ES2305014T3

ES2305014T3 - Metodo automatizado para deteccion, cuantificacion y monotorizacion de hemoglobina de hemoglobina en sangre entera, plasma y suero.

Info

Publication number: ES2305014T3
Application number: ES01112904T
Authority: ES
Inventors: Michael J. Malin; Phyllis Shapiro
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2021-06-05
Also published as: EP1162461B1; EP1162461B8; US20020012904A1; US6623972B2; EP1162461A2; DE60133510T2; JP4694720B2; JP2002040029A; EP1162461A3; ATE391917T1; DE60133510D1

Abstract

Un método para la determinación, cuantificación y monitorización de hemoglobina extracelular en una muestra de sangre entera, plasma o suero ejecutada sobre un analizador de hematología automatizado que tiene al menos dos canales analíticos para mediciones de hemoglobina donde la hemoglobina extracelular en la muestra es debida a la presencia de un producto de hemoglobina libre de células un sustituto de hemoglobina portador de oxígeno en la sangre y se selecciona de entre hemoglobina purificada, hemoglobina recombinante, hemoglobina entrecruzada, hemoglobina polimerizada y hemoglobina acoplada a polietilenglicol (PEG-HGB), comprendiendo el método: (a) el determinar la concentración de hemoglobina total en un alícuota de la muestra en un canal analítico de hemoglobina del analizador; (b) el determinar la concentración de hemoglobina celular en la alícuota en la muestra en un canal analítico de glóbulos rojos del analizador; y (c) calcular la diferencia entre la concentración de hemoglobina total determinada mediante el canal de hemoglobina y la concentración de hemoglobina celular determinada mediante el canal de glóbulos rojos del analizador para atender la concentración de hemoglobina en la muestra de sangre entera, plasma o suero, donde el canal analítico de hemoglobina de la etapa (a) mide la concentración total de hemoglobina en la muestra por hemolisis y extracción de los hemes de su complejo biológico con la globulina formando una especie heme férrica ligada capturable en un micelio surfactante según se determine a partir de absorbancia colorimétrica en el canal de hemoglobina del analizador, y adicionalmente donde el canal analítico de glóbulos rojos de la etapa (b) mide la concentración de glóbulos rojos, el volumen de glóbulos rojos y la concentración de hemoglobina de las células de glóbulos rojos individuales a medida que pasan a través de e dos detectores de luz dispersa virtualmente una célula a la vez.

Description

Método automatizado para detección, cuantificación y monitorización de hemoglobina en sangre entera, plasma y suero.

Método automatizado para detección, cuantificación y monitorización de hemoglobina exógena en sangre entera, plasma y suero.

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente de los Estados Unidos de serie 60/210,625, presentada el 9 de junio de 2000.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona en general con nuevos métodos para detectar, cuantificar y monitorizar hemoglobina añadida extracelular o de manera exógena, incluyendo sustitutos de la hemoglobina, en una muestra de sangre, particularmente una muestra de sangre entera, así como en muestras de plasma y suero. La presente invención se relaciona además con el uso de analizadores de hematología automatizados para determinar y cuantificar la concentración de hemoglobina extracelular y exógena, incluyendo sustitutos de hemoglobina libres de células, en sangre, plasma o suero, y es particularmente ventajoso para el uso médico durante trauma o cirugía del paciente, así como también para monitorizar los niveles de hemoglobina durante la recuperación.

Antecedentes de la invención

Los sustitutos de la sangre entera han sido buscados desde hace tiempo como alternativas a la sangre entera para su uso en el campo médico, particularmente después de cirugías y/o traumas, cuando se requieren transfusiones. Motivados por la necesidad de suministrar grandes cantidades de sangre a los militares en el campo de batalla, pero limitados por los recursos para asegurar la seguridad del suministro de sangre frente a la contaminación por patógenos y virus humanos, principalmente virus de la hepatitis y VIH, los bancos de sangre abandonaron sus programas de suministro de sangre entera al comienzo de los 80. Sin embargo, la búsqueda por sustitutos de sangre, por ejemplo sustitutos de sangre sintéticos, que son libres de contaminantes y que pueden ser utilizados en el tratamiento de los pacientes, ha continuado.

Actualmente, hay un interés renovado para producir y/o aislar un sustituto de la sangre. Sin embargo, debido a la complejidad de la sangre y a los diversos componentes que comprende la sangre entera, así como a las estrictas regulaciones federales que gobiernan la prueba y el uso de tales productos sintéticos, la industria se ha enfocado en cuanto a sus esfuerzos de investigación en el desarrollo de productos que liberan temporalmente el oxígeno, en vez de en el desarrollo de una variedad de productos que tengan otras funciones que provee la sangre usada en una transfusión.

La hemoglobina (HGB) aislada a partir de la sangre humana o animal, o un portador de oxígeno producido sintéticamente, tal como él el fluorocarbono, son dos tipos de sustitutos de la hemoglobina que están actualmente en pruebas clínicas. Otros sustitutos de los glóbulos rojos, por ejemplo sustitutos de la hemoglobina que portan oxígeno, también ha sido desarrollados y caracterizados para su uso en pacientes. (Véase, por ejemplo Red Blood Cell Substitutes, 1998, (Eds.) A.S. Rudolph, R. Rabinovici, and G.Z. Feuerstein, Dekker, New York, New York.). Tales sustitutos de la hemoglobina portadores de oxígeno pueden ser utilizados en conjunción con terapias médicas estándar, tales como productos de transfusión de sangre o sangre.

A manera de un ejemplo específico pero no limitante, Enzon, Inc. (Piscataway, New Jersey), ha desarrollado una hemoglobina bovina modificada con polietilenglicol (PE), abreviada PEG-HGB. La PEG-HGB es producida mediante un proceso en el cual cadenas de PEG son entrecruzadas sobre las superficies de moléculas de HGB, por ejemplo, como se describe en las patentes de los Estados Unidos números 5,386,014 y 5,234,903 de Nho et al. Otros ejemplos específicos no limitantes incluyen Hemopure® y Oxyglobin (biopure, Cambride, MA).

La primera generación de sustitutos de HGB estaba proyectada en general para tratamientos a corto plazo de pérdidas de sangre/oxígeno durante la cirugía o después de traumas. Una desventaja de los sustitutos de HGV es la corta vida media de circulación atribuida a estos productos. Por ejemplo, los sustitutos de HGB que son añadidos a la sangre tienen una vida media de circulación de hasta 36 horas en comparación con la vida media de circulación de hasta 30 días para la sangre por transfusión. Sin embargo, esta vida media relativamente corta es no es típicamente un problema serio asociado con el uso de tales sustitutos de la sangre, porque estos productos son predominantemente indicados para objetivos de tratamiento a corto plazo.

Para determinar si se hace o no una transfusión a un paciente que tiene una baja concentración de hemoglobina en sangre, el "disparador" de la transfusión está entre aproximadamente 6 y 8 g/dL de hemoglobina en sangre entera y depende de un cierto número de factores específicos, tales como el estado del volumen sanguíneo, estado pulmonar, cardíaco y cerebrovascular, cronicidad o severidad de la anemia, síntomas del paciente relativos a la pérdida de sangre, pérdida de sangre esperada para un procedimiento particular, riesgo de resangrado a partir de la cirugía, pacientes de alto riesgo (por ejemplo los ancianos), y trombocitopenia.

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En general, la medición de la hemoglobina en muestras de sangre entera se lleva a cabo mediante analizadores de hematología automatizados disponibles comercialmente. Hasta la fecha, con la excepción de ciertos analizadores de hematología, tales como los disponibles de Bayer Corporation, por ejemplo el analizador de hematología ADVIA 120®, otros analizadores de sangre comercialmente disponibles son capaces de medir solamente la hemoglobina total, la que incluye no solamente la hemoglobina añadida de manera exógena, sino también la hemoglobina intracelular que es derivada de los glóbulos rojos en la muestra de sangre. La presente invención proporciona la capacidad de determinar y medir la hemoglobina exógena en una muestra de sangre entera, plasma o suero de una manera confiable, reproducible y automatizada.

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Resumen de la invención

Es un objeto de la presente invención proveer métodos para detectar, cuantificar y monitorizar específica y exactamente diferentes tipos de hemoglobina en una muestra de sangre, plasma o suero, preferiblemente una muestra de sangre entera, bajo análisis, por ejemplo (i) hemoglobina derivada de glóbulos rojos (esto es, hemoglobina intracelular, o hemoglobina celular, según se usa aquí); (ii) hemoglobina extracelular, o un producto o sustituto de hemoglobina, particularmente un derivado de hemoglobina libre de células, por ejemplo de PEG-HGB, una forma sintética de hemoglobina, por ejemplo Hemopure® (Biopure, Cambridge, MA); Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA),, la cual ha sido tras fusionada hace un paciente que requiere de HGB añadida, o añadida de alguna otra forma a una muestra de sangre, plasma o suero (por ejemplo de hemoglobina exógena); y (iii) hemoglobina total (esto es, la combinación de hemoglobina intracelular y exógena).

Es otro objeto de la presente invención proveer la capacidad para monitorizar, durante el transcurso o régimen de tratamiento, hemoglobina o un producto de hemoglobina, derivado o sustituto de la misma, tal como un derivado de hemoglobina libre de células, que haya sido añadido a la sangre de un paciente o de un individuo que así lo requiera. También, de acuerdo con la presente invención, la hemoglobina o un producto, derivado o sustituto de la hemoglobina, tal como un derivado de hemoglobina libre de células, puede ser monitorizado, determinado o cuantificado como hemoglobina exógena en sangre, plasma o suero de un paciente, después de que el paciente ha recibido la transfusión con tal producto de hemoglobina, o una sustancia que contiene el producto (por ejemplo una solución o composición fisiológicamente estable, y similares).

Es aun otro objeto en la presente invención proveer un método para diferenciar y medir exactamente la contribución de un producto de hemoglobina exógena o sustituto de sangre añadida o exógena, por ejemplo de PEG-HGB, separada y distintamente de la contribución de la HGB celular que se deriva de los glóbulos rojos de un paciente. De acuerdo con la presente invención, el método analítico automatizado según se describe calcula una concentración específica de la hemoglobina extracelular en una muestra de sangre de la que se ha hecho transfusión con un producto de hemoglobina, o en una muestra de sangre, plasma o suero que contienen hemoglobina extracelular que va a ser detectada. Así, la invención permite la detección y monitorización de un componente de hemoglobina extracelular, aún en la presencia de un componente de hemoglobina celular derivado de los glóbulos rojos en una muestra dada. Además, a través del presente método, son detectables hasta aproximadamente 0. 5 g/dL de hemoglobina en un total de aproximadamente 6. 0 g/dL de hemoglobina extracelular se llevaron a cabo experimentos en el rango de concentración de HGB que es relevante para las transfusiones, por ejemplo un punto de decisión de aproximadamente 6-7 g/dL de la HGB total en sangre. Además, la hemoglobina fue recuperable y cuantifica en muestras de sangre de más de 24 horas, y que había sido almacenada temperaturas de 2ºC hasta 8ºC.

Objetivos y ventajas adicionales permitidos por la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue a continuación.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 1 para detectar y cuantificar específica y exactamente diferentes tipos de hemoglobina en una muestra de sangre entera, plasma o suero. Los analizadores de hematología automatizados producidos por Bayer Corporation, el titular de la presente, se ha encontrado que son capaces de determinar directamente y medir la concentración de hemoglobina exógena, esto es extracelular, en una muestra. Instrumentos adecuados para llevar a cabo los análisis de la presente invención poseen dos canales analíticos que miden la concentración de la hemoglobina en una muestra de sangre específicamente, y a manera de ejemplo, la serie Bayer H*^{TM} de instrumentos analizadores de hematología y la serie Bayer ADVIA® de sistemas de instrumentos analizadores de hematología (por ejemplo, (e.g. ADVIA 120®), así como los analizadores de hematología con diseño o función similares, tienen la capacidad de llevar a cabo análisis cuantitativos del contenido de hemoglobina en sangre plasma y suero que contengan hemoglobina exógena.

Otros analizadores de sangre disponibles en el mercado miden actualmente sólo la hemoglobina total (esto es la combinación de la HGB celular y la HGB extracelular añadidas de manera exógena) en una muestra de sangre. Sin embargo, instrumentos de hematología automatizados para su uso en la presente invención, por ejemplo los analizadores de hematología de Bayer antes mencionados, son capaces de determinar de manera separada e independiente la HGB celular (reportada como "HGB calculada"), así como la hemoglobina total (reportada como "HGB") en una muestra de sangre entera. Hasta la fecha, los analizadores de hematología disponibles actualmente no pueden detectar simultáneamente la hemoglobina celular y la hemoglobina no celular, es decir la hemoglobina añadida de manera exógena, en una muestra de sangre entera, plasma o suero, y por lo tanto, no pueden reportar los valores separados para estas mediciones.

Además, la monitorización del progreso de los pacientes en aquellos pacientes que han recibido hemoglobina exógena, por ejemplo PEG-HGB, un sustituto de la hemoglobina libre de células portador de oxígeno, tal como Hemopure® u Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA), a través de transfusiones, por ejemplo, no es posible con otros analizadores disponibles comercialmente, puesto que estos analizadores no son capaces de distinguir entre la hemoglobina aportada por el sustituto de HGB provisto de manera exógena y la hemoglobina provista por los glóbulos rojos en una muestra de sangre entera, particularmente en los casos de pérdida aguda de sangre o autolisis.

En contraste con los analizadores sanguíneos utilizados en la actualidad, los analizadores automatizados y los métodos de acuerdo con la presente invención pueden diferenciar y medir con exactitud la contribución del sustituto de HGB exógeno separadamente indistintamente de la contribución del HGB celular derivado de los glóbulos rojos como se describe aquí, los analizadores automatizados calculan una concentración específica de la hemoglobina extracelular en una muestra de sangre entera, plasma o suero de la que se ha hecho transfusión con un producto de hemoglobina, permitiendo por lo tanto la detección y monitorización de la hemoglobina exógena en ausencia de componentes de la hemoglobina celular derivada de los glóbulos rojos en una muestra dada. Además, los analizadores descritos aquí proveen valores de hemoglobina celular y total para una muestra de sangre que contiene un producto de hemoglobina añadida.

La presente invención es particularmente ventajosa porque se ha desarrollado cierto número de derivados de hemoglobina libres de células para su uso en lugar de la sangre entera, especialmente en casos de trauma. Así la presente invención provee un método viable para la determinación, medición y monitorización de los niveles de tales productos de hemoglobina en sangre, plasma o suero cuando tales productos han sido añadidos de manera exógena a la sangre, introducidos (por ejemplo por transfusión) en pacientes como sustitutos para la sangre entera.

Será evidente que el método de la presente invención abarca el análisis de muestras de sangre, preferiblemente muestras de sangre entera, así como muestras de plasma y suero, de pacientes que han recibido sustitutos de glóbulos rojos libres de células, por ejemplo que tienen productos sustitutos de hemoglobina añadidos o portadores de oxígeno en su sangre, por una variedad de razones médicas. Se ha evidente además que hay un cierto número de sustitutos de glóbulos rojos libres de células basados en la hemoglobina que puede ser añadidos a la sangre, o utilizados como sustitutos de la sangre, para tratar pacientes que requieren tales sustitutos de los glóbulos rojos o de la sangre portadores de oxígeno, para diversas terapias y condiciones de tratamiento, tales como transfusión, restauración del volumen sanguíneo, tratamiento de pérdida aguda de sangre, cirugía, choques (por ejemplo choques hemorrágicos, u oxigenación de tumores, por ejemplo.

Ejemplos no limitantes de sustitutos de los glóbulos rojos libres de células basados en hemoglobina, o sustitutos portadores de oxígeno, que pueden ser determinados, medidos y/o monitorizados en muestras de sangre entera, plasma o suero de acuerdo con los métodos presentes, particularmente productos de hemoglobina humana químicamente entrecruzados (e.g. D.J. Nelson, 1998, "HemAssist: Development and Clinical profile", En: red Blood Cell Substitutes, 1998, (Eds.) A.S. Rudolph, R. Rabinovici, and G.Z. Feuerstein, Dekker, New York, New York, pp. 353-400; J. Adamson et al., 1998, Ibid., pp. 335-351; and T.M.S. Chang, 1998, Ibid., pp. 465-473); productos de hemoglobina recombinante, particularmente hemoglobina humana recombinante (e.g. J.H. Siegel et al., 1998, Ibid., pp. 119-164 y J.W. Freytag and D. Templeton, 1998, Ibid., pp. 222-325) o hemoglobina de bovinos recombinante; productos de hemoglobina animal purificados preferiblemente ultrapurificados, por ejemplo hemoglobina bovina ultrapurificada y hemoglobina humana ultrapurificada; y productos portadoresl de oxígeno de origen animal, por ejemplo productos portadores de oxígeno basados en hemoglobina bovina (HBOC), por ejemplo "Hemopure®" y Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA); (W.R. Light et al., 1998, Ibid., pp. 421-436; T. Standl et al., 1998, Br. J. Anaesth., 80(2): 189-194; y Palaparthy et al., 2000, Adv. Drug Delivery Reviews, 40:185-198). Los productos de hemoglobina purificada o ultrapurificada son libres de células y pueden ser entrecruzados o pulverizados, por ejemplo Hemopure® y Ozyglobin (biopure, Cambridge, MA).

El uso de analizadores de hematología automatizados en los métodos de acuerdo con la presente invención provee ventajas adicionales, que se describen aquí y se demuestra mediante los ejemplos que se presentan más abajo. Más específicamente, y a manera de ejemplo, el uso de analizadores automatizados de hematología de acuerdo con esta invención permite la detección y medición de PEG-HGB extracelular (o no derivado de células) PEG-HGB (e.g. \geq0.2 a 5.6 g/dL de sangre) que se añade a muestras de sangre entera anticoagulada. La recuperación de PEG-HGB es lineal (e.g. >0.2 a 5.6 g/dL de sangre) cuando se adiciona a plasma o muestras de sangre entera. También la PEG-HGB es recuperable en muestras de 24 horas que ha sido almacenadas a 2-8ºC. Además, los productos de hemoglobina bovina Hemopure (Biopure, Cambridge, MA) y Oxyglobin han sido añadidos a muestras de sangre entera y plasma y detectados de manera exacta así como sustitutos de la sangre portadores de oxígeno de acuerdo con los métodos de la presente invención (ejemplos 5 y 6).

El componente PEG-HGB añadido en una muestra de sangre se obtiene determinando la diferencia entre el PEG-HGB total (calculado a partir de la absorbancia colorimétrica en el canal de la hemoglobina del analizador de hemoglobina) y la PEG-HGB celular calculada (derivada del citograma de glóbulos rojos (RBC) en el canal de glóbulos rojos del analizador de hematología) lo que se calcula mediante la fórmula (RBC x MCV x CHCM/1000) donde MCV significa del volumen celular y CHCM es la Concentración Media de Hemoglobina Celular, la cual mide la misma propiedad celular como MCHC, o Concentración Media de Hemoglobina Celular, en sangre no lisada. El valor CHCM es obtenido a partir del canal de glóbulos rojos del analizador de hematología tal como el sistema ADVIA 120®.

El particular, el CHCM se obtiene a partir de mediciones de dispersión de la luz de acuerdo con la Teoría de Mie (véase Tycko et al., 1985, Appl. Opticsm 24:1355-1365, y la patente de los EEUU No. 4,736,504 de Tycko). En contraste, el MCHC se obtiene dividiendo la PEG-HGB total por el producto (MCV x RCB. Hablando de manera práctica, MCHC no es exactamente igual a CHCM para una muestra de sangre normal pero estos valores preferiblemente concuerdan de manera cercana. Por ejemplo el valor MCHC asociado con el componente de hemoglobina añadida está preferiblemente dentro de un rango de aproximadamente 0-5 g/dL de sangre, mas preferiblemente entre aproximadamente 0.2 g/dL de sangre, del valor CHCM La diferencia entre la hemoglobina total y la hemoglobina intracelular se denomina "HGB Delta" ("HGB\Delta") y representa la concentración de hemoglobina añadida de manera exógena, por ejemplo PEG-HGB en una muestra de sangre.

Una explicación relacionada con la ya mencionada falta de igualdad completa entre los valores MCHC y CHCM es como sigue. Después de una comida típica, por ejemplo no es infrecuente que el plasma sanguíneo desarrolle un pequeño grado de lipemia (es decir, una suspensión de pequeñas partículas submicroscópicas y microscópicas de lípidos, llamados quilomicrones). La presencia de las partículas causa que una menor cantidad de la luz sea dispersada, disminuyendo por tanto la cantidad de luz trasmitida a través de la solución de hemoglobina en un hemoglobinómetro. Consecuentemente, la solución parece contener ligeramente más hemoglobina de la que realmente tiene. Las mediciones célula a célula de la concentración de hemoglobina llevadas a cabo en el ADVIA 120® son libres de este error. El ADVIA 120® se calibró de tal manera que si \DeltaHGB es mayor de 1.9 g/dL, una muestra es catalogada como normal; esto es un grado de lipemia en exceso de esta cantidad es considerado anormal. También si parte de la muestra de sangre ha sufrido hemolisis, bien in vivo en el paciente o en el tubo de recolección, se produce también un valor \BoxHGB. Las dos mediciones de HGB mediante la analizador ADVIA 120® alertan al médico o al clínico de la existencia de cualquier lipidemia o hemolisis anormal en una muestra de paciente.

Hasta la presente invención ningún otro analizador de hematología automatizado disponible comercialmente era capaz de detectar de manera simultánea la hemoglobina intracelular (o celular) (HGB calculada) y la HGB extracelular ("HGB Calculada") en una muestra de sangre entera. De acuerdo con ello, la presente invención provee la capacidad para monitorizar sustitutos de hemoglobina añadidos a la sangre determinando la cantidad de hemoglobina añadida independientemente de la hemoglobina aportada por el componente de glóbulos rojos de la sangre. Para muestras normales no sometidas a lisis y para muestras anormales de sangre, con un sistema apropiadamente calibrado, HGB Delta es igual a cero.

De acuerdo con una modalidad de la presente invención, los analizadores de hematología adecuados para su uso en la presente invención por ejemplo la serie Bayer ADVIA 120® y el sistema Bayer H*^{TM} de analizadores de hematología, son capaces de medir de manera directa la concentración de hemoglobina extracelular exógena puesto que estos instrumentos poseen dos canales analíticos o de detección, cada uno de los cuales mide un tipo diferente de concentración de hemoglobina en una muestra de sangre entera o plasma.

En tales instrumentos, uno de los canales analíticos o de detección es el canal de hemoglobina (HGB) que mide la concentración de la hemoglobina total en la sangre por medio de hemolisis y extracción de los hemes de sus complejos biológicos con la globulina, formando una especie de heme férrico ligado, la cual es capturada en un micelio surfactante y medida espectrofotométricamente (véase, por ejemplo la patente de los EEUU No. 5,858,794 de M. Malin; M. Malin et al., 1992, Anal. Chim. Acta., 262:67-77; y M. Malin et al., 1989, Am. J. Clin. Path., 92:286-294). El segundo canal analítico o de detección de tal instrumento es el canal de glóbulos rojos (RBC) y de la concentración de glóbulo rojos y el volumen celular medio (MCV) y la concentración media de hemoglobina (MCHC) de aproximadamente 10000 eritrocitos individuales a medida que pasan a través de los dos detectores de luz dispersa.

La presencia y diseño de analizadores de hematología que tienen tanto el canal HGB como el canal RBC, junto con los dos detectores de luz dispersa que detectan la luz dispersada sobre una muestra de sangre en base célula a célula que contiene RBCs pasa a través del canal óptico RBC, permitiendo diferenciar entre la hemoglobina intracelular y la hemoglobina extracelular para ser determinadas y calculadas, proporcionando así el rendimiento del método descrito. Para una descripción de los mecanismos ópticos de los analizadores automatizados adecuados que son capaces de llevar a cabo el método de la presente invención, véase Kim and Ornstein, 1983, Cytometry, 3:419-427; Patente de los EEUU No. 4,412,004 de Omstein y Kim; Tycko et al., 1985, Appl. Optics, 24:1355-1365; Patente de los EEUU No. 4,735,504 de Tycko; y Mohandas et al., 1986, Blood, 68:506-513.

A manera de un ejemplo específico pero no limitante, el analizador de hematología Bayer ADVIA 120® es capaz de calcular la diferencia ("HGB Delta", o "HGB\Delta") entre las concentraciones total e intracelular HGB (las concentraciones de HGB están en gramos por decilitro, g/dL, de sangre entera) crema como sigue:

HGB\Delta, g/dL = HGB \ Total, g/dL_{\ Canal \ HGB} - HGB \ Intracelular, g/dL_{\ Canal \ de \ glóbulos \ rojos}

En la ecuación anterior HGB\Delta representa la concentración de la HGB extracelular en la muestra de sangre, plasma o sueroB bajo condiciones ordinarias, HGB (HGB\Delta) = 0.

Así, de acuerdo con la presente invención la hemoglobina total se mide y se monitoriza utilizando el canal HGB del instrumento de hematología, mientras que el canal RBC detecta solamente la HGB intracelular contenida en los glóbulos rojos de una muestra de sangre. Estas dos mediciones son restadas para producir HGB Delta, que representa la HGB extracelular.

En un sistema que podría ser utilizado para la presente invención, HGB Delta se introdujo como un parámetro de lectura con el fin de proveer una revisión de los resultados de HGB obtenidos en el canal de HGB con ciertos tipos de muestras de sangre anormales o patológicas, incluyendo muestras de sangre lipémicas e ictéricas y muestras que tienen recuentos elevados de glóbulos blancos. Tales muestras de sangre anormales o patológicas, incluyendo muestras de sangre lipémicas e ictéricas y muestras que tienen elevados conteos de glóbulos blancos. Tales muestras de sangre anormales han mostrado producir resultados de HGB elevados artificialmente en el canal del H*^{TM} System HGB (véase, M. Malin et al., 1989, Am. J. Clin. Path., 92:286-294). Por ejemplo, ciertas muestras de sangre dispersan la luz, y tales interferencias de luz dispersa producen alguna parte de la luz que no es detectada. Esta interferencia de luz dispersa produce un aparente incremento, o elevación artificial, en la luz absorbida, u en el valor de absorbancia de la muestra debido a que puede obtenerse una concentración de HGB a partir del canal de glóbulos rojos de un analizador de hematología (Tycko et al., 1985, Appl. Optics, (24:1355-1365), HGB\Delta (o HGB Delta) fue encontrado de manera novedosa por los presentes inventores como capaz de ser introducida como un parámetro de lectura para el analizador, donde el valor de la hemoglobina intracelular derivado a partir del canal de los glóbulos rojos del analizador era restado del valor para la hemoglobina total derivada del canal de hemoglobina del analizador con el fin de producir el valor de HGB Delta (g/dL en sangre).

El presente método de medición y terminación de la concentración de HGB intracelular versus la extracelular o añadida de manera exógena en una muestra de sangre entera, así como la concentración total de HGB, puede ser usado y desarrollado en cualquiera de los instrumentos analizadores de hematología disponibles comercialmente Bayer H*^{TM} System o ADVIA 120®. Sin embargo será entendido por los expertos en la materia pertinente que otros instrumentos de hematología que tengan un sistema de canal para la medición de la concentración de HGB en sangre pueden ser diseña-
dos para llevar a cabo el método de determinación y monitorización de concentración de HGB como se describe aquí.

También abarca el presente método una serie o combinación de analizadores de hematología que están diseñados y/o programados para operar sobre la base de un sistema de análisis de hemoglobina de dos canales.

Así, la presente invención proporciona un método para determinar y monitorizar de manera directa la concentración de hemoglobina extracelular en una muestra de sangre, preferiblemente una muestra de sangre entera, y se lleva a cabo sobre un analizador de hematología automatizado, que tiene preferiblemente dos canales analíticos para la medición de la hemoglobina. El método involucra la determinación de la concentración de hemoglobina total de una alícuota de la muestra de sangre alícuota en el analizador, es adecuado para determinar, detectar y/o medir la hemoglobina por medio del presente método, concentraciones de hemoglobina total de aproximadamente 0.5-1 g/dL, o
1.1 g/dL, hasta aproximadamente 25 g/dL of blood, preferiblemente aproximadamente 1 g/dL hasta aproximadamente 25 g/dL, más preferiblemente aproximadamente 2 g/dL hasta aproximadamente 25 g/dL of blood, and most preferiblemente, aproximadamente 6 g/dL hasta aproximadamente 22 g/dL pueden ser determinadas en una muestra de sangre, plasma o suero, o alícuota de los mismos. Como será evidente al practicante experto en la técnica que un valor de hemoglobina normal está en el rango de aproximadamente 11-18 g/dL de sangre. Para mujeres, el rango normal de hemoglobina es de 11-10 6 g/dL de sangre; para varones, el rango normal de hemoglobina es aproximadamente 13-18 g/dL de sangre, y para recién nacidos el rango normal de hemoglobina es aproximadamente 16-20 g/dL de sangre (Fundamentals of Clinical Chemistry, Eds. N. Tietz, W. B. Saunders Co., 1960, P. 944). También a manera de ejemplo, un individuo anémico típicamente tendrá con probabilidad un valor de hemoglobina en el rango de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 g/dL.

El método involucra adicionalmente la determinación de la concentración intracelular de la alícuota de la muestra de sangre en un canal del analizador que sea adecuado para determinar, detectar y/o medir los glóbulos rojos. Las cantidades de hemoglobina intracelular que pueden ser determinadas y medidas por medio del presente método incluyen concentraciones de HGB desde aproximadamente 0.5-1 g/dL, o 1.1 g/dL, hasta aproximadamente 25 g/dL de sangre, preferiblemente aproximadamente 1 g/dL hasta aproximadamente 25 g/dL, más preferiblemente aproximadamente
4 g/dL hasta aproximadamente 24 g/dL de sangre y lo más preferiblemente, aproximadamente 5 g/dL hasta aproximadamente 23 g/dL de sangre. Un rango más preferido de concentraciones de HGB para la detección es aproximadamente 6 g/dL hasta aproximadamente 18 g/dL de sangre. Una concentración de hemoglobina total crítica que puede ser medida por el método de esta invención es aproximadamente 6 g/dL, más preferiblemente 5.6 g/dL, y son concentraciones de hemoglobina que son relevantes para las transfusiones, donde el punto de decisión para realizar una transfusión a un paciente es aproximadamente 6-7 g/dL de hemoglobina.

Cuando las concentraciones de hemoglobina total e intracelular han sido determinadas, estos valores son utilizados para calcular la diferencia entre las concentraciones de hemoglobina total e intracelular de manera que se llega al valor para la concentración de la hemoglobina extracelular de la muestra de sangre, un valor que es calculado automáticamente por el analizador de hematología. De acuerdo con la presente invención el canal de glóbulos rojos del analizador de hematología mide la concentración de hemoglobina en la sangre entera como sigue:

[HGB]_{Sangre, \ Canal \ Glóbulos \ Rojos/Intracelular} \ (g/dL) = [CHCM (g/dL) \ x \ RBC \ Recuento \ (células/mm^{3}) \ x MCV \ (femtolitros/célula)/1000]

El canal HGB mide esa concentración total de hemoglobina, esto es

[HGB]_{Intracelular} + [HGB]_{Extracelular}

De acuerdo con el método descrito el analizador de hematología automatizado ADVIA® 120 calcula la diferencia entre la concentración de HGB total y la concentración de HGB intracelular para producir el HGB Delta, el cual corresponde a la concentración de HGB extracelular o exógena.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos son incluidos aquí con el propósito de ilustrar y ejemplificar los diversos aspectos de discusión de la presente invención y no pretenden limitar la invención de manera alguna.

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Ejemplo 1 Materiales y métodos

PEG-HGB (Enzon, Inc., Piscataway, N.J.) fue recibida congelada y almacenada congelada en el congelador. La bolsa congelada fue descongelada antes de su uso y transferida en 6 tubos de ensayo de polipropileno de 50 ml. Tres tubos de ensayo fueron congelados para uso posterior; los otros dos tubos fueron almacenados en el refrigerador. Una alícuota apropiada para cada experimento fue sometida a decantación en un tubo de ensayo y se permitió que se equilibrara a la temperatura ambiente antes de su uso.

El experimento descrito aquí fue llevado a cabo en un instrumento analizador de hematología automatizado ADVIA 120® ((Bayer Corporation). El canal de hemoglobina de este instrumento utiliza un reactivo para la hemoglobina que contiene cianuro, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos número 5,858,794 de D. Zelmanovic et al. y la Serie EEUU No. 08/884,595, presentada el 27 de junio de 1997 a D. Zelmanovic et al.)

Para calibrar el sistema de hematología ADVIA 120®, el material de calibración (calibrador ADVIA 120®
Setpoint^{TM}) fue aspirado 10 veces y luego se determinó el valor medio de HGB. El factor del sistema calibrador fue definido entonces de tal manera que el valor medio del calibrador correspondiera con el valor de la etiqueta para la HGB del calibrador (g/dL). Para estimar la precisión del canal de HGB se aspiró veinte veces una muestra de sangre entera recientemente extraída y la media y la desviación estándar (SD) fueron calculadas. Una precisión aceptable fue como sigue: SD < 0.11 g/dL.

Las muestras de sangre obtenidas a partir de voluntarios normales fueran sometidas a anticoagulación, preferiblemente utilizando K\cdot EDTA (\equiv12.15 mg/tubo).

La mayor parte de los experimentos descritos en los ejemplos aquí fueron llevados a cabo a niveles de concentración de HGB de aproximadamente 6 g/dL, dado que PEG-HGB (Enzon, Inc.) se reporta con un contenido de 6 g/dL de hemoglobina bovina. El valor de HGB recuperada fue 5.4 \pm 2 g/dL, que se correlaciona apropiadamente con el valor nominal de 6 g/dL de la sangre. Además, en todo los ejemplos utilizando un analizador de hematología de Bayer Corporation, la precisión en hemoglobina del instrumento fue revisada antes de su calibración aspirando dos veces PEG-HGB a antes de cada experimento.

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Ejemplo 2

Para determinar la recuperación de hemoglobina añadida en una muestra de plasma, el experimento descrito del ejemplo 2 fue llevado a cabo. En este experimento se añadieron volúmenes variables de PEG hemoglobina (Enzon, Inc.) al plasma, el cual fue analizado en un Bayer ADVIA 120® de manera que se estableció la variación de la PEG-HGB exógena en el plasma.

Diez tubos que contenían alícuotas de una muestra de sangre normal recolectada en ácido etilendiaminotetraacético, EDTA (sangre entera EDTA normal) se sometieron a centrifugación a 750 x g. El plasma fue retirado y luego se sometió a centrifugación de nuevo para producir plasma libre de células. A cada uno de siete tubos se añadieron las cantidades de plasma y PEG-HGB según se indica en la Tabla 1 para producir un volumen final de 4.0 mL. Cada tubo fue aspirado 4 veces para determinar valores replicados.

TABLA 1

1

Los cuatro valores replicados de HGB fueron promediados y la diferencia porcentual entre los resultados esperados y los observados fue calculada (véase Tabla 1).

Los resultados de experimentos de replicación muestran que la hemoglobina añadida de manera exógena, esto es, EG-HGB (Enzon, Inc.), fue detectada a partir del canal de hemoglobina y no a partir del canal RBC del instrumento analizador de hematología automatizado, con base en el perfil obtenido (Tabla 1). Esto es consistente con la presencia de PEG-HGB enteramente como hemoglobina extracelular. Además, la recuperación fue lineal de acuerdo con el diseño experimental. Todos los niveles de HGB coincidieron con las especificaciones de linealidad de 0.2 g/dL o 2% de los valores esperados.

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Ejemplo 3

En el ejemplo, se llevaron a cabo los experimentos en los cuales una concentración constante de hemoglobina fue añadida a una matriz de sangre entera en la cual la hemoglobina total era variada, tal como se midió a partir del canal HGB del analizador de hematología.

Diez tubos de sangre entera normal EDTA se sometió a centrifugación a 750 x g. Se retiró el plasma libre de células y se reunieron los glóbulos rojos. Se retiró una alícuota de glóbulos rojos y se añadió plasma de manera que la concentración total de hemoglobina fuera 10 g/dL, esto es, aproximadamente 6 ml es glóbulos rojos empacados más
14 ml de plasma). El volumen total de la alícuota de 10 g/dL requerido fue 15 ml. A cada uno de seis tubos se añadieron la alícuota de 10 g/dL y el plasma libre de células en las cantidades mostradas en la Tabla 3 para producir valores de hemoglobina (HGB) de 6.0, 5.0, 4.0, 3.0, 2.0 y 1.0 g/dL..

TABLA 2

2

Dos mililitros de las muestras "A" de la Tabla 2 fueron diluidos con 2 ml de PEG-HGB. Dado que un volumen igual de PEG-HGB fue añadido a un volumen igual de cada alícuota (i.e. 6.0 g/dL, 5.0 g/dL, 4.0 g/dL, 3.0 g/dL,
2.0 g/dL y 1.0 g/dL), tanto la HGB celular como la HGB extracelular de cada alícuota fueron reducidas en un 50%. La PEG-HGB, que sin diluir está a una concentración de 5. 6 g/dL, fue reducida a 2.8 g/dL en cada alícuota. La HGB total fue igual a la suma de la PEG-HGB extracelular más la HGB celular. Cada tubo fue aspirado 5 veces para obtener resultados replicados.

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TABLA 3

3

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Los resultados presentados en la Tabla 3 en este ejemplo muestran que cuando una concentración constante de PEG-HGB extracelular se añade a una matriz de sangre entera en la cual la concentración de HGB intracelular varía, hay una recuperación aceptable tanto de PEG-HGB extracelular como de HGB celular. Los resultados en la Tabla 3 indican que la cantidad de PEG-HGB fue recuperable y medible en el instrumento Bayer ADVIA 120® cuando se añadía PEG-HGB a muestras de sangre entera con baja HGB celular. A la vista del rendimiento aceptable del presente método para la recuperación de valores de HGB exógena, así como HGB celular, en muestras de sangre humana complementada con PEG-HGB, el método proporciona una aplicabilidad similar para su uso con muestras de sangre, plasma o suero de pacientes que han recibido transfusión, especialmente muestras de sangre entera, que contienen derivados de HGB libres de células o sustitutos de HGB portadores de oxígeno, como se describió anteriormente.

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Ejemplo 4

Este ejemplo presenta datos que muestran la estabilidad de la PEG-HGB añadida de manera exógena a muestras de sangre entera. Las muestras fueron preparadas por la adición de volúmenes variables de sangre entera (6.0 g/dL HGB) a volúmenes variables de PEG-HGB (5.6 g/dL) (Tabla 4A). Cada muestra fue aspirada 4 veces. Las muestras fueron probadas una hora después de la preparación y luego 24 horas después de haber sido almacenadas en refrigeración a 5ºC (Tabla 4B).

A partir de estos experimentos se demostró que el sustituto de hemoglobina PEG-HGB era recuperable después de 24 horas cuando las muestras eran almacenadas 2-8ºC. Como se muestra en las Tablas 4A y 4B, virtualmente no hubo cambios en la HGB total, HGB calculada (esto es HGB celular), o HGB Delta (esto es, HGB extracelular) en muestras de sangre almacenadas a 2-8ºC por 24 horas (Tabla 4B), a partir de valores en el tiempo cero (Tabla 4A). Así, dado que el conteo glóbulos rojos es estable durante el almacenamiento, la HGB Delta, debido la presencia de PEG-HGB, era también constante después de almacenamiento las 24 horas a 2-8ºC.

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Tablas 4A y 4B

PEG-HGB en muestras de sangre de 24 horas

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TABLA 4A

4

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TABLA 4B

5

Ejemplo 5

Este ejemplo describe la medición analítica de otro sustituto de sangre portador de oxígeno, por ejemplo, un portador de oxígeno basado en hemoglobina polimerizada con glutaraldehído (HBOC), Hemopure® obtenido de Biopure Corporation (Cambridge, MA), según se lleva a cabo de acuerdo con la presente invención en un instrumento de hematología ADVIA 120® (Bayer Corporation). Hemopure® es hemoglobina bovina, pulverizada con glutaraldehído para producir oligómeros con un peso molecular de 500.000. La polimerización fue diseñada en este producto para disminuir la rata de excreción a través del riñón.

Sello a cabo dos tipos de experimento y se destinen utilizando el producto Hemopure®: (1) Hemopure® fue introducido en plasma humano y (2) Hemopure® fue introducido en sangre humana entera antes del análisis de hematología automatizado en la determinación de la concentración de hemoglobina exógena.

Los experimentos que miden Hemopure® como una sustancia de hemoglobina exógena en una muestra de sangre o plasma fueron llevados a cabo según se describe en los ejemplos anteriores utilizando el analizador de hematología automatizado ADVIA 120®. De acuerdo con esta invención el analizador ADVIA 120® calculó la diferencia entre la hemoglobina total y las concentraciones de hemoglobina intracelular para producir hemoglobina Delta (esto es, hemoglobina exógena).

Recuperación de HGB exágena HBOC (Hemopure®) en plasma libre de células

Se obtuvo plasma a partir de sangre humana fresca por centrifugación durante 25 minutos en una centrifuga Sorvall R-3^{R} equipada con un rotor de soporte horizontal HB4L a 2400 rpm (620 x g). El sobrenadante del plasma fue recentrifugado durante 10 minutos a 620 x g y se desecho el residuo. El plasma libre de células fue distribuido en tubos de vidrio como sigue: 5.00, 4.75, 4.50, 3.00, 2.00, 1.00 y 0.00 ml. En estos tubos se añadió el producto Hemopure® como sigue: 0.00, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 3.00, 4.00 y 5.00 m, respectivamente, de manera que el volumen total fue 5.00 ml. Los tubos fueron tapados y mezclados por inversión 10 veces y luego fueron probados de 30-60 minutos después en ADVIA 120®, utilizando 5 replicados por tuvo. Las concentraciones de la HGB total, HGB intracelular y HGB Delta fueron tabuladas.

Los resultados se resumen en la Tabla 5, donde los resultados de los ensayos son las medias de 5 replicados. Para el producto Hemopure® la diferencia entre HGBDelta _{predicho} y HGBDelta_{-de-prueba} fue 0 o 0.1, y por lo tanto estaba dentro de la especificación de linealidad para HGB del analizador ADVIA 120® de 0.2 g/dL o un 2% de diferencia relativa. Para todos los niveles, la concentración de HGB intracelular fue cero según lo requería el diseño experimental. Los datos ilustran que la recuperación de la HGB exógena es lineal en la matriz de plasma en el rango de 0.6 a 13.0 g/dL.

TABLA 5

6

Recuperación de la HGB exógena HBOC (Hemopure®) en sangre entera

Sangre entera obtenida de voluntarios y sometida a un proceso de coagulación en K_{3}EDTA, fue manipulada de manera que la concentración total de HGB era 13.0 g/dL. Se distribuyó la sangre entera en tubos de vidrio como sigue: 5.00, 4.75, 4.50, 4.00, 3.00, 2.00, 1.00 y 0.00 ml. En estos tubos, se añadió Hemopure® como sigue: 0.00, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 3.00, 4.00 y 5.00 ml, respectivamente, de manera que el volumen total era de 5.00 ml. Los tubos fueron tapados y mezclados por inversión (10 veces), y luego fueron probados durante 30-60 minutos después en ADVIA 120®, utilizando 5 replicados por tubo. Las concentraciones de HGB total, HGB intracelular y HGB Delta fueron tabuladas.

Usando sangre entera y Hemopure®, la concentración de HGB intracelular disminuyó a medida que aumentó la HGB extracelular. Los resultados se resumen en la Tabla 6, en la cual los resultados obtenidos son una media de 5 replicados. Para el producto Hemopure®, la diferencia entre HGBDelta _{predicho} y HGBDelta_{-de-prueba} era en general cero o 0.1, y no excedía la especificación de linealidad de HGB del analizador ADVIA 120®. Para todos los niveles la concentración de HGB intracelular fue cero, según lo requería el diseño experimental. Los datos ilustran que la recuperación de HGB exógena fue lineal en una matriz de sangre entera en el rango de 0.09 a 13.0 g/dL.

7

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Ejemplo 5

Este ejemplo describe la medición analítica de otro sustituto de sangre libre de células portador de oxígeno. Oxyglobin (Biopure Corporation, Cambridge, MA) ejecutado de acuerdo con la presente invención en ADVIA 120® (Bayer Corporation). Al igual que Hemopure® es también una solución libre de células de hemoglobina polimerizada con glutaraldehído.

Como en ejemplo 5, se llevaron a cabo dos tipos de experimentos utilizando el producto Oxyglobin: (1) Oxyglobin fue introducido en plasma humano y (2) Oxyglobin fue introducido en sangre humana entera antes del análisis de hematología automatizado.

Los experimentos que medían Oxyglobin como una sustancia de hemoglobina exógena en una muestra de sangre o plasma fueron ejecutados tal como se describe en los ejemplos anteriores utilizando el analizador de hematología automatizado ADVIA 120®.

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Recuperación de Oxyglobin en plasma libre de células

El plasma se obtuvo a partir de sangre humana fresca por centrifugación durante 25 minutos en una centrifuga Sorvall R-3^{R} equipada un rotor horizontal HB4L a 2400 rpm (620 x g). El sobrenadante del plasma fue centrifugado durante 10 minutos a 620 x g y se descartó el residuo. Se distribuyó plasma libre de células en tubos de vidrio como sigue: 5.00, 4.75, 4.50, 3.00, 2.00, 1.00 y 0.00 ml. Se añadió Oxyglobin a estos tubos como sigue: 0.00, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 3.00, 4.00 y 5.00 ml respectivamente, de manera que el volumen total fuera de 5.00 ml. Los tubos fueron tapados y mezclados por inversión (10 veces) y luego se ensayaron durante 30-60 minutos después en el analizador de hematología ADVIA 120®., utilizando 5 replicados por tubo. Las concentraciones de HGB total, HGB intracelular y HGB Delta fueron tabuladas.

Los resultados se resumen en la Tabla 7, donde los resultados de la prueba son la media de 5 replicados. Como se observa en el producto Hemopure® (ejemplo 5), la diferencia entre HGBDelta _{predicho} y HGBDelta_{-de-prueba} para Oxyglobin fue 0 o 0.1, y por lo tanto estaba dentro de la especificación de linealidad de HGB del analizador ADVIA 120® de 0.2 g/dL o 2% de diferencia relativa. Para todos los niveles, la concentración de HGB intracelular fue cero, según era requerido por el diseño experimental. Los datos ilustran que la recuperación de HGB exógena fue lineal en una matriz de plasma a lo largo del rango de 0.6 a 13.0 g/dL.

TABLA 7

8

Recuperación de Oxyglobin en sangre entera

Sangre entera, obtenida de voluntarios y sometida a anticoagulación en K_{3}EDTA, fue manipulada de tal manera que la concentración total de HGB fue 13. 0 g/dL. La sangre entera fue distribuida en tubos de vidrio como sigue: 5.00, 4.75, 4.50, 4.00, 3.00, 2.00, 1.00 y 0.00 ml. Se añadió Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA) a los tubos como sigue: 0.00, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 3.00, 4.00 y 5.00 ml, 60 y respectivamente, de manera que el volumen total en cada tubo fue de 5.00 ml. Los tubos fueron tapados y mezclados por inversión (10 veces), y luego se sometieron a la prueba 30-60 minutos después en ADVIA 120® utilizando 5 replicados por tubo. Las concentraciones de HGB total, HGB intracelular y HGB Delta fueron tabuladas.

Utilizando sangre entera y el producto Oxyglobin, la concentración de HGB intracelular disminuía a medida que aumentaba la HGB extracelular. Los resultados se resumen en la Tabla 8, en la cual los resultados de la prueba son la media de 5 replicados. De manera similar a los resultados observados par el producto Hemopure®, la diferencia entre HGBDelta _{predicho} y HGBDelta_{-de-prueba} fue en general 0 o 0.1 para Oxyglobin, y no excedía la especificación de linealidad de HGB del analizador ADVIA 120®. Para todos los niveles, la concentración de HGB intracelular era cero, según lo requería el diseño experimental. Los datos ilustran que la recuperación de HGB exógena es lineal en una matriz de sangre entera a lo largo del rango de 0.09 a 13.0 g/dL.

TABLA 8

9

Los resultados de los experimentos descritos en los ejemplos 5 y 6 demuestran que los sustitutos de sangre portadores de oxígeno Hemopure® y Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA) pueden ser detectados cuantitativamente de manera directa mediante un analizador de hematología automatizado tal como el analizador de hematología ADVIA 120® de Bayer Corporation. El analizador ADVIA 120® fue capaz de detectar de manera directa y cuantitativa los materiales Hemopure® y Oxyglobin del plasma y en sangre entera en un rango de 0.6 a 13.0 g/dL. El ADVIA 120® reportó estos sustitutos de hemoglobina como hemoglobina extracelular.

Según se describe aquí de acuerdo con la operación del analizador de hematología automatizado de acuerdo con la presente invención, el canal de hemoglobina mide colorimétricamente la concentración de hemoglobina total en la muestra mediante la interacción de HGB en la muestra con cianuro iónico en presencia de micelios surfactantes (Véase M.J. Malin et al., 1992, J. Anal. Chim. Acta., 262:67-77, y M.J. Malin et al., 1989, J. Amer. Clin. Path., 92:286-294.). Así, la HGB total es una combinación de HGB intracelular y HGB extracelular. En contraste, el canal BBC registra típicamente sólo la HGB intracelular presente en una muestra. El sistema automatizado calcula la concentración de HGB extracelular obteniendo la diferencia entre los niveles de HGB total e intracelular. Ambos materiales fueron recuperados dentro de la especificación en un experimento de linealidad en matrices de plasma y sangre entera.

Ejemplo 7

Los aspectos de asociación en agua confirmaron que los materiales Hemopure® y Oxyglobin eran derivados de hemoglobina en los cuales los grupos heme eran capaces de oxigenación. Más específicamente, Hemopure® y Oxyglobin y la sangre entera fueron diluidos 251 veces en agua destilada, se mezclaron y se barrieron desde 750 a 450 nanómetros contra agua destilada en un espectrofotómetro Cary 3. Los espectros de la sangre entera y de los dos sustitutos de sangre exhibieron máximos espectrales a 541 nanómetros y 577 nanómetros respectivamente, y mínimos espectrales a 508 nanómetros y 560 nanómetros respectivamente. Estos rasgos son característicos de la oxihemoglobina (van Kampen and Ziljstra, 1965, Adv. Clin. Chem., 8:141) cuando se compara con sangre entera. Puesto que los productos párrafo 72 tienen un espectro de vocación hemoglobina en agua oxigenada, el hierro tiene está en el estado de oxidación ferroso tal como está en la hemoglobina de la sangre entera.

Ejemplo los dos productos Hemopure® y Oxyglobin se comportaron como la hemoglobina en sangre entera cuando se diluyeron 251 veces con un reactivo de hemoglobina que contenía cianuro y se analizaron en el analizador de hematología ADVIA 120®. Específicamente 20 \mul de Hemopure® y Oxyglobin fueron diluidos cada uno en 5.0 ml reactivo de hemoglobina que contenía cianuro según se usa en el analizador ADVIA 120®. Las muestras fueron mezcladas y luego barridas desde 750 nanómetros hasta 450 nanómetros en un espectrofotómetro Cary 3 y se compararon con el reactivo en cubetas de longitud de paso de 1 cm. A_{750} fue puesto en 0 como control, una alícuota de sangre humana fresca fue tratada como se describió anteriormente para los productos de prueba. Los resultados se resumen en la Tabla 9 la cual muestra los máximos y mínimos espectrales de los portadores de oxígeno basados en hemoglobina y de la sangre entera en el reactivo de hemoglobina con contenido de cianuro.

TABLA 9

10

Los datos muestran que ambos Biopure HBOCs recuerdan a la sangre humana con respecto a su reacción con el reactivo de hemoglobina que contiene cianuro. Todo los espectros exhibieron un máximo de 550 nanómetros y un mínimo a 514 nanómetros, con una relación similar de absorbancia máxima/mínima. Este experimento demuestra que ambos productos Hemopure® y Oxyglobin contienen heme, dado que los productos obtenidos en el reactivo de HGB es diciano-Fe^{+3} protoporfirina IX (véase Malin et al., 1992, Anal. Chim. Acta, 262:67-77).

Los contenidos de todas las patentes, solicitudes de patente, artículos publicados, libros, manuales de referencia y extractos citados aquí son por lo tanto incorporados como referencia en su totalidad para describir más completamente el estado del arte al cual pertenece esta invención.

Puesto que pueden hacerse diversos cambios en el asunto antes descrito sin apartarse del alcance y espíritu de la presente invención, se entiende que toda la materia contenida en la anterior descripción, o definida en las reivindicaciones anexas, será interpretada como descriptiva e ilustrativa de la presente invención. Muchas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores.

Claims

1. Un método para la determinación, cuantificación y monitorización de hemoglobina extracelular en una muestra de sangre entera, plasma o suero ejecutada sobre un analizador de hematología automatizado que tiene al menos dos canales analíticos para mediciones de hemoglobina donde la hemoglobina extracelular en la muestra es debida a la presencia de un producto de hemoglobina libre de células un sustituto de hemoglobina portador de oxígeno en la sangre y se selecciona de entre hemoglobina purificada, hemoglobina recombinante, hemoglobina entrecruzada, hemoglobina polimerizada y hemoglobina acoplada a polietilenglicol (PEG-HGB), comprendiendo el método:

(a) el determinar la concentración de hemoglobina total en un alícuota de la muestra en un canal analítico de hemoglobina del analizador;

(b) el determinar la concentración de hemoglobina celular en la alícuota en la muestra en un canal analítico de glóbulos rojos del analizador; y

(c) calcular la diferencia entre la concentración de hemoglobina total determinada mediante el canal de hemoglobina y la concentración de hemoglobina celular determinada mediante el canal de glóbulos rojos del analizador para atender la concentración de hemoglobina en la muestra de sangre entera, plasma o suero, donde el canal analítico de hemoglobina de la etapa (a) mide la concentración total de hemoglobina en la muestra por hemolisis y extracción de los hemes de su complejo biológico con la globulina formando una especie heme férrica ligada capturable en un micelio surfactante según se determine a partir de absorbancia colorimétrica en el canal de hemoglobina del analizador, y adicionalmente donde el canal analítico de glóbulos rojos de la etapa (b) mide la concentración de glóbulos rojos, el volumen de glóbulos rojos y la concentración de hemoglobina de las células de glóbulos rojos individuales a medida que pasan a través de e dos detectores de luz dispersa virtualmente una célula a la vez.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la muestra es una muestra de sangre entera normal o anormal.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la muestra es una muestra de plasma o suero.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la concentración de hemoglobina total en la etapa (a) y la concentración de hemoglobina celular en la etapa (b) es de aproximadamente 0.5 gl/dl hasta aproximadamente
25 gl/dl de sangre, plasma o suero.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde la muestra de sangre entera anormal es derivada de un individuo que tiene una condición patológica seleccionada de pérdida de sangre durante cirugía, pérdida de sangre durante trauma y choque hemorrágico.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la hemoglobina purificada es hemoglobina bovina purificada o hemoglobina humana purificada.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, donde la hemoglobina recombinante es hemoglobina humana recombinante.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la hemoglobina celular de la etapa (b) es determinada por la fórmula RBC x MCV x CHCM/100; donde RBC es el valor de citograma de glóbulos rojos en el canal de glóbulos rojos del analizador de hematología; MCV es el volumen celular medio; y CHCM es la concentración de hemoglobina celular media obtenida del canal de glóbulos rojos del analizador de hematología.