ES2327141T3 - Compuestos luminiscentes dotados de un brazo de enlace funcionalizado utilizado en bioconjugacion y marcado de biomoleculas. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que tiene la fórmula general (I) siguiente, que incluye sus tautómeros de valencia:** ver fórmula** en donde Me es un metal de transición o un metal de tierras raras; R es un grupo funcional elegido del grupo constituido por -COOH, -OH, -NH 2, o es -R 10-Y en donde R 10 es una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada, que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio, y en donde Y se elige del grupo constituido por hidrógeno, carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato, isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxilo, fosforamidita, glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido, cloroacetamido, yodo-acetamido, haluro de sulfonilo, haluro de acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de N-hidroxisuccinimidilo, éster de N-hidroxisulfosuccinimidilo, éster de ftalimida, éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina mono- o di-halogensustituida, diazina mono- o di-halogen-sustituida, aziridina, éster de imida, hidrazina, azido-nitrofenilo, azida, 3-(2piridilditio)-propionamida, glioxal, aldehido, -C*CH y -COZ en donde Z es un grupo de partida; A y B son independientemente uno de otro: - de cero a 4 sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por hidrógeno, -COOH, -OH, -NO2, -OCH3, -SO3H, -SO3 - , -R11-Y'', en donde R 11 es una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH-, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio, y en donde Y'' se elige del grupo constituido por hidrógeno, carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato, isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxi-lo, fosforamidita, glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido, cloroacetamido, yodoacetamido, haluro de sulfonilo, haluro de acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de succinimidilo, éster de hidroxi-sulfosuccinimidilo, éster de ftalimida, éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina mono- o di-halogen-sustituida, diazina mono- o di-halogen-sustituida, aziridina, éster de imida, hidrazina, azido-nitrofenilo, azida, 3-(2-piridilditio)-propionamida, glioxal, aldehido, nitrofenilo, dinitrofenilo, trinitrofenilo, -C*CH y arilo opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por -SO 3H, carboxilo (-COOH), amino (-NH 2), carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi y -COZ'', en donde Z'' es un grupo de partida; - un condensado homocíclico o heterocíclico de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido por hidrógeno, -SO 3 - , -SO3H, -COOH, -OH, -NO 2, -OCH 3, -NH 2, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R 12-Y'''' y -COZ'''', en donde R 12, Y'''' y Z'''' tienen el significado antes indicado para R10, Y y Z, respectivamente; o - un sistema condensado homocíclico o heterocíclico de 2 ciclos fusionados, que tiene 5 o 6 átomos en cada anillo, opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes elegidos del grupo constituido por hidrógeno, -SO 3 - , -SO3H, -COOH, -OH, -NO2, -OCH3, -NH2, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R13-Y'''''' y -COZ'''''', en donde R10, Y'''''' y Z'''''' tienen el significado antes indicado para R10, Y y Z, respectivamente; X se elige del grupo constituido por -O-, -S-, -Se-, -NH-, -C(CH3)2-NR100- y**ver fórmula** en donde R100 se elige del grupo constituido por hidrógeno y R14-Y'''''''', en donde R14 e Y'''''''' tienen el significado previamente definido para R10 e Y, respectivamente, y R55 y R66 son independientemente una cadena de alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono está(n) sustituido(s) opcionalmente cada uno por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un grupo -CONH-, o una agrupación de átomos de carbono cíclica aromática o no aromática, de 4, 5 o 6 miembros, en donde uno o mas átomos de carbono está(n) opcionalmente cada uno sustituido por un heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y selenio; M es un contraión; m es un número entre -5 y +5; L1 y L2 son independientemente uno de otro un ligando bidentado elegido del grupo constituido por:** ver fórmulas** en donde D, E, G y Q tienen independientemente el significado definido anteriormente para A y B y T y W tienen cada uno, independientemente, el significado definido anteriormente para X.
Description
Compuestos luminiscentes dotados de un brazo de
enlace funcionalizado utilizado en bioconjugación y marcado de
biomoléculas.
El presente invento se refiere a compuestos
luminiscentes que tienen brazo de enlace funcionalizado, su síntesis
y empleo en la bioconjugación y marcado de biomoléculas, tal como,
por ejemplo nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos (DNA, ARN o
PAN) y proteínas, así como su empleo en la ejecución de ensayos
analíticos y de diagnóstico in vitro e in vivo.
Existe una necesidad continua y en aumento para
disponer de métodos altamente específicos y rápidos para la
detección y cuantificación de sustancias químicas, bioquímicas y
biológicas. Son de particular interés métodos para detectar y
medir pequeñas cantidades de fármacos, metabolitos,
micro-organismos y otros materiales valiosos en
diagnóstico, tal como, por ejemplo fármacos para uso terapéutico,
hormonas, micro-organismos patogénicos y virus,
marcadores de tumores, anticuerpos, enzimas, ácidos nucleicos,
narcóticos, venenos y drogas de adicción. Estos materiales se
detectan y determinan de conformidad con técnicas ahora bien
establecidas que explotan la ligazón de alta especificidad entre
componentes bioquímicos, tales como los que se encuentran, por
ejemplo, en el antígeno-anticuerpo, sistemas de
proteína-ligando y en hibridización de ácido
nucleico. En estos métodos la presencia del componente
diagnósticamente valioso se detecta típicamente por la presencia o
ausencia de una molécula visualizable, un llamado trazador, por
medio de una técnica químico-física, tal como, por
ejemplo detección de radioactividad, color, luminiscencia, por
ejemplo fluorescencia, fosforescencia, quimiluminiscencia y
electroquimiluminiscencia.
La electroquimiluminiscencia (ECL), o
quimiluminiscencia electro-generada, consiste en la
producción de luz en la proximidad de una superficie de electrodo
siguiendo la formación de especies que pueden originar reacciones
de transferencia de electrones altamente energéticas.
ECL se origina mediante annihilación en una
reacción de transferencia de electrones entre una especie oxidada
y una reducida, ambas generadas en el electrodo por impulsos
alternativos del potencial.
- A + e- -> A^{\bullet}
- (reducción)
- D - e- -> D^{\bullet}+
- (oxidación)
- A^{\bullet -} + D^{\bullet +} -> A^{*} + D
- (formación de estado excitado)
- A* -> A + hv
- (emisión)
El potencial de electrodo operativo oscila
rápidamente entre dos valores potenciales, de modo que genera la
especie reducida A^{\bullet +} y la especie oxidada D^{\bullet
+}, que reaccionaran luego cerca de la superficie de electrodo
para formar el estado emisor A*.
Sin embargo, este tipo de reacción implica el
uso de disolventes no acuosos (por ejemplo dimetilformamida,
acetonitrilo) rigurosamente purificados y desoxigenados, puesto que
el rango de potencial disponible en agua es muy estrecho para
generar los precursores altamente energéticos requeridos.
La generación de ECL de una etapa utilizando un
co-reactivo apto para generar especies altamente
oxidantes o reductoras es de particular interés para aplicaciones
prácticas.
Por ejemplo, en el sistema de
Ru(bpy)_{3}^{2+}/(CH_{3}CH_{2}CH_{2})_{3}N:
se produce ECL siguiendo la oxidación simultánea
de Ru(bpy)_{3}^{2+} y
(CH_{3}CH_{2}CH_{2})_{3}N,
Este procedimiento implica la formación de una
especie altamente reductora, C_{9}H_{20}N^{*}, a través de
una secuencia de oxidación inicial.
El estado excitado que se forma en la reacción
de ECL es la misma que se forma en una
foto-excitación normal y por consiguiente produce
la misma luminiscencia que se obtiene de una espectroscopia de
foto-luminiscencia.
El reactivo electroquimiluminiscente puede
utilizarse para marcar moléculas biológicamente interesantes, tal
como ADN o anticuerpos, justo como un reactivo
foto-luminiscente. Sin embargo, en contraste con
métodos de fluorescencia, ECL no requiere el uso de fuentes de
excitación de luz y por consiguiente resulta como inmune de
interferencia por impurezas luminiscentes o luz difusa. Los métodos
de ECL son de considerable interés para determinar muchas moléculas
químicas y biológicas, facilitando análisis altamente sensibles,
selectivos y alta gama dinámica. La ECL aparece
muy prometedora para el desarrollo de métodos analíticos para moléculas biológicas y diagnostica mente interesantes.
muy prometedora para el desarrollo de métodos analíticos para moléculas biológicas y diagnostica mente interesantes.
Los métodos electroquimiluminiscentes para
determinar la presencia de analitos de interés son preferibles
comparados con otros métodos debido a que se reduce el ruido de
fondo, debido a que en las muestras biológicas no existe especie
alguna a su vez electroquimiluminiscente que pueda interferir con el
ensayo analítico. En adición, la formación de las especies
luminiscentes en solución tiene lugar electroquímicamente, mientras
que la detección se produce a través de medios ópticos: se elimina
de este modo la necesidad de utilizar filtros ópticos en orden a
separar la luz de excitación de la luz de emisión, como sucede
usualmente en técnicas que utilizan fluorescencia. Los compuestos
químicos mas apropiados utilizados en ensayos analíticos basados en
electroquimiluminiscencia son complejos de metal de transición,
cuyos ligandos están generalmente bidentados. En química, un
complejo es una estructura compuesta de un átomo de metal de núcleo
o ión circundado por una serie de iones con carga negativa o
moléculas neutras que poseen dobletes electrónicos. Un complejo se
denomina también compuesto de coordinación o complejo metálico.
Los iones o moléculas que circundan el metal se denominan ligandos.
Los ligandos son átomos o moléculas capaces de donar un par
electrónico al metal, usualmente a través de un doblete electrónico
disponible. Ejemplos de ligandos son cloro, amonio, agua, piridina
y el grupo tiocianato. Estos tipos de ligandos que forman solo una
unión con el átomo de núcleo se denominan monodentados. Los
ligandos pueden ser también moléculas aptas para ocupar mas de una
posición de coordinación en el mismo metal de núcleo, si en su
estructura contienen mas de un átomo capaz de donar dobletes
electrónicos. En estos casos se hace referencia a ligandos
bidentados, tridentados, quadridentados o, mas genéricamente,
polidentados.
Los procesos de ECL son conocidos para muchas
moléculas diferentes y particularmente para complejos de metal de
transición, tales como rutenio, osmio y renio. Con el fin de ser
utilizables en ensayos analíticos y biológicos, los complejos deben
contener grupos funcionales que permitan su unión, o su conjugación,
a sustancias biológicas analíticamente interesantes, tales como
anticuerpos, oligonucleótidos, nucleótidos, biotina, avidin, o a
compuestos sintéticos utilizables en ensayos analíticos. Grupos
funcionales útiles para conjugación se localizan sobre los ligandos
metálicos o en el extremo de una cadena de átomos químicamente
enlazados al ligando.
Los complejos de metal de transición utilizables
en ensayos analíticos o bioanalíticos son conocidos en el arte.
Por ejemplo la patente US 5221605 (Bard and Whitesides) describe
complejos de ruetenio y osmio que tienen bipiridina opcionalmente
sustituida, bipiracina y fenantrolina como los ligandos, conjugados
a sustancias biológicas. La patente EP 0658564 (Massey et
al.) describe rutenio electroquimiluminiscente y complejos de
osmio, en donde los ligandos son bipiridinas, uno de los cuales se
modifica con un grupo reactivo. La patente EP 0178450 (Müller and
Schmidt) describe complejos metálicos que tienen ligandos de
bipiridina o fenantrolina sulfonados o carboxilados, con el fin de
aumentar su solubilidad en soluciones acuosas. La patente US
5981286 (Hermann et al.) describe complejos de metal
conteniendo ligandos de bipiridina o fenantrolina hidrofílicos.
Un objeto del presente invento es proporcionar
compuestos luminiscentes de tipo complejo de metal de transición
provisto con un brazo de enlace apropiado para la formación de un
conjugado con una biomolécula, tal como, por ejemplo, nucleósido,
nucleótido, ácido nucleico o proteína, o con un segundo compuesto
apto para modificar las caracte-
rísticas químico-físicas, electroquímicas y espectroquímicas de compuestos luminiscentes o de formar un par FRET.
rísticas químico-físicas, electroquímicas y espectroquímicas de compuestos luminiscentes o de formar un par FRET.
Este objeto se obtiene mediante un compuesto que
tiene la fórmula general siguiente (I), incluyendo sus tautómeros
de valencia:
en
donde
Me es un metal de transición o un metal de
tierras raras;
R es un grupo funcional elegido del grupo
constituido por -COOH, -OH, -NH_{2}, o es
-R_{10}-Y en donde R_{10} es una cadena de
alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada, que tiene de 1
a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se
sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido
independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un
grupo -CONH, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros
aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se
sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo
elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y
selenio, y en donde Y se elige del grupo constituido por hidrógeno,
carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato,
isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxilo, fosforamidita,
glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido,
cloroacetamido, yodoacetamido, haluro de sulfonilo, haluro de
acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de
N-hidroxisuccinimidilo, éster de
N-hidroxisulfosuccinimidilo, éster de ftalimida,
éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina
mono- o di-halogen-sustituida,
diazina mono- o
di-halogen-sustituida, aziridina,
éster de imida, hidrazina, azidonitrofenilo, azida,
3-(2-piridilditio)-propionamida,
glioxal, aldehido, -C\equivCH y -COZ en donde Z es un grupo de
partida;
A y B son independientemente uno de otro:
- de cero a 4 sustituyentes elegidos
independientemente del grupo constituido por hidrógeno, -COOH, -OH,
-NO_{2}, -OCH_{3}, -SO_{3}H, -SO_{3}^{-},
-R_{11}-Y', en donde R^{11} es una cadena de
alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada que tiene de 1 a
30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se
sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido
independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un
grupo -CONH-, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros
aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se
sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo
elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y
selenio, y en donde Y' se elige del grupo constituido por hidrógeno,
carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato,
isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxilo, fosforamidita,
glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido,
cloroacetamido, yodoacetamido, haluro de sulfonilo, haluro de
acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de succinimidilo, éster de
hidroxi-sulfosuccinimidilo, éster de ftalimida,
éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina
mono- o di-halogen-sustituida,
diazina mono- o
di-halogen-sustituida, aziridina,
éster de imida, hidrazina, azidonitrofenilo, azida,
3-(2-piridilditio)-propionamida,
glioxal, aldehido, nitrofenilo, dinitrofenilo, trinitrofenilo,
-C\equivCH y arilo opcionalmente sustituido con uno o mas
sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido
por -SO_{3}H, carboxilo (-COOH), amino (-NH_{2}), carbonilo
(-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi y -COZ', en
donde Y' y Z tienen el significado definido previamente para
R_{10}, Y y Z;
- un condensado homocíclico o heterocíclico de 5
o 6 miembros opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes
elegidos independientemente del grupo constituido por hidrógeno,
-SO_{3}^{-}, -SO_{3}H, -COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3},
-NH_{2}, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato
(-CNS), epoxi, -R_{12}-Y'' y -COZ'', en donde
R_{12}, Y'' y Z'' tienen el significado antes indicado para
R_{10}, Y y Z, respectivamente; o
- un sistema condensado homocíclico o
heterocíclico de 2 ciclos fusionados, que tiene 5 o 6 átomos en cada
anillo, opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes elegidos
del grupo constituido por hidrógeno, -SO_{3}^{-},
-SO_{3}H,
-COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3}, -NH_{2}, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R_{13}-Y''' y -COZ''', en donde R_{10}, Y''' y Z''' tienen el significado antes indicado para R_{10}, Y y Z, respectivamente;
-COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3}, -NH_{2}, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R_{13}-Y''' y -COZ''', en donde R_{10}, Y''' y Z''' tienen el significado antes indicado para R_{10}, Y y Z, respectivamente;
X se elige del grupo constituido por -O-, -S-,
-Se-, -NH-,
-C(CH_{3})_{2}-NR_{100}- y
en donde R_{100} se elige del
grupo constituido por hidrógeno y R_{14}-Y'''', en
donde R_{14} e Y'''' tienen el significado previamente definido
para R_{10} e Y, respectivamente, y R_{55} y R_{66} son
independientemente una cadena de alquilo saturada o insaturada,
lineal o ramificada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde
uno o mas átomos de carbono está(n) sustituido(s)
opcionalmente cada uno por un heteroátomo elegido
independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un
grupo -CONH-, o una agrupación de átomos de carbono cíclica
aromática o no aromática, de 4, 5 o 6 miembros, en donde uno o mas
átomos de carbono está(n) opcionalmente cada uno sustituido por un
heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre,
nitrógeno y
selenio;
M es un contraión; m es un número entre -5 y
+5;
L_{1} y L_{2} son independientemente uno de
otro un ligando bidentado elegido del grupo constituido por:
en donde D, E, G y Q tienen
independientemente el significado definido anteriormente para A y B
y T y W tienen cada uno, independientemente, el significado
definido anteriormente para
X.
De preferencia los grupos de partida Z,
Z',Z'',Z''' y Z'''' se eligen independientemente uno de otro del
grupo constituido por -Cl, -Br,-I, -OH, -OR_{22}, -OCOR_{22},
en donde R_{22} es alquilo C_{1}-C_{4} lineal
o ramificado (por ejemplo metilo, etilo, t-butilo o
i-propilo),
-O-CO-Ar, en donde Ar es arilo
opcionalmente sustituido, -O-CO-Het,
en donde Het es un sistema heterocíclico elegido de preferencia
entre succinimida, sulfosuccinimida, ftalimida y naftalimida,
-NR_{33}R_{44}, en donde R_{33} y R_{44} son cada uno
independientemente alquilo C_{1}-C_{10} lineal
o ramificado.
La expresión "átomo de carbono opcionalmente
sustituido", como se utiliza antes, indica que este átomo de
carbono puede estar sustituido por uno de los componentes o
heteroátomos antes indicados.
En la continuación de la descripción los
compuestos del presente invento ilustrados por la fórmula (I) se
referirán como "complejos ECL".
Los complejos ECL son complejos luminiscentes, o
sea complejos que son aptos para generar una reacción luminiscente
detectable. La reacción luminiscente puede detectarse, por ejemplo,
por medio de mediciones fluorescentes o electroquimiluminiscentes.
En estos complejos el catión metálico es un metal de transición o un
metal de tierras raras, de preferencia elegido del grupo
constituido por Ru, Os, Re, Ir, Rh, Mo, Pt, Pd, In, Tc, Cu, W, Fe,
Co, Va, Cr. Se prefiere particularmente rutenio, iridio, renio,
cromo y osmio.
Los complejos de ECL de conformidad con el
presente invento difieren de los complejos metálicos conocidos en
el arte porque contienen por lo menos un ligando de tipo
piridilbenz-X-azólico
funcionalizado, en donde X puede ser -O-, -S-, -Se-, -NH-, -C-,
-C(CH_{3})_{2}-, -NR_{100}- o
Los ligandos de
piridilbenz-X-azólico son
particularmente ventajosos comparados con los ligandos conocidos
previamente citados puesto que, cambiando simplemente el átomo X,
puede obtenerse una serie homóloga de ligandos que permitan
modulación de las características electroquímicas y fotofísicas de
los complejos sintetizados con estos. Con el empleo de diferentes
ligandos piridilbenz-X-azólicos es
posible por tanto, sintetizar complejos de metal de transición con
diferentes características electroquímicas y fotofísicas y
utilizarlos en ensayos analíticos múltiples, o sea ensayos en donde
cada analito se detecta de un complejo diferente.
Así pues, ventajosamente, el presente invento
proporciona una serie homóloga de compuestos luminiscentes de tipo
de complejo de metal de transición conteniendo por lo menos un
ligando de tipo
piridilbenz-X-azólico, apto para
emitir luminiscencia a diferentes longitudes de onda, o
caracterizado por diferentes potenciales de oxidación, y también
sintetizable con un método similar para todos los elementos de la
serie. Los compuestos del presente invento pueden utilizarse, por
consiguiente, en análisis analíticos múltiples, facultando la
detección simultánea de mas analitos, siendo cada uno de estos
conjugado con un compuesto luminiscente diferente de conformidad
con el invento.
La síntesis del ligando
piridilbenzo-X-azólico contempla una
reacción de dos etapas, seguido de la introducción de un grupo
funcional (R en la fórmula (I)) conteniendo un grupo reactivo. Los
grupos reactivos preferidos son grupos de éster activos, tales como
éster de N-hidroxisuccinimilo, ácidos carboxílicos,
grupos amino, tioles, maleimidas, hidrazinas. Opcionalmente,
además del grupo R funcional, pueden adicionarse grupos funcionales
adicionales (A,B en la fórmula (I)).
Para funcionalización con éxito, dadas las
drásticas condiciones de reacción en donde se opera, es necesario
proteger el grupo reactivo con un grupo protector que pueda
separarse fácilmente en condiciones que no comprometan la
estructura del propio complejo. En caso que el grupo reactivo sea
un ácido carboxílico, se ha establecido que el grupo de bencilo es
un grupo protector excelente que satisfaga estas exigencias, el cual
se separa con una hidrólisis básica.
Las etapas siguientes pueden esquematizar la
síntesis de complejos de ECL del presente invento:
a) síntesis de ligando
piridilbenz-X-azólico
b) síntesis del intermedio
Me(L_{1})(L_{2})Cl_{2}
c) síntesis del complejo M
Me(L_{1})(L_{2})(ligando
benz-X-azólico)]^{m}
\vskip1.000000\baselineskip
El ligando
benz-X-azólico puede sintetizarse,
por ejemplo, a partir de la 4-picolina de
conformidad con el esquema siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La funcionalización del ligando se lleva a cabo
explotando la reactividad del metilo picolínico, cuya baja acidez
requiere el uso de bases fuertes, tal como diisopropilamida de litio
(LDA). El carbanión así obtenido se hace reaccionar con un bromuro
de alquilo, adecuadamente sustituido con el grupo reactivo que ha de
introducirse en el ligando, de conformidad con lo que se expone en
el Esquema 2. En caso de introducirse un ácido
alquil-carboxílico, el uso de LDA requiere la
protección del grupo carboxílico como un éster bencílico, separable
mediante una hidrólisis básica. El esquema que sigue ilustra la
introducción de un brazo de enlace funcionalizado por un ácido
carboxílico.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
2
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando X en la fórmula (I) es nitrógeno, existen
dos formas posibles de obtener el ligando funcionalizado. La
primera pasa a través de cuaternarización de uno de los dos átomos
de nitrógeno imidazólico con un grupo alquilo (Esquema 3) y la
funcionalización subsiguiente a través del metilo picolínico, como
se ilustra en el Esquema 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
3
\vskip1.000000\baselineskip
En el segundo el ligando se funcionaliza
selectivamente en el grupo NH imidazólico mediante desprotonación
del grupo NH con ter-butilato potásico y reacción
subsiguiente con un haluro de alquilo conteniendo el grupo
funcional que ha de introducirse, como se ilustra en el Esquema
4.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las etapas b) y c) se exponen en los ejemplos 1
a 4 y pueden generalizarse para cualquier ligando L_{1} y
L_{2}. En caso de que L_{1} y L_{2} sean dos ligandos
diferentes será necesaria una purificación cromatográfica para
obtener el compuesto deseado.
Otro objeto del presente invento es un conjugado
de fórmula \alpha-\omega_{1}, en donde
\alpha es por lo menos un complejo ECL de conformidad con el
presente invento y \omega_{1} es una sustancia biológica.
Ejemplos de sustancias biológicas que pueden utilizarse son células,
virus, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, péptidos,
polipéptidos, ácidos nucleícos, oligosacáridos, polisacáridos,
lipolisacáridos, metabolitos celulares, hormonas, sustancias
farmacológicamente activas, alcaloides, esteroides, vitaminas,
aminoácidos, azúcares, anticuerpos, antígenos, haptenos y sus
fragmentos.
El complejo de ECL se une de preferencia a la
sustancia biológica a través de un grupo funcional del propio
complejo, que puede enlazarse covalentemente a un grupo funcional
presente en la sustancia biológica. En caso de que, por ejemplo,
el grupo funcional del complejo de ECL sea un éster reactivo, este
puede reaccionar con un grupo amino libre de la biomolécula. En
caso de que, por ejemplo, el grupo funcional del complejo de ECL
sea una maleimida, este puede reaccionar con un grupo SH libre de la
sustancia biológica. De modo análogo los grupos funcionales de la
biomolécula pueden activarse y reaccionar, consecuentemente, con
ácidos carboxílicos, grupos amino o tiólicos del complejo de ECL.
Ejemplos preferidos de sustancias biológicas son biotina, ácidos
nucleicos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, antígenos y
haptenos.
Un conjugado
\alpha-\omega_{2}, en donde \alpha es por lo
menos un complejo de ECL de conformidad con el presente invento y
\omega_{2} es un colorante fluorescente conjugado al complejo de
ECL a través de un grupo funcional de este último, está también
dentro del alcance del presente invento. El colorante fluorescente
es una molécula apta para absorber a longitudes de onda en donde el
complejo de ECL es apto para emitir, por ejemplo una cianina.
Un ejemplo específico no limitativo de un
conjugado de esta índole es sal disódica de
1-(4-sulfonatobutil)-1'-{Ru(II)
[6-[(2-2'-bipiridina)_{2}{2-[6-({[(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentil]amino}sulfonil)-3H-indol-2-il]esanoil-amino
pentan}]}-1'3,3,3',3'-tetrametil-5,5'-disulfonato
indodicarbocianina:
Este conjugado se sintetiza haciendo reaccionar
el complejo de ECL del invento
bis(2,2'-bipiridina {2-[6-({[ácido
2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentil]-amino)sulfonil)-3H-indol-2-il]esanoico
rutenio (II) con la sal disódica de
1-(4-sulfonatobutil)-1'-(5-aminopentil)-3,3,3',3'-tetrametil-5,5'-disulfonato
indodicarbocianina compuesto con un procedimiento similar al del
ejemplo 5, en donde BSA se sustituye por fluoroforo.
Un conjugado de este tipo tiene propiedades
ópticas muy interesantes que lo hacen particularmente útil como un
trazador en aplicaciones bioanalíticas. Puede evidentemente
excitarse electroquímicamente induciendo la emisión del complejo
metálico mediante electroquimiluminiscencia a alrededor de 630 nm.
Esta emisión se encuentra casi dentro del máximo de absorción de la
indodicarbocianina enlazada al complejo que absorbe fotones
emitidos por el complejo y a su vez se vuelve fotoexcitada,
emitiendo fluorescencia a 665 nm.
En adición, un conjugado del tipo
\alpha(\omega_{1}) (\omega_{2}), en donde \alpha
es por lo menos un complejo de ECL de conformidad con el presente
invento, \omega_{1} es una sustancia biológica como se ha
definido antes conjugada al complejo de ECL a través de un primer
grupo funcional, y \omega_{2} es un compuesto fluorescente como
se ha definido antes conjugado al complejo de ECL a través de un
segundo grupo funcional, queda también dentro del alcance del
presente invento. Un conjugado de esta índole puede obtenerse
haciendo reaccionar el complejo
\alpha-\omega_{2}, como se ha definido antes,
con una biomolécula \omega_{1}, por ejemplo albúmina de suero
bovino (BSA), con un procedimiento similar al expuesto en el
ejemplo 5.
Otro objeto del presente invento es el empleo de
un conjugado \alpha-\omega_{1} o
\alpha(\omega_{1}) (\omega_{2}) en un método para
detección cualitativa y/o cuantitativa de un analito en una muestra
que ha de probarse. En este contexto el conjugado
\alpha-\omega_{1} o
\alpha(\omega_{1}) (\omega_{2}) del presente
invento se utiliza como un reactivo detectable específico. La
especificidad de este reactivo se lleva a cabo por el componente
\omega_{1} , que se elige de conformidad con el analito que ha
de detectarse. Por el contrario el componente \alpha (complejo de
ECL), opcionalmente en combinación con el colorante fluorescente
\omega_{2}, representa un grupo marcador, o sea el componente
del sistema analítico que es capaz de generar una señal detectable.
De preferencia el grupo marcador se detecta por
electroquimiluminiscencia, en cuyo caso la luminiscencia se genera
electroquímicamente en una superficie de electrodo. Ejemplos de
ensayos analíticos de electroquimiluminiscencia en donde se
utilizan complejos de metal pueden hallarse en
EP-A-0580979, WO 90/05301, WO
90/11511 y WO 92/14138. En adición el grupo marcador puede
detectarse mediante fluorescencia, cuyo caso el complejo de ECL se
excita por medio de radiación lumínica con una longitud de onda
apropiada y se mide la emisión de fluorescencia resultante.
Ejemplos de ensayos analíticos fluorescentes utilizando complejos
de metal de transición pueden hallarse en
EP-A-0178450 y
EP-A-0255534, que se incorporan aquí
como referencia.
Otro objeto del presente invento es un método
analítico para la detección de un analito en una muestra, que
comprende las etapas siguientes:
(i) contactar la muestra con un conjugado de
conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 o 10, en
condiciones apropiadas para la unión del conjugado al analito, de
estar presente; y
(ii) determinar la presencia de la cantidad de
analito unido al conjugado en la muestra midiendo la luminiscencia
emitida por el conjugado unido al analito.
\vskip1.000000\baselineskip
Este método pueden también incluir una etapa en
donde el analito se separe de los otros componentes de muestra
antes del contacto con el conjugado. En un tipo de método de esta
índole, el conjugado \alpha-\omega_{1} es por
ejemplo un conjugado en donde \omega es un anticuerpo.
Además el método puede comprender una etapa en
donde el analito se separa de los otros componentes de muestra
mediante contacto con un segundo anticuerpo unido a una fase
sólida.
Un segundo ejemplo es uno en donde el conjugado
\alpha-\omega_{1} es un conjugado en donde
\omega_{1} es una sonda de ADN y el analito se separa de los
otros componentes de muestra mediante contacto con una segunda
sonda de ADN unida a una fase sólida.
Los ejemplos que siguen ilustran la síntesis de
algunos complejos de ECL preferidos del invento, su conjugación con
moléculas biológicas (BSA, IgG), la caracterización espectroscópica
y electroquímica de los mismos y un método analítico que utiliza
conjugados de complejos de ECL con sustancias biológicas. Estos
ejemplos se proporcionan a título de ilustración y no deben
entenderse como limitativos del alcance del invento, como se define
en las reivindicaciones anexas.
Se disolvieron 1,50 g de RuCl_{3}3H_{2}O
(5,74\cdot10^{-3} mol), 1,8 g de 2,2'-dipiridina
(1,15.10^{-2} mol y 1,7 g de LiCl en 50 ml de
N,N-dimetilformamida. Se desgasea la mezcla bajo Ar
durante 15 minutos y luego se somete a reflujo durante 7 horas.
Después de enfriamiento a temperatura ambiente se vierte la solución
en 200 ml de acetona con rápida agitación. Luego se mantiene la
solución durante la noche a 0ºC. El precipitado microcristalino
formado se filtra, se lava con 75 ml de agua y 75 ml de éter
etílico. se obtiene 1,60 g de
[Ru(bpy)_{2}Cl_{2}].2H_{2}O con un rendimiento
del 54%.
Una mezcla de ácido
6-bromo-hexanoico (0,10 mol),
alcohol bencílico (0,10 mol),
4-dimetilaminopiridina
(1,78\cdot10^{-2} mol) y diclorometano (600 ml) se agita y se mantiene a 0ºC con un baño de hielo, luego se le adiciona N,N'-diciclohexilcarbodiimida (0,13 mol) se deja que reaccione durante 16 horas. Al final de la reacción se filtra la solución y se descarta el precipitado, mientras que la solución se lava repetidamente con H_{2}O descartándose el precipitado posiblemente formado. Se agrupan las fases orgánicas y se lavan de nuevo con una solución saturada de NaHCO_{3}, una solución de HCl 0,1 M y luego con agua. Se seca la solución con MgSO_{4}, se filtra y se separa el disolvente mediante evaporación en vacío.
(1,78\cdot10^{-2} mol) y diclorometano (600 ml) se agita y se mantiene a 0ºC con un baño de hielo, luego se le adiciona N,N'-diciclohexilcarbodiimida (0,13 mol) se deja que reaccione durante 16 horas. Al final de la reacción se filtra la solución y se descarta el precipitado, mientras que la solución se lava repetidamente con H_{2}O descartándose el precipitado posiblemente formado. Se agrupan las fases orgánicas y se lavan de nuevo con una solución saturada de NaHCO_{3}, una solución de HCl 0,1 M y luego con agua. Se seca la solución con MgSO_{4}, se filtra y se separa el disolvente mediante evaporación en vacío.
Purificación con cromatografía instantánea,
elución con una mezcla de éter de petróleo/acetato de etilo. Se
obtiene un líquido oleoso con un rendimiento del 93%.
En un matraz de tres cuellos y fondo redondo,
equipado con condensador, termómetro y agitador mecánico, se
adicionan 450 g de ácido polifosfórico, 40 g (0,29 mol) de amida del
ácido
4-metil-piridin-2-carboxílico
y 31 g (0,29 mol) de o-fenilendiamina. Se calienta la
mezcla a 210ºC durante 4 horas. Al final se enfría la mezcla a 70ºC
y se adiciona el crudo a 1 L de agua. Se basifica con una solución
acuosa al 50% de hidróxido sódico y se filtra el sólido obtenido.
Cristaliza en etanol absoluto. El producto
2-(4-metilpiridin-2-il)-1H-benzoimidazol
se obtiene con un rendimiento del 85%. Punto de fusión:
228-9ºC.
Se disuelven 10 g (0,048 mol) del compuesto de
2-(4-metilopiridin-2-il)-1H-benzoimidazol
sintetizado en la etapa anterior en 100 ml de dimetilformamida
anhidra a temperatura ambiente en un matraz de fondo redondo y tres
cuellos y se adicionan 6,3 g (0,056 mol) de ter-butilato
potásico recién sublimado. Después de 15 minutos de agitación se
adiciona a gotas 46 g (0,16 mol) de éster bencílico del ácido
6-bromo-hexanoico y se calienta a
45ºC durante 15 horas. Después de enfriamiento se adicionan 100 ml
de agua desionizada y se extrae la mezcla con acetato de etilo.
Después de secado de las fases orgánicas con sulfato sódico anhidro
se separa el disolvente mediante evaporación bajo vacío y se
purifica el producto crudo mediante cromatografía instantánea sobre
columna de gel de sílice, eluyéndose con un gradiente a partir de
una mezcla de éter de petróleo/acetato de etilo (95:5) y terminando
con una mezcla de éter de petróleo/acetato de etilo (70:30). Se
obtiene un aceite ligeramente amarillo con un rendimiento del
75%.
En un matraz se disuelve en 50 ml de
etilenglicol 7,69\cdot10^{-4} de
[Ru(bpy)_{2}Cl_{2}]\cdot2H_{2}O y
1,15\cdot10^{3} mol de LegN-benz. Se desgasea la
mezcla con Ar durante 15 minutos y luego se somete a reflujo
durante 4 horas. Después de enfriamiento a temperatura ambiente se
adicionan 20 ml de agua y 10 ml de una solución acuosa de
NH_{4}PF_{6}. Se recoge el precipitado formado y se recristaliza
en mezcla de acetonitrilo/etanol 1:1. Se obtiene 0,294 g de
Ru(bpy)_{2}(LegN)](PF_{6})_{2} con
un rendimiento del 80%. Luego se disuelve el complejo en 80 ml de
una solución al 10% de KOH en metanol y se agita la mezcla a
temperatura ambiente durante por lo menos 15 horas. Después de
acidificación a pH \approx 2-3 con
H_{2}SO_{4}, se separa el metanol mediante evaporación en vacío
y se extrae la solución acídica con diclorometano. Se agrupan las
fracciones orgánicas, deshidratas con Na_{2}SO_{4} y se separa
el disolvente mediante evaporación en vacío. Se obtiene el
producto
Ru(bpy)_{2}(LegN)](PF_{6})_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
El intermedio [Ru/bpy)_{2}Cl_{2}] se
sintetiza como en el ejemplo 1a)
El ligando se sintetiza como en la etapa
1b).
En un matraz de tres cuellos y fondo redondo,
equipado con un condensador, termómetro y agitación mecánica, se
adiciona ácido polifosfórico (220 ml), amida del ácido
4-metil-piridin-2-carboxílico
(0,29 mol) y o-aminofenol (0,29 mol). La mezcla se hace
reaccionar a 210ºC durante 4 horas, luego se percola la solución en
H_{2}O. Se filtra el precipitado y se suspende en una solución
acuosa saturada de NaHCO_{3}. Se filtra el precipitado de nuevo
y se lava con H_{2}O. El producto
2-(4-metil-piridin-2-il)-benzotiazol
se cristaliza en ciclohexano después de haberse filtrado y
eliminado las impurezas insolubles.
Luego se carga una mezcla de THF (\sim90 ml)
y diisopropilamina (1 equivalente) en un matraz de fondo redondo y
tres cuellos, agitada y enfriada a -78ºC; luego se adiciona una
solución de butil-litio (n-BuLi, 1,7
M en hexano, 1,1 equivalentes). Se agita la solución a -78ºC
durante 10 minutos, se calienta hasta 0ºC y se agita durante 10
minutos, y de nuevo se enfría a -78ºC.
Una solución de
2-(4-metil-piridin-2-il)-benzooxazol
(1 equivalente) se canula en THF y se agita la mezcla durante 1
hora a -78ºC, luego se adiciona mediante una jeringa el éster
bencílico del ácido
6-bromo-hexanoico anhidrificado
(1,1 equivalentes) y se hace reaccionar durante un mínimo de 3 horas
a temperatura ambiente. Se detiene la reacción con hielo y
NH_{4}Cl y se extrae la solución con acetato de etilo. Se agrupan
las fases orgánicas y se anhidrifica con NA_{2}SO_{4} y se
separa el disolvente mediante evaporación en vacío. la purificación
se lleva a cabo mediante cromatografía instantánea con elución en
gradiente de una mezcla de diclorometano/metanol. Se obtiene un
sólido ligeramente amarillo.
Se disuelven 0,200 g de
[Ru(bpy)_{2}Cl_{2}]\cdot2H_{2}O
(3,84.10^{-4} mol) y 0,120 g de
(4-metil-2-piridil)benzoxazol
(5,71.10^{-3} mol) en 50 ml de etilenglicol. Se desgasea la
mezcla con Ar durante 15 minutos y luego se somete a reflujo
durante 4 horas. La solución inicialmente violeta cambia
progresivamente a una solución rojiza mas clara en alrededor de una
hora y después de 4 horas su color es definitivamente rojo.
Después de enfriamiento a temperatura ambiente
se adicionan 20 ml de agua y 10 ml de una solución acuosa de
NH_{4}PF_{6} (1,0 g/10 ml).
Luego se recoge el precipitado formado, se lava
con 10 ml de H_{2}O y se seca con Et_{2}O.
Se obtienen 0,275 de
[Ru(bpy)_{2}(LegO-benz](PF_{6})_{2}
con un rendimiento de 78,4%. Se disuelve el complejo en 80 ml de
una solución del 10% de KOH en metanol y luego se agita durante por
lo menos 15 horas a temperatura ambiente. Después de acidificación
a pH \approx 2-3, se separa el metanol mediante
evaporación a presión reducida, y se extrae la solución acídica con
diclorometano.
Se recogen todas las fracciones orgánicas,
deshidratadas con Na_{2}SO_{4} y se separa el disolvente
mediante evaporación a presión reducida.
Se obtiene el producto
[Ru(bpy)_{2}(LegO)](PF_{6})_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetiza el intermedio
[Ru/bpy)_{2}Cl_{2}] como en el ejemplo 1a)
El compuesto se sintetiza como en la etapa
1b).
En un matraz de tres cuellos fondo redondeado,
equipado con condensador, termómetro y agitación mecánica, se
adiciona ácido polifosfórico (220 ml), amida de ácido
4-metil-piridin-2-carboxílico
(0,29 mol) y o-aminotiofenol (0,29 mol).
Se hace reaccionar la mezcla a 210ºC durante 4
horas, luego se percola la solución en H_{2}O. Se filtra el
precipitado y suspende en una solución acuosa saturada de
NaHCO_{3}.
La solución se filtra de nuevo y se lava el
precipitado con H_{2}O. El producto
2-(4-metil-piridin-2-il)-benzotiazol
se cristaliza en ciclohexano después de haberse filtrado y
eliminado las impurezas insolubles.
Luego se carga una mezcla de THF (\sim90 ml)
y diisopropilamina (1 equivalente) en un matraz de fondo redondo y
tres cuellos, agitada y enfriada a -78ºC; luego se adiciona una
solución de butil-litio (n-BuLi, 1,7
M en hexano, 1,1 equivalentes). Se agita la solución a -78ºC
durante 10 minutos, se calienta hasta 0ºC y se agita durante 10
minutos, y de nuevo se enfría a -78ºC.
Una solución de
2-(4-metil-piridin-2-il)-benzooxazol
(1 equivalente) se canula en THF y se agita la mezcla durante 1
hora a -78ºC, luego se adiciona rápidamente mediante una jeringa el
éster bencílico del ácido
6-bromo-hexanoico anhidrificado
(1,1 equivalentes) y se hace reaccionar durante un mínimo de 3 horas
a temperatura ambiente.
Se detiene la reacción con hielo y NH_{4}Cl y
se extrae la solución con acetato de etilo. Se agrupan las fases
orgánicas y se anhidrifica con Na_{2}SO_{4} y se separa el
disolvente mediante evaporación en vacío.
La purificación se lleva a cabo mediante
cromatografía instantánea con elución en gradiente de una mezcla de
éster de petróleo/acetato de etilo. Se obtiene un sólido gris.
Se disuelve en 50 ml de etilenglicol
3,84\cdot10^{-4} de
[Ru(bpy)_{2}Cl_{2}]\cdot2H_{2}O y
5,74\cdot10^{3} mol de LegS-benz. Se desgasea
la mezcla con Ar durante 15 minutos y luego se somete a reflujo
durante 4 horas.
La solución inicialmente violeta cambia
progresivamente a una solución rojiza mas clara en alrededor de una
hora y después de 4 horas su color es definitivamente rojo.
Después de enfriamiento a temperatura ambiente
se adicionan 20 ml de agua y 10 ml de una solución acuosa de
NH_{4}PF_{6} (1,0 g/10 ml). Se recoge luego el precipitado
formado, se lava con 10 ml de agua y se seca con Et_{2}O. Se
obtiene 0,298 g de
Ru(bpy)_{2}(LegS-benz)](PF_{6})_{2}
con un rendimiento del 83,5%. Luego se disuelve el complejo en 80
ml de una solución al 10% de KOH en metanol y se agita a temperatura
ambiente durante por lo menos 15 horas.
Después de acidificación a pH \approx
2-3 con H_{2}SO_{4}, se separa el metanol
mediante evaporación a presión reducida y se extrae la solución
acídica con diclorometano.
Se agrupan las fracciones orgánicas, deshidratas
con Na_{2}SO_{4} y se separa el disolvente mediante evaporación
a presión reducida. Se obtiene el producto
Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetiza el intermedio
[Ru/bpy)_{2}Cl_{2}] como en el ejemplo 1a)
El compuesto se sintetiza como en la etapa
1b).
En un matraz de tres cuellos fondo redondeado,
equipado con condensador, termómetro y agitación mecánica, se
adiciona ácido polifosfórico (220 ml), amida de ácido
4-metil-piridin-2-carboxílico
(0,29 mol) y 2-aminobenzonitrilo (0,29 mol).
Se hace reaccionar la mezcla a 210ºC durante 4
horas, luego se percola la solución en H_{2}O. Se filtra el
precipitado y suspende en una solución acuosa saturada de
NaHCO_{3}.
La solución se filtra de nuevo y se lava el
precipitado con H_{2}O. El producto
2-(4-metil-piridin-2-il)-3H-indol
se cristaliza en ciclohexano después de haberse filtrado y
eliminado las impurezas insolubles.
Luego se carga una mezcla de THF (\sim90 ml)
y diiso-propilamina (1 equivalente) en un matraz de
fondo redondo y tres cuellos, agitada y enfriada a -78ºC; luego se
adiciona una solución de butil-litio
(n-BuLi, 1,7 M en hexano, 1,1 equivalentes). Se
agita la solución a -78ºC durante 10 minutos, se calienta hasta 0ºC
y se agita durante 10 minutos, y de nuevo se enfría a -78ºC.
Una solución de
2-(4-metil-piridin-2-il)-benzooxazol
(1 equivalente) se canula en THF y se agita la mezcla durante 1
hora a -78ºC, luego se adiciona rápidamente mediante una jeringa el
éster bencílico del ácido
6-bromo-hexanoico anhidrificado
(1,1 equivalentes) y se hace reaccionar durante un mínimo de 3 horas
a temperatura ambiente.
Se detiene la reacción con hielo y NH_{4}Cl y
se extrae la solución con acetato de etilo. Se agrupan las fases
orgánicas y se anhidrifica con Na_{2}SO_{4} y se separa el
disolvente mediante evaporación en vacío.
La purificación se lleva a cabo mediante
cromatografía instantánea con elución en gradiente de una mezcla de
éster de petróleo/acetato de etilo. Se obtiene un sólido
ligeramente amarillo.
Se disuelve en 50 ml de etilenglicol
3,84\cdot10^{-4} de
[Ru(bpy)_{2}Cl_{2}]\cdot2H_{2}O y
5,74\cdot10^{3} mol de LegS-benz. Se desgasea
la mezcla con Ar durante 15 minutos y luego se somete a reflujo
durante 4 horas.
La solución inicialmente violeta cambia
progresivamente a una solución rojiza mas clara en alrededor de una
hora y después de 4 horas su color es definitivamente rojo.
Después de enfriamiento a temperatura ambiente
se adicionan 20 ml de agua y 10 ml de una solución acuosa de
NH_{4}PF_{6} (1,0 g/10 ml). Se recoge luego el precipitado
formado, se lava con 10 ml de agua y se seca con Et_{2}O. Se
obtiene 0,304 g de
Ru(bpy)_{2}(LegS-benz)](PF_{6})_{2}
con un rendimiento del 84%. Luego se disuelve el complejo formado
en 80 ml de una solución al 10% de KOH en metanol y se agita a
temperatura ambiente durante por lo menos 15 horas.
Después de acidificación a pH \approx
2-3 con H_{2}SO_{4}, se separa el metanol
mediante evaporación a presión reducida y se extrae la solución
acídica con diclorometano.
Se agrupan las fracciones orgánicas, deshidratas
con Na_{2}SO_{4} y se separa el disolvente mediante evaporación
a presión reducida. Se obtiene el producto
Ru(bpy)_{2}-(LegC)](PF_{6})_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de fondo redondo conteniendo 5 ml
de DMF anhidro se disuelve 1,34.10^{5} mol de
Ru(bpy)_{2}-(LegN)]
(PF_{6})_{2}, 2,68.10^{-5} mol de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 2,68.10^{-5} mol de N-hidroxisuccinimida (NHS). Se hace reaccionar la solución durante 5 horas a 70ºC sobre un baño de aceite de silicona. Se obtiene el éster de hidroxisuccinimida del complejo Ru(bpy)_{2}-(LegN)](PF_{6})_{2}.
(PF_{6})_{2}, 2,68.10^{-5} mol de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 2,68.10^{-5} mol de N-hidroxisuccinimida (NHS). Se hace reaccionar la solución durante 5 horas a 70ºC sobre un baño de aceite de silicona. Se obtiene el éster de hidroxisuccinimida del complejo Ru(bpy)_{2}-(LegN)](PF_{6})_{2}.
Después de 5 horas se extraen 56 \mul de la
solución de éster (1,50 10^{-7} mol) y se adiciona 1 ml (1,50
10^{-8} mol) de una solución de BSA 1 mg/ml en tampón de borato
sódico (pH 8,5), de modo que la relación molar entre
[Ru(bpy)_{2}-(LegN-NHS)](PF_{6})_{2}
y BSA sea 10:1. Se agrupan las dos porciones y se hace reaccionar
durante 2 horas a temperatura ambiente.
Después de 2 horas se adiciona una segunda
porción de 56 \mul de
[Ru(bpy)_{2}-(LegN-NHS)](PF_{6})_{2}
y se prosigue la reacción durante otras 2 horas. El conjugado
{[Ru(bpy)_{2}-(LegN-BSA)]}(PF_{6})_{2}
obtenido se purifica sobre una columna cromatográfica tipo PD10,
conteniendo una resina Sephadex GD25, eluyéndose con tampón de
borato sódico pH 8,5. Se recogen fracciones de 1 ml en tubos
Eppendorf.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de fondo redondo conteniendo 5 ml
de DMF anhidro se disuelve 1,34.10^{5} mol de
Ru(bpy)_{2}-(LegS)]
(PF_{6})_{2}, 2,68.10^{-5} mol de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 2,68.10^{-5} mol de N-hidroxisuccinimida (NHS). Se hace reaccionar la mezcla durante 5 horas a 70ºC sobre un baño de aceite de silicona.
(PF_{6})_{2}, 2,68.10^{-5} mol de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 2,68.10^{-5} mol de N-hidroxisuccinimida (NHS). Se hace reaccionar la mezcla durante 5 horas a 70ºC sobre un baño de aceite de silicona.
Después de 5 horas se extraen 56 \mul de la
solución de éster (1,50 10^{-7} mol) y se adiciona 1 ml (1,50
10^{-8} mol) de una solución de IgG 2,33 mg/ml en 1 ml de tampón
de borato sódico (pH 8,5), de modo que la relación molar entre
[Ru(bpy)_{2}-(LegS-NHS)](PF_{6})_{2}
e IgG sea 10:1. Se agrupan las dos porciones y se hace reaccionar
durante 2 horas e agitación a temperatura ambiente. Después de 2
horas se adiciona una segunda porción de 56 \mul de
[Ru(bpy)_{2}-(LegS-NHS)](PF_{6})_{2}
y se prosigue la reacción durante otras 2 horas. El conjugado
{[Ru(bpy)_{2}-(LegS-IgG)]} obtenido
se purifica sobre una columna cromatográfica tipo PD10, conteniendo
una resina Sephadex GD25, eluyéndose con tampón de borato sódico pH
8,5. Se recogen fracciones de 1 ml en tubos Eppendorf.
\vskip1.000000\baselineskip
Los complejos
[Ru(bpy)_{2}(LegN)](PF_{6})_{2},
[Ru(bpy)_{2}-(LegO)](PF_{6})_{2},
[Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2} y
[Ru(bpy)_{2}(LegC)]-(PF_{6})_{2},
han sido caracterizados mediante punto de vista espectroscópico y
electroquímico.
La caracterización electroquímica se llevó a
cabo por medio de mediciones voltamétricas cíclicas; se realizaron
pruebas en diclorometano, utilizando hexafluorofosfato de
tetrabutilamonio como electrolito de soporte. El electrodo de
trabajo se obtiene de carbón vítreo (CG), el auxiliar de Pt,
mientras que el electrodo de referencia es un SCE normal (Saturated
Calomel Electrode). Los potenciales se exponen con respecto al par
redox de ferroceno Fc/Fc^{+} que en las condiciones
experimentales utilizadas muestra un potencial se semionda E_{1/2}
= + 0,46 V.
La compensación de resistencia se llevó a cabo
por medio de método de realimentación positiva. En la gama de 50
mV-3 V/s \DeltaE_{p} permanece en el orden de 60
mV, mientras que las corrientes pico i_{p} son directamente
proporcionales a la raíz cuadrada del ratio de exploración. Se
llevaron a cabo experimentos disolviendo los complejos de ECL en
acetonitrilo y utilizando hexafluorofosfato de tetrabutilamonio como
electrolito de soporte.
\newpage
El comportamiento electroquímico del complejo
[Ru(bpy)_{2}(LegN)](PF_{6})_{2} se
caracteriza por dos reducciones monoelectrónicas y una oxidación
monoelectrónica, química y electrónicamente reversibles. Los dos
procesos de reducción se caracterizan por un potencial de semionda
de -1,764 y -2,018 V respectivamente, mientras que el proceso de
oxidación muestra un potencial E_{1/2} = 0,793 V.
El comportamiento electroquímico del complejo
[Ru(bpy)_{2}(LegO)](PF_{6})_{2} se
caracteriza por dos reducciones monoelectrónicas reversibles y una
oxidación monoelectrónica reversible. Los dos procesos de reducción
se caracterizan por un potencial de semionda de -1,563 y -1,924 V
respectivamente, mientras que el proceso de oxidación muestra un
potencial E_{1/2} = 1,010 V.
Asimismo el comportamiento electroquímico del
complejo
[Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2} se
caracteriza por dos reducciones monoelectrónicas y una oxidación
monoelectrónica, química y electrónicamente reversibles. Los dos
procesos de reducción se caracterizan por un potencial de semionda
de -1,487 y -1,914 V respectivamente, mientras que el proceso de
oxidación muestra un potencial E_{1/2} = 1,008 V.
De modo análogo el comportamiento electroquímico
del complejo
[Ru(bpy)_{2}(LegC)](PF_{6})_{2} se
caracteriza por dos reducciones monoelectrónicas reversibles y una
oxidación monoelectrónica reversible. Los dos procesos de reducción
se caracterizan por un potencial de semionda de -1,650 y -1,976 V
respectivamente, mientras que el proceso de oxidación muestra un
potencial E_{1/2} = 0,915 V.
A continuación se resume los datos relevantes
para los cuatro complejos utilizados como ejemplos
representativos:
Detección electroquimiluminiscente del conjugado
{[Ru(bpy)_{2}(LegN)]-BSA}(PF_{6})_{2}
obtenido en el ejemplo 5 se ha disuelto en tampón PBS para obtener
cuatro soluciones con concentración molar igual a 10^{-11},
10^{-10}, 10^{-9}, 10^{-8}. Los experimentos se han llevado a
cabo en la célula electroquímica utilizada en las mediciones
voltamétricas cíclicas descritas en el ejemplo 7. La luminiscencia
emitida se ha registrado con un tubo fotomultiplicador Hamamatsu
R928 conectado a una computadora equipada con un tablero de
adquisición de datos. La Tabla 2 resume los resultados obtenidos
con diferentes soluciones conjugadas. El tampón PBS solo se ha
utilizado como testigo.
De modo análogo al ejemplo precedente se han
preparado cuatro soluciones de concentración molar igual a
10^{-11}, 10^{-10}, 10^{-9} y 10^{-8} de los conjugados
{[Ru(bpy)_{2}(LegN)]-BSA}(PF_{6})_{2}
y
{[Ru(bpy)_{2}(LegS)]-IgG}(PF_{6})_{2},
sintetizados en el ejemplo 5 y ejemplo 6 respectivamente. Los
experimentos se han llevado a cabo en la célula electroquímica
utilizada en las mediciones kilométricas cíclicas descritas en el
ejemplo 7. Se ha registrado luminiscencia emitida con dos tubos
fotomultiplicadores Hamamatsu R928 conectados a un osciloscopio
conectado a una computadora equipada con tablero de adquisición de
datos.
El primer tubo fotomultiplicador está equipado
con un filtro óptico bandpass XF3028 (630 \pm 22 nm) centrado a
682 nm.
La Tabla 3 resume las emisiones
electroquimiluminiscentes detectados con soluciones de conjugados
diferentes. El tampón PBS solo se ha utilizado como testigo.
Como un ejemplo de un método analítico en donde
se utiliza el complejo de ECL de conformidad con el presente
invento, se describe un emparedado electroquimiluminiscente
inmunoquímico para la detección de Troponina I (TnI) en suero. En
este tipo de ensayo se utilizan dos anticuerpos monoclonales que son
específicos para dos epitopos diferentes del analito TnI. El
esquema analítico del ensayo es como sigue: se utiliza el primer
anticuerpo anti-TnI Mab^{1} como un anticuerpo de
captura y se conjuga con biotina, el segundo anticuerpo
anti-TnI Mab_{2} se conjuga con el complejo de ECL
[Ru(bpy)_{2}(LegS)]PF_{6})_{2} de
conformidad con un procedimiento similar al del ejemplo 6.
La reacción inmunológica entre el analito y el
par de anticuerpo monoclonal tiene lugar en fase homogénea, en
presencia de una fase sólida, por ejemplo un electrodo de oro
revestido con estreptavidina, que constituye el medio de separación
libre/unido.
En resumen:
en donde |-StAV
es el electrodo de oro revestido con estreptavidina,
biot-Mab_{1}anti-TnI es el
anticuerpo de captura conjugado con bitoina, TnI es Troponina I y
Mab_{2}anti-TnI-[Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2}
es el anticuerpo conjugado con la ECL sintetizado en el ejemplo 3.
Después de lavar el electrodo con un tampón de lavado apropiado
quedarán ancladas a la fase sólida una serie de moléculas
Mab_{2}anti-TnI-[Ru(bpy)_{2}(LegS)](PF_{6})_{2}
iguales a las del analito. Esto permite el cálculo de la
concentración de analitos en el suero de partida, mediante la
construcción de una curva de titulación con calibradores que tienen
una concentración conocida de TnI. La detección se lleva a cabo
utilizando un dispositivo análogo al descrito en el ejemplo 8, en
donde el electrodo de trabajo de carbón vítreo se sustituye por un
electrodo de oro revestido con estreptavidina. La Tabla 4 resume
los resultados
obtenidos:
Claims (18)
1. Un compuesto que tiene la fórmula general
(I) siguiente, que incluye sus tautómeros de valencia:
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
Me es un metal de transición o un metal de
tierras raras;
R es un grupo funcional elegido del grupo
constituido por -COOH, -OH, -NH_{2}, o es
-R_{10}-Y en donde R_{10} es una cadena de
alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada, que tiene de 1
a 30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se
sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido
independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un
grupo -CONH, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros
aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se
sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo
elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y
selenio, y en donde Y se elige del grupo constituido por hidrógeno,
carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato,
isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxilo, fosforamidita,
glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido, bromoacetamido,
cloroacetamido, yodo-acetamido, haluro de
sulfonilo, haluro de acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de
N-hidroxisuccinimidilo, éster de
N-hidroxisulfosuccinimidilo, éster de ftalimida,
éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina, piridina
mono- o di-halogen-sustituida,
diazina mono- o
di-halogen-sustituida, aziridina,
éster de imida, hidrazina, azido-nitrofenilo, azida,
3-(2-piridilditio)-propionamida,
glioxal, aldehido, -C\equivCH y -COZ en donde Z es un grupo de
partida;
A y B son independientemente uno de otro:
- de cero a 4 sustituyentes elegidos
independientemente del grupo constituido por hidrógeno, -COOH, -OH,
-NO_{2}, -OCH_{3}, -SO_{3}H, -SO_{3}^{-},
-R_{11}-Y', en donde R^{11} es una cadena de
alquilo saturada o insaturada, lineal o ramificada que tiene de 1 a
30 átomos de carbono, en donde uno o mas átomos de carbono se
sustituye cada uno opcionalmente por un heteroátomo elegido
independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un
grupo -CONH-, o una agrupación cíclica de 4-, 5- o 6- miembros
aromática o no aromática, en donde uno o mas átomos de carbono se
sustituye(n) cada uno opcionalmente por un heteroátomo
elegido independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno y
selenio, y en donde Y' se elige del grupo constituido por hidrógeno,
carboxilo, carbonilo, amino, sulfhidrilo, tiocinanato,
isotiocianato, isocianato, maleimida, hidroxi-lo,
fosforamidita, glicidilo, imidazolilo, carbamoilo, anhídrido,
bromoacetamido, cloroacetamido, yodoacetamido, haluro de sulfonilo,
haluro de acilo, haluro de arilo, hidrazida, éster de succinimidilo,
éster de hidroxi-sulfosuccinimidilo, éster de
ftalimida, éster de naftalimida, monoclorotriacina, diclorotriacina,
piridina mono- o
di-halogen-sustituida, diazina
mono- o di-halogen-sustituida,
aziridina, éster de imida, hidrazina,
azido-nitrofenilo, azida,
3-(2-piridilditio)-propionamida,
glioxal, aldehido, nitrofenilo, dinitrofenilo, trinitrofenilo,
-C\equivCH y arilo opcionalmente sustituido con uno o mas
sustituyentes elegidos independientemente del grupo constituido
por -SO_{3}H, carboxilo (-COOH), amino (-NH_{2}), carbonilo
(-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi y -COZ', en
donde Z' es un grupo de partida;
- un condensado homocíclico o heterocíclico de 5
o 6 miembros opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes
elegidos independientemente del grupo constituido por hidrógeno,
-SO_{3}^{-}, -SO_{3}H, -COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3},
-NH_{2}, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato
(-CNS), epoxi, -R_{12}-Y'' y -COZ'', en donde
R_{12}, Y'' y Z'' tienen el significado antes indicado para
R_{10}, Y y Z, respectivamente; o
- un sistema condensado homocíclico o
heterocíclico de 2 ciclos fusionados, que tiene 5 o 6 átomos en cada
anillo, opcionalmente sustituido con uno a 4 sustituyentes elegidos
del grupo constituido por hidrógeno, -SO_{3}^{-},
-SO_{3}H,
-COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3}, -NH_{2}, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R_{13}-Y''' y -COZ''', en donde R_{10}, Y''' y Z''' tienen el significado antes indicado para R_{10}, Y y Z, respectivamente;
-COOH, -OH, -NO_{2}, -OCH_{3}, -NH_{2}, carbonilo (-CHO), tiocianato (-SCN), isotiocianato (-CNS), epoxi, -R_{13}-Y''' y -COZ''', en donde R_{10}, Y''' y Z''' tienen el significado antes indicado para R_{10}, Y y Z, respectivamente;
X se elige del grupo constituido por -O-, -S-,
-Se-, -NH-,
-C(CH_{3})_{2}-NR_{100}- y
en donde R_{100} se elige del
grupo constituido por hidrógeno y R_{14}-Y'''', en
donde R_{14} e Y'''' tienen el significado previamente definido
para R_{10} e Y, respectivamente, y R_{55} y R_{66} son
independientemente una cadena de alquilo saturada o insaturada,
lineal o ramificada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, en donde
uno o mas átomos de carbono está(n) sustituido(s)
opcionalmente cada uno por un heteroátomo elegido
independientemente entre oxígeno y azufre, o por un grupo -NH-, un
grupo -CONH-, o una agrupación de átomos de carbono cíclica
aromática o no aromática, de 4, 5 o 6 miembros, en donde uno o mas
átomos de carbono está(n) opcionalmente cada uno sustituido por un
heteroátomo elegido independientemente entre oxígeno, azufre,
nitrógeno y
selenio;
M es un contraión; m es un número entre -5 y
+5;
L_{1} y L_{2} son independientemente uno de
otro un ligando bidentado elegido del grupo constituido por:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde D, E, G y Q tienen
independientemente el significado definido anteriormente para A y B
y T y W tienen cada uno, independientemente, el significado
definido anteriormente para
X.
2. Un compuesto, de conformidad con la
reivindicación 1, en donde los grupos de partida Z, Z', Z'', Z''' y
Z'''' se eligen independientemente del grupo constituido por -Cl,
-Br, -I, -OH, -OR_{22}, -OCOR_{22}, en donde R_{22} es alquilo
C_{1}-C_{4} lineal o ramificado (por ejemplo
metilo, etilo, t-butilo o
i-propilo),
-O-CO-Ar, en donde Ar es
opcionalmente arilo sustituido,
-O-CO-Het, en donde Het es un
sistema heterocíclico elegido de preferencia entre succinimida,
sulfosuccinimida, ftalimida y naftalimida, NR_{33}R_{4,} en
donde R_{33} y R_{34} son cada uno independientemente alquilo
C_{1}-C_{4} lineal o ramificado.
3. Un compuesto, de conformidad con la
reivindicación 1 o 2, en donde Me se elige entre rutenio, osmio,
iridio, renio y cromo.
4. Un compuesto, de conformidad con la
reivindicación 1, elegido del grupo constituido por:
5. Un método para producir un compuesto, de
conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que
comprende la etapa en donde se hace reaccionar un ligando de
piridilbenz-X-azólico (A)
con un compuesto de fórmula
Me(L_{1})(L_{2})Alg, en donde X, A, R, B, L_{1}
y L_{2} son como se ha definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y Alg es
halógeno.
\newpage
6. Un conjugado con la fórmula
\alpha-\omega_{1}, en donde \alpha es un
compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4 y \omega_{1} es una sustancia biológica.
7. Un conjugado, de conformidad con la
reivindicación 6, en donde \omega_{1} se elige del grupo
constituido por células, virus, proteínas, lipopoproteínas,
glicoproteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos,
oligonucleótidos, nucleótidos, sondas de ADN, oligosacáridos,
polisacáridos, lipo-polisacáridos, metabolitos
celulares, hormonas sustancias farmacológicamente activas,
alcaloides, esteroides, vitaminas, aminoácidos, azúcares,
anticuerpos, antígenos, haptenos o sus fragmentos.
8. Un conjugado de fórmula
\alpha-\omega_{1}, en donde \alpha es un
compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4 y \omega_{1} es un colorante fluorescente de absorción a
longitudes de onda a las que el compuesto \alpha es capaz de
emitir.
9. Un conjugado de conformidad con la
reivindicación 8, en donde \omega_{2} es una cianina.
10. Un conjugado de conformidad con la
reivindicación 8, en donde \omega_{2} es una indocianina.
11. Un conjugado de fórmula
\alpha(\omega_{1})(\omega_{2}), en donde \alpha
es un compuesto de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, \omega_{1} es un sustancia biológica de
conformidad c on la reivindicación 6 o 7 y \omega_{2} es un
colorante fluorescente de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10.
12. El uso de un conjugado de conformidad con
cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 u 11 como un reactivo
detectable específico en un método para detección cualitativa y/o
cuantitativa de un analito en una muestra que ha de probarse.
13. Un método analítico para la detección de un
analito en una muestra, que comprende las etapas siguientes:
(i) poner en contacto la muestra con un
conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6,
7 u 11, en condiciones apropiadas para la unión del conjugado al
analito, de estar presente; y
(ii) determinar la presencia de la cantidad de
analito unido al conjugado en la muestra midiendo la luminiscencia
emitida por el conjugado unido al analito.
14. El método, de conformidad con la
reivindicación 13, en donde el analito se separa de los otros
componentes de muestra antes del contacto con el conjugado.
15. El método, de conformidad con la
reivindicación 13 o 14, en donde el conjugado es un conjugado de
conformidad con la reivindicación 6, en donde \omega_{1} es un
anticuerpo.
16. El método, de conformidad con la
reivindicación 15, en donde el analito se separa de los otros
componentes de muestra mediante contacto con un segundo anticuerpo
unido a una fase sólida.
17. El método, de conformidad con las
reivindicaciones 13 o 14, en donde el conjugado es un conjugado de
conformidad con la reivindicación 7, en donde \omega_{1} es una
sonda de ADN.
18. El método, de conformidad con la
reivindicación 17, en donde el analito se separa de los otros
componentes de muestra mediante contacto con una segunda sonda de
ADN unida a una fase sólida.
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