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ES2319063B1 - Compuesto de silica-vinilsulfona, sintesis y usos del mismo. - Google Patents

Compuesto de silica-vinilsulfona, sintesis y usos del mismo. Download PDF

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ES2319063B1 ES200702542A ES200702542A ES2319063B1 ES 2319063 B1 ES2319063 B1 ES 2319063B1 ES 200702542 A ES200702542 A ES 200702542A ES 200702542 A ES200702542 A ES 200702542A ES 2319063 B1 ES2319063 B1 ES 2319063B1
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Universidad de Granada
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Abstract

Compuesto de sílica-vinilsulfona, síntesis y usos del mismo.
Compuesto que comprende un soporte de silica funcionalizada con grupos vinilsulfona. Además, se refiere a su procedimiento de obtención y sus usos como inmovilizador de biomoléculas, y más concretamente de enzimas tales como invertasa, lactasa, peroxidasa o tiorredoxina h1, y de otras biomoléculas tales como glutatión, nitrosoglutation o biotina.

Description

Compuesto de sílica-vinilsulfona, síntesis y usos del mismo.
La presente invención se refiere a un compuesto de sílica conteniendo grupos vinilsulfona de fórmula general (I), a su procedimiento de obtención y a sus usos. Más particularmente, el uso de los compuestos de sílica en aplicaciones biotecnológicas.
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Estado de la técnica anterior
La inmovilización de macromoléculas a soportes sólidos se remonta a comienzos del siglo XX con los trabajos de Nelson y Griffin (cfr. Nelson, J.M. et al., 1916 J. Am. Chem. Soc., vol. 38, pp. 1109-1115) sobre inmovilización de invertasa. El interés inicial por los enzimas inmovilizados y su actividad catalítica se ha ido extendiendo a otras macromoléculas. En la actualidad, la inmovilización de macromoléculas sobre un soporte sólido y el concepto de afinidad entre moléculas juegan un papel central en lo que se ha dado en denominar la era de las "omics" (cfr. Sheldon, R. A., 2007, Adv. Synth. Catal., vol. 349, pp.1289-1307). En este contexto se han descrito numerosas aproximaciones para inmovilizar macromoléculas a soportes con el objetivo de fabricación de microarrays (cfr. Sun, H. et al., 2006, Anal. Bioanal. Chem, vol. 386, pp. 416-426; Sun, X-L, Stabler, C.L., Cazalis, C.S., Chaikif, E.L., 2006, Bioconjugate Chem. vol. 17, pp. 52-57).
A pesar de los avances, aún persiste la necesidad de efectuar una "activación" para promover dicha inmovilización. Básicamente, existen dos métodos para llevar a cabo la mencionada activación: (a) activación de la macromolécula a inmovilizar; o (b) activación del soporte.
La primera de las metodologías (activación de la macromolécula a inmovilizar) ha tenido una amplia difusión y uso. En este sentido, mediante técnicas de Biología Molecular las proteínas pueden ser "activadas" vía fusión a colas o péptidos/dominios proteicos que le confieren afinidad por el soporte. Esta estrategia ha dado lugar al desarrollo de distintos sistemas comerciales entre los que se encuentran: (a) Colas de histidina ("His-Tag") (cfr. Hengen, P., 1995, Trends Biochem Sci. vol. 20, pp. 285-286.) en combinación con soportes conteniendo Ni (Quiagen, IBA, Amershem-Bioscience, Clontech); (b) Fragmento de la haloalcano deshalogenasa ("Halo-Tag") en combinación con soportes con haloalcano (Promega); (c) SNAP: O6-alquilguanina- ADN alquiltransferasa (cfr. Keppler, A. et al. 2004 Methods vol. 32, pp. 337-344) en combinación con soportes conteniendo O6-bencilguanina (Covalys); (d) Colas conteniendo péptidos con afinidad por estreptavidina ("Strep-tag") (cfr. Schmidt, TGM, et al., 1996 J. Mol. Biol. vol. 255, pp. 753-766) en combinación con soportes conteniendo estreptavidina (Novagen, IBA, Quiagen, Stratagene); (e) Glutatión transferasa en combinación con soportes conteniendo glutatión (Novagen, Clontech o Amershan-Biosciences); (f) Proteína de unión a maltosa en combinación con soportes con maltosa, (New England Biolab); (g) Péptido de unión a calmodulina en combinación con soportes conteniendo calmodulina (Stratagene); (h) Dominio de unión a celulosa en combinación con soportes conteniendo celulosa (Novagen); (i) Péptido biotinilado in vivo (cfr. Cronan, J.E., 1990, J. Biol. Chem vol. 265, pp. 10327-10333) en combinación con soportes conteniendo avidina (Promega); (j) IMPACT Inteina en combinación con soportes conteniendo quitina (New Englad Biolabs). Esta aproximación está limitada a proteínas recombinantes y generalmente conduce a una inmovilización no covalente de la macromolécula, hecho que determina su aplicación en purificación de proteínas mediante cromatografía de
afinidad.
Otra opción para la activación de la macromolécula a inmovilizar es la introducción en su estructura de grupos químicos que le confieran reactividad o sobre los que se pueda llevar a cabo posteriores transformaciones químicas. Para proteínas, el grupo de elección es el grupo tiol (-SH) y la aproximación experimental usada es la mutagénesis dirigida o la fusión a una inteina (cfr. Girish, A., et al., 2005 Bioorg. Med. Chem. Lett., vol. 15, pp. 2447-
2451).
La segunda de las metodologías ("activación" de los soportes) supone la preparación de soportes sólidos conteniendo grupos funcionales reactivos para que reaccionen y formen un enlace covalente con las macromoléculas a inmovilizar. Los soportes que tradicionalmente se vienen empleando son la agarosa y el poliestireno. Los procedimientos clásicos de activación del soporte son: (a) el método de aminación reductiva (Pierce: agarosa y poliestireno funcionalizados con grupos tosil, tresil, epoxi, alquilamina, aldehído, hidrazida); (b) el método de cabonildiimidazol (Quiagen: poliestireno activado para reaccionar con SH, carboxi para ser activado con grupos succinimida o carbodiimida); (c) el método de la N-hidroxisuccinimida éster (Hispanagar: agarosa funcionalizada con grupos glioxal o aminoetil); (d) el método de la maleimida (Polygenetics: poliestireno funcionalizado con grupos amina ó CN); (e) el método de la hidrazida (Bangs Laboratories: poliestireno funcionalizado con grupos carboxi para ser activado con carbodiimida o grupos amino). Los grupos diana de la macromolécula son las aminas para los métodos (a), (b) y (c), los grupos tiol para el método (d) y los grupos aldehído, obtenidos por oxidación de carbohidratos, para el método
(e).
El uso de la sílica/vidrio como soporte para la inmovilización de macromoléculas ha cobrado recientemente interés. En la actualidad existen en el mercado (a) sílica con Concanavalina A (Biotech Support Group) que interacciona con carbohidratos, (b) sílica con ácidos grasos (Nimbus Biotechnology) para incorporación de proteínas de membrana y (c) sílica con albúmina sérica humana (Nimbus Biotechnology). Las estrategias de inmovilización para este soporte sólido son las mismas que las indicadas para los otros soportes: (a) fusión de la proteína a inmovilizar con colas de Histidina (HisLink Resin de Promega en combinación con sílica con Ni de Biotech Support Group), con GST (sílica con glutatión de Biotech Support Group) con péptidos que interaccionan con estreptavidina (sílicas con estreptavidina de Bangs Laboratories y de Polysciences), con péptidos que interacciona directamente con la sílica (Arg-Tag14, Si-Tag15) b) empleo de soportes funcionalizados que permitan su fácil activación y reacción con la macro-
molécula.
Por otro lado, las sulfonas \alpha,\beta-insaturadas (vinil sulfonas) son reconocidas como intermediarios sintéticos de gran utilidad debido fundamentalmente a su capacidad para participar en reacciones de adición 1,4 (aceptores de Michael) y en reacciones de cicloadición (como donores 2\pi). Adicionalmente, las vinilsulfonas son fáciles de preparar, a través de una amplia variedad de procesos sintéticos, y de manipular (Simphinks, N. S., 1990, Tetrahedron vol. 282, pp. 6951-6984; Meadows, D. C., et al., 2006, Med. Res. Rev. vol. 26(&) pp. 793-814). Estas características han encontrado recientemente utilidad en el diseño de fármacos y en química médica cuando se demostró su capacidad para inhibir de forma potente y reversible una variedad de procesos enzimáticos, fundamentalmente aquellos en los que están implicados cistein proteasas a las que se unen a través de reacciones de adición con el grupo tiol presente en el residuo de cisteína del sitio activo de estas enzimas. (cfr. Simphinks, N. S., 1990, Tetrahedron vol. 282, pp. 6951-6984; Meadows, D. C., et al., 2006 Med. Res. Rev. vol. 26(6), pp. 793-814).
La alta reactividad del grupo vinilsulfona ha sido explotada previamente en la preparación de distintos materiales conteniendo esta funcionalización: (i) poliestireno (comercializados por Aldrich) (ii) agarosa (comercializada por Gentaur) y (iii) sefarosa (comercializada por Affiland). Estos materiales han sido utilizados para el acoplamiento covalente con compuestos conteniendo grupos amina, tioles e hidroxilo habiendo encontrado aplicabilidad en la inmovilización de biomoléculas portadoras de estos grupos funcionales.
Además, el grupo vinilsulfona se usa en la preparación de intermedios de síntesis para la posterior obtención de materiales más elaborados, que contienen soportes de sílica. Estos materiales se suelen denominar resinas tiofílicas o "T-Gel" (cfr. Schwarz A. et al., 1994, Reactive Polymers vol. 22, pp. 256-266; GB 2 230 003 A; US 4,696,980; DE 10330204 A1). En este tipo de materiales el concepto clave es el de adsorción tiofílica descrito por Porath (cfr. Porath et al., 1984, Physical Chemistry of Colloids and Macromolecules, pp 137-142; Porath J. et al., 1985, FEBS vol. 185 (2), pp. 306-310). La adsorción tiofílica se basa en la afinidad de macromoléculas por resinas del tipo SOPORTE-O-CH_{2}-CH_{2}-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2}-S-R (R= un residuo alifático pequeño) y en la actualidad es usada como una técnica alternativa para la inmovilización no covalente y purificación de moléculas biológicas (cfr. Hutchens T.W. et al., 1987, Biochemistry vol. 26, pp. 7199-7204). Para la preparación de estas resinas tiofílicas la estrategia utilizada supone la reacción de divinilsulfona, como reactivo difuncional, con un compuesto de sílica conteniendo grupos hidroxilo, sílica recubierta con dextrano o grupos tiol obteniéndose así un material activado que se hace reaccionar normalmente in situ con tiol derivados sencillos.
Explicación de la invención
En la presente invención se proporciona un nuevo compuesto que comprende sílica funcionalizada con grupos vinilsulfona a través de una cadena conteniendo un grupo funcional del tipo tiol o amina. Además de proporcionar el procedimiento de obtención de los mismos y sus usos, en particular en la inmovilización de biomoléculas dentro del campo de la biotecnología.
El nuevo compuesto proporciona una técnica de inmovilización que no requiere ninguna estrategia de activación y que combina las propiedades de la sílica como soporte con la reactividad de la vinilsulfona con grupos presentes de forma natural en las biomoléculas en condiciones de reacción suaves compatibles con su naturaleza biológica.
El uso de sílica como material para soportar grupos vinilsulfona supone una serie de importantes ventajas con respecto a otros materiales poliméricos como, por ejemplo, polisacáridos o poliestireno:
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Estabilidad mecánica. El material puede ser sometido a agitación mecánica sin sufrir alteraciones en su tamaño lo que permite llevar a cabo procesos en "batch". Otro aspecto importante es la estabilidad a alta presión de la sílica lo que permite su uso en HPLC.
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Estabilidad química y biológica. El material no es susceptible de sufrir degradaciones por la acción de microorganismos y agentes químicos (por ejemplo ácidos).
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Estabilidad térmica. Es posible utilizar un amplio rango de temperaturas sin que el material sufra descomposiciones térmicas. El material es también susceptible de ser usado en procesos asistidos con microondas.
\circ
Independencia del disolvente. El material no sufre ni encogimiento ni hinchado como consecuencia de la acción de los disolventes. Además, no es soluble en ningún disolvente lo que facilita la operatividad.
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Facilidad de uso en lo que respecta, fundamentalmente, al manejo y pesado. No se requieren lavados extensos. El material no se pega ni al vidrio ni al plástico. Por estas razones, el material es susceptible de ser usado en procesos automatizados.
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Flexibilidad de formatos. Es posible preparar fácilmente sílicas funcionalizadas con un amplio rango de tamaños de partícula. Al no sufrir hinchamiento en contacto con disolventes estos materiales pueden ser empaquetados en una variedad de flujos a través de formatos tales como columnas de HPLC, cartuchos flash.
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Reproducibilidad. Permiten cargas de material exactas incrementando el grado de reproducibilidad en sus aplicaciones.
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Optimización de los recursos de partida: sílica, silanoles y divinilsulfona (DVS) que son productos de partida baratos. Optimización de las condiciones de reacción: temperatura ambiente, disolventes baratos y tiempo de reacción. Ambos factores permiten obtener un producto competitivo en el mercado.
Los materiales que se describen en el estado de la técnica, denominadas resinas tiofílicas o "T-Gel", han sido utilizados como soportes de cromatografía de afinidad explotándose las interacciones tiofílicas reversibles de este tipo de materiales con biomoléculas. La función vinilsulfona, en estos materiales, es utilizada para posibilitar la formación de grupos éter o tioeter en la construcción de las cadenas de tipo O-CH_{2}-CH_{2}-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2}-S-R unidas a los soportes. Sin embargo, en estas resinas tiofílicas, la función vinilsulfona ha sido utilizada para que los materiales que la contienen puedan llevar a cabo la unión no covalente en la inmovilización de biomoléculas. Mientras que en la invención se produce unión covalente en la inmovilización de biomoléculas con el uso del compuesto de sílica-
vinilsulfona.
Además, se ha comprobado, en la presente invención, que la incorporación de la función vinilsulfona a la sílica se puede realizar en más de una etapa usando bisvinilsulfonas a partir de sílica comercial. Se requiere el uso de un compuesto de sílica funcionalizada con grupos que tengan un carácter nucleófilo, preferentemente grupos tioles o aminos, con capacidad para reaccionar fácilmente con bisvinilsulfonas. Estos grupos tioles o aminos pueden estar unidos al soporte inorgánico a través de un espaciador de longitud y naturaleza variable. Sin embargo, la utilización de sílicas funcionalizadas conteniendo aminas primarias no es factible dado que en la reacción de estos compuestos con bisvinilsulfonas se produce una segunda ciclación intramolecular con formación de compuestos cíclicos. La solución a este inconveniente supone la preparación de un compuesto de sílica conteniendo aminas secundarias que en la reacción con bisvinilsulfonas permiten la obtención de los compuestos de sílica de la
invención.
Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I):
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Donde:
n representa la unión entre el Si y X mediante un grupo alquilo, sustituido o no sustituido, donde el número de carbonos dependerá del valor de n.
n tiene valores comprendidos entre 0 y 15, preferiblemente 2, 3 ó 11 y más preferiblemente 3.
X es un átomo de azufre (S) o de nitrógeno (N). Cuando X es S, el grupo R^{1} no existe.
R^{1} es un grupo seleccionado de entre un alquilo(C_{1}-C_{10}), sustituido o no sustituido, o un alquenilo(C_{1}-C_{10}), sustituido o no sustituido. Preferiblemente R^{1} es un grupo metilo.
Y puede ser un grupo -SO_{2}R^{2}, donde R^{2} es un alquilo(C_{1}-C_{10}) o un dialquilarilo ((C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10})). En una realización preferida del compuesto de sílica de la presente invención, Y no existe.
3, representa un soporte poroso de sílica.
Por "alquilo" se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbonos, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, etc.
Por "alquenilo" se refiere en la presente invención a un radical alquilo que tiene entre 1 y 10 átomo de carbono y que tiene uno o más enlaces insaturados. Los radicales alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como un arilo, halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto, etc.
En una realización preferida, el compuesto de la invención puede ser:
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4 
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5 
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Otro aspecto de la presente invención se refiere al procedimiento de obtención del compuesto de fórmula general (I) que comprende:
a.
Obtención de sílica funcionalizada con grupos tiol o amina.
b.
Reacción del compuesto de sílica obtenido en el paso (a) con divinilsulfona en presencia de una base orgánica.
Una realización preferida del procedimiento de la invención comprende una amina terciaria como base orgánica que se puede seleccionar del grupo que comprende, sin limitarse a, trietilamina o diisopropiletilamina.
Otra realización más preferida del procedimiento de la invención, comprende en la reacción del paso (b) el uso de disolventes que se pueden seleccionar entre mezclas de THF con un alcohol como, por ejemplo isopropanol o terc-butanol, preferiblemente isopropanol.
\newpage
A continuación se describe esquemáticamente el procedimiento de la invención:
6
n, X, R^{1} e Y están descritos anteriormente.
Otro aspecto más de la presente invención, se refiere al compuesto N-alquil o alquenil-aminopropil-sílica (V), obtenido en el paso (a) del procedimiento de obtención del compuesto de sílica de la invención y cuya fórmula es:
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7 
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donde n y R^{1} están descritos anteriormente, preferentemente n=3 y/o R^{1} es metilo(Me).
Más preferiblemente, el compuesto puede tener la fórmula (VI)
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8 
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Aún otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula general (I) para inmovilizar biomoléculas. Esta inmovilización se produce mediante la unión covalente entre la biomolécula y el grupo vinilsulfona presente en el compuesto de la invención. Este método de inmovilización covalente se lleva a cabo en condiciones de reacción suaves que son compatibles con la naturaleza biológica de las biomoléculas a través de grupos funcionales ya presentes en las mismas macromoléculas en un número considerable y accesible, por lo que no hay que realizar modificaciones químicas o mutagénesis dirigida para funcionalizarlas. La alta reactividad de la función vinilsulfona, en el compuesto de la invención, permite inmovilizar una amplia variedad de biomoléculas. Se describen varios casos en los que se pone de manifiesto la capacidad de inmovilización covalente de diferentes biomoléculas en términos de peso molecular, punto isoeléctrico y función. Los ejemplos se refieren, pero sin limitarse, a la posibilidad de unir el compuesto de la invención a enzimas (invertasa, lactasa y peroxidasa), para poner de manifiesto que tras la inmovilización mantienen la actividad catalítica, y a péptidos/proteínas (glutatión, nitroso glutatión y tiorredoxina h del guisante), para demostrar que la inmovilización transforma la sílica-vinilsulfona en un soporte de cromatografía de afinidad apto para la purificación y experimentos de "pull- down".
Además, el compuesto de fórmula general (I) puede inmovilizar cualquier biomolécula que tenga grupos amina y/o tioles y usarse como soportes cromatográficos para cromatografía de afinidad según la necesidad en cada momento. Los resultados son extrapolables a lípidos y carbohidratos y otros sistemas que reaccionen con la vinilsulfona.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
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Breve descripción de las Figuras
Fig 1. Muestra la variación de la concentración de invertasa en solución (no inmovilizada) en función del tiempo de reacción con el compuesto de sílica-vinilsulfona a dos temperaturas.
Fig 2. Muestra la actividad enzimática de la invertasa inmovilizada. Variación del poder rotatorio (producto de la actividad catalítica del enzima inmovilizada) de una solución de sacarosa en contacto con la invertasa inmovilizada a dos temperaturas.
Fig 3. Muestra un estudio de la viabilidad de inmovilizar la lactasa sobre columnas de compuesto de sílica-vinilsulfona previamente empacadas. Poder rotatorio específico (alfa) de la muestra a distintos intervalos de tiempo. La hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa origina un incremento de alfa.
Fig 4. Muestra un cromatograma del experimento de "pull-down" con nitrosoglutatión inmovilizado.
Fig 5. Muestra la electroforesis bidimensional de las fracciones recogidas en el experimento de "pull-down" llevadas a cabo con tiorredoxina h-1 del guisante, inmovilizada sobre el compuesto de sílica-vinilsulfona.
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Exposición detallada de modos de realización
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de la invención.
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Ejemplo 1
Preparación del compuesto de sílica-vinilsulfona de fórmula (II)
Primeramente, se transformó sílica en el derivado mercaptopropil-sílica (IV). Este derivado es un compuesto conocido (cfr. Howard, A.G et al., (1987), Analyst vol. 112, pp. 159) que se obtiene por reacción de sílica con 3-mercaptopropiltrimetoxisilano y que también se puede obtener comercialmente (Silicycle).
El compuesto de fórmula (II) se obtuvo por reacción del compuesto (IV) con divinilsulfona según el siguiente procedimiento: La mercaptopropil-sílica (1 g) se suspendió en una mezcla de THF-isopropanol (1:2, 10 mL) que se burbujea con argón para posteriormente añadir DVS (0.515 mL, 5 eq) y trietilamina (0.028 mL, 0.2 eq). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 16 h. Tras ese tiempo, se filtró el compuesto resultante de fórmula (II) que fue lavado con acetona y secado en una estufa de vacío a 50ºC.
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Ejemplo 2
Preparación del compuesto de sílica-vinilsulfona de fórmula (III)
El compuesto de formula (III) se obtuvo en un procedimiento de dos etapas:
a)
Primero se obtuvo el compuesto 3-(metilamino)-propil-sílica, de fórmula (V) (X=N R^{1}=Me), por silanización de sílica: Se suspendió sílica (5 g) activada previamente por tratamiento térmico (120ºC a vacío durante 24 h) en tolueno (25 mL) y se adicionó 3-(metilamino)-propil-trimetoxisilano (1,250 g),calentándose a reflujo durante 2 h. Se evaporó un 20% del disolvente (5 mL) y se volvió a poner a reflujo durante 1 h adicional. El compuesto resultante de fórmula (V) se filtra y seca.
b)
Reacción del compuesto 3-(metilamino)-propil-sílica (V, X=N R^{1}=Me) con DVS: 1.53 g del compuesto de fórmula (V) fueron suspendidos en una mezcla de THF-isopropanol (1:2, 10 mL) y se le añadió DVS (0.640 mL, 5 eq). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 16 h. Tras ese tiempo, el compuesto resultante de fórmula (III) se filtró y lavó sucesivamente con metanol y cloruro de metileno, secándose posteriormente en una estufa de vacío a 50ºC.
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Ejemplo 3
Protocolo general de inmovilización en discontinuo ("batch")
A una suspensión de sílica-vinilsulfona de fórmula (II) ó (III) (0.5 g) en un tampón que no contenga aminas libres, como por ejemplo fosfato o HEPES, de fuerza iónica moderada (50 - 200 mM) y pH básico (7,5 -8,7) (10 mL) se adicionó la molécula a inmovilizar (0.6 micromoles) y se dejaron reaccionar durante tiempo suficiente (entre 6 horas y 10 horas) con agitación. Posteriormente se adicionó mercaptoetanol (8 micromoles) y se agitó durante 1 hora. Los excesos de reactivos se eliminaron mediante sucesivos lavados con una solución de NaCl 2M y la resina (proteína inmovilizada en la sílica-vinilsulfona) se equilibró con el tampón en el que se realizaron los experimentos
posteriores.
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Ejemplo 4
Protocolo general de inmovilización en columna
La inmovilización de una biomolécula puede ser llevada a cabo directamente sobre sílica-vinilsulfona empacada en una columna haciendo recircular una solución de la biomolécula de interés en un tampón que no contenga aminas libres, como por ejemplo fosfato o HEPES, de fuerza iónica moderada (50 - 200 mM) y pH básico (7,5 -8,7) durante un tiempo suficiente (en función del flujo de la columna y del volumen de la solución de macromolécula. A modo de ejemplo, para 49 ml de solución de macromolécula y un flujo de de 0.5 ml/min, el tiempo de reacción fue de 14 horas). El empacado se llevó a cabo suspendiendo la sílica vinil-sulfona en el tampón anteriormente mencionado y de forma general se utilizaron 3 g de sílica vinil sulfona/micromol de biomolécula. Para bloquear los grupos vinilsulfona que no hayan reaccionado se trató el material con una disolución de \beta-mercaptoetanol (16 micromoles por gramo de vinil-sílica empacada) durante tiempo suficiente (en función del flujo de la columna y del volumen de la solución) a temperatura ambiente. Este protocolo permite la transformación directa de vinil-sílica previamente empacada en una columna cromatográfica y/o reactor enzimático basado en la macromolécula que se inmoviliza.
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Ejemplo 5
Inmovilización de la invertasa
La invertasa (beta-fructofuranosidasa [EC3.2.1.26]), enzima que cataliza la hidrólisis de sacarosa en fructosa y glucosa, es elegida como enzima modelo teniendo en cuenta que (a) la proteína es comercial, (b) el sustrato es barato, (c) la actividad puede ser fácilmente medida en el laboratorio y (d) tiene aplicación industrial en el sector alimentario, donde se prefiere la fructosa sobre la glucosa por ser más dulce y no cristalizar tan fácilmente.
La inmovilización de invertasa de levadura comercial (10 mg, Sigma I-4504) se realizó según el protocolo general mediante una reacción en discontinuo ("batch"). El estudio de la influencia de la temperatura sobre la reacción (Fig. 1) muestra que a las 10 horas la reacción es completa, independientemente de la temperatura utilizada (temperatura ambiente ó 4ºC). El análisis de la funcionalidad de la invertasa inmovilizada (Fig. 2) demuestra que el enzima mantiene su actividad.
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Ejemplo 6
Inmovilización de la lactasa
La lactasa (glicosidasa hidrolasa [EC3.2.1.23]), enzima que cataliza la hidrólisis de lactosa en glucosa y galactosa, es elegida como enzima a inmovilizar teniendo en cuenta el alto interés que ello tiene tanto en la industria alimentaria, dado que la lactosa es poco soluble y su capacidad edulcorante es insuficiente, como en medicina, debido a la intolerancia a este disacárido.
La inmovilización de lactasa de Kluyveromyces lactis (Sigma G-3665) se llevó a cabo en columna, siguiendo el protocolo general arriba indicado, empacando la sílica-vinil sulfona (2.5 g) y haciendo recircular una solución de lactasa (49 mL) a temperatura ambiente a un flujo de 0.5 mL/min.
Para estudiar la actividad de la enzima inmovilizada se midió el poder rotatorio específico de la muestra de lactosa a distintos intervalos de tiempo sobre la base de que la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa origina un incremento del poder rotatorio (Fig. 3). El estudio muestra que la inmovilización de lactasa sobre sílica-vinilsulfona previamente empacada es factible y que el material así obtenido mantiene la actividad del enzima.
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Ejemplo 7
Inmovilización de peroxidasa
Las peroxidasas [EC1.11.1.x] son enzimas que catalizan la reducción de peróxido de hidrógeno con la ayuda de un sustrato que pierde dos átomos de hidrógeno. Los enzimas con capacidad redox son capaces de provocar la polimerización de compuestos fenólicos en presencia de peróxido de hidrógeno. Estos polímeros fenólicos son inocuos o menos tóxicos e insolubles en agua, facilitando su eliminación. En este contexto la inmovilización de peroxidasa es interesante. Además, al tratarse de una glicoproteína es un buen modelo para demostrar la capacidad de la sílica vinil-sulfona en la inmovilización de este tipo de biomoléculas. En concreto se seleccionaron las peroxidasas de rabano picante y alcachofa.
La inmovilización de las peroxidasa (10.9 mg) fue llevada a cabo usando el protocolo general mediante una reacción en discontinuo ("batch").
Para demostrar que la inmovilización de peroxidasa de alcachofa ha tenido lugar se midió la actividad enzimática. El enzima inmovilizado es activo.
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Ejemplo 8
Inmovilización de glutatión
El glutatión es un tripéptido de interés en biotecnología como elemento presente en resinas comerciales de uso en purificación de proteínas de fusión con glutatión-S- transferasa (GST) basadas en la afinidad de la GST por el glutatión inmovilizado (cfr Smith, D.B. and Johnson, K.S.,1988, Gene vol. 67, pp. 31-40). Las proteínas diana se purifican casi a homogeneidad en un solo paso y las condiciones de elución con glutation reducido son suaves, evitando desnaturalización de la proteína.
La inmovilización de glutatión comercial (2.4 mg Sigma G4251) se realizo según el protocolo general mediante una reacción en "batch" usando 1 g de sílica-vinil-sulfona. Los grupos vinilsulfona que no han reaccionado se bloquean con \beta-mercaptoetanol (563 \muL).
La sílica-glutatión fue empacada en una columna y empleada para purificar una proteína de fusión con GSH. Un lisado de un cultivo de bacterias que expresaron la proteína de fusión se pasó a través de la columna de sílica-glutatión. Se lavó la columna con 200 ml de HEPES 100 mM pH 7,5 y NaCl 200 mM. La elución se realizó con 50 mM de glutatión en 50 mM Tris-HCI pH 7,5.
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Ejemplo 9
Inmovilización de nitrosoglutatión
El S-nitrosoglutatión (GSNO) es un tripéptido que transfiere NO a proteínas con grupos tiol. Dada la importancia del óxido nítrico como molécula implicada en aspectos claves de la regulación de los sistemas inmune, cardiovascular y nervioso, la inmovilización de GSNO se llevó a cabo para poder obtener un soporte de afinidad cromatográfica basado en este péptido y poder realizar experimentos de "pull-down" para identificar proteínas susceptibles de ser nitrosadas (proteínas diana).
La preparación de este material se llevó a cabo en un proceso en tres etapas:
a)
Inmovilización de L-glutatión oxidado (GSSG) comercial (2.5 mg Sigma G4501). Se lleva a cabo según el protocolo general en "batch" usando 1 g de resina. Los grupos vinilsulfona que no han reaccionado se bloquean por tratamiento con \beta-mercaptoetanol (563 \muL).
b)
Reducción del GSSG y desprotección del grupo -SH del L-glutatión (GSH) inmovilizado. Se lleva a cabo por tratamiento del material obtenido en la anterior etapa con DTT (14 mg) durante 2 h. a 20ºC.
c)
Nitrosación del GSH inmovilizado y obtención de sílica-GSNO. Se lleva a cabo según el procedimiento de Lamas y col. (Biochem J. 2000, 349, 567) por tratamiento con HCl 10 mM y NaNO_{2} 10 mM (10 mL) durante 1 h a 20ºC. Se filtra y repite el tratamiento durante 30 min. Se filtra y lava con HEPES 40 mM pH 7.5 y NaCl 50 mM.
\newpage
Para comprobar la eficacia de la inmovilización y la aplicabilidad de la sílica-GSNO, se procedió a realizar un experimento de "pull-down" a partir de un extracto de girasol según el procedimiento que se indica: la sílica-GSNO se empacó usando 250 ml de HEPES 50 mM pH 7.5 y NaCl 50 mM. Se cargó un extracto de girasol (150 ml), se lavó con NaCl 200 mM para despegar las proteínas unidas a la columna mediante interacciones no específicas y se eluyó selectivamente con fuerza iónica (1.5 M NaCl) y con poder reductor (10 mM DTT en 1.5 M NaCl). El cromatograma obtenido (Fig. 4) muestra que los picos de proteína eluida (Absorbancia a 280) presentaban la señal característica del enlace S-NO (Absorbancia a 340), es decir, que las proteínas retenidas por la resina son y/o se han nitrosado, por lo que constituyen potenciales dianas del GSNO.
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Ejemplo 10
Inmovilización de tiorredoxina h1
Las tiorredoxinas, enzimas redox que actúan como interruptores que modulan la actividad de numerosas proteínas vía el intercambio de puentes disulfuro, han sido elegidas como proteínas de interés para demostrar la eficacia de la sílica vinil-sulfona para la inmovilización de proteínas. La inmovilización de la tiorredoxina h1 de guisante no es conocida y experimentos de "pull-down" son una estrategia viable para identificarla.
La inmovilización de la tiorredoxina h1 de guisante recombinante con cola de His expresada en E. coli (6.08 mg) fue llevada a cabo usando el protocolo general mediante una reacción en "batch" y la alta reactividad de los restos de histidinas presentes en la cola de esa proteína hacia los grupos vinil-sulfona es aprovechada para favorecer la orientación de la molécula (la molécula reaccionará preferentemente con la cola de polihistidina, que está en la cara opuesta al centro activo, por lo que éste queda accesible).
Para demostrar la inmovilización de la tiorredoxina h1 y la aplicabilidad del material obtenido se llevaron a cabo experimentos de "pull-down" siguiendo el esquema de elución expuesto en el ejemplo anterior: se pasa el extracto, se lava la columna con 200 mM NaCl para despegar las proteínas unidas a la columna mediante interacciones no específicas y se eluye selectivamente con fuerza iónica (1.5 M NaCl) y con poder reductor (10 mM DTT en 1.5 M NaCl). Una electroforesis bidimensional (Fig. 5) de las fracciones recogidas en el experimento revela que sólo unas pocas proteínas han sido retenidas por la columna, lo cual apoya la especificidad de la interacción y la viabilidad de la sílica-vinilsulfona como resina sobre la que llevar a cabo experimentos de "pull-down".
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Ejemplo 11
Inmovilización de biotina
La inmovilización de aminobiotina comercial (0.1 g de biotina Merck) se llevó a cabo usando el protocolo general mediante una reacción en "batch" con las siguientes modificaciones: 1.25 g de resina, una mezcla de THF-isopropanol (2:1, 10 ml) como disolvente y trietil amina (38 mg) como base. Tras un periodo de reacción de 14 h, se filtró y lavó con cloruro de metileno:metanol (1:1).
Para demostrar que la inmovilización de biotina ha tenido lugar se llevó a cabo una cromatografía de afinidad para el aislamiento y purificación de avidina.

Claims (17)

1. Compuesto de fórmula general (I):
9
donde:
n tiene valores comprendidos entre 0 y 15.
X es S ó N.
R^{1} es un grupo seleccionado de entre un alquilo (C_{1}-C_{10}), sustituido o no sustituido, o un grupo alquenilo(C_{1}-C_{10}), sustituido o no sustituido.
Y no existe o es el grupo -SO_{2}R^{2}, donde R^{2} es un grupo alquilo (C_{1}-C_{10}) o un dialquilarilo ((C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10})).
2. Compuesto según la reivindicación 1, donde n tiene un valor de 3.
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde X es S.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde X es N.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4, donde R^{1} es metilo.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde Y no existe.
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 6, de fórmula (II)
10
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 6, de fórmula (III)
11
9. Método de obtención de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende:
a.
obtención de sílica funcionalizada con grupos tiol o amina;
b.
reacción del compuesto de sílica obtenida en el paso (a) con divinilsulfona en presencia de una base orgánica.
10. Método según la reivindicación 9, donde la base orgánica usada en el paso (b) es trietilamina.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, que además comprende el uso de THF-isopropanol como disolvente de la reacción del paso (b).
12. Compuesto de fórmula general (V):
12
donde n y R^{1} están descritos en la reivindicación 1.
13. Compuesto según la reivindicación 12, donde n es 3.
14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde R^{1} es metilo.
15. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como inmovilizador de biomoléculas.
16. Uso del compuesto según la reivindicación 15, donde las biomoléculas son enzimas, glutatión, nitrosoglutatión o biotina.
17. Uso del compuesto según la reivindicación 16, donde los enzimas se seleccionan de entre invertasa, lactasa, peroxidasa o tiorredoxina h1.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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US6802966B2 (en) * 2001-08-14 2004-10-12 W. R. Grace & Co. Conn. Solid compositions for selective adsorption from complex mixtures
DE10330204A1 (de) * 2003-07-03 2005-02-03 Universität Tübingen Verfahren zum Aufbringen von Substanzen auf unporöse Kieselgel-Nanopartikel
US7285674B2 (en) * 2004-05-06 2007-10-23 Interuniversitair Microelektronica Centrum (Imec) Silane molecules with pre-activated and protein-resistant functionalities and silane films comprising such molecules

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCHWARZ, A. et al. "{}Novel sulfone-based thiophilic ligands for the high-performance liquid chromatographic purification of antibodies"{}. Reactive Polymers, 1994, Volumen 22, páginas 259-266. Ver página 263, figura 1. *

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