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ES2314099T3 - Oligonucleotidos inmunoestimulantes con motivos combinados con actividad mejorada. - Google Patents

Oligonucleotidos inmunoestimulantes con motivos combinados con actividad mejorada. Download PDF

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ES2314099T3
ES2314099T3 ES02768621T ES02768621T ES2314099T3 ES 2314099 T3 ES2314099 T3 ES 2314099T3 ES 02768621 T ES02768621 T ES 02768621T ES 02768621 T ES02768621 T ES 02768621T ES 2314099 T3 ES2314099 T3 ES 2314099T3
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ES
Spain
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cancer
odn
nucleic acid
immunostimulatory nucleic
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Expired - Lifetime
Application number
ES02768621T
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English (en)
Inventor
Arthur M. Krieg
Jorg Vollmer
Eugen Uhlmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Coley Pharmaceutical GmbH
University of Iowa Research Foundation UIRF
Original Assignee
Coley Pharmaceutical GmbH
University of Iowa Research Foundation UIRF
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Publication date
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Abstract

Un ácido nucleico inmunoestimulante de 14-100 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la fórmula: 5'' PX1DCGHX2 3'' o 5'' X1DCGHX2P 3'' en la que X1 y X2 son independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud, D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina, H es una base distinta de G y P es una secuencia que contiene palíndromo rica en CG de al menos 10 bases de longitud, en la que a) H es timina (T) y X2 es CGTTT o CGTTTT, b) P es completamente palindrómico, H es T y X2 se selecciona del grupo consistente en CG, CGT, CGTT, CGTTT y CGTTTT y/o c) P incluye al menos una hipoxantina (I).

Description

Oligonucleótidos inmunoestimulantes con motivos combinados con actividad mejorada.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a ácidos nucleicos inmunoestimulantes, a composiciones de los mismos y a métodos de uso de los ácidos nucleicos inmunoestimulantes.
Antecedentes
Son conocidas en la técnica dos clases principales de secuencias inmunoestimulantes que tienen diferentes perfiles de actividad inmunoestimulante. Krieg A.M. (2001) Trends Microbiol. 9: 249-252. Estas son los denominados oligodesoxinucleótidos (ODN) de CpG de clase B, que son fuertes activadores de células B, y los ODN de CpG de clase A, que son fuertes activadores de linfocitos citolíticos naturales (NK). Además de estas secuencias inmunoestimulantes, son conocidas al menos dos clases de secuencias neutralizantes, incluyendo secuencias de CpG en las que el CG está precedido por una C o seguido por una G (Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12631-12636), y secuencias de ADN en las que el CG está metilado. Es un motivo neutralizante un motivo que tiene cierto grado de capacidad inmunoestimulante cuando está presente en un motivo por lo demás no estimulante pero que, cuando está presente en el contexto de otros motivos inmunoestimulantes, sirve para reducir el potencial inmunoestimulante de los otros motivos.
Se han descrito también ácidos nucleicos inmunoestimulantes ricos en pirimidina y ácidos nucleicos inmunoestimulantes que tienen un motivo TG que no requieren la presencia de un motivo CpG (número de solicitud de patente internacional PCT/US00/26383). De forma interesante, se encontró que las secuencias de poli-T y los motivos TG eran rasgos estructurales importantes para conferir actividad inmunoestimulante.
Sumario de la invención
Se proporciona en la presente memoria una nueva clase de ácidos nucleicos inmunoestimulantes. En algunos casos, estos ácidos nucleicos tienen un palíndromo rico en CG o un motivo neutralizante rico en CG. Los solicitantes reconocieron y describieron anteriormente oligodesoxinucleótidos (ODN) que contenían motivos neutralizantes consistentes en repeticiones de la secuencia CG tales como CGCGCG o un dinucleótido CG precedido de una C (concretamente CCG) y/o seguido de una G (concretamente CGG, CCGG). Se creía que estos motivos neutralizantes causaban cierta reducción de los efectos estimulantes de ODN que contienen CpG en múltiples lecturas, tales como la secreción de IL-6, IL-12, IFN-\gamma, TNF-\alpha y la inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12631-12636.
La presente invención está basada en parte en el sorprendente descubrimiento por los solicitantes de que ciertos ODN que contienen una combinación de motivo estimulante y motivo neutralizante son altamente inmunoestimulantes. La presente invención está también basada en parte en el sorprendente descubrimiento por los solicitantes de que los ODN que tienen ciertas secuencias palindrómicas ricas en CG, incluyendo secuencias palindrómicas que contienen motivos neutralizantes, son altamente inmunoestimulantes. El motivo neutralizante, por tanto, puede pero no tiene por qué aparecer en el contexto de una secuencia palindrómica para ser altamente inmunoestimulante.
Además, los ODN inmunoestimulantes de la presente invención tienen efectos inmunoestimulantes asociados anteriormente a ambas de las dos clases distintas de ODN de CpG, aquellos que activan característicamente células B (ODN de CpG de clase B) y aquellos que activan característicamente células NK e inducen la producción de interferón (IFN)-\alpha (ODN de CpG de clase A). Los ODN inmunoestimulantes novedosos de la presente invención tienen por tanto un espectro de efectos inmunoestimulantes distinto de los ODN de CpG de clase A o los ODN de CpG de clase B. La nueva clase de ODN inmunoestimulantes de la presente invención se designa como ODN de CpG de tipo C. Como se describe con mayor detalle a continuación, en ciertas realizaciones los ODN de la presente invención implican una combinación de motivos en la que un motivo es un palíndromo rico en CG o un motivo neutralizante y otro motivo es un motivo estimulante, por ejemplo, un motivo CpG o la secuencia TCGTCG.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer aspecto, se proporciona un ácido nucleico inmunoestimulante de 14-100 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la fórmula:
5' PX_{1}DCGHX_{2} 3' o 5' X_{1}DCGHX_{2}P 3'
en la que X_{1} y X_{2} son independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud, D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina, H es una base distinta de G y P es una secuencia que contiene palíndromo rica en CG de al menos 10 bases de longitud, en la que
a) H es timina (T) y X_{2} es CGTTT o CGTTTT,
b) P es completamente palindrómico, H es T y X_{2} se selecciona del grupo consistente en CG, CGT, CGTT, CGTTT y CGTTTT y/o
c) P incluye al menos una hipoxantina (I).
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene una secuencia de bases que comprende 5' X_{1}DCGHX_{2}PX_{3} 3', 5' X_{1}DCGHPX_{3} 3', 5' DCGHX_{2}PX_{3} 3', 5' TCGHX_{2}PX_{3} 3' o 5' DCGHPX_{3} 3'. X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud. En otras realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene una secuencia de bases que comprende 5' DCGHP 3'.
Opcionalmente, D y/o H son timina (T).
En un segundo aspecto, se proporciona un ácido nucleico inmunoestimulante de 14-100 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la fórmula:
5' NX_{1}DCGHX_{2} 3' o 5' X_{1}DCGHX_{2}N 3'
en la que X_{1} y X_{2} son independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud. D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina, H es una base distinta de G y N es una secuencia neutralizante de células B que empieza por CGG y es de al menos 10 bases de longitud, en el que:
1)
para 5' NX_{1}DCGHX_{2} 3':
a)
H es timina (T) y/o
b)
H es T y X_{2} se selecciona del grupo consistente en CG, CGT, CGTT, CGTTT y CGTTTT, y
2)
para 5' X_{1}DCGHX_{2}N 3':
a)
H es T y X_{2} es CGTTTT.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, C está no metilada.
N incluye al menos cuatro dinucleótidos CG y no más de dos trinucleótidos CCG en algunas realizaciones.
Opcionalmente, P incluye al menos una hipoxantina (I).
La secuencia de bases puede incluir también una secuencia poli-T en el extremo 5' o el extremo 3'.
En un tercer aspecto, se proporciona un ácido nucleico inmunoestimulante de 13-100 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la fórmula
5' N_{1}PyGN_{2}P 3'
en la que N_{1} es cualquier secuencia de 1 a 6 bases de longitud, Py es una pirimidina, G es guanina, N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de longitud y P es una secuencia que contiene un palíndromo rica en GC de al menos 10 bases de longitud, en la que N_{1}:
a)
incluye al menos un motivo citosina-hipoxantina (CI),
b)
incluye al menos un motivo TCI,
c)
incluye al menos un motivo IG,
d)
incluye al menos un motivo TIG, y/o
e)
es TCGG.
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones, N_{1} es al menos un 50% de pirimidinas y preferiblemente al menos un 50% de T. En otras realizaciones, N_{1} incluye al menos un motivo CG o al menos un motivo TCG. N_{1} es TCGH en otras realizaciones, en las que H es un nucleótido distinto de G.
En algunas realizaciones, Py es una C no metilada.
En algunas realizaciones, N_{2} es al menos un 50% de pirimidinas o al menos un 50% de T. En otras realizaciones, N_{2} no incluye ningún motivo poli-G ni poli-A.
En algunas realizaciones, P es completamente palindrómico. En otras realizaciones, P es un palíndromo que tiene entre 1 y 3 nucleótidos intercalados consecutivos. Opcionalmente, los nucleótidos intercalados pueden ser TG. En otras realizaciones, P incluye al menos 3, 4 ó 5 nucleótidos C y al menos 3, 4 ó 5 G. Según otras realizaciones, P incluye al menos una hipoxantina.
En una realización, el palíndromo rico en GC tiene un contenido de bases de al menos dos tercios de G y C. En otras realizaciones, el palíndromo rico en CG tiene un contenido de bases de al menos un 81% de G y C. En algunas realizaciones, el palíndromo rico en GC es de al menos 12 nucleótidos de longitud. El palíndromo rico en GC puede estar compuesto exclusivamente por C y G. En algunas realizaciones, el palíndromo rico en GC puede incluir al menos un nucleótido que no es C ni G.
En algunas realizaciones, el palíndromo rico en GC incluye al menos un trímero CGG, al menos un trímero CCG o al menos un tetrámero CGCG. En algunas realizaciones, el palíndromo rico en GC incluye al menos cuatro dinucleótidos CG. En ciertas realizaciones preferidas, el palíndromo rico en GC tiene un dinucleótido CG central.
En ciertas realizaciones, el palíndromo rico en GC es CGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 23), CGGCGGCCGCCG (SEC ID Nº 28), CGACGATCGTCG (SEC ID Nº 68) o CGACGTACGTCG (SEC ID Nº 69).
En ciertas realizaciones, el palíndromo rico en GC no es CGCGCGCGCGCG (SEC ID Nº 29), GCGCGCGCGCGC (SEC ID Nº 30), CCCCCCGGGGGG (SEC ID Nº 31), GGGGGGCCCCCC (SEC ID Nº 32), CCCCCGGGGG (SEC ID Nº 33) ni GGGGGCCCCC (SEC ID Nº 34).
En algunas realizaciones, N_{1}PyGN_{2} es una secuencia seleccionada del grupo consistente en TTTTTCG, TTTCG, TTTTCG, TTCGT y TTTCGT.
En un cuarto aspecto, se proporciona un ácido nucleico inmunoestimulante de 13-100 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la fórmula:
5' N_{1}PyG/IN_{2}P 3'
en la que N_{1} es cualquier secuencia de 1 a 6 bases de longitud, Py es una pirimidina, G/I designa una sola base que es una G o una I, G es guanina e I es hipoxantina, N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de longitud, y P es una secuencia que contiene un palíndromo de al menos 10 bases de longitud en la que, cuando G/I es G, P es un palíndromo rico en IC.
En algunas realizaciones, P es un palíndromo rico en GC. En otras realizaciones, P es un palíndromo rico en IC.
N_{1}PyIN_{2} es en algunas realizaciones TCITCITTTT (SEC ID Nº 47).
Las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria pueden tener cualquier tipo de composición de cadena principal. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene una cadena principal completamente resistente a nucleasa. La cadena principal resistente a nucleasa puede estar compuesta por enlaces fosforotioato. En otras realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene una cadena principal completamente fosfodiéter. En aún otras realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene una cadena principal quimérica. En una realización, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene al menos un enlace fosfodiéster entre un motivo CG, CI o IG. Como alternativa, los ODN de la presente invención se formulan con micropartículas, emulsiones u otros medios para evitar una digestión rápida in vivo.
Las moléculas de ácido nucleico inmunoestimulantes descritas en la presente memoria tienen una variedad de longitudes. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulante es de 13-100, 13-40, 13-30, 14-100, 14-40 ó 14-30 nucleótidos de longitud o cualquier entero entre estos.
Se proporciona también un ácido nucleico inmunoestimulante que tiene una secuencia de bases que comprende una de las siguientes secuencias: TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 1), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGC
CG (SEC ID Nº 4), TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG (SEC ID Nº 5), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (SEC ID Nº 6), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (SEC ID Nº 7), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (SEC ID Nº 12), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 13), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (SEC ID Nº 14), en la que Z es 5-metilcitosina, TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (SEC ID Nº 11), TCGTCGTTTTCGGCGGCC
GACG (ODN 5513, SEC ID Nº 64), TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514, SED ID Nº 65), TCGTCGTT
TTCGACGGCCGCCG (ODN 5515, SEC ID Nº 66) y TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG (ODN 5516, SEC ID Nº 67).
Adicionalmente según otras realizaciones de la invención, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene una secuencia de bases consistente en una de las siguientes secuencias: TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (ODN 2395), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 2429), TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG (ODN 2430), TCGTCGTT
TTCGGCGCCGGCCG (ODN 2431), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (ODN 2432), TCGTCGTTTTCGGCGC
GCGCCGTTTTT (ODN 2452), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG (ODN 5315), TZGTZGTTTTZGGZGGZGZ
GZGZZG (ODN 5327, en la que Z es 5-metilcitosina), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG (ODN 5513), TCGTCG
TTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514), TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG (ODN 5515), TCGTCGTTTTCGGCG
GCCGTCG (ODN 5516), TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (ODN 2451), TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG
(ODN 20173, SEC ID Nº 71), TCGTCGTTTCGACGATCGTCG (ODN 20176, SEC ID Nº 72), TCGTCGTTTC
GACGTACGTCG (ODN 20177, SEC ID Nº 73), TCGTCGCGACGGCCGTCG (ODN 20178, SEC ID Nº 74), TCGT
CGCGACGATCGTCG (ODN 20179, SEC ID Nº 75), TCGTCGCGACGTACGTCG (ODN 20180, SEC ID Nº 76), TCGTTTTTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20184, SEC ID Nº 77), TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG (ODN 20185, SEC ID Nº 78) y TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG (ODN 20186, SEC ID Nº 79).
Se proporciona según otros aspectos de la invención una composición farmacéutica que comprende los ácidos nucleicos inmunoestimulantes descritos en la presente memoria y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otros aspectos de la invención, se proporciona un método in vitro para inducir la expresión de interferón (IFN) de tipo 1. El método implica poner en contacto una célula capaz de expresar IFN de tipo 1 con una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante descrito en la presente memoria para inducir la expresión de IFN de tipo 1.
Se proporciona también un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para uso en un método terapéutico que comprende poner en contacto el ácido nucleico inmunoestimulante con una célula capaz de expresar interferón (IFN) de tipo 1 e inducir así la expresión de IFN de tipo 1.
La invención es en otros aspectos un método in vitro para activar un linfocito citolítico natural (NK). El método implica poner en contacto una célula NK con una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante descrito en la presente memoria para activar la célula NK.
Se proporciona también un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método terapéutico que comprende poner en contacto el ácido nucleico inmunoestimulante con un linfocito citolítico natural (NK) y activar así la célula NK.
En aún otros aspectos, la invención es un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método terapéutico que comprende tratar o prevenir una infección en un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, dicha infección.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, una infección seleccionada del grupo consistente en una infección vírica, bacteriana, fúngica y parasitaria.
En ciertas realizaciones, el método implica la administración de un ácido nucleico inmunoestimulante de la invención solo para tratar o prevenir la infección. En ciertas realizaciones, el método según este aspecto de la invención incluye adicionalmente administrar al sujeto un agente antibiótico, que puede ser un agente antibacteriano, un agente antivírico, un agente antifúngico o un agente antiparasitario.
En otros aspectos, la invención es un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método terapéutico que comprende tratar o prevenir una afección alérgica en un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, dicha afección alérgica.
En algunas realizaciones, la afección alérgica es asma alérgica. En una realización, la afección alérgica es asma. En ciertas realizaciones, el método implica administrar un ácido nucleico inmunoestimulante de la invención solo para tratar o prevenir la afección alérgica. En ciertas realizaciones, el método según este aspecto de la invención incluye adicionalmente administrar al sujeto un medicamento para el asma/alergia, por ejemplo, esteroides, antihistamínicos e inductores de prostaglandina.
Según otros aspectos de la invención, se proporciona un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método terapéutico que comprende tratar o prevenir el cáncer en un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, cáncer. El método implica administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante descrito en la presente memoria, para tratar o prevenir el cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo consistente en carcinoma de células basales, cáncer de tracto biliar, cáncer de vejiga, cáncer óseo, cáncer de cerebro y SNC, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cáncer de colon y recto, cáncer de tejido conectivo, cáncer del sistema digestivo, cáncer endométrico, cáncer esofágico, cáncer de ojo, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, neoplasma intraepitelial, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, de células pequeñas y de células no pequeñas), linfoma incluyendo linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin, melanoma, mieloma, neuroblastoma, cáncer de la cavidad oral (por ejemplo, de labio, lengua, boca y faringe), cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer del sistema respiratorio, sarcoma, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer tiroideo, cáncer uterino, cáncer del sistema urinario y otros carcinomas y sarcomas.
En ciertas realizaciones, el método implica administrar un ácido nucleico inmunoestimulante de la invención solo para tratar el cáncer. En ciertas realizaciones, el método según este aspecto de la invención incluye adicionalmente administrar al sujeto un medicamento o tratamiento anticanceroso, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos o
radiación.
Cada una de las limitaciones de la invención puede comprender diversas realizaciones de la invención. Por lo tanto, se prevé que cada una de las limitaciones de la invención que implica cualquier elemento o combinaciones de elementos pueda incluirse en cada aspecto de la invención.
Breve descripción de los dibujos
Se proporcionan las siguientes figuras sólo con fines ilustrativos, y no son necesarias para entender o practicar la invención.
La Figura 1 es una gráfica de barras que exhibe las cantidades de IFN-\alpha (pg/ml) inducidas en PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas, con IL-2 o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas.
La Figura 2 es una gráfica de barras que exhibe las cantidades de MCP-1 (pg/ml) inducidas en PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas, con IL-2 o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas.
La Figura 3 es una gráfica de barras que exhibe las cantidades de IP-10 (pg/ml) inducidas en PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas, con IL-2 o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas.
La Figura 4 es una gráfica de barras que exhibe las cantidades de IFN-\alpha (pg/ml) inducidas en PBMC humanas después de 48 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado a 1,0 \mug/ml.
La Figura 5 es un par de gráficas de barras que exhiben la tinción de superficie en células B por CD86 (MFI) después de 48 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado a 0,25 \mug/ml (panel A) o 1,0 \mug/ml (panel B).
La Figura 6 es un par de gráficas de barras que exhiben los resultados de un ensayo de proliferación de células B de 72 horas (incorporación de cpm de ^{3}H-timidina) solas (N/A) o en presencia del ODN indicado a 0,25 \mug/ml (panel A) o 1,0 \mug/ml (panel B).
La Figura 7 es un par de gráficas de barras que exhiben las cantidades de IL-10 (pg/ml) inducidas en PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado a 0,25 \mug/ml (panel A) o 1,0 \mug/ml (panel B).
La Figura 8 es una gráfica de barras que exhibe las cantidades de IFN-\alpha (pg/ml) inducidas en PBMC a partir de dos donantes (D127, barras negras y D124, barras blancas) después de 24 horas de cultivo solas (sin) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1 ó 6 \mug/ml).
La Figura 9 es una gráfica de barras que exhibe la activación de células B medida mediante el porcentaje de células CD86+ en PBMC humanas cultivadas durante 24 horas solas (sin) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (0,4, 1,0 ó 10,0 \mug/ml).
La Figura 10 es una gráfica de barras que exhibe la cantidad de IFN-\alpha (pg/ml) secretada por PBMC a partir de dos donantes (D141, barras blancas y D142, barras negras) después de 24 horas de cultivo solas (sin) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1 ó 6 \mug/ml).
La Figura 11 es una gráfica de barras que exhibe la cantidad de IFN-\alpha (pg/ml) secretada por PBMC a partir de dos donantes (D141, barras blancas y D142, barras negras) después de 48 horas de cultivo solas (sin) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1 ó 6 \mug/ml).
La Figura 12 es una gráfica de barras que exhibe la cantidad de IFN-\alpha (\mug/ml) secretada por PBMC a partir de dos donantes (D141, barras negras y D142, barras blancas) después de 24 horas de cultivo solas (sin) o en presencia del ODN indicado a 6 \mug/ml.
La Figura 13 es una serie de tres gráficas de barras que exhiben la cantidad de IFN-\gamma (pg/ml) secretada por PBMC después de 24 horas de cultivo solas (n/a) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1, 3 ó 10 \mug/ml en los paneles A, B y C, respectivamente).
La Figura 14 es una gráfica de barras que exhibe el porcentaje de células CD3+ de tinción positiva por IFN-\gamma después de 48 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado.
La Figura 15 es una gráfica de barras que exhibe la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la tinción por IFN-\gamma en células T después de 48 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado.
La Figura 16 es una gráfica de barras que exhibe la cantidad de IFN-\alpha (pg/ml) secretada por PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado a 1,0 \mug/ml.
La Figura 17 es un par de gráficas de barras que exhiben la cantidad de IFN-\alpha (pg/ml) secretada por PBMC humanas después de 24 ó 48 horas solas (sin) o en presencia del ODN indicado a la concentración indicada (1 ó 6 \mug/ml). El panel A exhibe resultados de PBMC combinados a partir de dos donantes. El panel A exhibe resultados de PBMC obtenidos a partir de dos donantes (D141 y D142).
La Figura 18 es una gráfica de barras que exhibe el porcentaje de células B CD86+ después de 24 horas de cultivo solas (sin) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (0,4 y 1,0 \mug/ml).
La Figura 19 es una serie de tres gráficas de barras que exhiben la concentración de IFN-\gamma (pg/ml) en sobrenadantes de cultivo de PBMC humanas después de incubación solas (sin), con LPS o con el ODN indicado a las concentraciones indicadas (0,2 a 1,0 \mug/ml) durante 6 horas (panel A), 24 horas (panel B) o 48 horas (panel C).
La Figura 20 es una gráfica de barras que exhibe la cantidad de IFN-\gamma (pg/ml) generada en una reacción linfocitaria mixta (MLR) bidireccional en la que los linfocitos obtenidos a partir de dos donantes se cultivaron durante 24 horas solos (sin) o en presencia del ODN indicado a 6 \mug/ml y se mezclaron después.
La Figura 21 es una serie de tres gráficas de barras que exhiben la concentración de IL-10 (pg/ml) en sobrenadantes de cultivo de PBMC humanas después de incubación solas (sin), con LPS o con el ODN indicado a las concentraciones indicadas (0,2 a 1,0 \mug/ml) durante 6 horas (panel 6), 24 horas (panel B) o 48 horas (panel C).
La Figura 22 es una gráfica de barras que exhibe las cantidades de IP-10 (pg/ml) en sobrenadantes de PBMC 24 horas después de incubación solas (n/a) o en presencia de controles (IL-2, ODN 1585 (GGGGTCAACGTT
GAGGGGGG, SEC ID Nº 35) y ODN 2118 (GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG, SEC ID Nº 36)) o los diversos ODN indicados a 0,6 \mug/ml (barras blancas) o 3,0 \mug/ml (barras negras).
La Figura 23 es un par de gráficas de barras que exhiben las cantidades de IFN-\alpha (pg/ml) en sobrenadantes de PBMC después de 24 horas de incubación solas (n/a) o en presencia de controles (IL-2, ODN 1585 y ODN 2118) o los diversos ODN indicados a 0,6 \mug/ml (panel A) o 3,0 \mug/ml (panel B).
La Figura 24 es una gráfica de barras que exhibe las cantidades de IFN-\gamma (pg/ml) en sobrenadantes de PBMC después de 24 horas de incubación solas (n/a) o en presencia de controles (IL-2, ODN 1585 y ODN 2118) o los diversos ODN indicados a 0,6 \mug/ml (barras blancas) o 3,0 \mug/ml (barras negras).
La Figura 25 es una gráficas de barras que exhibe las cantidades de IL-6 (pg/ml) en sobrenadantes de PBMC después de 24 horas de incubación solas (n/a) o en presencia de controles (IL-2, ODN 1585 y ODN 2118) o los diversos ODN indicados a 0,6 \mug/ml (barras blancas) o 3,0 \mug/ml (barras negras).
La Figura 26 es una gráfica de barras que exhibe las cantidades de secreción de IFN-\alpha (pg/ml) por PBMC después de 24 horas de cultivo solas (sin) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (3,0 y 6,0 \mug/ml).
Descripción detallada de la invención
Se ha descubierto que ciertos oligodesoxinucleótidos (ODN) que contienen al menos dos motivos distintos tienen efectos estimulantes únicos y deseables sobre células del sistema inmunitario. Algunos de estos ODN tienen tanto una secuencia CpG "estimulante" tradicional como un motivo "rico en GC" o "neutralizante de células B". Estos ácidos nucleicos de motivos combinados tienen efectos inmunoestimulantes que entran en algún punto entre aquellos efectos asociados a ODN de CpG "de clase B" tradicionales, que son fuertes inductores de la activación de células B y de la activación de células dendríticas (DC), y aquellos efectos asociados a una clase descrita más recientemente de ácidos nucleicos inmunoestimulantes (ODN de CpG "de clase A"), que son fuertes inductores de la activación de IFN-\alpha y linfocitos citolíticos naturales (NK) pero relativamente malos inductores de la activación de células B y DC. Krieg A.M. et al. (1995) Nature 374: 546-549; Ballas Z.K. et al. (1996) J. Immunol. 157: 1840-1845; Yamamoto S. et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076. Aunque los ODN de CpG de clase B preferidos tienen a menudo cadenas principales de fosforotioato y los ODN de CpG de clase A preferidos tienen cadenas principales mixtas o quiméricas, la nueva clase de ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados puede tener una cadena principal estabilizada, por ejemplo, cadenas principales de fosforotioato, quiméricas o de fosfodiéster.
En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos inmunoestimulantes que pertenecen a esta nueva clase de ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados. El dominio estimulante de células B se define por la fórmula: 5' X_{1}DCGHX_{2} 3'. D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina y H es una base distinta
de G.
X_{1} y X_{2} son cualquier secuencia de ácido nucleico de 0 a 10 bases de longitud. X_{1} puede incluir un CG, en cuyo caso hay preferiblemente una T inmediatamente antes de este CG. En algunas realizaciones, el DCG es TCG. X_{1} es preferiblemente de 0 a 6 bases de longitud. En algunas realizaciones, X_{2} no contiene ningún motivo poli-G ni poli-A. En otras realizaciones, la secuencia de bases del ácido nucleico inmunoestimulante tiene una secuencia poli-T en el extremo 5' o el extremo 3'. Como se usa en la presente memoria, "poli-A" o "poli-T" designarán un tramo de cuatro o más A o T consecutivas, respectivamente por ejemplo, 5' AAAA 3' o 5' TTTT 3'.
Como se usa en la presente memoria, "extremo poli-G" designará un tramo de cuatro o más G consecutivas, por ejemplo 5' GGGG 3', que aparece en el extremo 5' o el extremo 3' de un ácido nucleico. Como se usa en la presente memoria, "ácido nucleico poli-G" designará un ácido nucleico que tiene una secuencia de bases de fórmula 5' X_{1}X_{2}GGGX_{3}X_{4} 3' en la que X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son bases y preferiblemente al menos una de X_{3} y X_{4} es una G.
Algunos diseños preferidos para el dominio estimulante de células B de esta fórmula comprenden TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, TCGTCGT.
El segundo motivo del ácido nucleico se designa como P o N y está dispuesto inmediatamente 5' a X_{1} o inmediatamente 3' a X_{2}.
N es una secuencia neutralizante de células B que empieza con un trinucleótido CGG y es de al menos 10 bases de longitud. Un motivo neutralizante de células B incluye al menos una secuencia de CpG en la que el CG es precedido por una C o seguido por una G (Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12631-12636) o es una secuencia de ADN que contiene CG en la que la C del CG está metilada. Como se usa en la presente memoria, "CpG" designará una 5' citosina (C) seguida de una 3' guanina (G) y ligadas por un enlace fosfato. Al menos la C del 5' CG 3' debe estar no metilada. Los motivos neutralizantes son motivos que tienen cierto grado de capacidad inmunoestimulante cuando están presentes en un motivo por lo demás no estimulante pero que, cuando están presentes en el contexto de otros motivos inmunoestimulantes, sirven para reducir el potencial inmunoestimulante de los otros motivos.
P es un palíndromo rico en GC que contiene una secuencia de al menos 10 bases de longitud. Como se usa en la presente memoria, "palíndromo" y equivalentemente "secuencia palindrómica" designarán una repetición invertida, concretamente una secuencia tal como ABCDEE'D'C'B'A' en la que A y A', B y B', etc. son bases capaces de formar los pares de bases de Watson-Crick habituales.
Como se usa en la presente memoria "palíndromo rico en GC" designará un palíndromo que tiene una composición de bases de al menos dos tercios de G y C. En algunas realizaciones, el dominio rico en GC está preferiblemente 3' al "dominio estimulante de células B". En el caso de un palíndromo rico en GC de 10 bases de longitud, el palíndromo contiene por tanto al menos 8 G y C. En el caso de un palíndromo rico en GC de 12 bases de longitud, el palíndromo contiene también al menos 8 G y C. En el caso de un palíndromo de 14 unidades rico en GC, al menos 10 bases del palíndromo son G y C. En algunas realizaciones, el palíndromo rico en GC está compuesto exclusivamente
por G y C.
En algunas realizaciones, el palíndromo rico en GC tiene una composición de bases de al menos un 81% de G y C. En el caso de dicho palíndromo rico en GC de 10 bases, el palíndromo está compuesto por tanto exclusivamente por G y C. En el caso de dicho palíndromo rico en GC de 12 bases de longitud, se prefiere que al menos 10 bases (83%) del palíndromo sean G y C. En algunas realizaciones preferidas, el palíndromo rico en GC de 12 bases de longitud está compuesto exclusivamente por G y C. En el caso de un palíndromo rico en GC de 14 unidades, al menos 12 bases (86%) del palíndromo son G y C. En algunas realizaciones preferidas, el palíndromo rico en GC de 14 bases de longitud está compuesto exclusivamente por G y C. Las C de un palíndromo rico en GC pueden estar no metiladas o pueden estar metiladas.
En general, este dominio tiene al menos 3 C y G, más preferiblemente 4 de cada, y lo más preferiblemente 5 o más de cada. El número de C y G de este dominio no tiene que ser idéntico. Se prefiere que las C y G estén dispuestas de modo que sean capaces de formar un dúplex autocomplementario o palíndromo, tal como CCGCGCGG. Este puede estar interrumpido por A o T, pero se prefiere que la autocomplementariedad esté al menos parcialmente conservada como, por ejemplo, en los motivos CGACGTTCGTCG (SEC ID Nº 80) o CGGCGCCGTGCCG (SEC ID Nº 81). Cuando no se conserva la complementariedad, se prefiere que los pares de bases no complementarias sean TG. En una realización preferida, no hay más de 3 bases consecutivas que no sean parte del palíndromo, preferiblemente no más de 2, y lo más preferiblemente sólo 1. En algunas realizaciones, el palíndromo rico en GC incluye al menos un trímero CGG, al menos un trímero CCG o al menos un tetrámero CGCG. En otras realizaciones, el palíndromo rico en GC no es CCCCCCGGGGGG (SEC ID Nº 31) ni GGGGGGCCCCCC (SEC ID Nº 32), CCCCCGGGGG (SEC ID Nº 33) ni GGGGGCCCCC (SEC ID Nº 34).
Al menos una de las G de la región rica en GC puede estar sustituida por una hipoxantina (I). En algunas realizaciones, P incluye más de una I.
En ciertos aspectos, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene una secuencia de bases que comprende una de las siguientes fórmulas: 5' NX_{1}DCGHX_{2} 3', 5' X_{1}DCGHX_{2}N 3', 5' PX_{1}DCGHX_{2} 3' o 5' X_{1}DCGHX_{2}P 3'.
En ciertas realizaciones, la secuencia de bases comprende 5' X_{1}DCGHX_{2}PX_{3} 3', 5' X_{1}DCGHPX_{3} 3', 5' DCGHX_{2}
PX_{3} 3', 5' TCGHX_{2}PX_{3} 3', 5' DCGHPX_{3} 3' o 5' DCGHP 3'.
En otros aspectos, la invención proporciona ácidos nucleicos inmunoestimulantes que se definen por la fórmula: 5' N_{1}PyGN_{2}P 3'. N_{1} es cualquier secuencia de 1 a 6 bases de longitud. Py es una pirimidina. G es guanina. N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de longitud. P es un palíndromo rico en GC que contiene una secuencia de al menos 10 bases de longitud.
N_{1} y N_{2} pueden contener más de un 50% de pirimidinas, y más preferiblemente más de un 50% de T. N_{1} puede incluir un CG, en cuyo caso hay preferiblemente una T inmediatamente anterior a este CG. En algunas realizaciones, N_{1}PyG es TCG (tal como ODN 5376, que tiene un 5' TCGG), y lo más preferiblemente TCGN_{2}, en la que N_{2} no es G.
N_{1}PyGN_{2}P puede incluir uno o más nucleótidos de inosina (I). Cualquiera de C o G en N_{1} puede reemplazarse por inosina, pero se prefiere CpI a IpG. Para sustituciones por inosina tales como IpG, puede conseguirse una actividad óptima con el uso de una cadena principal "semiflexibilizada" o quimérica, en la que el enlace entre IG o CI sea fosfodiéster. N_{1} puede incluir al menos un motivo CI, TCI, IG o TIG.
En ciertas realizaciones, N_{1}PyGN_{2} es una secuencia seleccionada del grupo consistente en TTTTTCG, TTTCG, TTTTCG, TTCGT y TTTCGT.
En otros aspectos, la invención proporciona ácidos nucleicos inmunoestimulantes que se definen por la fórmula: 5' N_{1}PyG/IN_{2}P 3'. N_{1} es cualquier secuencia de 1 a 6 bases de longitud. Py es una pirimidina, G/I designa un solo nucleótido que es una G o una I. G es guanina e I es hipoxantina. N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de longitud. P es un palíndromo que contiene una secuencia de al menos 10 nucleótidos de longitud en la que cuando G/I es G, P es un palíndromo rico en IC. En algunas realizaciones, N_{1}PyIN_{2} es TCITCITTTT (SEC ID Nº 47).
Algunos ejemplos no limitantes de ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados, que se describen por las fórmulas anteriores, incluyen aquellos que tienen las siguientes secuencias de bases:
TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (ODN 2395), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 2429), TCGTCG
TTTTCGGCGCGCCGCG (ODN 2430), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (ODN 2431), TCGTCGTTTTCGGC
CCGCGCGG (ODN 2432), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (ODN 2452), TCCTGACGTTCGGCGCG
CGCCG (ODN 5315), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (ODN 5327, en la que Z es 5-metilcitosina), TCGTCGTT
TTCGGCGGCCGACG (ODN 5513), TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514), TCGTCGTTTTCGACGG
CCGCCG (ODN 5515), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG (ODN 5516), TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT
(ODN 2451), TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20173), TCGTCGTTTCGACGATCGTCG (ODN 20176), TCGTCGTTTCGACGTACGTCG (ODN 20177), TCGTCGCGACGGCCGTCG (ODN 20178), TCGTCGCGAC
GATCGTCG (ODN 20179), TCGTCGCGACGTACGTCG (ODN 20180), TCGTTTTTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20184), TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG (ODN 20185), TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG (ODN 20186), TIG
TIGTTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 5569, SEC ID Nº 63) y TCITCITTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 5570, SEC ID Nº 70).
Como se usa en la presente memoria, "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan intercambiablemente y designarán múltiples nucleótidos (concretamente, moléculas que comprenden un azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa) ligado a un grupo fosfato y a una base orgánica intercambiable, que es una pirimidina sustituida (por ejemplo, citosina (C), timina (T) o uracilo (U)) o una purina sustituida (por ejemplo, adenina (A) o guanina (G))). Como se usa en la presente memoria, los términos designan oligorribonucleótidos así como oligodesoxirribonucleótidos (ODN). Los términos incluirán también polinucleósidos (concretamente un polinucleótido menos el fosfato) y cualquier otra fuente orgánica (por ejemplo, ADN genómico o ADNc), pero son preferiblemente sintéticos (por ejemplo, producidos mediante síntesis de ácido nucleico).
Los términos ácido nucleico y oligonucleótido comprenden también ácidos nucleicos u oligonucleótidos con sustituciones o modificaciones, tales como en bases y/o azúcares. Por ejemplo, incluyen ácidos nucleicos que tienen azúcares de cadena principal que están unidos covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 3', y otros distintos de un grupo fosfato en la posición 5'. Los ácidos nucleicos así modificados puede incluir un grupo ribosa 2'-O-alquilado. Además, los ácidos nucleicos modificados pueden incluir azúcares tales como arabinosa en lugar de ribosa. Pro tanto, los ácidos nucleicos pueden ser heterogéneos en la composición de la cadena principal, conteniendo así cualquier posible combinación de unidades poliméricas ligadas entre sí tales como ácidos péptidonucleicos (que tienen una cadena principal de aminoácidos con bases de ácido nucleico). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos son homogéneos en la composición de la cadena principal. Los ácidos nucleicos incluyen también purinas y pirimidinas sustituidas tales como bases modificadas con C-5 propino. Wagner R.W. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 840-844. Las purinas y pirimidinas incluyen, pero sin limitación, adenina, citosina, guanina, timidina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina y otras nucleobases de origen natural y no natural, restos aromáticos sustituidos y no sustituidos. Son bien conocidas por los expertos en la técnica otras de dichas modificaciones.
Los oligonucleótidos inmunoestimulantes de la presente invención pueden comprender diversas modificaciones químicas y sustituciones, en comparación con ARN y ADN naturales, que implican un puente internucleosídico fosfodiéster, una unidad \beta-D-ribosa y/o una base nucleosídica natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracilo). Los ejemplos de modificaciones químicas son conocidos por el experto y se describen, por ejemplo, en Uhlmannn E. et al. (1990) Chem. Rev. 90: 543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", "Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques", S. Agrawal, Ed. Humana Press, Totowa, EE.UU. 1993; Crooke S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36: 107-129; y Hunziker J. et al. (1995) Mod. Synth. Methods. 7: 331-417. Un oligonucleótido según la invención puede tener una o más modificaciones, en el que cada modificación se localiza en un puente internucleosídico fosfodiéster particular y/o en una unidad de \beta-D-ribosa particular y/o en una posición de base nucleosídica natural particular en comparación con un oligonucleótido de la misma secuencia que está compuesto por ADN o ARN natural.
Por ejemplo, la invención se refiere a un oligonucleótido que puede comprender una o más modificaciones y en el que cada modificación se selecciona independientemente de:
a) el reemplazo de una unidad de azúcar-fosfato de la cadena principal de azúcar-fosfato por otra unidad,
b) el reemplazo de una unidad de \beta-D-ribosa por una unidad de azúcar modificada, y
c) el reemplazo de una base nucleosídica natural por una base nucleosídica modificada.
Son ejemplos más detallados de la modificación química de un oligonucleótido los siguientes.
Una unidad de azúcar-fosfato (concretamente, una \beta-D-ribosa y puente internucleosídico fosfodiéster formando conjuntamente una unidad azúcar-fosfato) de la cadena principal de azúcar-fosfato (concretamente, una cadena principal de azúcar-fosfato está compuesta por unidades de azúcar-fosfato) puede reemplazarse por otra unidad, en la que la otra unidad es, por ejemplo, adecuada para formar un oligómero "derivado de morfolino" (como se describe, por ejemplo, en Stirchak E.P. et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 6129-6141), es decir, por ejemplo, el reemplazo por una unidad derivada de morfolino; o para formar un ácido poliamidonucleico ("PNA", como se describe, por ejemplo, en Nielsen P.E. et al. (1994) Bioconjug. Chem. 5: 3-7), es decir, por ejemplo, el reemplazo por una unidad de cadena principal de PNA, por ejemplo, por 2-aminoetilglicina.
Una unidad de \beta-ribosa o unidad de \beta-D-2'-desoxirribosa puede reemplazarse por una unidad de azúcar modificada, en la que la unidad de azúcar modificada se selecciona, por ejemplo, de \beta-D-ribosa, \alpha-D-2'-desoxirribosa, L-2'-desoxirribosa, 2'-F-2'-desoxirribosa, 2'-O-alquil C_{1}-C_{6}-ribosa, preferiblemente 2'-O-alquil C_{1}-C_{6}-ribosa es 2'-O-metilrribosa, 2'-O-alquenil C_{2}-C_{6}-ribosa, 2'-[O-alquil C_{1}-C_{6}-O-alquil C_{1}-C_{6}]-ribosa, 2'-NH_{2}-2'-desoxirribosa, \beta-D-xilofuranosa, \alpha-arabinofuranosa, 2,4-didesoxi-\beta-D-eritrohexopiranosa y análogos carbocíclicos (descritos, por ejemplo, en Froehler J. (1992) Am. Chem. Soc. 114: 8320) y/o análogos de azúcar de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49: 7223) y/o análogos de bicicloazúcar (descritos, por ejemplo, en Tarkov M. et al. (1993) Helv. Chim. Acta 76: 481).
Una base nucleosídica natural puede reemplazarse por una base nucleosídica modificada, en la que la base nucleosídica modificada se selecciona, por ejemplo, de hipoxantina, uracilo, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquil C_{1}-C_{6}-uracilo, 5-alquenil C_{2}-C_{6}-uracilo, 5-alquinil C_{2}-C_{6}-uracilo, 5-hidroximetiluracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquil C_{1}-C_{6}-citosina, 5-alquenil C_{2}-C_{6}-citosina, 5-alquinil C_{2}-C_{6}-citosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N^{2}-dimetilguanina, 2,4-diaminopurina, 8-azapurina y modificaciones sustituidas de bases nucleosídicas naturales. Esta lista se pretende que sea ilustrativa y no ha de interpretarse como limitante.
Como se usa en la presente memoria, "ácido nucleico inmunoestimulante" designará una molécula de ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico, derivado o análogo de la misma, caracterizada por su capacidad de inducir un aspecto funcional de una célula del sistema inmunitario. Dicho aspecto funcional de una célula del sistema inmunitario puede incluir, por ejemplo, la elaboración de una citocina o quimiocina, la expresión de un marcador de superficie celular, la secreción de un anticuerpo, la proliferación u otra actividad en respuesta a o dirigida contra un antígeno o diana unida a membrana que porta antígeno.
Para uso en la presente invención, los ácidos nucleicos de la invención pueden sintetizarse de novo usando cualquiera de una serie de procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el método de \beta-cianoetilfosforamidita (Beaucage S.L. y Caruthers M.H. (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859) y el método de H-fosfonato nucleosídico (Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett. 27: 4051-4054; Froehler et al. (1986) Nucl. Acid Res. 14: 5399-5407; Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett. 27: 4055-4058; Gaffney et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29: 2619-2622). Estas químicas pueden realizarse mediante una variedad de sintetizadores automatizados de ácidos nucleicos disponibles en el mercado. Estos ácidos nucleicos se designan como ácidos nucleicos sintéticos. Como alternativa, los ácidos nucleicos de la invención pueden producirse a gran escala en plásmidos (véase Sambrook T. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989) y se separan en trozos menores o se administran enteros. Los ácidos nucleicos pueden prepararse entonces a partir de secuencias de ácido nucleico existentes (por ejemplo, ADN genómico o ADNc) usando técnicas conocidas tales como aquellas que emplean enzimas de restricción, exonucleasas o endonucleasas. Los ácidos nucleicos preparados de esta manera se designan como ácidos nucleicos aislados. Un ácido nucleico aislado designa generalmente un ácido nucleico que está separado de los componentes con los que está asociado normalmente en la naturaleza. Como ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser aquel que está separado de una célula, de un núcleo, de mitocondrias o de cromatina. Los ácidos nucleicos de motivos combinados de la presente invención comprenden tanto ácidos nucleicos de motivos combinados sintéticos como aislados.
Para uso in vivo, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados pueden ser opcionalmente relativamente resistentes a la degradación (por ejemplo, están estabilizados). Una "molécula de ácido nucleico estabilizada" significará una molécula de ácido nucleico que es relativamente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, mediante una exonucleasa o endonucleasa). La estabilización de ácido nucleico puede conseguirse mediante modificaciones de la cadena principal fosfato. Los ácidos nucleicos estabilizados preferidos de la presente invención tienen una cadena principal modificada. Se ha demostrado que la modificación de la cadena principal de ácido nucleico proporciona una actividad potenciada de los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados cuando se administran in vivo. Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados que tienen enlaces fosforotioato proporcionan en algunos casos una máxima actividad y protegen al ácido nucleico de la degradación por exonucleasas y endonucleasas intracelulares. Otros ácidos nucleicos modificados incluyen ácidos nucleicos fosfodiéster modificados, combinaciones de ácidos nucleicos fosfodiéter y fosforotioato (concretamente quiméricos), metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi y combinaciones de los mismos.
Las cadenas principales modificadas tales como fosforotioatos pueden sintetizarse usando técnicas automatizadas que emplean químicas de fosforamidato o H-fosfonato. Pueden prepararse fosfonatos de arilo y alquilo, por ejemplo como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.469.863, y pueden prepararse fosfotriésteres de alquilo (en los que el resto de oxígeno cargado está alquilado como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.023.243 y la patente europea nº 092.574) mediante síntesis automatizada en fase sólida usando reactivos comercialmente disponibles. Se han descrito métodos para preparar otras modificaciones y sustituciones de la cadena principal de ADN. Uhlmann E. y Peyman A. (1990) Chem. Rev. 90: 544, Goodchild J. (1990) Bioconjugate Chem. 1: 165.
Otros ácidos nucleicos estabilizados incluyen: análogos de ADN no iónicos tales como fosfatos de alquilo y arilo (en los que el oxígeno de fosfonato cargado está reemplazado por un grupo alquilo o arilo), fosfodiésteres y fosfotriésteres de alquilo en los que el resto oxígeno cargado está alquilado. Los ácidos nucleicos que contienen diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en cualquiera o ambos extremos, han mostrado también ser sustancialmente resistentes a la degradación por nucleasa.
En otras realizaciones, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden tener cadenas principales fosfodiéster o quiméricas, por ejemplo, flexibilizadas o semiflexibilizadas. Una cadena principal quimérica incluye una combinación de enlaces de cadena principal fosfodiéster y modificados. Un oligonucleótido quimérico, por ejemplo, puede ser un oligonucleótido flexibilizado o un oligonucleótido semiflexibilizado.
Un oligonucleótido flexibilizado es un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene una cadena principal parcialmente estabilizada, en la que los enlaces internucleosídicos fosfodiéster o similares a fosfodiéster aparecen sólo dentro de e inmediatamente adyacentes a al menos un dinucleótido de nucleósido de pirimidina-guanosina (YG) interno. El al menos un dinucleótido YG interno mismo tiene un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar a fosfodiéster. Un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar a fosfodiéster que aparece inmediatamente adyacente a al menos un dinucleótido YG interno puede estar 5', 3' o tanto 5' como 3' a al menos un dinucleótido YG interno. Preferiblemente, un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar a fosfodiéster que aparece inmediatamente adyacente a al menos un dinucleótido YG interno es en sí mismo un enlace internucleosídico interno. Por tanto, para una secuencia N_{1}YGN_{2} en la que N_{1} y N_{2} son cada uno independientemente del otro cualquier nucleótido sencillo, el dinucleótido YG tiene un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar a fosfodiéster, y además (a) N_{1} e Y están ligados por un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar a fosfodiéster cuando N_{1} es un nucleótido interno, (b) G y N_{2} están ligados por un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar a fosfodiéster cuando N_{2} es un nucleótido interno, o (c) N_{1} e Y están ligados por un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar a fosfodiéster cuando N_{1} es un nucleótido interno y G y N_{2} están ligados por un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar a fosfodiéster cuando N_{2} es un nucleótido interno.
Un oligonucleótido semiflexibilizado es un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene una cadena principal parcialmente estabilizada en la que aparecen enlaces internucleosídicos fosfodiéster o similares a fosfodiéster sólo dentro de un dinucleótido de nucleósido de pirimidina-guanosina (YG) interno. Los oligonucleótidos semiflexibilizados pueden tener una serie de ventajas frente a los oligonucleótidos inmunoestimulantes con cadenas principales totalmente estabilizadas. Por ejemplo, los oligonucleótidos semiflexibilizados pueden poseer una potencia inmunoestimulante aumentada respecto a los correspondientes oligonucleótidos inmunoestimulantes totalmente estabilizados.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden usarse para tratar a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria o tratar una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario tal como, por ejemplo, enfermedad infecciosa, cáncer y trastornos alérgicos. Como se usa en la presente memoria, "sujeto" designará un animal humano o vertebrado incluyendo, pero sin limitación, un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pollo, mono, conejo, rata, ratón, etc.
Como se usan en la presente memoria, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratado" designarán un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto a desarrollar una enfermedad o, en otras palabras, reduce la probabilidad de que un sujeto desarrolle una enfermedad o retarda el desarrollo de la enfermedad, así como un tratamiento después de que el sujeto haya desarrollado la enfermedad para luchar contra ella, por ejemplo, reducirla o eliminarla completamente o evitar que empeore. Por ejemplo, cuando se usan con respecto al tratamiento de una enfermedad infecciosa, los términos designan un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto a un microorganismo o, en otras palabras, reduce la probabilidad de que el sujeto desarrolle una enfermedad infecciosa por el microorganismo, así como un tratamiento después de que el sujeto se haya infectado para luchar contra la enfermedad infecciosa, por ejemplo, reducirla o eliminarla totalmente o evitar que empeore. Cuando se usan con respecto a una enfermedad tal como cáncer, los términos designan la prevención o retardo del desarrollo de un cáncer, reducir los síntomas del cáncer y/o inhibir o retardar el crecimiento de un cáncer establecido.
Por tanto, los ácidos nucleicos son útiles como agentes profilácticos para la inducción de inmunidad de un sujeto en riesgo de desarrollar una infección por un organismo infeccioso o un sujeto en riesgo de desarrollar un trastorno alérgico o cáncer. Un "sujeto en riesgo" como se usa en la presente memoria es un sujeto que tiene cualquier riesgo de exposición a un patógeno infeccioso causante de infección, exposición a un alergeno o desarrollo de cáncer. Por ejemplo, un sujeto en riesgo puede ser un sujeto que está planeando viajar a un área donde se encuentra un tipo particular de agente infeccioso o alergeno o puede ser un sujeto que por su estilo de vida o procedimientos médicos esté expuesto a fluidos corporales que pueden contener organismos infecciosos o incluso cualquier sujeto que viva en un área en la que se haya identificado un organismo infeccioso o alergeno y esté expuesto directamente al agente infeccioso o alergeno. Puede ser también un sujeto en riesgo de guerra biológica tal como personal militar o aquellos que vivan en áreas de riesgo de ataque terrorista. Los sujetos en riesgo de desarrollar infección incluyen también poblaciones genéricas a las que una agencia sanitaria recomiende la vacunación con un antígeno de organismo infeccioso particular. Si el antígeno es un alergeno y el sujeto desarrolla respuestas alérgicas a ese antígeno particular y el sujeto está expuesto al antígeno, concretamente, durante la temporada de polinización, entonces ese sujeto está en riesgo de exposición al antígeno. Los sujetos en riesgo de desarrollar cáncer incluyen aquellos con una predisposición genética o tratados anteriormente por cáncer, y aquellos expuestos a carcinógenos tales como tabaco, asbestos y otras toxinas químicas o luz solar excesiva y otros tipos de radiación. Los ácidos nucleicos son también útiles como agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedad infecciosa, cáncer y trastornos alérgicos.
Un "sujeto que tiene una infección" es un sujeto que se ha expuesto a un patógeno infeccioso y que tiene niveles detectables agudos o crónicos del patógeno en el cuerpo. Los ácidos nucleicos pueden usarse solos, o junto con otros agentes terapéuticos tales como un antígeno o medicamento antimicrobiano, para generar una respuesta inmunitaria que sea capaz de reducir el nivel de o erradicar el patógeno infeccioso. El método comprende la administración a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una infección una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante de motivos combinados de la invención para tratar la infección. El método puede usarse para tratar infecciones víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias en sujetos vertebrados humanos y no humanos.
Como se usa en la presente memoria, "infección", y equivalentemente, "enfermedad infecciosa" designará una enfermedad que surge por la presencia de un microorganismo extraño en el cuerpo de un sujeto. Un microorganismo extraño puede ser un virus, una bacteria, un hongo o un parásito.
Los ejemplos de virus infecciosos incluyen: Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana tales como VIH-1 (también designado como HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV o VIH-III); y otros aislamientos tales como VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A, enterovirus, virus de Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus), Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de la paragripe, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bungaviridae (por ejemplo, virus del Hantaan, bungavirus, flebovirus y nairovirus); Arenaviridae (virus de fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papoviridae (papilomavirus, poliomavirus); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (herpesvirus simple (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zóster, citomegalovirus (CMV), herpesvirus); Poxviridae (virus de la viruela, virus variolovacunales, poxvirus) e Iridoviridae (por ejemplo, virus de la fiebre porcina africana); y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de encefalopatías espongiformes, el agente de la hepatitis delta (que se cree que es un satélite defectivo del virus de la hepatitis B), los agentes de la hepatitis no A no B (clase 1= transmitido internamente, clase 2= transmitido parenteralmente (concretamente, hepatitis C); virus de Norwalk y relacionados y astrovirus).
Los ejemplos de bacterias infecciosas incluyen: Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacteroides spp., Borrelia burgdorferi, Chlamydia trachomatis, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium spp., Enterobacter aerogenes, Enterococcus sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus influenzae, Helicobacter pyloris, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophilia, Leptospira, Listeria monocytogenes, Mycobacteia spp. (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae), Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasturella multocida, Campylobacter sp. patogénica, Staphylococcus aureus, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus (sp. anaeróbica), Streptococcus (grupo Viridans), Streptococcus agalactiae (estreptococos de grupo B), Streptococcus bovis, Streptococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (estreptococos de grupo A), Treponema pallidium y Treponema pertenue.
Los ejemplos de hongos infecciosos incluyen: Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis y Blastomyces dermatitidis.
Otros organismos infecciosos (concretamente protistas) incluyen Plasmodium spp. tales como Plasmodium falciparumm, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. Los parásitos portados por sangre y/o tejido incluyen Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense (enfermedad del sueño africana), Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas) y Toxoplasma gondii.
Las listas anteriores de virus, bacterias, hongos y otros microorganismos infecciosos se entiende que son representativas y no limitantes. Se han descrito extensamente otros microorganismos médicamente relevantes en la bibliografía, por ejemplo, véase C.G.A. Thomas, "Medical Microbiology", Bailliere Tendal, Reino Unido, 1983.
Aunque muchos de los agentes microbianos descritos anteriormente se refieren a trastornos humanos, la invención es también útil para tratar vertebrados no humanos. Los vertebrados no humanos son también capaces de desarrollar infecciones que pueden prevenirse o tratarse con los ácidos nucleicos inmunoestimulantes dados a conocer en la presente memoria. Por ejemplo, además del tratamiento de enfermedades infecciosas humanas, los métodos de la invención son útiles para tratar infecciones de animales.
Los virus infecciosos de vertebrados tanto humanos como no humanos incluyen retrovirus, virus de ARN y virus de ADN. Este grupo de retrovirus incluye tanto retrovirus sencillos como retrovirus complejos. Los retrovirus sencillos incluyen los subgrupos de retrovirus de tipo B, retrovirus de tipo C y retrovirus de tipo D. Es un ejemplo de un retrovirus de tipo B el virus del tumor mamario de ratón (MMTV). Los retrovirus de tipo C incluyen los subgrupos grupo A de tipo C (incluyendo virus del sarcoma de Rous (RSV), virus de la leucemia aviar (ALV) y virus de la mieloblastosis aviar (AMV)) y grupo B de tipo C (incluyendo virus de la leucemia felina (FeLV), virus de la leucemia de mono gibón (GALV), virus de la necrosis de bazo (SNV), virus de la reticuloendoteliosis (RV) y virus del sarcoma de simio (SSV)). Los retrovirus de tipo D incluyen virus de mono de Mason-Pfizer (MPMV) y retrovirus de simio de tipo 1 (SRV-1). Los retrovirus complejos incluyen los subgrupos de lentivirus, virus de la leucemia de células T y virus espumosos. Los lentivirus incluyen VIH-1, pero incluyen también VIH-2, SIV, virus de Visna, virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y virus de la anemia infecciosa equina (EIAV). Los virus de la leucemia de células T incluyen HTLV-1, HTLV-II, virus de la leucemia de células T de simio (STLV) y virus de la leucemia bovina (BLV). Los virus espumosos incluyen virus espumoso humano (HFV), virus espumoso de simio (SFV) y virus espumoso bovino (BFV).
Los ejemplos de otros virus de ARN que son agentes infecciosos en animales vertebrados incluyen, pero sin limitación, miembros de la familia Reoviridae, incluyendo el género Orthoreovirus (serotipos múltiples de retrovirus de mamífero y aviares), el género Orbivirus (virus de la lengua azul, virus de Eugenangee, virus de Kemerovo, virus de la enfermedad equina africana y virus de la fiebre por garrapatas de Colorado), el género Rotavirus (rotavirus humano, virus de la diarrea de terneros de Nebraska, rotavirus de simio, rotavirus bovinos u ovinos, rotavirus aviares); la familia Picornaviridae, incluyendo el género Enterovirus (poliovirus, virus A y B de Coxsackie, virus entérico citopático humano huérfano (ECHO), virus de la hepatitis A, enterovirus de simio, virus de la encefalomielitis de múrido (ME), Poliovirus muris, enterovirus bovinos, enterovirus porcinos, el género Cardiovirus (virus de la encefalomiocarditis (EMC), mengovirus), el género Rhinovirus (rinovirus humanos incluyendo al menos 113 subtipos; otros rinovirus), el género Apthovirus (virus de la glosopeda (FMDV); la familia Calciviridae, incluyendo virus del exantema vesicular porcino, virus del león marino de San Miguel, picornavirus felinos y virus de Norwalk; la familia Togaviridae, incluyendo el género Alphavirus (virus de la encefalitis equina oriental, virus del bosque Semliki, virus de Sindbis, virus de la chicunguña, virus de O'Nyong-Nyong, virus del río Ross, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la encefalitis equina occidental), el género Flavivirus (virus de la fiebre amarilla portado por mosquitos, virus del dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de St. Louis, virus de la encefalitis del valle Murray, virus del Nilo occidental, virus de Kunjin, virus portado por garrapatas centroeuropeas, virus portado por garrapatas de Extremo Oriente, virus del boque Kyasanur, virus del Louping III, virus de Powassan, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk), el género Rubivirus (virus de la rubéola), el género Pestivirus (virus de la enfermedad de la mucosa, virus de la peste porcina, virus de la enfermedad de la frontera); la familia Bunyaviridae, incluyendo el género Bunyvirus (virus de Bunyamwera y relacionados, virus del grupo de encefalitis de California), el género Phlebovirus (virus siciliano de la fiebre por flebótomos, virus de la fiebre del valle del Rift), el género Nairovirus (virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, virus de la enfermedad ovina de Nairobi) y el género Uukuvirus (virus de Uukuniemi y relacionados); la familia Orthomyxoviridae, incluyendo el género de virus Influenza (virus de la gripe de tipo A, muchos subtipos humanos); virus de la gripe porcina y virus de la gripe aviar y equina; gripe de tipo B (muchos subtipos humanos) y de gripe de tipo C (posible género separado); la familia Paramyxoviridae, incluyendo el género Paramyxovirus (virus de la paragripe de tipo 1, virus de Sendai, virus de la hemadsorción, virus de la paragripe de tipos 2 a 5, virus de la enfermedad de Newcastle, virus del las paperas), el género Morbillivirus (virus del sarampión, virus de panencefalitis esclerosante subaguda, virus del moquillo, virus de la peste bovina), el género Pneumovirus (virus respiratorio sincitial (RSV), virus respiratorio sincitial bovino y virus de la neumonía); la familia Rhabdoviridae, incluyendo el género Vesiculovirus (VSV), virus de Chandipura, virus del parque Flanders-Hart), el género Lyssavirus (virus de la rabia), rabdovirus de peces y dos rabdovirus probables (virus de Marburg y virus del Ébola); la familia Arenaviridae, incluyendo virus de coriomeningitis linfocítica (LCM), virus del complejo Tacaribe y virus de Lassa; la familia Coronaviridae, incluyendo virus de la bronquitis infecciosa (IBV), virus de la hepatitis, coronavirus entérico humano y de peritonitis infecciosa felina (coronavirus felino).
Los virus de ADN ilustrativos que son agentes infecciosos en animales vertebrados incluyen, pero sin limitación, la familia Poxviridae, incluyendo el género Orthopoxvirus (viruela mayor, viruela menor, Vaccinia de viruela de los simios, viruela vacuna, viruela de búfalos, viruela de conejos, ectromelia), el género Leporipoxvirus (mioxoma, fibroma), el género Avipoxvirus (viruela aviar, otros virus de viruela aviar), el género Capripoxvirus (viruela ovina, viruela caprina), el género Suipoxvirus (viruela porcina), el género Parapoxvirus (virus de la dermatitis pustular contagiosa, pseudoviruela vacuna, virus de la estomatitis papular bovina); la familia Iridoviridae (virus de la fiebre porcina africana, virus de rana 2 y 3, virus linfoquístico de peces); la familia Herpesviridae, incluyendo los herpesvirus alfa (herpes simple de tipos 1 y 2, de varicela zóster, virus del aborto equino, herpesvirus equino 2 y 3, virus de la pseudorrabia, virus de la queratoconjuntivitis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueitis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueitis felina, virus de la laringotraqueitis infecciosa), los herpesvirus beta (citomegalovirus humanos y citomegalovirus de cerdos y monos); los herpesvirus gamma (virus de Epstein-Barr (EBV), virus de la enfermedad de Marek, herpes de Saimiri, herpesvirus de Ateles, herpesvirus de Sylvilagus, herpesvirus de conejillo de indias, virus del tumor de Lucke); la familia Adenoviridae, incluyendo el género Mastadenovirus (subgrupos humanos A, B, C, D, E y no agrupados; adenovirus de simio (al menos 23 serotipos), hepatitis canina infecciosa y adenovirus de ganado bovino, cerdos, ovejas, ranas y muchas otras especies, el género Aviadenovirus (adenovirus aviares); y adenovirus no cultivables; la familia Papoviridae, incluyendo el género Papillomavirus (papilomavirus humanos, papilomavirus bovinos, papilomavirus de conejo Shope y diversos papilomavirus patogénicos de otras especies), el género Polyomavirus (poliomavirus, agente vaculoante de simio (SV-40), agente vacuolante de conejo (RKV), virus K, virus BK, virus JC y otros virus de polioma de primate tales como el papilomavirus linfotrófico); la familia Parvoviridae, incluyendo el género de virus adenoasociados, el género Parvovirus (virus de panleucopenia felina, parvovirus bovino, parvovirus canino, virus de la enfermedad aleutiana del visón, etc.), Finalmente, los virus de ADN pueden incluir virus que no se ajustan a las familias anteriores, tales como los virus de la enfermedad Kuru y de Creutzfeld-Jakob y agentes neuropáticos infecciosos crónicos (virus CHINA).
Los ácidos nucleicos pueden administrarse a un sujeto con un agente antimicrobiano. Un agente antimicrobiano, como se usa en la presente memoria, designa un compuesto de origen natural, sintético o semisintético que es capaz de matar o inhibir microorganismos infecciosos. El tipo de agente antimicrobiano útil según la invención dependerá del tipo de microorganismos con el que el sujeto esté infectado o en riesgo de infectarse. Los agentes antimicrobianos incluyen, pero sin limitación, agentes antibacterianos, agentes antivíricos, agentes antifúngicos y agentes antiparasitarios. Las frases tales como "agente antiinfeccioso", "agente antibacteriano", "agente antivírico", "agente antifúngico", "agente antiparasitario" y "parasiticida" tienen significados bien establecidos para los expertos en la técnica y se definen en textos médicos estándar. Brevemente, los agentes antibacterianos matan o inhiben bacterias, e incluyen antibióticos así como otros compuestos sintéticos o naturales que tienen funciones similares. Los antibióticos son moléculas de bajo peso molecular que se producen como metabolitos secundarios por células tales como microorganismos. En general, los antibióticos interfieren con una o más funciones o estructuras bacterianas que son específicas del microorganismo y que no están presentes en células hospedadoras. Los agentes antivíricos pueden aislarse a partir de fuentes naturales o sintetizarse y son útiles para matar o inhibir virus. Los agentes antifúngicos se usan para tratar infecciones fúngicas superficiales así como infecciones fúngicas oportunistas y sistémicas primarias. Los agentes antiparásitos matan o inhiben parásitos.
Los agentes antibacterianos matan o inhiben el crecimiento o funcionamiento de bacterias. Es una gran clase de agentes antibacterianos los antibióticos. Los antibióticos que son eficaces para matar o inhibir un amplio intervalo de bacterias se designan como antibióticos de amplio espectro. Otros tipos de antibióticos son predominantemente eficaces contra las bacterias de las clases grampositiva o gramnegativa. Estos tipos de antibióticos se designan como antibióticos de espectro estrecho. Otros antibióticos que son eficaces contra un solo organismo o enfermedad y no contra otros tipos de bacterias se designan como antibióticos de espectro limitado. Los agentes antibacterianos se clasifican a veces basándose en su modo de acción primario. En general, los agentes antibacterianos son inhibidores de la síntesis de la pared celular, inhibidores de membrana celular, inhibidores de la síntesis de proteína, inhibidores de la síntesis de ácido nucleico o inhibidores funcionales e inhibidores competitivos.
Los agentes antivíricos son compuestos que previenen la infección de células por virus o la replicación del virus en la célula. Hay muchos menos fármacos antivíricos que fármacos antibacterianos porque el proceso de replicación vírica está tan estrechamente relacionado con la replicación de ADN en la célula hospedadora que los agentes antivíricos no específicos serían a menudo tóxicos para el hospedador. Hay varias etapas dentro del proceso de replicación vírica que pueden bloquearse o inhibirse mediante agentes antivíricos. Estas etapas incluyen la unión del virus a la célula hospedadora (inmunoglobulina o péptidos de unión), la descapsidación del virus (por ejemplo, amantadina), la síntesis o traducción de ARNm vírico (por ejemplo, interferón), la replicación de ARN o ADN vírico (por ejemplo, análogos nucleosídicos), la maduración de nuevas proteínas víricas (por ejemplo, inhibidores de proteasa) y el brote y liberación de los virus.
Los análogos nucleotídicos son compuestos sintéticos que son similares a los nucleótidos, pero que tienen un grupo desoxirribosa o ribosa incompleto o anormal. Una vez los análogos nucleotídicos están en la célula, se fosforilan, produciendo el trifosfato formado que compite con los nucleótidos normales por la incorporación al ADN o ARN vírico. Una vez se incorpora la forma trifosfato del análogo nucleotídico a la cadena de ácido nucleico en crecimiento, causa una asociación irreversible con la polimerasa vírica, y por tanto la terminación de cadena. Los análogos nucleotídicos incluyen, pero sin limitación, aciclovir (usado para el tratamiento de herpesvirus simple y virus de la varicela zóster), ganciclovir (útil para el tratamiento de citomegalovirus), idoxuridina, ribavirina (útil para el tratamiento del virus respiratorio sincitial), didesoxiinosina, didesoxicitidina y zidovudina (azidotimidina).
Los agentes antifúngicos son útiles para el tratamiento y la prevención de hongos infecciosos. Los agentes antifúngicos se clasifican a veces por su mecanismo de acción. Algunos agentes antifúngicos funcionan como inhibidores de la pared celular inhibiendo la glucosa sintasa. Estos incluyen, pero sin limitación, basiunguna/ECB. Otros agentes antifúngicos funcionan desestabilizando la integridad de la membrana. Estos incluyen, pero sin limitación, imidazoles tales como clotrimazol, sertaconazol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol y voriconazol, así como FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina y terbinafina. Otros agentes antifúngicos funcionan degradando la quitina (por ejemplo, quitinasa) o por inmunosupresión (501 Cream).
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden usarse, solos o en combinación con una terapia anticancerosa, para el tratamiento del cáncer. El método comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante de motivos combinados de la invención para tratar el cáncer.
Un "sujeto que tiene un cáncer" es un sujeto que tiene células cancerosas detectables. El cáncer puede ser un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen, pero sin limitación, cáncer del tracto biliar, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de cuello del útero, coriocarcinoma, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, neoplasmas intraepiteliales, linfomas, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, de células pequeñas y de células no pequeñas), melanoma, neuroblastomas, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal, sarcomas, cáncer de piel, cáncer testicular, cáncer tiroideo y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. En una realización, el cáncer es tricoleucemia, leucemia mielogenosa crónica, leucemia de células T cutáneas, mieloma múltiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, carcinoma de células de vejiga o carcinoma de colon.
El cáncer es una de las causas principales de muerte en animales de compañía (concretamente, gatos y perros). Los trastornos malignos diagnosticados comúnmente en perros y gatos incluyen, pero sin limitación, linfosarcoma, osteosarcoma, tumor mamario, mastocitoma, tumor cerebral, melanoma, carcinoma adenoescamoso, tumor de pulmón carcinoide, tumor de glándula bronquial, adenocarcinoma bronquiolar, fibroma, mixocondroma, sarcoma pulmonar, neurosarcoma, osteoma, papiloma, retinoblastoma, sarcoma de Ewing, tumor de Wilms, linfoma de Burkitt, microglioma, neuroblastoma, osteoclastoma, neoplasia oral, fibrosarcoma, osteosarcoma y rabdomiosarcoma. Otros neoplasmas en perros incluyen carcinoma de células escamosas genitales, tumor venéreo transmisible, tumor testicular, seminoma, tumor de células de Sertoli, hemangiopericitoma, histiocitoma, cloroma (sarcoma granulocítico), papiloma corneal, carcinoma de células escamosas corneales, hemangiosarcoma, mesotelioma pleural, tumor de células basales, timoma, tumor de estómago, carcinoma de glándula suprarrenal, papilomatosis oral, hemangiotelioma y cistadenoma. Las malignidades adicionales diagnosticadas en gatos incluyen linfoma folicular, linfosarcoma intestinal, fibrosarcoma y carcinoma de células escamosas pulmonares. El hurón, una mascota cada vez más popular, es conocido por desarrollar insulinoma, linfoma, sarcoma, neuroma, tumor de células del islote pancreático, linfoma gástrico MALT y adenocarcinoma gástrico.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden administrarse también junto con una terapia anticancerosa. Las terapias anticancerosas incluyen medicamentos contra el cáncer, radiación y procedimientos quirúrgicos. Como se usa en la presente memoria, un "medicamento contra el cáncer" designa un agente que se administra a un sujeto con el fin de tratar un cáncer. Se describen en la presente memoria diversos tipos de medicamentos para el tratamiento del cáncer. Con los fines de esta memoria descriptiva, los medicamentos contra el cáncer se clasifican como agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos, vacunas del cáncer, terapia hormonal y modificadores de la respuesta biológica.
El uso de ácidos nucleicos inmunoestimulantes junto con agentes inmunoterapéuticos tales como anticuerpos monoclonales es capaz de aumentar la supervivencia a largo plazo mediante una serie de mecanismos que incluyen una potenciación significativa de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), la activación de células NK y un aumento de los niveles de IFN-\alpha. La ADCC puede realizarse usando un ácido nucleico inmunoestimulante en combinación con un anticuerpo específico de una diana celular, tal como una célula cancerosa. Cuando el ácido nucleico inmunoestimulante se administra a un sujeto junto con el anticuerpo, se induce al sistema inmunitario del sujeto a matar la célula tumoral. Los anticuerpos útiles en el procedimiento de ADCC incluyen anticuerpos que interaccionan con una célula del cuerpo. Se han descrito en la técnica muchos de dichos anticuerpos específicos de dianas celulares y muchos están comercialmente disponibles. Los ácidos nucleicos, cuando se usan en combinación con anticuerpos monoclonales, sirven para reducir la dosis de anticuerpo necesaria para conseguir un resultado biológico.
Otros tipos de agentes quimioterapéuticos que pueden usarse según la invención incluyen aminoglutetimida, asparaginasa, busulfano, carboplatino, clorambucilo, HCl de citarabina, dactinomicina, HCl de daunorubicina, fosfato de estramustina de sodio, etopósido (VP16-213), floxuridina, fluorouracilo (5-FU), flutamida, hidroxiurea (hidroxicarbamida), ifosfamida, interferón alfa-2a, alfa-2b, acetato de leuprolida (análogo de factor de liberación de LHRH), lomustina (CCNU), HCl de mecloretamina (mostaza nitrogenada), mercaptopurina, mesna, mitotano (op'-DDD), HCl de mitoxantrona, octreotida, plicamicina, HCl de procarbazina, estreptozocina, citrato de tamoxifeno, tioguanina, tiotepa, sulfato de vinblastina, amsacrina (m-AMSA), azacitidina, eritropoyetina, hexametilmelamina (HMM), interleucina 2, mitoguazona (metil-GAG, metilglioxalbisguanilhidrazona, MGBG), pentostatina (2'-desoxicoformicina), semustina (metil-CCNU), tenipósido (VM-26) y sulfato de vindesina.
Las vacunas del cáncer son medicamentos que se pretende que estimulen una respuesta inmunitaria endógena contra células cancerosas. Las vacunas producidas actualmente activan predominantemente el sistema inmunitario humoral (concretamente, la respuesta inmunitaria dependiente de anticuerpo). Otras vacunas actualmente en desarrollo están enfocadas a activar el sistema inmunitario mediado por célula, incluyendo los linfocitos T citotóxicos que son capaces de matar células tumorales. Las vacunas del cáncer potencian generalmente la presentación de antígenos cancerosos tanto a células presentadoras de antígeno (por ejemplo, macrófagos y células dendríticas) como a otras células inmunitarias tales como células T, células B y células NK. En algunos casos, las vacunas del cáncer pueden usarse junto con coadyuvantes tales como aquellos descritos anteriormente.
Algunas células cancerosas son antigénicas y por tanto pueden ser dianas del sistema inmunitario. En un aspecto, la administración combinada de ácidos nucleicos inmunoestimulantes y medicamentos contra el cáncer, particularmente aquellos que se clasifican como inmunoterapias del cáncer, es útil para estimular una respuesta inmunitaria específica contra un antígeno canceroso. Como se usan en la presente memoria, los términos "antígeno canceroso" y "antígeno tumoral" se usan intercambiablemente para designar antígenos que se expresan diferencialmente por células cancerosas y pueden explotarse por tanto para orientarse a células cancerosas. Los antígenos cancerosos son antígenos que pueden estimular potencialmente respuestas inmunitarias aparentemente específicas de tumor. Algunos de estos antígenos están codificados, aunque no necesariamente expresados, por células normales. Estos antígenos pueden caracterizarse como aquellos que son normalmente silenciosos (concretamente, no se expresan) en células normales, aquellos que se expresan sólo en ciertas etapas de diferenciación y aquellos que se expresan temporalmente tales como antígenos embriónicos y fetales. Otros antígenos cancerosos están codificados por genes celulares mutantes tales como oncogenes (por ejemplo, oncogén ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53 mutante), proteínas de fusión resultantes de delecciones internas o translocaciones cromosómicas. Aún otros antígenos cancerosos pueden estar codificados por genes víricos tales como aquellos portados en virus tumorales de ARN y ADN. Los antígenos "asociados a tumor" están presentes tanto en células tumorales como en células normales, pero están presentes en una cantidad diferente o en una forma diferente en células tumorales. Son ejemplos de dichos antígenos los antígenos oncofetales (por ejemplo, antígeno carcinoembriónico), antígenos de diferenciación (por ejemplo, antígenos T y Tn) y productos oncogénicos (por ejemplo, HER/neu).
Los antígenos cancerosos, tales como aquellos presentes en vacunas del cáncer o aquellos usados para preparar inmunoterapias del cáncer, pueden prepararse a partir de extractos celulares cancerosos brutos, como se describe en Cohen P.A. et al. (1994) Cancer Res. 54: 1055-1058, o purificando parcialmente los antígenos, usando tecnología recombinante o síntesis de novo de antígenos conocidos. Los antígenos cancerosos pueden usarse en forma de porciones inmunogénicas de un antígeno particular o, en algunos casos, puede usarse como antígeno una célula entera o una masa tumoral. Dichos antígenos pueden aislarse o prepararse recombinantemente o mediante cualquier otro medio conocido en la técnica.
Otras vacunas toman la forma de células dendríticas que se han expuesto a antígenos cancerosos in vitro, han procesado los antígenos y son capaces de expresar los antígenos cancerosos en su superficie celular en el contexto de moléculas de MHC para una presentación de antígeno eficaz a otras células del sistema inmunitario. Las células dendríticas forman el nexo entre el sistema inmunitario innato y el adquirido al presentar antígenos y mediante su expresión de receptores de reconocimiento de patrón que detectan moléculas microbianas como LPS en su entorno local.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados son útiles para el tratamiento de la alergia, incluyendo el asma. Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados pueden usarse, solos o en combinación con un medicamento para la alergia/asma, para tratar la alergia. El método comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una afección alérgica o asmática una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante de motivos combinados de la invención para tratar la afección alérgica o asmática.
Como se usa en la presente memoria, "alergia" designará hipersensibilidad adquirida a una sustancia (alergeno). Las afecciones alérgicas incluyen eccema, rinitis alérgica o coriza, fiebre del heno, asma bronquial, urticaria (erupción), alergias alimentarias y otras afecciones atópicas. Un "sujeto que tiene una alergia" es un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una reacción alérgica en respuesta a un alergeno. Un "alergeno" designa una sustancia que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un sujeto sensible. La lista de alergenos es enorme y puede incluir pólenes, venenos de insectos, caspa animal, polvo, esporas fúngicas y fármacos (por ejemplo, penicilina).
Los ejemplos de alergenos naturales animales y vegetales incluyen proteínas específicas de los siguientes géneros: Canine (Canis familiaris), Dermatophagoides (por ejemplo, Dermatophagoides farinae), Felis (Felis domesticus), Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia), Lolium (por ejemplo, Lolium perenne o Lolium multiflorum), Cryptomeria (Cryptomeria japonica), Alternaria (Alternaria alternata), Alder, Agnus (Agnus gultinosa), Betula (Betula verrucosa), Quercus (Quercus alba), Olea (Olea europa), Artermisia (Artemisia vulgaris), Plantago (por ejemplo, Plantago lanceolata), Parietaria (Parietaria officinalis o Parietaria judaica), Blattella (por ejemplo, Blattella germanica), Apis (por ejemplo, Apis multiflorum), Cupressus (por ejemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa), Juniperus (por ejemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis y Juniperus ashei), Thuya (por ejemplo, Thuya orientalis), Chamaecyparis (por ejemplo, Chamaecyparis obtusa), Periplaneta (por ejemplo, Periplaneta americana), Agropyron (por ejemplo, Agropyron repens), Secale (por ejemplo, Secale cereale), Triticum (por ejemplo, Triticum aestivum), Dactylis (por ejemplo, Dactylis glomerata), Festuca (por ejemplo, Festuca elatior), Poa (por ejemplo, Poa pratensis o Poa compressa), Avena (por ejemplo, Avena sativa), Holcus (por ejemplo, Holcus lanatus), Anthoxanthum (por ejemplo, Anthoxanthum odoratum), Arrhenatherum (por ejemplo, Arrhenatherum elatius), Agrostis (por ejemplo, Agrostis alba), Phleum (por ejemplo, Phleum pratense), Phalaris (por ejemplo, Phalaris arundinacea), Paspalum (por ejemplo, Paspalum notatum), Sorghum (por ejemplo, Sorghum halepensis) y Bromus (por ejemplo, Bromus inermis).
Como se usa en la presente memoria, "asma" designa un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias y reactividad aumentada de las vías respiratorias ante agentes inhalados. El asma está frecuentemente asociado, aunque no exclusivamente, a síntomas atópicos o alérgicos.
Un "medicamento para el asma/alergia" como se usa en la presente memoria es una composición de material que reduce los síntomas, inhibe la reacción asmática o alérgica o previene el desarrollo de una reacción alérgica o asmática. Se describen diversos tipos de medicamentos para el tratamiento de asma y alergia en las "Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma", Expert Panel Report 2, publicación NIH nº 97/4051, 19 de julio de 1997. Se presenta a continuación el sumario de los medicamentos como se describen en la publicación NIH.
En la mayoría de las realizaciones, el medicamento para el asma/alergia es útil en cierto grado para tratar tanto asma como alergia. Algunos medicamentos para el asma/alergia se usan preferiblemente en combinación con los ácidos nucleicos inmunoestimulantes para tratar el asma. Estos se designan como medicamentos para el asma. Los medicamentos para el asma incluyen, pero sin limitación, inhibidores de PDE-4, broncodilatadores/agonistas de beta 2, abridores de canal de K+, antagonistas de VLA-4, antagonistas de neurocina, inhibidores de la síntesis de TXA2, xantaninas, antagonistas de ácido araquidónico, inhibidores de 5-lipooxigenasa, antagonistas de receptor de tromboxano A2, antagonistas de tromboxano A2, inhibidor de proteínas de activación de 5-lipooxigenasa e inhibidores de proteasa.
Se usan preferiblemente otros medicamentos para el asma/alergia en combinación con los ácidos nucleicos inmunoestimulantes para tratar la alergia. Se designan estos como medicamentos para la alergia. Los medicamentos para la alergia incluyen, pero sin limitación, antihistamínicos, esteroides, inmunomoduladores e inductores de prostaglandina. Los antihistamínicos son compuestos que contrarrestan la histamina liberada por mastocitos o basófilos. Estos compuestos son bien conocidos en la técnica y se usan comúnmente para el tratamiento de la alergia. Los antihistamínicos incluyen, pero sin limitación, loratidina, cetirizina, buclizina, análogos de ceterizina, fexofenadina, terfenadina, desloratadina, norastemizol, epinastina, ebastina, astemizol, levocabastina, azelastina, tranilast, terfenadina, mizolastina, betastatina, CS 560 y HSR 609. Los inductores de prostaglandina son compuestos que inducen la actividad de prostaglandina. Las prostaglandinas funcionan regulando la relajación del músculo liso. Los inductores de prostaglandina incluyen, pero sin limitación, S-5751.
Los esteroides incluyen, pero sin limitación, beclometasona, fluticasona, tramcinolona, budesonida, corticosteroides y budesonida. La combinación de ácidos nucleicos inmunoestimulantes y esteroides es particularmente bien adecuada para el tratamiento de sujetos jóvenes (por ejemplo niños). Hasta la fecha, el uso de esteroides en niños ha estado limitado por la observación de que algunos tratamientos con esteroides se han asociado al parecer con retardo del crecimiento. Por tanto, según la presente invención, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden usarse en combinación con esteroides retardantes del crecimiento, y pueden proporcionar por tanto un "efecto economizador de esteroides". La combinación de los dos agentes puede dar como resultado requerir menores dosis de esteroides.
Los inmunomoduladores incluyen, pero sin limitación, el grupo consistente en agentes antiinflamatorios, antagonistas de leucotrieno, muteínas de IL-4, receptores solubles de IL-4, inmunosupresores (tales como vacuna de péptido tolerizante), anticuerpos anti-IL-4, antagonistas de IL-4, anticuerpos anti-IL-5, proteínas de fusión receptor soluble de IL-13-Fc, anticuerpos anti-IL-9, antagonistas de CCR3, antagonistas de CCR5, inhibidores de VLA-4 y reguladores negativos de IgE.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de la invención pueden usarse para inducir IFN de tipo 1, concretamente, IFN-\alpha e IFN-\beta. El método implica poner en contacto una célula capaz de expresar un IFN de tipo 1 con una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante de motivos combinados de la invención para inducir la expresión de IFN de tipo 1 por la célula. Se ha apreciado recientemente que el tipo celular más productor de IFN-\alpha en seres humanos es la célula dendrítica plasmacitoide (pDC). Este tipo de célula aparece a muy baja frecuencia (0,2-0,4%) en PBMC y se caracteriza por un fenotipo que es de linaje negativo (concretamente, no se tiñe por CD3, CD14, CD19 ni CD56) y negativo para CD11c, mientras que es positivo para CD4, CD123 (IL-3R\alpha) y complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHC de clase II). Grouard G. et al. (1997) J. Exp. Med. 185: 1101-1111; Rissoan M.-C. et al. (1999) Science 283: 1183-1186; Siegal F.P. et al. (1999) Science 284: 1835-1837; Cella M. et al. (1999) Nat. Med. 5: 919-923. Los métodos para medir IFN de tipo 1 son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA), bioensayo y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Pueden realizarse ensayos de esta clase usando reactivos y kits fácilmente disponibles
comercialmente.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de la invención pueden usarse para activar células NK. El método implica poner en contacto una célula NK con una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante de motivos combinados de la invención para activar las células NK. La activación de las células NK puede ser activación directa o activación indirecta. La activación indirecta designa la inducción de citocinas u otros factores que causan la posterior activación de las células NK. La activación de células NK puede evaluarse mediante diversos métodos, incluyendo la medida de la actividad lítica, la medida de la inducción de marcadores de activación tales como CD69 y la medida de la inducción de ciertas citocinas. Además de su capacidad característica de matar ciertas dianas tumorales espontáneamente, las células NK participan en la ADCC y son productoras importantes de IFN-\gamma, TNF-\alpha, GM-CSF e IL-3.
La diana celular sensible a NK prototípica para células NK de ratón es el cromosoma artificial de levadura (YAC-1), un timoma derivado de cepa A de ratón infectada con virus Moloney. Para células NK humanas, es una diana estándar K562, una estirpe celular derivada de un linaje eitroleucémico. Se incuba en placas de microvaloración un número constante de dianas radiomarcadas (por ejemplo, K562 marcada con ^{51}Cr) solas (espontáneo), con detergente (máximo) o con números variables de células efectoras (experimental). La relación de células efectoras a diana se designa como la relación de E:T. Las células NK enriquecidas activadas son típicamente eficaces a relaciones de E:T de menos de 10:1, aunque las PBMC no fraccionadas o esplenocitos requieren relaciones de E:T de 100:1 o más.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes son también útiles como coadyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria sistémica y/o mucosa. Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados de la invención pueden suministrarse a un sujeto expuesto a un antígeno para producir una respuesta inmunitaria potenciada ante el antígeno. Por tanto, por ejemplo, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados son útiles como coadyuvantes de vacuna.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden administrarse en combinación con coadyvuantes no ácidos nucleicos. Un coadyuvante no ácido nucleico es cualquier molécula o compuesto, excepto los ácidos nucleicos inmunoestimulantes descritos en la presente memoria, que pueda estimular la respuesta inmunitaria humoral y/o celular. Los coadyuvantes no ácido nucleico incluyen, por ejemplo, coadyuvantes que crean un efecto de liberación lenta, coadyuvantes inmunoestimulantes y coadyuvantes que crean un efecto de liberación lenta y estimulan el sistema inmunitario. Un coadyuvante mucoso no de ácido nucleico como se usa en la presente memoria es un coadyuvante distinto de un ácido nucleico inmunoestimulante que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria mucosa en un sujeto cuando se administra a una superficie mucosa junto con un antígeno.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de la invención pueden formularse como composiciones farmacéuticas en un portador farmacéuticamente aceptable. Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden administrarse directamente al sujeto o pueden administrarse junto con un complejo de suministro de ácido nucleico. Un complejo de suministro de ácido nucleico significará una molécula de ácido nucleico asociada a (por ejemplo, unida iónica o covalentemente a o encapsulada en) un medio orientador (por ejemplo, una molécula que dé como resultado una mayor afinidad de unión por la célula diana (por ejemplo, superficies de células B) y/o una captación celular aumentada por células diana). Los ejemplos de complejos de suministro de ácido nucleico incluyen ácidos nucleicos asociados a un esterol (por ejemplo, colesterol), un lípido (por ejemplo, un lípido catiónico, virosoma o liposoma) o un agente de unión específica a célula diana (por ejemplo, un ligando reconocido por un receptor específico de célula diana). Los complejos preferidos pueden ser suficientemente estables in vivo para prevenir un desacoplamiento significativo antes de la internalización por la célula diana. Sin embargo, el complejo puede ser escindible en condiciones apropiadas en la célula, de modo que el ácido nucleico se libere de forma funcional.
El ácido nucleico inmunoestimulante y/o el antígeno y/u otros agentes terapéuticos pueden administrarse solos (por ejemplo, en disolución salina o tampón) o usando cualquier vehículo de suministro conocido en la técnica. Por ejemplo, se han descrito los siguientes vehículos de suministro: cocleatos (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); emulsomas (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOMas (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et al., 1998, Morein et al., 1999); liposomas (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); microesferas (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); polímeros (por ejemplo, carboximetilcelulosa, quitosán) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); anillos poliméricos (Wyatt et al., 1998); proteosomas (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); virosomas (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); partículas similares a virus (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). Son conocidos en la técnica otros vehículos de suministro.
Las dosis en cuestión de los compuestos descritos en la presente memoria para suministro mucoso o local se encuentran típicamente en el intervalo de aproximadamente 0,1 \mug a 10 mg por administración, que dependiendo de la aplicación podrían darse diaria, semanal o mensualmente y en cualquier otro espacio de tiempo entre ellos. Más típicamente, las dosis mucosa o local se encuentran en el intervalo de aproximadamente 10 \mug a 5 mg por administración, y lo más típicamente de aproximadamente 100 \mug a 1 mg, estando espaciadas 2-4 administraciones por días o semanas. Más típicamente, las dosis inmunoestimulantes se encuentran en el intervalo de 1 \mug a 10 mg por administración, y lo más típicamente de 10 \mug a 1 mg, con administraciones diarias o semanales. Las dosis en cuestión de los compuestos descritos en la presente memoria para suministro parenteral con el fin de inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno, en la que los compuestos se suministran con un antígeno pero no otro agente terapéutico, son típicamente de 5 a 10.000 veces mayores que la dosis mucosa eficaz para coadyuvante de vacuna o aplicaciones inmunoestimulantes, y más típicamente de 10 a 1.000 veces mayores, y lo más típicamente de 20 a 100 veces mayores. Las dosis de compuestos descritos en la presente memoria para suministro parenteral con el fin de inducir una respuesta inmunitaria innata o para aumentar la ADCC o para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno cuando los ácidos nucleicos inmunoestimulantes se administran en combinación con otros agentes terapéuticos o en vehículos de suministro especializados, se encuentran típicamente en el intervalo de aproximadamente 0,1 \mug a 10 mg por administración, que dependiendo de la aplicación podrían darse diaria, semanal o mensualmente y en cualquier otro espacio de tiempo entre ellos. Más típicamente, las dosis parenterales con estos fines se encuentran en el intervalo de aproximadamente 10 \mug a 5 mg por administración, y lo más típicamente de aproximadamente 100 \mug a 1 mg, estando espaciadas 2-4 administraciones por días o semanas. En algunas realizaciones, sin embargo, las dosis parenterales con estos fines pueden usarse en un intervalo de 5 a 10.000 veces mayor que las dosis típicas descritas anteriormente.
Como se usa en la presente memoria "cantidad eficaz" designará la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, es una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante para tratar una infección aquella cantidad necesaria para tratar la infección. Combinado con las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria, eligiendo entre los diversos compuestos activos y ponderando factores tales como potencia, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, gravedad de los efectos secundarios adversos y modo de administración preferido, puede planearse un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico que no cause una toxicidad sustancial y que sin embargo sea enteramente eficaz para tratar el sujeto particular. La cantidad eficaz para cualquier aplicación dada puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que se esté tratando, el ácido nucleico inmunoestimulante particular que se esté administrando, el antígeno, el tamaño del sujeto o la gravedad de la enfermedad o afección. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante y/o antígeno y/u otro agente terapéutico particular sin necesitar experimentación indebida.
Para cualquier compuesto descrito en la presente memoria, la cantidad terapéuticamente eficaz puede determinarse inicialmente a partir de modelos animales. Puede determinarse también una dosis terapéuticamente eficaz a partir de datos humanos de oligonucleótidos de CpG que se han ensayado en seres humanos (se han iniciado ensayos clínicos humanos) y compuestos que son conocidos por exhibir actividades farmacológicas similares, tales como otros coadyuvantes mucosos, por ejemplo, LT y otros antígenos con fines de vacunación, para administración mucosa o local. Son necesarias dosis mayores para administración parenteral. La dosis aplicada puede ajustarse basándose en la biodisponibilidad relativa y la potencia del compuesto administrado. Ajustar la dosis para conseguir una eficacia máxima basándose en los métodos descritos anteriormente y otros métodos como son bien conocidos en la técnica está bien dentro de las habilidades del experto ordinario.
Las formulaciones de la invención se administran en disoluciones farmacéuticamente aceptables, que pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes de tamponación, conservantes, portadores compatibles, coadyuvantes, y opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos.
Para uso en terapia, puede administrarse una cantidad eficaz del ácido nucleico inmunoestimulante a un sujeto mediante cualquier modo que suministre el ácido nucleico a la superficie deseada, por ejemplo, mucoso o sistémico. La administración de la composición farmacéutica de la presente invención puede conseguirse mediante cualquier medio conocido por el experto. Las vías de administración preferidas incluyen, pero sin limitación, oral, parenteral, intramuscular, intranasal, intratraqueal, por inhalación, ocular, sublingual, vaginal y rectal.
Para administración oral, los compuestos (concretamente, ácidos nucleicos inmunoestimulantes, antígenos y otros agentes terapéuticos) pueden formularse fácilmente combinando el(los) compuesto(s) activo(s) con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos portadores posibilitan formular los compuestos de la invención como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones densas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un sujeto a tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse en forma de excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleo de gragea. Son excipientes adecuados, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Opcionalmente, las formulaciones orales pueden formularse también en disolución salina o tampones para neutralizar las condiciones ácidas internas o pueden administrase sin portadores.
Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Con este fin, pueden usarse disoluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Pueden añadirse tintes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de gragea para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste suave pueden contener los ingredientes activos mezclados con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Pueden usarse también microesferas formuladas para administración oral. Dichas microesferas han sido bien definidas en la técnica. Todas las formulaciones para administración oral deberían estar en dosificaciones adecuadas para dicha administración.
Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas masticables formuladas de manera convencional.
Para administración por inhalación, los compuestos para uso según la presente invención pueden suministrarse convenientemente en forma de una presentación de pulverizador en aerosol a partir de paquetes a presión o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presión, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos, por ejemplo de gelatina para uso en un inhalador o insuflador, pueden formularse para contener una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos, cuando es deseable suministrarlos sistémicamente, pueden formularse para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección intravenosa rápida o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácido graso sintéticos tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.
Como alternativa, los compuestos activos pueden estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos, antes del uso.
Los compuestos pueden formularse también en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos pueden formularse también en forma de una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de larga acción pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también portadores o excipientes en fase sólida o gel adecuados. Los ejemplos de dichos portadores o excipientes incluyen, pero sin limitación, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.
Son formas de preparación farmacéutica líquidas o sólidas adecuadas, por ejemplo, disoluciones acuosas o salinas para inhalación, formas microencapsuladas, encocleadas, recubiertas sobre partículas de oro microscópicas, contenidas en liposomas, nebulizadas, aerosoles, aglomerados para implantación en la piel, o se secadas sobre un objeto punzante para arañar la piel. Las composiciones farmacéuticas incluyen también gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones con liberación postergada de compuestos activos, en cuya preparación se usan habitualmente excipientes y aditivos y/o auxiliares tales como disgregantes, aglutinantes, agentes de recubrimiento, agentes de hinchamiento, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes o solubilizantes como se describen anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para uso en una variedad de sistemas de suministro de fármaco. Para una breve revisión de los métodos para suministro de fármaco, véase Langer (1990) Science 249: 1527-1533.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes, y opcionalmente otros agentes terapéuticos y/o antígenos, pueden administrarse per se (puros) o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero las sales farmacéuticamente no aceptables pueden usarse convenientemente para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Dichas sales incluyen, pero sin limitación, aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluenosulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico y bencenosulfónico. También, dichas sales pueden prepararse como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo ácido carboxílico.
Los agentes de tamponamiento adecuados incluyen: ácido acético y una sal (1-2% p/v), ácido cítrico y una sal (1-3% p/v), ácido bórico y una sal (0,5-2,5% p/v) y ácido fosfórico y una sal (0,8-2% p/v). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0,003-0,03% p/v), clorobutanol (0,3-0,9% p/v), parabenos (0,01-0,25% p/v) y timerosal (0,004-0,02% p/v).
Las composiciones farmacéuticas de la invención contienen una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante y, opcionalmente, antígenos y/u otros agentes terapéuticos incluidos opcionalmente en un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable" significa una o más cargas sólidas o líquidas, diluyentes o sustancias encapsulantes compatibles que son adecuados para administración a un ser humano u otro animal vertebrado. El término "portador" designa un ingrediente orgánico u inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas pueden mezclarse también con los compuestos de la presente invención, y entre sí, de tal manera que no haya interacción.
Para el tratamiento de un sujeto, dependiendo de la actividad del compuesto, el modo de administración, el fin de la inmunización (concretamente, profiláctico o terapéutico), la naturaleza y gravedad del trastorno, la edad y peso corporal del paciente, pueden ser necesarias diferentes dosis. La administración de una dosis dada puede llevarse a cabo mediante administración única en forma de una unidad de dosificación individual o también de varias unidades de dosis menor. La administración múltiple de dosis a intervalos específicos de semanas o meses es habitual para reforzar las respuestas específicas de antígeno.
Otros sistemas de suministro pueden incluir sistemas de suministro de liberación cronometrada, liberación retardada o liberación mantenida. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de los compuestos, aumentando la conveniencia para el sujeto y el médico. Están disponibles muchos tipos de sistemas de suministro de liberación y son conocidos por los expertos ordinarios de la técnica. Incluyen sistemas basados en polímero tales como poli(lactida-glicolida), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, poli(ácido hidroxibutírico) y polianhídridos. Se describen microcápsulas de polímeros extraños que contienen fármacos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.075.109. Los sistemas de suministro incluyen también sistemas no poliméricos que son: lípidos incluyendo esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-, di- y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; recubrimientos de cera; comprimidos por compresión que usan aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados y similares. Los ejemplos específicos incluyen, pero sin limitación: (a) sistemas erosivos en los que un agente de la invención está contenido en una forma en una matriz tales como los descritos en las patentes de EE.UU. nº 4.452.775, 4.675.189 y 5.736.152, y (b) sistemas de difusión en los que un componente activo penetra a una velocidad controlada desde un polímero tal como se describe en las patentes de EE.UU. nº 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686. Además, pueden usarse sistemas de suministro de material basado en bombeo, algunos de los cuales están adaptados para implantación.
La presente invención se ilustra adicionalmente con los siguientes ejemplos, que en modo alguno deben considerarse como limitantes adicionales. Los contenidos enteros de todas las referencias (incluyendo referencias de la bibliografía, patentes expedidas, solicitudes de patente publicadas y solicitudes de patente en tramitación junto con la presente) citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan expresamente por la presente como referencia.
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Ejemplos Ejemplo 1 El ODN 2395 es un activador notablemente fuerte de células NK y de la producción de IFN-\alpha
Se han reconocido y descrito anteriormente oligodesoxinucleótidos (ODN) que contienen motivos neutralizantes consistentes en repeticiones de la secuencia CG tales como CGCGCG o en los que el CG está precedido por una C y/o seguido por una G. Se cree que estos motivos neutralizantes reducen los efectos estimulantes del ODN en múltiples lecturas, tales como la secreción de IL-6, IL-12, IFN-\gamma, TNF-\alpha y la inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12631-12636.
En muchos casos, la presencia de un motivo neutralizante en un oligonucleótido junto con un motivo estimulante se creía que evitaba la activación inmunitaria. Uno de dichos ODN que contiene tanto motivos estimulantes como neutralizantes es el ODN 2136, que tiene la secuencia TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEC ID Nº 19). El extremo 3' de este ODN contiene un motivo neutralizante bastante típico, CGGCGCGCGCCC (SEC ID Nº 37), derivado del extremo 3' del ODN 2010 inhibidor (GCGGCGGGCGGCGCGCGCCC, SEC ID Nº 38). Sorprendentemente, el ODN 2136 tenía una fuerte actividad inductora de la actividad lítica de células NK (unidades líticas, U.L.). Como se muestra en la Tabla 1, el ODN 2136 a una concentración de 3 \mug/ml era realmente más fuerte que el patrón fosforotioato estimulante de células B y células NK ODN 2006 (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT, SEC ID nº 39) para la inducción de U.L. Más llamativamente, mientras que el ODN 2006 inducía sólo la producción de 2,396 pg/ml de IFN-\alpha, el ODN 2136 inducía la producción de 14,278 pg/ml (Figura 1). Esto indicaba que, sorprendentemente, la presencia de esta secuencia neutralizante no había de evitarse necesariamente.
TABLA 1 PBL humanos cultivados durante una noche con diversos ODN
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Secuencias de ODN para la Tabla 1
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Sin embargo, en un esfuerzo por entender esta observación, se creó un activador de NK e inductor de IFN-\alpha aún más fuerte combinando el extremo 3' del ODN 2136 con el extremo 5' del ODN 2006. El ODN 2395 resultante (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG, SEC ID Nº 1) incorporaba fortuitamente un cambio en la última base del extremo 3' de C a G. Este único cambio de base tiene el efecto de crear un palíndromo perfecto de 12 bases de longitud en el extremo 3' del ODN 2395, mientras que en el ODN 2136 el palíndromo es de sólo 10 bases de longitud.
La Tabla 2 muestra otro ejemplo de datos en que el ODN 2395 es notablemente potente en la inducción de las U.L. de células NK en comparación con la mayoría de los otros ODN de cadena principal toda fosforotioato. En este ensayo, el ODN 2395 es más débil que el control ODN 1585 positivo, que tiene una cadena principal fosforotioato/fosfodiéter quimérica (SOS). El ODN 1585 (ggGGTCAACGTTGAgggggG, SEC ID Nº 35) se describe en la solicitud PCT publicada WO 01/22990. A la baja concentración de 0,6 \mug/ml ensayada en este experimento, el ODN 2136 no inducía U.L. por encima del fondo de 0,03 en el control sin ODN. La Figura 2 y la Figura 3 muestran el nivel de proteína quimiotáctica de monocito (MCP)-1 y proteína inducible de IFN-1 (IP)-10, respectivamente, en los sobrenadantes de cultivos de células NK de la Tabla 2. La MCP-1 es una quimiocina que es un ligando de CCR2 y está asociada tanto a respuestas inmunitarias de tipo Th1 como Th2. La IP-10 es una quimiocina CXC que es un ligando de CXCR3 y está asociada a respuestas Th1. Loetscher P. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 2986-2991. Estos datos muestran que el ODN 2395 es un inductor relativamente fuerte de la producción de IP-10, pero induce sólo niveles medios
de MCP-1.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 PBL humanos cultivados durante una noche con diversos ODN
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Secuencias de ODN para la Tabla 2
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Basándose en estos y otros datos, se concluyó que la secuencia de ODN 2395 era un activador notablemente fuerte de células NK y de la producción de IFN-\alpha.
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Ejemplo 2 Los ODN relacionados con ODN 2395 son también fuertes activadores de células NK y de la producción de IFN-\alpha
Se diseñaron y se sintetizaron ODN 2427-2433 (SEC ID Nº 2-8) adicionales para ensayar la posibilidad de que el palíndromo en el extremo 3' del ODN 2395 pueda ser importante en su actividad inmunoestimulante. La Tabla 3 compara la capacidad de estos diferentes ODN de activar U.L. de NK. Como resulta evidente a partir de estos datos, el ODN más fuerte a la concentración de 1 \mug/ml es el ODN 2429 (TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG, SEC ID Nº 4) que inducía 2,85 U.L. de actividad NK. El ODN 2006 era muy débil en este experimento y todos los demás oligos que se ensayaron, excepto el control ODN 2118 (GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG, SEC ID Nº 36) que no tiene CG, eran más fuertes que 2006. El ODN 2429 es notable debido a que es el único que mantiene un palíndromo de 12 bases, aunque es un palíndromo diferente del que estaba presente en 2395. El ODN 2430 (TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG, SEC ID Nº 5), que es el segundo ODN más fuerte a la concentración de 1 \mug/ml, es similar, pero el palíndromo se ha acortado ligeramente a 10 bases de longitud. El resto de los ODN no tienen secuencias palindrómicas o son más cortas, e inducen menos actividad NK.
TABLA 3 PBL humanos cultivados durante una noche con diversos ODN
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Secuencias de ODN para la Tabla 3
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La Figura 4 muestra la capacidad de estos oligos de inducir la producción de IFN-\alpha en comparación con el control positivo SOS ODN 2216 (GGGGGACGATCGTCGGGGG, SEC ID Nº 55), 2334 (GGGGTCGACGTCGACGTC
GAGGGGGGG, SEC ID Nº 56) y 2336 (GGGGACGACGTCGTGGGGGGG, SEC ID Nº 57). Todos los ODN relacionados con 2395 inducen un mayor nivel de producción de IFN-\alpha que el ODN 2006, aunque los niveles están por debajo de los niveles inducidos por el ODN SOS quimérico. El orden de grado de inducción de la expresión de IFN-\alpha es aproximadamente similar al de U.L. de NK, observándose los efectos más fuertes en los ODN 2395 y 2429.
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Ejemplo 3 Los fuertes efectos estimulantes sobre células NK y la producción de IFN-\alpha no se corresponden con efectos en células B
Como se muestra en la Figura 5A, el ODN 2395 y sus próximos eran relativamente más débiles a una concentración de 0,25 \mug/ml que el ODN 2006 o su próximo 2397, en términos de su capacidad de inducir la expresión de células B de CD86 a las 48 horas. Como se ha observado anteriormente, a concentraciones de ODN mayores tales como 1 \mug/ml, se observó menos diferencia entre los diversos ODN (Figura 5B). En el mismo experimento, se midió también la activación de células B mediante un ensayo de proliferación (incorporación de ^{3}H-timidina; Figura 6). De nuevo, a la concentración de 0,25 \mug/ml, el ODN 2006 y el ODN 2397 (SEC ID Nº 44) eran de lejos los más fuertes (Figura 6A). Sin embargo, a concentraciones mayores, los ODN relacionados con 2395 eran de eficacia similar (Figura 6B).
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Ejemplo 4 El ODN 2395 y ODN relacionados son inductores débiles de IL-10
Los estudios previos han sugerido que la mayoría de la producción de IL-10 que se induce por CpG deriva de células B. Como se muestra en la Figura 7, la expresión de IL-10 se correlacionaba bien con la proliferación de células B. De nuevo, el ODN 2006 y su próximo ODN 2397 eran los más fuertes a la concentración baja de 0,25 \mug/ml. El ODN 2395 y sus próximos inducían menos producción de IL-10 a esta concentración.
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Ejemplo 5 Dependencia de la concentración del efecto inmunoestimulante
Estudios adicionales de esta clase de oligonucleótidos y los derivados implicaron ODN de números 2427-2433 (SEC ID Nº 2-8). Los datos para estos ODN se muestran en la Figura 8. Esta demuestra de nuevo que el ODN 2006 era muy débil para inducir la producción de IFN-\alpha a una concentración de 1 ó 6 \mug/ml. Sin embargo, el ODN 2395 inducía cantidades sustanciales de IFN-\alpha, especialmente a la menor concentración de 1 \mug/ml. Se han observado ocasionalmente ODN en los que la actividad estimulante se reducía a las concentraciones mayores, tales como 6 \mug/ml, en comparación con los efectos observados a las concentraciones menores tales como 1 \mug/ml. En los experimentos mostrados en la Figura 8, el ODN 2395 era más potente a la concentración menor que a la concentración mayor, pero el ODN 2429 era más potente a la concentración mayor. En contraposición con la curva de dosis-respuesta invertida común de ODN de fosforotioato, los ODN quiméricos tales como ODN 2336 en este experimento mostraron típicamente efectos inmunoestimulantes aumentados a concentraciones mayores. El efecto estimulante del ODN 2432 en este experimento mostrado en la Figura 8 era interesante, considerando que este ODN no tiene un buen palíndromo. Este sistema con actividad estimulante de células B relativamente débil se muestra en la Figura 5 y la Figura 6.
Ejemplo 6 Relación recíproca entre la estimulación con células B y la estimulación de NK y la secreción de IFN-\alpha
La Figura 9 muestra otro experimento en el que el ODN 2395 a una baja concentración de 0,4 \mug/ml era significativamente más débil que el ODN 2006 para inducir la expresión de células B de CD86. Los otros próximos de 2395 muestran una pérdida menos marcada de estimulación de células B. De forma interesante, existe la sugerencia del mismo orden de grado de pérdida de estimulación de células B que se había observado anteriormente para la ganancia de estimulación de NK: el ODN 2429, seguido del ODN 2430, son los estimulantes de células B más débiles entre los próximos a 2395. Esto plantea la posibilidad de que la pérdida de estimulación de células B por los ODN similares a 2395 esté estrechamente relacionada con la ganancia de estimulación de NK y secreción de IFN-\alpha. La Figura 10 y la Figura 11 muestran que se observa inducción de IFN-\alpha con ODN 2395 y ODN 2429, seguido de ODN 2430. La Tabla 4 y la Figura 12, de un experimento separado, muestran también la fuerte capacidad de los ODN 2395 y ODN 2429 de inducir la secreción de IFN-\alpha en dos donantes humanos diferentes (D141 y D142).
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TABLA 4 Secreción de IFN-\alpha por variantes de ODN 2395^{1}
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Secuencias de ODN para la Tabla 4
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Ejemplo 7 Características del dominio rico en GC
Sorprendentemente, ninguno de los ODN 5293-5297 demostró respuestas inmunoestimulantes fuertes. El ODN 5293 contiene un palíndromo de 10 bases, pero el palíndromo difiere del de 2395 en que el CG central está invertido a un GC. Sin embargo, se cree que este cambio no puede explicar por sí mismo la pérdida de actividad, puesto que el ODN 2429 tiene también dicha inversión. En lugar de ello, pueden aparecer mayores niveles de actividad con un palíndromo de 12 bases a menos que haya un CG central en el palíndromo. Sin embargo, el ODN 2430 tiene también sólo un palíndromo de 10 bases con un dinucleótido GC central. La actividad inmunoestimulante del ODN 2430 puede potenciarse por el hecho de que contiene cinco dinucleótidos CpG en el extremo 3', mientras que el ODN 5293 contiene sólo tres.
El ODN 5294 contiene sólo un palíndromo de 6 bases, lo que podría estar relacionado posiblemente con su baja actividad. El ODN 5295 igualmente no tiene un buen palíndromo. La baja actividad del ODN 5296 sugiere que simples repeticiones de CCG no son suficientes para conferir los efectos inmunoestimulantes del ODN 2395. El ODN 2397 tiene un palíndromo de 12 bases perfecto en el extremo 3', pero no tiene motivos CpG en el extremo 5'. Puesto que el palíndromo de 12 bases en el ODN 5297 es el mismo que en el ODN 2429, puede concluirse que el motivo 5' TCGTCG del ODN 2429 es importante para su actividad inmunoestimulante. Es decir, se cree que la presencia del palíndromo neutralizante de ODN 2429 en un extremo de un oligonucleótido será insuficiente para proporcionar actividad inmunoestimulante en ausencia de al menos un motivo estimulante en el otro extremo.
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Ejemplo 8 Efectos sobre la producción de IFN-\gamma
Se han realizado varios tipos de ensayos adicionales para entender mejor el intervalo de efectos inmunoestimulantes de esta nueva clase de ácidos nucleicos inmunoestimulantes. La Figura 13 muestra algunos de los efectos de estos ODN sobre la producción de IFN-\gamma a partir de los sobrenadantes de PBMC humanos. Estas células eran las mismas que las usadas en los experimentos mostrados en la Tabla 3, pero se ensayaron los niveles de IFN-\gamma en los sobrenadantes de los cultivos. El panel C de la Figura 3 muestra que los ODN de CpG SOS tales como el ODN 1585 inducen cierta producción de IFN-\gamma, mientras que los ODN sin el motivo CpG (por ejemplo, ODN 2118 control) no lo hacen. Los paneles A y B de la Figura 13 muestran que el ODN 2006 es relativamente débil para inducir la producción de IFN-\gamma, mientras que el ODN 2395 y sus próximos son algo más fuertes.
Se realizó otro conjunto de estudios para examinar los efectos de estos ODN diferentes sobre células dendríticas. Las DC plasmacitoides (pDC) son la fuente del IFN-\alpha que se produce en respuesta al ODN 2395 y sus próximos. Los efectos de los diversos ODN sobre las DC mieloides (mDC) son relativamente similares en que todos los ODN inducen a mDC parcialmente purificadas a activar células T CD4+, produciendo IFN-\gamma (Figura 14 y Figura 15). Se aislaron DC mieloides de una capa leucocítica y se incubaron con GM-CSF (4,4 ng/ml) y diversos ODN durante 2 días. Se aislaron entonces células T no expuestas a CD4+ de un donante diferente, se mezclaron con las DC a relaciones de efector a diana (E:T) seleccionadas y se incubaron durante 6 días más. Se tiñeron entonces las células y se analizaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se midieron los resultados en términos del porcentaje de células CD3+ que se teñían por IFN-\gamma. La Figura 14 muestra el porcentaje de células T que se teñían positivamente por IFN-\gamma y la Figura 15 muestra la intensidad media de fluorescencia (MFI) de tinción por IFN-\gamma en estas células.
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Ejemplo 9 No todos los palíndromos ricos en GC son eficaces
Se sintetizaron varios ODN adicionales para entender mejor los requisitos estructurales de esta nueva clase de ODN. Puesto que se había observado que los ODN inmunoestimulantes potentes contenían palíndromos ricos en GC, se sintetizaron los ODN 2449 (TCGTCGTTTTCGGGGGGCCCCC, SEC ID Nº 9) y 2450 (TCGTCGTTTTCCCCC
CGGGGGG, SEC ID Nº 10) que tenían palíndromos ricos en GC que eran simplemente sólo G seguidas de sólo C o sólo C seguidas de sólo G. Como se muestra en la Figura 16, ninguno de estos ODN inducía la producción de
IFN-\alpha.
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Ejemplo 10 Efecto de la orientación de la secuencia inmunoestimulante y el motivo neutralizante
Se sintetizó el ODN 2451 (TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT, SEC ID Nº 11) para ensayar la posibilidad de que la orientación 5' y 3' del motivo TCGTCG "estimulante" y el palíndromo CGGCGCGCGCCG "neutralizante" (SEC ID Nº 23) pudieran invertirse sin perder actividad inmunoestimulante. Es más, el ODN 2451 era altamente estimulante (Figura 16). Se sintetizó el ODN 2452 (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT, SEC ID Nº 12) para determinar si podrían añadirse secuencias adicionales al extremo 3' del palíndromo CGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 23) sin reducir la actividad inmunoestimulante a condición de que el motivo estimulante TCGTCG estuviera en el extremo 5'. Es más, este ODN era también altamente inmunoestimulante (Figura 16).
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Ejemplo 11 Variantes de ODN 2395 y su inducción de IFN-\alpha
Para estudiar con más detalle los requisitos estructurales de esta nueva clase de ODN para inducir la secreción de IFN-\alpha, se sintetizaron variantes de ODN 2395 y se ensayó su actividad inmunoestimulante. La Tabla 5 resume los datos referentes a la inducción de IFN-\alpha.
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TABLA 5 Variantes de ODN 2395 y su inducción de IFN-\alpha^{1,2}
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A partir del primer conjunto de experimentos que usa los ODN de fosforotioato 2395 y 2427-2433, resultó evidente que la secuencia palindrómica en el extremo 3' del ODN tiene un papel importante para la inducción de la secreción de IFN-\alpha por células dendríticas que son las principales productoras de IFN-\alpha (véanse 2395 y 2429), aunque algunos ODN sin dicho palíndromo en el extremo 3' (por ejemplo, ODN 2430 y ODN 2432) inducían también IFN-\alpha en cantidades algo menores (ejemplo de la Figura 17A). Los ODN 2395 y ODN 2429 inducían las mayores cantidades de IFN-\alpha, mientras que el 2006 (ODN de clase B) inducía de nada a cantidades mínimas, y el ODN 2336 (ODN de clase A) inducía grandes cantidades de esta citocina. La mayoría de experimentos demostraron que el ODN 2429 inducía cantidades aún mayores de esta citocina (Figura 17B). La introducción de un motivo TCG adicional (por ejemplo, ODN 2427 y ODN 2428) parecía tener efectos negativos sobre la secreción de IFN-\alpha. Basándose en los datos de estos y otros estudios de ODN 2186, el gcc en el extremo 3' parecía desempeñar un posible papel en los efectos observados.
Por lo tanto, se ensayó otro conjunto de ODN que tenían todos secuencias GCC en el extremo 3'. No se observó que ninguno de estos ODN indujera IFN-\alpha. Por lo tanto, sólo el GCC mismo en un palíndromo no parece ser suficiente para los efectos observados.
Además, el ODN 5297 con un TGC en el extremo 5' no inducía nada de IFN-\alpha a pesar de portar la secuencia 3' palindrómica. Esto condujo a la conclusión de que no sólo la secuencia 3' palindrómica, sino también el motivo 5' TCG es importante para la actividad de estos ODN.
Esto se confirmó usando el ODN 5328 (2395 con motivo 5' TGC). En contraposición con la metilación de los ODN de clase A, la metilación de al menos el motivo 5' reducía, pero no anulaba, la secreción de IFN-\alpha. Este descubrimiento está de acuerdo con los resultados obtenidos con ODN de clase B. No obstante, un ODN con parte del palíndromo 3' pero una secuencia diferente en el extremo 5' con sólo un dinucleótido CpG (ODN 2136) inducía también IFN-\alpha. En resultados preliminares que usan este ODN y un ODN con el palíndromo 3' completo (ODN 5315), el ODN 5315 era mejor que el ODN 2136, pero no tan bueno como el ODN 2395.
El hecho de que el ODN 5329 no parece inducir IFN-\alpha o sólo cantidades muy bajas, aunque tenga un palíndromo CG completo en el extremo 3', indica que se prefieren secuencias palindrómicas específicas para la actividad de IFN-\alpha.
Ejemplo 12 Relación recíproca entre la activación de células B y la inducción de IFN-\alpha
Se realizó un experimento de activación de células B adicional con un panel de algunos de los ODN del ejemplo 11 (Figura 18). Los resultados indicaron que cuanto mejor es un ODN para la inducción de IFN-\alpha, menos activo es en células B (comparar especialmente los ODN 2006, 2336, 2395 y 2429). No obstante, se demostró también que todos estos ODN eran superiores al 2336 (ODN de clase A) en la estimulación de células B.
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Ejemplo 13 Efecto sobre la secreción de IFN-\gamma
Se determinó también la secreción de IFN-\gamma tras incubación de PBMC con diferentes concentraciones de ODN en diferentes puntos temporales (Figura 19A-C). Los ODN ensayados inducían una secreción de IFN-\gamma con el orden de grado 2336 > 2395, 2429 > 2006. No obstante, la diferencia entre los ODN no era tan clara como usando IFN-\alpha como lectura.
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Ejemplo 14 Efecto sobre IFN-\gamma en MLR
Se determinó también el efecto de estos ODN sobre la inducción de IFN-\gamma en una reacción linfocitaria mixta (MLR). En estas condiciones, los linfocitos de un donante responden a antígenos expresados en células de otro donante. Los resultados demostraron que los ODN 2006, 2336, así como 2395, eran capaces de potenciar la secreción de IFN-\gamma durante dicha respuesta específica de antígeno (Figura 20). Esto indicaba que todos estos ODN eran capaces de potenciar la reactividad ante antígeno(s) específico(s).
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Ejemplo 15 El ODN 2395 induce menos IL-10 que el ODN 2006
Un conjunto adicional de experimentos se centró en la inducción de la citocina proinflamatoria IL-10. De nuevo, como antes para IFN-\gamma, se incubaron PBMC durante tiempos diferentes y con diferentes concentraciones de ODN (Figura 21A-C). Los resultados demuestran que, como se muestra anteriormente, el ODN 2006 induce cantidades relativamente altas de IL-10 en contraposición con el ODN 2336, que induce sólo cantidades de mínimas a bajas. En contraposición, el ODN 2395, así como el ODN 2429, inducen más IL-10 que el ODN 2336, pero menos que el ODN 2006. Esto confirma de nuevo que el ODN de esta nueva clase de ODN inmunoestimulantes tiene actividades estimulantes que se encuentran entre las descritas para ODN de clase A y de clase B.
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Ejemplo 16 El ODN 2395 induce menos TNF-\alpha que el ODN 2006, pero más que el ODN 8954
Se cultivaron PBMC humanos durante 6 horas con 1,6 \mug/ml de ODN 2006, 8954, 2395, 2429 o LPS, y se recogieron entonces los sobrenadantes y se midió el TNF-\alpha mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en la Tabla 6.
TABLA 6 Inducción de TNF-\alpha por ODN representativos de diferentes clases
16
Experimentos adicionales indicaron que las citocinas IL-5 así como IL-15 no podían detectarse en estas condiciones experimentales tras la incubación de PBMC con estos ODN.
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Ejemplo 17 Inducción de IP-10
Se cultivaron PBMC humanos solos, en presencia de IL-2, en presencia de ODN control 1585 u ODN control 2118 a 10 \mug/ml, o en presencia de diversos ODN a 0,6 ó 3,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midió la IP-10 mediante ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA) específico. Se muestran los resultados en la Figura 22. Los ODN 2395, 2429, 2430, 2432 y 2451 a 3,0 \mug/ml y el ODN 2452 a 0,6 \mug/ml inducían todos grandes cantidades de IP-10.
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Ejemplo 18 Inducción de IFN-\alpha
Se cultivaron PBMC humanos solos, en presencia de IL-2, en presencia de ODN control 1585 u ODN control 2118 a 10 \mug/ml, o en presencia de diversos ODN a 0,6 ó 3,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midió el IFN-\alpha mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en la Figura 23A (ODN a 0,6 \mug/ml) y la Figura 23B (ODN a 3,0 \mug/ml). Los ODN 2395, 2427, 2429, 2430, 2431, 2432 y 2451 a 3,0 \mug/ml y el ODN 2452 a 0,6 \mug/ml inducían todos grandes cantidades de IFN-\alpha.
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Ejemplo 19 Inducción de IFN-\gamma
Se cultivaron PBMC humanos solos, en presencia de IL-2, en presencia de ODN control 1585 u ODN control 2118 a 10 \mug/ml, o en presencia de diversos ODN a 0,6 ó 3,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midió el IFN-\gamma mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en la Figura 24. Los ODN 2395, 2427, 2429, 2430, 2431, 2432, 2451 y 2452 a 3,0 \mug/ml y el ODN 2352 a 0,6 \mug/ml inducían todos grandes cantidades de IFN-\gamma.
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Ejemplo 20 Inducción de IL-6
Se cultivaron PBMC humanos solos, en presencia de IL-2, en presencia de ODN control 1585 u ODN control 2118 a 10 \mug/ml, o en presencia de diversos ODN a 0,6 ó 3,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midió el IL-6 mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en la Figura 25. Los ODN 2395, 2430, 2432, 2433, 2136, 2449, 2450, 2451 y 2452 a 0,6 \mug/ml y el ODN 2449 y el ODN 2451 a 3,0 \mug/ml inducían todos grandes cantidades de IL-6.
Ejemplo 21 Inducción de IFN-\alpha
Se cultivaron PBMC humanos solos o en presencia de diversos ODN a 3,0 ó 6,0 mg/ml. Los ODN incluían 2006, 8954, 2395, 2449, 2450, 2451, 2452, 5373 (CGGCGCGCGCCG, SEC ID Nº 23), 5374 (CGGCGCGCGCCGCGGC
GCGCGCCG, SEC ID Nº 24), 5375 (CGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT, SEC ID Nº 25), 5376 (TCGGCGCGCGC
CGTGCTGCTTT, SEC ID Nº 26) y 5377 (CCGCCGTTTTCGGCGCGCGCCG, SEC ID Nº 27). Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midió el IFN-\alpha mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en la Figura 26. Los ODN 2395, 2451, 2452 y 5376 inducían todos IFN-\alpha.
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Ejemplo 22 Inducción de IFN-\alpha por ODN 5515 y ODN 5516
Se cultivaron PBMC humanos obtenidos de dos donantes (D346 y D240) solos o en presencia de ODN 2006, ODN 5515 u ODN 5516 a 0,8, 2,4 ó 6,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midió el IFN-\alpha mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en la Tabla 7. Los ODN 5515 y ODN 5516 inducían IFN-\alpha más eficazmente que el ODN 2006, particularmente a concentraciones de ODN de 2,4 y 6,0 \mug/ml.
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Ejemplo 23 Inducción de IFN-\alpha por ODN 20184, 20185 y 20186
Se cultivaron PBMC obtenidos de tres donantes (D445, D446 y D448) solos o en presencia de ODN 2006, ODN 20184, ODN 20185 u ODN 20186 a 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 ó 1,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midió el IFN-\alpha mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en la Tabla 8. Los ODN 20184, ODN 20185 y ODN 20186 inducían IFN-\alpha más eficazmente que el ODN 2006, particularmente a 0,2-0,5 \mug/ml.
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TABLA 7 Inducción de IFN-\alpha (pg/ml) por ODN 5515 y ODN 5516
17
TABLA 8 Inducción de IFN-\alpha (pg/ml) por ODN 20184, 20185 y 20186
18 
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Ejemplo 24 Inducción de IFN-\alpha por ODN 8954, 5569 y 5570
Se cultivaron PBMC humanos obtenidos de tres donantes (D521, D525 y D526) solos o en presencia de ODN 2006 (SEC ID Nº 39), ODN 8954, ODN 5569 (TIGTIGTTTTCGGCGGCCGCCG, SEC ID Nº 63) u ODN 5570 (TCIT
CITTTTCGGCGGCCGCCG, SEC ID Nº 70) a 0,03, 0,06, 0,125, 0,25 ó 1,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midieron IFN-\alpha e IL-10 mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en las Tablas 9 y 10.
TABLA 9 Inducción de IFN-\alpha (pg/ml) por ODN 8954, 5569 y 5570
20
TABLA 10 Inducción de IL-10 (pg/ml) por ODN 8954, 10101-2, 5569 y 5570
22 
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La memoria descriptiva escrita anterior se considera suficiente para posibilitar a un experto en la técnica practicar la invención. La presente invención no ha de limitarse en alcance por los ejemplos proporcionados, puesto que los ejemplos se pretenden sólo como una simple ilustración de un aspecto de la invención, y otras realizaciones funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Resultarán evidentes para los expertos en la técnica diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente memoria, a partir de la descripción anterior y entra dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las ventajas y objetos de la invención no están necesariamente comprendidos por cada realización de la invención.
<110> Coley Pharmaceutical Group Inc.
\hskip1cm
Coley Pharmaceutical GmbH 
\hskip1cm
University of Iowa Research Foundation 
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Oligonucleótidos inmunoestimulantes de motivos combinados con actividad mejorada
\vskip0.400000\baselineskip
<130> TSJ/45454EP1
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 02768621.1
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 19-08-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/313.273
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 17-08-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/393.952
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 03-07-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Oligonucleótido sintético
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\hskip1cm
44 
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<212> ADN
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 22
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\hskip1cm
45 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
46 
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\hskip1cm
47 
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\hskip1cm
48 
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\hskip1cm
49 
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\hskip1cm
50 
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\hskip1cm
51 
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\hskip1cm
52 
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\hskip1cm
53 
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\hskip1cm
54 
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\hskip1cm
55 
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<220>
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\hskip1cm
56 
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<220>
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\hskip1cm
57 
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\hskip1cm
58 
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\hskip1cm
59 
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<220>
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
60 
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<220>
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\hskip1cm
61 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
63 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
64 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
65 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
66 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
67 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
68 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
69 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
70 
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
71 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
72 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= 5-metilcitosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
74 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
75 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
76 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
78 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
79 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
80 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
82 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
84 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
85 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= inosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
86 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
87 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
88 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
89 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
90 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
91 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
92 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= inosina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n= inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
93 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
94 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
96 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
97 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
98 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
99 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
100 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
101 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
102 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
103 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
104 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (28)

1. Un ácido nucleico inmunoestimulante de 14-100 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la fórmula:
5' PX_{1}DCGHX_{2} 3' o 5' X_{1}DCGHX_{2}P 3'
en la que X_{1} y X_{2} son independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud, D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina, H es una base distinta de G y P es una secuencia que contiene palíndromo rica en CG de al menos 10 bases de longitud, en la que
a)
H es timina (T) y X_{2} es CGTTT o CGTTTT,
b)
P es completamente palindrómico, H es T y X_{2} se selecciona del grupo consistente en CG, CGT, CGTT, CGTTT y CGTTTT y/o
c)
P incluye al menos una hipoxantina (I).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 1, en el que las secuencias de bases comprenden:
a)
5' X_{1}DCGHX_{2}PX_{3} 3', en la que X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud,
b)
5' X_{1}DCGHPX_{3} 3', en la que X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud,
c)
5' DCGHX_{2}PX_{3} 3', en la que X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud,
d)
5' TCGHX_{2}PX_{3} 3', en la que X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud,
e)
5' DCGHPX_{3} 3', en la que X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud, y/o
f)
5' DCGHP 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un ácido nucleico inmunoestimulante de 14-100 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la fórmula
5' NX_{1}DCGHX_{2} 3' o 5' X_{1}DCGHX_{2}N 3'
en la que X_{1} y X_{2} son independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud. D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina, H es una base distinta de G y N es una secuencia neutralizante de células B que empieza por CGG y es de al menos 10 bases de longitud, en el que:
1)
para 5' NX_{1}DCGHX_{2} 3':
a)
H es timina (T) y/o
b)
H es T y X_{2} se selecciona del grupo consistente en CG, CGT, CGTT, CGTTT y CGTTTT, y
2)
para 5' X_{1}DCGHX_{2}N 3':
a)
H es T y X_{2} es CGTTTT.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 1, en el que en las fórmulas 5' PX_{1}DCGHX_{2} 3' y 5' X_{1}DCGHX_{2}P 3', la C está no metilada.
5. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 3, en el que en las fórmulas 5' NX_{1}DCGHX_{2} 3' y 5' X_{1}DCGHX_{2}N 3', la C está no metilada.
6. Un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico inmunoestimulante
a)
tiene una cadena principal resistente a nucleasa,
b)
tiene una cadena principal fosforotioato,
c)
tiene una cadena principal quimérica,
d)
es de 14-40 nucleótidos de longitud y/o
e)
es de 14-30 nucleótidos de longitud.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia de bases comprende adicionalmente una secuencia de poli-T en el extremo 5' y/o 3'.
8. Un ácido nucleico inmunoestimulante de 13-100 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la fórmula:
5' N_{1}PyGN_{2}P 3'
en la que N_{1} es cualquier secuencia de 1 a 6 bases de longitud, Py es una pirimidina, G es guanina, N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de longitud y P es una secuencia que contiene un palíndromo rico en GC de al menos 10 bases de longitud, en la que N_{1}:
a)
incluye al menos un motivo citosina-hipoxantina (CI),
b)
incluye al menos un motivo TCI,
c)
incluye al menos un motivo IG,
d)
incluye al menos un motivo TIG, y/o
e)
es TCGG.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 8, en el que
a)
Py es C no metilada,
b)
N_{2} es al menos un 50% de pirimidinas,
c)
N_{2} es al menos un 50% de T,
d)
N_{2} no incluye ningún motivo poli-G ni poli-A, y/o
e)
N_{1}PyGN_{2} es una secuencia seleccionada del grupo consistente en TTTCG, TTTTCG, TTTTTCG, TTCGT y TTTCGT.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 8, en el que el ácido nucleico inmunoestimulante tiene:
a)
una cadena principal completamente resistente a nucleasa, opcionalmente en el que la cadena principal está compuesta por enlaces fosforotioato,
b)
una cadena principal completamente fosfodiéster y/o
c)
una cadena principal quimérica, preferiblemente en la que el ácido nucleico inmunoestimulante tiene al menos un enlace fosfodiéster entre un motivo CG, CI o IG.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 8, en el que P:
a)
es completamente palindrómico,
b)
es una secuencia palindrómica que tiene entre 1 y 3 bases intercaladas consecutivas, preferiblemente en el que las bases intercaladas son TG,
c)
incluye al menos 3 bases C y al menos 3 G,
\newpage
d)
incluye al menos 4 bases C y al menos 4 G,
e)
incluye al menos 5 bases C y al menos 5 G, y/o
f)
incluye al menos una hipoxantina.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 8, en el que el ácido inmunoestimulante es
a)
de 13-40 nucleótidos de longitud, y/o
b)
de 13-30 nucleótidos de longitud.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Un ácido nucleico inmunoestimulante de 13-100 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la fórmula:
5' N_{1}PyG/IN_{2}P 3'
en la que N_{1} es cualquier secuencia de 1 a 6 bases de longitud, Py es una pirimidina, G/I designa una sola base que es una G o una I, G es guanina e I es hipoxantina, N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de longitud y P es una secuencia que contiene un palíndromo de al menos 10 bases de longitud, en el que cuando G/I es G, P es un palíndromo rico en IC.
14. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 13, en el que cuando G/I es I:
a)
N_{1}PyIN_{2} es TCITCITTTT (SEC ID Nº 47),
b)
P es un palíndromo rico en GC, y/o
c)
P es un palíndromo rico en IC.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 13, en el que el ácido nucleico inmunoestimulante es de 13-30 nucleótidos de longitud.
16. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y un portador farmacéuticamente aceptable.
17. Una composición farmacéutica según la reivindicación 16, que comprende adicionalmente un antígeno, opcionalmente un antígeno tumoral.
18. Un método in vitro para inducir la expresión de interferón (IFN) de tipo 1, que comprende poner en contacto una célula capaz de expresar IFN de tipo 1 con un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
19. Un método in vitro para activar un linfocito citolítico natural (NK), que comprende poner en contacto una célula NK con un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
20. Un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método terapéutico que comprende poner en contacto el ácido nucleico inmunoestimulante con una célula capaz de expresar interferón (IFN) de tipo 1 e inducir así la expresión de IFN de tipo 1.
21. Un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método terapéutico que comprende poner en contacto el ácido nucleico con un linfocito citolítico natural (NK) y activar así la célula NK.
22. Un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método terapéutico que comprende tratar o prevenir una infección en un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, dicha infección.
23. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 22, en el que el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, una infección seleccionada del grupo consistente en infección vírica, bacteriana, fúngica y parasitaria.
24. Un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método terapéutico que comprende tratar o prevenir una afección alérgica en un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, dicha afección alérgica.
25. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 24, en el que la afección alérgica es asma alérgica.
26. Un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método terapéutico que comprende tratar o prevenir el cáncer en un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, cáncer.
27. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la reivindicación 26, en el que el cáncer se selecciona del grupo consistente en:
carcinoma de células basales, cáncer de tracto biliar, cáncer de vejiga, cáncer óseo, cáncer de cerebro y SNC, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cáncer de colon y recto, cáncer de tejido conectivo, cáncer del sistema digestivo, cáncer endométrico, cáncer esofágico, cáncer de ojo, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, neoplasma intraepitelial, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma incluyendo linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin, melanoma, mieloma, neuroblastoma, cáncer de la cavidad oral, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer del sistema respiratorio, sarcoma, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer tiroideo, cáncer uterino, cáncer del sistema urinario y otros carcinomas y sarcomas.
28. Un ácido nucleico inmunoestimulante que tiene una secuencia que comprende:
TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 1), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (SEC ID Nº 4), TCGT
CGTTTTCGGCGCGCCGCG (SEC ID Nº 5), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (SEC ID Nº 6), TCGTCGTTTT
CGGCCCGCGCGG (SEC ID Nº 7), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (SEC ID Nº 12), TCCTGACGTTC
GGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 13), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (SEC ID Nº 14), en la que Z es 5-metilcitosina o TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (SEC ID Nº 11).
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