 (Martín et al., 2004. J. Bacteriol 186:3760-3765). Los cultivos celulares (500 ml) en fase exponencial fueron inducidos con isopropil-\beta-D-tio-galactósido (IPTG) 1 mM durante 3 horas. A continuación, las células fueron sonicadas y los cuerpos de inclusión se extrajeron con urea 8 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8 y CaCl_{2} 0,2 mM. Las proteínas se purificaron en sucesivas cromatografías de intercambio iónico en columnas de DEAE-Sepharose y Phenyl-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) según un protocolo conocido (Sakamoto et al., 1992. JBC 267:13598-13602). En el paso final, las proteínas se fluyeron en urea 8 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y se congelaron a -20ºC hasta su utilización.

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1.2 Anclaje/adsorción de la ACT a la membrana bacteriana

Las bacterias (E. coli) se crecieron en medio LB (medio Luria-Bertoni) durante 12 horas. A continuación, se centrifugaron a 10.000 r.p.m. durante 5 minutos y se resuspendieron en tampón (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH 8) a una concentración aproximada de 10^{8} bacterias/ml. A la suspensión bacteriana se le añadieron 20 \mug/ml de ACT y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora en agitación constante. Para eliminar la ACT no unida a las bacterias, la suspensión se centrifugó a 4.000 r.p.m. durante 5 minutos y se lavó 3 veces con el mismo tampón. Para aumentar la eficiencia de unión de la ACT a la superficie bacteriana, el proceso se repitió 5 veces antes de la incubación con las células eucariotas.

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1.3 Cuantificación de AMPc

La actividad de intoxicación de la ACT se determinó mediante cuantificación del AMPc intracelular producido en células de ovario de hamster chino (CHO, del inglés chinese hamster ovary) (LGC Prochem). Tras la incubación con ACT o con las bacterias recubiertas con ACT, las células CHO se homogenizaron en etanol acidificado frío y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se centrifugaron y se lavaron los precipitados con etanol:agua (2:1 v:v). Los sobrenadantes obtenidos se evaporaron y los pellets resultantes se resuspendieron en tampón Tris-HCl/EDTA para determinar el AMPc por radioinmunoensayo según las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences).

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1.4 Ensayos de polimerización con actina-pireno

La polimerización de la actina-G [actina en forma globular (G)] se determinó mediante el incremento de fluorescencia producido en la polimerización de la actina marcada con pireno. La fluorescencia se siguió espectrofluorimétricamente (excitación 365 nm, emisión 395 nm, slits 2,5 nm) en un espectrofluorimetro FluoroMax-3 (Horiba). Actina-G marcada con pireno y actina-G sin marcar se mezclaron en una relación 1:10 en tampón-G (Tris-HCl 5 mM pH 8,0, ATP 0,1 mM, CaCl_{2} 0,5 mM). La mezcla se centrifugó a 150.000 g durante 1 hora antes de su utilización. La polimerización de la actina-G se inició añadiendo 0,02 volúmenes de tampón de inicio de polimerización 50x (MgCl_{2} 100 mM, ATP 50 mM, KCl 2,5 M) y la fluorescencia en las muestras se determinó durante 30 minutos a 37ºC y en agitación.

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1.5 Microscopia de fluorescencia

Las células CHO se cultivaron hasta alcanzar la confluencia en cámaras de Permanox Lab-Tek en medio esencial modificado Dulbecco (DMEM), suplementado con suero fetal bovino al 10% (v/v), L-glutamina y penicilina/estreptomicina. La ACT o las bacterias recubiertas con ACT se añadieron al medio y se co-incubaron con las células CHO durante 2 horas. A continuación, las células se lavaron en tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4, se fijaron en formaldehido al 3,7% y se permeabilizaron en presencia de acetona durante 3 minutos a -20ºC.

Para visualizar la actina-F [actina en forma fibrosa (F)] y el ADN, las células se tiñeron con Alexa F1uor®488 phalloidin (Molecular Probes) y DAPI (Molecular Probes), respectivamente. Se utilizaron también anticuerpos primarios monoclonales anti-ACT (List Biological Laboratories, INC) y secundarios anti-ratón IgG (Cell Signall Technology) marcados con Texas red® (Molecular Probes) para detectar la ACT unida a bacterias. Las muestras se visualizaron con un microscopio de fluorescencia (Axioplan2, Zeiss) acoplado a una cámara digital (Axiocam NRc5, Zeiss). Las imágenes se procesaron con el software Axovision 4 software.

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1.6 Microscopía electrónica

Para la preparación de las secciones, las células se crecieron hasta alcanzar confluencia en frascos de 75 cm^{2} en medio DMEM, suplementado con suero fetal bovino al 10% (v/v), L-glutamina y penicilina/estreptomicina. Las bacterias incubadas con ACT se añadieron al medio de cultivo y se co-incubaron durante 2 horas. A continuación, las células se lavaron con tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4, se fijaron en glutaraldehido al 2% y ácido tánico 0,1% en cacodilato sódico 0,1 M. Después del post-fijado en OsO_{4} al 1% las muestras se deshidrataron y se embebieron en resina epoxi Polarbed 814 (BioRad).

Para la tinción negativa, las proteínas se adsorbieron en rejillas de cobre recubiertas de carbón durante 1-2 minutos y se lavaron en agua antes de la tinción negativa (Harris, 1997, Royal Microscopical Society Microscopy Handbook Nº 35. BIOS Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK.) con acetato de uranilo al 2% pH 7,0.

Las rejillas se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión Phillips CM100 a 80 kV.

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1.7 Microscopía electrónica de barrido

Las células se crecieron hasta alcanzar sub-confluencia en cubreobjetos redondos de 13 mm (Sarsted) en medio DMEM, suplementado con suero fetal bovino 10% (v/v), L-glutamina y penicilina/estreptomicina. Las bacterias incubadas con ACT se añadieron al medio de cultivo y se co-incubaron durante 2 horas. Las células se lavaron con PBS pH 7,4, se fijaron en glutaraldehido al 2% en cacodilato sódico 0,1 M, se post-fijaron en OsO_{4} al 1%, deshidrataron sucesivamente en etanol y se secaron al punto critico. Después del recubrimiento con oro, las muestras se examinaron en un microscopio de barrido JSM-35C Jeol a 25 kV.

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1.8 Ensayo de dot blotting

Diferentes concentraciones de actina-G (0-50 \mug) se adsorbieron cuidadosamente a membranas de nitrocelulosa en aplicaciones sucesivas de 2 \mul. Las membranas, una vez secas, se bloquearon durante 3 horas con TBS suplementado con BSA (seroalbúmina bovina) al 5%. A continuación, se incubaron durante 1 hora con diferentes concentraciones de ACT (0-20 \mug) en tampón Tris-HCl pH 8,0, NaCl 10 mM y CaCl_{2} 10 mM. Las membranas de nitrocelulosa se lavaron tres veces con Tween-20 salino tamponado con Tris (TBST, del inglés Tris-Buffered Saline Tween-20), Tris salino tamponado (TBS, del inglés Tris-Buffered Saline) y Tween al 0,1% y se incubaron con anticuerpo anti-ACT [Anticuerpo monoclonal comercial anti-RTX (Ref. 94D, BIOLOGICAL LABORATORIES INC)] durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres nuevos lavados, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios y las bandas resultantes se visualizaron por fosforoimagen. Los experimentos se repitieron 3 veces y los valores densitométricos se representan como la media \pm D.E. (desviación estándar).

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1.9 Ensayos de invasión bacteriana

Para estudiar la invasión bacteriana se utilizó el ensayo de protección con gentamicina descrito previamente [Isberg, RR. and Falkow, SA. 1985. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. Vol. 317(6034):262-264]. Las células CHO sembradas 36 horas antes del ensayo en placas de 96 pocillos se dejaron crecer hasta alcanzar confluencia en medio DMEM con suero fetal bovino al 10%. Las células se lavaron con medio libre de antibiótico y se incubaron en medio sin suero durante 2 horas antes de la infección.

Las células CHO se infectaron con E. coli recubiertas de ACT en una relación de 100 bacterias por célula CHO. A continuación, las placas se incubaron entre 2 y 8 horas a 37ºC, se lavaron, y, posteriormente, se incubaron durante 1 hora en DMEM con gentamicina a una concentración final de 25 \mug/ml para matar las bacterias extracelulares. Después de 3 nuevos lavados con PBS, las células se lisaron en PBS con tritón X-100 al 0,1%. Los lisados celulares se sembraron en placas de LB agar y el número de bacterias internalizadas se determinó por recuento de unidades formadoras de placa (ufc) tras 24 horas de incubación a 37ºC.

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II. Resultados 2.1 Efecto de la ACT sobre la formación intracelular de AMPc en células CHO

La capacidad de la ACT de intoxicar las células mediante elevación de los niveles intracelulares de AMPc se estudió a altas y bajas concentraciones de ACT libre en el medio de incubación. La adición de 20 \mug/ml de ACT elevó significativamente los niveles intracelulares de AMPc al cabo de 2 horas de incubación. Estos resultados coinciden con estudios anteriores en los que se demuestra que la ACT es capaz de unirse e intoxicar distintos tipos de células eucariotas (Figura 1). Además, la viabilidad de dichas células se vio afectada y también se observó que en la periferia celular aparecieron cambios morfológicos como la aparición de estructuras semejantes a pseudópodos. A bajas concentraciones de ACT libre (2 \mug/ml) ni la viabilidad celular, ni los niveles intracelulares de AMPc, se vieron afectados; sin embargo, también se observaron cambios morfológicos en las células, aunque no tan acusados, como en las células tratadas con altas concentraciones de ACT. Cuando las células CHO se co-incubaron con las bacterias recubiertas con ACT (20 \mug/ml) se obtuvieron resultados similares a los producidos por la ACT libre a bajas concentraciones (2 \mug/ml) (Figura 1). Asimismo, la cuantificación de ACT unida a bacterias mediante Western-blot reveló que la cantidad de ACT unida a la membrana externa de las bacterias es de 0,55 \mug. Por tanto, la modificación estructural de las células CHO no es producida por la alteración de los niveles intracelulares de AMPc. Estos resultados sugieren que la ACT podría tener una nueva actividad responsable de las modificaciones observadas en la morfología de las células CHO.

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2.2 Efecto de la ACT sobre el citoesqueleto de células CHO

Para determinar si las modificaciones morfológicas inducidas por la ACT afectaban directamente al citoesqueleto, se visualizaron las fibras de actina con Alexa Fluor®488 phalloidin una vez terminados los tratamientos tanto con ACT soluble como con ACT unida a bacterias. A diferencia de las células control en las que se observó un citoesqueleto muy estructurado (Figura 2A), el tratamiento con ACT libre a altas concentraciones resultó en una desorganización de las fibras de actina. Además, se observó un acúmulo de actina-F a nivel de la membrana plasmática, así como la formación de espículas o estructuras parecidas a pseudópodos (Figura 2B). La ACT libre a bajas concentraciones también fue capaz de inducir la formación de protuberancias en la superficie celular sin modificar drásticamente la arquitectura del citoesqueleto (Figura 2C). La formación de estas estructuras parecidas a pseudópodos también se indujo en las células CHO cuando se co-incubaron con las bacterias recubiertas con la ACT (Figura 2D). Previamente se han descrito efectos similares sobre el citoesqueleto celular inducidos por bacterias patógenas invasivas como Listeria o Salmonella.

Anteriormente, se ha demostrado que B. pertussis es capaz de invadir células epiteliales y se ha atribuido este efecto principalmente a la hemaglutinina filamentosa (FHA) asociada a la membrana bacteriana.

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2.3 Efecto de la Cya asociada a la membrana de E. coli en la invasión celular

Para comprobar si la ACT confiere a las bacterias la capacidad de invasión, se examinó por microscopia electrónica las células CHO co-incubadas con E. coli recubiertas con ACT (20 \mug/ml). En las fotos de microscopia electrónica de barrido (Figura 3) se observó cómo las células CHO emitían prolongaciones parecidas a pseudópodos que envolvían fuertemente a las bacterias recubiertas con la ACT. En las secciones de microscopia electrónica de transmisión se observaron distintos estadios del proceso que concluyen con la internalización de la bacteria en el citoplasma celular. Así, en un primer momento, se observó el contacto de la bacteria con la célula mediante una pequeña prolongación que parte de la célula CHO (Figura 4A). En una etapa más avanzada, se estableció un fuerte contacto entre las membranas de las bacterias y las membranas de las células CHO (Figura 4B). Posteriormente, la célula rodeó casi completamente a la bacteria de un modo similar a la fagocitosis (Figura 4C), y, por último, se pudieron observar a las bacterias dentro del citoplasma celular en estructuras similares a los fagosomas (Figura 4D).

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2.4 Interacción de la ACT con la actina G

Para comprobar si la ACT tiene capacidad de unirse a la actina y confirmar que los efectos causados en el citoesqueleto son ejercidos por la ACT, se estudió la capacidad de la ACT de unirse a la actina por la técnica del dot blotting. En la Figura 5 se puede comprobar que la ACT fue capaz de interaccionar directamente con la actina-G previamente inmovilizada en una membrana de nitrocelulosa. Los resultados negativos de unión a BSA confirmaron que la unión a actina es específica.

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2.5 Polimerización de actina-G inducida por ACT

A continuación, se estudió la posibilidad de que la ACT tuviera un efecto polimerizador de actina-G. Para ello se hicieron experimentos control de polimerización de actina-G marcada con pireno. La adición de tampón de inicio de la polimerización a la disolución con actina-G produjo una rápida polimerización de la actina. Esta reacción se determinó por el aumento de la fluorescencia emitida por el pireno cuando la actina polimerizó. A continuación se comprobó el efecto de la polimerización de la ACT a diferentes concentraciones sobre la actina-G. Como se puede ver en la Figura 6, toxina produjo un rápido efecto polimerizador que fue además dependiente de la concentración de ACT.

Para comprobar que el efecto ejercido por la ACT no se debió a una agregación inespecífica de las proteínas, se tomaron alícuotas de los ensayos de polimerización al cabo de 30 minutos y se analizaron por tinción negativa en el microscopio electrónico. Los resultados obtenidos revelaron la formación de largos filamentos de actina en las preparaciones que contienen la ACT (Figura 7).

Para comprobar si la toxina asociada a la membrana de las bacterias conservaba esta propiedad polimerizadora de actina, las bacterias recubiertas con ACT se incubaron con actina-G. Al cabo de 2 horas de incubación, se añadió Alexa Fluor®488 phalloidin para fijar la actina-F y se analizó la muestra en el microscopio de fluorescencia. En las bacterias control (E. coli sin ACT) no se encontró polimerización de actina mientras que en los ensayos realizados con E. coli recubiertas de ACT se encontraron grandes halos de actina-F rodeando a las bacterias (Figura 8). Estos experimentos pusieron de manifiesto que la ACT adherida a la bacteria conserva la capacidad polimerizadora de actina-G observada en los experimentos de polimerización in vitro.

Los resultados de este Ejemplo revelan que la ACT induce una polimerización directa de la actina-G incluso cuando permanece asociada a la membrana de las bacterias. Esta nueva función de la toxina sería la responsable de la internalización de las bacterias recubiertas de ACT en células no fagocíticas.

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III. Conclusión

Los resultados descritos en la presente descripción demuestran que la ACT purificada es capaz de promover la internalización de bacterias no invasivas en células no fagocíticas de mamífero. Este efecto es mediado por una nueva función encontrada por los inventores que resulta en la re-estructuración del citoesqueleto celular. Esto abre nuevas expectativas ante posibles aplicaciones en las técnicas de vacunación genética y de presentación de antígenos heterólogos mediado por bacterias.

<110> Universidad del País Vasco

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<120> Método para la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas

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<130> P1683ES

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<160> 1

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 1706

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<212> PRT

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<213> Bordetella pertussis

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<400> 1

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8

Claims (23)

1. Uso de la toxina adenilato ciclasa, o una variante funcionalmente equivalente de la misma, como agente inductor de la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas.

2. Uso según la reivindicación 1, en la que la toxina adenilato ciclasa presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que la tóxina adenilato ciclasa procede de un microorganismo del género Bordetella sp.

4. Uso según la reivindicación 3, en la que el microorganismo del género Bordetella sp. es B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica.

5. Una bacteria no invasiva que comprende, unida a su membrana, una toxina adenilato ciclasa o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

6. Bacteria según la reivindicación 5, que comprende además

(i)

un polinucléotido que codifica un polipéptido heterólogo de interés, o

(ii)

una construcción génica que comprende un polinucléotido según (i), o

(iii)

un plásmido que comprende una construcción génica según (ii) o

(iv)

un polipéptido heterólogo de interés.

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7. Bacteria según la reivindicación 5 ó 6, en la que la toxina adenilato ciclasa presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

8. Bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que la tóxina adenilato ciclasa procede de un microorganismo del género Bordetella sp.

9. Bacteria según la reivindicación 8, en la que el microorganismo del género Bordetella sp. es B. pertussis, B. bronchiseptica o B. parapertussis.

10. Una composición farmacéutica que comprende una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 para su uso como medicamento.

12. Uso de una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 en la elaboración de una vacuna.

13. Uso según la reivindicación 12, en la elaboración de una vacuna para un proceso de inmunización mediante bactofección.

14. Uso según la reivindicación 12, en la elaboración de una vacuna para un proceso de inmunización mediante un sistema bacteriano presentador de antígenos.

15. Un procedimiento para la obtención de una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 que comprende incubar una bacteria no invasiva con una toxina adenilato ciclasa o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

16. Un procedimiento para la obtención de una bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que comprende transformar una bacteria no invasiva con un polinucleótido que codifica la toxina adenilato ciclasa o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16, en la que la toxina adenilato ciclasa presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde la toxina adenilato ciclasa comprende la señal de exportación para la maquinaria específica de secreción de dicha toxina.

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19. Método para inducir la internalización de bacterias no invasivas en células eucariotas que comprende:

(a)

incubar la bacteria no invasiva en presencia de una toxina adenilato ciclasa, o una variante funcionalmente equivalente de la misma, o transformar la bacteria no invasiva con un polinucleótido que codifica una toxina adenilato ciclasa, o una variante funcionalmente equivalente de la misma, y

(b)

poner en contacto la bacteria obtenida en el apartado (a) con un cultivo de células eucariotas.

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20. Método según la reivindicación 19, en la que la toxina adenilato ciclasa presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

21. Método según la reivindicación 19 ó 20, en la que la bacteria comprende

(i)

un polinucléotido que codifica un polipéptido heterólogo de interés, o

(ii)

una construcción génica que comprende un polinucléotido según (i), o

(iii)

un plásmido que comprende una construcción génica según (ii) o

(iv)

un polipéptido heterólogo de interés.

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22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que la toxina adenilato ciclasa procede de un microorganismo del género Bordetella sp.

23. Método según la reivindicación 22, en la que el microorganismo del género Bordetella sp. es B. pertussis, B. bronchiseptica o B. parapertussis.