ES2313715T3 - Compuestos de lipoxina con semivida prolongada. - Google Patents
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Abstract
COMPUESTOS QUE TIENEN LA LOCALIZACION ACTIVA DE LIPOXINAS NATURALES, PERO CON UN PERIODO DE SEMIDESINTEGRACION DE TEJIDO AMPLIADA. ESTAS PEQUEÑAS MOLECULAS SON UTILES PARA TRATAR ENFERMEDADES VASOCONSTRICTIVAS, INFLAMATORIAS, MIELOIDES SUPRESIVAS, CARDIOVASCULARES, Y GASTROINTESTINALES.
Description
Compuestos de lipoxina con semivida
prolongada.
Lipoxinas son un grupo de mediadores
biológicamente activos derivados del ácido araquidónico mediante la
acción de los sistemas enzimáticos de la lipogenasa. (Serhan, C.N.
y Samuelsson, B. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5335). La
formación en tipos celulares humanos se inicia mediante la
5-lipogenasa o 15-lipogenasa.
(Serhan, C.N. (1991) J. Bioenerg. Biomembr. 23:105). Los tipos
celulares de célula única generan lipoxinas en cantidades de
nanogramo durante la biosíntesis transcelular de eicosanoides de
neutrófilos-plaquetas y eosinófilos en seres
humanos. (Serhan, C.N. y Sheppard, K.-A. (1990) J. Clin. Invest.
85:772). Lipoxinas son eicosanoides conjugados que contienen
tetraenos que modulan eventos celulares en varios sistemas de
órganos.
Lipoxina A_{4} (LXA_{4}) y lipoxina B_{4}
(LXB_{4}) son las dos lipoxinas principales. Cada una potencia la
actividad de la proteína quinasa C (PKC) en núcleos de células de
eritroleucemia a 10 nM (Beckman, B.S. y col. (1992) Proc. Soc. Exp.
Biol. Med, 201:169). Cada una induce la vasodilatación temprana en
cantidades de nM (Busija, D.W. y col. (1989) Am. J. Physiol.
256:H468; Katoh, T. y col. (1992) Am. J. Physiol. 263 (Renal Fluid
Electrolyte Physiol. 32):F436). Los efectos vasodilatadores de las
lipoxinas están bien documentados. Por ejemplo, la administración
de LXA_{4} en cantidades micromolares por inhalación bloquea la
broncoconstrición en pacientes asmáticos. (Christie, P.E. y col.
(1992) Am. Rev. Respir. Dis. 145:1281).
En el intervalo de 10^{-10} M, LXA_{4}
también estimula la proliferación celular combinada con
concentraciones subóptimas de factor estimulante de colonias de
granulocito-macrófago (GM-CSF) para
inducir la formación de colonias en la médula ósea mieloide.
(Stenke, L. y col. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 180:255).
LXA_{4} también estimula la formación de colonias de células
mononucleares en seres humanos (Popov, G.K. y col. (1989) Bull.
Exp. Biol. Med. 107:93).
LXA_{4} inhibe la quimiotaxis de leucocitos
polimorfonucleares (Lee, T.H. y col. (1991) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 180:1416). Se ha encontrado que una combinación equimolar de
lipoxinas modula la interacción de células
neutrófilo-mesangiales polimorfonucleares en la
inflamación glomerular. (Brady, U.R. y col. (1990) Am. J. Physiol.
809). La activación de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN)
incluye la liberación de mediadores de anormalidades estructurales
y funcionales relacionadas con los estados iniciales de la
inflamación glomerular. (Wilson, C.B. y Dixon, F.J. (1986) En: The
Kidney, editado por B.M. Brenner y F.C. Rector. Filadelfia, PA:
Saunders, p.
800-891).
800-891).
Lipoxinas actúan como antagonistas de los
leucotrienos (LT), que son mediadores de la inflamación. LXA_{4}
modula la obstrucción de las vías respiratorias inducida por
LTC_{4} en pacientes asmáticos. (Christie, P.E. y col. (1992) Am.
Rev. Respir. Dis. 145:1281). LXA_{4} inhibe la inflamación mediada
por LTD_{4} y LTB_{4} en modelos animales in vivo.
(Badr, K.F. y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3438; Hedqvist,
P. y col. (1989) Acta Physiol. Scand. 137:571). La exposición
anterior a LXA_{4} (nM) bloquea las acciones de vasoconstricción
renal de LTD_{4} (Katoh, T. y col. (1992) Am. J. Physiol. 263
(Renal Fluid Electrolyte Physiol. 32) F436). La inflamación
inducida por leucotrieno se produce, por ejemplo, en artritis, asma,
varios tipos de shock, hipertensión, enfermedades renales,
reacciones alérgicas y enfermedades circulatorias incluyendo
infarto de miocardio.
Aunque lipoxinas son potentes moléculas pequeñas
que se podrían administrar in vivo para tratar numerosos
trastornos y enfermedades, estas moléculas tienen una corta viva
in vivo. Compuestos que tuvieran las mismas bioactividades
que las lipoxinas naturales, pero con una semivida in vivo
mayor, serían compuestos farmacéuticos valiosos.
Esta invención presenta análogos de lipoxina,
que tienen una región activa que es idéntica o similar a la
lipoxina natural, pero con una región de transformación metabólica
que es más resistente al catabolismo in vivo. Los análogos
de lipoxina descritos en esta memoria tienen la actividad biológica
de las lipoxinas naturales, pero una semivida metabólica más
prolongada. Algunos de los análogos de lipoxina descritos en esta
memoria pueden tener adicionalmente una potencia in vivo
aumentada, mayor afinidad de enlace a los receptores de lipoxina o
bioactividad potenciada, en comparación con las lipoxinas
naturales.
Se describen también procedimientos preferidos
para hacer los compuestos e intermedios descritos útiles para la
preparación, así como ensayos útiles para caracterizar los
compuestos de lipoxina respecto de su bioactividad, semivida in
vivo, capacidad para inhibir el metabolismo de lipoxina y/o para
determinar la afinidad de enlace a un receptor lipoxina.
La presente invención presenta además fármacos
de molécula pequeña basados en lipoxina y su uso para tratar o
prevenir una enfermedad o afección asociada con una respuesta
celular inadecuada o inapropiada mediada por lipoxina en un sujeto.
En una forma de realización, el análogo de lipoxina de molécula
pequeña actúa como un antagonista de leucotrieno y por tanto es
útil para tratar enfermedades o afecciones que sean el resultado de
estimulación mediante leucotrieno tal como inflamaciones inducidas
por leucotrieno. En otra forma de realización, el análogo de
lipoxina de molécula pequeña inicia la osteogénesis y por tanto es
útil para tratar los trastornos de supresión mieloide.
Al igual que las lipoxinas naturales, las
moléculas pequeñas descritas en esta memoria son muy potentes y
biocompatibles (es decir, no tóxicas). Sin embargo, a diferencia de
las lipoxinas naturales, los análogos de lipoxina inhiben,
resistes, o experimentan metabolismo más lentamente, y por tanto
tienen una actividad farmacológica más larga. Además, los
compuestos descritos en esta memoria son más lipófilos que las
lipoxinas naturales y por tanto se capturan más rápidamente por las
membranas biológicas.
Los compuestos de la invención tienen usos de
diagnóstico e investigación de los compuestos de lipoxina. Rasgos y
ventajas adicionales de la invención serán más evidentes a partir de
la descripción detallada y reivindicaciones siguientes.
Como se usan en el presente documento, las
siguientes frases y términos se definen como sigue:
Un "análogo de lipoxina" significa un
compuesto que tiene una "región activa" que funciona como la
región activa de una "lipoxina natural", pero que tiene una
"región de transformación metabólica" que difiere de la
lipoxina natural. Análogos de lipoxina incluyen compuestos que son
estructuralmente similares a una lipoxina natural, compuestos que
comparten el mismo lugar de reconocimiento del receptor, compuestos
que comparten la misma o análoga región de transformación
metabólica de lipoxina que lipoxina, y compuestos reconocidos en la
técnica como análogos de lipoxina. Análogos de lipoxina incluyen
metabolitos de un análogo de lipoxina. Los compuestos descritos en
el presente documento pueden contener uno o más centros de
asimetría. Cuando hay carbonos asimétricos, es posible más de un
estereoisómero, y se pretende que todas las formas isoméricas
posibles queden incluidas en las representaciones estructurales
mostradas. Los isómeros (R) y (S) ópticamente activos se pueden
resolver usando técnicas convencionales conocidas del técnico
experto. Se pretende que la presente invención incluya todos los
posibles diastereoisómeros así como los isómeros ópticamente
resueltos y los racémicos.
Los términos "lipoxina correspondiente" y
"lipoxina natural" se refieren a una lipoxina o metabolito de
lipoxina que aparece en la naturaleza. Cuando un análogo tiene
actividad de un receptor específico de lipoxina, la lipoxina
correspondiente o natural es el ligando normal de dicho receptor.
Por ejemplo, cuando un análogo es un análogo de LXA_{4} que tiene
actividad específica para un receptor específico de LXA_{4} en
células HL-60 diferenciadas, la lipoxina
correspondiente es LXA_{4}. Cuando un análogo tiene actividad como
antagonista respecto de otro compuesto (tal como leucotrieno), que
es antagonizado por una lipoxina que aparece en la naturaleza, esa
lipoxina natural es la lipoxina correspondiente.
"Región activa" significa la región de una
lipoxina natural o análogo de lipoxina que está asociada con
interacciones celulares in vivo. La región activa puede
unirse al "emplazamiento de reconocimiento" de un receptor
celular de lipoxina o una macromolécula o complejo de
macromoléculas, incluyendo una enzima y su cofactor. Los análogos
de lipoxina A_{4} preferidos tienen una región activa que
comprende C_{5}-C_{15} de la lipoxina A_{4}
natural. Los análogos de lipoxina B_{4} preferidos tienen una
región activa que comprende C_{5}-C_{14} de
lipoxina B_{4} natural.
El término "emplazamiento de
reconocimiento" o receptor es conocido en la técnica, y se
pretende que se refiera en general a una macromolécula o complejo
de macromoléculas funcional que debe reaccionar con ciertos grupos
de mensajeros celulares, tales como hormonas, leucotrienos, y
lipoxinas, antes del inicio de las respuestas bioquímicas y
fisiológicas a dichos mensajeros. Tal como se usa en esta solicitud,
un receptor puede estar aislado, en una célula intacta o
permeabilizada, o en un tejido, incluyendo un órgano. Un receptor
puede proceder o estar en un sujeto vivo, o puede estar clonado. Un
receptor puede existir normalmente o puede ser inducido por estado
de enfermedad, por una lesión, o artificialmente. Un compuesto de
esta invención puede unirse reversiblemente, irreversiblemente,
competitivamente, no competitivamente, sin competencia con respecto
al sustrato natural de un emplazamiento de reconocimiento.
Se pretende que el término "región de
transformación metabólica" haga referencia en general a aquella
porción de una lipoxina, un metabolito de lipoxina, o análogo de
lipoxina que incluye un análogo de metabolito de lipoxina, mediante
el cual una enzima o una enzima y su cofactor intentar llevar a cabo
una o más de las transformaciones metabólicas que dicha enzima o
enzima y cofactor normalmente realizan sobre las lipoxinas. La
región de transformación metabólica puede ser o no susceptible de
transformación. Un ejemplo no limitante de una región de
transformación metabólica de una lipoxina es una porción de
LXA_{4} que incluye el doble enlace C-13,14 o el
grupo hidroxilo C-15, o ambos.
El término "molécula con etiqueta
detectable" se define para incluir moléculas marcadas con
fluorescencia, fosforescencia y radiantes usadas para trazar,
rastrear o identificar el compuesto o emplazamiento de
reconocimiento del receptor al cual se enlaza la molécula con
etiqueta detectable. La molécula con etiqueta se puede detectar
mediante cualquiera de los diferentes procedimientos conocidos en la
técnica.
El término "análogo de lipoxina marcado" se
entiende además que abarca los compuestos marcados con isótopos
radioactivos, tales como pero sin limitarse a tritio (^{3}H),
deuterio (^{2}H), carbono (^{14}C), o marcado de cualquier otra
manera (por ejemplo fluorescencia). Los compuestos de esta invención
pueden marcarse o derivatizarse, por ejemplo, para experimentos
cinéticos de enlace, para elucidar adicionalmente rutas metabólicas
y mecanismos enzimáticos, o para caracterización mediante
procedimientos conocidos en la técnica de la química analítica.
El término "inhibe el metabolismo"
significa el bloqueo o reducción de la actividad de una enzima que
metaboliza una lipoxina nativa. El bloqueo o reducción se pueden
producir mediante enlace covalente, mediante enlace irreversible,
mediante enlace reversible que tiene un efecto práctico de enlace
irreversible, o mediante cualquier otro procedimiento que evite que
la enzima funcione de manera normal sobre otro análogo de lipoxina,
incluyendo un análogo de metabolito de lipoxina, una lipoxina, o un
metabolito de lipoxina.
El término "resiste el metabolismo" se
define para incluir que no experimenta una o más de las
transformaciones metabólicas degradativas debidas al menos a una de
las enzimas que metabolizan lipoxinas. Dos ejemplos no limitantes
de análogo de LXA_{4} que resiste el metabolismo son 1) una
estructura que no se puede oxidar a la forma
15-oxo, y 2) una estructura que se puede oxidar a la
forma 15-oxo, pero que no es susceptible de
reducción enzimática a la forma 13,14-dihidro.
El término "experimenta más lentamente el
metabolismo" significa que tiene una cinética de reacción más
lenta, o que necesita más tiempo, para completar una serie de
transformaciones metabólicas mediante una o más de las enzimas que
metabolizan lipoxina. Un ejemplo no limitante de un análogo de
LXA_{4} que experimenta más lentamente el metabolismo es una
estructura que tiene un estado de transición energética más alto
para la deshidrogenación C-15 que el LXA_{4} ya
que el análogo está estéricamente impedido en el
C-16.
Se pretende que el término "tejido" incluya
células intactas, sangre, preparaciones sanguíneas tales como
plasma y suero, huesos, articulaciones, músculos, músculos lisos y
órganos.
Se define el término "halógeno" para que
incluya flúor, cloro, bromo y yodo, o fluoro, cloro, bromo, y
yodo.
Se pretende que el término "sal
farmacéuticamente aceptable" incluya las sales farmacéuticamente
aceptables reconocidas en la técnica. Estas sales no tóxicas se
hidrolizan normalmente en condiciones fisiológicas, e incluyen
bases orgánicas e inorgánicas. Ejemplos de sales incluyen sodio,
potasio, calcio, amonio, cobre y aluminio, así como aminas
primarias, secundarias y terciarias, resinas básicas de intercambio
iónico, purinas, piperazina, y similares. Se pretende que el
término incluya adicionalmente ésteres de grupos hidrocarburo
inferior, tales como metilo, etilo y propilo.
El término "composición farmacéutica"
comprende uno o más análogos de lipoxina como ingrediente(s)
acti-
vo(s), o sal(es) farmacéuticamente aceptable(s) de los mismos, y puede contener también un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. Las composiciones incluyen composiciones adecuadas para administración oral, rectal, oftálmica, pulmonar, nasal, dérmica, tópica, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular e intravenosa) o inhalación. La ruta más adecuada en cualquier caso particular dependerá de la naturaleza y gravedad de las enfermedades en tratamiento y la naturaleza del (de los) ingrediente(s) activo(s). Las composiciones se pueden presentar en forma de dosis unitaria y prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacopea. Las pautas terapéuticas se pueden ajustar a efectos de mejorar la respuesta terapéutica. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis se puede reducir en el tiempo proporcionalmente. Una persona experta en la técnica puede normalmente determinar la cantidad de dosis efectiva y la pauta apropiada. Composiciones farmacéuticas de análogo de lipoxina pueden también hacer referencia a combinaciones que comprenden lipoxinas, análogos de lipoxina, y/o metabolitos de lipoxina, incluyendo metabolitos de análogos de lipoxina. Un ejemplo no limitante de una combinación es una mezcla que comprende un análogo de lipoxina x que inhibe una enzima que metaboliza lipoxinas y que opcionalmente tiene actividad específica con un emplazamiento de reconocimiento de receptor de lipoxina, y un segundo análogo de lipoxina y que tiene actividad específica con un emplazamiento de reconocimiento receptor de lipoxina y que opcionalmente inhibe o resiste el metabolismo de lipoxina. Esta combinación da como resultado una semivida en tejido más larga al menos para y puesto que x inhibe una de las enzimas que metabolizan las lipoxinas. Así, la acción mediada o antagonizada por la lipoxina queda potenciada.
vo(s), o sal(es) farmacéuticamente aceptable(s) de los mismos, y puede contener también un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. Las composiciones incluyen composiciones adecuadas para administración oral, rectal, oftálmica, pulmonar, nasal, dérmica, tópica, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular e intravenosa) o inhalación. La ruta más adecuada en cualquier caso particular dependerá de la naturaleza y gravedad de las enfermedades en tratamiento y la naturaleza del (de los) ingrediente(s) activo(s). Las composiciones se pueden presentar en forma de dosis unitaria y prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacopea. Las pautas terapéuticas se pueden ajustar a efectos de mejorar la respuesta terapéutica. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis se puede reducir en el tiempo proporcionalmente. Una persona experta en la técnica puede normalmente determinar la cantidad de dosis efectiva y la pauta apropiada. Composiciones farmacéuticas de análogo de lipoxina pueden también hacer referencia a combinaciones que comprenden lipoxinas, análogos de lipoxina, y/o metabolitos de lipoxina, incluyendo metabolitos de análogos de lipoxina. Un ejemplo no limitante de una combinación es una mezcla que comprende un análogo de lipoxina x que inhibe una enzima que metaboliza lipoxinas y que opcionalmente tiene actividad específica con un emplazamiento de reconocimiento de receptor de lipoxina, y un segundo análogo de lipoxina y que tiene actividad específica con un emplazamiento de reconocimiento receptor de lipoxina y que opcionalmente inhibe o resiste el metabolismo de lipoxina. Esta combinación da como resultado una semivida en tejido más larga al menos para y puesto que x inhibe una de las enzimas que metabolizan las lipoxinas. Así, la acción mediada o antagonizada por la lipoxina queda potenciada.
Se pretende que el término "sujeto" abarque
organismos vivos susceptibles a las afecciones o enfermedades
causadas o a las que contribuye la inflamación, respuestas
inflamatorias, vasoconstricción, y supresión mieloide. Ejemplos de
sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, vacas, cabras, y
ratones. Se pretende además que el término sujeto incluya especies
transgénicas.
La presente invención está basada en el
sorprendente hallazgo de que las lipoxinas se metabolizan
rápidamente de una manera única mediante algunas células in
vivo. Aunque otros productos derivados de lipogenasa (por
ejemplo leucotrienos) se metabolizan mediante
\omega-oxidación seguida por
\beta-oxidación (Huwyler y col., (1992) Eur. J.
Biochem. 206, 869-879), la presente invención está
basada en el inesperado hallazgo de que las lipoxinas se
metabolizan mediante una serie de reacciones de oxidación y
reducción que actúan en algunos emplazamientos de la molécula de
lipoxina. Por ejemplo, se ha encontrado que el metabolismo de
LXA_{4} se realiza, al menos en parte, mediante oxidación del
hidroxilo C-15 para generar
15-oxo-LXA_{4}, reducción del
doble enlace C-13,14 para dar
13,14-dihidro-15-oxo-LXA_{4}
y reducción adicional para dar
13,14-dihidro-LXA_{4}. En
LXB_{4} y sus isómeros naturales, se produce oxidación análoga en
el hidroxilo C-5 y la reducción se produce en el
doble enlace C-6,7.
Así, la presente invención presenta análogos de
lipoxina que tienen actividad lipoxina, pero que están químicamente
modificados para prevenir la deshidrogenación y por tanto la
posterior degradación in vivo. En estos análogos, la porción
C-1 a C-13 de la lipoxina natural
puede conservarse o no. Las variaciones de la porción
C-1 a C-13 incluyen diferentes
geometrías cis o trans así como sustituciones. Los
compuestos descritos se representan a continuación mediante un
género estructural, que a su vez se divide en subgéneros. Los
subgéneros incluidos en cada uno de los siguientes dos grupos R se
denota mediante un número romano a la izquierda de la página.
Los análogos de lipoxina de esta invención
tienen la siguiente fórmula estructural I:
en la que X es R_{1}, OR_{1}, o
SR1;
en la que R_{1} es
(i) hidrógeno;
(ii) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
(iii) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
inclusive;
(iv) aralquilo de 7 a 12 átomos de carbono;
(v) fenilo;
(vi) fenilo sustituido
en la que Z_{j}, Z_{iii}, y
Z_{v} se seleccionan cada uno independientemente entre el grupo
constituido por -NO_{2}, -CN, -C(=)-R_{1},
-SO_{3}H, e
hidrógeno;
en la que Z_{ii}; y Z_{iv} cada uno se
seleccionan independientemente entre el grupo constituido por
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
en la que Q_{1} es (C = O), SO_{2} o
(CN);
en la que Q_{3} es O, S ó NH;
en la que uno de R_{2} y R_{3} es hidrógeno
y el otro es
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
(c) cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono,
inclusive;
(d) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono,
inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada; o
(e) R_{a}Q_{2}R_{b}
en la que Q_{2} es-O- ó
-S-;
en la que R_{a} es alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
y en la que R_{b} es alquilo de 0 a 8 átomos de carbono,
inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
en la que R_{4} es
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 6 átomos de carbono,
inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
en la que Y_{1} o Y_{2} es -OH, metilo,
o-SH y en la que el otro es
(a) H
(b) CH_{a}Z_{b}
en la que a + b = 3, a = 0 a 3, b = 0 a 3, y
Z es ciano, nitro, o halógeno;
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono,
inclusive, de cadena lineal o ramificada; o
(d) alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono,
inclusive;
o Y_{1} e Y_{2} tomados conjuntamente
son
(a) = N; o
(b) = O;
en la que R_{5} es
(a) alquilo de 1 a 9 átomos de carbono que puede
ser de cadena lineal o ramificada;
(b)
-(CH_{2})_{n}-R_{i}
en la que n = 0 a 4 y R_{i} es
(i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
inclusive;
(ii) fenilo; o
(iii) fenilo sustituido
en la que Z_{i}, Z_{iii}, y
Z_{v} se seleccionan cada uno independientemente entre el grupo
constituido por hidrógeno, -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, metoxi, y -SO_{3}H;
y
en la que Z_{ii} y Z_{iv} se seleccionan
cada uno independientemente entre el grupo constituido por halógeno,
metilo, hidrógeno, e hidroxilo;
(c) -R_{a}Q_{a}R_{b}
en la que Q_{a} = -O- o -S-;
en la que R_{a} es alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o
ramificada;
en la que R_{b} es alquilo de 0 a 8 átomos de
carbono, inclusive, que puede ser de cadena lineal o ramificada;
(d)
-C(R_{iii})(R_{iv})-R_{i}
en la que R_{iii} y R_{iv} se seleccionan
cada uno independientemente entre el grupo constituido por
(i) H;
(ii) CH_{a}Z_{b} en la que a + b = 3, a = 0
a 3, b = 0 + 3; y en la que cualquier Z se selecciona
independientemente del grupo constituido por halógeno;
(e) haloalquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
inclusive, y de 1 a 6 átomos de halógeno, inclusive, de cadena
lineal o ramificada; y en la que R_{6} es
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 4 átomos de carbono,
inclusive, de cadena lineal o ramificada;
(c) halógeno; pero excluyendo la posición
C-1 en amidas, posición C-1 en
alcanoatos y sales farmacéuticamente aceptables en la posición
C-1 de ácido
(5S,6R,15S)-trihidroxi-7E,9E,11Z,13E-eicosatetraenoico
(LXA_{4}); y excluyendo las posiciones C-5,
C-6, y C-15 en alcanoatos de
LXA_{4}
En la forma de realización de esta invención más
preferida, los compuestos de esta invención tienen las siguientes
fórmulas estructurales:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las que R' es H o
CH_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos preferidos se pueden fabricar tal
como se describe específicamente en el siguiente Ejemplo 1. Otros
compuestos de esta invención se pueden fabricar combinando
estrategias análogas de síntesis para lipoxina (LX) y
prostaglandina usando procedimientos convencionales en química tal
como la hidrogenación selectiva, acoplamiento
Pd(O)-Cu(I), acoplamiento tipo Wittig,
epoxidación de Sharpless, y reducciones asimétricas tras
acoplamiento de los principales intermedios descritos más adelante y
en la bibliografía para generar los análogos estables de LX de esta
invención. (Webber, S.E. y col. (1988) Adv. Exp. Med. Biol. 229:61;
Radüchel, B. y Vorbrüggen, H. (1985) Adv. Prostaglandin Thromboxane
Leukotriene Res. 14:263; y Nicolaou, K.C. y col. (1991) Angew Chem.
Int. Ed. Engl. 30:1100). Se pueden llevar a cabo variaciones
geométricas, por ejemplo tal como se describe en la Patente de los
Estados Unidos 4.576.758 y en Nicolaou, K.C. (1989) J. Org. Chem.
54: 5527.
Como se muestra más adelante, los compuestos
análogos de lipoxina que comprenden el subgénero 1 en el Esquema I
se pueden preparar en forma de 3 fragmentos principales (A, B, y C),
que se pueden combinar a continuación para formar la molécula
completa.
Esquema
I
La síntesis del epoxi-alcohol
para el fragmento precursor 2 se puede generar con los sustituyentes
R_{2}, R_{3} y R_{4} seleccionados entre hidrógeno, fenilo,
halógeno o metilo. Cada uno de estos respectivos
epoxi-alcoholes se puede transformar en el derivado
de feniluretano como 3.
con PhNCO, pirimidina y
CH_{2}Cl_{2} seguido por catálisis ácida de Lewis con apertura
SN^{2} para dar un carbonato 1,2 cíclico que contiene el diol
vecino en C-6 en la configuración (R) necesaria para
unir y C-5 en la configuración (S) también definida
para bioactividad y enlace en el emplazamiento de reconocimiento. A
continuación, estos alcoholes se protegen para generar el fragmento
A como
4.
Estos fragmentos pueden acoplarse ahora al
fragmento B intermedio, un bromuro de fosfonio 5 como en Webber,
S.E. y col. (1988) Adv. Exp. Med. Biol. 229:61 en cantidades de
gramo para generar el producto 6 de fragmento A + B combinado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos C intermedios procedentes del
Esquema I se han generado en paralelo a la preparación de los
acoplamientos A-B. En estos fragmentos C, las
sustituciones en Y_{1} y/o Y_{2} son metilo, metoxi, hidrógeno,
ciano, nitro, o halógeno; véase específicamente el ejemplo 3. De
esta forma, llevar derivados 15-metilo y/o, por
ejemplo, 16-metilo o 16-fenoxi
permite que estos análogos LXA_{4} sustituidos no sean
susceptibles a la deshidrogenación.
De esta forma, los fragmentos C que portan la
resistencia preferida a la oxidación y/o deshidrogenación enzimática
se pueden convertir, mediante protección de los emplazamientos
claves, seguido por bromación, para dar productos de bromuro de
vinilo del fragmento C tales como 6b que se acopla a 6 usando
cantidades catalíticas de P(Ph_{3})_{4} y CuI
para generar la estructura completa del esqueleto de los análogos de
LXA_{4} de la formula I genérica. Este esquema se ilustra
adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos.
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\newpage
Esquema
II
Los compuestos de esta invención comprendidos en
el subgénero de las fórmulas II y III se pueden sintetizar de
manera similar.
Los compuestos de los géneros II y III se
generan en primer lugar preparando individualmente compuestos
sustituidos del fragmento A que se acoplan cada uno como en el
Esquema I al fragmento B individualmente preparado para generar 7 o
fragmentos A_{1} +B_{1} que tienen sustituciones individuales en
X, Q_{1}, R_{2}, R_{3}, y R_{4} según se indica.
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El fragmento C_{1} de 8 que lleva el grupo
acetilénico C-14,15 y las sustituciones finales
\omega-C-20 se generarán cada uno
como se ha mostrado anteriormente para los análogos de
prostaglandina de estructura 6 y se convierten a sus
correspondientes productos de bromuro de vinilo como en (KCN JAC
1985, Webber) para dar los productos bromados de cada fragmento C1
o especie 8 individualmente sustituido adecuado para acoplarse a 20
usando cantidades catalíticas de P(Ph_{3})_{4} y
CuI para generar los productos combinados de la clase de análogos
de LXA_{4} acetilénicos. Cada uno de los productos finales puede a
continuación someterse a RP-HPLC en gradiente
usando detección rápida mediante matriz de diodos (como en Serhan,
C.N., Methods in Enzymology) para purificación. La presencia de la
modificación en de C-15 a C-20 de
LXA_{4} puede alterar el metabolismo de deshidrogenasas y
oxidasas proporcionando impedimento estérico, se han preparado
análogos de prostaglandina estables que llevan las sustituciones
C-15 a \omega-final, y no se
metabolizan por las deshidrogenasas (Radüchel, B. y Vorbrüggen, H.
(1985) Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res. 14:263 y
Vorbrüggen, H. y col. en: Chemistry, Biochemistry, and
Pharmacological Activity of Prostanoids (Roberts, S.M., Scheinmann,
F. eds.). Oxford: Pergamon Press).
Los compuestos ciclo-LXA_{4}
de esta invención comprendidos en el género de formula IV se pueden
hacer de la siguiente forma:
\newpage
Esquema
III
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto pariente de esta clase se somete
también a una estrategia de síntesis total similar, y se le asignan
tres fragmentos principales A B, y C en la estructura 30. Un
precursor del fragmento A se puede preparar con las rutas usadas en
Nicolaou, K.C. (1989) J. Org. Chem. 54:5527 para preparar 10 en la
síntesis del éster metílico de
7-cis,11-trans-LXA_{4}.
El fragmento B en 30 se puede obtener mediante
el precursor 11 o saligenin-([O-hidroxibencilalcohol) como
se genera en (Vorbrüggen y col., p. 353). El alcohol bencílico 11 se
hace reaccionar con 10 (1:1) en presencia de NaH en DMF para dar
12. Este intermedio clave se silila en BSTFA seguido por
acoplamiento con fragmentos individuales designados para los
precursores C.
A continuación, 13 se puede acoplar al fragmento
C vinil bromado del diseño individual dado tratando con un
precursor de bromito con 4,0 equivalentes de AgNO_{3}, seguido de
7,0 equiv. de KCN, EtOH/THF/H_{2}O (1:1:1), 0 \rightarrow 25ºC,
2-4 h. Los productos individuales se someten a
continuación a cat. de Lindlar para hidrogenación catalítica suave
en CH_{2}Cl_{2} 2-3 h para dar compuestos
individuales que pertenecen al género IV. Cada uno se puede
saponificar en LiOH/THF para dar los correspondientes ácidos libres
tras aislamiento mediante RP-HPLC.
La invención de los compuestos del género IV se
ilustra adicionalmente en el ejemplo 5 siguiente, la síntesis del
éster metílico de
15(\pm)metil-ciclo-LXA_{4}
y del ácido libre correspondiente.
Los compuestos de esta invención comprendidos en
el género de formula V se pueden fabricar de forma similar. Varios
sistemas estudiados con LXB_{4} indican que se necesitan varios
emplazamientos dentro del compuesto natural para la bioactividad
(Serhan, C.N. (1991) J. Bioenerg. y Biomembr. 23:105). Estos
emplazamientos incluyen el alcohol C-14 en la
configuración(R) y el doble enlace en C-8,9
del tetraeno en la configuración cis. Además, según los
estudios metabólicos resultado de la presente invención, se han
identificado varios emplazamientos de adición clave que son
necesarios para conservar la bioactividad de LXB_{4}. Estos
incluyen preservar el alcohol C-15 de la actividad
deshidrogenasa es decir, bloquear la formación de
5-oxo-LXB_{4}); manteniendo tanto
el enlace \Delta8 como el alcohol 14(R); y evitando la
reducción del doble enlace \Delta6-7 y las
\beta/\omega-oxidaciones de los compuestos
resultantes.
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Esquema
IV
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De esta forma, el género V (14) mantiene las
regiones de LXB_{4} que son necesarias para su bioactividad, pero
modifica las regiones disponibles para la degradación metabólica. De
nuevo, un análisis retrosintético da prioridad a los tres
fragmentos A, B y C clave diseñados en 14. El acoplamiento de los
intermedios clave para generar miembros de la clase de análogos de
LXB_{4} usa técnicas convencionales como se detallan para
LXA_{4} y sus análogos, concretamente, la hidrogenación selectiva
(para generar geometría 8-cis); acoplamiento de
Pd(O)-Cn(I) para unir los fragmentos A
y B que llevan sustituciones únicas; acoplamiento de tipo Wittig
para unir los fragmentos C que llevan sustituciones necesarias, y
epoxidación de Sharpless para dar el alcohol vecinal 14(R)
(véase el citado Nicolaou, K.C. y col. (1991) Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. 30:1100.), el citado; Weber, S.E. y col. (1988) Adv. Exp.
Med. Biol. 229:61 Ed. Wong, P.K. y Serhan, C.N.) y los citados en
los anteriores). De esta forma, usando una estrategia similar a la
de los análogos de LXA_{4} y la construcción de LXB_{4} nativo,
se pueden obtener los análogos específicos.
Los fragmentos A de 15 que llevan sustituciones
en R_{2}, R_{6}, R_{7} que pueden ser (H, CH_{3},
OCH_{3}, fenilo, fenilo halosustituido) se generan mediante
procedimientos convencionales a partir de, por ejemplo 16 en la que
=CH_{2} de longitud de cadena creciente.
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El compuesto 16 se convierte en el bromuro de
vinilo 15 como en (Nicolaou K.C. y col. (1991) Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 30: 1100-16.) mediante un intermedio de
trimetilsililo acetilénico 17 que se reduce mediante
pinanil-9BBN y después con
n-BuN_{4}NF en THF para dar 18 que se somete ahora
a bromación tras proteger los restos esenciales tal como el alcohol
para dar 15 (fragmento A).
El fragmento C en 14 se genera partir del
compuesto 19 con las sustituciones R_{5} según se indica.
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El alcohol acetilénico 19 se reduce a
continuación en LAH seguido por epoxidación asimétrica de Sharpless
para generar 20 que se aísla mediante RP-HPLC para
dar el (+) isómero que se usó para generar el alcohol
C-14 de los análogos de LXB_{4} en configuración
(R). El compuesto 20 se transforma en el correspondiente aldehído
21 tras proteger los grupos funcionales en R_{4} y R_{5} así
como el alcohol usando PCC en cloruro de metileno. (Nicolaou, K.C.
y col. (1991) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:1100).
La sal de fosfonio 22 se puede preparar como en
los citados; (Weber, S.E. y col. (1988) Adv. Exp. Med. Biol.
229:61, Ed. Wong, P.K. y Serhan, C.N.) y usarse aquí para generar el
acoplamiento del fragmento B-C mediante un
acoplamiento de tipo Wittig para dar 23 que lleva las sustituciones
designadas en el grupo de 23 en el que R_{4} y R_{5} llevan
sustituciones. Este doble enlace cis de 23 se puede
isomerizar para dar el isómero trans usando I_{2} como
catalizador para dar la forma precursora pariente de 14 como 24.
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A continuación, el acoplamiento de 24 a 15 se
realiza mediante acoplamiento Pd(O) - Cu(I) para dar
el precursor acetilénico de 14 designado 25. Tras hidrogenación
catalítica de Lindlar, los análogos de LXB_{4} individuales se
pueden purificar adicionalmente mediante RP-HPLC
usando el esqueleto de tetraeno como un medio conveniente para
aislar los productos individuales empleando detección rápida
mediante matriz de diodos (Serhan, C.N. (1990) Meth. Enzymol.
187:167).
Los compuestos de esta invención tienen la
actividad biológica de las lipoxinas naturales, paro son más
resistentes a la degradación o alternativamente inhiben la
degradación de las lipoxinas naturales. Los compuestos descritos
por tanto tienen utilidad como compuestos farmacéuticos para tratar
o prevenir ciertas enfermedades o afecciones asociadas con una
respuesta celular inadecuadamente mediada con lipoxina en un
sujeto.
Basándose en la acción estimulante celular de
las lipoxinas, la invención incluye el uso en el tratamiento de un
sujeto con un trastorno mieloide supresivo administrando al sujeto
una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende
un análogo de lipoxina. La cantidad eficaz es normalmente la
cantidad necesaria que asegura una exposición suficiente a la
población de células diana. Dicha cantidad dependerá normalmente de
la naturaleza del análogo, el modo de administración, la gravedad de
la supresión mieloide, y otros factores a considerar por una
persona normalmente experta cuando determina una pauta
terapéutica.
El uso terapéutico de un análogo de lipoxina
proliferativo celular también incluye extraer células de un sujeto,
estimular el crecimiento celular in vitro, y reintroducir la
preparación celular estimulada, en todo o en parte, en el sujeto.
Opcionalmente se pueden usar agentes terapéuticos adicionales (por
ejemplo citoquinas tal como GM-CSF) junto con la
lipoxina durante la estimulación o junto con la introducción de la
preparación celular.
Los compuestos de esta invención se pueden usar
para tratar o prevenir inflamación o una respuesta inflamatoria.
LXA_{4} inhibe la activación de leucocitos que son mediadores de
la inflamación. El efecto inducido por LXA_{4} incluye de la
migración de leucocitos, generación de especies de oxígeno reactivo,
y la formación de mediadores proinflamatorios implicados en la
hinchazón del tejido. (Raud, J. y col. (1991) Adv. Exp. Med. Biol.
314:185. Cell-Cell Interactions in the Release of
Inflammation Mediators vol. 314) LXB_{4} muestra acciones
radioprotectoras, como evitación de diarrea y ataxia, en un ensayo
in vivo con células madre hematopoyéticas de ratón. (Walken,
T.L. Jr., (1988) J. Radiat. Res. 29:255)
La inflamación o respuesta inflamatoria mediada
por leucocito causa o contribuye a un amplio intervalo de
enfermedades y afecciones incluyendo varias formas de asma y
artritis. Se incluye en la presente invención la respuesta
inflamatoria a la lesión física, tal como traumatismo físico,
exposición a la radiación y otros.
En otra forma de realización, los compuestos de
esta invención se usan para tratar o prevenir inflamación
antagonizando la acción de leucotrienos. LXA_{4} inhibe la
inflamación inducida por LTB_{4} bloqueando tanto la pérdida de
plasma y migración leucocitaria en un ensayo in vivo en
abazón de hámster. (Hedqvist, P. y col. (1989) Acta Physiol. Scand.
137:571.) Pérdida de plasma y migración leucocitaria son los eventos
clave tanto en la cicatrización de heridas como en la inflamación.
LXA_{4} también antagoniza acciones hemodinámicas renales
inducidas por LTD_{4} y bloquea la unión de LTD_{4} a células
mesangiales que son responsables, en parte, de regular la
hemodinámica en el riñón. (Badr. K.F. y col. (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86: 438).
Los compuestos de esta invención se pueden
administrar para antagonizar la acción de leucotrienos de
sulfidopéptidos, tales como LTD_{4}, LTC_{4}, y LTB_{4}. Las
respuestas vasoconstrictoras mediadas por leucotrieno asociadas con
enfermedades tales como: asma, reacciones anafilácticas, reacciones
alérgicas, shock, inflamación, artritis reumatoide, gota,
psoriasis, rinitis alérgica, síndrome de dificultad respiratoria en
el adulto, enfermedad de Crohn, shock por endotoxinas, shock
traumático, shock hemorrágico, shock isquémico del intestino,
enfermedad glomerular renal, hipertrofia prostática benigna,
enfermedad inflamatoria del intestino, isquemia miocárdica, infarto
de miocardio, shock circulatorio, lesión cerebral, lupus eritematoso
sistémico, enfermedad renal crónica, enfermedad cardiovascular, e
hipertensión.
En otra forma de realización, los compuestos de
esta invención se usan para tratar o prevenir una respuesta o
afección vasoconstrictora. Lipoxinas inducen vasodilatación
dependiente del endotelio (LXA_{4}) (Lefer, A.M. y col. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8340) y dilatación de arteriolas
cerebrales en cobayas recién nacidas in vivo (LXA_{4} y
LXB_{4}) (Busija, D.W. y col. (1989) Am. J. Physiol. 256:468.).
Además, LXA_{4} induce la dilatación arteriolar rápida en abazón
de hámster in vivo (Dahlen, S.E. y col. (1987) Acta Physiol.
Scand. 130:643) y en la hemodinámica renal en rata. (Badr, K.F. y
col. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 145: 408).
Las respuestas o afecciones vasoconstrictoras
originan, contribuyen o están asociadas con enfermedades y
afecciones tales como enfermedades hemodinámicas renales incluyendo
enfermedades glomerulares, enfermedades cardiovasculares incluyendo
hipertensión, infarto de miocardio, isquemia miocárdica, y
enfermedades vasculares y enfermedades gastrointestinales.
Se describe también un procedimiento para
seleccionar análogos de lipoxina u otros compuestos para identificar
aquellos que tengan una semivida en tejido más prolongada que la
correspondiente lipoxina natural. Este procedimiento se puede usar
para determinar si el compuesto inhibe, resiste, o experimenta más
lentamente el metabolismo en comparación con la lipoxina natural.
Este procedimiento se realiza preparando al menos una enzima que
metaboliza lipoxinas, poniendo en contacto el compuesto con la
preparación de enzima, y determinar si el compuesto inhibe,
resiste, o experimenta más lentamente el metabolismo por la enzima.
Las células que tienen un emplazamiento de reconocimiento de
lipoxina, tal como neutrófilos polimorfonucleares, monocitos de
sangre periférica, y células HL-60 diferenciadas
están entre las fuentes apropiadas de preparación de enzima. El
emplazamiento de reconocimiento de lipoxina puede existir de forma
natural o inducirse artificialmente, mediante un estado de
enfermedad o una lesión. Un ejemplo no limitante de emplazamientos
de reconocimiento de LXA_{4} artificialmente inducido es la
inducción de dichos emplazamientos en células HL-60
diferenciadas.
En una forma de realización, la preparación de
las enzimas comprende cosechar células y realizar lisis por
congelación-descongelación tres veces, seguido por
ultracentrifugación para dar un sobrenadante a 100.000 g. Se puede
usar también un residuo a 100.000 g. Además, una preparación de
enzima puede comprender cualesquiera enzimas que no participen en
el metabolismo de la lipoxina natural, pero realice transformaciones
sobre lipoxinas similares o equivalentes a las transformaciones
realizada por la enzima o enzimas que naturalmente metabolizan
lipoxinas. Ejemplos no limitantes de enzimas apropiadas son
15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa, citocromo
P-450 monogenasas procedentes de leucocitos humanos
y de rata y microsomas de hígado humano.
La caracterización de metabolitos de lipoxina
incluyó técnicas convencionales tales como extracción,
cromatografía, y HPLC cuantitativo seguido por derivatización con
trimetil sililo, derivatización con O-metoxima y
análisis mediante cromatografía de gases/espectroscopia de masas.
Los detalles experimentales de esta forma de realización se
describen a continuación en el Ejemplo 1.
Se pueden seleccionar también análogos de
lipoxina respecto de la actividad de enlace con un emplazamiento de
reconocimiento del receptor de lipoxina, por ejemplo poniendo en
contacto el compuesto con un emplazamiento de reconocimiento del
receptor y determinar si se produce y en qué grado el compuesto se
une. Ejemplos ensayos de enlace cinéticos incluyen desplazamiento
homólogo, enlace competitivo, isoterma, y ensayos de enlace en
equilibrio.
El emplazamiento de reconocimiento del receptor
puede existir normalmente o se puede inducir mediante un estado de
enfermedad, una lesión, o con medios artificiales. Por ejemplo, se
puede usar ácido retinoico, PMA, o DMSO para inducir la
diferenciación en células HL-60. Las células
HL-60 diferenciadas expresan emplazamientos de
reconocimiento específicos del receptor de LXA_{4}. Ejemplos de
otras células que se pueden seleccionar para especificidad lipoxina
incluyen PMN, células epiteliales, y monocitos de sangre
periférica.
La selección de ligandos competitivos dependerá
de la naturaleza del emplazamiento de reconocimiento, la estructura
del sustrato natural, cualesquiera análogos funcionales o
estructurales del sustrato natural conocidos en la técnica y otros
factores a considerar por el técnico experto cuando realiza dicha
determinación. Dichos ligandos también incluyen antagonistas
conocidos del receptor. Los compuestos de esta invención pueden
estar radiomarcados con isótopos incluyendo ^{2}H, ^{3}H,
^{13}C, y ^{14}C mediante técnicas convencionales conocidas en
la técnica de la radioquímica o química sintética.
En una forma de realización de este
procedimiento, la especificidad estructural de los emplazamientos de
reconocimiento LXA_{4} inducidos se evaluó con LXB_{4},
LTC_{4}, LTB_{4} y éster metílico de trihidroxiheptanoico. Los
detalles experimentales de esta forma de realización se describen en
el Ejemplo 2 siguiente.
Además, los compuestos de esta invención se
pueden usar para ejercer ciertas acciones sobre tipos celulares
específicos como modelos de desarrollo para inflamación y lesión.
Por ejemplo, LXA_{4} estimula la movilización del Ca^{2+}
intracelular, remodelación lipídica y quimiotaxis sin agregación en
PMN humano (Palmblad, J. y col. Biochem. Biophys. Res. Commun.
(1987) 145: 168; Lee, T.H. y col. Clin. Sci. (1989) 77:195; Nigam,
S. y col. J. Cell. Physiol. (1990) 143:512; Luscinskas, F.W. y col.
(1990) Biochem. Pharmacol. 39:355). LXA_{4} también bloquea las
respuestas inducidas tanto por LTB_{4} como por FMLP, tales como
la generación de IP_{3}. LXB_{4} también estimula la
remodelación lipídica. LXA_{4} activa el PKC aislado, y es
específico de la subespecie \gamma de PKC que se encuentra en el
cerebro y espina dorsal. (Hansson, A. y col. Biochem. Biophys. Res.
Commun. (1986) 134: 1215; Shearman, M.S. y col. FEBS Lett. (1989)
245: 167); se cita la publicación de Nicolaou, K.C. y col. Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. (1991)
30:100.
30:100.
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos que en forma alguna se deben tomar
como limitaciones adicionales. Los contenidos de todas las
preferencias y patentes otorgadas citadas en todas las partes de
esta solicitud, incluyendo los antecedentes, se incorporan
expresamente por referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
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\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
3-metil-3-trimetilsiloxi-1-bromo-1-octeno
(130 mg 0,44 mmol) en benceno (1,5 ml) se añadió
n-propilamina (0,05 ml, 0,61 mmol) y
Pd(PPh_{3})_{4} (20 mg 0,02 mmol) y la solución se
protegió de la luz. Se desgasificó mediante el procedimiento
congelación-descongelación y se agitó a temperatura
ambiente durante 45 min. Se añadieron (7E, 9E, 5S, 6R) Metil
5,6-di(terc-butildimetilsiloxi)-dodeca-7,9-dieno-11-inoato
(183 mg 0,44 mmol) (compuesto 12) y yoduro de cobre (14 mg 0,07
mmol) y la solución se desgasificó una vez más mediante el
procedimiento de congelación-descongelación. La
mezcla se agitó durante 3 h a temperatura ambiente y se detuvo
rápidamente con solución acuosa saturada de NH_{4}Cl y se extrajo
con éter. A continuación, se lavó con salmuera y se secó con
MgSO_{4} y el solvente se evaporó. La cromatografía instantánea en
columna (sílice, éter hexanos al 3%) dio como resultado el
compuesto puro como un líquido incoloro (171 mg Rendimiento del
57%).
A una solución del compuesto (171 mg 0,25 mmol)
en THF (0,5 ml) se añadió n-BuN_{4}F (0,9 ml. 0,90
mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. La reacción se
completó en 2 h en cuyo momento se vertió sobre agua y se extrajo
con éter. Los extractos etéreos se lavaron con salmuera, se secaron
con Na_{2}SO_{4} y el solvente se evaporó. La cromatografía
instantánea en columna (sílice MeOH/CH_{2}Cl_{2} al 4%) dio
como resultado el éster metílico (24 mg) junto con parte de la
correspondiente lactona. Tiempo de retención HPLC: 9:39 min
(columna C-18 microsorb de fase invertida, 4,6 mm X
25 cm, MeOH/H_{2}O 70:30 caudal 1 ml/min, detector UV a 300 nm).
UV en MeOH: \lambda_{max} 283, 294, 311 nm. RMN ^{1}H (500 MHz
CDCl_{3}) \delta 6,53 (dd. 15,2 10,9 Hz, 1 H), 6,32 (dd, J =
15,1, 11,0 Hz, 1 H), 6,17 (d, J = 15,9 Hz, 1 H), 5,83 (dd. J =
17,5, 2,1 Hz, 1 H), 5,80 (dd. J = 15,2, 6,7 Hz, 1 H), 5,72 (dd. J =
17,0, 2,1 Hz, 1 H), 4,14 (m, 1 H), 3,68-3,64 (m,
4H), 2,35-2,31 (m, 2 H), 1,51-1,48
(m, 1 H), 1,43-1,42 (m, 2 H),
1,30-1,23 (m, 15 H) 0,85 (t, 3 H). RMN ^{13}C
(126 MHz, CDCl_{3}) \delta\beta150,01, 140,18, 132,95, 132,26,
112,43,107,50, 75,23, 73,76, 42,49, 33,67, 32,17, 31,36, 27,96,
23,56, 22,58, 21,03, 14,03.
Una solución del éster metílico del precursor
del compuesto1 (3 mg en CH_{2}Cl_{2} (1 ml) se mezcló con
catalizador de Lindlar (1 mg) y se colocó bajo atmósfera de
hidrógeno. La mezcla se agitó a temperatura ambiente en la
oscuridad seguido por HPLC hasta una conversión aproximada del 80%
(1 h). La filtración a través de celite y evaporación del solvente
y separación mediante HPLC dio el éster metílico puro. Tiempo de
retención HPLC: 10:02 min (columna microsorb C-18
de fase invertida. 10 mm X 25 cm, MeO/H_{2}O 70:30 caudal 4
ml/min. Detector UV a 300 nm). UV en MeOH: \eta_{max} 287, 301,
315 nm.
Este compuesto se preparó de manera similar a la
preparación del éster metílico del precursor del compuesto 1 (a
partir de
3-ciclohexil-3-trimetilsiloxi-1-bromo-1-octeno).
La desililación de este compuesto también se realizó de manera
similar para dar el éster metílico. Tiempo de retención HPLC: 8:02
min (columna microsorb C-18 de fase invertida, 4,6
mm X 25 cm. MeOH/H_{2}O 70:30, caudal 1 ml/min, detector UV a
300nm). UV en MeOH: \lambda_{max} 282, 293, 311 nm. RMN ^{1}H
(360 MHz, CDCl_{3}) \delta 6,56 (dd, 15,4, 10,9 Hz, 1 H), 6,33
(dd, J = 15,2, 10,9 Hz, 1 H), 6,13 (dd, J = 15,8, 6,5 Hz, 1 H), 5,81
(dd, J = 15,2, 6,4 Hz, 1 H), 5,80 (d, J = 15,6 Hz, 1 H), 5,73 (dd,
J = 15,4, 2,1 Hz, 1 H), 4,15 (br, 1 H), 3,93-3,90
(m, 1 H), 3,67 (br, 1 H), 3,65 (s, 3 H), 2,34 (t, 2 H),
1,82-1,65 (m, 10 H), 1,46-1,38 (m, 3
H), 1,26-1,01 (m, 5 H).
La hidrogenación selectiva del éster metílico
del precursor del compuesto 3, seguido por purificación mediante
HPLC dio el éster metílico de precursor del compuesto 4. Tiempo de
retención HPLC: 9,72 min (columna microsorb C-18 de
fase invertida, 10 mm X 25 cm, MeOH/H_{2}O 70:30 caudal 4 ml/min.
detector UV a 300 nm), UV en MeOH: \lambda_{max} 288, 301, 315
nm. RMN ^{1}H (250 MHz, C_{6}D_{6}) \delta
6,66-6,89 (m, 2 H), 5,95-6,24 (m, 4
H), 5,55-5,66 (m, 2 H), 3,82 (m, 1 H), 3,73 (m, 1
H), 3,41 (m, 1 H), 3,31 (s, 3H, OCH3), 2,08 (t, 2 H, CH_{2}COO),
1,00-1,81 (m, 18 H).
Los ésteres de metilo se pueden convertir en los
correspondientes alcoholes usando técnicas convencionales.
Se preparó aproximadamente 1 g de cetona
acetilénica usando acilación de Friedel-Crafts de
bis(trimetilsilil)acetileno con cloruro de hexanoilo,
y se redujo usando
(-)-pinail-9-BBN
para dar el (S) alcohol en CH_{3}N_{2} como en Webber, S.E. y
col. (1988) Adv. Exp. Med. Biol. 229:61; Nicolaou, K.C. y col.
(1991) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:1100; y Vorbrüggen, H. y
col.: En: Chemistry, Biochemistry, and Pharmacological Activity of
Prostanoids (Roberts, S.M., Scheinmann, F. eds.). Oxford: Pergamon
Press, para generar el metilo en C-15.
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\vskip1.000000\baselineskip
Alternativamente, el grupo cetónico se puede
tratar con CH_{3}MgBr (60 \rightarrow 70ºC) como en Vorbrüggen,
H. y col.: En: Chemistry, Biochemistry, and Pharmacological Activity
of Prostanoids (Roberts, S.M., Scheinmann, F. eds.). Oxford:
Pergamon Press para dar el 15(\pm)metil de b
(2-5 g) en CH_{2}Cl_{2} seco (\sim20 ml) a
0ºC con adiciones secuenciales de 2,6-lutidina (5,2
ml) y triflato de terc-butildimetilsililo (6,9 ml).
Esta reacción se mezcló durante 1 h y a continuación se diluyó con
100 ml de éter para extracción acuosa y secado con MgSO_{4}.
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El producto c se acopla a continuación con d
\vskip1.000000\baselineskip
que se genera como en Nicolaou,
K.C. y col. (1991) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 30:1100; Nicolaou,
K.C. y col. (1989) J. Org. Chem. 54:5527 y Webber, S.E. y col.
(1988) Adv. Exp. Med. Biol. 229:61. La estructura d procedente del
fragmento A del Esquema I se suspende en 4,0 equiv. de AgNO_{3}, a
continuación 7,0 equiv. de KCN, conteniendo EtOH:THF:H_{2}O
(1:1:1), 0-25ºC durante 2 h para generar el análogo
15-metil-LXA_{4} protegido con
éster metílico en C que se concentró y saponificó en THF con LiOH
(2 gotas, 0,1 M) a 40ºC, 12-24 h para dar el ácido
libre
correspondiente.
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Este compuesto se generó usando una estrategia
similar acoplando el d con el e de más arriba, o f para generar el
análogo 15-fenil-LXA_{4}, o g para
generar los
análogos17-m-clorofenoxi-LXA_{4}.
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Cada uno de los fragmentos C apropiados del
Esquema I (es decir e, f, g, h,) se preparan como se revisó en
Radüchel, B. y Vorbrüggen, H. (1985) Adv. Prostaglandin Thromboxane
Leukotriene Res. 14:263 para los correspondientes análogos
conocidos de prostaglandina. En h, R = H; Cl, metoxi o halógeno.
Usando el fragmento A_{2}B_{2} generado
según el Esquema II, se prepararon para acoplamiento los
correspondientes fragmentos C_{2}. Las estructuras j y k se
generaron como en Nicolaou, K.C. y col. (1989) J. Org. Chem.
54:5527 y se metilaron como en Radüchel, B. y Vorbrüggen, H. (1985)
Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res. 14:263 se acoplaron
a 7 para dar estos análogos LX. Los materiales se pueden someter a
RP-HPLC para purificación como más arriba.
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El fragmento combinado designado A_{2}B_{2}
se puede preparar a partir de acoplamiento de los fragmentos
A_{1} y B_{1}, mostrado en la Ruta II para realizar la
estructura de 7 ó 4 de más arriba para acoplar al fragmento
C_{2}. El precursor del fragmento C_{2} he C2 se puede preparar
como en Radüchel, B. y Vorbrüggen, H. (1985) Adv. Prostaglandin
Thromboxane Leukotriene Res. 14:263 para un análogo de
prostaglandina.
El precursor m preparado como anteriormente
(Nicolaou, K.C. (1989) J. Org. Chem. 54:5527) se añadió a de 1,2
equiv. a 0,05 equiv. de Pd(PPh_{3})_{4}, 0,16
equiv. de CuI, n-PrNH_{2}, en benceno con soporte
Me_{2}Al 1, 2-3 h a temperatura ambiente para dar
n.
Los grupos protectores de alcohol TBDMS = R se
eliminaron con 10 equiv. de HF-pyr, THF,
0-25ºC (4 h) seguido por exposición a 3,0
equivalentes de Et_{3}N, MeOH, 25ºC 15 min para abrir las
\delta-lactonas inducidas por ácido formadas
normalmente entre el carboxilo C-1 y el alcohol
C-5 en las lipoxinas (Serhan, C.N. (1990) Meth.
Enzymol, 187:167 y Nicolaou, K.C. (1989) J. Org. Chem. 54:5527).
Tras tratamiento suave con catalizador de Lindlar al 5% en peso, el
material extraído se puede someter a saponificación con LiOH en THF
para generar el ácido libre de la molécula diana, que se puede
someter a purificación adicional mediante RP-HPLC
con fase móvil en gradiente como en (Serhan, C.N. y col. (1990)
Meth. Enzymol 187:167).
El compuesto o como derivado de SiMe_{3} se
puede colocar (\sim 1 g) en un matraz de 100 ml de fondo redondo
en un atmósfera enriquecida con argón en benceno desgasificado (20
ml). A éste se añadieron 3,0 equivalentes de un fragmento de
bromuro de vinilo de más abajo. Esta reacción de acoplamiento se
llevó a cabo con cantidades catalíticas de Pd
(PPh_{3})_{4} y CuI y se puede vigilar con alícuotas de
esta suspensión inyectadas en RP-HPLC seguido por
abundancia UV con un diodo de barrido rápido. El línea de progresión
llevó 1-3 h a 23ºC tras lo cual el material se
extrajo con acetato de etilo:H_{2}O 4:1 v/v) y se concentró
mediante evaporación rotativa. El éster metílico se puede
saponificar en LiOH/THF para dar rendimientos cuantitativos del
ácido carboxílico libre. Se puede preparar otros derivados como
anteriormente usando el fragmento A con restos diferentes del
fragmento B que se hayan sustituido para dar por ejemplo un dimetilo
u otros derivados. Esto se puede obtener tomando una cetona p
fácilmente disponible y tratándola con CH_{3}MgBr (60ºC) para
generar q que también se puede acoplar al fragmento A como
anteriormente usando técnicas convencionales como el acoplamiento
con Pd(O)-Cu(I) Se pueden también
obtener cadenas con longitud superior a C-15.
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El
5-metil-LXB_{4} impide o retrasa
la formación de 5-oxo-LXB_{4}.
Usando el esquema general detallado antes, el fragmento A se puede
construir para que lleve el 5-metilo en precursor r
de bromuro de vinilo que se acopla a un fragmento B + C unido
mediante acoplamiento con
Pd(O)-Cu(I).
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El r de bromuro de vinilo se puede obtener a
partir de s que contiene sustituyentes tanto dimetilo como hidrógeno
en su posición C-4. El precursor protegido t que
contiene los fragmentos B + C se genera como se publica en la
referencia (Nicolaou K.C. y col. (1991) Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
30: 1100-16.). El compuesto t se convierte en s o
28 acoplando con el bromuro de vinilo indicado. Así, la molécula
diana se puede generar añadiendo r a 1,0 equv (\sim 1 g) a un
matraz de fondo redondo desgasificado que contiene Et_{2}NH como
solvente inyectando t en Et_{2}NH a 1,2 equiv. Se añadió
Pd(Ph_{3}P)_{4} a 0,02 equiv. para dar el éster
metílico del precursor acetilénico de s que contiene
8(9).
El material se extrajo y se sometió a
evaporación rotativa suspendido en quinolina (0,5 eq) en
CH_{2}Cl_{2} y se sometió a hidrogenación usando (10%; 25ºC) o
usando catálisis de Lindlar y una corriente de H_{2} gaseoso para
reducir selectivamente el doble enlace acetilénico en la postillón
8. La formación del componente tetraeno del éster metílico de
5-metil-LXB_{4} o éster metílico
de 4-dimetil LXB_{4} se puede vigilar mediante
RP-HPLC para evaluar la finalización de la reducción
(es decir, 1-3h). Los ésteres metílicos se
saponificaron a continuación a los correspondientes ácidos libres
tratando los productos con LiOH en TMF 25 \mul H_{2}O añadido a
0 \rightarrow 24º, 8 - 24 h.
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Ejemplo
2
Se obtuvieron células HL-60 de
la American Type Culture Collection (Rockville, MD), y el resto de
reactivos de cultivo celular procedían de GIBCO (Grand Island, NY).
Versene (EDTA) procedía de Whittaker Bioproducts (Walkersville,
MD). El éster metílico de 11,12-acetilénico
LXA_{4} sintético y lipoxinas procedían de Cascade Biochemical
(Reading, Reino Unido.). El
15(S)-15-m-PGE_{1},
PGE_{1} y 5-HETE procedían de Cayman Chemical Co.
(Ann Arbor, MI). [11,12-3H]LXA_{4} se
preparó a partir de 11,12-LXA_{4} acetilénico
usando catalizador de Lindlar como tritiado a medida
(NET-259, lote 0 2793-275, New
England Nuclear, Boston, MA). Los productos tritiados se aislaron
mediante RP-HPLC (Fiore y col. (1992) J. Biol. Chem.
267:16168; Serhan, C.N. (1990) Meth. Enzymol. 187:167). Metoxiamina
y NAD procedían de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Dióxido
de manganeso y el reactivo de Adams procedían de Aldrich Chemical
Co. (Milwaukee, WI).
Las células polimorfonucleares humanas (PMN) se
obtuvieron de voluntarios sanos mediante centrifugación en
gradiente de sangre venosa fresca heparinizada (Böyum, A. (1986)
Scand. J. Clin. Lab. Invest, 21:77). Las células
HL-60 se sembraron en RPMI suplementado con
penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \muml), suero fetal
bovino (10%) (Hyclone, Logan, UT) y se incubaron (37ºC con atmósfera
de CO_{2} al 5%) en matraces de plástico de 250 ml. Los matraces
individuales que contenían 5 x 10^{-7} Células
HL-60/ml se incubaron en presencia o ausencia de
12-miristato 13-acetato de forbol
(PMA) (10 ó 16 nM, 24-27 h) y se controló la
adherencia para inducción de fenotipo tipo macrófago como en
Collins, S.J. (1987) Blood 70:1233. Los monocitos de sangre
periférica se obtuvieron (Goldyne, M.E. y col. (1984) J. Biol. Chem.
259:8815 tras plaquear células mononucleares frescas en placas
petri de plástico que contenían PBS con glucosa (1 mg/ml) durante 1
h a 37ºC. Se eliminaron las células no adherentes, y las células
mononucleares adherentes se resuspendieron suavemente usando
Versene (7 ml/placa) y se lavaron en PBS. PMN (> 98%), monocitos
adherentes (> 95%) y células HL-60 se enumeraron
mediante microscopía óptica, s suspendieron en PBS para incubación,
y < 2-3% en cada caso fuero permeables a azul
tripán. En algunos experimentos, se prepararon sobrenadantes libres
de células a partir de células HL-60 tratadas con
PMA (16 nM) durante 24 - 72 h. Tras cosechar, las células
diferenciadas se lavaron, después se sometieron a lisis mediante
congelación-descongelación (repetida 3 veces) y se
ultracentrifugaron (100.000 g, 1 h).
Las incubaciones con eicosanoides se detuvieron
con metanol frío que contenía PGB_{2} o 5-HETE
como patrones internos (se usó 5-HETE cuando se
cuantificaba15-oxo-ETE) Los
productos se extrajeron usando Sep-pak C18 y se
cromatografiaron rutinariamente como en Serhan, C.N. (1990) Meth.
Enzymol. 187:167. El sistema RP HPLC estaba constituido por dos
bombas LKB de gradiente gradual equipadas con una columna Altex
Ultrasphere-ODS (4,6 mm x 25 cm) caudal 1 ml/min
eluído (0-20 min) con metanol/H_{2}O/ácido acético
(65:35:0,01) y metanol/ácido acético (99,99/0,1) en un gradiente
lineal (20-45 min) que se usó para cuantificar los
\omega-metabolitos de LTB_{4} (es decir,
20-COOH y
20-OH-LTB_{4}) así como LXA_{4}.
La recuperación de los patrones internos fue de 82,2 7,9, D.E.
promedio (n = 13). Los compuestos I-IV se separaron
usando una columna Altex Ultrasphere-ODS (10 mm x
25 cm) eluída a un caudal de 3,0 ml/min con metanol/H_{2}O/ácido
acético (60:40:0,01, v/v/v). La formación de
15-oxo-ETE en sobrenadantes 100.000
g (cf. Agins, A.P. y col. (1987) Agents Actions 21:397; Xun,
C-Q. y col. (1991) Biochem. J. 279:553; y Sok,
D-E. y col. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun.
156:524) se cuantificó tras la RP-HPLC usando una
columna ODS (4,6 mm x 25 cm) eluída con metanol/H_{2}O/ácido
acético (70:30:0,01, v/v/v) vigilada a 280 nm con un caudal de 1
ml/min. Los productos derivados de monolito se cromatografiaron
también usando una columna Hypersil (5 IL, 4 mm x 300 mm) eluída con
metanol/H_{2}O/ácido acético (60,40:0,01, v/v/v) y un caudal de 1
ml/min. Se registraron espectros en línea usando un detector de
matriz de diodos (Hewlett-Packard 1040M serie II)
equipado con software HPLC^{3D} ChemStation (serie DOS). Los
espectros se adquirieron usando pasos de 4 nm, B_{w} = 10 nm,
intervalo = 235-360 nm con un intervalo de muestreo
de 1,28 s.
GC/MS se realizó con un
Hewlett-Packard 5971 A con cuadripolo detector
selectivo de masa equipado con una estación de trabajo HPG1030A y
GC 5890. La columna fue una HPUltra 2 (fase de goma de fenil metil
silicona 5% entrecruzada; 25 m x 0,2 mm x 0,33 \mum) y se
realizaron inyecciones en el modo sin divisor en
bis(TMS)trifluoroacetamida (BSTFA). El programa de
temperatura se inició a 150ºC y alcanzó 250ºC a los 10 min y 325ºC a
los 20 min. Los metil ésteres convencionales de ácido graso
saturado C_{16}-C_{26} dieron los siguientes
tiempos de retención (min:s; promedio de n = 6). C_{16}, 8,03;
C_{18}, 9,77; C_{20}, 12,22; C_{22}, 16,11; C_{24}, 20,72;
C_{26}, 23,62 que se usaron para calcular los respectivos valores
C de los metabolitos LX-derivados como en Serhan,
C.N. (1990) Meth. Enzymol. 187:167. Se preparó diazometano y el
éster metílico de los productos se trató con BSTFA (Pierce Chemical
Co., Rockford, IL) para obtener los derivados de Me_{3}Si. Se
preparó el derivado del éster metílico de
O-metoxima como en Kelly, R.W. y Abel, M.H. (1983)
Biomed. Mass Spectrom. 10:276. Las hidrogenaciones catalíticas se
realizaron en metanol (1 ml) con reactivo de Adams (Aldrich,
Milwaukee, WI) saturando el óxido de platino IV
(1-2 mg) con una corriente de hidrógeno borboteante
(20 min, temperatura ambiente). Tras extracción, los materiales se
trataron con diazometano seguido por BSTFA (toda la noche,
temperatura ambiente).
\vskip1.000000\baselineskip
Metabolismo de LXA_{4}: los neutrófilos
intactos procedentes de sangre periférica de donantes sanos no
metabolizaron significativamente LXA_{4} exógeno mientras que
células procedentes de los mismos donantes rápidamente transformaron
LXA_{4} por \omega-oxidación. Por el contrario,
células HL-60 tratadas con PM que mostraban
propiedades tipo monolito transformaron rápidamente el LXA_{4}.
En los primeros 60 s de exposición, se metabolizó > 70% de
LXA_{4}. En ausencia de tratamiento con PMA ni las células
HL-60 intactas (no diferenciadas) ni sus
sobrenadantes libres de células (100.000 x g) ft = orm LXA_{4} (n
= 3).
Las células HL-60 diferenciadas
incubadas con LXA_{4} convirtieron este eicosanoide en varios
productos. LXA_{4} mercado se transformó en cuatro productos
principales que llevaban tritio (denotados como compuestos
I-IV), que se recogieron para análisis
posterior.
Estructuras de compuestos
I-IV. Para obtener cantidades de estos
compuestos que permitan estudios estructurales, se determinaron sus
tiempos de retención en RP-HPLC usando el perfil de
elución de la ^{3}H-marca para establecer las
fronteras, y las muestras no marcadas combinadas a partir de varias
incubaciones se cromatografiaron y se recogieron individualmente en
dichas regiones para análisis GC/MS. La vigilancia de iones selectos
de los productos obtenidos tras tratamiento con diazometano y BSTFA
reveló que cada uno de los compuestos I-IV mostraba
iones prominentes a una m/z 203
[-CH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}-COOCH_{3}]
indicando que los carbonos de 1 a 5 de LXA_{4} (el carbono
carboxílico es el número 1) no se modificaron, aunque cada producto
dio lugar a un tiempo de retención diferente de LXA_{4}. El éster
metílico, derivado de trimetil sililo de LXA_{4} mostró iones
prominentes en su espectro de impacto electrónico a m/z 203 (pico
base) y 173, con su ión molecular a 582 (M+4). Otros iones de valor
diagnóstico en este derivado de LXA_{4} se observaron a m/z 171
(203-32), 409 (M-173), 379
(M-203), 482 (M-100) y 492
(M-90) (Serhan, C.N. y col. (1984) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:5335; y Serhan, C.N. (1990) Meth. Enzymol 187:167. Es
de interés que las lipoxinas en general son conocidas por dar picos
de ion molecular extremadamente débiles, (Serhan, C.N. y col. (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:5335). Sin embargo, los compuestos
marcados como I & II también poseen también iones prominentes a
m/z 173
(Me_{3}SiO^{+}=CH-(CH_{2})_{4}-CH_{3})
indicando que el fragmento 15-20 de carbono de estos
productos derivados de LXA_{4} estaba intacto, mientras que el
ion a m/z 173 no era evidente en compuestos III y IV. De esta
forma, la conclusión de que los compuestos I-IV son
metabolitos de LXA_{4} estaba basada en sus propiedades físicas
(HPLC y GC/MS), el hallazgo de que llevan la marca de tritio, así
como la ausencia de estos productos in incubaciones con células
HL-60 no tratadas con PMA.
A continuación, la atención se centró en los
compuestos III y IV ya que aparentemente representaban metabolitos
con modificaciones estructurales en el carbono del 15 al 20 del
fragmento de LXA_{4}. Puesto que la o-oxidación
(hidroxilación en el carbono 20) era una posibilidad, los iones que
podrían resultar de las respectivas formas 20-OH y
20-COOH de LXA_{4} tras la derivatización, más
exactamente m/z 261 y 217
(Me_{3}SiO+=CH-(CH_{2})_{4}-CH_{2}OSiMe_{3}
y
Me_{3}SiO+=CM-(CH_{2})_{4}-CO_{2}Me),
se escasearon en los perfiles de datos adquiridos mediante
GC-MS. Ni II ni tampoco IV presentaron iones
prominentes a ninguna m/z 261 o 217 indicando que estos productos
aparentemente no eran resultado de la
\omega-oxidación].
Se obtuvo el espectro de masa (valor C 24,3) del
derivado de Me_{3}Si, éster metílico del compuesto III. Se
observaron iones prominentes en su espectro m/z 203 (pico base,
CH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}-COOCH_{3}),
171 (203-32; eliminación de CH_{3}O), 215
[(M-203)-90, eliminación de
trimetilsilanol (Me_{3}SiOH)] y 99
(O=C-(CH_{2})_{4}-CH_{3}). Los iones de
intensidad inferior fueron m/z 508 (M+) y 418 (M-90;
pérdida de Me_{3}SiOH). La presencia de estos iones sugiere que
el material que coeluye con el compuesto III marcado con ^{3}H
fue el 15-oxo-derivado de LXA_{4}.
Esto se basa en varias líneas de evidencia más exactamente, la
pérdida virtual del ion prominente a m/z 173
(Me_{3}SiO+=CH-(CH_{2})_{4}-CH_{3}),
presencia de m/z 99
(O=C-(CH_{2})_{4}-CH_{3}), la ausencia
de un cromóforo de tetraeno y la aparición de un nuevo cromóforo a
UV \lambda_{max} a 335-340 nm. El cromóforo de
tetraenona se confirmó tratando LXA_{4} con MNO_{2} en
cloroformo tal como se usa para la conversión de prostaglandina
(Änggard, E. y Samuelsson, B. (1964) J. Biol. Chem. 239:4097).
También, el espectro de masa del producto de la hidrogenación
catalítica dio un valor de 25,1 con iones prominentes a m/z 203
(pico base), m/z 99 (66%), m/z 313 (M-203 o
M-CH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}-COOCH_{3};
35%) y m/z 171 (36%) sin ion prominente a m/z 173. Iones menos
intensos aparecieron a m/z 516 (M+) y m/z 426
(M-90). De esta forma, el desplazamiento hacia
arriba de 8 amu y la fragmentación de este derivado saturado fueron
consistentes con la generación del correspondiente
15-oxo-derivado.
Para examinar adicionalmente este producto
derivado de LXA_{4}, una alícuota del material eluído junto con
el pico marcado III se trató con diazometano seguido por
metoximación (como en Bergholte, J.M. y col. (1987) Arch. Biochem.
Biophys. 257:444) y tratamiento con BSTFA. Su valor C de espectro
25,4, mostró iones prominentes a m/z 203 (pico base),171
(203-32; pérdida de CH_{3}OH) y 229
[M-128 o
CH_{3}O-N=C-(CH_{2})_{4}CH_{3}-(2x90)].
Los iones de intensidad inferior aparecieron a m/z 537 (M+), 466
(M-71, el ion at-rotura
M-CH_{2}(CH_{2})_{3}CH_{3}),
481 (M-56 o
M-CH_{2}=CH-CH_{2}-CH_{3},
un ion de reordenamiento de McLafferty), 431 [M-106
(posiblemente pérdida de C_{7}H_{5}N+)]* 401
[M-136 (eliminación de Me_{3}SiOH + CH_{3} +
OCH3) y 460 (M-77, pérdida de NOCH_{3} más MeOH).
De nuevo, un ion a m/z 173 que podría haberse originado a partir de
un alcohol que contuviera el fragmento C-15
(Me_{3}SiO^{+}-CH-(CH_{2})_{4}-CH_{3})
estaba virtualmente ausente en su espectro. De esta forma, los
iones presentes son consistentes con el éster metílico, derivado de
O-metoxima generado a partir del derivado de
LXA_{4} que contiene 15-oxo. Los iones prominentes
observados junto con estos diferentes derivados sugieren que el
material que se eluye bajo el pico marcado III era el
15-oxo-producto de LXA_{4} (es
decir, 15-oxo-LXA_{4}).
El espectro de masa del éster metílico,
Me_{3}Si derivado (Valor de C 26,0) de compuesto IV mostró iones
prominentes a m/z 203 (pico base,
CH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}COOCH_{3}), 171
(203-32; pérdida de CH_{3}OH), 99
(O=C-(CH_{2})_{4}-CH_{3}) y 307
(M-203 o
MCH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}-COOCH_{3}).
Los iones de intensidad inferior aparecieron a m/z 510 (M+), 420
(M-90, pérdida de trimetilsilanol) y 208
(M-(99+203)). Su espectro UV mostró un triplete de absorbancia con
un máximo a 259, 269 y 280 nm, consistente para un cromóforo de
trieno conjugado. La presencia de estos iones y el espectro UV
sugiere que IV era un
dihidro-15-oxo-metabolito
de LXA_{4}. Esta estructura básica estaba soportada por la
presencia del ion a m/z 99 lo que es consistente con un grupo ceto
la posición del carbono 15, y la presencia de m/z 203 como pico base
desveló que los grupos alcohol en los carbonos 5 y 6 permanecen
intactos. Además, la ausencia de un cromóforo de trienona (\lambda
cal = 310 nm) indica que la pérdida de un doble enlace fue en la
posición \Delta13-14 para dar el cromóforo de
trieno observado. Juntos, estos resultados indican que el compuesto
IV era 13,1 4-dihidro- 1
5-oxo-LXA_{4}.
El éster metílico, Me_{3}SiO derivado del
compuesto II (valor de C - 25,4) dio iones a m/z 203 (pico base;
CH(OSiMe_{3})-(CH_{2})_{3}COOCH_{3}), 173
(Me_{3}SiO^{+}=CH-(CH_{2})_{4}-CH_{3}),
171 (203-32) y 584 (M+). Su ion molecular era dos
unidades de masa superior que el derivado de LXA_{4}. Estos iones
y una banda triplete de absorbancia \lambda_{max} de MeOH a 259
nm, 269 y 282 nm sugiere que el compuesto II era un
dihidro-derivado de LXA_{4}. El éster metílico,
Me_{3}SiO derivado del compuesto I procedente de células
HL-60 dio dos productos en GC. El principal (valor
de C = 25,0) dio iones similares en su espectro de masa al del
LXA_{4}, pero en su lugar, su ión molecular aparecía a m/z 586 con
iones también presentes a m/z 555 (M-31) y 496
(M-90), indicando que dos de los cuatro dobles
enlaces se habían reducido (no mostrado) Sin embargo, no se
observaron productos idénticos con monocitos de sangre periférica
(más abajo) y por tanto, el material derivado de células
HL-60 del pico I ya no caracterizaban adicionalmente
en estos experimentos. Las estructuras de I-IV y
los resultados de la fig. 1 indican que LXA_{4} no se metaboliza
mediante \omega-oxidación por leucocitos
intactos, sino que en su lugar a la vez se deshidrogena en el
carbono 15 del alcohol 15 y también se transforma en un tetraeno
conjugado a estructuras de trieno. Tomadas en conjunto, estas
observaciones sugieren que LXA_{4} puede atacarse por
15-prostaglandina deshidrogenasa
NAD-dependiente (5-PGDH), una enzima
conocida por realizar similares reacciones con las prostaglandinas
como sustrajo (Anggard, E. y Samuelsson, B. (1964) J. Biol. Chem.
239:4097, y revisado en Hansen, H.S. (1976) Prostaglandins
12:647).
Se ha demostrado recientemente que la actividad
de 15-PGDH se induce en células
HL-60 (Xun, C-Q. y col. (1991)
Biochem. J. 279:553), y aparentemente utiliza
15-HETE como sustrato con una eficacia del 92%
comparada con PGE2 (Agins, A.P. y col. (1987) Agents Actions
21:397). Así, los sobrenadantes 100.000 g preparados a partir de
células HL-60 tratadas con PMA convirtieron
15-HETE en
15-oxo-ETE indicando la presencia de
actividad deshidrogenasa tras la diferenciación. LXA_{4} compite
para la catálisis de 15-HETE dando una a K_{i} =
8,2 \pm 2,6 pM (S.E.M., n = 6) calculado a partir de gráficas de
Lineweaverr-Burke. A concentraciones equimolares de
LXA_{4} y 15-HETE, LXA_{4} bloquea la formación
de 15-oxo-ETE en un 50%. La
conversión relativa de LX comparada con PGE por sobrenadantes
100.000 g (fig. 5) indicó que LXA_{4}, 11-trans-LXA_{4}
así como LXB_{4} pero no
5-metil-PGE1 se habían convertido.
Juntos, estos resultados sugieren que LXA_{4} >
11-trans-LXA_{4} > LXB_{4} son sustratos de 15- PGDH o
sistema enzimático equivalente.
Puesto que PMA induce la diferenciación tipo
monocito-macrófago en las células
HL-60 (Collins, S.J. (1987) Blood 70:1233), se
incubaron linajes de monocitos de sangre periférica para determinar
si metabolizaban lipoxina. Lipoxinas muestran potentes acciones
sobre los monocitos (Stenke, L. y col. (1991b) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 180:255) y estas células no
\omega-oxidan eicosanoides (Goldyne, M.E. y col.
(1984) J. Biol. Chem. 259:8815). Cuando suspensiones tanto de
monocitos intactos (n = 5) como células permeabilizadas
(congelación-descongelación o tratadas con
saponina, n = 5) se expusieron a LXA_{4}, ésta se convirtió en
15-oxo-LXA_{4} y productos
conjugados que contienen trienos,
13,14-dihidro-LXA_{4} y
13,14-dihidro-15-oxo-LXA_{4}
(véase la tabla 1).Como en las células HL-60
diferenciadas, los monocitos convierten rápidamente LXA_{4} (>
60%) en 30 s (Fig. 6). Las relaciones temporales para la formación
de estos metabolitos en monocitos tanto intactos como
permeabilizados fueron similares, y sugieren que el metabolito
15-oxo-LXA_{4} es un intermedio
transitorio. También, en cada suspensión de monocitos incubada con
^{3}H-LXA_{4} (d = 33),
13,14-dihidro-15-oxo-LXA_{4}
y 13,14-dihidro-LXA_{4} fueron
los productos principales con radiomarca. Es de notar que se observó
que un producto que se eluía antes de
13,14-dihidro-LXA_{4} a
15,5-17 min también mostraba un cromóforo de trieno
y era aparentemente el 11-trans isómero de
13,14-dihidro-LXA_{4} resultado de
la isomerización cis-trans aparecida durante la elaboración.
El doble enlace 11 -cis de LXA_{4} nativa es lábil y se
isomeriza rápidamente a todo-trans durante la extracción y
aislamiento (Romano, M. y Serhan, C.N. (1992) Biochemistry
31:8269).
31:8269).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se obtuvieron células de leucemia promielocítica
(HL-60) de la American Type Culture Collection
(Rockville, MD). El medio RPMI y los reactivos de cultivo celular
procedían de GIBCO (Grand Island, NY). LXA_{4} sintético, ácido
trihidroxiheptanoico (éster metílico), LXB_{4}, LTD_{4},
LTC_{4} y LTB_{4} procedían de Biomol (Plymouth Meeting, PA), y
SKF 104353 procedía de Smith Kline y French Laboratories. ONO 4057
procedía de ONO Pharmaceutical Co., Ltd. (Osaka, Japón).
[14,15-^{3}H]LTB_{4} (32,8 mCi/mmol),
[l-^{14}C] ácido araquidónico (50,2 mCi/mmol),
^{32}P\gammaATP (3,000 Ci/mmol), [9,10^{3}H(N)]ácido
palmítico (30,0 mCi/mmol), y [9,10^{3}H(N)] ácido
mirístico (30,7 Ci/mmol) procedían de New England Nuclear (DuPont
Co., Boston, MA). LXA_{4} 11,12-acetilénico
procedía de Cascade Biochemicals (Oxford, UK). Los tubos de filtro
para microcentrífuga (acetato de celulosa, 0,45 \mum) se
adquirieron de PGC Scientific (Gaithersburg, MD) y los aceites de
silicona procedían de Harwick Chemical Corp. (Akron, OH) (d = 1,05)
y Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) (d = 0,963), respectivamente.
El nitroazul de tetrazolio, PMA, DMSO, proteasas, ácido retinoico y
actinomicina D se consiguieron de Sigma (St. Louis, MO). La
proteína activamente de los islotes (IAP) procedía de LIST
Biological Lab., InC. (Campbell, CA). Material plástico, placas
Whatman LK6D TLC y solvente (caliedad HPLC) procedían de Fisher
(Springfield, NJ).
Preparación de
[11,12-^{3}H]LXA_{4}. La tritiación
del éster metílico de LXA_{4} 1,12-acetilénico se
realizó en un servicio de tritiación a medida
(NET-259:92-2326) por New England
Nuclear (Boston, MA). En resumen, éster metílico de
11,12-acetileno se caracterizó mediante absorbancia
UV y HPLC de gases invertida como en (Nicolaou, K.C. y col. (1985)
J. Am. Chem. Soc. 107:7515) y se expuso a atmósfera de tritio en
cloruro de metileno a temperatura ambiente. Esta incubación se
agitó en presencia de catalizador de Lindlar (1,0 mg procedente de
Fluka Chemicals) durante - 1 h. La mezcla resultante se almacenó en
metanol y se asiló usando RP-HPLC. Los productos
tritiados se cromatografiaron como el éster metílico usando un
sistema de HPLC en gradiente equipado con un detector de de matriz
de fotodiodos espectral rápido (Serhan, C.N., Methods in Enzymology:
Arachidonate Related Lipid Mediators, en Murphy R.C., Fitzpatrick,
F. (eds.), vol. 187. Orlando, FL, Academic, (1990), p. 167). Esta
mezcla contenía ambos ésteres metílicos de
[11,12-^{3}H]LXA_{4} y
[11,12-^{3}H]-11-trans-LXA_{4}
(relación 1:3) según se determina por coelución con patrones
sintéticos. Tras RP-HPLC, se recogieron las
fracciones que contenían
[11,12-3H]LXA_{4}, y se extrajeron en
acetato de etilo. El ácido libre se preparó mediante saponificación
con LiOH (Fiore, S. y col. (1992) J. Biol. Chem. 267:16168). El
material procedente de estas fracciones, cuando se inyectó en un
MPLC con detección UV-electroquímica, dio más de un
90% de radioactividad asociada con un producto que contenía terreno
que se eluía a la vez con el LXA_{4} sintético. Los materiales
que eluían un el tiempo de retención de la LXA_{4} auténtica en
dos sistemas HPLC se tomaron para los experimentos de enlace. La
actividad específica calculada para [11,12^{3}H]LXA_{4}
fue 40,5 Ci/mmol.
Cultivos y diferenciación celular. Las
células HL-60 se sembraron en medio RPMI
complementado con penicilina 100 U/ml, 100 \mug/ml de
estreptomicina y suero de ternero fetal al 10% (Hyclone, Logan, UT),
se incubaron a 37ºC con atmósfera de CO_{2} al 5% en matraces de
250 ml. Los matraces individuales que contenían 50 x 10^{6}
células/ml recibieron a continuación dimetil sulfóxido (DMSO) (1,12%
v/v, 120 h) o ácido retinoico (R_{A}) (1 pM, 120 h) o miristato
acetato de forbol (PMA) (20 nM, 48 h). Antes de realizar los ensayos
de enlace, las células se lavaron dos veces en solución salina
tamponada con fosfato (PBS), libre de Ca2^{+-} y Mg^{2+}-
enumeradas y suspendidas a 20 x 10^{6} células/ml en tampón Tris
(10 mM), pH 7,4 (Fiore S. y col. (1992) J. Biol. Chem. 267:16168).
La reducción con nitroazul de tetrazolio se realizó para controlar
la inducción del fenotipo polimorfonuclear como en (Imaizumi, M. y
Breitman, T.R. (1986) Blood 67:1273), y se determinó la adherencia
celular para la inducción de fenotipo tipo macrófago (Collins, S.J.
(1987) Blood 70:1273). Se obtuvieron células endoteliales de vena
umbilical humana (HUVEC) mantenidas en tercer paso de cultivo del
Dr. M. Gimbrone (Brigham y Women's Hospital Departamento de
Patología).
Aislamiento de PMN, plaquetas y RBC de sangre
periférica. Se obtuvo PMN humano mediante el procedimiento
modificado de Böyum (Böyum, A. (1968) Scan. J. Clin. Lab. Invest.
21:77) procedentes de sangre fresca heparinizada tras venopunción
de voluntarios normales sanos. Las suspensiones en PBS se
controlaron para el número y viabilidad celular por su capacidad
para excluir el azul tripan ambas excediendo el 98%.). Se obtuvieron
glóbulos rojos a partir de 10 ml de sangre heparinizada tras tres
centrifugaciones en PBS (2.500 rpm, 10 min a 21ºC). La sangre
extraída en citrato dextrosa acidificada (9:1 v/v) se usó para
aislar plaquetas como se ha descrito anteriormente (Serhan, C.N. y
Sheppard, K.A. (1990) J. Clin. Invest. 85:772).
Unión de ligando. Se realizó el enlace de
^{3}H-LXA_{4} y
^{3}H-LTB_{4} esencialmente como en Fiore, S. y
col. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16168. Tras suspender las células en
tampón Tris 10 mM (pH 7,4, Ca^{2+} 2,5 mM, Mg^{2+} 1,2 mM), se
incubaron (20 min a 40ºC) alícuotas (0,5 ml) con los
^{3}H-ligandos sólo (0,3 nM) o en presencia de
concentraciones crecientes de homoligandos u otros compuestos
(3-300 nM). Las incubaciones se centrifugaron
rápidamente (60 s, 12.000 g) en aceite de silicona (d = 1,028), y se
determinó la radioactividad asociada a células mediante recuento
por centelleo en medio líquido (Wallac 1409, Pharmacia, Piscataway,
NJ). Los experimentos de unión con HUVEC se realizaron en placas de
12 pocillos con 3,5 x 10^{5} células/pocillo. Tras 10 min, los
pocillos se lavaron dos veces con PBS y se recuperó la marca
asociada a la célula añadiendo ácido acético glacial (0,5 ml). Los
resultados obtenidos en estos análisis se enviaron para análisis
posterior usando el programa Ligand
(Elsevier-Biosoft, Cambridge, Reino Unido)
Actividad PLD. PMN humanas y células
HL-60 (50 x 10^{6} células/ml) preparadas como
anteriormente se incubaron con ácido
3^{H}-mirístico o ácido palmítico (8 \muCi/50 x
10^{6} células) durante 40-60 min a 37ºC en PBS.
La recaptación celular osciló entre 60-80% demarca
añadida, 7,1 \pm 4,2% (n = 10; media \pm DE) y 32,6 \pm 10,3%
(n = 6; media \pm DE) en tipos fosfolipídicos de PMN y células
HL-60, respectivamente. Las incubaciones se
realizaron a 37ºC (10 x 10^{6} células/ml PBS). Se añadieron los
agonistas en 50 \mul de PBS o a 1:10 (v/v). EtOH:PBS para
formación de fosfatidiletanol (PEt) como en Billah, M.M. y col.
(1989) J. Biol. Chem. 264:17069. En los tiempos indicados, se
detuvieron las incubaciones añadiendo 3,5 ml de CHCl_{3}/MeOH
(2/5, v/v) que contenían ácido ^{14}C-araquidónico
enfriado en hielo (5,000 cpm) usado aquí como patrón interno para
cuantificar el rendimiento de extracción. Las muestras se extrajeron
usando una extracción de Bligh y Dyer modificada como en (Serhan,
C.N. y Sheppard, K.-A. (1990) J. Clin. Invest, 85:772). Las fases
orgánicas, concentradas en 50 \mul de CHCl_{3}/MeOH (8/2, v/v),
se esparcieron en placas lineales K6D TLC reveladas con la fase
orgánica de acetato de etilo/isooctano/ácido acético/agua
(110/50/20/100, v/v/v/v) durante 50 min (Billah, M.M. y col. (1989)
J. Biol. Chem. 264:17069). En este sistema, el ácido fosfatídico
(PA) dio un R_{f} = 0,1 \pm 0,04 y PEt dio un R_{f} = 0,56
\pm 0,04; n = 38+ S.D, por lo que están claramente separados de
otros fosfolípidos (que restaban al principio) de lípidos naturales
(Rf = 0,75-0,90). Los lípidos se visualizaron con
vapor de yodo y se identificaron mediante coelución con patrones
auténticos que también habían sido esparcidos en placas lineales y
cromatografiados en cada TLC. Las regiones correspondientes a PA,
PEt, y patrones internos fueron machacadas y cuantificadas mediante
contador por centellero. Además del marcado con
^{3}H-miristato o
^{3}H-palmitato, las células marcadas, tanto el
[1-^{14}C]araquidonato (0,25 \muCi/30 x
10^{6} PMN) y 32 P\gammaATP (20 \muCi/SO x 10^{6} PMN) se
usaron para controlar la formación estimulada por LXA_{4} de PA y
generación de PEt. En estos experimentos, PA se resolvió usando
acetato de etilo/isooctano/ácido acético (45/15/10, v/v/v) como
sistema solvente (Bocckino, S.B. y col. (1989) Anal. Biochem.
180:24) y dio un R_{f} = 0,46 \pm 0,03 (n = 15). Todos los
valores recogidos para la formación de Pet en las Tablas 4 y 5 se
calcularon sustrayendo el dpm obtenido en presencia de
agonista(s) sólo menos la media en presencia de los
agonista(s) presencia de agonista(s) y EtOH al
0,5%.
Impacto de IAP y estaurosporina sobre la
actividad PLD inducida por LXA_{4}. Los ensayos de actividad
PLD, señalizados según se ha descrito (más arriba), fueron
precedidos de la exposición celular tanto a IAP o estaurosporina.
El tratamiento de PMN con IAP se realizó según se ha descrito
anteriormente (Nigam, S. y col. (1990) J. Cell Physiol. 143:512), y
se incubaron células HL-60 en presencia o ausencia
de lAP (300 ng/ml) durante 2 h a 37ºC (Kanaho, Y. y col. (1992) J.
Biol. Chem. 267:23554). se añadieron alícuotas (10^{7} células/0,5
ml) a 0,4 ml de tampón. A continuación, las células incubadas se
expusieron tanto a 100 \mul de vehículo (PBS, EtOH al 0,04%) o
LXA_{4} (10^{-7} M y 10^{-9} M), en presencia o ausencia de
EtOH al 0,5%. se añadió estaurosporina (100 nM) a las suspensiones
de células 5 min a 37ºC antes de la adición de LXA_{4}.
Tras la preparación de preparación de
11,12-^{3}H]LXA_{4} sintético, se
caracterizó su enlace específico a células promielocíticas y se
realizaron comparaciones directas con la unión específica de
[14,15-^{3}H]LTB_{4}. Cuando se
controlaron marcadores fenotípicos rutinarios, las células
HL-60 sin tratar mostraron un balo nivel de enlace
para ambos ligandos 3H-LXA_{4} y
3H-LTB_{4}. La diferenciación inducida por la
exposición tanto a DMSO (1,12%) como a ácido retinoico (1 \muM)
durante 5 días fue acompañada de un aumento de 5 veces en el enlace
específico para ambos radioligandos. Las células tratadas con PMA
(20 nM, 48 h) que mostraban propiedades de fenotipo tipo macrófago,
es decir, células NBT negativas que se adhieren al plástico (véase
Imaizumi, M. y Breitman, T.R. (1986) Blood 67:1273; Collins, S.J.
(1987) Blood 70:1233), también llevaron a la aparición de enlace
específico con ambos ^{3}H-LXA_{4} y
^{3}H-LTB_{4}. El enlace de equilibrio con
^{3}H-LXA_{4} a 40ºC se alcanzó a los 10 min y
permaneció inalterado en los 20 min siguientes.
Para evaluar si la inducción de enlace
específico para ambos ligandos ^{3}H requirió síntesis de
novo, se añadió actinomicina D (2 \mug/ml) a las incubaciones
con PMA. La actinomicina D bloquea el aumento inducido por PMA del
enlace específico para ambos eicosanoides marcados, sugiriendo que
la inhibición de la biosíntesis proteica de novo también
bloquea la aparición de emplazamientos de enlace específico. El
impacto de los tratamientos con proteasa y glicosidasa se evaluó
tanto en células HL-60 diferenciadas y PMN humano
para enlace específico de ^{3}H-LXA_{4}. El
tratamiento con proteasa redujo el enlace específico y proporcionó
evidencia adicional de apoyo de un componente proteínico de los
emplazamientos de enlace específicos de LXA_{4}.
Los resultados de los ensayos de enlace isotermo
(4ºC, 10 min) con células HL-60 diferenciadas y
[11,12-^{3}H]LXA_{4}
(0,1-30 nM) mostró que
[11,12-^{3}H]LXA_{4} los emplazamientos
de enlace específicos dieron una K_{d} = 0,6 \pm 0,3 nM. Se
observó una parte no lineal del gráfico de Scatchard para
concentraciones observadas con enlace específico de LXA_{4} con
PMN humanas (Fiore, S. y col. (1992) J. Biol. Chem. 267:16168). Los
resultados obtenidos aquí con enlace específico de LTB_{4} con
células HL-60, Kd = 0,12 nM, están esencialmente de
acuerdo con los valores recientemente informados por Harada (Xie, M.
y col. (1991) J. Clin. Invest. 88:45), más exactamente K_{d} =
0,23 nM. Para caracterizar adicionalmente las interacciones de
^{3}H-LXA_{4} con sus emplazamientos de enlace
específico, se realizaron experimentos de enlace competitivo con
células HL-60 diferenciadas. LXA_{4}, LXB_{4},
LTB_{4}, LTC_{4} y los antagonistas del receptor de leucotrieno
SKF 104353 (LTD_{4} antagonist; Harada, Y. (1990) Hiroshima J.
Med. Sci. 39:89) y ONO-4057 (LTB_{4} antagonist;
Gleason. J.G. y col. (1987) J. Med. Chem. 30:959) se evaluaron como
ligandos competitivos potenciales. Ni LXB_{4}, LTB_{4}, ni el
ácido trihidroxiheptanoico (éster metílico) (300 nM) fueron capaces
de desplazar el enlace específico de
^{3}H-LXA_{4} con las células
HL-60 diferenciadas mientras que LTC_{4} produjo
el 30% de disminución de enlace específico cuando se añadió en un
exceso de tres unidades molares logarítmicas. El hallazgo de que
LXA_{4} (300 nM) era incapaz de competir con el enlace de
^{3}H-LTB_{4} (0,3 nM) a células
HL-60 diferenciadas sugiere que LXA_{4} y
LTB_{4} interactúan con tipos separados de emplazamientos de
enlace específicos. Los antagonistas del receptor de leucotrieno SKF
104353 y ONO-4057 no desplazaron el enlace de
^{3}H-LXA_{4} con células HL-60
diferenciadas, pero SKF 104353 y LTD_{4} fueron eficaces
compitiendo por el enlace específico con
^{3}H-LXA_{4} con HUVEC. HUVEC mostró una
K_{d} de 11,0 \pm 2,6 nM y una B_{max} de 2,5 x10^{-10} M
para ^{3}H-LXA_{4}, y se calcularon valores
virtualmente idénticos para la competición por LTD_{4}. En el
caso de ^{3}H-LTB_{4}, HUVEC no enlaza
específicamente con LTB_{4} pero fue evidente una asociación
celular no específica con este ^{3}H-ligando (n =
3; no mostrado) La asociación específica de
^{3}H-LXA_{4} no fue evidente en varios otros
tipos celulares diferencias vigilados. Aquí, ni plaquetas lavadas,
RBC, células \beta (Raji), ni las líneas celulares cultivadas de
células T (Jurkat) mostraron enlace específico para
^{3}H-LXA_{4}. Tomados conjuntamente, estos
resultados indican que LXA_{4} interactúa con emplazamientos de
enlace único en células HL-60 diferenciadas que no
son sensibles ni al antagonista del receptor de leucotrieno (SKF
104353 o ONO-4057).En HUVEC, el enlace específico a
3H-LXA_{4} fue sensible tanto a LTD_{4} como a
SKF 104353 pero no a ONO-4057, sugiriendo que el
enlace específico de ^{3}H-LXA_{4} en este
tipo de células puede reflejar su interacción con receptores
putativos de LTD4.
LXA_{4} rápidamente estimula la formación de
ácido fosfatídico en neutrófilos humanos (Nigam, S. y col. (1990)
J. Cell Physiol. 143:512). Para determinar si el enlace a
^{3}H-LXA_{4} confiere activación PLD, se
controlaron PEt y PA tanto en PMN como en células
HL-60. Los resultados indicaron que LXA_{4}
estimula la actividad PLD en estos tipos celulares con respuestas
temporales similares. PMN expuesto a LXA_{4} (10^{-10} M)
rápidamente generó el producto PEt que atrapa etanol en 60 s, que
disminuyó a los niveles iniciales en 5 min. En ausencia de EtOH
añadido, no se formó PEt a niveles estadísticamente significativos.
Se obtuvo una dependencia de concentración bifásica para la
formación de PEt tanto en PMN como en células HL-60
diferenciadas. Una respuesta máxima aparente se notó en el
intervalo de concentraciones de
\sim10^{-9}-10^{-10} M LXA_{4}, y se
observó un segundo pico de actividad a 10^{-7} M LXA_{4}. Por
debajo de 10^{-8} M, tanto el péptido quimiotáctico FMLP como
LXA_{4} dieron resultados de similar magnitud, pareciendo FMLP
ligeramente más potente con PMN procedente de algunos donantes.
para evaluar la potencial contribución de otras rutas biosintéticas,
se examinó también la formación de PA inducida por LXA_{4} tanto
en ^{32}P\gammaATP como en PMN marcadas con
[1-^{14}C]araquidonato. Pa marcado con
^{32}P fue evidente en niveles estadísticamente significativos
solo tras 30 min de exposición a LXA_{4} (10^{-7} M). Se
obtuvieron resultados similares con la formación de PA marcado con
^{14}C derivado de precursores marcados con
[^{14}C]araquidonato. Estos hallazgos indican que
LXA_{4} también estimula otras rutas de formación de PA en PMN
pero únicamente tras 30 min de exposición.
Sólo células HL-60 diferenciadas
(expresando emplazamientos de enlace específicos para
^{3}H-LXA_{4}) incubadas con LXA_{4}
generaron rápidamente PEt que fue evidente en los 30 s. Las células
HL-60 incubadas con LXA_{4} (10^{-9} M) no
generaron rápidamente PEt. La dependencia de concentración entre
estas células dio también una respuesta bifásica con LXA_{4} y
dio un máximo aparente a 10^{-9} M. Para investigar posibles
eventos de transducción de la señal implicados en la activación de
PLD mediada por LXA_{4}, PMN y células HL-60 se
expusieron seguidamente tanto a IAP como a estaurosporina. Los
resultados indican que la actividad de PLD mediada por LXA_{4}
evocada en el intervalo ce concentraciones bajas
(10^{-9}-10^{-10} M) era sensible al
tratamiento con IAP en ambos tipos celulares y, de manera similar,
la actividad de PLD estimulada a concentraciones más altas de
LXA_{4} (10^{-7} M) era inhibida por la estaurosporina. De esta
forma, en ambos sistemas celulares a concentraciones inferiores a
10^{-8} M, LXA_{4} rápidamente interactúa con los
emplazamientos de enlace específicos que desencadenan la actividad
PLD y por tanto confieren una respuesta funcional, mientras que
para concentraciones submicromolares de LXA_{4}, puede estimular
otros procesos que lleven también a la activación de PLD.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Algunos de los análogos de lipoxina preferidos
(mostrados estructuralmente como compuestos 1 a 8 antes) se
prepararon mediante síntesis total según se describe en el Ejemplo
1. Tras la preparación y aislamiento de estos compuestos vía HPLC,
los compuestos se evaluaron primero para determinar si retenían
actividad biológica usando el ensayo de adhesión de neutrófilo y
los ensayos de transmigración de células epiteliales (según se
describe en Nash, S y col., (1987) J. Clin. Invest.
80:1104-1113; Nash, Sepal., (1991) J. Clin. Invest.
87: 1474-1477; Parkos, C.A. y col., (1991) J. Clin.
Invest. 88:1605-1612; Parkos, C.A. y col. (1992) J.
Cell. Biol. 117:757-764; Madara J.L. y col., (1992)
J. Tiss. Cult. Meth. 14:209-216).
Se encontró que los compuestos 1 a 8
(10^{-7}-10^{-10}M) inhibían la adhesión de
neutrófilo a células epiteliales y su transmigración en células
epiteliales. Se encontró que los precursores acetilénicos (compuesto
1, 3, 5 y 7) eran físicamente más estables que sus contrapartes de
tetraeno. El compuesto 7, que no tenía un grupo alcohol en la
posición C-15 u otras modificaciones en la serie, no
mostró actividad biológica en los ensayos. Parecería por tanto que
un sustituyente en la posición C-15 de lipoxina es
necesario para la biológica al menos de los análogos de lipoxina
A_{4}. 15-metil-lipoxina A_{4}
(compuesto 2) también demostró inhibir la adhesión polimorfonuclear
(PMN) estimulada por el leucotrieno B_{4} (LTB_{4}) a células
endoteliales humanas con una CI_{50} de 1 nM. Se encontró que los
análogos de lipoxina 1 a 8 bloquean la migración a potencias
superiores o iguales que la lipoxina A_{4}. Se encontró que el
compuesto 7 era esencialmente inactivo en el intervalo de
concentraciones para la inhibición inducida por LXA_{4} u otros
análogos. Los resultados en estos bioensayos con neutrófilos
indican que los análogos de lipoxina A_{4} con modificaciones en
las posiciones C15-C20 retienen su acción biológica
y pueden inhibir los eventos de transmigración y adhesión de
PMN.
La "bio-semivida" de los
compuestos 1-8 se evaluó usando células de leucemia
promielocítica humana (HL-60) tratadas con éster de
forbol según se ha descrito en el Ejemplo 2. Estas células
convirtieron más del 95% de lipoxina A_{4} en los cinco minutos
tras su adición a la incubación celular. La Lipoxina A_{4} en este
sistema se transformó rápidamente en la
15-oxo-lipoxina A_{4}. Sin
embargo, en el mismo ensayo,
15-metil-lipoxina A_{4}
(compuesto 2) y ciclohexil-lipoxina A_{4}
(compuesto 4) se recuperaron cuantitativamente en el medio de
incubación a tiempos de hasta dos horas. Estos resultados ilustran
que una modificación en las posiciones del carbono 20 hasta el
carbono 15 evita metabolismo adicional de la lipoxina A_{4}
mediante leucocitos.
Además, la estabilidad del éster metílico
acetilénico de lipoxina A_{4} (compuesto 1) se recuperó
esencialmente intacta tras 60 minutos de incubación en sangre
completa (37ºC) ex vivo, como se evalúa tras extracción y
HPLC de fase invertida. Cuando se toman en su conjunto, estos
resultados indican que los análogos de lipoxina retienen la acción
biológica y son resistentes a metabolismo posterior in
vitro.
Claims (4)
1. Un compuesto análogo de lipoxina excluyendo
lipoxina A_{4} y lipoxina B_{4} de fórmula estructural:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es R_{1}, OR_{1}, o
SR_{1};
en la que R_{1} es
(i) hidrógeno
(ii) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada;
(iii) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
inclusive;
(iv) aralquilo de 7 a 12 átomos de carbono;
(v) fenilo;
(vi) fenilo sustituido
en la que Z_{i}, Z_{iii}, y
Z_{v} se seleccionan cada uno de manera independiente entre el
grupo constituido por -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, -SO_{3}H, e
hidrógeno
en la que Z_{ii} y Z_{iv} se seleccionan
cada uno de manera independiente entre el grupo constituido por
halógeno, metilo, hidrógeno, e hidroxilo:
en la que Q_{1} es (C=O), SO_{2} o (CN);
en la l que Q_{3} es O, S o NH;
en la que uno de R_{2} y K_{3} es hidrógeno
y el otro es
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada;
(c) cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono,
inclusive;
(d) alquenilo de 2 a 8 átomos de carbono,
inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada, o
(e) R_{a}Q_{2}R_{b}
en la que Q_{2} es -O- o -S-;
en la que R_{a} es alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada;
y en el que R_{b} es alquilo de 0 a 8 átomos de carbono,
inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada;
en el que R_{4} es
(a) H;
(b) alquilo de 1 a 6 átomos de carbono,
inclusive, que puede ser una cadena lineal o ramificada;
en la que Y_{1} o Y_{2} es -OH, metilo, o
-SH y en el que el otro es
(a) H (b) CH_{a}Z_{b}
(b) CH_{a}Z_{b}
en la que a + b = 3, a = 0 a 3, b = 0 a 3; y
Z es ciano, nitro, o halógeno;
(c) alquilo de 2 a 4 átomos de carbono,
inclusive, de cadena lineal o ramificada; o
(d) alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono,
inclusive;
o Y_{1} e Y_{2} tomados conjuntamente
son
(a) =N; o
(b) =O;
en la que R_{5} es
(a) alquilo de 1 a 9 átomos de carbono que puede
ser una cadena lineal o ramificada;
(b)
-(CH_{2})_{n}-R_{j}
en la que n = 0 a 4 y R_{j} es
(i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono,
inclusive;
(ii) fenilo; o
(iii) fenilo sustituido
en la que Z_{i}, Z_{iii}, y
Z_{v} se seleccionan cada uno de manera independiente entre el
grupo constituido por, hidrógeno, -NO_{2}, -CN,
-C(=O)-R_{1}, metoxi, y -SO_{3}H; y en el que
Z_{ii} y Z_{iv} se seleccionan cada uno de manera independiente
entre el grupo constituido por halógeno, metilo, hidrógeno, e
hidroxilo;
(c) -R_{a}Q_{a}R_{b}
en la que Q_{a} = -O- ó -S-;
en la que R_{a} es alquileno de 0 a 6 átomos
de carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o
ramificada;
en la que R_{b} es alquilo de 0 a 8 átomos de
carbono, inclusive, que puede ser una cadena lineal o
ramificada;
(d)
-C(R_{iii})(R_{iv})-R_{i}
en el que R_{iii} y R_{iv} se seleccionan
cada uno de manera independiente entre el grupo constituido por
(i) H;
(ii) CH_{a}Z_{b} en el que a \div b = 3, a
= 0 a 3, b = 0 \div 3, y en el que cualquier Z se selecciona de
manera independiente entre el grupo constituido por halógeno;
(e) haloalquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
inclusive, y de 1 a 6 átomos de halógeno, inclusive, de cadena
lineal o ramificada;
en la que R_{6} es
(a) H;
(b) alquilo de entre 1 a 4 átomos de carbono,
inclusive, de cadena lineal o ramificada;
(c) halógeno; pero excluyendo las amidas de la
posición C-1, los alcanoatos de la posición
C-1, y las sales de la posición C-1
farmacéuticamente aceptables del ácido (5S, 6R,
15S)-trihidroxi-7E, 9E, 11Z,
13E-eicosatetranoico (LXA_{4}); y excluyendo los
alcanoatos de la posición C-5, C-6,
y C-15 de LXA_{4}.
2. Un compuesto seleccionado entre el grupo
constituido por:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R' es H o
CH_{3}
\vskip1.000000\baselineskip
3. Una composición farmacéutica que comprende
el compuesto de cualquier reivindicación anterior y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
4. Uso del compuesto según la reivindicación 1
o la reivindicación 2 o la composición de la reivindicación 3 para
la fabricación de un medicamento para
(1) tratar o prevenir la inflamación o una
respuesta inflamatoria en un sujeto y opcionalmente en el que (a)
la respuesta inflamatoria es el resultado de la activación de los
leucocitos, cuya activación comprende la migración de los
leucocitos y la generación de especies de oxígeno reactivo para
evocar la rotura vascular o edema, (b) la respuesta inflamatoria
está asociada con artritis reumatoide, o asma, o (c) la respuesta
inflamatoria es el resultado de lesión física, que incluye trauma
físico y exposición a la radiación;
(2) inducir la vasodilatación para tratar o
prevenir una respuesta vasoconstrictiva o afección, y por ejemplo
la respuesta vasoconstrictiva o afección se selecciona entre el
grupo constituido por enfermedad hemodinámica renal, que incluye
enfermedad glomerular, y una enfermedad cardiovascular, que incluye
hipertensión, infarto de miocardio, e isquemia de miocardio;
(3) para antagonizar una respuesta
vasoconstrictiva de un leucotrieno sulfidopéptido en un sujeto, y
por ejemplo, la respuesta vasoconstrictiva de dicho leucotrieno
está asociada con un trastorno médico seleccionado entre el grupo
constituido por asma, reacciones anafilácticas, reacciones
alérgicas, shock, inflamación, artritis reumatoide, gota,
psoriasis, rinitis alérgica, síndrome de estrés respiratorio en
adulto, enfermedad de Crohn, shock por endotoxina, shock
traumático, shock hemorrágico, shock isquémico del intestino,
enfermedad glomerular renal, hipertrofia prostática benigna,
enfermedad inflamatoria del intestino, isquemia de miocardio,
infarto de miocardio, shock circulatorio, lesión cerebral, lupus
eritematoso sistémico, enfermedad renal crónica, enfermedad
cardiovascular, e hipertensión, y por ejemplo, la respuesta
vasoconstrictiva es una respuesta vasoconstrictiva renal, que
incluye vasoconstricción leve, tal como enfermedad renal crónica, y
vasoconstricción grave crónica, tal como enfermedad renal
glomerular, o
(4) para estimular la proliferación celular en
un sujeto para tratar o prevenir los trastornos supresores
mieloides.
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