ES2313181T3 - Genes optimizados para plantas que codifican toxinas pesticidas. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que comprende SEC ID Nº: 1. Una célula huésped transformada que comprende una secuencia polinucleotídica según la reivindicación 1. Un constructo de ADN que comprende una región promotora que puede expresar en una célula vegetal y, bajo el control de dicha región promotora, una secuencia polinucleotídica según la reivindicación 1. Un procedimiento para controlar una plaga, que comprende poner en contacto dicha plaga con una toxina producida por un huésped transformado, en el que dicho huésped transformado comprende una secuencia polinucleotídica según la reivindicación 1.

Description

Genes optimizados para plantas que codifican toxinas pesticidas.

Antecedentes de la invención

Los insectos y otras plagas les cuestan a los agricultores miles de millones de dólares anualmente en pérdidas de cultivos y en el gasto de mantener estas plagas bajo control. Las pérdidas provocadas por plagas de insectos en entornos de producción agrícola incluyen una disminución en el rendimiento del cultivo, reducción de la calidad del cultivo y aumento de los costes de cosecha.

Los pesticidas químicos han proporcionado un procedimiento eficaz de control de plagas; sin embargo, la opinión pública se ha preocupado por la cantidad de productos químicos residuales que pueden encontrarse en los alimentos, las aguas subterráneas y el medio ambiente. Por tanto, los pesticidas químicos sintéticos están inspeccionándose cada vez más y de manera correcta de ese modo para determinar sus posibles consecuencias medioambientales tóxicas. Los pesticidas químicos sintéticos pueden envenenar el suelo y los acuíferos subyacentes, contaminar las aguas superficiales como resultado del derrame y destruir formas de vida no diana. Los agentes de control químicos sintéticos tienen la desventaja adicional de presentar riesgos para la seguridad pública cuando se aplican en zonas en las que las mascotas, los animales de granja o los niños pueden entrar en contacto con ellos. También pueden causar riesgos para la salud a los que los aplican, especialmente si no se siguen las técnicas de aplicación apropiadas. Las agencias reguladoras de todo el mundo están restringiendo y/o prohibiendo los usos de muchos pesticidas y particularmente los pesticidas químicos sintéticos que son persistentes en el medioambiente y que pueden introducirse en la cadena alimentaria. Los ejemplos de pesticidas químicos sintéticos ampliamente usados incluyen los organocloros, por ejemplo, DDT, mirex, kepona, lindano, aldrín, clordano, aldicarb y dieldrín; los organofosfatos, por ejemplo, clorpirifos, paratión, malatión y diazinón; y carbamatos. Las nuevas restricciones rigurosas sobre el uso de pesticidas y la eliminación de algunos pesticidas eficaces del mercado podrían limitar las opciones económicas y eficaces para controlar plagas costosas.

Debido a los problemas asociados con el uso de pesticidas químicos sintéticos, existe una clara necesidad de limitar el uso de estos agentes y una necesidad de identificar agentes de control alternativos. La sustitución de pesticidas químicos sintéticos, o una combinación de estos agentes con pesticidas biológicos, podría reducir los niveles de productos químicos tóxicos en el medioambiente.

Un agente pesticida biológico que está gozando de una popularidad en aumento es el microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.). El microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria Gram positiva, que forma esporas. La mayoría de las cepas de B.t. no muestran actividad pesticida. Algunas cepas de B.t. producen, y pueden caracterizarse por inclusiones de proteínas cristalinas paraesporales. Estas "endotoxinas \delta", que tienen normalmente actividad pesticida específica, son diferentes de las exotoxinas, que tienen un espectro de huéspedes no específico. Estas inclusiones aparecen a menudo de manera microscópica como cristales conformados de manera característica. Las proteínas pueden ser sumamente tóxicas para plagas y son específicas en su actividad tóxica.

Se han usado preparaciones de las esporas y los cristales de B. thuringiensis subsp. kurstaki durante muchos años como insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo, B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 produce una endotoxina \delta cristalina que es tóxica para las larvas de varios insectos lepidópteros.

La clonación y expresión de un gen de proteína de cristal de B.t. en Escherichia coli se describió en la bibliografía publicada hace más de 15 años (Schnepf, H.E., H.R. Whiteley [1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2893-2897). La patente estadounidense número 4.448.885 y la patente estadounidense número 4.467.036 dan a conocer ambas, la expresión de la proteína de cristal de B.t. en E. coli. Se han producido productos de B.t. a base de ADN recombinante y se han aprobado para su uso.

El uso comercial de pesticidas de B.t. se restringía originalmente a un estrecho espectro de plagas de lepidópteros (orugas). Sin embargo, más recientemente, los investigadores han descubierto pesticidas de B.t. con especificidades para un espectro de plagas mucho más amplio. Por ejemplo, otras especies de B.t., concretamente israelensis y morrisoni (también conocidos como tenebrionis, también conocidos como B.t. M-7), se han usado comercialmente para controlar insectos de los órdenes Diptera y Coleoptera, respectivamente (Gaertner, F.H. [1989] "Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms," en Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, ed., Taylor y Francis, Nueva York y Londres, 1990, págs. 245-255).

Se han identificado ahora nuevas especies de B.t., y se han aislado y secuenciado genes responsables de las proteínas de endotoxina \delta activas (Höfte, H., H.R Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52(2):242-255). Höfte y Whiteley clasificaron los genes de proteína de cristal de B.t. en cuatro clases principales. Las clases eran cryI (específica de Lepidoptera), cryII (específica de Lepidoptera y Diptera), cryIII (específica de Coleoptera) y cryIV (específica de Diptera). Se ha notificado el descubrimiento de cepas específicamente tóxicas para otras plagas (Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992] Bio/Technology 10:271-275). Por ejemplo, las designaciones CryV y CryVI se han propuesto para dos nuevos grupos de toxinas activas contra nematodos.

Muchas moléculas de proteína de cristal de endotoxina \delta de Bacillus thuringiensis están compuestas por dos segmentos funcionales. Para estas proteínas, la toxina núcleo resistente a proteasas es el primer segmento y corresponde a aproximadamente la primera mitad de la molécula de proteína. Se conoce la estructura tridimensional de un segmento núcleo de una endotoxina \delta de B.t. CryIIIA, y se propuso que todas las toxinas relacionadas tienen esa misma estructura global (Li, J., J. Carroll, D.J. Ellar [1991] Nature 353:815-821). La segunda mitad de la molécula se denomina a menudo el "segmento de protoxina". Se cree que el segmento de protoxina participa en la formación del cristal de toxina (Arvidson, H., P.E. Dunn, S. Strand, A.I. Aronson [1989] Molecular Microbiology 3: 1533-1534; Choma, C.T., W.K. Surewicz, P.R. Carey, M. Pozsgay, T. Raynor, H. Kaplan [1990] Eur. J. Biochem. 189: 523-527). La molécula de toxina de 130 kDa completa se procesa normalmente hasta el segmento núcleo resistente mediante proteasas en el intestino de insectos. Por tanto, el segmento de protoxina puede transmitir una especificidad parcial de insecto para la toxina limitando la accesibilidad del núcleo al insecto mediante la reducción del procesamiento mediante proteasas de la molécula de toxina (Haider, M.Z., B.H. Knowles, DJ. Ellar [1986] Eur. J. Biochem. 156:531-540) o mediante la reducción de la solubilidad de la toxina (Aronson, A.I., E.S. Han, W. McGaughey, D. Johnson [1991] Appl. Environ. Microbiol. 57:981-986).

La nomenclatura de 1989 y el esquema de clasificación de Höfte y Whiteley se basaban ambos en la secuencia de aminoácidos deducida y el espectro de huéspedes de la toxina. Este sistema se adaptó para cubrir 14 tipos diferentes de genes de toxina que se dividieron en cinco clases principales. El número de genes de proteína de cristal de Bacillus thuringiensis secuenciados se encuentra actualmente en más de 50. Se ha propuesto un esquema de nomenclatura revisado que se basa únicamente en la identidad de aminoácidos (Crickmore et al. [1996] Society for Invertebrate Pathology, 29ª Reunión Anual, IIIº Coloquio Internacional sobre Bacillus thuringiensis, Universidad de Córdoba, Córdoba, España, 1-6 de septiembre de 1996, resumen). Se ha conservado el nombre mnemotécnico "cry" para todos los genes de toxina excepto cytA y cytB, que conservan una clase separada. Los números romanos se han cambiado por números árabes en la clasificación primaria, y los paréntesis en la clasificación terciaria se han eliminado. Muchos de los nombres originales se han conservado, aunque varios se han vuelto a clasificar.

Con el uso de técnicas de ingeniería genética, están en desarrollo nuevos enfoques para suministrar toxinas de B.t. en entornos agrícolas, incluyendo el uso de plantas modificadas mediante ingeniería genética con genes de toxinas de B.t. para obtener resistencia a insectos y el uso de células microbianas estabilizadas como vehículo de suministro de toxinas de B.t. (Gaertner, F.H., L. Kim [1988] TIBTECH 6:S4-S7). Por tanto, los genes de endotoxinas de B.t. están haciéndose valiosos comercialmente.

Se han logrado diversas mejoras modificando toxinas de B.t. y/o sus genes. Por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.380.831 y 5.567.862 se refieren a la producción de genes de proteínas de cristal insecticidas sintéticas que tienen una expresión mejorada en plantas.

Los obstáculos para el uso agrícola satisfactorio de toxinas de B.t. incluyen el desarrollo de resistencia a toxinas de B.t. por insectos. Además, ciertos insectos pueden ser refractarios a los efectos de B.t. Tales insectos incluyen el picudo del algodonero y el gusano cortador grasiento, así como insectos adultos de la mayoría de las especies que anteriormente no han demostrado sensibilidad significativa aparente frente a endotoxinas \delta de B.t.

Por tanto, las estrategias de manejo de la resistencia en tecnología de plantas con B.t. se han hecho de gran interés. El descubrimiento de aislados de B.t. y nuevos usos de aislados de B.t. conocidos sigue siendo una técnica empírica, impredecible. Sigue habiendo una gran necesidad de nuevos genes de toxinas que puedan expresarse satisfactoriamente a niveles adecuados en plantas de una manera que dará como resultado el control eficaz de insectos y otras plagas.

Sumario de la invención

Un polinucleótido según la presente invención comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 1. Esta es una secuencia polinucleotídica para un gen diseñado 1AC1AB-B-PO, que está optimizado para su expresión en plantas. Este gen codifica una toxina CrylAc (N-terminal)/Cry1Ab (protoxina) quimérica.

La secuencia polinucleotídica de la presente invención tiene ciertas modificaciones, en comparación con secuencias de tipo natural, que la hacen particularmente muy adecuada para su expresión optimizada en plantas. Usando técnicas conocidas para los expertos en la técnica, pueden usarse las secuencias polinucleotídicas descritas en el presente documento para transformar plantas con el fin de conferir resistencia frente a plagas a las plantas.

Descripción de la invención

Debe resultar evidente para un experto en esta técnica que, dada la secuencia expuesta en el presente documento, puede obtenerse un gen de la invención objeto a través de varios medios. En una realización preferida, el gen objeto puede construirse sintéticamente usando un sintetizador de genes. El gen específico ejemplificado en el presente documento también puede obtenerse modificando, según las enseñanzas de la invención objeto, ciertos genes de tipo natural (por ejemplo, mediante técnicas de mutación puntual) a partir de ciertos aislados depositados en un depósito de cultivos según se trata a continuación.

Los polinucleótidos de la invención objeto pueden usarse para formar "genes" completos para codificar proteínas o péptidos en una célula huésped deseada. Por ejemplo, tal como reconocería fácilmente el experto, los polinucleótidos de la invención objeto se muestran sin codones de parada. Además, los polinucleótidos objeto pueden colocarse apropiadamente bajo el control de un promotor en un huésped de interés, según se conoce fácilmente en la técnica.

Tal como reconocería fácilmente el experto, el ADN puede existir en forma bicatenaria. En esta disposición, una cadena es complementaria a la otra cadena y viceversa. La "cadena codificante" se usa a menudo en la técnica para referirse a la cadena que tiene una serie de codones (un codón es tres nucleótidos que pueden leerse los tres a la vez para proporcionar un aminoácido particular) que puede leerse como un marco de lectura abierto (ORF) para formar una proteína o péptido de interés. Con el fin de expresar una proteína in vivo, se traduce normalmente una cadena de ADN en una cadena complementaria de ARN que se usa como molde para la proteína. A medida que se replica el ADN en una planta (por ejemplo) se producen cadenas complementarias, adicionales de ADN. Por tanto, la invención objeto incluye el uso de los polinucleótidos ejemplificados mostrados en el listado de secuencias adjunto o bien las cadenas complementarias. El ARN y ANP (ácidos nucleicos peptídicos) que son funcionalmente equivalentes al ADN ejemplificado, se incluyen en la invención objeto, cuya invención objeto incluye no sólo los genes y las secuencias ejemplificados específicamente en el presente documento sino también equivalentes y variantes de los mismos (tales como mutantes, fusiones, quiméricos, truncamientos, fragmentos y genes más pequeños) que presentan las mismas o similares características con respecto a la expresión de toxinas en plantas, en comparación con los dados a conocer específicamente en el presente documento. Según se usa en el presente documento, "variantes" y "equivalentes" se refieren a secuencias que tienen sustituciones, deleciones (internas y/o terminales), adiciones o inserciones de nucleótidos (o aminoácidos) que no afectan materialmente a la expresión de los genes objeto, y a la actividad pesticida resultante, en plantas. También se incluyen en esta definición fragmentos que conservan la actividad pesticida. Por tanto, se incluyen en la invención objeto polinucleótidos que son más pequeños que los ejemplificados específicamente en la invención objeto, siempre que el polinucleótido codifique una toxina pesticida.

Pueden modificarse genes, y pueden construirse fácilmente variaciones de genes, usando técnicas convencionales. Por ejemplo, se conocen bien en la técnica técnicas para producir mutaciones puntuales. Además, pueden usarse exonucleasas o endonucleasas disponibles comercialmente según procedimientos convencionales, y pueden usarse enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al sitio para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. También pueden obtenerse genes útiles usando una variedad de enzimas de restricción.

Debe indicarse que genes equivalentes codificarán toxinas que tienen una alta identidad u homología de aminoácidos con las toxinas codificadas por los genes objeto. La homología de aminoácidos será la más alta en regiones críticas de la toxina que explican la actividad biológica o están implicadas en la determinación de la configuración tridimensional que en última instancia es responsable de la actividad biológica. A este respecto, ciertas sustituciones son aceptables y pueden esperarse si estas sustituciones están en regiones que no son críticas para la actividad o son sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan a la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, pueden clasificarse los aminoácidos en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y ácidos. Las sustituciones conservativas mediante las cuales un aminoácido de una clase se sustituye por otro aminoácido del mismo tipo se encuentran dentro del alcance de la invención objeto siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. La tabla 1 proporciona un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

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En algunos casos, también pueden realizarse sustituciones no conservativas. El factor crítico es que estas sustituciones no deben restarle valor a la capacidad de las plantas para expresar las secuencias de ADN objeto o a la actividad biológica de la toxina.

Según se usa en el presente documento, polinucleótidos "aislados" se refiere a estas moléculas cuando no están asociadas con las otras moléculas con las que se encontrarían en la naturaleza e incluirían su uso en plantas. Por tanto, la referencia a "aislado y purificado" significa la implicación de la "mano del hombre" según se describe en el presente documento.

Los genes que codifican toxinas de la invención objeto pueden introducirse en una amplia variedad de huéspedes microbianos o vegetales. En algunas realizaciones de la invención objeto, pueden usarse huéspedes microbianos transformados en etapas preliminares para preparar precursores, por ejemplo, que finalmente se usarán para transformar, en realizaciones preferidas, células vegetales y plantas de modo que expresen las toxinas codificadas por los genes de la invención objeto. Los microbios transformados y usados de esta manera están dentro del alcance de la invención sujeto. Los microbios recombinantes pueden ser, por ejemplo, B.t., E. coli o Pseudomonas. Las transformaciones pueden realizarlas los expertos en la técnica usando técnicas convencionales. Los materiales necesarios para estas transformaciones se dan a conocer en el presente documento o de lo contrario están fácilmente disponibles para el experto.

Por tanto, en realizaciones preferidas, la expresión del gen de la toxina da como resultado, directa o indirectamente, el mantenimiento y la producción intracelular del pesticida. Cuando la plaga ingiere plantas transformadas, las plagas ingerirán la toxina. El resultado es el control de la plaga.

El gen de la toxina de B.t. puede introducirse mediante un vector adecuado en un huésped, preferiblemente un huésped vegetal. Hay muchos cultivos de interés, tales como maíz, trigo, arroz, algodón, soja y girasol. Los genes de la invención objeto son particularmente muy adecuados para proporcionar una expresión y un mantenimiento estables, en la planta transformada, de la expresión génica del pesticida polipeptídico y, de manera deseable, proporcionar una protección mejorada del pesticida de la inactivación y degradación medioambientales.

Obviamente, se necesita una región promotora que pueda expresar el gen en una planta. Por tanto, para la expresión in planta, el ADN de la invención objeto está bajo el control de una región promotora apropiada. Se conocen en la técnica técnicas para obtener la expresión in planta usando tales constructos.

Pueden insertarse genes que codifican toxinas pesticidas, según se da a conocer en el presente documento, en células vegetales usando una variedad de técnicas que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, está disponible un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas para la preparación para la inserción de genes foráneos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica la toxina de B.t. puede insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para la transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutritivo adecuado, luego se recogen y se lisan. Se recupera el plásmido. Se llevan a cabo generalmente análisis de secuencia, análisis de restricción, electroforesis y otros procedimientos bioquímicos y de biología molecular como procedimientos de análisis. Tras cada manipulación, la secuencia de ADN usada puede romperse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en el mismo u otro plásmido.

Dependiendo del procedimiento de inserción de genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal, entonces al menos el borde derecho, pero a menudo el borde derecho y el izquierdo del ADN-T del plásmido Ti o Ri ha de unirse como la región flanqueante de los genes que van a insertarse. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales se ha investigado de manera intensiva y se ha descrito de manera suficiente en el documento EP 120 516; Hoekema (1985) In: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, capítulo 5; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46; y An et al. (1985) EMBO J. 4:277-287.

Una vez que se ha integrado en el genoma el ADN insertado, es relativamente estable allí y, como norma, no se sale de nuevo. Contiene normalmente un marcador de selección que confiere a las células vegetales transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico, tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o cloranfenicol, entre otros. Por consiguiente, el marcador empleado individualmente debe permitir la selección de células transformadas en vez de células que no contienen el ADN insertado.

Está disponible un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula huésped vegetal. Esas técnicas incluyen la transformación con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformacón, fusión, inyección, biolística (bombardeo con micropartículas) o electroporación así como otros procedimientos posibles. Si se usan agrobacterias para la transformación, el ADN que va a insertarse ha de clonarse en plásmidos especiales, concretamente en un vector intermedio o bien en un vector binario. Los vectores intermedios pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homóloga debido a secuencias que son homólogas a secuencias en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermedios no pueden replicarse por sí mismos en agrobacterias. El vector intermedio puede transferirse en Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse por sí mismos en ambas, E. coli y agrobacterias. Comprenden un gen marcador de selección y un conector o policonector que está en marco mediante las regiones de borde de ADN-T izquierdo y derecho. Pueden transformarse directamente en agrobacterias (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163:181-187). El Agrobacterium usado como célula huésped comprende un plásmido que porta una región vir. La región vir en necesaria para la transferencia del ADN-T en la célula vegetal. Puede estar contenido ADN-T adicional. La bacteria así transformada se usa para la transformación de células vegetales. Pueden cultivarse ventajosamente explantes de plantas con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN a la célula vegetal. Entonces pueden regenerarse plantas completas a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, trozos de hojas, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas-en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas así obtenidas pueden someterse a prueba entonces para detectar la presencia del ADN insertado. No se realizan requerimientos especiales de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible usar plásmidos ordinarios, tales como, por ejemplo, derivados de pUC.

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Las células transformadas crecen dentro de las plantas de manera habitual. Pueden formar células germinales y transmitir el/los rasgo(s) transformado(s) a las plantas de la progenie. Tales plantas pueden hacerse crecer de manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.

<210> 1

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<211> 3468

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Gen de toxina de B.t. sintética

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<400> 1

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Claims (4)

1. Un polinucleótido que comprende SEC ID Nº: 1.

2. Una célula huésped transformada que comprende una secuencia polinucleotídica según la reivindicación 1.

3. Un constructo de ADN que comprende una región promotora que puede expresar en una célula vegetal y, bajo el control de dicha región promotora, una secuencia polinucleotídica según la reivindicación 1.

4. Un procedimiento para controlar una plaga, que comprende poner en contacto dicha plaga con una toxina producida por un huésped transformado, en el que dicho huésped transformado comprende una secuencia polinucleotídica según la reivindicación 1.