ES2319775T3 - Combinaciones para el tratamiento del vhc. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende: (a) el inhibidor de la proteasa NS3 4A del virus de la hepatitis un estereoisómero del mismo o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable; (b) ritonavir o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable; y (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Combinaciones para el tratamiento del VHC.

Campo técnico de la presente invención

La presente invención se refiere a combinaciones de un inhibidor de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C y de un inhibidor de la monooxigenasa del citocromo P450. Las combinaciones interfieren en el ciclo vital del virus de la hepatitis C, por lo que son útiles en terapias antivíricas. La combinación se puede usar como tal para el tratamiento y la prevención de infecciones de hepatitis C en pacientes. La presente invención se refiere también a composiciones, equipos y envases farmacéuticos que comprenden las combinaciones. La presente invención también se refiere a procedimientos para preparar estas combinaciones, composiciones, equipos y envases.

Antecedentes de la presente invención

La infección causada por el virus de la hepatitis C (VHC) es un problema médico significativo. Se considera que el VHC es el agente causante de la mayoría de los casos de hepatitis que no son A ni B, con una seroprevalencia global en humanos estimada del 3% [Alberti y col., "Natural History of Hepatitis C", J. Hepatology, 31., (Supl. 1), pp. 17-24 (1999)]. Sólo en los Estados Unidos pueden infectarse cerca de cuatro millones de personas [M.J. Alter et al., ``The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States, Gastroenterol. Clin. North Am., 23, pp. 437-455 (1994); M. J. Alter "Hepatitis C Virus Infection in the United States", J. Hepatology, 31., (Supl. 1), pp. 88-91 (1999)].

Tras la primera exposición al VHC, sólo alrededor del 20% de los individuos infectados desarrollan hepatitis clínica aguda, mientras que otros parece que resuelven la infección espontáneamente. En casi el 70% de los casos, sin embargo, el virus establece una infección crónica que persiste durante décadas [S. Iwarson, "The Natural Course of Chronic Hepatitis", FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 201-204 (1994); D. Lavanchy, "Global Surveillance and Control of Hepatitis C", J. Viral Hepatitis, 6, pp. 35-47 (1999)]. Ésto desemboca habitualmente en un empeoramiento progresivo y recurrente de la inflamación del hígado, que a menudo conduce a otros estados más graves de la enfermedad, como cirrosis y carcinoma hepatocelular [M.C. Kew, "Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma", FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 211-220 (1994); I. Saito y col., "Hepatitis C Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma", Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 87, pp. 6547-6549 (1990)]. Desafortunadamente, no hay ningún tratamiento general eficaz contra la debilitación progresiva producida por el VHC crónico.

El genoma del VHC codifica una poliproteína de 3010-3033 aminoácidos [Q.L. Choo, y col., "Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus". Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 88, pp. 2451-2455 (1991); N. Kato y col., "Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis", Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 87, pp. 9524-9528 (1990); A. Takamizawa y col., "Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers", J. Virol., 65, pp. 1105-1113 (1991)]. Se supone que las proteínas no estructurales (NS) del VHC proporcionan la maquinaria catalítica esencial para la replicación vírica. Las proteínas no estructurales se derivan de la escisión proteolítica de la poliproteína [R. Bartenschlager y col., "Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions", J. Virol., 67, pp. 3835-3844 (1993); A. Grakoui y col., "Characterization of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites", J. Virol., 67, pp. 2832-2843 (1993); A. Grakoui y col., "Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products", J. Virol., 67, pp. 1385-1395 (1993); L. Tomei y col., "NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein", J. Virol., 67, pp. 4017-4026 (1993)].

La proteína no estructural 3 (NS3) del VHC contiene una actividad de serina proteasa que favorece los procesos de la mayoría de las enzimas víricas, y se considera por ello esencial para la replicación vírica y la infectividad. Se sabe que la aparición de mutaciones en la proteasa NS del virus de la fiebre amarilla disminuye la infectividad vírica. [Chambers, T.J. y col., "Evidence that the N terminal Domain of Nonstructural Protein NS3 From Yellow Fever Virus is a Serine Protease Responsible for Site-Specific Cleavages in the Viral Polyprotein", Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 87, pp. 8898-8902 (1990)]. Se ha demostrado que los primeros 181 aminoácidos de NS3 (residuos 1027-1207 de la poliproteína vírica) contienen el dominio de serina proteasa de NS3 que procesa los cuatro sitios "corriente abajo" del VHC [C. Lin et al., "Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics", J. Virol., 68, pp. 8147-8157 (1994)].

No hay actualmente ningún tratamiento o agente satisfactorio contra el VHC. Hasta hace poco, la única terapia implantada para las enfermedades provocadas por el VHC era el tratamiento con interferón. Sin embargo, los interferones tienen efectos secundarios significativos [M. A. Wlaker y col., "Hepatitis C Virus: An Overview of Current Approaches and Progress", DDT, 4, pp. 518-29 (1999); D. Moradpour y col., "Current and Evolving Therapies for Hepatitis C", Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11, pp. 1199-1202 (1999); H. L. A. Janssen y col. "Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis", J. Hepatol., 21, pp. 241-243 (1994); P.F. Renault y col., "Side Effects of Alpha Interferon", Seminars in Liver Disease, 9, pp. 273-277. (1989)] e inducen a una remisión duradera en sólo una fracción (- 25%) de los casos [O. Weiland, "Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection", FEMS Microbiol. Rev., 14, pp. 279-288 (1994)]. Las introducciones recientes de formas pegiladas de interferón (PEG-INTRON® and PEGASYS®) y la terapia combinada de ribavirin e interferón pegilado (REBETROL®) sólo ha dado como resultado modestas mejoras en las tasas de remisión y reducciones parciales de los efectos secundarios. Además, las perspectivas de vacunas eficaces contra el VHC continúan siendo inciertas.

La serina proteasa NS3 del VHC y su cofactor asociado, NS4A, favorece procesos de todas los enzimas víricas, y se considera por ello esencial en la replicación vírica. Parece que este proceso es análogo al realizado por la aspartil proteasa del virus de inmunodeficiencia humana, que está también implicada en procesos de enzimas víricas de inhibidores de la proteasa del VIH, que inhiben los procesos de proteínas víricas y son potentes agentes antivíricos en humanos, indicando que la interrupción de esta fase del ciclo vital vírico da como resultado agentes terapéuticamente activos. Por lo que es una diana atractiva para los descubrimientos farmacológicos.

Se sabe que algunos fármacos se metabolizan por enzimas de citocromo p450. Tal metabolismo da típicamente como resultado que el fármaco tenga características farmacocinéticas desfavorables (por ejemplo, disminuye los niveles en sangre, disminuye la vida media). Por el contrario, la inhibición del metabolismo farmacológico puede llevar a mejoras en el perfil farmacocinético del fármaco. Este enfoque ha conducido a la divulgación de procedimientos para mejorar la farmacocinética de ciertos fármacos [véase, por ejemplo, el documento de patente de EEUU 6.037.157; D.E. Kempf y col. Antimicrob. Agents Chemother., 41, pp. 654-660 (1997)]. Sin embargo, no se han divulgado procedimientos para mejorar la farmacocinética de los inhibidores de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C.

Por ello, hay una necesidad de composiciones y combinaciones terapéuticas para mejorar la farmacocinética de los inhibidores de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C. Tales composiciones, combinaciones y procedimientos serían útiles en terapias contra el VHC.

Resumen de la presente invención

La presente invención se refiere a combinaciones de un inhibidor de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C, el VX-950, y un inhibidor de la monooxigenasa del citocromo P450, el ritonavir.

La presente invención proporciona composiciones, equipos y envases farmacéuticos que comprendan al inhibidor de proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C y el inhibidor de monooxigenasa del citocromo P450. La presente invención también proporciona procedimientos para preparar estas combinaciones, equipos y envases.

Descripción detallada de la presente invención

La presente invención proporciona procedimientos para perfeccionar la farmacocinética de los inhibidores de la proteasa NS3/4A de la hepatitis C. Las ventajas de mejorar la farmacocinética de fármacos se reconocen en la técnica (documentos US 2004/0091527; US 2004/0152625; US 2004/0091527). Tal mejora puede llevar a un incremento de los niveles en sangre del fármaco. De mayor importancia para terapias contra el VHC es que la mejora puede llevar a un aumento de las concentraciones del inhibidor de la proteasa en el hígado.

Los solicitantes han demostrado que los inhibidores de la proteasa NS3/4A de la hepatitis C se metabolizan por las enzimas del citocromo P450, en particular por la isoenzima 3A4. Los solicitantes han demostrado también que este metabolismo disminuye en presencia de un inhibidor de citocromo P450. Mediante la combinación de un inhibidor de la proteasa NS3/4A y de un inhibidor CYP, la presente invención proporciona la disminución del metabolismo de los inhibidores de las proteasas. Por ello se mejora la farmacocinética del inhibidor de la proteasa.

Como consecuencia, la presente invención proporciona combinaciones terapéuticas de un inhibidor de la monooxigenasa del citocromo P450 ("inhibidor CYP") y de un inhibidor de la proteasa NS3/4A de la hepatitis C.

Una realización de la presente invención proporciona un procedimiento para aumentar la biodisponibilidad de un inhibidor de la proteasa NS3/4A en un paciente, que comprende la administración de un inhibidor de proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C y un inhibidor de monooxigenasa del citocromo P450.

Otra realización de la presente invención proporciona un procedimiento para tratar a un paciente infectado con el virus de la hepatitis C que comprende administrar al paciente a) un inhibidor de proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C; y b) un inhibidor de monooxigenasa del citocromo P450.

Se espera que el inhibidor de monooxigenasa del citocromo P450 que se usa en la presente invención inhiba el metabolismo de los compuestos inhibidores de la proteasa NS3/4A. Por ello, el inhibidor de monooxigenasa del citocromo P450 estaría en una cantidad eficaz para inhibir el metabolismo del inhibidor de la proteasa. En consecuencia, el inhibidor CYP se administra en una cantidad tal que se aumente la biodisponibilidad del inhibidor de la proteasa en comparación con la biodisponibilidad en ausencia del inhibidor CYP.

En estas realizaciones, el inhibidor se administra preferiblemente en cantidades terapéuticamente eficaces. Se espera que el compuesto que se usa en la presente invención inhiba el VHC inhibiendo la proteasa NS3/4A. Como tal, es preferible coadministrar una combinación del inhibidor CYP y el inhibidor de proteasa en una cantidad suficiente para que tenga actividad antivírica.

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Debería entenderse que como la presente invención implica a una combinación de compuestos, la cantidad específica de cada compuesto puede depender de las cantidades específicas de cada uno de los otros compuestos de la combinación. Por ejemplo, la administración de inhibidor CYP y un inhibidor de proteasa en un procedimiento de la presente invención conduce a la mejora farmacocinética del inhibidor de la proteasa en comparación con la farmacocinética del inhibidor de la proteasa administrada en ausencia del inhibidor CYP.

La cantidad de ritonavir administrada al paciente es preferiblemente suficiente para mejorar la farmacocinética del inhibidor VX-950 de la proteasa en comparación con la farmacocinética del inhibidor VX-950 de la proteasa en ausencia de ritonavir. Preferiblemente, la cantidad de ritonavir administrada es suficiente para aumentar los niveles en sangre del inhibidor VX-950 de la proteasa o para aumentar las concentraciones en el hígado del inhibidor VX-950 de la proteasa. Se usa por ello, de manera ventajosa, una dosis más baja de inhibidor VX-950 de la proteasa (en relación con la administración de sólo el inhibidor VX-950 de la proteasa).

Además del tratamiento de pacientes infectados con hepatitis C, la presente invención puede usarse también para prevenir que un paciente se infecte con hepatitis C. En consecuencia, una realización de la presente invención proporciona un procedimiento para la prevención la infección por virus de hepatitis C en un paciente, lo que comprende administrar al paciente a) un inhibidor de proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C; y b) un inhibidor de monooxigenasa del citocromo P450.

Como se percataría un facultativo experimentado, la presente invención está usándose para el tratamiento profiláctico de pacientes, y si el paciente resulta infectado con el virus de la hepatitis C, el procedimiento puede entonces tratar la infección. Por ello, una realización de la presente invención proporciona un inhibidor de proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C y un inhibidor de monooxigenasa del citocromo P450, en la que la combinación de inhibidores presenta cantidades terapéuticamente eficaces para el tratamiento o prevención de la infección de la hepatitis C en un paciente.

El VX-950 es un inhibidor peptidomimético de la proteasa NS3/4A reversible y competitivo con una constante de unión (ki*) en el equilibrio de 3 nM [documento WO 02/018369].

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En consecuencia, el inhibidor de la proteasa NS3/4A para usar en los procedimientos, procesos, combinaciones, composiciones, envases y equipos de la presente invención es el VX-950.

Los compuestos preferidos para usar con respecto a la presente invención son esos en los que el compuesto es suficientemente estable para permitir la elaboración y la administración a un mamífero por medio de procedimientos conocidos en la técnica. Típicamente, tales compuestos son estables a una temperatura de 40ºC o menos, en ausencia de humedad o de otra condición químicamente reactiva, durante al menos una semana.

El VX-950 puede contener uno o más átomos de carbono asimétricos, y por eso, puede existir como racematos y mezclas racémicas, como un solo enantiómero, como mezclas de diastereoisómeros y como diastereoisómeros individuales. Todas estas formas isoméricas de estos compuestos se incluyen expresamente en la presente invención. La configuración de cada carbono estereogénico puede ser R o S. Los isómeros D y L en el extremo del N-propil de la cadena de VX-950 están incluidos expresamente en la presente invención.

El inhibidor CYP es ritonavir (documento WO 94/14436).

Los procedimientos de medición de la capacidad de un compuesto para inhibir la actividad de la monooxigenasa P50 del citocromo son conocidos (véase el documento US 6.037.157 y Yun y col. Drug Metabolism & Disposition, vol.21, pp. 403-407 (1993)). Por ejemplo, un compuesto que se vaya a evaluar puede incubarse con 0,1, 0,5, y 1 mg de proteína/ml, u otra concentración apropiada de microsomas hepáticos humanos (por ejemplo, disponible en el mercado, mezcla de microsomas hepáticos caracterizados de varios individuos) durante 0, 5, 10, 20, y 30 minutos, u otros tiempos apropiados, en presencia de un sistema generador de NADPH. Las incubaciones de control pueden realizarse en ausencia de microsomas hepáticos por 0 y 30 minutos (triplicado). Las muestras pueden analizarse por la presencia del compuesto. Las condiciones de incubación que produzcan un índice linear del metabolismo del compuesto se usarán como guía para estadios posteriores.

Los ensayos típicos determinarían la cinética del metabolismo del compuesto (K_{m} y v_{max}). La tasa de desaparición del compuesto puede determinarse y los datos analizarse de acuerdo con la cinética de Michaelis-Menten, usando a Lineweaver-Burk, a Eadie-Hofstee, o un análisis de regresión no linear.

Los ensayos de inhibición del metabolismo pueden realizarse entonces. Por ejemplo, un compuesto (una concentración, s K_{m}) puede incubarse con una mezcla de microsomas hepáticos humanos de varios individuos en ausencia o en presencia de un inhibidor CYP (como el ritonavir) en las condiciones determinadas anteriormente. Como se reconocería, las incubaciones de control deberían contener la misma concentración de solvente orgánico que las incubaciones con el inhibidor CYP. Las concentraciones del compuesto en las muestras pueden cuantificarse, y la tasa de desaparición del compuesto padre se puede determinar, con tasas que se expresan como porcentaje de la actividad de control.

Los procedimientos para evaluar la influencia de la coadministración del inhibidor de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C y el inhibidor CYP en un sujeto son también conocidos (documento US2004/0028755). Cualquiera de tales procedimientos podría usarse en conexión con esa invención para determinar el impacto farmacocinético de una combinación. Podrían entonces seleccionarse los sujetos que se beneficiarían del tratamiento de acuerdo con la presente invención. De forma específica, podrían elegirse para el tratamiento de acuerdo con la presente invención sujetos que metabolicen inhibidores de la proteasa NS3/4A. Los sujetos que metabolizan inhibidores de la proteasa NS3/4A en gran cantidad, o al menos en mayor medida que otros sujetos, serían sujetos preferidos para el tratamiento de acuerdo con la presente invención.

El inhibidor CYP que se emplea en la presente invención puede ser un inhibidor de sólo una isoenzima o de más de una. Si el inhibidor CYP inhibe más isoenzimas, el inhibidor puede, no obstante, inhibir una isoenzima de modo más selectivo que otra isoenzima. Cualquiera de tales inhibidores CYP puede usarse en un procedimiento de la presente invención.

Como se apreciará, la actividad CYP3A4 se observa ampliamente en humanos. En consecuencia, sería esperable que las realizaciones de la presente invención que implican la inhibición de la isoenzima 3A4 puedan aplicarse a un amplio rango de pacientes.

Los procedimientos de la presente memoria implican la administración de combinaciones de un inhibidor de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C y de un inhibidor de la monooxigenasa del citocromo P450. Se puede denominar tal administración como coadministración. La coadministración abarca administrar cada inhibidor en la misma forma posológica o en diferentes formas posológicas. Si se administran en formas posológicas diferentes, los inhibidores pueden administrarse en momentos diferentes y en cualquier orden.

En consecuencia, la presente invención proporciona procedimientos en los que el inhibidor CYP se administra junto con el inhibidor de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C en la misma forma posológica o en formas posológicas separadas.

Si el inhibidor CYP y el inhibidor de la proteasa se administran en formas posológicas separadas, cada inhibidor puede administrarse más o menos simultáneamente. De modo alternativo, el inhibidor CYP puede administrarse en cualquier momento en torno a la administración del inhibidor de la proteasa. Es decir, el inhibidor CYP puede administrarse antes de, junto con, o a continuación del inhibidor de la proteasa. El momento de la administración debería ser tal que el inhibidor CYP afecte al metabolismo del inhibidor de la proteasa. Por ejemplo, si el inhibidor de la proteasa se administra primero, el inhibidor CYP debería administrarse antes de que se metabolice y/o se excrete el inhibidor de la proteasa (por ejemplo, dentro de la vida media del inhibidor de la proteasa).

La presente invención puede también implicar la administración de otro componente que comprenda un agente adicional seleccionado entre un agente inmunomodulatorio, un agente antivírico, un inhibidor de la proteasa del VHC, un inhibidor de otra diana en el ciclo vital de VHC, un inhibidor del citocromo P450, o combinaciones de ellos.

En consecuencia, la presente invención proporciona un procedimiento que comprende administrar un inhibidor de proteasa NS3/4A, un inhibidor CYP, y otro agente antivírico, preferiblemente un agente contra el VHC. Tales agentes antivíricos incluyen, pero sin estar limitados a, agentes inmunomoduladores, tales como interferones \alpha, \beta, y \gamma, compuestos pegilados derivados del interferón \alpha, y timosin; otros agentes antivíricos, tales como ribavirin, amantadita, telvivudina, otros inhibidores de las proteasas de la hepatitis C (Inhibidores NS2-NS3 e inhibidores NS3-NS4); inhibidores de otras dianas en el ciclo vital del VHC, incluyendo inhibidores de helicasa, polimerasa y metaloproteasa; inhibidores del sitio interno de entrada al ribosoma; inhibidores víricos de amplio espectro, tales como inhibidores de IMPDH (por ejemplo compuestos de las patentes de Estados Unidos 5.807.876, 6.498.178, 6.344.465, 6.054.472 y de los documentos WO 97/40028, WO 98/40381, WO 00/56331, y ácido micofenólico y derivados del mismo, e incluyendo, pero no limitado a VX-497, VX-148, y/o VX-944); o combinaciones de cualquiera de los anteriores.

Otros agentes (por ejemplo, compuestos no-inmunomodulatorios o inmunomodulatorios) pueden usarse en combinación con un compuesto de la presente invención que incluye, pero no está limitado a, los compuestos específicos del documento WO 02/18369, que se incorpora a la presente memoria descriptiva como referencia (véase, por ejemplo, la página 273, líneas 9-22 y la página 274, línea 4 a la página 276, línea 11).

Otros agentes incluyen todavía, pero no están limitados a, PEG-INTRON® (peginteferon alfa-2b, disponible en Schering Corporation, Kenilworth, NJ, EEUU); INTRON-A®, (interferón alfa-2b disponible en Schering Corporation, Kenilworth, NJ, EEUU); ribavirin (1-beta-D-ribofuranosil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxamida, disponible en ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA, EEUU; descrito en el Índice Merck, entrada 8365, Edición Doce); REBETROL® (Schering Corporation, Kenilworth, NJ, EEUU), COPEGASUS® (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ, EEUU); PEGASYS® (peginterferón alfa-2a disponible en Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ, EEUU); ROFERON® (interferón alfa-2a recombinante disponible en Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ, EEUU); BEREFOR® (interferón alfa 2 disponoble en Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, CT, EEUU); SUMIFERON® (una mezcla purificada de interferones alfa naturales tal como Sumiferon disponible en Sumitomo, Japón); WELLFERON® (interferón alfa n1 disponible en Glaxo Wellcome Ltd., Reino Unido); ALFERON® (una mezcla de interferones alfa naturales elaborada por Interferon Sciences, y disponible en Purdue Frederick Co., CT, EEUU); interferón-a; interferón alfa natural 2a; interferón alfa natural 2b; interferón alfa pegilado 2a o 2b; interferón alfa de consenso (Amgen, Inc., Newbury Park, CA, EEUU); VIRAFERON®; INFERGEN®; REBETRON® (Schering Plough, Inteferón-alfa 2B + Ribavirin); interferón alfa pegilado (Reddy, K.R. y col. ``Efficacy and Safety of Pegylated (40-kd) Interferon alpha-2a Compared with Interferon alpha- 2a in Noncirrhotic Patients with Chronic Hepatitis C (Hepatology, 33, pp. 433-438 (2001); interferon de consenso (Kao, J.H., y col., "Efficacy of Consensus Interferon in the Treatment of Chronic Hepatitis" J. Gastroenterol. Hepatol. 15, pp. 1418-1423 (2000); interferon linfoblastoide o "natural"; interferón tau (Clayette, P. y col., "IFN-_tau, A New Interferon Type I with Antiretroviral activity" Pathol. Biol. (Paris) 47, pp. 553-559 (1999); interleukin 2 (Davis, G.L. y col., "Future Options for the Management of Hepatitis C". Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999); interleukin 6 (Davis y col. "Future Options for the Management of Hepatitis C". Seminars in Liver Disease 19, pp. 103-112 (1999); interleukin 12 (Davis, G.L. y col., "Future Options for the Management of Hepatitis C". Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999); y compuestos que incrementen el desarrollo de la respuesta de los linfocitos T colaboradores de tipo 1 (Davis y col., "Future Options for the Management of Hepatitis C". Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999)). También se incluyen compuestos que estimulan la síntesis de interferón en las células (Tazulakhova, E.B. y col., "Russian Experience in Screening, analysis, and Clinical Application of Novel Interferon Inducers" J. Interferon Cytokine Res., 21 pp. 65-73) incluyendo, pero sin limitarse a, ARN bicatenario, solo o en combinación con tobramicin, e imiquimod (3M Pharmaceuticals; Sauder, D.N. "Immunomodulatory and Pharmacologic Properties of Imiquimod" J. Am. Acad. Dermatol., 43 pp. S6-11
(2000).

Como reconocen facultativos experimentados, un inhibidor de proteasa y un inhibidor CYP se administrarían preferiblemente por vía oral. El interferón no se administra típicamente por vía oral. No obstante, no hay nada en la presente memoria descriptiva que limite los procedimientos o combinaciones de la presente invención a algún régimen o a formas posológicas específicas. Por ello, los componentes de la combinación de acuerdo con la presente invención pueden administrarse separadamente, juntos, o en cualquier combinación de los mismos. Como reconocen facultativos experimentados, la posología del interferón se mide típicamente en UI (por ejemplo, de aproximadamente 4 millones de UI a aproximadamente 12 millones de UI).

Si un agente adicional se selecciona de otro inhibidor CYP, el procedimiento emplearía, por lo tanto, dos o más inhibidores CYP. Cada componente puede administrarse en una o más formas posológicas. Cada forma posológica puede administrarse en el paciente en cualquier orden.

El inhibidor de la proteasa NS3/4A, el inhibidor CYP, y cualquier agente adicional pueden formularse en formas posológicas separadas. De modo alternativo, para disminuir el número de formas posológicas administradas a un paciente, el inhibidor de la proteasa NS3/4A, el inhibidor CYP, y cualquier agente adicional pueden formularse juntos en una combinación. Por ejemplo, el inhibidor de la proteasa NS3/4A puede formularse en una forma posológica y el inhibidor CYP y el agente adicional pueden formularse juntos en otra forma posológica. Cualesquiera formas posológicas separadas pueden administrarse al mismo tiempo o en momentos diferentes. Debería entenderse que el inhibidor CYP podría administrarse dentro de un periodo de tiempo tal que el inhibidor CYP disminuyera el metabolismo del inhibidor de la proteasa NS3/4A (o del agente o agentes adicionales).

En consecuencia, otra realización de la presente invención proporciona una composición que comprende un inhibidor de la proteasa NS3/4A, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un inhibidor CYP o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. De acuerdo con una realización preferida, el inhibidor de la proteasa NS3/4A está presente en una cantidad eficaz para disminuir la carga vírica en una muestra o en un paciente, en la que dicho virus codifica la serina proteasa NS3/4A necesaria para el ciclo vital vírico, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De modo alternativo, una composición de la presente invención comprende una agente adicional como se describe en la presente memoria descriptiva. Cada componente puede estar presente en composiciones individuales, composiciones en combinación, o en una composición única.

Si se utilizan en estas composiciones sales farmacéuticamente aceptables de compuestos, estas sales se derivan preferiblemente de bases y ácidos orgánicos o inorgánicos. Entre tales sales de ácido se incluyen las siguientes: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canfor sulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftaflensulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato,pectinato, persulfato, 3-fenil-propionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Las sales de bases incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos, tal como sales de sodio y potasio, sales de metales alcalinotérreos, tal como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas, tal como sales de diciclohexilamina, N-metil-D-glucamina, y sales con aminoácidos tal como arginina, lisina y demás.

También, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden cuaternizarse con tales agentes como haluros de alquilo inferiores, tal como metilo, etilo, propilo, y cloruro, bromuro y yoduro de butilo, sulfatos de dialquilo, tal como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo, y diamilo, haluros de cadena larga tal como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, haluros de aralquilo tal como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. Se obtienen, por consiguiente, productos solubles en agua o en aceite o dispersables.

Los compuestos que se utilizan en las composiciones o procedimientos de la presente invención pueden también modificarse por la incorporación de las funcionalidades apropiadas para incrementar las propiedades biológicas selectivas. Tales modificaciones se conocen en la técnica e incluyen las que aumentan la penetración biológica en un sistema biológico dado (por ejemplo, sangre, sistema linfático, sistema nervioso central), aumenta la accesibilidad oral, aumenta la solubilidad para permitir la administración por inyección, altera el metabolismo y altera la tasa de excreción.

Vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en estas composiciones incluyen, pero no están limitados a, cambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tal como la albúmina del suero humano, sustancias tampón tal como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de gliceridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tal como sulfato de protamina, fosfato hidrógeno de disodio, fosfato hidrógeno de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

De acuerdo con una realización preferida, las composiciones de la presente invención se formulan para la administración farmacéutica a mamíferos, en particular a seres humanos.

Tales composiciones farmacéuticas de la presente invención (así como composiciones para utilizar en procedimientos, combinaciones, envases y equipos de la presente invención) pueden administrarse por vía oral, parenteral, sublingual, mediante spray inhalador, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, o por medio de un reservorio implantado. El término "parenteral" tal como se usa en la presente memoria descriptiva incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. Preferiblemente, las composiciones se administran por vía oral o intravenosa. De forma más preferida, las composiciones se administran por vía oral.

Las formas inyectables estériles de las composiciones de y de acuerdo con la presente invención pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica usando agentes dispersantes o humectantes y agentes suspensores. La preparación inyectable estéril puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos aceptables y lo solventes que pueden utilizarse está el agua, la solución de Ringer y una solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos estériles como solvente o medio suspensor. Con esta finalidad, cualquier aceite fijo insípido puede emplearse incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tal como el ácido oléico y sus derivados glicéridos son útiles para la preparación de inyectables, como son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tal como el aceite de oliva o el aceite de castor, en especial en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones de aceites pueden también contener un dispersante o diluyente alcohol de cadena larga, tal como carboximetil celulosa o agentes dispersantes similares, que se usan habitualmente en la formulación de formas posológicas farmacéuticamente aceptables incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos que se usan habitualmente, tal como Tween, Span y otros agentes emulsionantes o sustancias que mejoran la biodisponibilidad, que se usan habitualmente en la fabricación de formas posológicas farmacéuticamente aceptables sólidas, líquidas o cualquiera sea, pueden también usarse para fines de formulación.

En composiciones de la presente invención, y de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, composiciones que se usan en procedimientos, equipos, combinaciones o envases de la presente invención, tanto el inhibidor de proteasa NS3/4A, el inhibidor CYP y cualquier agente adicional opcional debería estar presente a niveles posológicos de entre alrededor de 10% hasta 100%, y de modo más preferible entre 10% y 80% de la posología que normalmente se administra en un régimen monoterápico.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por vía oral en cualquier forma posológica oralmente aceptable incluyendo, pero sin limitarse a, cápsulas, comprimidos, pastillas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos que se usan habitualmente incluyen lactosa y almidón de maíz. Agentes lubricantes, como el estearato de magnesio, también se añaden de modo típico. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen la lactosa y el almidón de maíz desecado. Si se requieren soluciones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y suspensores. Si se desea, se pueden usar también ciertos sabores, agentes edulcorantes o colorantes. Las formas posológicas líquidas aceptables incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires.

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De forma alternativa, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en forma de supositorios por vía rectal. Estas pueden prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal y por ello se funda en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen mantequilla de coco, cera de abeja y poloetilenglicoles.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden también administrarse de modo tópico, en especial si la diana del tratamiento incluye zonas u órganos fácilmente accesibles por aplicación tópica, incluyendo enfermedades oculares, epidérmicas o del tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas zonas u órganos.

La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior puede efectuarse en una formulación en forma de supositorio por vía rectal (véase anteriormente) o una formulación adecuada de enema. También de forma tópica se usan los parches transdérmicos.

Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en una pomada adecuada que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más vehículos. Los vehículos para administración tópica de los compuestos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. De modo alternativo, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en una crema o loción adecuada que contenga los componentes activos suspendidos o disueltos en una o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Vehículos aceptables incluyen, pero no están limitados a, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de cetil esteres, cetearil alcohol, 2-octildodecanol, bencil alcohol y agua.

Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticas pueden formularse como suspensiones micronizadas en medio salino isotónico estéril con pH ajustado o preferiblemente como soluciones en medio salino isotónico estéril con pH ajustado tanto con o sin un conservante, tal como cloruro de benzalconio. De modo alternativo, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en una pomada tal como vaselina.

Las composiciones farmacéuticas de, y de acuerdo con, la presente invención pueden también administrarse por medio de un aerosol nasal o por inhalación. Tales composiciones se preparan de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en medio salino, empleando bencil alcohol u otro conservante adecuado, promotores de absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarbonos, y/u otros agentes dispersantes o solubilizantes convencionales.

Como se reconoce en la técnica, las composiciones farmacéuticas pueden también administrarse en forma de liposomas.

Se prefieren las composiciones farmacéuticas de, y de acuerdo con, la presente invención formuladas para la administración oral.

Los niveles posológicos de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal por día del inhibidor de la proteasa NS3/4A son útiles para la prevención y tratamiento de la enfermedad provocada por el VHC. Para el inhibidor CYP serían típicos los niveles posológicos de entre aproximadamente 0,001 a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal por día. Más típicos serían niveles posológicos de entre aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg o de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 25 mg/kg por día. De modo típico, las composiciones farmacéuticas de, y de acuerdo con, la presente invención se administrarán de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces al día o de modo alternativo, como una infusión continua. Tal administración puede utilizarse como terapia aguda o crónica. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con los materiales vehículos para producir una forma posológica única variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. Una preparación típica contendrá de aproximadamente 5% a aproximadamente 95% de compuesto activo (p/p). Preferiblemente, tales preparaciones contienen de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% de compuesto activo.

Tras la mejora de la condición del paciente, puede administrarse, si es necesario, una dosis de mantenimiento de un compuesto, composición o combinación de la presente invención. Subsecuentemente se puede reducir la dosis, la frecuencia de la administración o ambas, en función de los síntomas, a niveles a los que se mantenga la condición mejorada; cuando se hayan aliviado los síntomas al nivel deseado, el tratamiento debería concluir. Los pacientes pueden, no obstante, necesitar tratamiento intermitente a largo plazo considerando alguna recurrencia de los síntomas de la enfermedad.

Debería también entenderse que un régimen específico posológico y de tratamiento para un paciente concreto dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el género, los hábitos alimenticios, el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la opinión de los médicos que tratan al paciente y la gravedad de la enfermedad concreta que se trata. La cantidad de ingredientes activos dependerá también del compuesto concreto descrito y de la presencia o ausencia y de la naturaleza del agente antivírico de la composición.

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Para formas posológicas preferidas de ritonavir, véase la Patente de Estados Unidos 6.037.157, y los documentos que se mencionan en la misma: Patente de Estados Unidos 5.484.801, Solicitud de patente de Estados Unidos 08/402.690, y las solicitudes de patente internacionales WO 95/07696 y WO 95/0909614.

De acuerdo con otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar un paciente infectado con un virus caracterizado por una serina proteasa NS3/4A codificada víricamente que es necesaria para el ciclo vital del virus administrando a dicho paciente una composición farmacéuticamente aceptable de la presente invención. Preferiblemente, el procedimiento de la presente invención se usa para el tratamiento de pacientes que sufran una infección del VHC. Tal tratamiento puede erradicar completamente la infección vírica o reducir la gravedad de la misma. De modo más preferible, el paciente es un ser humano.

En todavía otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento de pretratamiento de una sustancia biológica deseada por administración a un paciente, lo que comprende la etapa de poner en contacto dicha sustancia biológica con una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un compuesto de la presente invención. Tales sustancias biológicas incluyen, pero no están limitadas a, sangre y sus componentes, tales como plasma, plaquetas, subpoblaciones de células sanguíneas y similares; órganos tales como riñones, hígado, corazón, pulmones, etc...; esperma y óvulos, médula ósea y sus componentes, y otros fluidos que se inyecte a un paciente tal como dextrosa, una solución salina, etc.

La presente invención también proporciona un procedimiento de preparación de una composición que comprende un inhibidor de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C y un inhibidor de la monooxigenasa del citocromo P450, que comprende la etapa de combinación del inhibidor de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C y del inhibidor de la monooxigenasa del citocromo P450. Una realización alternativa de la presente invención proporciona un procedimiento en el que la composición comprende uno o más agentes adicionales como se describe en la presente memoria descriptiva.

La presente invención también proporciona una combinación terapéutica que comprende un inhibidor de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C y un inhibidor de la monooxigenasa del citocromo P450. En una realización alternativa de la presente invención, la combinación terapéutica comprende además uno o más agentes adicionales como se describe en la presente memoria descriptiva.

La composición farmacéutica se puede también recetar a los pacientes en forma de producto envasado, en un "envase para el paciente" que contiene lo necesario para un tratamiento completo en un único paquete, habitualmente en un envase alveolado. Los productos envasados tienen una ventaja sobre las prescripciones tradicionales, en las que el farmacéutico toma la cantidad recetada al paciente de sus existencias a granel, en lo referente a que el paciente siempre tiene acceso al prospecto que contiene el envase del producto, que habitualmente se pierde en las prescripciones tradicionales. Se ha demostrado que la inclusión de un prospecto mejora el cumplimiento por parte del paciente de las indicaciones del médico.

Se entenderá que la administración de la combinación de la presente invención usando un único envase, o con un envase para cada formulación, que contenga dentro un prospecto para informar al paciente del uso correcto de la presente invención es una particularidad adicional deseable de la presente invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención es un envase que comprenda al menos un inhibidor de la proteasa NS3/4A y un inhibidor CYP de la presente invención y un prospecto con información que contenga directrices sobre el uso de la combinación de la presente invención. En una realización alternativa de la presente invención, el envase farmacéutico comprende además uno o más agentes adicionales como se describe en la presente memoria descriptiva. El agente o agentes adicionales se pueden proporcionar en el mismo envase o en envases separados.

Otro aspecto de ésta conlleva un equipo empaquetado para uso de un paciente en el tratamiento de la infección del VHC o en la prevención de la infección del VHC, que comprende: una única formulación farmacéutica de cada componente farmacéutico o una pluralidad de ellas; un recipiente que albergue la formulación o formulaciones farmacéuticas durante el almacenaje y antes de la administración; e instrucciones para llevar a cabo la administración del fármaco de un modo eficaz para tratar o prevenir la infección del VHC.

En consecuencia, la presente invención proporciona equipos para la administración simultánea o secuencial de un inhibidor de la proteasa NS3/4A y un inhibidor CYP (y opcionalmente un agente adicional) o sus derivados preparados de un modo convencional. Típicamente, tal equipo comprenderá, por ejemplo una composición de cada inhibidor y opcionalmente el o los agentes adicionales en un vehículo farmacéuticamente aceptable (y en una formulación farmacéutica o en una pluralidad de las mismas) e instrucciones escritas para la administración simultánea o
secuencial.

En otra realización, se proporciona un equipo empaquetado que contiene una o más formas posológicas para autoadministración; medios contenedores, preferiblemente precintados, para albergar las formas posológicas durante el almacenaje y antes de su uso; e instrucciones para el paciente para llevar a cabo la administración del fármaco. De modo típico, las instrucciones vendrán escritas en el prospecto, un etiqueta, y/o en otros componentes del equipo, y la forma o las formas posológicas se presentan como se describe en la presente memoria descriptiva. Cada forma posológica puede envasarse individualmente, como por medio de metal laminado revestido de plástico con cada forma posológica, separada de las otras en celdas individuales o en ampollas, o las formas posológicas pueden envasarse en un único recipiente, como en una botella de plastico. El presente equipo también incluirá de modo típico medios para empaquetar los componentes individuales del equipo, por ejemplo, las formas posológicas, los medios contenedores y las instrucciones de uso escritas. Tales medios de empaquetado pueden tener la forma de una caja de cartón o papel, de una bolsita de plástico o papel de aluminio, etc.

Aunque más adelante se representan y se describen ejemplos de ciertas realizaciones, se apreciará que compuestos de la presente invención puedan prepararse de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente de modo general usando materias primas apropiadas disponibles normalmente para alguien con algo de experiencia en la técnica.

Para que la presente invención pueda entenderse más plenamente, se realizaron los ejemplos siguientes de preparación y ensayo. Estos ejemplos tienen sólo la finalidad de ilustrar y no deben interpretarse en ningún sentido como limitación del alcance de la presente invención.

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Ejemplo 1 Protocolo de ensayo de células con replicón del VHC

Las células que contienen un replicón del virus de la hepatitis C (VHC) se sembraron en DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal (SBF), 0,25 miligramos por mililitro de G418, y con suplementos apropiados (medio A).

El día 1, la monocapa de células con replicón se trató con una mezcla de tripsina:EDTA, se eliminó, y se diluyó entonces el medio A hasta una concentración final de 100.000 células por ml. Se plaquearon 10.000 células en 100 \mul en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos, y se cultivó toda la noche en un incubador de cultivo de tejidos a 37ºC.

El día 2, se diluyeron los compuestos (en 100% de DMSO) en serie en DMEM suplementado con un 2% de SBF, 0,5% de DMSO y con los suplementos apropiados (medio B). La concentración final de DMSO se mantuvo al 0,5% gracias a las series de dilución.

Se eliminó el medio de la monocapa de células con replicón, y se añadió el medio B, que contenía varias concentraciones de compuestos. Se añadió medio B sin ningún compuesto a otros pocillos como controles sin compuesto.

Se incubaron las células con compuesto o con 0,5% de DMSO en medio B durante 48 horas en un incubador de cultivo de tejidos a 37ºC. Tras la incubación de 48 horas, se eliminó el medio, y la monocapa de células con replicón se lavó una vez con PBS y se almacenó a -80ºC antes de proceder a la extracción del ARN.

Las placas de cultivo con las monocapas de células con replicón tratadas se descongelaron, y se añadió a las células de cada pocillo una cantidad fija de otro ARN vírico, tal como del virus de la diarrea vírica bovina (VDVB). Los reactivos para la extracción de ARN (tal como los reactivos de los equipos RNeasy) se añadieron inmediatamente a las células para evitar la degradación del ARN. Se extrajo el ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante con una modificación para mejorar la eficacia y la consistencia de la extracción. Finalmente, se eluyó el ARN celular total, incluido el ARN del replicón del VHC, y se almacenó a -80ºC hasta un proceso posterior.

Se realizó un ensayo de cuantificación Taqman de PCR a tiempo real con dos conjuntos de cebadores específicos y sonda. Uno era para el VHC y el otro para el VDVB. Los extractantes con el ARN total extraído de las células con replicón del VHC tratadas se añadieron a las reacciones PCR para la cuantificación del ARN del VHC y del VDVB en el mismo pocillo de PCR. Se señalizaron los fallos experimentales y se rechazaron en base al nivel de ARN del VDVB en cada pocillo. Se calculo el nivel de ARN del VHC en cada pocillo de acuerdo con una curva estándar trazada en la misma placa de PCR. El porcentaje de inhibición o reducción del nivel de ARN del VHC debido al tratamiento con el compuesto se calculó usando el DMSO o el control sin compuesto como un 0% de inhibición. El CI50 (concentración a la que se observa un nivel del 50% de inhibición del ARN del VHC) se calculó a partir de la curva de valoración de cualquier compuesto dado.

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Ejemplo 2 Protocolo de ensayo del Ki del VHC Procedimiento por HPLC de microporo para la separación de sustrato 5AB y productos

Sustrato

NH_{2}-Glu-Asp-Val-Val-(alfa)Abu-Cys-Ser-Met-Ser-Tyr-COOH

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Se preparó una solución stock de 5AB 20 mM (o concentración de su elección 9 en DMSO/DTT 0,2 M. Se almacenó en partes alícuotas a -20ºC.

Tampón: HEPES 50 mM, pH 7,8; glicerol al 20%; NaCl 100 mM

El volumen de ensayo total fue de 100 \mul

2

El tampón, KK4A, DDT y tNS3 se combinaron; se distribuyeron 78 \mul de cada en pocillos de la placa de 96 pocillos. Ésta se incubó a 30ºC durante aproximadamente 5-10 min.

Se disolvieron 2,5 \mul de la concentración apropiada del compuesto de ensayo en DMSO (DMSO sólo para control) y se añadieron en cada pocillo. Se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min.

Se inició la reacción por adición de 20 \mul de sustrato 5AB 250 \muM (una concentración 25 \muM es equivalente o ligeramente inferior que la Km del 5AB).

Se incubó durante 20 min a 30ºC.

Se completó la reacción por adición de 25 \mul de TFA al 10%.

Se transfirieron alícuotas de 120 \mul a los viales del HPLC.

Se separó el producto SMSY del sustrato y el KK4A por el procedimiento siguiente:

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Procedimiento de separación por microporo

Aparatos: Agilent 1100

Desgasificador G1322A

Bomba binaria G1312A

Muestreador automático G1313A

Compartimento termostatizado para columnas G1316A

Detector de diodos en fila G1315A

Columna

Phenomenex Jupiter; 5 \mum C18; 300 angstroms; 150x2 mm; P/O 00f-4053-B0

Columna termostatizada: 40 C

Volumen de inyección: 100 \mul

Solvente A = agua grado HPLC + TFA al 0,1%

Solvente B = acetonitrilo grado HPLC + TFA al 0,1%

3

Tiempo de parada: 17 min

Tiempo de postejecución: 10 min

Ejemplo 3 Estabilidad metabólica de los inhibidores de proteasa NS3/4A Interacción de ritonavir en el metabolismo de VX-950

El metabolismo de VX-950 y la interacción con ritonavir se investigó usando microsomas hepáticos humanos. Las incubaciones iniciales se realizaron en un tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,4, que contenía EDTA 1 mM NADPH, VX-950 \muM y bien 0,1, 0,5 o bien 1,0 mg de proteína microsómica/ml para varios tiempos concretos. Debido a las tasas no lineares de metabolismo, las incubaciones adicionales se realizaron conteniendo bien 0,25 o bien 0,50 mg de proteína microsómica/ml a dos concentraciones de VX-950 (0,5 y 1 \muM) por no más de 30 minutos.

Debido a la aparente rapidez del metabolismo de VX-950 en microsomas hepáticos humanos, la cinética (Vmax y Km) del metabolismo de VX-950 se determinó usando una concentración de proteína de 0,25 mg/ml y un tiempo de incubación de 2 minutos. La interacción de ritonavir sobre el metabolismo de VX-950 se determinó por incubación de una concentración única de VX-950 (0,25 \muM) y microsomas hepáticos humanos (0,25 mg de proteína microsómica/ml) con varias concentraciones de ritonavir (0 a 100 \muM) durante 2 minutos. La adición de ritonavir a concentraciones de no más de 3 \muM produjo inhibición en el metabolismo de VX-950. A concentraciones más altas de ritonavir (10 a 100 \muM) se observó un aumento en el metabolismo de VX-950.

En resumen, el VX-950 a las concentraciones usadas en este estudio se metaboliza rápidamente en microsomas hepáticos humanos (por ejemplo, 73% @ 2 \muM a 60 min, 7% @ 20 \muM; o 86% @ 2 \muM a 120 min, 21% @ 20 \muM). Otros inhibidores de la proteasa NS3/4A exhibieron resultados similares.

Se ha demostrado que el ritonavir inhibe el metabolismo de VX-950. Sin embargo, interacciones ulteriores con concentraciones altas de ritonavir produjeron la activación del metabolismo de VX-950. El mecanismo de este aumento en el metabolismo de VX-950 en presencia de ritonavir no está claro. Sin estar ligado por la teoría, este aumento puede ser el resultado de la unión simultánea de ambos compuestos in el mismo sitio activo, o la abolición de la actividad de CYP3A4 por ritonavir puede dar como resultado que el VX-950 se metabolice por otras enzimas CYP450 no inhibidas.

Claims (7)

1. Una composición farmacéutica que comprende: (a) el inhibidor de la proteasa NS3 4A del virus de la hepatitis C

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un estereoisómero del mismo o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable; (b) ritonavir o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable; y (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. El uso del inhibidor de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C

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un estereoisómero del mismo o un sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y ritonavir o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una infección del virus de la hepatitis C.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el inhibidor de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C y el ritonavir están en formas posológicas separadas.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que las formas posológicas separadas se administran de modo aproximadamente simultáneo.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el inhibidor de la proteasa NS3/4A y el ritonavir están en una única forma posológica.

6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 en el que dicho uso comprende la administración de un agente adicional seleccionado a partir de un agente inmunomodulatorio; un agente antivírico; otro inhibidor de la proteasa NS3/4A del VHC; un inhibidor de una diana en el ciclo vital del VHC que no sea la proteasa NS3/4A; un inhibidor del sitio interno de entrada al ribosoma, un inhibidor vírico de amplio espectro; otro inhibidor del citocromo P-450; o una combinación de los mismos.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho agente inmunomodulatorio es un interferón-\alpha, -\beta,
ó -\gamma o timosin; el agente antivírico es ribavirin, amantadine, o telbivudine, o el inhibidor de otra diana en el ciclo vital del VHC es un inhibidor de helicasa, polimerasa, o metaloproteasa del VHC.