JP5746055B2 - 殺虫性タンパク質及びその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、分子生物学の分野に関する。殺虫性タンパク質をコードする新規の遺伝子が提供される。これらのタンパク質及びそれらをコードする核酸配列は、殺虫性製剤の調製及び耐害虫トランスジェニック植物の作出に有用である。

発明の背景
Bacillus thuringiensisは、昆虫のある一定の目及び種に特異的に有毒であるが、植物及び非標的生物には無害な結晶封入体を生産するその能力によって特徴付けられる、グラム陽性の胞子形成土壌細菌である。そのため、Bacillus thuringiensis株又はその殺虫性タンパク質を含む組成物は、農業上の害虫、又はヒト若しくは動物の様々な疾患を媒介する昆虫を制御するための環境に優しい殺虫剤として用いることができる。

Bacillus thuringiensis由来の結晶（Ｃｒｙ）タンパク質（デルタエンドトキシン）は、主に鱗翅目（Lepidopteran）、双翅類（Dipteran）、及び鞘翅目（Coleopteran）の幼虫に対する強力な殺虫活性を有する。これらのタンパク質が、膜翅目（Hymenoptera）、同翅類（Homoptera）、シラミ（Phthiraptera）、ハジラミ（Mallophaga）、及びダニ（Acari）害虫目、並びに線形動物（Nemathelminthes）、扁形動物（Platyhelminthes）、及び有毛足虫（Sarcomastigorphora）などのその他の無脊椎動物目に対してもまた活性を有することが示されている（Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.）。これらのタンパク質は、最初は主としてその殺虫活性によって、ＣｒｙＩからＣｒｙＶに分類された。主要なクラスは、鱗翅目−特異的（Ｉ）、鱗翅目及び双翅類−特異的（II）、鞘翅目−特異的（III）、双翅類−特異的（IV）、及び線虫−特異的（Ｖ）並びに（VI）であった。タンパク質は、サブファミリーにさらに分類された；それぞれのファミリーの中でより密接に関係したタンパク質には、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、などの区分を示す文字を割り当てられた。それぞれの区分の中でさらにより密接にタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｃ１、Ｃｒｙ１Ｃ２、などと命名された。

昆虫標的特異性よりもむしろアミノ酸配列相同性に基づいて、Ｃｒｙ遺伝子について新しい命名法が最近記述された（Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813）。新しい分類においては、それぞれの毒素には、第一階級（アラビア数字１つ）、第二階級（大文字１つ）、第三階級（小文字１つ）、及び第四階級（その他のアラビア数字１つ）を包含する固有の名前が割り当てられる。新しい分類においては、第一階級のローマ数字が、アラビア数字に置き換えられた。４５％未満の配列同一性を有するタンパク質は、異なる第一階級を有し、第二及び第三階級における基準は、それぞれ７８％及び９５％である。

結晶タンパク質は、昆虫の中腸に摂取され、そして可溶化されるまで殺虫活性を示さない。摂取されたプロトキシンは、昆虫の消化管においてプロテアーゼにより加水分解され、活性な有毒分子となる

この毒素は、標的幼虫の中腸内の頂部刷子縁のレセプターに結合し、イオンチャネル又は孔を形成しながら頂端膜に移入し、幼虫の死をもたらす。

デルタエンドトキシンは通常、５つの保存配列ドメイン、及び３つの保存構造ドメインを有する（例えば、de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199を参照のこと）。第一の保存された構造ドメインは、７つのアルファヘリックスを含み、膜挿入及び孔形成に関与する。ドメインIIは、ギリシャキー（Greek key）配置に配置された３つのベータシートからなり、そしてドメインIIIは、「ジェリーロール（jelly roll）」形態の２つの逆平行のベータシートからなる（de Maagd et al., 2001、前記）。ドメインII及びIIIは、レセプターの認識及びレセプターとの結合に関与し、そのため、毒素特異性の決定因子と考えられている。

デルタエンドトキシンとは別に、殺虫性タンパク質毒素にはいくつかのその他の公知の分類がある。ＶＩＰ１／ＶＩＰ２毒素（例えば、米国特許第５，７７０，６９６号を参照のこと）は、その他のバイナリー（「Ａ／Ｂ」）毒素の作用機序と同様に、レセプターを介したエンドサイトーシスとそれに続く細胞の被毒を含むと考えられる機序により昆虫に対して強い活性を表す、バイナリー殺虫性毒素である。ＶＩＰ、Ｃ２、ＣＤＴ、ＣＳＴ、又はB. anthracis浮腫及び致死毒素などのＡ／Ｂ毒素は、特異的な、レセプターを介した単量体としての「Ｂ」成分の結合を通して、最初に標的細胞と相互作用する。これらの単量体は、次にホモヘプタマーを形成する。次に、「Ｂ」ヘプタマー−レセプター複合体は、酵素の「Ａ」成分とその後結合し、レセプターを介したエンドサイトーシスを通した酵素の「Ａ」成分のサイトゾル中への移動を可能にするドッキングプラットフォームとして機能する。細胞のサイトゾル中に入ると、「Ａ」成分は、例えばＧ−アクチンのＡＤＰ−リボシル化、又は環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の細胞内レベルを上昇させることにより、正常な細胞の機能を阻害する。Barth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev 68:373--402を参照。

Bacillus thuringiensisをベースとする殺虫剤の過度の使用が、既にコナガ、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）の野外個体群における抵抗性を引き起こしている（Ferre and Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533）。抵抗性の最も一般的な機序は、毒素の、その特異的中腸レセプターへの結合の減少である。これは同じレセプターを共用するその他の毒素への交差耐性をも与える可能性がある（Ferre and Van Rie (2002)）。

発明の概要
細菌、植物、植物細胞、組織及び種子に害虫抵抗性を付与するための組成物及び方法が提供される。組成物は、毒素ポリペプチドのための配列をコードする核酸分子、それら核酸分子を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞を含む。組成物はまた、毒素のポリペプチド配列、及びそれらポリペプチドに対する抗体をも含む。ヌクレオチド配列を、ＤＮＡ構築物、又は微生物及び植物を含む生物への形質転換及び発現のための発現カセットにおいて使用することができる。ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、微生物又は植物を含むが、これらに限定されない生物において発現させるために設計された合成配列であってもよい。組成物はまた、形質転換された細菌、植物、植物細胞、組織、及び種子をも含む。

特に、毒素の核酸配列に対応する、単離した核酸分子が提供される。加えて、ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列が包含される。特に、本発明は、配列番号５０〜９６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子、又は配列番号１〜４７に示されるヌクレオチド配列並びに変異体及びその断片を提供する。本発明のヌクレオチド配列と相補的な、又は本発明の配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた包含される。

本発明の組成物及び方法は、農薬抵抗性を有する生物、特に細菌及び植物の作出に有用である。それらに由来するこれらの生物及び組成物は、農業上の目的のために望ましい。本発明の組成物は、殺虫活性を有する変化した若しくは改良した毒素タンパク質の生成、又は、産物若しくは生物における毒素タンパク質若しくは核酸の有無の検出のためにもまた有用である。

詳細な説明
本発明は、生物、特に植物又は植物細胞において害虫抵抗性を制御するための組成物及び方法に関する。この方法は、本発明の毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いて生物を形質転換することを含む。特に、本発明のヌクレオチド配列は、殺虫活性を有する植物及び微生物の調製に有用である。従って、形質転換した細菌、植物、植物細胞、植物組織及び種子が提供される。組成物は、Bacillus thuringiensisの毒素核酸及びタンパク質である。配列は、目的の生物へその後形質転換するための発現ベクターの構築においてはその他の毒素遺伝子の単離のためのプローブとして、そしてドメインスワッピング又はＤＮＡシャッフリングなどの当該分野において公知の方法により変化させた殺虫性タンパク質の生成のために用いられる。タンパク質は、鱗翅目、鞘翅目、及び線虫害虫集団の制御又は駆除、並びに殺虫活性を有する組成物の生産のために用いられる。

「毒素」という用語は、鱗翅目、双翅目、及び鞘翅目のメンバー又は線虫門のメンバーを含むがこれらに限定されない、１種類以上の害虫に対する有毒活性をもつ本明細書において開示された配列、又はそのようなタンパク質との相同性を有するタンパク質を意味する。いくつかの例においては、Bacillus sp.から毒素タンパク質が単離された。別の実施形態において、毒素を、Clostridium bifermentans及びPaenibacillus popilliaeを含むその他の生物から単離した。毒素タンパク質は、本明細書において開示された完全長ヌクレオチド配列から推測したアミノ酸配列、及び、下流の別の開始部位を使用すること又は殺虫活性を有するより短いタンパク質を生産するプロセシングのいずれかによる、完全長配列よりも短いアミノ酸配列を含む。プロセシングは、タンパク質が発現される生物、又はそのタンパク質を摂取した後の害虫において生じる場合がある。

様々な実施形態において、本明細書において開示された配列は、デルタエンドトキシンタンパク質との相同性を有する。デルタエンドトキシンは、ｃｒｙ１〜ｃｒｙ５３、ｃｙｔ１及びｃｙｔ２、及びＣｙｔ様毒素として同定されたタンパク質を含む。現在、多様な特異性及び有毒性を有する２５０を超える公知の種のデルタエンドトキシンがある。包括的な一覧については、Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813を、定期的な更新については、www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/indexのCrickmore et al. (2003)「Bacillus thuringiensis toxin nomenclature」を参照。いくつかの実施形態において、本明細書において開示されたデルタエンドトキシン配列は、配列番号１〜４７又は９７〜２０３のいずれかに示されたヌクレオチド配列、配列番号５０〜９６のいずれかに示されたアミノ酸配列、及びその断片を含む。

ｃｒｙ８ホモログ
１つの実施形態において、本明細書において開示された配列は、デルタエンドトキシンのｃｒｙ８ファミリーとの相同性を有する。デルタエンドトキシンのｃｒｙ８ファミリーは、鞘翅目の昆虫に対して有毒であることが示されている。例えば、鞘翅目に活性なＣｒｙ８変異体は、米国特許第７，１０５，３３２号に記載されている（その全体を参照により明細書に組み入れる）。特許‘３３２にはまた、エンドトキシンの構造と機能との間の関係についての知見を提供する、Ｃｒｙ３Ａ遺伝子の決定した構造（Li et al. (1991) Nature 353:815 821）から構築したｃｒｙ８相同性モデルが示されている。

いくつかの実施形態において、本明細書に包含されるｃｒｙ８ホモログは、配列番号１、２、及び３に示されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、並びに配列番号５０、５１、及び５２に示されたアミノ酸配列を含む。生物学的に活性な変異体及びこれら配列の断片もまた包含される。

ｃｒｙ７様配列
１つの実施形態において、本明細書において開示された配列は、ｃｒｙ７様デルタエンドトキシンである。様々な実施形態において、本発明のｃｒｙ７様配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列、配列番号５３に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

ｃｒｙ１Ｉホモログ
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、デルタエンドトキシンのｃｒｙ１Ｉファミリーとの相同性を有する。いくつかの実施形態において、ｃｒｙ１Ｉホモログは、配列番号５に示されるヌクレオチド配列、配列番号５４に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

ｃｒｙ１Ｉ遺伝子（以前のｃｒｙＶ遺伝子）は、結晶状に蓄積しない約７０〜８１kDaのタンパク質をコードし（Choi et al. (2000) Curr. Microbiol. 41:65-69; Gleave et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59:1683-1687; Kostichka et al. (1996) J. Bacteriol. 178:2141-2144;米国特許第６，２３２，４３９号；米国特許第５，７２３，７５８号；Selvapandiyan et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5855-5858; Shin et al. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61:2402-2407; Song et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:5207-5211; Tailor et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:1211-1217;及びTounsi et al. (2003) J. Appl. Microbiol. 95:23-28）；これらは、Ｃｒｙ１群のタンパク質との類似性によって、Ｃｒｙ１Ｉタンパク質として分類されてきた（Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813）。昆虫からの攻撃から、形質転換植物を保護することにおけるＣｒｙ１の有効性が示されてきた（Lagnaoui et al. (2001) CIP Program Rep. 1999-2000:117-121; Liu et al. (2004) Acta Biochim. Biophys. Sin. 36:309-313;及びSelvapandiyan et al. (1998) Mol. Breed. 4:473-478）。通常、ｃｒｙ１Ｉ遺伝子は、発現していないか又は成長期において発現するかのいずれかであり、そして成長懸濁液中に分泌される（Kostichka et al. (1996) J. Bacteriol. 178:2141-2144; Selvapandiyan et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5855-5858; Song et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:5207-5211;及びTounsi et al. (2003) J. Appl. Microbiol. 95:23-28）。Ｃｒｙ１Ｉタンパク質は、大部分のその他のＣｒｙ１タンパク質よりも広い宿主域を有し、そして宿主は、鱗翅目及び鞘翅目害虫の重要な種を含む（Tailor et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:1211-1217）。

ｃｒｙ９ホモログ
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、デルタエンドトキシンのｃｒｙ９ファミリーとの相同性を有する。いくつかの実施形態において、ｃｒｙ９ホモログは、配列番号６に示されるヌクレオチド配列、配列番号５５に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

ｃｒｙ４ホモログ
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、デルタエンドトキシンのｃｒｙ４ファミリーとの相同性を有する。様々な実施形態において、本明細書において包含されるｃｒｙ４ホモログは、配列番号７、８、９、１０、１１、及び１２に示されたヌクレオチド配列、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、及び６１に示されたアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

デルタエンドトキシンのｃｒｙ４ファミリーは、双翅目の害虫に対する活性を有することが示されてきた。Angsuthanasombat et al. ((2004) Journal of Biochemistry and Molecular Biology 37(3):304-313、その全体、特にｃｒｙ４の構造解析に関して、を参照により明細書に組み入れる）は、ｃｒｙ４の３次元構造及び構造と双翅類活性との相関について記載している。

ｃｒｙＣ３５／５３様配列
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、ｃｒｙＣ３５／ｃｒｙＣ５３様配列である。いくつかの実施形態において、ｃｒｙＣ３５／ｃｒｙＣ５３様配列は、配列番号１３、１４、１５、又は１６に示されるヌクレオチド配列、配列番号６２、６３、６４、及び６５に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

ｃｒｙ２１／ｃｒｙ１２様配列
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、ｃｒｙ２１／ｃｒｙ１２様配列である。ｃｒｙ１２／２１ファミリーは、線虫害虫に対する活性を有することが示されている（Wei (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(5): 2760-2765及び欧州特許第０４６２７２１Ａ２号、このそれぞれは参照により本明細書に組み入れる）。様々な実施形態において、本明細書に包含されるｃｒｙ２１／ｃｒｙ１２様配列は、配列番号１７、１８、１９、及び２０に示されるヌクレオチド配列、配列番号６６、６７、６８、及び６９に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

ＶＩＰ様又はバイナリー様配列
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、ＶＩＰ様又はバイナリー様タンパク質である。植物性殺虫タンパク質（ＶＩＰ）は、細菌の栄養成長の際に生産される殺虫タンパク質であり、従って外毒素に分類される。ＶＩＰ遺伝子は、様々な鱗翅目に対する殺虫活性を示す。

ＶＩＰ１／ＶＩＰ２毒素（例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第５，７７０，６９６号を参照）は、その他のバイナリー（「Ａ／Ｂ」）毒素の作用機序と同様に、レセプターを介したエンドサイトーシスとそれに続く細胞の被毒を含むと考えられる機序により昆虫に対して強い活性を表す、バイナリー殺虫性毒素である。ＶＩＰ、Ｃ２、ＣＤＴ、ＣＳＴ、又はB. anthracis浮腫及び致死毒素などのバイナリーＡ／Ｂ毒素は、特異的なレセプターを介した単量体としての「Ｂ」成分の結合を通して、最初に標的細胞と相互作用する。これらの単量体は、次にホモヘプタマーを形成する。次に「Ｂ」ヘプタマー−レセプター複合体は、その後、酵素の「Ａ」成分と結合し、レセプターを介したエンドサイトーシスを通した酵素の「Ａ」成分のサイトゾル中への移動を可能にするドッキングプラットフォームとして機能する。細胞のサイトゾル中に入ると、「Ａ」成分は、例えばＧ−アクチンのＡＤＰ−リボシル化、又は環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の細胞内レベルを上昇させることにより、正常な細胞の機能を阻害する。その全体を参照により本明細書に組み入れる、Barth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev 68:373-402を参照。

Ａ／Ｂ型バイナリー毒素とは別に、殺虫性タンパク質として作用するその他の型のバイナリー毒素も当該分野において公知である。Ｃｒｙ３４Ａｂ１及びＣｒｙ３５Ａｂ１は、ＰＳ１４９Ｂ１株より同定された、殺虫活性を有するバイナリー毒素を含む（Ellis et al. (2002) Appl Environ Microbiol. 68:1137-45、参照によりその全体を本明細書に組み入れられる）。これらの毒素はそれぞれ、およそ１４及び４４kDaの分子量を有する。同様の機構並びにＣｒｙ３４Ａａ及びＣｒｙ３４Ａｂとの相同性を有するその他のバイナリー毒素も同定された（Baum et al. (2004) Appl Environ Microbiol. 70:4889-98、参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。

ＢｉｎＡ及びＢｉｎＢは、殺蚊性（mosquitocidal）バイナリー毒素タンパク質を含むBacillus sphaericus由来のタンパク質である（Baumann et al. (1991) Micriobiol. Rev. 55:425-36）。Ｃｒｙ３５は、これらＢｉｎＡ及びＢｉｎＢタンパク質とのアミノ酸類似性を示す。Ｃｒｙ３６（ＥＴ６９）及びＣｒｙ３８（ＥＴ７５）（国際公開第００／６６７４２−Ｂ号、参照によりその全体を本明細書に組み入れる）もまた、ＢｉｎＡ及びＢｉｎＢとのアミノ酸類似性を示す独立して単離されたペプチドであり、従って、バイナリー毒素を含むと考えられる。

様々な実施形態において、本明細書に包含されるＶＩＰ様又はバイナリー様配列は、配列番号２１、２２、２３、及び２４に示されるヌクレオチド配列、配列番号７０、７１、７２、及び７３に示されるアミノ酸配列、並びにその生物学的に活性な変異体及び断片を含む。

ＭＴＸ様配列
さらに別の実施形態において、本明細書に包含される配列は、ＭＴＸ様配列である。当該分野で使用される場合、「ＭＴＸ」という用語は、当該技術において、Bacillus sphaericusにより生産される一組の殺虫性タンパク質を説明するために用いられる。当該分野においてはしばしばＭＴＸ１と称される、これらの第一は、蚊に対して有毒な副胞子結晶として合成される。結晶の主要な成分は５１及び４２kDaの２つのタンパク質である。有毒性には両方のタンパク質が存在することが必要とされるため、ＭＴＸ１は、「バイナリー」毒素だと考えられる（Baumann et al. (1991) Microbiol. Rev. 55:425-436）。

異なる有毒性を有する異なるBacillus sphaericus株の解析によって、２つの新しいクラスのＭＴＸ毒素が同定された。ＭＴＸ２及びＭＴＸ３は、殺虫活性を示す関連したクラスの別個の殺虫性毒素を表す。例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Baumann et al. (1991) Microbiol. Rev. 55:425-436を参照。ＭＴＸ２は、１００kDaの毒素である。Bacillus sphaericus由来のＭＴＸ３のアミノ酸配列は、Bacillus sphaericusＳＳＩＩ−１のＭＴＸ２毒素と３８％同一であるが、より最近になって、ＭＴＸ３は、別個の毒素として同定された（Liu, et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 2174-2176）。Ｍｔｘ毒素は、Bacillus sphaericus株の殺虫活性を増大させること、及び蚊集団におけるＢｉｎ毒素への抵抗性の進展を管理することの両方において有用な可能性がある（Wirth et al. (2007) Appl Environ Microbiol 73(19):6066-6071）。

様々な実施形態において、ＭＴＸ様配列は、配列番号２５、２６、２７、２８、及び２９に示されるヌクレオチド配列、配列番号７４、７５、７６、７７、及び７８に示されるアミノ酸配列、及びその生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

非Ｃｒｙ毒素
本発明はさらに、デルタエンドトキシンではないが、バチルスから単離された毒素配列を含む。１つの実施形態において、これらの毒素は、ホスファチジルイノシトールホスホジエステラーゼ（ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）とも称される）との相同性を有する。ホスファチジルイノシトールホスホジエステラーゼは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）とホスファチジルイノシトール（ＰＩ）アンカーを分解する。これらのタンパク質は、ＰＩ−ＰＬＣ Ｘ−ボックスドメインを含み、そして細菌細胞膜を通じて培養培地中に酵素を分泌する、Bacillus cereus、Bacillus thuringiensis、Staphylococcus aureus、及びClostridium novyiの培養から単離された。Bacillus cereus由来のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）（Heinz et al. (1995) EMBO J. 14, 3855-3863、参照によりその全体を本明細書に組み入れる）の活性部位ポケットに局在するアミノ酸残基の役割は、部位特異的突然変異生成、動力学、及び結晶構造解析により研究された（Gassler et al. (1997) Biochemistry 36:12802-12813、参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。

様々な実施形態において、本明細書において開示された毒素配列は、配列番号３０に示されるヌクレオチド配列、配列番号７９に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及び断片を含む。

従って、本明細書において、殺虫活性を付与する新規の単離したヌクレオチド配列のファミリーが提供される。毒素タンパク質のアミノ酸配列もまた提供される。この遺伝子の翻訳から生じたタンパク質は、その細胞がそれを摂取した害虫を制御又は殺虫することを可能にする。

ｃｒｙ５５ホモログ
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、ｃｒｙ５５ホモログである。いくつかの実施形態において、ｃｒｙ５５ホモログは、配列番号４３及び４４に示されるヌクレオチド配列、配列番号９２及び９３に示されるアミノ酸配列、並びにその生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

ｃｒｙ１５Ａホモログ
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、ｃｒｙ１５Ａホモログである。Ｃｒｙ１５Ａ毒素は、鱗翅目の害虫に対して活性を有することが示された（Rang et al. (2000) Curr Microbiol. 40(3):200-4）。いくつかの実施形態において、ｃｒｙ１５Ａホモログは、配列番号４５、４６、及び４７に示されるヌクレオチド配列、配列番号９４、９５、及び９６に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

単離した核酸分子、及びその変異体並びにその断片
本発明の１つの態様は、毒素タンパク質及びポリペプチド又はその生物学的に活性な一部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離した又は組換え核酸分子、並びに毒素をコードする核酸を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分である核酸分子に関する。本明細書で使用する場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）及びヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含むことを意味する。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

「単離した」又は「精製した」核酸分子若しくはタンパク質、又はその生物学的に活性な一部分は、組換え技術により生産される場合には、その他の細胞物質若しくは培地を実質的に含まず、又は化学的に合成する場合には、原料となる化学物質若しくはその他の化学物質を実質的に含まない。好ましくは、「単離した」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で、その配列と天然に隣接している配列（すなわち、その核酸の５’及び３’端に位置する配列）（好ましくはタンパク質をコードする配列）、を含まない。本発明の目的のために、核酸分子について言及する場合、「単離した」は単離したクロモソームを除外する。例えば、様々な実施形態において、単離した毒素をコードする核酸分子は、核酸が由来した細胞のゲノムＤＮＡにおいて、天然に隣接した核酸分子である、約５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、０．５kb、又は０．１kb未満のヌクレオチド配列を含むことが可能である。実質的に細胞物質を含まない毒素タンパク質は、（乾燥重量により）約３０％、２０％、１０％、又は５％未満の非毒素タンパク質（本明細書においては「混入タンパク質」とも称される）を有するタンパク質の調製物を含む。

本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜４７に示される配列、及びその変異体、断片、並びに相補鎖を含む。「相補鎖」とは、示されたヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、それによって安定な二本鎖を形成することができる、示されたヌクレオチド配列と十分に相補的なヌクレオチド配列を意味する。このヌクレオチド配列によりコードされる、毒素タンパク質に対応するアミノ酸配列は、配列番号５０〜９６に示される。

これらの毒素をコードするヌクレオチド配列の断片である核酸分子もまた、本発明に包含される。「断片」とは、毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部分を意味する。ヌクレオチド配列の断片は、毒素タンパク質の生物学的に活性な一部分をコードしてもよく、又は以下に開示された方法を用いるハイブリダイゼーションプローブ若しくはＰＣＲプライマーとして使用することが可能な断片であってもよい。毒素ヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、使用の目的により、少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、２９５０、３０００、３０５０、３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０の連続したヌクレオチド、又は本明細書において開示された完全長毒素をコードするヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチドの数までのヌクレオチドを含む。「連続した」ヌクレオチドは、それぞれ直接隣接したヌクレオチド残基を意味する。本発明のヌクレオチド配列断片は、毒素タンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質断片をコードし、それにより、殺虫活性が保持される。「活性を保持する」とは、断片が、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上の毒素タンパク質の殺虫活性を有するものであることを意味する。殺虫活性の測定方法は当該分野において周知である。例えば、参照によりそれらすべての全体を本明細書に組み入れる、Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206；Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照。

本発明のタンパク質の生物学的に活性な一部分をコードする毒素をコードするヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００の連続したアミノ酸、又は本発明の完全長毒素タンパク質中に存在するアミノ酸の総数までのアミノ酸をコードする。いくつかの実施形態において、断片は、タンパク質分解性の切断断片である。例えば、タンパク質分解性の切断断片は、配列番号５０〜９６に関連した、少なくとも約１００アミノ酸、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、又は約１６０アミノ酸のＮ末端又はＣ末端の欠損を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に包含される断片は、例えば、タンパク質分解又はコード配列への停止コドンの挿入による、Ｃ末端結晶化ドメインの除去により生じる。

本発明の好ましい毒素タンパク質は、配列番号１〜４７のヌクレオチド配列と十分に同一なヌクレオチド配列によってコードされる。「十分に同一」とは、本明細書において記載したアライメントプログラムのうちの一つを用いて標準的な指標を使用して参照配列と比較した場合に、少なくとも約６０％又は６５％配列同一性、約７０％又は７５％配列同一性、約８０％又は８５％配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸又はヌクレオチド配列を意味する。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、読み枠位置などを考慮に入れることにより、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するための、これらの値は適宜調整されることを認識するであろう。

２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性のパーセンテージを決定するためには、最適な比較目的について配列を整列させる。２つの配列間の同一性のパーセンテージは、その配列において共通した、同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性のパーセンテージ＝同一な位置の数／位置の総数（例えば、重複している位置）×１００）。１つの実施形態において、２つの配列は同じ長さである。別の実施形態において、比較は参照配列の全長に及ぶ（例えば、配列番号１〜４７のうちの一つの全長に及ぶ、又は配列番号５０〜９６のうちの一つの全長に及ぶ）。２つの配列間の同一性のパーセンテージは、許容できるギャップを含む、又は含まない、以下に記載した技術と同様の技術によって決定することができる。典型的には、同一性のパーセンテージの算出においては、完全な一致が計測される。

２つの配列間の同一性のパーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に用いられるそれら数学的アルゴリズムの非限定的な例としては、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877において変更された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264、のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれる。本発明の毒素様核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２、を使用したＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことができる。本発明の毒素タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を使用してＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる。比較目的のためのギャップのあるアライメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載されたように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０中の）を用いることができる。あるいはまた、分子間の距離関係を検出するための反復検索を行うためには、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いることができる。Altschul et al. (1997)前記を参照。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合には、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）において既定された指標を用いることができる。アライメントはまた、検査によって手動で行ってもよい。

配列を比較するために用いる、数学的アルゴリズムの別の非限定的な例としては、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）がある。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸又はＤＮＡ配列の全長を整列させ、こうして、全アミノ酸配列の保存配列についてのデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、Vector NTI Program Suite（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）のＡＬＩＧＮＸモジュールなどの、いくつかの市販されているＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアにおいて使用される。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアミノ酸配列をアライメントした後、アミノ酸同一性のパーセンテージを評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷのアライメント解析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例としては、ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）がある。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）（Karl Nicholas）は、複数のタンパク質間のアミノ酸（又はＤＮＡ）の類似性及び同一性の評価を可能にする。配列を比較するために用いられる、数学的アルゴリズムの別の非限定的な例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムは、GCG Wisconsin Genetics Software Package, Version 10（Accelrys, Inc, 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USAより入手可能）の一部分である、ＡＬＩＧＮプログラム（version 2.0）に組み込まれる。ＡＬＩＧＮプログラムを用いてアミノ酸配列を比較する場合には、ＰＡＭ１２０重量残基表（weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用することができる。

特にことわりがない限り、配列同一性又は類似性の決定には、以下の指標を用いて、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453を使用したＧＡＰ Version 10が用いられる：ヌクレオチド配列の％同一性及び％類似性については、５０のＧＡＰ Weight及び３のLength Weight、並びにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐ採点マトリックスを用い；アミノ酸配列の％同一性又は％類似性については８のＧＡＰ weight及び２のlength weight、並びにＢＬＯＳＵＭ６２採点プログラムを用いた。等価のプログラムもまた用いることができる。「等価のプログラム」とは、ＧＡＰ Version 10により生成した対応するアライメントと比較した場合に、同一のヌクレオチド残基の一致及び同一の配列同一性のパーセンテージを有するアライメントを生成する、対象となる任意の２つの配列のための任意の配列比較プログラムを意味する。本発明は、変異体核酸分子もまた包含する。毒素をコードするヌクレオチド配列の「変異体」は、本明細書において開示された毒素タンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重により保存的に異なる配列、並びに上記で議論したように十分に同一な配列を含む。天然に生じるアレル変異体を、以下に概説する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技術などの周知の分子生物学技術を用いて、同定することができる。変異体ヌクレオチド配列はまた、例えば、以下で議論するように、部位特異的突然変異を使用して生成されたが、本発明において開示された毒素タンパク質をなおもコードする、合成的に誘導したヌクレオチド配列をも含む。本発明に包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわちネイティブなタンパク質の所望の生物学的活性を持ち続けており、すなわち殺虫活性を保持している。「活性を保持する」とは、ネイティブなタンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％を有する変異体を意味する。殺虫活性の測定方法は、当該分野において周知である。例えば、参照によりそれらすべての全体を本明細書に組み入れる、Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485；Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照。

当業者はさらに、本発明のヌクレオチド配列の変異により変化を導入することができ、そのことによって、タンパク質の生物学的活性を変えることなく、毒素タンパク質をコードするアミノ酸配列を変化させることができる。従って、本明細書に開示された対応するヌクレオチド配列中に、コードされるタンパク質に１つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠損を導入するような１つ以上のヌクレオチド置換、付加、又は欠損を導入することにより、単離した核酸分子の変異体を作出することができる。変異は、部位特異的突然変異生成及びＰＣＲを介した突然変異生成などの標準的な技術によって導入することができる。そのようなヌクレオチド配列変異体もまた、本発明に包含される。

例えば、保存的アミノ酸置換を、１つ以上の予想される非必須アミノ酸残基に行ってもよい。「非必須」アミノ酸残基とは、生物学的活性を変化させることなく、毒素タンパク質の野生型配列から変化させることの可能な残基であり、一方「必須」アミノ酸残基とは、生物学的活性に必要とされる残基である。「保存的アミノ酸置換」とは、類似した側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置換することである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該分野において明らかとなっている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。

一般に、デルタエンドトキシンは、５つの保存配列ドメイン、及び３つの保存構造ドメインを有する（例えば、de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199を参照）。第一の保存構造ドメインは７つのアルファヘリックスからなり、膜挿入及び孔形成に関与する。ドメインIIは、ギリシャキー配置に配置された３つのベータシートを含み、そしてドメインIIIは、「ジェリーロール」形態２つの逆平行のベータシートをからなる（de Maagd et al. (2001)、前記）。ドメインII及びIIIは、レセプターの認識及びレセプターとの結合に関与し、そのため、毒素特異性の決定因子と考えられている。

アミノ酸置換を、機能を保持する非保存領域中で行うことが可能である。通常、それらの置換は、残基がタンパク質活性のために必須である、保存されたアミノ酸残基又は保存されたモチーフ中のアミノ酸残基に対しては行われない。保存された及びタンパク質活性に必須でありうる残基の例としては、例えば、本発明のアミノ酸配列及び公知の毒素配列のアライメントに含まれるすべてのタンパク質の間で同一な残基が挙げられる。保存されているが保存的アミノ酸置換が可能で、なお活性を保持するであろう残基の例としては、例えば、本発明のアミノ酸配列及び公知の毒素配列のアライメントに含まれるすべてのタンパク質の間で保存的置換のみを有する残基が挙げられる。しかしながら、機能的変異体は、保存された残基中にわずかの保存された又は非保存の変化を有することを当業者は理解するだろう。

あるいは、ヌクレオチド配列変異体を、飽和突然変異生成などによりコード配列の全て又は一部分にわたってランダムに変異を導入することにより作出することができ、そして活性を保持する変異体を同定するために、毒素活性を付与する能力について、得られた変異体をスクリーニングすることができる。突然変異生成の後には、コードされたタンパク質を組換え的に発現させることができ、そしてタンパク質の活性を標準的なアッセイ技術を用いて決定することができる。

ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を用いて、本発明の配列と実質的な同一性を有する、対応する毒素配列を同定することができる。例えば、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) and Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY）を参照。

ハイブリダイゼーション法において、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングするために、毒素ヌクレオチド配列の全て又は一部分を用いることができる。それらｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーの構築方法は、一般に当該分野において公知であり、また、Sambrook and Russell, 2001、前記に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、又はその他のオリゴヌクレオチドであってよく、及び^３２Ｐなどの検出可能な基又は、その他の放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、もしくは酵素補因子などのその他の任意の検出可能マーカーを用いて標識してもよい。ハイブリダイゼーション用のプローブを、本明細書において開示された公知の毒素をコードするヌクレオチド配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作出することができる。加えて、ヌクレオチド配列又はコードされたアミノ酸配列における、保存されたヌクレオチド又はアミノ酸残基に基づいて設計された縮重プライマーを用いることもできる。プローブは典型的には、本発明の毒素をコードするヌクレオチド配列若しくは断片、又はその変異体の少なくとも約１２、少なくとも約２５、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００の連続したヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。ハイブリダイゼーション用のプローブの調製方法は、一般に当該分野において公知であり、また参照により本明細書に組み入れる、Sambrook and Russell, 2001、前記に開示されている。

例えば、本明細書において開示された全毒素配列、又は１つ以上のその一部分を、対応する毒素様配列及びメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして用いてもよい。様々な条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するためには、それらのプローブは、ユニークな、そして好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチドの長さの又は少なくとも約２０ヌクレオチドの長さの配列を含む。それらのプローブを、選択した生物から対応する毒素配列をＰＣＲによって増幅させるために用いても良い。この技術を、所望の生物からのさらなるコード配列を単離するために、又は生物中のコード配列の有無を検出するための診断アッセイとして用いてもよい。ハイブリダイゼーション技術は、プレーティングしたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを含む（プラーク又はコロニーのいずれか；例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)を参照）。

そのような配列のハイブリダイゼーションを、ストリンジェントな条件下で行ってもよい。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、その条件下においてプローブが、その他の配列よりも、その標的配列に検出可能に、より強度にハイブリダイズする（例えば、少なくともバックグラウンドよりも２倍）条件を意味する。ストリンジェント条件は配列依存性であり、かつ、異なる環境においては異なるだろう。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄の条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブと１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同性プロービング）。あるいは、より低い類似性を検出するために、配列中のいくつかの不一致を許容するようにストリンジェンシー条件を調整することができる（異種プロービング）。通常、プローブは長さにして約１０００ヌクレオチド未満であり、好ましくは長さにして５００ヌクレオチド未満である。

典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３においては塩濃度が約１．５M未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０MのＮａイオン濃度（又はその他の塩）となるであろう条件であり、かつ、温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、及び長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの安定化剤の添加によっても達成され得る。低ストリンジェンシー条件の例としては、３０〜３５％ホルムアミドの緩衝液溶液、１M ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１Ｘ〜２Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘ ＳＳＣ＝３．０M ＮａＣｌ／０．３M クエン酸三ナトリウム）中、５０〜５５℃での洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェント条件の例としては、４０〜４５％ホルムアミド、１．０M ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．５Ｘ〜１Ｘ ＳＳＣ中、５５〜６０℃での洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ ホルムアミド、１M ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１Ｘ ＳＳＣ中、６０〜６５℃での洗浄が挙げられる。任意に、洗浄緩衝液は約０．１％〜約１％ ＳＤＳを含んでもよい。ハイブリダイゼーションを行う時間は通常約２４時間未満であり、一般的には約４〜約１２時間である。

特異性は、典型的には、重要な因子が最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションについては、Ｔ_ｍはMeinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284の式から概算することができる：Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（log M）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；式中Ｍは一価の陽イオンのモル濃度、％ＧＣはそのＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージ、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージ、及びＬは塩基対中のハイブリダイズした長さである。Ｔ_ｍは、（明確なイオン強度及びｐＨの下で）相補的な標的配列の５０％が、完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度である。Ｔ_ｍはそれぞれ１％の不一致につき、約１℃低下する；従って、Ｔ_ｍ、ハイブリダイゼーション、及び／又は洗浄条件を、所望の同一性を有する配列がハイブリダイズするように、調整することができる。例えば、≧９０％同一性を有する配列を探索する場合、Ｔ_ｍを１０℃低下させることができる。通常、ストリンジェントな条件は、特異的配列及びその相補のための明確なイオン強度及びｐＨにおいての熱融点（thermal melting point、Ｔ_ｍ）よりも約５℃低く設定される。しかしながら、厳しいストリンジェント条件は、熱融点（Ｔ_ｍ）よりも１、２、３、又は４℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができ；中程度にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_ｍ）よりも６、７、８、９、又は１０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができ；低いストリンジェント条件は、熱融点（Ｔ_ｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を使用することができる。式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、及び所望のＴ_ｍを用いることで、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変動が本質的に記載されることを、当業者は理解するであろう。所望する不一致の度合いが４５℃未満（水溶液）又は３２℃未満（ホルムアミド溶液）のＴ_ｍを生じる場合には、より高い温度が使用できるように、ＳＳＣ濃度を上昇させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲の指針は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); 及びAusubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)を参照。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。

単離したタンパク質及びその変異体並びにその断片
毒素タンパク質もまた本発明に包含される。「毒素タンパク質」とは、配列番号５０〜９６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。断片、生物学的に活性な一部分、及びその変異体もまた提供され、及び本発明の方法を実施するために用いてもよい。

「断片」又は「生物学的に活性な一部分」とは、配列番号５０〜９６のいずれかに示されたアミノ酸配列を十分に同一であり、かつ、殺虫活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド断片を含む。毒素タンパク質の生物学的に活性な一部分は、例えば、１０、２５、５０、１００又はそれ以上の長さのアミノ酸であるポリペプチドである場合がある。それらの生物学的に活性な一部分は、組み換え技術によって調製すること、及び殺虫活性を評価することができる。殺虫活性の測定方法は、当該分野において周知である。例えば、そのすべての全体を参照により本明細書に組み入れる、Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206；Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照。本明細書で使用する場合、断片は、配列番号５０〜９６の少なくとも８つの連続したアミノ酸を含む。本発明は、その他の断片を包含するが、例えば、約１０、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、又は１３００を超えるアミノ酸の、そのタンパク質中の任意の断片などである。

「変異体」とは、配列番号５０〜９６いずれかのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチドを意味する。変異体はまた、ストリンジェントな条件下で、配列番号１〜４７の核酸分子又はその相補鎖とハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドをも含む。変異体は、突然変異生成により、アミノ酸配列が異なるポリペプチドを含む。本発明によって包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわちネイティブなタンパク質における所望の生物学的活性をもち続けており、すなわち殺虫活性を保持している。殺虫活性の測定方法は当該分野において周知である。例えば、それらすべての全体を参照により本明細書に組み入れる、Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485；Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293；及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照。

本発明のａｘｍｉ遺伝子などの細菌の遺伝子はしばしば、オープンリーディングフレームの開始点に近接した、複数のメチオニン開始コドンを有する。しばしば、１つ以上のこれら開始コドンからの翻訳の開始は、機能性タンパク質の生成を生じる場合がある。これらの開始コドンは、ＡＴＧコドンを含んでもよい。しかしながら、バチルス種などの細菌は、開始コドンとしてＧＴＧコドンもまた認識し、そしてＧＴＧコドンから翻訳が開始されたタンパク質は、最初のアミノ酸としてメチオニンを含む。さらに、細菌においてこれらコドンのどれが天然に使用されているかの予測がなされていることが少ない。従って、別のメチオニンコドンのうちの１つを使用することもまた、殺虫活性をコードする毒素タンパク質の生成を誘導し得ることを理解されたい。これらの毒素タンパク質は本発明に包含され、及び本発明の方法の使用において用いられ得る。

本発明のポリペプチド又は変異体に対する抗体、又はその断片もまた包含される。抗体の作成方法は、当該分野において周知である（例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY；米国特許第４，１９６，２６５号を参照のこと）。

変化させた又は改良した変異体
毒素のＤＮＡ配列を様々な方法により変化させてもよく、そしてこれらの変化が、本発明の毒素によってコードされるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を生じてもよいことが認識される。このタンパク質は、最大約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０又はそれ以上までのアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、配列番号５０〜９６の１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、切断、及び、挿入を含む、様々な方法によって変化させてもよい。

そのような操作の方法は、当該分野において一般に公知である。例えば、毒素タンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異により、調製することができる。これは、突然変異生成及び／又は定方向進化における複数の形態のうちの１つによってもまた達成され得る。いくつかの態様においては、アミノ酸配列中でコードされる変化は、そのタンパク質の機能に実質的に影響を及ぼさない。それらの変異体は、所望の殺虫活性を有するだろう。しかしながら、本発明の組成物へのそれら技術の使用により、殺虫活性を付与する毒素の能力を改善し得ることを理解されたい。例えば、ＸＬ−１ Ｒｅｄ（Stratagene）などは、ＤＮＡ複製に際して高頻度の塩基の誤取り込みを示す宿主細胞において、毒素を発現し得る。それらの株を増殖させた後に、毒素ＤＮＡを（例えば、プラスミドＤＮＡの調製により、又はＰＣＲによる増幅と得られたＰＣＲ断片をベクター中にクローニングすることにより）単離し、非変異原性株中で毒素突然変異体を培養し、そして殺虫活性を有する突然変異した毒素遺伝子を、例えば、殺虫活性について試験するアッセイを行うことによって、同定することができる。通常、タンパク質を混合し、そして摂食アッセイに用いる。例えば、Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293を参照。それらのアッセイは、植物を１種類以上の害虫に接触させ、そして植物の生存能力及び／又は害虫の致死率を決定することを含む場合がある。高められた有毒性を生じる突然変異の例は、Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806に見られる。

あるいは、実質的に活性に影響を及ぼすことなく、数多くのタンパク質のタンパク質配列のアミノ又はカルボキシ末端に変化を作出してもよい。これは、ＰＣＲ増幅において用いられるオリゴヌクレオチド中にアミノ酸をコードする配列が含まれるために、タンパク質のコード配列を変化又は伸張させるＰＣＲ増幅を含む、ＰＣＲなどの、近年の分子法により導入された、挿入、欠失、又は、変化を含む場合がある。あるいは、付加されたタンパク質配列は、タンパク質融合体を生成するために、当該分野において一般的に用いられるタンパク質の、全タンパク質コード配列を含む場合がある。それらの融合タンパク質は、（１）目的のタンパク質の発現を上昇させる（２）タンパク質精製、タンパク質検出、又はその他の当該分野において公知の実験方法のいずれかを促進するための、結合ドメイン、酵素活性、又はエピトープを導入する（３）グラム陰性細菌の細胞周辺腔、又は真核細胞の小胞体、後者はしばしばタンパク質のグリコシル化を生じる、などの細胞内小器官への標的分泌又はタンパク質の翻訳、のためにしばしば用いられる。

本発明のヌクレオチド及びアミノ酸配列の変異体は、ＤＮＡシャッフリングなどの突然変異原性及び組換え的手法により誘導された配列をもまた包含する。それらの手法では、所望の特性を有する新しい毒素タンパク質の作出のために、１つ以上の異なる毒素タンパク質のコード領域を用いることができる。この方法においては、組換えポリヌクレオチドのライブラリーが、十分な配列同一性を有する領域を含む、関連するポリヌクレオチド配列の集団から生成され、そして、インビトロ又はインビボにおいて相同的に再結合する可能性がある。例えばこの方法を用いて、高められた殺虫活性などの、目的の改善された特性を有するタンパク質をコードしている新しい遺伝子を得るために、本発明の毒素遺伝子とその他の公知の毒素遺伝子との間で目的のドメインをコードするモチーフ配列を、シャッフリングする場合がある。それらＤＮＡシャッフリングの方法は、当該分野において公知である。例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291；及び米国特許第５，６０５，７９３号及び第５，８３７，４５８号を参照。

ドメインスワッピング又はシャッフリングは、変化させたデルタエンドトキシンタンパク質を生成する別の機序である。ドメインII及びIIIを、デルタエンドトキシンタンパク質間でスワッピングさせてもよく、その結果、改善した殺虫活性又は標的スペクトル有する雑種又はキメラ毒素が生じる。組換えタンパク質の作出方法及びそれらの殺虫活性について試験する方法は、当該分野において周知である（例えば、Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925を参照）。

ベクター
本発明の毒素配列は、目的の植物中で発現させるための発現カセットにおいて提供され得る。「植物発現カセット」とは、植物細胞においてオープンリーディングフレーム由来のタンパク質の発現を誘導することができるＤＮＡ構築物を意味する。典型的には、これらは、プロモーター及びコード配列を含む。しばしば、それらの構築物は、３’非翻訳領域をもまた含む場合がある。それらの構築物は、葉緑体（又はその他の色素体）、小胞体、又はゴルジ装置などの特定の細胞内構造への、翻訳と同時の又は翻訳後の、ペプチドの輸送を促進するための「シグナル配列」又は「リーダー配列」を含んでもよい。

「シグナル配列」とは、細胞膜を通じた、ペプチドの、翻訳と同時の又は翻訳後の輸送を誘導することが公知である、又はそう考えられている配列を意味する。真核生物においては、これは典型的には、ゴルジ装置への分泌を含み、その結果多少のグリコシル化を伴う。「リーダー配列」とは、翻訳されると、翻訳と同時にペプチド鎖の細胞内小器官への輸送を引き起こすのに十分なアミノ酸配列を生じる、いずれかの配列を意味する。従って、これは、小胞体への移行、液胞、葉緑体を含む色素体、ミトコンドリアなどへの移行による輸送及び／又はグリコシル化を標的としているリーダー配列を含む。

「植物形質転換ベクター」とは、植物細胞の効率的な形質転換に必要なＤＮＡ分子を意味する。それらの分子は、１つ以上の植物発現カセットを含んでいてもよく、そして１つ以上の「ベクター」ＤＮＡ分子を構成していてもよい。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞の形質転換のための、すべての必須なシス及びトランス作用機能をコードするための、２つの非連続なＤＮＡベクターを使用する植物形質転換ベクターである（Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451）。「ベクター」は、異なる宿主細胞間を移動させるために設計された核酸構築物を意味する。「発現ベクター」は、他の細胞において、異種ＤＮＡ配列又は断片を組み入れる、組み込む、及び発現させる能力を有するベクターを意味する。カセットは、本発明の配列に作動可能に連結した、５’及び３’制御配列を含む場合がある。「作動可能に連結した」とは、そのプロモーター配列が第二の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始及び媒介する、プロモーターと第二の配列との間の機能的な結合を意味する。通常、作動可能に連結したとは、結合した核酸配列が連続していること、及び、２つのコード領域を結合させる必要がある場合には、結合した核酸配列が連続し、かつ、同じリーディングフレーム中にあることを意味する。加えて、カセットは、生物に共に形質転換される、少なくとも１つのさらなる遺伝子を含んでいてもよい。あるいは、さらなる遺伝子を、複数の発現カセットにおいて提供することができる。

「プロモーター」は、下流のコード配列の転写を指令するように機能する核酸配列を意味する。プロモーターは、その他の転写及び翻訳制御核酸配列（「制御配列」とも称される）と一緒に、目的のＤＮＡ配列の発現に必須である。

そのような発現カセットは、毒素を制御領域の転写制御下になるように挿入するための、複数の制限部位と共に提供される。

５’〜３’の方向の転写において発現カセットは、植物において機能する、転写及び翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本発明のＤＮＡ配列、並びに翻訳及び転写終止領域（すなわち、終止領域）を含む場合がある。プロモーターは、宿主植物及び／又は本発明のＤＮＡ配列に対して、ネイティブであっても若しくは類似であってもよく、又は外来若しくは異種であってもよい。加えて、プロモーターは、天然の配列であっても又は合成配列であってもよい。プロモーターが宿主植物に対して「ネイティブ」又は「同種」である場合、そのプロモーターが、プロモーターを導入する天然の植物においてみられることを意味する。プロモーターが、本発明のＤＮＡ配列に対して「外因性外来」又は「異種」である場合、本発明の作動可能に連結したＤＮＡ配列に対して、プロモーターが、ネイティブではない又は天然に生じるプロモーターではないことを意味する。

終止領域は、転写開始領域に対してネイティブであってもよく、目的の作動可能に連結したＤＮＡ配列に対してネイティブであってもよく、宿主植物に対して天然であってもよく、又は別の資源（すなわち、プロモーター、目的のＤＮＡ配列、宿主植物、又はそのいずれの組み合わせにとって、外因性外来又は異種）に由来してもよい。オクトピンシンターゼ及びノパリンシンターゼ終止領域などの便利な終止領域は、A. tumefaciensのＴｉ−プラスミドから入手可能である。Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; 及び Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639もまた参照。

適切な場合、形質転換した宿主細胞中での発現を上昇させるように、遺伝子を最適化してもよい。すなわち、発現の改善のために、宿主細胞に好ましいコドンを用いて遺伝子を合成することができ、又は宿主に好ましいコドン使用頻度でのコドンを用いて遺伝子を合成してもよい。通常、遺伝子のＧＣ含量が上昇する。宿主に好ましいコドン使用頻度の議論については、例えば、Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11を参照。当該分野においては、植物に好ましい遺伝子を合成する方法が使用可能である。例えば、参照により本明細書に組み入れる、米国特許第５，３８０，８３１号及び第５，４３６，３９１号、及び、Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498を参照。

１つの実施形態において、毒素が、葉緑体で発現するためにターゲティングされる。この方法において、毒素が葉緑体中に直接挿入されない場合には、発現カセットが、毒素を葉緑体に誘導する輸送ペプチドをコードする核酸をさらに含む場合がある。それら輸送ペプチドは当該分野において公知である。例えば、Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; 及び Shah et al. (1986) Science 233:478-481を参照。

葉緑体を標的とする毒素遺伝子は、植物の核と該器官との間のコドン使用頻度を考慮して、葉緑体において発現させるために最適化してもよい。この方法において、葉緑体に好ましいコドンを用いて目的の核酸を合成してもよい。例えば、参照により本明細書に組み入れる、米国特許第５，３８０，８３１号を参照。

植物形質転換
本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物に導入する工程を含む。「導入する」とは、植物細胞の内部に構築物が侵入する方法において、ヌクレオチド構築物を植物に与えることを意味する。本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を用いる植物に導入する特定の方法の使用を必要とせず、植物の少なくとも１つの細胞にヌクレオチド構築物が侵入することだけが必要とされる。ヌクレオチド構築物を植物に導入する方法は、当該分野において公知であり、安定な形質転換方法、一過性の形質転換方法、及びウイルスを介した方法を含むが、これらに限定されない。

「植物」とは、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、零余子（むかご）、胚及びその後代を意味する。植物細胞は、分化した、又は未分化の細胞である場合がある（例えばカルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師部細胞、花粉）。

「トランスジェニック植物」又は「形質転換した植物」又は「安定に形質転換した」植物又は細胞又は組織は、植物細胞中に組み入れられた又は組み込まれた外因性の核酸配列又はＤＮＡ断片を有する植物を意味する。これらの核酸配列は、外因性の又は非形質転換植物細胞中に存在しない核酸配列、並びに内因性の、又は非形質転換植物細胞中に存在する核酸配列を含む。通常「異種」は、細胞又はそれらが存在する天然のゲノムの一部に対して内因性でない、そして、感染、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マクロプロジェクションなどにより、細胞に付加された核酸配列を意味する。

本発明のトランスジェニック植物は、本明細書において開示された１つ以上の殺虫性配列を発現する。様々な実施形態において、トランスジェニック植物は、さらに、１つ以上のさらなる昆虫抵抗性遺伝子、例えば、１種類以上の鞘翅目、鱗翅目、異翅類、又は線虫害虫を制御するさらなる遺伝子を含む。トランスジェニック植物が、目的の農業上の特性を付与するいずれの遺伝子を含んでもよいことを、当業者は理解するであろう。

植物細胞の形質転換は、当該分野において公知の複数の技術のうちの１つにより達成することができる。植物細胞における発現を得る又は増強するために、本発明の毒素遺伝子を改変してもよい。典型的には、それらのタンパク質を発現する構築物は、その遺伝子の転写を駆動するプロモーター、並びに転写の終止及びポリアデニル化を可能にする３’非翻訳領域を含む。それら構築物の構成は、当該分野において公知である。いくつかの例においてそれは、生じるペプチドが分泌されるように、さもなければ、植物細胞中で標的とされるように、遺伝子を処理するために有用な場合がある。例えば、ペプチドの小胞体への輸送を促進するためのシグナルペプチドを含むように、遺伝子を改変することができる。イントロンのｍＲＮＡプロセシングが発現に必要とされるため、植物発現がイントロンを含むように処理することもまた好ましい。

典型的には、この「植物発現カセット」を「植物形質転換ベクター」中に挿入する。この植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するために必要とされる、１つ以上のＤＮＡベクターを含んでいてもよい。例えば、１つ以上の連続したＤＮＡセグメントを含む植物形質転換ベクターを使用することが、当該分野における一般的な方法である。当該分野においては、これらのベクターはしばしは、「バイナリーベクター」と称される。Agrobacteriumを介した形質転換においては、バイナリーベクター並びにヘルパープラスミドを有するベクターが最も頻繁に用いられ、そこでは効率的な形質転換を達成するために必要とされるＤＮＡセグメントの大きさ及び複雑性が非常に大きく、かつ、機能を別個のＤＮＡ分子上に分けるのに有利である。典型的には、バイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡ輸送に必要なシス作用配列（レフトボーダー及びライトボーダーなど）、植物細胞中で発現できるように改変された選択マーカー、及び「目的の遺伝子」（トランスジェニック植物の作出が望まれる植物細胞中で発現できるように改変された遺伝子）を含むプラスミドベクターを含む。このプラスミドベクター上には、細菌の複製に必要とされる配列もまた存在する。シス作用配列は、植物細胞への効率的な輸送、及びそこにおける発現を可能にする様式で配置される。例えば、選択マーカー遺伝子及び毒素は、レフト及びライトボーダーの間に位置する。しばしば、第二のプラスミドベクターが、Agrobacteriumから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ輸送を仲介する、トランス作用因子を含む。このプラスミドはしばしば、当該分野において理解されるような、Agrobacteriumによる植物細胞への感染、並びにボーダー配列における開裂によるＤＮＡの輸送、及びｖｉｒを介したＤＮＡの輸送を可能にする、病原性機能（Ｖｉｒ遺伝子）を含む（Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451）。複数の型のAgrobacterium株（例えばＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、など）を、植物の形質転換に用いることができる。マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどによる、その他の方法を用いた植物の形質転換においては、第二のプラスミドベクターは必須ではない。

一般的に、植物の形質転換方法は、異種ＤＮＡを標的植物細胞（例えば未成熟又は成熟胚、懸濁培養、未分化細胞、プロトプラストなど）中に移す工程と、その後、非形質転換細胞集団の群から形質転換された植物細胞を回収するために、最大閾値レベルの適した選抜（選択マーカー遺伝子による）を適用する工程を含む。典型的には、移植片を、新しく準備した同じ培地に移し、慣習的に培養する。その後、最大閾値レベルの選択試薬を含む再生培地に静置し、形質転換した細胞を茎に分化させる。その茎を次に、発根した茎又は植物体を回収するために選択発根培地に移す。トランスジェニック植物体はその後、成熟した植物に生育し、そして稔性の種子を生産する（例えば、Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750）。典型的には、移植片を、新しく準備した同じ培地に移し、慣習的に培養する。この技術の一般的な記載及びトランスジェニック植物の作出方法は、Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 及び Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120において見られる。形質転換した材料は多くの細胞を含むため、形質転換された及び非形質転換の両方の細胞が、対象となる標的カルス若しくは組織又は細胞群のいずれの一部分にも存在する。非形質転換細胞を死滅させ、そして形質転換細胞を増殖させることを可能にする能力が、形質転換植物培養を生じる。しばしば非形質転換細胞を除去する能力は、形質転換植物細胞の迅速な回収及びトランスジェニック植物の作出の成功への制限となる。

形質転換プロトコール並びにヌクレオチド配列を植物に導入するプロトコールは、形質転換される標的植物又は植物細胞の型、すなわち単子葉又は双子葉かにより、多様になり得る。トランスジェニック植物の作出は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、遺伝子直接導入、Agrobacteriumによる異種ＤＮＡの植物細胞中への導入（Agrobacteriumを介した形質転換）、粒子に接着させた異種外因性ＤＮＡを用いた植物細胞のボンバードメント、バリスティック粒子加速（ballistic particle acceleration）、エアロゾルビーム（aerosol beam）形質転換（米国特許出願第２００１００２６９４１号；米国特許第４，９４５，０５０号；国際公開第９１／００９１５号；米国特許出願第２００２０１５０６６号）、Ｌｅｃ１形質転換、及びＤＮＡを移すための、その他の様々な粒子を介さない方法を含むが、これらに限定されない、複数の方法のうちの１つによって行われてもよい。

葉緑体の形質転換方法は、当該分野において公知である。例えば、Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606を参照。この方法は、選択マーカーを含み、かつ、同種組換えを介して色素体ゲノムにＤＮＡを標的とするＤＮＡのパーティクルガンによる送達による。加えて、色素体の形質転換は、核にコードされ、かつ、色素体を標的としたＲＮＡポリメラーゼを組織優先的に発現させることにより、色素体が有する発現していない導入遺伝子をトランス活性化することによって達成することができる。このような系は、McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305において報告された。

異種外因性ＤＮＡを植物細胞へ組み込んだ後、次に、非形質転換細胞を死滅させるために培地中に最大閾値レベルの適した選抜を適用し、そして、この選択処理によっても生存した形質転換したと推測される細胞を、定期的に新しい培地に移すことにより、分離及び増殖させる。継代及び適した選択を続けることにより、プラスミドベクターによって形質転換された細胞を同定し、増殖させる。その後、トランスジェニック植物のゲノム中に組み込まれた目的の異種遺伝子の有無を確認するために、分子及び生化学的手法を用いることができる。

標準的な方法に従い、形質転換した細胞を植物中で生育させてもよい。例えば、McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照。次にこれらの植物を生育させ、そして同じ形質転換株又は異なる株のいずれかを用いて受粉させる。得られた雑種は、同定した所望の表現型特徴の構成的発現を有する。所望の表現型特徴の発現が安定して維持され、かつ、遺伝的に引き継がれたかを確認するために２世代以上生育させてもよく、その後、所望の表現型特徴の発現が達成されたかを確認するために、種子を収穫してもよい。この方法において本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば、安定してそれらのゲノムに組み入れられた本発明の発現カセット、を有する形質転換した種子を提供する（「トランスジェニック種子」とも称される）。

植物形質転換の評価
異種外因性ＤＮＡを植物細胞へ導入した後、植物ゲノムへの異種遺伝子の形質転換又は組換えを、核酸、タンパク質及び、組み換えた遺伝子に関連する代謝産物の解析などの様々な方法より確認する。

ＰＣＲ解析は、植物を土壌に移植する前の早い段階において、形質転換細胞、組織、又は茎を、組み入れた遺伝子の有無についてスクリーニングする迅速な方法である（Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。ＰＣＲは、目的の遺伝子又はバックグラウンドのAgrobacteriumベクターなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。

植物の形質転換を、ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析によって確認してもよい（Sambrook and Russell, 2001、前記）。通常、トータルＤＮＡを形質転換体から抽出し、適切な制限酵素で消化し、アガロースゲル中で分画し、そしてニトロセルロース又はナイロン膜上に移す。膜又は「ブロット」を次に、標準的な技術に従って、例えば、放射性標識した^３２Ｐ標的ＤＮＡ断片を用いてプロービングし、導入した遺伝子の植物ゲノム中への組み込みを確認する（Sambrook and Russell, 2001、前記）。

ノーザンブロット解析においては、当該分野において慣習的に用いられる標準的な方法に従って、ＲＮＡを形質転換体の特定の組織から単離し、ホルムアルデヒドゲル中で分画し、そしてナイロンフィルター上にブロッティングする（Sambrook and Russell, 2001、前記）。毒素によりコードされるＲＮＡの発現を次に、当該分野において公知の方法を用いて、このフィルターを毒素に由来する放射性プローブとハイブリダイゼーションすることによって試験する（Sambrook and Russell, 2001、前記）。

毒素タンパク質上に存在する１つ以上のエピトープに結合する抗体を用いて、標準的な手法により、毒素遺伝子によってコードされるタンパク質の有無を確認するために、トランスジェニック植物についてウェスタンブロット、生化学的アッセイなどを行ってもよい（Sambrook and Russell, 2001、前記）。

植物における殺虫活性
本発明の別の態様において、殺虫活性を有する毒素を発現しているトランスジェニック植物を作出してもよい。一例として、トランスジェニック植物を作出するためには上述した方法を用いることができるが、トランスジェニック植物細胞の作出方法は、本発明にとって重要ではない。Agrobacteriumを介した形質転換、微粒子銃を用いた形質転換、及び粒子を介さない方法などの、当該分野において公知の又は記載された方法を実験者の判断で用いてもよい。毒素を発現している植物は、当該分野において記載された一般的な方法、例えば、カルスの形質転換、トランスジェニックカルスの選抜、及びそれら形質転換化するからの稔性のある植物の再生により、単離され得る。それらの過程においては、植物細胞におけるその発現が形質転換細胞の同定する又は選別する能力を付与する限り、いずれの遺伝子を選択マーカーとして使用してもよい。

クロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマイシンなどに対する抵抗性などの、植物細胞に使用するための数多くのマーカーが開発された。葉緑体代謝に含まれる産物をコードするその他の遺伝子もまた、選択マーカーとして使用され得る。例えば、グリホサート、ブロモキシニル、又はイミダゾリノンなどの、植物除草剤への抵抗性を提供する遺伝子は特定の使用を見出す可能性がある。それらの遺伝子は報告されている（Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314（ブロモキシニル抵抗性ニトリルラーゼ遺伝子）；及びSathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188（ＡＨＡＳイミダゾリノン抵抗性遺伝子）。加えて、本明細書において開示された遺伝子は、細菌の又は植物細胞の形質転換を評価するためのマーカーとして有用である。植物、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、零余子（むかご）、胚又はその後代における、導入遺伝子の有無の検出方法は当該分野において周知である。１つの実施形態において、導入遺伝子の有無は、殺虫活性について試験することにより、検出される。

毒素を発現している稔性植物を、殺虫活性について試験し、そして、最適な活性を示されている植物をその後の育種のために選択してもよい。害虫活性ついてアッセイするための方法は当該分野において使用可能である。通常、タンパク質は混合され、摂食アッセイにおいて用いられる。例えばMarrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293を参照。

単子葉及び双子葉を含むがこれらに限定されない、いずれの種の植物形質転換においても本発明を用いることができる。目的の植物の例としては、穀草（トウモロコシ）、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びナタネ、アブラナ属、アルファルファ、ライムギ、キビ、ベニバナ、落花生、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココヤシ、パイナップル、柑橘樹木、ココア、チャ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、エンバク、野菜、装飾用植物、及び針葉樹が挙げられるがこれらに限定されない。

野菜には、トマト、レタス、インゲン、ライマメ、エンドウ、並びにキュウリ、カンタロープ、及びマスクメロンなどのキュウリ属のメンバーが含まれるがこれらに限定されない。装飾用植物には、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、及びキクが含まれるがこれらに限定されない。好ましくは、本発明の植物は、穀物（例えば、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネなど）である。

害虫制御における使用
農薬制御又は殺虫性薬剤としてのその他の生物の改変における、本発明のヌクレオチド配列を含む株又はその変異体の一般的な使用方法は、当該分野において公知である。例えば米国特許第５，０３９，５２３号及び欧州特許第０４８０７６２Ａ２号を参照。

本発明のヌクレオチド配列を含むBacillus株、若しくはその変異体、又は殺虫性遺伝子及びタンパク質を含むように遺伝的に変化させた微生物を、農業穀物及び産物を害虫から保護するために使用することができる。本発明の１つの態様において、細胞を標的害虫の環境に適用した場合に細胞中で生産された毒素の活性を延長する試薬を用いて、全部、すなわち溶解していない、毒素（農薬）を生産する生物の細胞を処理する。

あるいは、毒素遺伝子を細胞宿主中に導入することにより農薬を生産する。毒素遺伝子の発現は、農薬の細胞内因性産及び維持を、直接又は間接的にもたらす。本発明の１つの態様においては、これらの細胞を、細胞を標的害虫の環境に適用した場合に細胞中で生産された毒素の活性を延長する条件下でその後処理する。得られた産物は、毒素の有毒性を保持する。その後、標的害虫を宿している環境、例えば、土壌、水、及び植物の枝葉に適用するために、これらを天然に包含する農薬を、標準的な技術に従って調製することができる。例えば欧州特許出願第０１９２３１９号、及びそこに引用された参考文献を参照。あるいは、得られた材料を農薬として適用することを可能にするなどの、本発明の遺伝子を発現している細胞を調製してもよい。

殺虫性組成物
本発明の活性成分は、通常、組成物の形態において適用され、そして、同時に又は連続して、その他の化合物共に農地又は処理する植物に適用することができる。これらの化合物は、肥料、除草剤、凍結防止剤、界面活性剤、洗浄剤、殺虫性石鹸、ドーマントオイル、ポリマー、及び／又は、製剤の単回投与の後に、標的地域での長期投与を可能にする、持続放出型又は生分解性担体製剤である可能性がある。それらはまた、選択的除草剤、化学的な殺虫剤、殺ウイルス剤、殺菌薬、殺アメーバ剤、農薬、抗真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤又は複数のこれら調整物の混合物となる可能性があり、所望ならば、さらに、製剤分野において習慣的に用いられる農業上許容可能な担体、界面活性剤又は適用を促進するアジュバントと一緒に用いられる。好適な担体及びアジュバントは、固体であっても液体であってもよく、かつ、製剤技術において通常用いられる物質、例えば天然の又は再生した鉱物、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着剤、結合剤又は肥料に相当する。同様に、製剤を食用の「餌」として調製してもよく、又は殺虫性製剤の標的害虫が、摂食又は摂取することを可能にする、害虫「わな」の様式としてもよい。

本発明の細菌株によって生産された少なくとも一つの殺虫性タンパク質を含む、本発明の活性成分又は本発明の農薬組成物の適用方法は、葉への適用、種子コーティング及び土壌への適用を含む。適用の数、及び適用率は、対応する害虫による感染の強度に依存する

組成物は、粉末、塵埃、錠剤、顆粒、スプレー、乳濁液、コロイド、溶液などとして処方することができ、及び乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、又はポリペプチドを含む培養細胞の濃縮などの標準的な手段によって調製することができる。少なくとも１つのそれら殺虫性ポリペプチドを含むすべてのそれら組成物においては、ポリペプチドは、約１％〜約９９重量％の濃度で存在し得る。

本発明の方法により、指定された地域における鱗翅目、双翅目、鞘翅目の、又は線虫害虫を殺す、若しくはその数を減少させることができ、又は感染しやすい害虫による感染を防ぐために、環境地域に予防的に適用することができる。好ましくは、害虫が殺虫的効果量のポリペプチドを摂取、又はそれと接触する。「殺虫的効果量」とは、少なくとも１つの害虫の死、又は害虫増殖、摂食、又は通常の生理的な発達の顕著な減少をもたらす農薬の量を意味する。この量は、例えば、制御する特定の標的害虫、特定の環境、場所、植物、穀物、又は処理する農業用地、環境条件、及び方法、率、濃度、安定性、及び殺虫効果のあるポリペプチド組成物の適用量などの因子によって、多様になり得る。製剤はまた、気候条件、環境の考慮、及び／又は適用の頻度及び／又は害虫感染の強度より、多様になり得る。

記載される農薬組成物を、細菌細胞、結晶及び／又は胞子懸濁液、又は単離したタンパク質成分のいずれかを所望の農業上許容可能な担体と共に配合することにより、製造してもよい。投与に先だち、組成物を、凍結乾燥、フリーズドライ、乾燥、又は水性担体、培地若しくは好適な希釈剤（生理食塩水若しくはその他の緩衝液など）中、などの適切な手段中において調製してもよい。調製した組成物を、塵埃若しくは顆粒材料、又は油中の懸濁液（植物若しくは鉱物）、又は水若しくは油／水乳濁液、又は可溶性粉末、又は農業上の適用において好適な任意のその他担体材料との組み合わせ、の様式をとってもよい。好適な農業上の担体は、固体又は液体であってよく、かつ、当該分野において周知である。「農業上許容可能な担体」という用語は、農薬製剤技術において通常用いられる、アジュバント、不活性化合物、分散剤、界面活性剤、粘着剤、結合剤など全てを含み；これらは農薬製剤分野の当業者において周知である。製剤を、１種類以上の固体又は液体のアジュバントと混合してもよく、そして例えば、標準的な製剤技術に用いる好適なアジュバントと共に殺虫性組成物を均質に混合する、調合する及び／又は粉砕するなどの様々な手段により調製することができる。好適な製剤及び適用方法は、参照により本明細書に組み入れる、米国特許第６，４６８，５２３号に記載される。

あるいは、毒素遺伝子をシュードモナス（Pseudomonas）種中にクローニングして、タンパク質を発現させ、そしてそれらを細菌の細胞壁中にマイクロカプセル化させてもよい。マイクロカプセル化された毒素を、スプレー散布において単独で、又はその他の毒素を含むBacillus thuringiensisを用いた殺虫剤と順番に用いてもよい。

植物を、１つ以上の除草剤、殺虫剤、又は抗真菌剤を含む、１つ以上の化学組成物を用いて処理することもできる。化学組成物の例としては、：果実／野菜除草剤：アトラジン（Atrazine）、ブロマシル（Bromacil）、ジウロン（Diuron）、グリホサート、リヌロン（Linuron）、メトリブジン（Metribuzin）、シマジン（Simazine）、トリフルラリン（Trifluralin）、フルアジホップ（Fluazifop）、グルホシネート（Glufosinate）、ハロスルフロンゴワン（HalosulfuronGowan）、パラコート（Paraquat）、プロピザミド（Propyzamide）、セトキシジム（Sethoxydim）、ブタフェナシル（Butafenacil）、ハロスルフロン（Halosulfuron）インダジフラム（Indaziflam）；果実／野菜殺虫剤：アルジカルブ（Aldicarb）、Bacillus thuringiensis、カルバリル（Carbaryl）、カルボフラン（Carbofuran）、クロルピリホス（Chlorpyrifos）、シペルメトリン（Cypermethrin）、デルタメトリン（Deltamethrin）、ダイアジノン（Diazinon）、マラチオン（Malathion）、アバメクチン（Abamectin）、シフルトリン／ベータ−シフルトリン（Cyfluthrin/beta-cyfluthrin）、エスフェンバレレート（Esfenvalerate）、ラムダ−シハロトリン（Lambda-cyhalothrin）、アセキノシル（Acequinocyl）、ビフェナゼト（Bifenazate）、メトキシフェノジド（Methoxyfenozide）、ノバルロン（Novaluron）、クロマフェノジド（Chromafenozide）、チアクロプリド（Thiacloprid）、ジノテフラン（Dinotefuran）、フルアクリピリム（Fluacrypyrim）、トルフェンピラド（Tolfenpyrad）、クロチアニジン（Clothianidin）、スピロジクロフェン（Spirodiclofen）、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン（Spiromesifen）、スピノサド（Spinosad）、リナキシピル（Rynaxypyr）、シアジピル（Cyazypyr）、スピネトラム（Spinoteram）、トリフルムロン（Triflumuron）、スピロテトラマト（Spirotetramat）、イミダクロプリド（Imidacloprid）、フルベンジアミド（Flubendiamide）、チオジカルブ（Thiodicarb）、メタフルミゾン（Metaflumizone）、スルホクサフロール（Sulfoxaflor）、シフルメトフェン（Cyflumetofen）、シエノメトフェン（Cyanopyrafen）、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、スピノトラム（Spinotoram）、チオジカルブ、フロニカミド（Flonicamid）、メチオカルブ（Methiocarb）、エマメクチン−ベンゾエート（Emamectin-benzoate）、インドキサカルブ（Indoxacarb）、ホスチアゼート（Fozthiazate）、フェナミホス（Fenamiphos）、カズサホス（Cadusaphos）、ピリプロキシフェン（Pyriproxifen）、酸化フェンブタスズ（Fenbutatin-oxid）、ヘキシチアゾクス（Hexthiazox）、メソミル（Methomyl）、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオレチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン；果実／野菜抗真菌剤：カルベンダジム（Carbendazim）、クロロタロニル（Chlorothalonil）、ＥＢＤＣ、スルホール（Sulphur）、チオファネート−メチル（Thiophanate-methyl）、アゾキシストロビン（Azoxystrobin）、シモキサニル（Cymoxanil）、フルアジナム（Fluazinam）、ホセチル（Fosetyl）、イプロジオン（Iprodione）、クレソキシム−メチル（Kresoxim-methyl）、メタラキシル／メフェノキサム（Metalaxyl/mefenoxam）、トリフロキシストロビン（Trifloxystrobin）、エタボキサム（Ethaboxam）、イプロバリカルブ（Iprovalicarb）、トリフロキシストロビン、フェンヘキサミド（Fenhexamid）、フマル酸オキシポコナゾール（Oxpoconazolefumarate）、シアゾファミド（Cyazofamid）、フェンアミドン（Fenamidone）、ゾキサミド（Zoxamide）、ピクオキシストロビン（Picoxystrobin）、ピラクロストロビン（Pyraclostrobin）、シフルフェナミド（Cyflufenamid）、ボスカリド（Boscalid）；穀類除草剤：イソプロチュロン（Isoproturon）、ブロモキシニル、イオキシニル（Ioxynil）、フェノキシ類、クロルスルフロン（Chlorsulfuron）、クロジナホップ（Clodinafop）、ジクロホップ（Diclofop）、ジフルフェニカン（Diflufenican）、フェノキサプロップ（Fenoxaprop）、フロラスラム（Florasulam）、フルロキシピル（Fluroxypyr）、メツルフロン（Metsulfuron）、トリアスルフロン（Triasulfuron）、フルカルバゾン（Flucarbazone）、ヨードスルフロン（Iodosulfuron）、プロポキシカルバゾン（Propoxycarbazone）、ピコリナフェン（Picolinafen）、メソスルフロン（Mesosulfuron）、ベフルフタミド（Beflubutamid）、ピノキサデン（Pinoxaden）、アミドフスルフロン（Amidosulfuron）、チフェンスルフロン（Thifensulfuron）、トリベヌロン（Tribenuron）、フルピルスルフロン（Flupyrsulfuron）、スルホスルフロン（Sulfosulfuron）、ピラスルホトール（Pyrasulfotole）、ピロックススラム（Pyroxsulam）、フルフェナセット（Flufenacet）、トラルコキシジム（Tralkoxydim）、ピロキサスルホン（Pyroxasulfon）；穀類抗真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、アゾキシストロビン、シプロコナゾール（Cyproconazole）、シプロジニル（Cyprodinil）、フェンプロピモルフ（Fenpropimorph）、エポキシコナゾール（Epoxiconazole）、クレソキシム−メチル、キノキシフェン（Quinoxyfen）、テブコナゾール（Tebuconazole）、トリフロキシストロビン、シメコナゾール（Simeconazole）、ピクオキシストロビン、ピラクロストロビン、ジモキシストラビン（Dimoxystrobin）、プロチオコナゾール（Prothioconazole）、フロキサストロビン（Fluoxastrobin）；穀類殺虫剤：ジメトエート（Dimethoate）、ラムダ−シハロトリン（Lambda-cyhalthrin）、デルタメトリン、アルファ−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン（Bifenthrin）、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド（Acetamiprid）、ジノテフラン（Dinetofuran）、クロルピリホス（Clorphyriphos）、メタミドホス（Metamidophos）、オキシデメトン−メチル（Oxidemethon-methyl）、ピリミカルブ（Pirimicarb）、メチオカルブ；トウモロコシ除草剤：アトラジン、アラクロール（Alachlor）、ブロモキシニル、アセトクロール（Acetochlor）、ジカンバ（Dicamba）、クロピラリド（Clopyralid）、（Ｓ−）ジメテナミド（Dimethenamid）、グルホシネート、グリホサート、イソキサフルトール（Isoxaflutole）、（Ｓ−）メトラクロル（Metolachlor）、メソトリオン（Mesotrione）、ニコスルフロン（Nicosulfuron）、プリミスルフロン（Primisulfuron）、リムスルフロン（Rimsulfuron）、スルコトリオン（Sulcotrione）、フォラムスルフロン（Foramsulfuron）、トプラメゾン（Topramezone）、テンボトリオン（Tembotrione）、サフルフェナシル（Saflufenacil）、チエンカルバゾン（Thiencarbazone）、フルフェナセット、ピロキサスルホン；トウモロコシ殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル（Fipronil）、イミダクロプリド、ラムダ−シハロトリン、テフルトリン（Tefluthrin）、テルブホス（Ｔｅｒｂｕｆｏｓ）、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン（Lufenuron）、トリフルムロン（Triflumoron）、テフルトリン、テブプリムホス（Tebupirimphos）、エチプロル（Ethiprole）、シアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン、アベルメクチン（Avermectin）、メチオカルブ、スピロジクロフェン、スピロテトラマト；トウモロコシ抗真菌剤：フェニトロパン（Fenitropan）、チウラム（Thiram）、プロチオコナゾール、テブコナゾール、トリフロキシストロビン；イネ除草剤：ブタクロール（Butachlor）、プロパニル（Propanil）、アジムスルフロン（Azimsulfuron）、ベンスルフロン（Bensulfuron）、シハロホップ（Cyhalofop）、ダイムロン（Daimuron）、フェントラザミド（Fentrazamide）、イマゾスルフロン（Imazosulfuron）、メフェナセット（Mefenacet）、オキサジクロメホン（Oxaziclomefone）、ピラゾスルフロン（Pyrazosulfuron）、ピリブチカルブ（Pyributicarb）、キンクロラック（Quinclorac）、チオベンカルブ（Thiobencarb）、インダノファン（Indanofan）、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン（Halosulfuron）、オキサジクロメホン、ベンゾビシクロン（Benzobicyclon）、ピリフタリド（Pyriftalid）、ペノキススラム（Penoxsulam）、ビスピリバック（Bispyribac）、オキサジアルキル（Oxadiargyl）、エトキシスルフロン（Ethoxysulfuron）、プレチラクロール（Pretilachlor）、メソトリオン、テフリルトリオン（Tefuryltrione）、オキサジアゾン（Oxadiazone）、フェノキサプロップ、ピリミスルファン（Pyrimisulfan）；イネ殺虫剤：ダイアジノン、フェニトロチオン（Fenitrothion）、フェノブカルブ（Fenobucarb）、モノクロトホス（Monocrotophos）、ベンフラカルブ（Benfuracarb）、ブプロフェジン（Buprofezin）、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ（Isoprocarb）、チアクロプリド、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、エチプロル、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン−ベンゾエート、シペルメトリン、クロルピリホス（Chlorpyriphos）、カルタップ（Cartap）、メタミドホス（Methamidophos）、エトフェンプロックス（Etofenprox）、トリアゾホス（Triazophos）、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオレチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、カルボフラン、ベンフラカルブ；イネ抗真菌剤：チオファネート−メチル、アゾキシストロビン、カルプロパミド（Carpropamid）、エジフェンホス（Edifenphos）、フェリムゾン（Ferimzone）、イプロベンホス（Iprobenfos）、イソプロチオラン（Isoprothiolane）、ペンシクロン（Pencycuron）、プロベナゾール（Probenazole）、ピロキロン（Pyroquilon）、トリシクラゾール（Tricyclazole）、トリフロキシストロビン、ジクロシメット（Diclocymet）、フェノキサニル（Fenoxanil）、シメコナゾール、チアジニル（Tiadinil）；ワタ除草剤：ジウロン、フルオメツロン（Fluometuron）、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン（Oxyfluorfen）、プロメトリン（Prometryn）、トリフルラリン、カルフェントラゾン（Carfentrazone）、クレトジム（Clethodim）、フルアジホップ−ブチル、グリホサート、ノルフルラゾン（Norflurazon）、ペンディメタリン（Pendimethalin）、ピリチオバックナトリウム（Pyrithiobac-sodium）、トリキシスルフロン（Trifloxysulfuron）、テプラロキシジム（Tepraloxydim）、グルホシネート、フルミオキサジン（Flumioxazin）、チジアズロン（Thidiazuron）；ワタ殺虫剤：アセフェート（Acephate）、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、マラチオン、モノクロトホス、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチンベンゾエート、イミダクロプリド、インドキサカルブ、ラムダ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル（Pyridalyl）、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、ベータ−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジノテフラン、フルベンジアミド、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、ガンマシハロトリン、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオレチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホクサフロール、プロフェノホス（Profenophos）、トリアゾホス（Thriazophos）、エンドスルファン（Endosulfan）；ワタ抗真菌剤：エ
トリジアゾール（Etridiazole）、メタラキシル、キントゼン（Quintozene）；ダイズ除草剤：アラクロール、ベンタゾン（Bentazone）、トリフルラリン、クロリムロン−エチル（Chlorimuron-Ethyl）、クロランスラム−メチル（Cloransulam-Methyl）、フェノキサプロップ、フォメサフェン（Fomesafen）、フルアジホップ、グリホサート、イマザモックス（Imazamox）、イマザキン（Imazaquin）、イマゼタピル（Imazethapyr）、（Ｓ−）メトラクロル、メトリブジン、ペンディメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート；ダイズ殺虫剤：ラムダ−シハロトリン、メソミル、パラチオン（Parathion）、チオカルブ（Thiocarb）、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン−ベンゾエート、フィプロニル、エチプロル、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマ及びラムダシハロトリン、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオレチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン（Spinodiclofen）、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルトリン；ダイズ抗真菌剤：アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアホール（Flutriafol）、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール（Tetraconazole）；テンサイ除草剤：クロリダゾン（Chloridazon）、デスメジファム（Desmedipham）、エトフメセート（Ethofumesate）、フェンメジファム（Phenmedipham）、トリアレート（Triallate）、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル（Lenacil）、メタミトロン（Metamitron）、キンメラック（Quinmerac）、シクロキシジム（Cycloxydim）、トリフルスルフロン（Triflusulfuron）、テプラロキシジム、キザロホップ（Quizalofop）；テンサイ殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマ／ラムダシハロトリン、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２、２−ジフルオレチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、シアジピル（Cyaxypyr）、フィプロニル、カルボフラン；カノーラ除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロル（Metazachlor）、トリフルラリンエタメツルフロン（TrifluralinEthametsulfuron）、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；カノーラ抗真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、フルジオキソニル（Fludioxonil）、イプロジオン、プロクロラズ（Prochloraz）、ビンクロゾリン（Vinclozolin）；カノーラ殺虫剤：カルボフラン、有機リン剤（Organophosphates）、ピレスロイド（Pyrethroids）、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジノテフラン、β−シフルトリン、ガンマ及びラムダシハロトリン、タウ−フルバリレート（tau-Fluvaleriate）、エチプロル、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、４−［［（６−クロロピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオレチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、が挙げられる。

「害虫」とは、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニ、などを含むがこれらに限定されない。害虫は、鞘翅目（Coleoptera）、双翅目（Diptera）、膜翅目（Hymenoptera）、鱗翅目（Lepidoptera）、ハジラミ（Mallophaga）、同翅類（Homoptera）、半翅目（Hemiptera）、直翅目（Orthroptera）、総翅目（Thysanoptera）、ハサミムシ目（Dermaptera）、シロアリ目（Isoptera）、シラミ目（Anoplura）、ノミ目（Siphonaptera）、毛翅目（Trichoptera）などの目、特に鞘翅目、鱗翅目、及び双翅目から選択された昆虫を含む。

鞘翅目は、Adephaga及びPolyphaga亜目を含む。Adephaga亜目は、Caraboidea及びGyrinoidea上科を含み、Polyphaga亜目はHydrophiloidea、Staphylinoidea、Cantharoidea、Cleroidea、Elateroidea、Dascilloidea、Dryopoidea、Byrrhoidea、Cucujoidea、Meloidea、Mordelloidea、Tenebrionoidea、Bostrichoidea、Scarabaeoidea、Cerambycoidea、Chrysomeloidea、及びCurculionoidea上科を含む。Caraboidea上科は、Cicindelidae、Carabidae、及びDytiscidae科を含む。Gyrinoidea上科は、Gyrinidae科を含む。Hydrophiloidea上科は、Hydrophilidae科を含む。Staphylinoidea上科は、Silphidae及びStaphylinidae科を含む。Cantharoidea上科は、Cantharidae及びLampyridae科を含む。Cleroidea上科は、Cleridae及びDermestidae科を含む。Elateroidea上科は、Elateridae及びBuprestidae科を含む。Cucujoidea上科は、Coccinellidae科を含む。Meloidea上科は、Meloidae科を含む。Tenebrionoidea上科は、Tenebrionidae科を含む。Scarabaeoidea上科は、Passalidae及びScarabaeidae科を含む。Cerambycoidea上科は、Cerambycidae科を含む。Chrysomeloidea上科は、Chrysomelidae科を含む。Curculionoidea上科は、Curculionidae及びScolytidae科を含む。

双翅目は、Nematocera、Brachycera、及びCyclorrhapha亜目を含む。Nematocera亜目は、Tipulidae、Psychodidae、Culicidae、Ceratopogonidae、Chironomidae、Simuliidae、Bibionidae、及びCecidomyiidae科を含む。Brachycera亜目は、Stratiomyidae、Tabanidae、Therevidae、Asilidae、Mydidae、Bombyliidae、及びDolichopodidae科を含む。Cyclorrhapha亜目は、Aschiza及びAschiza門を含む。Aschiza門は、Phoridae、Syrphidae、及びConopidae科を含む。Aschiza門は、Acalyptratae及びCalyptratae節を含む。Acalyptratae節は、Otitidae、Tephritidae、Agromyzidae、及びDrosophilidae科を含む。Calyptratae節は、Hippoboscidae、Oestridae、Tachinidae、Anthomyiidae、Muscidae、Calliphoridae、及びSarcophagidae科を含む。

鱗翅目は、Papilionidae、Pieridae、Lycaenidae、Nymphalidae、Danaidae）、Satyridae、Hesperiidae、Sphingidae、Saturniidae、Geometridae、Arctiidae、Noctuidae、Lymantriidae、Sesiidae、及びTineidae科を含む。

線虫は、根瘤、シスト、及び、病原性線虫などの寄生線虫を含み、Heterodera spp、Meloidogyne spp、及びGlobodera sppを含み；特にシスト線虫のメンバー（これらに限定されない）であって以下を含む、Heterodera glycines（ダイズシスト線虫）；Heterodera schachtii（ビートシスト線虫）；Heterodera avenae（ムギシスト線虫）；並びにGlobodera rostochiensis及びGlobodera pailida（ジャガイモシスト線虫）。病原性線虫は、Pratylenchus sppを含む。

主要作物に対する本発明の昆虫害虫は、以下を含む：トウモロコシ： Ostrinia nubilalis、ヨーロッパアワノメイガ（European corn borer）；Agrotis ipsilon）、タマナヤガ（black cutworm）；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ（corn earworm）；Spodoptera frugiperda、ヨトウガ（fall armyworm）；Diatraea grandiosella、南西部アワノメイガ（southwestern corn borer）；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ（lesser cornstalk borer）；Diatraea saccharalis、シュガーケーンボーラー(surgarcane borer）；Diabrotica virgifera、ウエスタンコーンルートワーム（western corn rootworm）；Diabrotica longicornis barberi、ノーザンコーンルートワーム（northern corn rootworm）；Diabroti caundecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム（southern corn rootworm）；Melanotus spp.、ハリガネムシ（wireworms）；Cyclocephala borealis、ノーザンマスクドコガネムシ（northern masked chafer）（ホワイトグラブ（white grub））；Cyclocephala immaculata、サザンマスクドコガネムシ（southern masked chafer）（ホワイトグラブ（white grub））；Popillia japonica、マメコガネ（Japanese beetle）；Chaetocnema pulicaria、トウモロコシノミハムシ（corn flea beetle）；Sphenophorus maidis、トウモロコシゾウムシ（maize billbug）；Rhopalosiphum maidis、トウモロコシ葉アブラムシ（corn leaf aphid）；Anuraphis maidiradicis、トウモロコシ根アブラムシ（corn root aphid）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ（chinch bug）；Melanoplus femurrubrum、アカアシバッタ（redlegged grasshopper）；Melanoplus sanguinipes、移動性バッタ（migratory grasshopper）；Hylemya platura、シードコーンマゴット（seedcorn maggot）；Agromyza parvicornis、トウモロコシ斑点ハモグリバエ（cornblot leaf miner）；Anaphothrips obscrurus、アザミウマ（grass thrips）；Solenopsis milesta、盗賊アリ（thief ant）；Tetranychus urticae、ナミハダニ（twospotted spider mite）；ソルガム：Chilo partellus、ソルガムボーラー（sorghum borer）；Spodoptera frugiperda、ヨトウガ；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ（Fall armyworm）；Feltia subterranea、グラニュレートカットワーム（granulate cutworm）；Phyllophaga crinita、ホワイトグラブ（white grub）；Eleodes、Conoderus、及びAeolus spp.、ハリガネムシ；Oulema melanopus、穀類のハムシ（cereal leaf beetle）；Chaetocnema pulicaria、トウモロコシノミハムシ；Sphenophorus maidis、トウモロコシゾウムシ；Rhopalosiphum maidis；トウモロコシ葉アブラムシ；Sipha flava、イエローシュガーケーンアブラムシ（yellow sugarcane aphid）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ；Contarinia sorghicola、ソルガムミッジ（sorghum midge）；Tetranychus cinnabarinus、ニセナミハダニ（carmine spider mite）；Tetranychus urticae、ナミハダニ；コムギ： Pseudaletia unipunctata、アーミーワーム（army worm）；Spodoptera frugiperda、ヨトウガ；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ；Agrotis orthogonia、ウェスタンカットワーム（western cutworm）；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ；Oulema melanopus、穀類のハムシ；Hypera punctata、クローバーゾウムシ（clover leaf weevil）；Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム；ロシアコムギアブラムシ（Russian wheat aphid）；Schizaphis graminum、ムギミドリアブラムシ（greenbug）；Macrosiphum avenae、イングリッシュグレインアフィド（English grain aphid）；Melanoplus femurrubrum、アカアシバッタ；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー（differential grasshopper）；Melanoplus sanguinipes、移動性バッタ；マイエチオラ・デストラクター（Mayetiola destructor）、ヘシアンバエ（Hessian fly）；Sitodiplosis mosellana、ムギアカタマバエ（wheat midge）；Meromyza americana、ムギキモグリバエ（wheat stem maggot）；Hylemya coarctata、コムギハナアブ（wheat bulb fly）；Frankliniella fusca、タバコアザミウマ（tobacco thrips）；Cephuscinctus、ムギクキハバチ（wheat stem sawfly）；Aceria tulipae、チューリップサビダニ（wheat curl mite）；ヒマワリ： Suleima helianthana、サンフラワーバッドモス（sunflower bud moth）；Homoeosoma electellum、サンフラワーモス（sunflowermoth）；zygogramma exclamationis、サンフラワービートル（sunflower beetle）；Bothyrus gibbosus、キャロットビートル（carrot beetle）；Neolasioptera murtfeldtiana、サンフラワーシードミッジ（sunflower seed midge）；ワタ： Heliothis virescens、コットンバッドワーム（cotton budworm）；Helicoverpa zea、コットンボールワーム（cotton bollworm）；Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ（beet armyworm）；Pectinophora gossypiella、ピンクボールワーム（pink bollworm）；Anthonomus grandis、ワタミゾウムシ（boll weevil）；Aphis gossypii、ワタアブラムシ（cotton aphid）；Pseudatomoscelis seriatus、ワタノミハムシ（cotton fleahopper）；Trialeurodes abutilonea、バンデッドウィングド・ホワイトフライ（bandedwinged whitefly）；Lygus lineolaris、ターニシュドプラントバグ（tarnished plant bug）；Melanoplus femurrubrum、アカアシバッタ；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー； Thrips tabaci、タマネギアザミウマ（onion thrips）；Franklinkiella fusca、タバコアザミウマ；Tetranychus cinnabarinus、ニセナミハダニ；Tetranychus urticae、ナミハダニ；イネ： Diatraea saccharalis、シュガーケーンボーラー；Spodoptera frugiperda、ヨトウガHelicoverpa zea、アメリカタバコガ；Colaspis brunnea、ブドウコラスピス；Lissorhoptrus oryzophilus、イネミズゾウムシ（rice water weevil）；Sitophilus oryzae、イネゾウムシ（rice weevil）；Nephotettix nigropictus、クロスジツマグロヨコバイ（rice leafhopper）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ；Acrosternum hilare、アオカメムシ（green stink bug）；ダイズ：Pseudoplusia includens、ダイズシャクトリムシ（soybean looper）；Anticarsia gemmatalis、ハッショウマメケムシ（velvetbean caterpillar）；Plathypena scabra、グリーンクローバーワーム（green cloverworm）；Ostrinia nubilalis、ヨーロッパアワノメイガ；Agrotis ipsilon、タマヤナガ；Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ；Heliothis virescens、コットンバッドワーム；Helicoverpa zea、アメリカタバコガ；Epilachna varivestis、インゲンテントウ（Mexican bean beetle）；Myzus persicae、モモアカアブラムシ（green peach aphid）； Empoasca fabae、（potato leafhopper）；Acrosternum hilare、アオカメムシ；Melanoplus femurrubrum、アカアシバッタ；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー；Hylemya platura、タネバエ； Sericothrips variabilis、ダイズアザミウマ（soybean thrips）；Thrips tabaci、タマネギアザミウマ； Tetranychus turkestani、イチゴハダニ（strawberry spider mite）；Tetranychus urticae、ナミハダニ；オオムギ：Ostrinia nubilalis、ヨーロッパアワノメイガ；Agrotis ipsilon、タマヤナガ；Schizaphis graminum、ムギミドリアブラムシ；Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ；Acrosternum hilare、アオカメムシ；Euschistus servus、チャイロカメムシ（brown stink bug）；Delia platura、タネバエ；Mayetiola destructor、ヘシアンバエ；Petrobia latens、チャイロコムギダニ（brown wheat mite）；ナタネ： Brevicoryne brassicae、ダイコンアブラムシ（cabbage aphid）；Phyllotreta cruciferae、ノミハムシ；Mamestra configurata、バーサアーミーワーム（Bertha armyworm）；Plutella xylostella、コナガ；Delia ssp.、ネクイムシ（Root maggots）。

植物の収量を増加させる方法
植物の収量を増加させる方法が提供される。該方法は、本明細書において開示された殺虫性ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現している植物又は植物細胞を提供する工程、及び前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫によって感染された用地にその植物又は種子を生育させる工程を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは鱗翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目、又は線虫害虫、に対する殺虫活性を有し、前記用地は鱗翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目、又は線虫害虫により感染される。

本明細書において使用される場合、植物の「収量」とは、植物によって生産されたバイオマスの質及び／又は量を意味する。「バイオマス」とは、任意の測定された植物産物を意図する。バイオマス生産の増加とは、測定された植物産物の生産量における任意の改善である。増加する植物生産量は、複数の商業的応用を有する。例えば、増加する植物葉バイオマスは、人類又は動物が消費する葉野菜の生産量を増加させる可能性がある。加えて、増加する葉バイオマスを、植物由来の医薬又は工業製品の生産を増加させるために使用することができる。生産量の増加は、殺虫性配列を発現していない植物と比較して、少なくとも１％の増加、少なくとも３％の増加、少なくとも５％の増加、少なくとも１０％の増加、少なくとも２０％の増加、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも１００％又はそれを超える生産量の増加を含むがこれらに限定されない、任意の統計学的に有意な増加を含み得る。

特定の方法においては、植物生産量は、本明細書において開示された殺虫性タンパク質を発現している植物の害虫抵抗性の改善の結果として増加する。殺虫性タンパク質の発現は、害虫がその植物を摂取する又は摂食する能力の低下をもたらし、そのために植物生産量が改善される。

以下の実施例は、説明のために提供されるものであり、本発明を限定しない。

実施例
実施例１ 新規遺伝子の同定
以下のような方法を用いて、本明細書において記載した細菌株より、新規の殺虫性遺伝子を同定した：

方法１
・ デルタエンドトキシン遺伝子を典型的に有するプラスミドを含む株からの、染色体外ＤＮＡの調製
・ 大きさによって分散する断片を生成するための、染色体外ＤＮＡの機械的切断
・ 〜２Kbから〜１０Kbの染色体外ＤＮＡ断片のクローニング
・ 染色体外ＤＮＡ〜１５００クローンの増殖
・ クローニングベクター特異的プライマーを用いた１５００クローンの部分的なシークエンシング（末端の読み出し）
・ （その全文を参照により本明細書に組み入れる、米国特許第２００４００１４０９１号に記載されたような）ＭｉＤＡＳ法を介した相同性解析を通じての、推定毒素遺伝子の同定
・ 目的の推定毒素遺伝子の断片を含むクローンの配列解読完了（ウォーキング）

方法２
・ （様々な大きさのプラスミド；ファージ染色体；精製プロトコールによって分離されていないゲノムＤＮＡ断片；その他の解析されていない染色体外分子、のいくつか又はすべての混合物を含む）株からの染色体外ＤＮＡの調製
・ 大きさによって分散する断片を生成するための、染色体外ＤＮＡの機械的又は酵素的切断
・ 断片化ＤＮＡのハイスループットなパイロシークエンシング法によるシークエンシング
・ 相同性及び／又はその他のコンピューター解析を介した推定毒素遺伝子の同定
・ 複数のＰＣＲ又はクローニング法（例えばＴＡＩＬ−ＰＣＲ）のうちの１つを用いた、目的の遺伝子配列解読完了

実施例２ Bacillus thuringiensisからの、ｃｒｙ８との相同性を有する新規殺虫性遺伝子の発見

実施例３ Bacillus thuringiensisからの、新規ｃｒｙ７様殺虫性遺伝子の発見
実施例１において開示された方法を用い、表２に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例４ Bacillus thuringiensisからの新規ｃｒｙ１Ｉホモログの発見
実施例１において開示された方法を用い、表３に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例５ Bacillus thuringiensisからの新規ｃｒｙ９ホモログの発見
実施例１において開示された方法を用い、表４に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例６ Bacillus thuringiensisからの新規ｃｒｙ４ホモログの発見
実施例１において開示された方法を用い、表５に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例７ Bacillus thuringiensisからの新規ｃｒｙＣ５３／ｃｒｙＣ５３様配列の発見
実施例１において開示された方法を用い、表６に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。ａｘｍｉ−１５３とａｘｍｉ−１５４の両方をコードする完全長配列を配列番号４８に示した。ａｘｍｉ−１５７とａｘｍｉ−１５８の両方をコードする完全長配列を配列番号４９に示した。

実施例８ Bacillus thuringiensisからの新規ｃｒｙ２１／ｃｒｙ１２様配列の発見
実施例１において開示された方法を用い、表７に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例９ Bacillus thuringiensisからの新規ＶＩＰ様又はバイナリー様配列の発見
実施例１において開示された方法を用い、表８に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例１０ Bacillus thuringiensisからの新規ＭＴＸ様配列の発見
実施例１において開示された方法を用い、表９に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例１１ Bacillus thuringiensisからの新規毒素配列の発見
実施例１において開示された方法を用い、表１０に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例１２ Bacillus thuringiensisからの新規毒素配列の発見
実施例１において開示された方法を用い、表１１に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例１３ Bacillus thuringiensisからの新規毒素遺伝子配列の発見
実施例１において開示された方法を用い、表１２に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例１４ Bacillus thuringiensisからの新規毒素遺伝子配列の発見
実施例１において開示された方法を用い、表１３に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝子を同定した。

実施例１５ バチルスにおける発現
本明細書において開示された毒素遺伝子をｐＡＸ９８０からＰＣＲによって増幅し、そしてＰＣＲ産物を当該分野において周知の方法により、バチルス発現ベクターｐＡＸ９１６、又は別の好適なベクターにクローニングした。ａｘｍｉ遺伝子を有するベクターを含む得られたバチルス株を、ＣＹＳ培地（１０ｇ／ｌバクト−カシトン；３ｇ／ｌ酵母エキス；６ｇ／ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４；１４ｇ／ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４；０．５mM ＭｇＳＯ_４；０．０５mM ＭｎＣｌ_２；０．０５mM ＦｅＳＯ_４）などの標準的な成長培地上で、顕微鏡的試験によって胞子形成が明かになるまで培養した。試料を調製し、バイオアッセイにおいて活性について試験した。

実施例１６ 合成配列の構築
本発明の１つの態様においては、合成毒素配列を生成した。これら合成配列は、親毒素配列に関連した変化したＤＮＡ配列を有し、及び対応する親毒素タンパク質と同一線上のタンパク質をコードするが、多くのデルタエンドトキシンタンパク質に存在するＣ末端「クリスタルドメイン」を欠いた。本明細書において開示された新規の毒素に対応する合成配列を表１４に示す。

本発明の別の態様において、得られたペプチドが、小胞体又はアポプラストなどの植物小器官を標的とするように、改変した合成遺伝子を設計する。融合タンパク質を植物小器官を標的として送ることが公知であるペプチド配列は、当該分野において公知である。例えば、シロバナルピナス（Lupinus albus）由来の酸性ホスファターゼ遺伝子のＮ末端領域（Genebank ID GI：14276838；Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606）は、異種タンパク質の小胞体ターゲティングをもたらすことが当該分野において公知である。得られた融合タンパク質が、Ｃ末端に、Ｎ末端−リジン−アスパラギン酸−グルタミン酸−ロイシン（すなわち「ＫＤＥＬ」モチーフペプチド（配列番号２０８）を含む小胞体保持配列をもまた含む場合には、融合タンパク質は小胞体に輸送されるだろう。融合タンパク質がＣ末端における小胞体ターゲティング配列を欠損する場合、タンパク質は小胞体に輸送されるが、最終的にはアポプラスト内に隔離されるだろう。

実施例１７ Ａｘｍｉ１５６のバイオアッセイ
遺伝子発現及び精製
Ａｘｍｉ１５６の毒素ドメインをコードするＤＮＡ領域を、E. coli発現ベクターｐＭＡＬ−Ｃ４ｘに、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードしているｍａｌＥ遺伝子の後ろで、別個にクローニングした。これらのインフレーム融合は、Ｅ．ｃｏｌｉでのＭＢＰ−Ａｘｍｉ融合タンパク質の発現を生じた。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためには、ＢＬ２１^＊ＤＥ３を個々のプラスミドを用いて形質転換した。単一のコロニーを、カルベニシリン及びグルコースを含むＬＢ中に播種し、そして一晩３７℃で生育させた。翌日、１％の一晩培養に新しい培地を加え、そして３７℃で対数期まで生育させた。その後培養を、０．３mM ＩＰＴＧ、２０℃で一晩誘導した。それぞれの細胞ペレットを、２００mM ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴ、プロテアーゼインヒビターを含む２０mM Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．４に懸濁し、そして超音波破砕した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析により、融合タンパク質の発現を確認した。

ＭＢＰ−ａｘｍｉ融合タンパク質をアフィニティ精製するために、全無細胞抽出液を、ＦＰＬＣに結合したアミロースカラムに流した。１０mM マルトース溶液を用いて、結合した融合タンパク質を樹脂から溶出した。精製した融合タンパク質を因子Ｘａ又はトリプシンのいずれかを用いて分解し、Ａｘｍｉタンパク質からアミノ末端ＭＢＰタグを除去した。タンパク質の分解及び可溶性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて決定した。

昆虫バイオアッセイ
分解したタンパク質を、適当な対照を用いた昆虫アッセイにおいて試験した。５日目のプレートの測定は、因子Ｘａ及びトリプシンを用いて分解した融合タンパク質がコナガ及びサウスウエスタンコーンボーラ―（Southwestern cornborer）害虫に対する殺虫活性を有したことを示した。

実施例１８ 半翅目、リグス・ヘスペルス（Lygus hesperus）におけるＡｘｍｉ−１７１の活性
植物害虫種を制御するＡｘｍｉ−１７１の能力を試験するために、目的のタンパク質と高発現で、高可溶性タンパク質との間のＮ末端融合を創造することにより、高レベルの可溶性タンパク質を得るように設計したベクター中に、オープンリーディングフレームをクローニングした。Ａｘｍｉ−１７１を、２つの異なる構築物として発現ベクターｐＭａｌ−Ｃ４ｘ（New England Biolabs）中にクローニングした。第一の構築物（ａｍｘｉ−１７１．１、配列番号２０５をコードする配列番号２０４に対応する）は高レベルの発現を生じず、その後追求しなかった。内部のメチオニン開始コドンを構成するオープンリーディングフレームの発現は（配列番号６９をコードする配列番号２０に対応する）、より短いオープンリーディングフレームをマルトース結合タンパク質にインフレームで融合させた、ｐＡＸ５５５７と命名した構築物を生じた。構築物のヌクレオチド配列を配列番号２０６に示し、及びコードされる融合タンパク質を配列番号２０７に示す。この構築物を用いて、Ａｘｍｉ１７１．２の発現を製造業者の説明の通りに誘導し、そして、当該分野において公知の通りに、融合タンパク質を精製した。

融合体を分解し、精製した融合タンパク質をプロテアーゼ（当該分野において知られる、因子Ｘａ）で処理し、Ａｘｍｉ１７１．２を遊離させた。興味深いことに、この分解反応の後にはＡｘｍｉ１７１．２が沈殿することが見出された。沈殿したタンパク質を水中に懸濁し、そしてリグス・ヘスペルスを用いたバイオアッセイにおいて試験した。表１５に示したように、リグス・ヘスペルスに対する活性が観察された。

実施例１９ 半翅目、ダイズアブラムシ（エイフィス・グリシンズ、Aphis glycines）におけるＡｘｍｉ１７１の活性
Ａｘｍｉ１７１の害虫を制御する能力をさらに試験するために、分解したｐｍａｌ−Ａｘｍｉ−１７１．２タンパク質をダイズアブラムシ（エイフィス・グリシンズ）における多重容器形式のバイオアッセイで試験した。再懸濁したＡｘｍｉ１７１．２タンパク質（上述したように因子Ｘａを用いて分解した）、その後加熱（１００℃で３０分）した再懸濁１７１．２タンパク質、又は水対照のいずれかを含む多重容器を準備した。複数の動物をそれぞれの容器中の試料に曝露し、そして、それぞれの容器における１００％死亡率を伴う容器の数を、アッセイの終わりに記録した。容器のどれもが１００％死亡率を示さなかった場合に、その試料のスコアを０として記録した。容器の０〜２５％が１００％死亡率を示した場合に、その試料のスコアを「１」として記録し、容器の２５〜５０％が１００％死亡率を示した場合に、その試料のスコアを「２」として記録し、容器の５０〜７５％が１００％死亡率を示した場合に、その試料のスコアを「３」として記録し、そして、容器の１００％が１００％死亡率を示した場合に、その試料のスコアを「４」として記録した。水のみ対照、並びに試料に加える前に加熱した試料と比較して、この害虫に対する活性が観察された。

その後、Ａｘｍｉ１７１．２オープンリーディングフレームをＨｉｓ−ｔａｇ発現ベクター（ｐＲＳＦ−１ｂ；Novagen）中にクローニングし、そしてタンパク質発現させ、Ｈｉｓｔａｇを用いて精製し（当該分野において公知の通りに）、クローンｐＡＸ５０６８を得た。可溶性の、精製したＡｘｍｉ１７１．２タンパク質を得た。バイオアッセイを行う前に、１つの試料を１００℃で３０分間加熱した。多重容器形式におけるエイフィス・グリシンズを用いたアッセイは、対照と比較した、Ａｘｍｉ１７１．２試料の活性を示した。

加えて、Ｎ末端タグ又は融合を欠損するＡＸＭＩ１７１．２タンパク質を発現しているE. coli発現クローンを準備し、ｐＡＸ５０６９として表した。可溶性Ａｘｍｉ１７１．２タンパク質を含む濃縮した抽出物を調製し、エイフィス・グリシンズにおける活性について同様にアッセイした。

実施例２０ 殺虫活性についてのさらなるアッセイ
害虫への農薬として作用する殺虫性タンパク質の能力は、しばしば数多くの方法において評価される。当該分野において公知の１つの方法は、摂食アッセイの実施である。この摂食アッセイにおいては、害虫を、試験する化合物又は対照試料のいずれかを含む試料に曝露する。しばしばこれは、試験する材料又はそれら材料の好適な希釈物を、人工飼料などの、害虫が摂取するであろう材料上に置くことにより、行われる。試験する材料は、液体、固体、又はスラリーであってもよい。試験する材料を、表面に置き、その後乾燥させてもよい。あるいは、試験する材料を、溶解した飼料に混合し、その後アッセイチャンバー中に入れてもよい。アッセイチャンバーは例えば、カップ、皿、マイクロタイタープレートのウェルであってもよい。

吸引害虫（例えばアブラムシ）についてのアッセイは、仕切り（理想的には、試験材料の摂取を可能にするために、吸汁昆虫の一部分である吸汁口によって、一部分に穴をあけることができる）によって昆虫から試験する材料を分離する工程を含んでもよい。しばしば試験材料は、試験化合物の摂取を促進するための、ショ糖などの摂食刺激剤とともに混合される。

その他の型のアッセイは、害虫の口器又は消化管への試験化合物のマイクロインジェクション、並びにトランスジェニック植物の開発とその後、そのトランスジェニック植物を摂食する害虫の能力を試験することを含む可能性がある。植物試験は、通常消費される植物の一部分の単離、例えば葉に付着した小さいかご、又は昆虫を含むかご中の全植物の単離を含んでいてもよい。

害虫をアッセイするためのその他の方法及び取り組みは当該分野において公知であり、そして、例えばRobertson, J. L. & H. K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC, Boca Raton, FLにおいて見ることができる。あるいは、アッセイは一般的に、雑誌「Arthropod Management Tests」及び「Journal of Economic Entomology」、又はEntomological Society of America（ＥＳＡ）のメンバーによる議論によって、記載される。

実施例２１ 本発明の毒素遺伝子の、植物発現のためのベクター化
本発明の遺伝子のそれぞれのコード領域を、植物において発現させるために、それぞれ独立して適したプロモーター及びターミネーター配列と結合させた。それらの配列は、当該分野において周知であり、そして、単子葉における発現のためのイネアクチンプロモーター又はトウモロコシユビキチンプロモーター、双子葉における発現のためのシロイヌナズナ（Arabidopsis）ＵＢＱ３プロモーター又はＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、及びｎｏｓ又はＰｉｎＩＩターミネーターを含んでいてもよい。プロモーター-遺伝子-ターミネーター構築物を生産し、確認する技術もまた、当該分野において周知である。

実施例２２ Agrobacteriumを介した形質転換による、本発明の遺伝子の植物細胞中への形質転換
受粉後８〜１２日目に穂を回収した。さやから胚を単離し、０．８〜１．５mmの大きさのそれら胚を形質転換に用いた。胚盤を上にして好適なインキュベーション培地上に置き、暗所、２５℃で一晩インキュベーションした。しかしながら、胚を一晩インキュベーションすること自体は必要ではなかった。Ｔｉプラスミドを介した移行のための適したベクターを含むAgrobacterium株に、胚を５〜１０分間接触させ、その後、共存培養培地上に３日間プレーティングした（２５℃、暗所）。共存培養後、外稙片を５日間、回復期間用培地に移した（２５℃、暗所）。用いる特定の選抜の性質及び特徴に応じて、外植片を選択培地上で８週までインキュベーションした。選抜期間の後、得られたカルスを、成熟した不定胚の形成が観察されるまで胚成熟培地に移した。得られた成熟した不定胚をその後低光下に置き、当該分野において公知のように、再生過程を開始した。得られた茎を発根培地上で発根させ、得られた植物を苗木用の鉢に移して、トランスジェニック植物として増殖させた。

実施例２３ 本発明の毒素遺伝子を用いたトウモロコシ細胞の形質転換
受粉後８〜１２日目に、トウモロコシの穂を回収した。穂から胚を単離し、０．８〜１．５mmの大きさのそれら胚を形質転換に用いた。胚盤を上にして、ＤＮ６２Ａ５Ｓ培地（３．９８ｇ／Ｌ Ｎ６塩；１mL／Ｌ（１０００ｘＳｔｏｃｋの）Ｎ６ビタミン；８００mg／Ｌ Ｌ−アスパラギン；１００mg／Ｌ ミオ‐イノシトール；１．４ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン；１００mg／Ｌ カザミノ酸（Casamino acid）；５０ｇ／Ｌ ショ糖；１mL／Ｌ（１mg／ｍＬストックの）２，４−Ｄ）などの好適なインキュベーション培地上に置き、暗所、２５℃で一晩インキュベーションした。

得られた外稙片を四角い網に移し（１プレートあたり３０〜４０）、浸透培地上に３０〜４５分間移し、その後、ビーミングプレートに移した（例えば、国際公開番号ＷＯ０１３８５１４号及び米国特許第５，２４０，８４２号を参照）。

国際公開番号ＷＯ０１３８５１４号に本質的に記載された条件を用い、エアロゾルビーム加速器により、本発明の遺伝子を植物細胞中で発現するように設計されたＤＮＡ構築物を植物組織中に打ち込んだ。照射した後、胚を浸透培地上で３０分間インキュベーションし、その後インキュベーション培地上に一晩、２５℃、暗所で静置した。照射した外稙片の過度の損傷を避けるため、回復培地に移す前に、それらを少なくとも２４時間インキュベーションした。次に、胚を５日間、２５℃暗所で回復期間用培地に広げ、その後選択培地に移した。用いる特定の選抜の性質及び特徴に応じて、外稙片を選択培地上で最長８週間までインキュベーションした。選抜期間の後、得られたカルスを、成熟した不定胚の形成が観察されるまで胚成熟培地に移した。得られた成熟した不定胚をその後低光下に置き、当該分野において知られるように、再生過程を開始した。得られた茎を発根培地上で発根させ、得られた植物を苗木用の鉢に移して、トランスジェニック植物として増殖させた。

１N ＫＯＨ／１N ＫＣｌを用いて溶液のｐＨをｐＨ５．８に調整し、３ｇ／ＬになるようにGelrite（Sigma）を加え、そしてオートクレーブした。５０℃まで冷却した後、硝酸銀（Phytotechnology Labs）の５mg／ml ストック溶液を、２ml／Ｌ加えた。この方法で約２０枚のプレートが得られた。

明細書において言及したすべての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示している。すべての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の出版物及び特許出願が、特に及び個別に参照することにより組み入れられると示されているのと同様に、参照により本明細書に組み入れる。

前述の発明を、理解を明確にする目的のために幾分詳細に説明および実施例によって記載したが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更及び改変が実施されてもよいことは明白である。

Claims (25)

1. 殺虫活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子であって、ここで前記ヌクレオチド配列が、
   ａ）配列番号５に示されたヌクレオチド配列；及び
   ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
   からなる群より選択される、組換え核酸分子。
2. 前記ヌクレオチド配列がＣ末端クリスタルドメインを欠く、請求項１に記載の組換え核酸分子。
3. 前記配列が配列番号１３１〜１３４、１９７及び１９８のいずれかに示される配列である、請求項２に記載の組換え核酸分子。
4. 前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列を植物細胞中で発現させることができるプロモーターに作動可能に連結される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
5. 請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
6. 異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項５に記載のベクター。
7. 請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
8. 細菌性宿主細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
9. 植物細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
10. 請求項９に記載の宿主細胞を含むトランスジェニック植物。
11. 前記植物が、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びナタネからなる群より選択される、請求項１０に記載のトランスジェニック植物。
12. 請求項１に記載の核酸分子を含むトランスジェニック種子。
13. 殺虫活性を有する組換えポリペプチドであって、
    ａ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
    ｂ）配列番号５によりコードされるポリペプチド、
    からなる群より選択される、組換えポリペプチド。
14. 請求項１３に記載の組換えポリペプチドを含む組成物。
15. 前記組成物が、粉末、塵埃、錠剤、顆粒、スプレー、乳濁液、コロイド、及び溶液からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記組成物が、乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、又は細菌細胞培養の濃縮、により調製される、請求項１４に記載の組成物。
17. 重量にして約１％〜約９９％までの前記ポリペプチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
18. 鱗翅目、鞘翅目、異翅類、線虫、又は双翅目の害虫集団を、殺虫的効果量の請求項１３に記載のポリペプチドに接触させる工程を含む、前記集団の制御方法。
19. 鱗翅目、鞘翅目、異翅類、線虫、又は双翅目害虫を、殺虫的効果量の請求項１３に記載のポリペプチドに接触させる、又は前記害虫に前記ポリペプチドを摂食させる工程を含む、前記害虫の殺虫方法。
20. 殺虫活性を有するポリペプチドの生産方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸分子が発現する条件下において請求項７に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、生産方法。
21. 殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物がそのゲノム中に安定して組み入れられた植物であって、前記ヌクレオチド配列が、
    ａ）配列番号５に示されたヌクレオチド配列；及び
    ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    からなる群より選択され、
    ここで前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中でコード配列の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結される、植物。
22. 前記植物が植物細胞である、請求項２１に記載の植物。
23. 殺虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、植物又はその細胞中で発現させる工程を含む、害虫から植物を保護する方法であって、前記ヌクレオチド配列が、
    ａ）配列番号５に示されたヌクレオチド配列；及び
    ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    からなる群より選択される、方法。
24. 前記植物が、鱗翅目、鞘翅目、異翅類、線虫、又は双翅目の害虫に対する殺虫活性を有する殺虫性ポリペプチドを生産する、請求項２３に記載の方法。
25. 殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物がそのゲノム中に安定して組み入れられた植物又はその種子を、用地において生育させる工程を含む、植物生産量を増加させる方法であって、前記ヌクレオチド配列が、
    ａ）配列番号５に示されたヌクレオチド配列；及び
    ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むポリペプドチをコードするヌクレオチド配列、
    からなる群より選択され、
    前記用地が、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫に感染している、方法。