ES2320285T3 - Polipeptido dna19355, un homologo del factor de necrosis tumoral. - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado que comprende los restos de aminoácidos 1 a 177 de la SEC ID Nº: 1.

Description

Polipéptido DNA19355, un homólogo del factor de necrosis tumoral.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la identificación y aislamiento de nuevo ADN y a la producción recombinante de nuevos polipéptidos, denominados en este documento "DNA19355".

Antecedentes de la invención

Se cree que el control del número de células en mamíferos se determina, en parte, mediante un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, denominada a veces como muerte celular necrótica, se caracteriza habitualmente como una forma patológica de muerte celular que resulta de algún trauma o lesión celular. Por el contrario, existe otra, forma "fisiológica" de muerte celular que normalmente se desarrolla de forma ordenada o controlada. Esta forma de muerte celular ordenada o controlada se denomina a menudo como "apoptosis" [véase, por ejemplo, Barr y col., Bio/Technology, 12: 487-493 (1994); Steller y col., Science, 267: 1445-1449 (1995)]. La muerte celular apoptótica se produce de forma natural en muchos procesos fisiológicos, incluyendo desarrollo embrionario y selección clonal en el sistema inmune [Itoh y col., Cell, 66: 233-243 (1991)]. Los niveles reducidos de muerte celular apoptótica se han asociado con diversas afecciones patológicas, incluyendo cáncer, lupus e infección por virus herpes [Thompson, Science, 267: 1456-1462 (1995)]. Los niveles aumentados de muerte celular apoptótica pueden asociarse con otras afecciones patológicas, incluyendo SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, retinitis pigmentaria, degeneración cerebelar, anemia aplásica, infarto de miocardio, apoplejía, lesión por reperfusión y enfermedad hepática inducida por toxinas [véase, Thompson, supra].

La muerte celular apoptótica habitualmente está acompañada por uno o más cambios morfológicos y bioquímicos característicos en las células, tales como condensación del citoplasma, pérdida de las microvellosidades de la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial. Se cree que diversas señales extrínsecas e intrínsecas desencadenan o inducen dichos cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature, 356: 397-400 (1992); Steller, supra; Sachs y col., Blood, 82: 15 (1993)]. Por ejemplo, estos cambios pueden ser desencadenados por estímulos hormonales, tales como hormonas glucocorticoides para timocitos inmaduros, así como la retirada de algunos factores de crecimiento [watanabe-Fukunaga y col., Nature, 356: 314-317 (1992)]. Además, se ha descrito que algunos oncogenes identificados tales como myc, rel, y E1A, y supresores tumorales, como p53, juegan un papel en la inducción de la apoptosis. Del mismo modo, se ha observado que algunos fármacos de quimioterapia y algunas formas de radiación tienen actividad inductora de apoptosis [Thompson,
supra].

Diversas moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral-\alpha ("TNF-\alpha"), factor de necrosis tumoral-\beta ("TNF-\beta" o "linfotoxina-\alpha"), linfotoxina-\beta ("LT-\beta"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1BB, ligando Apo-1 (también denominado ligando Fas o ligando CD95) y ligando Apo-2 (también denominado TRAIL) han sido identificadas como miembros de la familia de citoquinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") [Véase, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85: 3378-3404 (1995); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1996); Wiley y col., Immunity, 3: 673-682 (1995); Browning y col., Cell, 72: 847-856 (1993); Armitage y col. Nature, 357: 80-82 (1992)]. Entre estas moléculas, se ha descrito que TNF-\alpha, TNFR-\beta, ligando CD30, ligando 4-1BB, ligando Apo-1 y ligando Apo-2 (TRAIL) están implicadas en la muerte celular apoptótica. Se ha descrito que tanto TNF-\alpha como TNF-\beta inducen la muerte apoptótica en células tumorales susceptibles [Schmid y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 1881 (1986); Dealtry y col., Eur. J. Immunol., 17: 689 (1987)]. Zheng y col. han descrito que TNF-\alpha está implicado en la apoptosis posterior a la estimulación de células T CD8 positivas [Zheng y col., Nature, 377: 348-351 (1995)]. Otros investigadores han descrito que el ligando CD30 puede estar implicado en la eliminación de células T auto-reactivas en el timo [Amakawa y col., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. No. 10, (1995)].

Las mutaciones en el receptor Fas/Apo-1 de ratón o genes ligandos (llamados Ipr y gld, respectivamente) se han asociado con algunos trastornos autoinmunes, lo que indicaba que el ligando Apo-1 puede jugar un papel en la regulación de la eliminación clonal de linfocitos auto-reactivos en la periferia [Krammer y col., Curr. Op. Immunol., 6: 279-289 (1994); Nagata y col., Science, 267: 1449-1456 (1995)]. También se ha descrito que el ligando Apo-1 induce apoptosis posterior a la estimulación en linfocitos T CD4 positivos y en linfocitos B, y puede estar implicado en la eliminación de linfocitos activados cuando su función ya no es necesaria [Krammer y col., supra; Nagata y col., supra]. Se ha descrito que los anticuerpos monoclonales agonistas de ratón que se unen específicamente al receptor Apo-1 muestran actividad de destrucción celular que es comparable o similar a la del TNF-\alpha [Yonehara y col., J. Exp. Med., 169: 1747-1756 (1989)].

Se cree que la inducción de diversas respuestas celulares mediadas por dichas citoquinas de la familia de TNF se inicia mediante su unión a receptores celulares específicos. Se han identificados dos receptores de TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) y 75 kDa (TNFR2) [Hohman y col., J. Biol. Chem., 264: 14927-14934 (1989); Brockhaus y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3127-3131 (1990); EP 417.563, publicada el 20 de marzo de 1991] y se han aislado y caracterizado ADNc humano y de ratón que corresponden a ambos tipos de receptor [Loetscher y col., Cell, 61: 351 (1990); Schall y col., Cell, 61: 361 (1990); Smith y col., Science, 248: 1019-1023 (1990); Lewis y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 2830-2834 (1991); Goodwin y col., Mol. Cell. Biol., 11: 3020-3026 (1991)]. Los polimorfismos extensivos se han asociado con ambos genes del receptor de TNF [véase, por ejemplo, Takao y col., Immunogenetics, 37: 199-203 (1993)]. Ambos TNFR comparten la estructura típica de los receptores de la superficie celular incluyendo regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las partes extracelulares de ambos receptores también se encuentran de forma natural como proteínas solubles de unión a TNF [Nophar, Y. y col., EMBO J., 9: 3269 (1990); y Kohno, T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 8331 (1990)]. Más recientemente, la clonación de receptores de TNF solubles recombinantes fue descrita por Hale y col. [J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, p. 113 (P424)].

La parte extracelular de TNFR de tipo 1 y tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un patrón repetitivo de secuencia de aminoácidos de cuatro dominios ricos en cisteína (CRD) denominados de 1 a 4, comenzando a partir del extremo NH. Cada CRD tiene aproximadamente 40 aminoácidos de longitud y contiene de 4 a 6 restos de cisteína en posiciones que están bien conservadas [Schall y col., supra; Loetscher y col., supra; Smith y col., supra; Nophar y col., supra; Kohno y col., supra]. En TNFR1, los límites aproximados de los cuatro CRD son los siguientes: CRD1 - aminoácidos 14 a aproximadamente 53; CRD2 - aminoácidos de aproximadamente 54 a aproximadamente 97; CRD3 - aminoácidos de aproximadamente 98 a aproximadamente 138; CRD4 - aminoácidos de aproximadamente 139 a aproximadamente 167. En TNFR2, CRD1 incluye los aminoácidos 17 a aproximadamente 54; CRD2 - aminoácidos de aproximadamente 55 a aproximadamente 97; CRD3 - aminoácidos de aproximadamente 98 a aproximadamente 140; y CRD4 - aminoácidos de aproximadamente 141 a aproximadamente 179 [Banner y col., Cell, 73: 431-435 (1993)]. El papel potencial de los CRD en la unión a ligandos también ha sido descrito por Banner y col., supra.

Un patrón repetitivo similar de CRD existe en otras proteínas de la superficie celular, incluyendo el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (NGFR) [Johnson y col., Cell, 47: 545 (1986); Radeke y col., Nature, 325: 593 (1987)], el antígeno de células B CD40 [Stamenkovic y col., EMBO J., 8: 1403 (1989)], el antígeno de células T OX40 [Mallet y col., EMBO J., 9: 1063 (1990)] y el antígeno Fas [Yonehara y col., supra y Itoh y col., Cell, 66: 233-243 (1991)]. También se encuentran CRD en las proteínas T2 solubles similares a TNFR (sTNFP) de los poxvirus Shope y mixoma [Upton y col., Virology, 160: 20-29 (1987); Smith y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176: 335 (1991); Upton y col., Virology, 184: 370 (1991)]. El alineamiento óptimo de estas secuencias indica que las posiciones de los restos de cisteína están bien conservadas. Estos receptores a veces se denominan colectivamente como miembros de la superfamilia de receptores de TNF/NGF. Estudios recientes sobre p75NGFR mostraron que la eliminación de CRD1 [Welcher, A.A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 159-163 (1991)] o una inserción de 5 aminoácidos en este dominio [Yan, H. y Chao, M.V., J. Biol. Chem., 266: 12099-12104 (1991)] tenía poco o ningún efecto sobre la unión a NGF [Yan, H. y Chao, M.V., supra]. El p75 NGFR contiene un tramo rico en prolina de aproximadamente 60 aminoácidos, entre su CRD4 y la región transmembrana, que no está implicado en la unión a NGF [Peetre, C. y col., Eur. J. Hematol., 41: 414-419 (1988); Seckinger, P. y col., J. Biol. Chem., 264: 11966-11973 (1989); Yan, H. y Chao, M.V., supra]. Una región rica en prolina similar se encuentra en TNFR2 pero no en TNFR1.

Itoh y col. describen que el receptor Apo-1 puede señalizar una muerte celular apoptótica similar a la señalizada por el TNFR1 de 55 kDa [Itoh y col., supra]. También se ha descrito que la expresión del antígeno Apo-1 se regula negativamente junto con la de TNFR1 cuando las células se tratan con TNF-\alpha o un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Apo-1 [Krammer y col., supra; Nagata y col., supra]. Por consiguiente, algunos investigadores plantearon la hipótesis de que las líneas celulares que co-expresan los receptores Apo-1 y TNFR1 pueden mediar en la destrucción celular a través de rutas de señalización comunes [Id.].

Los ligandos de la familia de TNF identificados hasta la fecha, con la excepción de la linfotoxina-\alpha, son proteínas transmembrana de tipo II, cuyo extremo C es extracelular. Por el contrario, la mayoría de los receptores en la familia del receptor de TNF (TNFR) identificados hasta la fecha son proteínas transmembrana de tipo I. En las familias del ligando y del receptor de TNF, sin embargo, la homología identificada entre los miembros de la familia se ha observado principalmente en el dominio extracelular ("ECD"). Varias de la citoquinas de la familia de TNF, incluyendo TNF-\alpha, ligando Apo-1 y ligando CD40, se escinden de forma proteolítica en la superficie celular; la proteína resultante en cada caso forma habitualmente una molécula homotrimérica que funciona como una citoquina soluble. Las proteínas de la familia del receptor de TNF también se escinden normalmente de forma proteolítica para liberar ECD del receptor solubles que pueden funcionar como inhibidores de las citoquinas afines.

Recientemente, se han identificado otros miembros de la familia de TNFR. Dichos miembros recientemente identificados de la familia de TNFR incluyen CAR1, HVEM y osteoprotegerina (OPG) [Brojatsch y col., Cell, 87: 845-855 (1996); Montgomery y col., Cell, 87: 427-436 (1996); Marsters y col., J. Biol. Chem., 272: 14029-14032 (1997); Simonet y col., Cell, 89: 309-319 (1997)]. A diferencia de otras moléculas similares a TNFR conocidas, Simonet y col., supra, describen que OPG no contiene secuencias hidrofóbicas que se extienden a través de de la membrana.

En el documento Masters y col., Curr. Biol., 6: 750 (1996), los investigadores describen un polipéptido humano de secuencia nativa de longitud completa, llamado Apo-3, que muestra similitud con la familia de TNFR en sus repeticiones ricas en cisteína extracelulares y se parece a TNFR1 y CD95 en que contiene una secuencia de dominio de muerte celular citoplasmático [véase también Marsters y col., Curr. Biol., 6: 1669 (1996)]. Otros autores también se refieren a Apo-3 como DR3, wsl-1 y TRAMP [Chinnaiyan y col., Science, 274: 990 (1996); Kitson y col., Nature, 384: 372 (1996); Bodmer y col., Immunity, 6: 79 (1997)].

Pan y col. han descrito otro miembro de la familia del receptor TNF denominado "DR4" [Pan y col., Science, 276: 111-113 (1997)]. Se describió que DR4 contiene un dominio de muerte citoplasmático capaz de activar al aparato de suicidio celular. Pan y col. describen que se cree que DR4 es un receptor para el ligando conocido como ligando Apo-2 o TRAIL.

En los documentos Sheridan y col., Science, 277: 818-821 (1997) y Pan y col., Science, 277: 815-818 (1997), se describe otra molécula que se cree que es un receptor para el ligando Apo-2 (TRAIL). Esta molécula se denomina DR5 (como alternativa, también se ha denominado Apo-2). Al igual que DR4, se ha descrito que DR5 contiene un dominio de muerte citoplasmático y es capaz de señalizar la apoptosis.

En el documento Sheridan y col., supra, se describe un receptor llamado DcR1 (o como alternativa, Apo-2DcR) como un potencial receptor señuelo para el ligando Apo-2 (TRAIL). Sheridan y col. describen que DcR1 puede inhibir la función del ligando Apo-2 in vitro. Véase también, Pan y col., supra, para una descripción del receptor señuelo denominado TRID.

Para una revisión de la familia de citoquinas de TNF y sus receptores, véase Gruss y Dower, supra.

Como se entiende actualmente, el programa de muerte celular contiene al menos tres elementos importantes - activadores, inhibidores y efectores; en C. elegans, estos elementos están codificados respectivamente por tres genes, Ced-4, Ced-9 y Ced-3 [Steller, Science, 267: 1445 (1995); Chinnaiyan y col., Science, 275: 1122-1126 (1997); Wang y col., Cell, 90: 1-20 (1997)]. Dos de los miembros de la familia de TNFR, TNFR1 y Fas/Apo1 (CD95), pueden activar la muerte celular apoptótica [Chinnaiyan y Dixit, Current Biology, 6: 555-562 (1996); Fraser y Evan, Cell; 85: 781-784 (1996)]. También se sabe que TNFR1 media en la activación del factor de transcripción, NF-\kappaB [Tartaglia y col., Cell, 74: 845-853 (1993); Hsu y col., Cell, 84: 299-308 (1996)]. Además de alguna homología de ECD, estos dos receptores comparten homología en su dominio intracelular (ICD) en un interfaz de oligomerización conocido como el dominio de muerte [Tartaglia y col., supra; Nagata, Cell, 88: 355 (1997)]. Los dominios de muerte también se encuentran en varias proteínas de metazoos que regulan la apoptosis, concretamente, la proteína de Drosophila, Reaper, y las proteínas de mamífero denominadas FADD/MORT1, TRADD y RIP [Cleaveland e Ihle, Cell, 81: 479-482 (1995)]. Después de la unión al ligando y el agrupamiento de receptores, se cree que TNFR1 y CD95 reclutan a FADD en un complejo de señalización que induce la muerte. CD95 supuestamente se une a FADD directamente, mientras que TNFR1 se une a FADD indirectamente mediante TRADD [Chinnaiyan y col., Cell, 81: 505-512 (1995); Boldin y col., J. Biol. Chem., 270: 387-391 (1995); Hsu y col., supra; Chinnaiyan y col., J. Biol. Chem., 271: 4961-4965 (1996)]. Se ha descrito de que FADD sirve como proteína adaptadora que recluta a la proteasa relacionada con Ced-3, MACH\alpha/FLICE (caspasa 8), en el complejo señalizador de muerte [Boldin y col., Cell, 85: 803-815 (1996); Muzio y col., Cell, 85: 817-827 (1996)]. MACH\alpha/FLICE parece ser el desencadenante que desencadena una cascada de proteasas apoptóticas, incluyendo la enzima de conversión de interleucina-1\beta (ICE) y CPP32/Yama, que pueden ejecutar algunos aspectos críticos del programa de muerte celular [Fraser y Evan,
supra].

Recientemente se describió que la muerte celular programada implica la actividad de miembros de una familia de cisteína proteasas relacionadas con el gen de muerte celular de C. elegans, ced-3, y con la enzima de conversión de IL-1 de mamífero, ICE. La actividad de las proteasas ICE y CPP32/Yama puede inhibirse mediante el producto del gen del virus de la viruela vacuna, crmA [Ray y col., Cell, 69: 597-604 (1992); Tewari y col., Cell, 81: 801-809 (1995)]. Estudios recientes muestran que CrmA puede inhibir la muerte celular inducida por TNFR1 y CD95 [Enari y col., Nature, 375: 78-81 (1995); Tewari y col., J. Biol. Chem., 270: 3255-3260 (1995)].

Como ha sido revisado recientemente por Tewari y col., TNFR1, TNFR2 y CD40 modulan la expresión de citoquinas proinflamatorias y coestimuladoras, receptores de citoquina y moléculas de adhesión celular a través de la activación del factor de transcripción, NF-\kappaB (Tewari y col., Curr. Op. Genet. Develop., 6: 39-44 (1996)]. NF-\kappaB es el prototipo de una familia de factores de transcripción diméricos cuyas subunidades contienen regiones Rel conservadas [Verma y col., Genes Develop., 9: 2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14: 649-681 (1996)]. En su forma latente, NF-\kappaB se compleja con miembros de la familia del inhibidor de I\kappaB; después de la inactivación del I\kappaB en respuesta a ciertos estímulos, el NF-\kappaB liberado se transloca al núcleo donde se une a secuencias de ADN específicas y activa la transcripción génica. NF-\kappaB es inducido por diversas señales proinflamatorias y citoquinas incluyendo IL-1 y LPS que actúan a través del receptor similar a Toll TLR2 [Baeuerle y col., Ann. Rev. Immunol., 12: 141-79 (1994); Verma y col., supra].

Descripción resumida de la invención

Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido, denominado en la presente solicitud "DNA19355". El documento WO98/07880 se refiere a una secuencia de polinucleótidos y a su supuesta secuencia de aminoácidos (que corresponde a los aminoácidos 9 a 177 del polipéptido DNA 19355).

En una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende ADN que codifica el polipéptido DNA19355 tal como se define en las reivindicaciones. Opcionalmente, el ácido nucleico aislado comprende ADN que codifica el polipéptido DNA19355 que tiene los restos de aminoácidos 1 a 177 de la Fig. 1 (SEC ID ID Nº: 1), o es complementario a dicha secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece unido de forma estable a ésta en condiciones al menos moderadas, y opcionalmente, de alta astringencia. El ácido nucleico aislado puede comprender el inserto de ADNc de DNA19355 del vector depositado como ATCC 209466, y en particular el inserto que incluye la secuencia de ADN que codifica el polipéptido DNA19355.

En otra realización, la invención proporciona un vector que comprende ADN que codifica el polipéptido DNA19355 tal como se define en las reivindicaciones. También se proporciona una célula huésped que comprende dicho vector. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, E. coli, o levadura. También se proporciona un proceso para producir polipéptidos DNA19355 y que comprende cultivar células huésped en condiciones adecuadas para la expresión de DNA19355 y recuperar DNA19355 a partir del cultivo celular.

En otra realización, la invención proporciona polipéptido DNA19355 aislado tal como se define en las reivindicaciones. En particular, la invención proporciona polipéptido DNA19355 de secuencia nativa aislada, que en una realización, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los restos 1 a 177 de la Figura 1 (SEC ID ID Nº: 1). Opcionalmente, el polipéptido DNA19355 se obtiene o puede obtenerse expresando el polipéptido codificado por el inserto de ADNc del vector depositado como ATCC 209466.

En este documento se describen variantes del polipéptido DNA19355 aisladas. Las variantes comprenden polipéptidos que tienen al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos deducida de la Fig. 1 (SEC ID Nº:1) o secuencias de dominio identificadas en este documento, y preferentemente tienen actividad o actividades de polipéptido DNA19355 de secuencia nativa o de origen natural.

En otra realización, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden el polipéptido DNA19355 fusionado a un polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos heteróloga tal como se define en las reivindicaciones. Un ejemplo de dicha molécula quimérica comprende un DNA19355 fusionado a una secuencia de marca epitópica o una región Fc de una inmunoglobulina.

En este documento también se describe un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido DNA19355. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En este documento también se describen métodos de diagnóstico y terapéuticos que usan DNA19355. Por ejemplo, se describen métodos para inducir apoptosis en células cancerosas de mamífero.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº:2) de un ADNc para DNA19355 humano y la secuencia de aminoácidos derivada de ésta (SEC ID Nº:1).

La Figura 2 muestra un alineamiento y comparación de la secuencia de aminoácidos extracelular del polipéptido DNA19355 con Apo-2L humano, ligando Fas/Apo1 (CD95L), TNF-alfa y LT-\alpha; las identidades de aminoácidos respectivas (%) son de aproximadamente 19,8, 19,0, 20,6 y 17,5.

La Figura 3 muestra un análisis de transferencia de Northern de la expresión de ARNm de DNA19355 en tejidos humanos (tejidos adultos y fetales identificados) y líneas celulares tumorales (leucemia promielocítica HL60, carcinoma cervical HeLa S3, leucemia mielógena crónica K562, leucemia linfoblástica MOLT4, linfoma de Raji Burkitt, adenocarcinoma colorrectal SW480, carcinoma pulmonar A549 y melanoma G361).

La Figura 4 muestra un análisis de polipéptido DNA19355 soluble mediante SDS-PAGE.

La Figura 5 muestra: (A) imágenes de fluorescencia de núcleos teñidos mediante tinción de Hoechst de células transfectadas con pRK5 (a); pRK5 que codifica DNA19355 (b); pRK5 que codifica ligando Apo-2 (c); pRK5 que codifica DNA19355 más pRK5 que codifica CrmA (d); pRK5 que codifica DNA19355 más pRK5 que codifica FADD-DN (e); pRK5 que codifica ligando Apo-2 más pRK5 que codifica FADD-DN (f). (B) inducción de apoptosis mediante DNA19355 o ligando Apo-2transfectado y efecto de los inhibidores de caspasa y FADD-DN.

La Figura 6 muestra el efecto de DNA19355 sobre la actividad de NF-\kappaB. Análisis de desplazamiento por movilidad electroforética de la actividad de NF-\kappaB en células transfectadas con pRK5, o pRK5 que codifica DNA19355, o pRK5 que codifica ligando Apo-2. En cada caso, las células se co-transfectaron con pRK5 (3 pistas de la izquierda) o pRK5 que codifica NIK de dominio negativo (NIK-DN, 3 pistas de la derecha).

La Figura 7 muestra un alineamiento y comparación de las secuencias de aminoácidos para GITR humano (hGITR) y GITR de múrido (mGITR). Se muestran los tres dominios ricos en cisteína (CRD1, CRD2, y CRD3) y la región transmembrana (TM).

La Figura 8 muestra los resultados de un análisis de co-precipitación descrito en el Ejemplo 12 posteriormente. La autorradiografía del gel de SDS-PAGE mostraba la molécula hGITR-IgG unida al polipéptido DNA19355 radioyodado. No se observó unión para las demás construcciones de inmunoadhesina identificadas.

La Figura 9A muestra los resultados de análisis FACS de células 293 transfectadas de las que se evaluó la unión a los receptores o ligandos de construcciones de inmunoadhesina identificadas.

La Figura 9B muestra los resultados de análisis FACS de células HUVEC de las que se evaluó la unión al receptor de construcciones de inmunoadhesina identificadas.

La Figura 10 muestra los resultados de un análisis de la actividad de luciferasa realizado para demostrar la activación de NF-\kappaB mediante DNA19355/hGITR.

La Figura 11 muestra los resultados de un ELISA realizado para determinar los niveles de TNF-alfa en sobrenadantes de cultivo de células T primarias y monocitos/macrófagos incubados con polipéptido DNA19355.

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Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Las expresiones "Polipéptido DNA19355" y "DNA19355" cuando se usan en este documento abarcan DNA19355 de secuencia nativa y variantes DNA19355 (que se definen adicionalmente en este documento). El DNA19355 puede aislarse a partir de diversas fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o puede prepararse mediante métodos recombinantes o sintéticos. Las expresiones "polipéptido DNA19355" y "DNA19355" cuando se usan en este documento se refieren a los mismos polipéptidos denominados en la bibliografía como "GLITTER". Un "DNA19355 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un DNA19355 obtenido de la naturaleza. Dicho DNA19355 de secuencia nativa puede aislarse a partir de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. La expresión "DNA19355 de secuencia nativa" abarca específicamente formas de origen natural truncadas, solubles o secretadas del DNA19355 (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular o forma soluble), formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas cortadas y empalmadas ("spliced") de forma alternativa) y variantes alélicas de origen natural del DNA19355. En una realización de la invención, el DNA19355 de secuencia nativa es un polipéptido DNA19355 de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 177 de la Fig. 1 (SEC ID Nº: 1). Como alternativa, el polipéptido DNA19355 comprende los aminoácidos 52 a 177 de la Fig. 1 (SEC ID Nº: 1). Opcionalmente, el polipéptido DNA19355 se obtiene o puede obtenerse expresando el polipéptido codificado por el inserto de ADNc del vector depositado como ATCC 209466.

El "Dominio extracelular de DNA19355" o "DNA19355 ECD" se refiere a una forma de DNA19355 que está esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplasmático de DNA19355. Generalmente, el DNA19355 ECD tendrá menos del 1% de dichos dominios transmembrana y/o citoplasmático y preferentemente, tendrá menos del 0,5% de dichos dominios. Opcionalmente, el DNA19355 ECD comprenderá restos de aminoácidos X a 177 de la Fig. 1 (SEC ID Nº: 1), donde X es uno cualquiera de los restos de aminoácidos 48 a 57 de la Fig. 1 (SEC ID Nº: 1). El experto técnico en la materia entenderá que el dominio transmembrana identificado para el polipéptido DNA19355 de la presente invención se identifica siguiendo los criterios empleados habitualmente en la técnica para identificar a este tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar pero, muy probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio mencionado específicamente en este documento.

"Variante de DNA19355" significa un DNA19355 como se define a continuación que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con el DNA19355 que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la Fig. 1 (SEC ID Nº: 1) para un DNA19355 de secuencia nativa de longitud completa o las diversas secuencias de dominio identificadas en este documento. Dichas variantes de DNA19355 incluyen, por ejemplo, polipéptidos DNA19355 en los que uno o más restos de aminoácidos se añaden o eliminan en el extremo N- o C- de la secuencia de la Fig. 1 (SEC ID Nº:1). Las variantes de DNA19355 incluyen fragmentos de ECD que incluyen secuencias que tienen menos que los restos de aminoácidos 52 a 177 de la Fig. 1 (SEC ID Nº: 1). Generalmente, una variante de DNA19355 tendrá al menos aproximadamente el 80% o el 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, y aún más preferentemente al menos aproximadamente el 95% identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 (SEC ID Nº: 1).

"El porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de DNA19355 identificadas en este documento se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de DNA19355, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad en la secuencia. El alineamiento con el propósito de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas maneras que están dentro del alcance de la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertotécnicos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo alineamiento en toda la longitud de las secuencias comparadas.

"El porcentaje (%) de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de DNA19355 identificadas en este documento se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en la secuencia de DNA19355, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir leal máximo porcentaje de identidad en la secuencia. El alineamiento con el propósito de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos puede conseguirse de diversas maneras que están dentro del alcance de la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos técnicos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo alineamiento en toda la longitud de las secuencias comparadas.

La expresión "marcado con epítopo" cuando se usa en este documento se refiere a un polipéptido quimérico que comprende DNA19355, o una secuencia de dominio del mismo, fusionado a un "polipéptido marca". El polipéptido marca tiene suficientes restos para proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un anticuerpo, o que puede ser identificado por algún otro agente, que es lo suficientemente corto para no interferir con la actividad del DNA19355. El polipéptido marca preferentemente también es bastante único de modo que el anticuerpo no reacciona sustancialmente de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos marca generalmente tienen al menos seis restos de aminoácidos y normalmente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 restos de aminoácidos (preferentemente, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 restos).

"Aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos descritos en este documento, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que habitualmente interferirían con usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural de DNA19355 no estará presente. Generalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico de DNA19355 "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que generalmente se asocia en la fuente natural del ácido nucleico de DNA19355. Una molécula de ácido nucleico de DNA19355 aislada es diferente en la forma o entorno en que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico de DNA19355 aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico de DNA19355 tal como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico de DNA19355 aislada incluye moléculas de ácido nucleico de DNA19355 contenidas en las células que generalmente expresan DNA19355 donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida de forma operativa en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un punto de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido de forma operativa" cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o secuencia líder de secreción está unido de forma operativa a ADN para un polipéptido si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido de forma operativa a una secuencia codificante si éste afecta a la transcripción de la secuencia; o un punto de unión al ribosoma está unido de forma operativa a una secuencia codificante si éste se sitúa para facilitar la traducción. Generalmente, "unido de forma operativa" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de una secuencia líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue mediante ligamiento en puntos de restricción convenientes. Si dichos puntos no existen, se usan adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales únicos anti-DNA19355 (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas, y de neutralización) y composiciones de anticuerpos anti-DNA19355 con especificidad poliepitópica. La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en muy pequeñas cantidades.

"Biológicamente activo" y "actividad biológica deseada" para los propósitos de este documento significan (1) tener la capacidad de modular apoptosis (de manera agonista o estimuladora o de manera antagonista o bloqueante) en al menos un tipo de célula de mamífero in vivo o ex vivo o (2) tener la capacidad de inducir o estimular una respuesta proinflamatoria en al menos un tipo de célula de mamífero in vivo o ex vivo.

Las expresiones "apoptosis" y "actividad apoptótica" se usan en un sentido amplio y se refieren a la forma de muerte celular ordenada o controlada en mamíferos que habitualmente está acompañada por uno o más cambios celulares característicos, incluyendo condensación del citoplasma, pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial. Esta actividad puede determinarse y medirse, por ejemplo, mediante ensayos de viabilidad celular, análisis FACS o electroforesis de ADN, todos los cuales se conocen en la técnica.

Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia" tal como se usan en este documento se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que habitualmente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, aunque sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón macrocítico, blastoma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer pancreático, glioblastoma, neuroblastoma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El término "mamífero" tal como se usa en este documento se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un ser humano.

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II. Composiciones y Métodos de la Invención A. Polipéptidos DNA19355

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos recién identificadas y aisladas que codifican polipéptidos denominados en la presente solicitud DNA19355. En particular, los Solicitantes identificaron y aislaron ADNc que codifica un polipéptido DNA19355, tal como se describe con más detalle en los Ejemplos a continuación. Usando los programas informáticos de alineamiento de secuencia BLAST y FastA, los Solicitantes descubrieron que DNA19355 (mostrado en la Figura 1 y en SEC ID Nº: 1) comparte cierta identidad en la secuencia de aminoácidos con algunos miembros de la familia de TNF (véase, por ejemplo, la Figura 2 y el Ejemplo 1 a continuación). Tal como se muestra en los Ejemplos a continuación, se descubrió que el polipéptido DNA19355 tiene actividad apoptótica y se une específicamente a GITR. También se descubrió que DNA19355 estimulaba la secreción de TNF-alfa en células T primarias in vitro (Ejemplo 14) y la infiltración o entrada de neutrófilos en un ensayo de biopsia de piel de cobaya (tal como se describe en el Ejemplo 15), lo que sugiere el papel de DNA19355 en respuestas proinflamatorias.

Además del DNA19355 de secuencia nativa de longitud completa y formas solubles de DNA19355 descritas en este documento, se contempla que pueden preparase variantes de DNA19355. Pueden preparase variantes de DNA19355 introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en la secuencia de nucleótidos de DNA19355, o mediante síntesis del polipéptido DNA19355 deseado. Los expertos en la materia comprenderán que los cambios de aminoácidos pueden alterar procesos post-traduccionales del DNA19355, tales como cambiar el número o posición de los puntos de glucosilación o alterar las características de anclaje a la membrana.

Las modificaciones en el DNA19355 de secuencia nativa de longitud completa o en diversos dominios del
DNA19355 descrito en este documento pueden realizarse, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas mostradas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº. 5.364.934. Las modificaciones pueden ser una sustitución, eliminación o inserción de uno o más codones que codifican el DNA19355 que provocan un cambio en la secuencia de aminoácidos del DNA19355 en comparación con el DNA19355 de secuencia nativa. Opcionalmente, la modificación es mediante sustitución de al menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del DNA19355. La orientación para determinar qué resto de aminoácido puede insertarse, sustituirse o eliminarse sin afectar de forma adversa a la actividad deseada puede encontrarse comparando la secuencia del DNA19355 con la de moléculas proteicas homólogas conocidas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos realizados en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativas. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos. La modificación permitida puede determinarse realizando sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y analizando la actividad de las variantes resultantes en cualquiera de los ensayos in vitro descritos en los Ejemplos a continuación.

Las modificaciones pueden realizarse usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis (dirigida) mediada por oligonucleótidos, barrido con alanina, y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter y col., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis en casete [wells y col., Gene, 34: 315 (1985)], mutagénesis de selección por restricción [Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden realizarse en el ADN clonado para producir el ADN de la variante de DNA19355.

También puede emplearse análisis de barrido con aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos están aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es habitualmente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo puesto que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. Habitualmente, también se prefiere la alanina puesto que es el aminoácido más común. Además, frecuentemente se encuentra tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. Si la sustitución con alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede usarse un aminoácido isostérico.

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B. Modificaciones de DNA19355

Las modificaciones covalentes de DNA19355 se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar restos de aminoácidos marcados del DNA19355 con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los restos N- o C- terminales del DNA19355. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular DNA19355 con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en el método para purificar anticuerpos anti-DNA19355, y viceversa. Los agentes de entrecruzamiento usados habitualmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido-salicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidil-propionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de restos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes restos glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de restos serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido DNA19355 incluida en el alcance de la presente invención comprende alterar el patrón de glucosilación nativo del polipéptido. "Alterar el patrón de glucosilación nativo" pretende, para los propósitos de este documento, indicar la eliminación de uno o más restos de carbohidrato hallados en DNA19355 de secuencia nativa, y/o la adición de uno o más puntos de glucosilación que no están presentes en el DNA19355 de secuencia nativa.

La adición de puntos de glucosilación al polipéptido DNA19355 puede conseguirse alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición, o la sustitución, de uno o más restos de serina o treonina en el DNA19355 de secuencia nativa (para puntos de glucosilación enlazados a O). La secuencia de aminoácidos de DNA19355 puede alterarse opcionalmente a través de cambios a nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido DNA19355 en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio para aumentar el número de restos de carbohidrato en el polipéptido DNA19355 es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Dichos métodos se describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

La eliminación de los restos de carbohidrato presentes en el polipéptido DNA19355 puede conseguirse química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican restos de aminoácidos que sirven como dianas para la glucosilación. En la técnica se conocen y se describen técnicas de desglucosilación química, por ejemplo, por Hakimuddin, y col., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y por Edge y col., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La escisión enzimática de restos de carbohidrato en polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de diversas endoglucosidasas y exoglucosidasas descrita por Thotakura y col., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de DNA19355 comprende enlazar el polipéptido DNA19355 a uno de diversos polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, en la manera que se muestra en las Patentes de Estados Unidos Nº. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.

El DNA19355 de la presente invención también puede modificarse de manera que se forme una molécula quimérica que comprende DNA19355 fusionado a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heteróloga. En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión del DNA19355 con un polipéptido marca que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-marca. La marca epitópica se coloca generalmente en el extremo amino- o carboxilo- del DNA19355. La presencia de dichas formas marcadas con epítopo del DNA19355 puede detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido marca. Además, la disposición de la marca epitópica permite que el DNA19355 se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la marca epitópica. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del DNA19355 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, dicha fusión podría ser a la región Fc de una molécula de IgG. En particular, la molécula quimérica puede comprender un ECD de DNA19355 fusionado a una molécula con una marca de His.

Diversos polipéptidos marca y sus respectivos anticuerpos se conocen bien en la técnica. Los ejemplos incluyen marcas de polihistidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido marca Ha de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field y col., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la marca c-myc y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 [Evan y col., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la marca de glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y sus anticuerpos [Paborsky y col., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos marca incluyen el péptido Flag [Hopp y col., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; el péptido epitópico KT3 [Martin y col., Science, 255: 192-194 (1992)]; un péptido epitópico de \alpha-tubulina [Skinner y col., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; la marca peptídica de la proteína del gen 10 de T7 [Lutz-Freyermuth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].

El DNA19355 de la invención también puede modificarse para formar una molécula quimérica que comprende DNA19355 fusionado a una cremallera de leucina. En la técnica se han descrito diversos polipéptidos de cremallera de leucina. Véase, por ejemplo, Landschulz y col., Science, 240: 1759 (1988); WO 94/10308; Hoppe y col., FEBS Letters, 344: 1991 (1994); Maniatis y col., Nature, 341: 24 (1989). Se cree que el uso de una cremallera de leucina fusionada a DNA19355 puede ser deseable para ayudar a dimerizar o trimerizar DNA19355 soluble en solución. Los expertos en la materia entenderán que la cremallera de leucina puede fusionarse en el extremo 5' o 3' de la molécula de DNA19355.

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C. Preparación de DNA19355

La descripción a continuación se refiere principalmente a la producción de DNA19355 cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico de DNA19355. Por supuesto, se contempla que pueden emplearse métodos alternativos, que se conocen bien en la técnica, para preparar DNA19355. Por ejemplo, la secuencia de DNA19355, o partes de la misma, puede producirse mediante síntesis peptídica directa usando técnicas en fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart y col., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro puede realizarse usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Diversas partes del DNA19355 pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos o enzimáticos para producir el DNA19355 de longitud completa.

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1. Aislamiento de ADN que codifica DNA19355

El ADN que codifica DNA19355 puede obtenerse de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm de DNA19355 y que lo expresa a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN de DNA19355 humano puede obtenerse convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica DNA19355 también puede obtenerse a partir de una biblioteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.

Las bibliotecas pueden cribarse con sondas (tales como anticuerpos para el DNA19355 u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. El cribado del ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede realizarse usando procedimientos convencionales, tal como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica DNA19355 es usar una metodología de PCR [Sambrook y col., anteriormente; Dieffenbach y col., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los Ejemplos siguientes describen técnicas para cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente no ambiguas para que los falsos positivos se minimicen. El oligonucleótido se marca preferentemente de modo que pueda detectarse después de la hibridación a ADN en la biblioteca cribada. Los métodos de marcado se conocen bien en la técnica, e incluyen el uso de radiomarcadores como ATP marcado con ^{32}P, biotilinación o marcado con enzimas. Las condiciones de hibridación, incluyendo astringencia moderada y astringencia alta, se proporcionan en Sambrook y col., supra.

Las secuencias identificadas en dichos métodos de cribado en una biblioteca pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (a nivel de aminoácidos o de nucleótidos) en las regiones definidas de la molécula o en la secuencia de longitud completa, puede determinarse a través de alineamiento de secuencias usando programas informáticos tales como ALIGN, DNAstar e INHERIT que emplean diversos algoritmos para medir la homología.

El ácido nucleico que tiene la secuencia codificante de proteínas puede obtenerse mediante el cribado de ADNc o bibliotecas genómicas seleccionadas usando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en este documento por primera vez y, si fuera necesario, usando procedimientos de extensión con cebador convencionales según se describe en Sambrook y col., supra, para detectar precursores y procesar intermedios de ARNm que pueden no haberse transcrito de forma inversa a ADNc.

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2. Selección y Transformación de Células Huésped

Se transfectan o transforman células huésped con vectores de expresión o clonación descritos en este documento para la producción de DNA19355 y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y similares, pueden seleccionarse por un experto en la materia sin mucha experimentación. En general, principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares pueden encontrarse en el documento Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y col., supra.

Los métodos de transfección son conocidos por un experto en la materia, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas convencionales apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro cálcico, tal como se describe en Sambrook y col., supra, o electroporación, se usan generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales de la pared celular. La infección por Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, según lo descrito por Shaw y col., Gene, 23: 315 (1983) y el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para células de mamífero sin dichas paredes celulares, puede emplearse el método de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). Los aspectos generales de transformaciones en el sistema de la célula huésped de mamífero se han descrito en la Patente de Estados Unidos Nº. 4.399.216. Las transformaciones en levadura se realizan habitualmente según el método de Van Solingen y col., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también pueden usarse otros métodos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión del protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas para transformar células de mamífero, véase Keown y col., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) y Mansour y col., Nature, 336: 348-352 (1988).

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en este documento incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores. Los procariotas adecuados incluyen aunque sin limitación eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli. Diversas cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635).

Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican DNA19355. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped ecurariota inferior usado habitualmente.

Las células huésped adecuadas para la expresión de DNA19355 glucosilado se obtienen de organismos pluricelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles incluyen células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y COS. Ejemplos más específicos incluyen la línea de riñón de mono CV1 transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en un cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); células de Ovario de Hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); y tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se considera dentro del alcance de la técnica.

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3. Selección y Uso de un Vector Replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica DNA19355 puede insertarse en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Diversos vectores están disponibles públicamente. El vector puede, por ejemplo, estar en forma de plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos. En general, el ADN se inserta en uno o varios puntos de restricción con endonucleasas apropiadas usando técnicas conocidas en el sector. Los componentes del vector incluyen generalmente, aunque sin limitación, uno o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de ligamiento estándar conocidas por el experto en la materia.

El DNA19355 puede producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también en forma de un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un punto de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN de DNA19355 que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de secuencias líderes de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levadura la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la secuencia líder de invertasa de levadura, la secuencia líder del factor alfa (incluyendo secuencias líderes de factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, el último descrito en la Patente de Estados Unidos Nº. 5.010.182), o la secuencia líder de fosfatasa ácida, la secuencia líder de glucoamilasa de C. albicans (EP 362.179 publicado el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, pueden usarse secuencias de señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal a partir de polipéptidos secretados de la misma o de especies relacionadas, así como secuencias líderes de secreción virales.

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias se conocen bien para diversas bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen plasmídico 2 \mu es adecuado para levadura, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero.

Los vectores de expresión y clonación contendrán habitualmente un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilos.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico de DNA19355, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada según lo descrito por Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10: 157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].

Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor unido de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico de DNA19355 para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por diversas células huésped potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de \beta-lactamasa y lactosa [Chang y col., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281: 544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida de forma operativa al ADN que codifica DNA19355.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)] u otras enzimas glucolíticas [Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levadura se describen adicionalmente en el documento EP 73.657.

La transcripción de DNA19355 a partir de vectores en células huésped de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y Virus de Simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

La transcripción de un ADN que codifica el DNA19355 por eucariotas superiores puede aumentar insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en posición cis de ADN, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en la parte final del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la parte final del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede cortarse y empalmarse ("splice") en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante de DNA19355, pero se sitúa preferentemente en un punto 5' con respecto al promotor.

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanas o células nucleadas de otros organismos pluricelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica DNA19355.

Otros métodos, vectores, y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de DNA19355 en cultivo de células recombinantes de vertebrados se describen en Gething y col., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei y col., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117.060; y EP 117.058.

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4. Detección de la Amplificación/Expresión Génica

La amplificación y/o expresión génica puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante Transferencia de Southern, Transferencia de Northern convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], transferencia puntual (método "dot blot") (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, en base a las secuencias las secuencias proporcionadas en este documento. Como alternativa, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer dobles cadenas específicss, incluyendo dobles cadenas de ADN, dobles cadenas de ARN y dobles cadenas híbridas de ADN-ARN o dobles cadena de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y puede realizarse el ensayo en el que la doble cadena se une a una superficie, de modo que después de la formación de la doble cadena en la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido a la doble cadena.

La expresión génica, como alternativa, puede medirse mediante métodos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de secciones tisulares o celulares y el ensayo de cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el análisis de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido DNA19355 de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en este documento o contra secuencia exógena fusionada a ADN de DNA19355 y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.

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5. Purificación de Polipéptido

Pueden recuperarse formas de DNA19355 a partir de medio de cultivo o de lisados de célula huésped. Si esta unido a la membrana, puede liberarse de la membrana usando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células utilizadas en la expresión de DNA19355 pueden romperse mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, destrucción mecánica o agentes de lisis celular.

Puede desearse purificar DNA19355 a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tales como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G- 75; columnas de proteína A Sepharose para eliminar contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metales para unirse a formas del DNA19355 marcadas con epítopo. Pueden utilizarse diversos métodos de purificación de proteínas y dichos métodos se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-verlag, New York (1982). La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y del DNA19355 particular producido.

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D. Usos para DNA19355

Las secuencias de nucleótidos (o su complemento) que codifican DNA19355 tienen diversas aplicaciones en la técnica de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en el mapeo de cromosomas y genes y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico de DNA19355 también será útil para la preparación de polipéptidos DNA19355 mediante las técnicas recombinantes descritas en este documento.

El gen de DNA19355 de secuencia nativa de longitud completa (Fig. 1; SEC ID Nº: 2), o partes del mismo, puede usarse como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar, por ejemplo, otros genes (como los que codifican variantes de origen natural de DNA19355 o DNA19355 de otras especies) que tienen una identidad en la secuencia deseada con la secuencia de DNA19355 descrita en la Fig. 1 (SEC ID Nº: 2). Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación pueden obtenerse de la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 2 o de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos potenciadores e intrones de DNA19355 de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un método de cribado comprenderá aislar la región codificante del gen de DNA19355 usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse mediante diversos marcadores, incluyendo radionucleótidos tales como ^{12}P o ^{25}S, o marcadores enzimáticos tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante sistemas de acoplamiento de avidina/biotina. Pueden usarse sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen de DNA19355 de la presente invención para cribar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar con qué miembros de dichas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con más detalle en los Ejemplos a continuación.

Las secuencias de nucleótidos que codifican un DNA19355 también pueden usarse para construir sondas de hibridación para mapear el gen que codifica ese DNA19355 y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en este documento pueden mapearse en un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma usando técnicas conocidas, tales como hibridación in situ, análisis de formación de enlaces contra marcadores cromosómicos conocidos, y cribado de hibridación con bibliotecas.

Los análisis de cribado pueden diseñarse para encontrar compuestos activos que mimetizan la actividad biológica de un DNA19355 de secuencia nativa o un ligando o receptor para DNA19355. Dichos ensayo de cribado incluirán ensayos susceptibles para un cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, lo que les hace particularmente adecuados para identificar fármacos candidatos de moléculas pequeñas. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos sintéticos orgánicos e inorgánicos. Los ensayos pueden realizarse en diversos formatos, incluyendo análisis de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican DNA19355 o sus formas modificadas también pueden usarse para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual se introdujo en el animal o un antepasado del animal en una fase prenatal, por ejemplo, embrionaria. Un transgén es un ADN que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica DNA19355 puede usarse para clonar ADN genómico que codifica DNA19355 de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas usadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica DNA19355. Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº. 4.736.866 y 4.870.009. Habitualmente, se fijarían como objetivo células particulares para la incorporación de transgenes de DNA19355 con potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica DNA19355 introducido en la línea germinal del animal en una fase embrionaria pueden usarse para examinar el efecto de la expresión aumentada de ADN que codifica DNA19355. Dichos animales pueden usarse como animales de prueba para reactivos que se piensa que otorgan protección contra, por ejemplo, afecciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. Un animal puede tratarse con el reactivo y una incidencia reducida de la afección patológica, en comparación con animales no tratados portadores del transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica para la afección
patológica.

Como alternativa, pueden usarse homólogos no humanos de DNA19355 para construir un animal "knock out" de DNA19355 que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica DNA19355 como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica DNA19355 y el ADN genómico alterado que codifica DNA19355 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, puede usarse ADNc que codifica DNA19355 para clonar ADN genómico que codifica DNA19355 de acuerdo con técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica DNA19355 puede eliminarse o sustituirse por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede usarse para controlar la integración. Habitualmente, varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (en los extremos 5' y 3') se incluyen en el vector [véase por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se recombinó de forma homóloga con el ADN endógeno [véase por ejemplo, Li y col., Cell, 69: 915 (1992)]. A continuación, las células seleccionadas se inyectan en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [véase por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. A continuación, puede implantarse un embrión quimérico en una hembra de acogida pseudopreñada del animal y el embrión se desarrolla para crear un animal "knock out". La progenie que aloja al ADN recombinado de forma homóloga en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas convencionales y puede usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de forma homóloga. Los animales Knockout pueden caracterizarse por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas afecciones patológicas y por su desarrollo de afecciones patológicas debidas a la ausencia del polipéptido DNA19355.

Los polipéptidos DNA19355 también pueden emplearse en ensayos de diagnóstico para, por ejemplo, detectar la presencia del receptor "GITR" en tejidos de mamífero. Dichos ensayos pueden realizarse usando técnicas conocidas en el sector o, por ejemplo, usando los ensayos de unión descritos en este documento.

Los polipéptidos DNA19355 pueden emplearse adicionalmente como inmunógenos para generar anticuerpos contra DNA19355. Las técnicas y métodos para generar anticuerpos se describen a continuación.

Los polipéptidos DNA19355 también pueden emplearse terapéuticamente. Por ejemplo, los polipéptidos
DNA19355 pueden emplearse para inducir apoptosis en células cancerosas de mamífero. Generalmente, los métodos para inducir apoptosis en células cancerosas de mamífero comprenden exponer a las células a una cantidad eficaz (o inductora de apoptosis) del polipéptido DNA19355. La aplicación terapéutica del polipéptido DNA19355 para el tratamiento de cáncer se describe con detalle a continuación.

En los métodos para tratar el cáncer, se administra polipéptido DNA19355 a un mamífero al que se le diagnosticó un cáncer. Por supuesto, se contempla que el polipéptido DNA19355 puede emplearse en combinación con otras composiciones y técnicas terapéuticas, incluyendo otros agentes inductores de apoptosis, quimioterapia, radioterapia y cirugía.

El polipéptido DNA19355 se administra en un portador aceptable, y preferentemente, un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo y col. Habitualmente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para hacer a la formulación isotónica. Los ejemplos de portadores aceptables incluyen solución salina, solución de Ringer, y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y más preferentemente, de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,8. Será evidente para los expertos en la materia que ciertos portadores pueden ser más preferibles dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración y la concentración del polipéptido DNA19355 administrado.

El polipéptido DNA19355 puede administrarse a un mamífero mediante inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular), o mediante otros métodos tales como infusión que aseguran su administración al torrente sanguíneo en una forma eficaz. También se contempla que el polipéptido DNA19355 puede administrarse mediante terapia génica in vivo o ex vivo.

Las dosificaciones y programas eficaces para administrar polipéptido DNA19355 pueden determinarse empíricamente y la realización de dichas determinaciones está dentro del alcance de la técnica. Actualmente se cree que una dosificación o cantidad eficaz de polipéptido DNA19355 puede variar entre aproximadamente 1 microgramo/kg y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o más al día. El escalado entre especies de las dosificaciones puede realizarse de manera conocida en la técnica, por ejemplo, como se describe en Mordenti y col., Pharmaceut. Res., 8: 1351 (1991). Los expertos en la materia entenderán que la dosificación de polipéptido DNA19355 que debe administrarse variará dependiendo de, por ejemplo, el mamífero que recibirá el polipéptido DNA19355, la vía de administración, y otros fármacos o terapias que se estén administrando al mamífero.

La terapia o terapias adicionales administradas al mamífero pueden incluir aunque sin limitación, quimioterapia y/o radioterapia, inmunoadyuvantes, citoquinas y terapias basadas en anticuerpos. Los ejemplos incluyen interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6), factor inhibidor de leucemia, interferones, eritropoyetina, anticuerpo anti-VEGF, y anticuerpo Her-2. También pueden emplearse otros agentes que se sabe que inducen apoptosis en células de mamífero, y dichos agentes incluyen TNF-alfa, TNF-beta, ligando CD30, ligando 4-1BB y ligando Apo-1.

Las quimioterapias incluyen sustancias químicas o fármacos que se conocen en la técnica y están disponibles en el mercado, tales como Doxorrubicina, 5-Fluorouracilo, etopósido, camptotecina, leucovorina, Citosina arabinósido (Ara-C), Ciclofosfamida, Tiotepa, Busulfan, Citoxina, Taxol, metotrexato, Cisplatino, Melfalina, Vinblastina y Carboplatino. Los programas de preparación y dosificación para dicha quimioterapia pueden usarse según las instrucciones del fabricante o según determine empíricamente el experto en la materia. Los programas de preparación y dosificación para dicha quimioterapia se describen también en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

La quimioterapia se administra en un portador aceptable, preferentemente un portador farmacéuticamente aceptable, tal como los descritos anteriormente. El modo de administración de la quimioterapia puede ser el mismo que el empleado para el polipéptido DNA19355 o puede administrarse al mamífero mediante un modo diferente. Por ejemplo, el polipéptido DNA19355 puede inyectarse mientras que la quimioterapia se administra por vía oral al mamífero.

La radioterapia puede administrarse al mamífero según protocolos empleados habitualmente en la técnica y conocidos por el experto en la materia. Dicha terapia puede incluir radiación de cesio, iridio, yodo o cobalto. La radiación puede ser irradiación de todo el cuerpo o puede dirigirse localmente a un punto o tejido específico en o sobre el cuerpo. Habitualmente, la radioterapia se administra en pulsos durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas. Opcionalmente, la radioterapia puede administrarse como una única dosis o como múltiples dosis secuenciales.

El polipéptido DNA19355 y una o más terapias diferentes pueden administrarse al mamífero de forma concurrente o secuencial. Después de la administración de polipéptido DNA19355 y una o más terapias diferentes al mamífero, la afección fisiológica del mamífero puede controlarse de diversas maneras bien conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, puede observarse la masa tumoral físicamente, mediante biopsia, o mediante técnicas convencionales de formación de imágenes por rayos X.

Los modos y métodos para administrar polipéptido DNA19355 descritos anteriormente también pueden ser usados por el experto en la materia para tratar afecciones en las que se desea la estimulación o inducción de una respuesta proinflamatoria.

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E. Anticuerpos Anti-DNA19355

La presente invención describe además en este documento anticuerpos anti-DNA19355. Los anticuerpos de ejemplo incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

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1. Anticuerpos Policlonales

Los anticuerpos para DNA19355 pueden comprender anticuerpos policlonales. Los métodos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos por el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden generarse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectará en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido DNA19355 o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas incluyen, aunque sin limitación, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. Los ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia sin una gran experimentación.

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2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos para DNA19355 pueden ser, como alternativa, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal huésped adecuado, se inmuniza habitualmente con un agente inmunizante para generar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizante incluirá habitualmente el polipéptido DNA19355 o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o se usan células esplénicas o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamífero no humano. A continuación, se fusionan los linfocitos con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son normalmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Normalmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas habitualmente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en
HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, refuerzan un nivel de expresión alto y estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma de ratón, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas celulares de mieloma humanas y de heteromieloma de ratón-humanas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antobody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].

A continuación, del medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma puede analizarse la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra DNA19355. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220
(1980).

Después de que las células de hibridoma deseadas se hayan identificado, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos convencionales [Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, Medio Eagle Modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Como alternativa, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o fluido ascítico mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº. 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de ratón). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que a continuación se transfectan a células huésped, tales como células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), o células de mieloma que de otro modo no producen la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias homólogas múridas [Patente de Estados Unidos Nº. 4.816.567; Morrison y col., supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido que no es inmunoglobulina. Dicho polipéptido que no es inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un punto de combinación a antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, un método implica la expresión recombinante de cadena ligera y cadena pesada modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada está truncada generalmente en cualquier punto en la región Fc para impedir el entrecruzamiento de la cadena pesada. Como alternativa, los restos de cisteína pertinentes se sustituyen por otro resto de aminoácido o se eliminan para evitar el entrecruzamiento.

Los métodos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, puede conseguirse usando técnicas rutinarias conocidas en el sector.

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3. Anticuerpos Humanizados

Los anticuerpos para DNA19355 pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, múridos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima obtenida de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que restos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, restos del armazón ("framework") Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los restos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o armazón importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá de forma óptima al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen bien en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en éste a partir de una fuente que es no humana. Estos restos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan restos "importados", que se toman habitualmente de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239: 1534-1536 (1988)], sustituyendo CDR o secuencias de CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos Nº. 4.816.567), donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR están sustituidos por restos de puntos análogos en anticuerpos de roedores.

Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en el sector, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cole y col. y Boerner y col. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991)].

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4. Anticuerpos Biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es por el DNA19355, la otra es por cualquier otro antígeno, y preferentemente por una proteína o receptor o subunidad de receptor de la superficie celular.

Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales solamente una tiene la correcta estructura biespecífica. La purificación de la molécula correcta se consigue normalmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y col., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (puntos de combinación de anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CHl) que contiene el punto necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión diferentes y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121: 210
(1986).

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5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para reconocer células del sistema inmune a células no deseadas [Patente de Estados Unidos Nº. 4.676.980], y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo los que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de enlaces disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº. 4.676.980.

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F. Usos para anticuerpos para DNA19355

Los anticuerpos para DNA19355 tienen diversas utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos para DNA19355 pueden usarse en ensayos de diagnóstico para DNA19355, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos o suero específicos. Pueden usarse diversas técnicas de ensayos de diagnóstico conocidas en la técnica, tales como ensayos de unión competitiva,ensayos de tipo sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos usados en los ensayos de diagnóstico pueden marcarse con un grupo detectable. El grupo detectable debe ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo al grupo detectable, incluyendo aquellos métodos descritos por Hunter y col., Nature, 144: 945 (1962); David y col., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem and Cytochem., 30: 407 (1982).

Los anticuerpos para DNA19355 también son útiles para la purificación por afinidad de DNA19355 a partir de cultivo celular recombinante o fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra DNA19355 se inmovilizan en un soporte adecuado, tal como resina Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. A continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el DNA19355 a purificar, y a continuación el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el DNA19355, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará al DNA19355 del anticuerpo.

Los siguientes ejemplos se ofrecen solamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar en modo alguno el alcance de la presente invención.

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Ejemplos

Los reactivos disponibles en el mercado mencionados en los ejemplos se usaron según las instrucciones del fabricante a menos que se indique otra cosa. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y en toda la memoria descriptiva, mediante números de entrada de ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.

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Ejemplo 1

Aislamiento de DNA19355 Humano

Se emplearon los métodos descritos en Klein y col., PNAS, 93: 7108-7113 (1996) con las siguientes modificaciones. La transformación de levadura se realizó con cantidades limitantes de ADN transformante para reducir el número de células de levadura transformadas múltiples. En lugar del aislamiento de plásmido a partir de la levadura seguido de la transformación de E. coli como se describe en Klein y col., anteriormente, se realizó análisis de PCR en colonias individuales de levadura. Esto se consiguió resembrando en estrías la colonia sacarosa positiva original en medio de sacarosa recién preparado para purificar el clon positivo. Después se usó una colonia individual purificada para PCR usando los siguientes cebadores: TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTCTCAGAGAAACAAGCAAAAC (SEC ID Nº: 7) y CAGGAAACAGCTATGACCGAAGTGGACCAAAGGTCTATCGCTA (SEC ID Nº: 8). Los cebadores de PCR son bipartitos para amplificar el inserto y una pequeña parte del gen de invertasa (permitiendo determinar que el inserto estaba en marco con la invertasa) y añadir puntos de cebador de secuenciación universales.

Una biblioteca de fragmentos de ADNc obtenida de células HUVEC humanas fusionadas a invertasa se transformó en levadura y se seleccionaron transformantes en medios SC-URA. Los URA y los transformantes se colocaron en placas de replicación en medio de sacarosa para identificar clones que secretaban invertasa. Los clones positivos se volvieron a poner a prueba y los productos de PCR se secuenciaron. Se determinó que la secuencia de un clon, DNA1840, contenía una secuencia codificante de péptido señal. Se diseñaron cebadores y sondas de oligonucleótidos usando la secuencia de nucleótidos de DNA1840. Se valoró una biblioteca de plásmidos de longitud completa de ADNc de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y aproximadamente 100.000 cfu se colocaron en placas en 192 grupos de 500 cfu/grupo en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Los grupos se cultivaron durante una noche a 37ºC con agitación (200 rpm). Se realizó una PCR en los cultivos individuales usando cebadores específicos para DNA1840. Se realizó electroforesis en gel de agarosa y las células positivas se identificaron mediante visualización de una banda del tamaño esperado. Los clones positivos individuales se obtuvieron mediante transferencia de colonias seguida de hibridación con oligonucleótido marcado con ^{32}P. Estos clones se caracterizaron mediante análisis de PCR, digestión con enzimas de restricción y transferencia de Southern.

Un clon de ADNc se secuenció en su totalidad. Una secuencia de nucleótidos de DNA19355 se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 2). El clon DNA19355-1150 contiene un único marco abierto de lectura con un punto de inicio de la transcripción evidente en las posiciones de nucleótidos 21-23 [Kozak y col., anteriormente] (Fig. 1; SEC ID Nº: 2). El precursor del polipéptido predicho tiene 177 aminoácidos de longitud y tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 20.308 daltons. El análisis de hidropatía sugiere una tipología de proteína transmembrana de tipo II, con una supuesta región citoplasmática (aminoácidos 1-25); región transmembrana (aminoácidos 26-51); y región extracelular (aminoácidos 52-177). Se han identificado dos potenciales puntos de glucosilación enlazados en el extremo N en la posición 129 (Asn) y posición 161 (Asn) de la secuencia mostrada en la Fig. 1 (SEC ID Nº: 1). El clon DNA19355-1150 se depositó en la ATCC y se le asignó el Nº de depósito ATCC 209466. El polipéptido DNA19355 se obtiene o puede obtenerse expresando la molécula codificada por el inserto de ADNc del vector depositado ATCC 209466. La digestión del vector con las enzimas de restricción XbaI y NotI producirá un fragmento de 1411 pb y un fragmento de 668 pb.

Partiendo de un análisis de alineamiento de secuencia de BLAST y FastA (usando el programa informático ALIGN) de secuencia extracelular, DNA19355 muestra identidad de secuencia de aminoácidos con varios miembros de la familia de citoquinas de TNF, y particularmente, con Apo-2L humano (19,8%), Fas/ligando Apol (19,0%), TNF-alfa (20,6%) y Linfotoxina-\alpha (17,5%) (véase la Figura 2). La mayoría de la identidad de secuencia de aminoácidos se encuentra en las regiones correspondientes a las hebras beta en la estructura cristalina de TNF-alfa [Banner y col., Cell, 73: 431-435 (1993); Eck y col., J. Biol. Chem., 264: 17595-605 (1989); Lewit-Bentley y col., J. Mol. Biol., 199: 389-92 (1988)]. La secuencia de la hebra C está especialmente conservada en todos los miembros de la familia (véase la Figura 2). La secuencia entre el supuesto dominio transmembrana y la primera hebra beta del polipéptido DNA19335 es relativamente corta, incluyendo 5 restos, en comparación con de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 restos en TNFalfa, CD95L o ligando Apo-2.

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Ejemplo 2

Análisis de Transferencia de Northern

La expresión del ARNm de DNA19355 en tejidos humanos y líneas celulares tumorales se examinó mediante análisis de transferencia de Northern (véase la Figura 3). Se hibridaron transferencias de ARN humano con una sonda de ADN de aproximadamente 700 pb de longitud marcada con ^{32}P generada mediante digestión del plásmido pRK5 que codifica ADNc de DNA19355 de longitud completa con Xba-I; Esta sonda corresponde a toda la secuencia codificante más algunas secuencias flanqueantes 5' y 3'.

Transferencias de ARNm humano fetal, adulto o de línea celular cancerosa (Clontech) se incubaron con la sonda de ADN en tampón de hibridación (5X SSPE; 2X solución de Denhardt; 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado; formamida al 50%; SDS al 2%) durante 60 horas a 42ºC. Las transferencias se lavaron varias veces en 2X SSC; SDS al 0,05% durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de un lavado de 30 minutos en 0,1X SSC; SDS al 0,1% a 50ºC. Las transferencias se revelaron después de exposición durante una noche mediante análisis automatizado de imágenes "Phosphorimager" (Fuji).

Como se muestra en la Figura 3, un transcrito de ARNm predominante de aproximadamente 3,2 kB se detectó en riñón y pulmón fetal y en el intestino delgado de adulto. La expresión también se detectó en 6 de 8 líneas celulares tumorales humanas puestas a prueba, que mostraron aproximadamente el mismo transcrito de 3,2 kB, así como una expresión más débil de transcritos de aproximadamente 1,5 y aproximadamente 5 kB.

Los resultados indican que la expresión de ARNm del polipéptido DNA19355 está relativamente restringida en los tejidos normales, pero es marcadamente elevada en líneas celulares tumorales de origen linfoide así como no
linfoide.

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Ejemplo 3

Expresión de DNA19355 en E. coli

La secuencia de ADN (de la Fig. 1; SEC ID Nº: 2) que codifica una región extracelular del polipéptido DNA19355 (aminoácidos 52 a 177 de la Fig. 1; SEC ID Nº: 1) se amplificó con cebadores de PCR que contienen puntos de restricción NdeI y XbaI flanqueantes, respectivamente: directo: 5'-GAC GAC AAG CAT ATG TTA GAG ACT GCT AAG GAG CCC TG- 3' (SEC ID Nº: 3); inverso: 5'-TAG CAG CCG GAT CCT AGG AGA TGA ATT GGG GATT-3' (SEC ID Nº: 4). La PCR se digirió y clonó en los puntos de NdeI y XbaI del plásmido pET19B (Novagen) cadena abajo y en marco con una secuencia Met Gly His10 seguida de un punto de escisión de enteroquinasa de 12 aminoácidos (obtenido del plásmido): Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met (SEC ID Nº: 5).

El plásmido resultante se usó para transformar la cepa de E. coli JM109 (ATCC 53323) usando los métodos descritos en Sambrook y col., anteriormente. Los transformantes se identificaron mediante PCR. El ADN del plásmido se aisló y se confirmó mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.

Los clones seleccionados se cultivaron durante una noche en medio de cultivo líquido LB suplementado con antibióticos. El cultivo durante una noche se usó posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. Las células se cultivaron a una densidad óptica deseada, durante lo cual se activa el promotor de expresión.

Después de cultivar las células durante varias horas más, las células se recogieron mediante centrifugado. El sedimento celular obtenido mediante el centrifugado se disolvió usando un microfluidizador en un tampón que contenía Tris 0,1 M, NaCl 0,2 M, EDTA 50 mM, pH 8,0. La proteína de DNA19355 disuelta se purificó usando cromatografía de afinidad de Níquel-sepharose.

La proteína DNA19355 se analizó mediante SDS-PAGE seguida de Transferencia de Western con peroxidasa de rábano rusticano conjugada con níquel seguida de detección por ECL (Boehringer Mannheim). Se detectaron tres bandas de proteína predominantes, que corresponden en tamaño a formas monoméricas, homodiméricas y homotriméricas de la proteína (Figura 4). Se cree, en base a este resultado, que en su forma nativa, en ausencia de desnaturalización por SDS, la proteína DNA19355 soluble es capaz de formar homotrímeros.

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Ejemplo 4

Actividad Apoptótica de DNA19355

El plásmido pRK5 que codifica la proteína DNA19355 de longitud completa, o el plásmido pRK5 vacío, o pRK5 que codifica el ligando Apo-2 humano de longitud completa (Apo-2L) se transfectó transitoriamente en células 293 humanas (10^{6} células/placa de 10 cm) mediante precipitación con fosfato cálcico. En algunos casos, las células se co-transfectaron con un plásmido pRK5 que codifica el inhibidor de caspasa obtenido de poxvirus CrmA, o una forma mutante negativa dominante de proteína adaptadora con dominio de muerte FADD (FADD-DN), que media en la señalización de la muerte mediante Fas/Apo1 y TNFR1. Dieciséis horas después, las células se tiñeron con colorante Hoechst 33342 (10 \mug/ml), y se contaron los núcleos apoptóticos o normales en un microscopio de fluorescencia Leica equipado con lentes Hoffmann. En algunos casos, el inhibidor de caspasa z-VAD-fmk (Research Biochemicals) (200 \muM) se añadió a las placas inmediatamente después de la transfección.

Como se muestra en la Fig. 5, la transfección mediante DNA19355 dio como resultado un aumento sustancial del nivel de apoptosis en comparación con pRK5, similar al aumento observado con Apo-2L, un inductor de apoptosis bien establecido. El aumento de apoptosis inducido por DNA19355 se bloqueaba mediante CrmA o mediante z-VAD-fmk, lo que indicaba la implicación de caspasas en este efecto. Además, el aumento de apoptosis inducido por DNA19355, pero no por Apo-2L, se bloqueó mediante FADD-DN, lo que indicaba que la proteína adaptadora FADD juega un papel esencial en la transmisión de la señal de muerte de DNA19355 a la maquinaria de la caspasa.

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Ejemplo 5

Activación de NF-\kappaB mediante DNA19355

El plásmido pRK5 que codifica la proteína DNA19355 de longitud completa, o el plásmido pRK5 vacío, o pRK5 que codifica Apo-2L humano de longitud completa se transfectó transitoriamente en células 293 humanas (10^{6} células/placa de 10 cm) mediante precipitación con fosfato cálcico. Las células se co-transfectaron con plásmido pRK5 vacío, o plásmido pRK5 que codifica una forma mutante negativa dominante, deficiente en quinasa de la serina/treonina quinasa NIK (NIK-DN), que media la activación de NF-\kappaB mediante TNF [Malinin y col., Nature, 385: 540-544 (1997)]. Dieciséis horas después, las células se recogieron, se prepararon extractos celulares, y 1 \mug de proteína nuclear se hizo reaccionar con una sonda de oligonucleótidos sintética específica de NF-\kappaB marcada con 32P ATCAG-GGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCG (SEC ID Nº: 6) [véase, también, MacKay y col., J. Immunol., 153: 5274-5284 (1994)].

Como se muestra en la Fig. 6, la transfección mediante DNA19355 inducía la activación significativa de NF-\kappaB, según lo medido con un análisis de desplazamiento de movilidad electroforética [Marsters y col. PNAS, 92: 5401-5405 (1995)]; el nivel de activación era mayor que el nivel obtenido con Apo-2L. La co-transfección con NIK-DN reducía sustancialmente la activación de NF-\kappaB mediante DNA19355, pero no la activación mediante Apo-2L. Este resultado sugiere que, al igual que TNF-alfa, DNA19355 activa NF-\kappaB a través de una ruta de señalización que implica la proteína NIK.

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Ejemplo 6

Expresión de DNA19355 en células de mamífero

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma de DNA19355 mediante expresión recombinante en células de mamífero.

El vector, pRK5 (véase el documento EP 307.247, publicado el 15 de marzo de 1989), se emplea como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de DNA19355 se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de DNA19355 usando métodos de ligamiento tal como se describe en Sambrook y col., anteriormente. El vector resultante se denomina pRK5-DNA19355.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se cultivan hasta confluencia en placas de cultivo tisular en medio tal como DMEM suplementado con suero fetal de ternero y opcionalmente, componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 \mug de pRK5-ADN de DNA19355 se mezclan con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen de ARN asociado a virus [Thimmappaya y col., Cell, 31: 543 (1982)] y se disuelven en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se le añaden, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM, y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se retira mediante aspiración y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se lavan después con medio libre de suero, se añade medio recién preparado y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se retira y se sustituye por medio de cultivo (en solitario) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de 35S-cisteína y 200 \muCi/ml de 35S-metionina. Después de una incubación de 12 horas, se recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro de centrifugado, y se carga en un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a una película fotográfica durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia de polipéptido DNA19355. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden sufrir una incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio de pone a prueba en bioanálisis seleccionados.

En una técnica alternativa, DNA19355 puede introducirse en células 293 transitoriamente usando el método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Las células 293 se cultivan hasta densidad máxima en un matraz de agitación y se añaden 700 \mug de pRK5-ADN de DNA19355. Las células se concentran en primer lugar a partir del matraz de agitación mediante centrifugado y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el sedimento celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo tisular, y se reintroducen en el matraz de agitación que contiene medio de cultivo tisular, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para retirar células y restos. La muestra que contiene DNA19355 expresado puede concentrarse y purificarse después mediante cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna.

En otra realización, DNA19355 pueden expresarse en células CHO. El pRK5-DNA19355 puede transfectarse en células CHO usando reactivos conocidos tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio puede sustituirse por medio de cultivo (en solitario) o medio que contiene un radiomarcador tal como ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia de polipéptido DNA19355, el medio de cultivo puede sustituirse por medio libre de suero. Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y después el medio acondicionado se recoge. El medio que contiene el DNA19355 expresado puede concentrarse y purificarse después mediante cualquier método seleccionado.

El DNA19355 marcado con epítopo también puede expresarse en células CHO huésped. El DNA19355 puede subclonarse a partir del vector pRK5. El inserto de subclon puede someterse a PCR para fusionarse en marco con una marca epitópica seleccionada tal como una marca poli-his en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de DNA19355 marcado con poli-his puede subclonarse después en un vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (como se ha descrito anteriormente) con el vector dirigido por SV40. El marcado puede realizarse, como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el DNA19355 expresado marcado con poli-His puede concentrarse y purificarse después mediante cualquier método seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2-}-quelato.

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Ejemplo 7

Expresión de DNA19355 en Levadura

El siguiente método describe expresión recombinante de DNA19355 en levadura.

En primer lugar, se construyen vectores de expresión de levadura para la producción intracelular o secreción de DNA19355 a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica DNA19355, un péptido señal seleccionado y el promotor se inserta en puntos de enzima de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de DNA19355. Para la secreción, el ADN que codifica DNA19355 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia líder/señal de secreción de factor alfa de levadura, y secuencias enlazadoras (si fueran necesarias) para la expresión de DNA19355.

Las células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, pueden transformarse después con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medios de fermentación. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguida de tinción de los geles con tinte Azul de Coomassie.

Posteriormente el DNA19355 recombinante puede aislarse y purificarse retirando las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugado y después concentrando el medio usando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene DNA19355 puede purificarse adicionalmente usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.

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Ejemplo 8

Expresión de DNA19355 en Células de Insecto infectadas por Baculovirus

El siguiente método describe la expresión recombinante de DNA19355 en células de insecto.

El DNA19355 se fusiona cadena arriba de una marca epitópica contenida en un vector de expresión de baculovirus. Dichas marcas epitópicas incluyen marcas poli-his y marcas de inmunoglobulina (como regiones Fc de IgG). Pueden emplearse diversos plásmidos, incluyendo plásmidos obtenidos de plásmidos disponibles en el mercado tales como pVL1393 (Novagen). En resumen, el DNA19355 o la parte deseada del DNA19355 (tal como una secuencia que codifica un dominio extracelular) se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar puntos flanqueantes de enzimas de restricción (seleccionadas). El producto se digiere después con esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expre-
sión.

El baculovirus recombinante se genera co-transfectando el plásmido anterior y ADN de virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (disponible en el mercado de GIBCO-BRL). Después de 4 - 5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se usan para amplificaciones adicionales. La infección vírica y la expresión de proteínas se realizan según lo descrito por O'Reilley y col., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

El DNA19355 expresado marcado con poli-his puede purificarse después, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2'}-quelato de la siguiente manera. Se preparan extractos a partir de células Sf9 infectadas por virus según lo descrito por Rupert y col., Nature, 362: 175-179 (1993). En resumen, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; Glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; kCl 0,4 M), y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se purifican mediante centrifugado, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, Glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtran a través de un filtro de 0,45 \mum. Una columna de Ni^{2+}-NTA agarosa (disponible en el mercado de Qiagen) se prepara con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava al valor de referencia A280 con tampón de carga, punto en el cual se inicia la recogida de fracciones. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, Glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye la proteína unida de forma no específica. Después de alcanzar el valor de referencia A280 de nuevo, la columna se revela con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia de Western con Ni^{2-}NTA conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el DNA19355 eluido marcado con His10 se reúnen y dializan contra tampón de
carga.

Como alternativa, la purificación del DNA19355 marcado con IgG (o marcado con Fc) puede realizarse usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo, cromatografía en columna de Proteína A o proteína G.

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Ejemplo 9

Preparación de Anticuerpos que se Unen a DNA19355

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a DNA19355.

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, anteriormente. Los Inmunógenos que pueden emplearse incluyen DNA19355 purificado, proteínas de fusión que contienen DNA19355 y células que expresan DNA19355 recombinante en la superficie celular. La selección del inmunógeno puede realizarla el experto en la materia sin experimentación indebida.

Ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno de DNA19355 emulsionado en adyuvante completo de Freund e inyectado por vía subcutánea o por vía intraperitoneal en una cantidad de 1-100 microgramos. Como alternativa, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las almohadillas de la pata trasera del animal. Los ratones inmunizados reciben refuerzos 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante varias semanas, los ratones también pueden recibir refuerzos con inyecciones de inmunización adicionales. Pueden obtenerse periódicamente muestras de suero de los ratones mediante extracción de sangre por vía retro-orbital para ponerlas a prueba en análisis ELISA para detectar anticuerpos para DNA19355.

Después de haber detectado un valor cuantitativo de anticuerpos adecuado, a los animales "positivos" para los anticuerpos se les inyecta una inyección intravenosa final de DNA19355. De tres a cuatro días después, los ratones se sacrifican y se recogen las células esplénicas. Las células esplénicas se fusionan después (usando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma de ratón seleccionada tal como P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que después pueden colocarse en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células esplénicas.

Las células de hibridoma se someterán a detección sistemática en un ELISA para detectar la reactividad contra DNA19355. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales contra DNA19355 deseados está dentro del alcance de la técnica.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse por vía intraperitoneal en ratones Balb/c singénicos para producir ascitis que contiene los anticuerpos monoclonales anti-DNA19355. Como alternativa, las células de hibridoma pueden cultivarse en matraces de cultivo tisular o frascos rotatorios. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en la ascitis puede conseguirse usando precipitación con sulfato de amonio, seguida de cromatografía de exclusión en gel. Como alternativa, puede emplearse cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a la proteína A o proteína G.

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Ejemplo 10

Usos de DNA19355 como sonda de hibridación

El siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica DNA19355 como sonda de hibridación.

El ADN que comprende la secuencia codificante de DNA19355 (como se muestra en la Figura 1, SEC ID Nº: 2) se emplea como sonda para detectar de forma sistemática ADN homólogos (tales como los que codifican variantes de origen natural de DNA19355) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido
humano.

La hibridación y lavado de filtros que contienen ADN de cualquiera de las bibliotecas se realiza en las siguientes condiciones de rigurosidad alta. La hibridación de una sonda obtenida de DNA19355 radio marcado con los filtros se realiza en una solución de formamida al 50%, 5x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato sódico al 0,1%, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, 2x solución de Denhardt y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.

Después pueden identificarse ADN que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica DNA19355 de secuencia nativa de longitud completa usando técnicas convencionales conocidas en la técnica.

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Ejemplo 11

Cartografía Cromosómica

La localización cromosómica del gen de DNA19355 humano se examinó mediante análisis de un panel de híbridos de radiación (RH). La cartografía con RH se realizó mediante PCR usando un panel de híbridos de radiación de células de ratón-humanas (Research Genetics) y cebadores basados en la región codificante del ADNc de DNA19355 [Gelb y col., Hum. Genet., 98: 141 (1996)]. El análisis de los datos de PCR usando la base de datos Stanford Human Genome Center Database indicaba que el DNA19355 está enlazado con el marcador D1S2790 de STS y con el marcador AFMb352xe9 de Genethon, y cartografía el cromosoma humano 1q23. Particularmente, CD95L también cartografía el cromosoma 1q23 [Takahashi y col., Int. Immunol., 6: 1567-1574 (1994), mientras que el ligando OX40 cartografía el cromosoma 1q25 [Baum y col., EMBO J., 13: 3992-4001 (1994)]. Por consiguiente, estos miembros de la familia de TNF pueden haberse generado mediante duplicación y divergencia de un gen ancestral
común.

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Ejemplo 12

Especificidad de Unión del Polipéptido DNA19355 por el Receptor GITR Humano

Se realizaron análisis para determinar si el polipéptido DNA19355 interactúa con y se une específicamente a un homólogo humano de la molécula receptora denominada "GITR". Un polipéptido GITR de ratón (mGITR) se describió en Nocentini y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 6216-6221 (1997). Se han descrito lo que se cree que son homólogos humanos del mGITR. Una secuencia de aminoácidos para un GITR humano de longitud completa (hGITR) se muestra en la SEC ID Nº: 4 en el documento PCT WO 98/06842, publicado el 19 de febrero de 1998. Una comparación de las secuencias de aminoácidos de hGITR y mGITR se muestra en la Figura 7.

Para poner a prueba la unión, una proteína de fusión a inmunoglobulina soluble (inmunoadhesina) que incluía el hGITR extracelular (véase aminoácidos 1-167 de la Figura 7) se expresó en células de insecto. El hGITR ECD se expresó como una forma C terminal marcada con IgG-Fc en células de insecto usando Baculovirus (como se ha descrito en el Ejemplo 8 anteriormente).

Un polipéptido DNA19355 soluble también se preparó expresando el ECD en células de E. coli (como se describe en Ejemplo 3 anteriormente). La molécula de DNA19355 ECD soluble se marcó después con ^{125}I. Para comparación, también se prepararon construcciones de inmunoadhesina de los siguientes miembros de la familia del receptor de TNF: CD95, DR4, DR5, TNFR1, TNFR2, y Apo-3. Las inmunoadhesinas CD95, DR4, DR5, TNFR1, TNFR2, y Apo-3 se prepararon fusionando el ECD de cada receptor a la parte bisagra y Fc de IgG humana, como se ha descrito anteriormente para TNFR1 [Ashkenazi y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10535-10539 (1991)]. Los respectivos miembros de la familia del receptor de TNF se describen (y se mencionan referencias pertinentes) en la sección de Antecedentes de la Invención.

Para el análisis de co-precipitación, cada inmunoadhesina (5 microgramos) se incubó con polipéptido DNA19355 soluble marcado con ^{125}I (1 microgramo) durante 1 hora a 24ºC, seguido de proteína A-sepharose durante 30 minutos en hielo. Las mezclas de reacción se centrifugaron y se lavaron varias veces en PBS, se llevaron a ebullición en tampón de SDS-PAGE que contenía ditiotreitol 20 mM y después se resolvieron mediante SDS-PAGE y autorradiogra-
fía.

Los resultados se muestran en la Figura 8. La posición de los marcadores de peso molecular (kDa) se indica en la figura. El hGITR-IgG unido al polipéptido DNA19355 soluble radioyodado. Sin embargo, el hGITR-IgG no se unía a las construcciones de inmunoadhesina de CD95, DR4, DR5, TNFR1, TNFR2 o Apo-3.

En otro análisis, células 293 humanas se transfectaron transitoriamente con DNA19355 y la capacidad de las construcciones de inmunoadhesina receptora para hGITR, TNFR1, HVEM, y DcR1, para unirse a las células transfectadas se determinó mediante análisis FACS. Las células 293 se mantuvieron en medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, glutamina 2 mM, 100 microgramos/ml de penicilina, y 100 microgramos/ml de estreptomicina. Las células transfectadas (1 x 10^{5}) se incubaron durante 60 minutos a 4ºC en 200 microlitros de FBS/PBS al 2% con 1 microgramo de la respectiva inmunoadhesina receptora o ligando. Las células se lavaron después con FBS/PBS al 2%, se tiñeron con anticuerpo de cabra anti-humano conjugado con R-ficoeritrina (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). A continuación, las células se analizaron mediante FACS. Para poner a prueba la unión de las respectivas inmunoadhesinas a las células transfectadas transitoriamente, un vector de expresión (pRK5-CD4; Smith y col., Science, 328: 1704-1707 (1987)) para CD4 se co-transfectó con vector de expresión de DNA19355 (véase el Ejemplo 3). Después se usó anticuerpo anti-CD4 conjugado con FITC (Pharmingen, San Diego, CA) para identificar y controlar la entrada de la población de células transfectadas en el análisis
FACS.

Como se muestra en la Figura 9A, el hGITR-IgG se unía específicamente a la superficie de células transfectadas con el plásmido de expresión que codifica el DNA19355 de longitud completa. No se observó dicha unión para TNFR1, HVEM o DcR1. El hGITR-IgG no se unía a las células transfectadas con un plásmido de control (no se muestran los datos).

Los resultados demuestran una interacción de unión específica del polipéptido DNA19355 con hGITR y que el polipéptido DNA19355 no interactúa con ninguno de los demás miembros de la familia del receptor TNF puestos a prueba.

El polipéptido DNA19355 se identificó en una biblioteca de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), y los transcritos del polipéptido DNA19355 son fácilmente detectables en HUVEC mediante RT-PCR (no se muestran los datos). Se realizó un análisis FACS para examinar si la unión específica de hGITR-IgG podía demostrarse con HUVEC mediante análisis FACS. Las células HUVEC se adquirieron de Cell Systems (Kirkland, WA) y se cultivaron en una mezcla 50:50 de medios F12 de Ham y DMEM de bajo contenido en glucosa que contenía suero fetal bovino al 10%, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 mM, y 10 ng/ml de FGF básico. Las células se clasificaron mediante FACS con PBS, hGITR-IgG, TNFR1-IgG o Fas-IgG como anticuerpo primario y F(ab')2 de cabra anti-humano conjugado con ficoeritrina (CalTag, Burlingame, CA).

Se descubrió que hGITR-IgG se unía específicamente a HUVEC. (Véase la Figura 9B). Ni Fas-IgG ni TNFR1-IgG mostraban unión específica a las células HUVEC.

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Ejemplo 13

Activación de NF-\kappaB mediante DNA19355

Se realizó un análisis para determinar si DNA19355/hGITR induce activación de NF-\kappaB analizando la expresión de un gen informador dirigido por un promotor que contiene un elemento sensible a NF-\kappaB del gen de E-selec-
tina.

Células 293 humanas (2 x 10^{5}) se transfectaron transitoriamente mediante transfección con fosfato cálcico con 0,5 microgramos del plásmido informador de luciferasa de luciérnaga pGL3.ELAM.tk [Yang y col., Nature, 395: 284-288 (1998)] y 0,05 microgramos del plásmido informador de luciferasa de Renilla (como control interno de transfección) (Pharmacia), así como los vectores de expresión adicionales indicados para DNA19355 y hGITR (descritos anteriormente) (0,1 microgramos de hGITR; 0,5 microgramos para otros vectores de expresión), y el plásmido vehículo pRK5D para mantener el ADN constante entre transfecciones. Después de 24 horas, las células se recogieron y se analizó la actividad de luciferasa según lo recomendado por el fabricante (Pharmacia). Las actividades se normalizaron para las diferencias en la eficacia de transfección dividiendo la actividad de luciferasa de luciérnaga por la de luciferasa de Renilla y se expresaron como actividad relativa a la observada en ausencia de vectores de expresión añadidos.

Como se muestra en la Figura 10, la sobre-expresión de hGITR dio como resultado la activación génica significativa, y el resultado observado se potenciaba mediante la co-expresión de DNA19355 y hGITR.

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Ejemplo 14

Estimulación de la Producción de TNF-alfa

Se realizó un análisis para examinar la producción de TNF-alfa e IL-1beta a partir de células T primarias y macrófagos aislados en respuesta a la estimulación mediante polipéptido DNA19355.

Las células T primarias o monocitos/macrófagos se aislaron de donantes humanos. Las células T humanas primarias se aislaron de sangre completa mediante una columna de enriquecimiento de células T (R & D Systems). Los monocitos/macrófagos se aislaron de sangre completa mediante adherencia a un matraz de cultivo tisular. Las células aisladas respectivas se trataron después durante 24 horas con la inmunoadhesina de DNA19355 (véase el Ejemplo 3 anteriormente) a 5 microgramos/ml en medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10%. Los niveles de TNF-alfa en los sobrenadantes de cultivo se determinaron después mediante ELISA (R & D Systems; según las instrucciones del fabricante).

Los resultados se ilustran en la Figura 11. El polipéptido DNA19355 inducía un aumento de aproximadamente 20 veces en niveles de TNF-alfa secretados a partir de las células T, pero no afectaba a la liberación de TNF-alfa o liberación de IL-1beta a partir de macrófagos (no se muestran los datos). La producción inducida de TNF-alfa a partir de las células T humanas sugiere que el polipéptido DNA19355/hGITR contribuye a una respuesta proinflama-
toria.

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Ejemplo 15

Análisis de Biopsia de Piel de Cobaya

Se realiza un análisis in vivo para determinar la actividad de una molécula candidata en respuestas proinflamatorias. Específicamente, una molécula candidata (tal como polipéptido DNA19355) se inyecta en cobayas y se analizan biopsias de piel del animal tratado para detectar infiltrado de células polimorfonucleares/mononucleares o infiltrado de eosinófilos.

Las cobayas se anestesian con Ketamina (75-80 mg/kg más 5 mg/kg de Xilazina) por vía intramuscular. La molécula candidata se inyecta después en la piel del lomo del animal en 16 puntos (100 microlitros por punto por vía intradérmica). Aproximadamente 1 ml de tinte azul de Evans/PBS se inyectan por vía intracardíaca.

Las manchas en los puntos de inyección se miden (mm de diámetro) en 1 hora y 6 horas. Las cobayas se sacrifican a las 6 horas después de la inyección cutánea. Se extraen muestras de piel en los puntos de inyección y se fijan en paraformaldehído. Los tejidos se preparan después para evaluación histológica usando técnicas de tinción convencionales. El análisis de los tejidos incluye caracterizar el tipo celular en el infiltrado inflamatorio y evaluar el infiltrado perivascular.

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Depósito de Material Biológico

Los siguientes materiales se depositaron en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia USA (ATCC):

	Material	ATCC Nº de Dep.	Fecha de Depósito
	DNA19355-1150	209466	18 de noviembre de 1997

Este depósito se realizó bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimiento de Patente y las Regulaciones del mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito estará disponible en ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público después de la expedición de la Patente de Estados Unidos pertinente o después de la apertura al público de cualquier solicitud de Patente de Estados Unidos o extranjera, lo que suceda en primer lugar, y asegura la disponibilidad de la progenie a alguien determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas de Estados Unidos como autorizado para ello, según 35 USC \NAK122 y las reglas del Comisionado relacionadas con esto (incluyendo 37 CFR \NAK1.14 con referencia particular a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud acordó que si un cultivo de los materiales en depósito muere o se pierde o se destruye mientras se cultiva en condiciones adecuadas, los materiales serán sustituidos inmediatamente a la notificación por otros del mismo cultivo. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para poner en práctica la invención contraviniendo los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

La anterior memoria descriptiva escrita se considera suficiente para permitir a un experto en la materia poner en práctica la invención. La presente invención no debe limitarse en alcance por la construcción depositada, puesto que la realización depositada se interpreta como una única ilustración de ciertos aspectos de la invención. El depósito de material de este documento no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en este documento es inadecuada para permitir la puesta en práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo su mejor modo, ni debe interpretarse como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las que se muestran y describen en este documento serán evidentes para los expertos en la materia partiendo de la descripción anterior.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet EP 417563 A [0006]

\bullet WO 9807880 A [0020]

\bullet US 5364934 A [0046]

\bullet WO 8705330 A [0053]

\bullet US 4640835 A [0055]

\bullet US 4496689 A [0055]

\bullet US 4301144 A [0055]

\bullet US 4670417 A [0055]

\bullet US 4791192 A [0055]

\bullet US 4179337 A [0055]

\bullet WO 9410308 A [0058]

\bullet WO 8905859 A [0066]

\bullet US 4399216 A [0066]

\bullet US 5010182 A [0071]

\bullet EP 362179 A [0071]

\bullet WO 9013646 A [0071]

\bullet EP 36776 A [0075]

\bullet EP 73657 A [0077]

\bullet GB 2211504 A [0078]

\bullet EP 117060 A [0081]

\bullet EP 117058 A [0081]

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<110> GENENTECH INC.

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<120> POLIPÉPTIDO DNA19355, UN HOMÓLOGO DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL

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<130> 11669.26WO01

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<140> NUEVA PRESENTACIÓN

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<141> 18-11-1998

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<150> 60/069.661

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<151> 12-12-1997

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/065.635

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<151> 18-11-1997

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,4cm

1

\hskip0,4cm

100

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 1964

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

2

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<210> 3

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Desconocido

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción del Organismo Desconocido: Desconocido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgacaagc atatgttaga gactgctaag gagccctg

\hfill

38

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Descripción del Organismo Desconocido: Desconocido

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

tagcagccgg atcctaggag atgaattggg gatt

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34

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<210> 5

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Descripción del Organismo Desconocido: Desconocido

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<400> 5

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\hskip0,7cm

3

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<210> 6

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Descripción del Organismo Desconocido: Desconocido

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

atcagggact ttccgctggg gactttccg

\hfill

29

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<210> 7

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Descripción del Organismo Desconocido: Desconocido

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<400> 7

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tgtaaaacga cggccagttt ctctcagaga aacaagcaaa ac

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42

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<210> 8

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Descripción del Organismo Desconocido: Desconocido

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<400> 8

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caggaaacag ctatgaccga agtggaccaa aggtctatcg cta

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43

Claims (17)

1. Polipéptido aislado que comprende los restos de aminoácidos 1 a 177 de la SEC ID Nº: 1.

2. Polipéptido según la reivindicación 1 que consiste en los restos de aminoácidos 1 a 177 de la SEC ID Nº: 1.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el polipéptido se une a GITR humano.

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, codificado por el inserto de ADNc del vector depositado como ATCC 209466.

5. Ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID Nº: 2 o el inserto de ADNc del vector depositado como ATCC 209466.

6. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 5.

7. Vector según la reivindicación 6, donde el ácido nucleico está unido de forma operativa a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

8. Célula huésped aislada que comprende el vector según la reivindicación 6 o la reivindicación 7.

9. Célula huésped según la reivindicación 8, donde dicha célula es una célula CHO.

10. Célula huésped según la reivindicación 8, donde dicha célula es una E. coli.

11. Célula huésped según la reivindicación 8, donde dicha célula es una célula de levadura.

12. Proceso para producir el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende cultivar la célula huésped según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido y recuperar el polipéptido del cultivo.

13. Molécula quimérica que comprende el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.

14. Molécula quimérica según la reivindicación 13, donde dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia de marca epitópica.

15. Molécula quimérica según la reivindicación 13, donde dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una región Fc de una inmunoglobulina.

16. Molécula quimérica según la reivindicación 13, donde dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una cremallera de leucinas.

17. Molécula quimérica que comprende el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, fusionado a un polímero no proteico.