ES2301246T3 - Visualizacion diferencial en dos colores como procedimiento para la deteccion de genes regulados. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para el análisis de una muestra de ARN, en el que a)partiendo de una muestra de ARN se prepara la primera cadena de una muestra complementaria de ADN (muestra ADNc) utilizando un primer cebador, el cual eventualmente está marcado con un primer colorante, b)se prepara la segunda cadena de esta muestra de ADNc utilizando un segundo cebador, el cual preferentemente está marcado con un segundo colorante, c)se amplifica la muestra de ADNc utilizando un primer cebador, el cual es secuencialmente idéntico al primer cebador de la etapa a), y el cual está marcado con un primer colorante, y un segundo cebador, el cual es secuencialmente idéntico al segundo cebador de la etapa c), y el cual está marcado con un segundo colorante, y d)se analiza la composición de la muestra de ADNc amplificada y marcada.
Description
Visualización diferencial en dos colores como
procedimiento para la detección de genes regulados.
La invención se refiere a un nuevo procedimiento
para el análisis de la composición de una muestra de ARNm y para el
análisis de la expresión génica diferencial, utilizando dos
cebadores marcados de diferente manera, así como a la utilización de
la invención.
La visualización diferencial de pantalla de RNA
(Differential Display: DD) es uno de los métodos más
frecuentemente aplicados para la detección y el aislamiento de
genes regulados (Liang, P. y Pardee, A. B. (1992) Science 257,
967-971; Liang y Pardee (1995) Current Opinion in
Immunology 7, 274-280; McClelland et al.
(1995) Trends in Genetics 11: 242-246). El método
DDRT (Differential Display + Reverse
Transkription (pantalla diferencial +
transcripción inversa: DDRT) comprende, que en una
primera etapa el ARN aislado se transcribe inversamente
(transcripción inversa (RT)) utilizando un primer
cebador, por lo que se prepara la primera cadena de un ADN
complementario (ADNc) y éste, después, en una segunda etapa,
utilizando el primer cebador y un segundo cebador se amplifica con
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y, a continuación, se
analiza la composición de la muestra de ADNc amplificada, por
ejemplo por apertura del ADNc amplificado en un gel. La detección
puede tener lugar después, por ejemplo por hibridación con una
muestra marcada o por marcación del ADNc amplificado, pero también
porque la amplificación se lleva a cabo en presencia de nucleótidos
marcados radiactivamente (generalmente ATPd marcado
radiactivamente) o en presencia de un cebador marcado, el cual se ha
marcado, por ejemplo, con un colorante fluorescente ("DDRT
fluorescente") (Ito et al. (1994) FEBS Letters 351,
231-236; Ito and Sakaki ("Methods in Molecular
Biology Vol. 85: Differential Display Methods and Protocols"
(1997) págs. 37-44 Liang y Pardee editores, Human
Press Inc. Totowa, NJ; Jones et al. (1997) Biotechniques 22,
536-543; Smith et al. (1997) Biotechniques
23, 274-279).
Si la reacción se lleva a cabo en presencia de
nucleótidos marcados radiactivamente, entonces se marcan todos los
ADNc amplificados (DDRT radioactivo; DDRT clásico). Si por el
contrario se utiliza un cebador marcado (por ejemplo DDRT
fluorescente), entonces por las posibles combinaciones del primer
cebador marcado y del segundo cebador no marcado durante el PCR
sólo se marca una parte de los ADNc amplificados, mientras que otra
parte se queda sin marcar.
Para la RT se emplea el cebador primeramente
marcado (aquí el cebador 1 es un
oligo(dT)-cebador con dos nucleótidos más
(M=A, C, G; N=A, C, G, T) en el extremo-3'
("5'-(T)_{12}-MN-3'"
es (T)_{12}-MN)). En la siguiente PCR se
emplea adicionalmente con este primer cebador un segundo cebador no
marcado (aquí el cebador 2 es un oligonucleótido con una secuencia
de 10 nucleótidos que presentan una secuencia casual
("10mero")), no obstante, el primer cebador se emplea
habitualmente con doble cantidad de exceso. De esta manera se
obtiene por lo regular una proporción relativamente elevada de ADNc
amplificados, cuyos extremos-3' presentan la
secuencia del primer cebador, y cuyos extremos-5'
presentan la secuencia del segundo cebador (por ejemplo
5'-10mero - - - - -
(T)_{12}-MN-3',
simbolizando "- - - - -" la secuencia
de ADNc amplificada, situada entre las secuencias de los cebadores.
Además de esto, se amplifican ADNc, en los cuales las secuencias de
los cebadores se han intercambiado frente a 1) (en cuyos
extremos-5' se encuentra la secuencia del cebador
(T)_{12}-MN y en su
extremo-3' la secuencia del cebador 10mero; (véase.
2)). Otros ADNc se amplifican o bien sólo a través del
cebador-(T)_{12}-MN (véase. 3) o sólo a
través del cebador-10mero (véase. 4). Por lo tanto,
en el caso de utilizar dos cebadores distintos, por las posibles
combinaciones de los cebadores en el DDRT se pueden amplificar los
siguientes productos de reacción:
- 1)
- 5'-10mero- - - - - - - - - (T)_{12}-MN-3'
- 2)
- 5'-(T)_{12}-MN - - - - - - - - - 10mero-3'
- 3)
- 5'-(T)_{12}-MN - - - - - - - - - - (T)_{12}-MN-3'
- 4)
- 5'-10mero - - - - - - - - -10mero-3'
Debido al hecho de que en esta tanta de DDRT
fluorescente sólo está marcado el primer cebador, en el subsiguiente
análisis de los ADNc amplificados sólo se detectan aquellos ADNc,
que fueron amplificados en al menos una dirección a través de
primer cebador marcado, es decir los ADNc citados bajo 1), 2) y 3),
mientas que por el contrario los ADNc, que sólo se amplifican con
el segundo cebador ni se marcan ni se detectan (véase 4). Con ello,
en comparación con un DDRT radioactivo, la complejidad de los
productos detectados por PCR (ADNc) es menor. Por este motivo, con
el DDRT fluorescente convencional no se captan aquellos genes
regulados o, respectivamente, los ARNm correspondientes a ellos,
los cuales sólo se amplifican con el segundo cebador. Por
consiguiente, el número de genes regulados que se capta con el DDRT
fluorescente convencional puede ser menor que el captado en el DDRT
radioactivo.
Además, tanto con el DDRT radioactivo
convencional como también con el DDRT fluorescente convencional,
como se expone bajo 1) a 4), partiendo de un único ARNm no se
amplifica en el PCR un producto de ADNc homogéneo sino que por las
diferentes combinaciones de los cebadores se pueden amplificar
varios ADNc, los cuales se diferencian en su longitud (esto sería
visible, por ejemplo por separación en un gel). El que en el caso de
diferentes ADNc amplificados se trate o no de productos de ADNc de
un mismo gen regulado, lo indicaría solamente un análisis detallado
(por ejemplo un análisis secuencial). Los DDRT convencionales no
ofrecen la posibilidad de diferenciar entre los ADNc redundantes
amplificados, marcados. En el DDRT radioactivo no se puede
diferenciar entre 1) a 4). En el DDRT fluorescente convencional no
se puede diferenciar entre 1), 2) y 3), aunque exista una mayor
probabilidad de que el fragmento visible de ADNc proceda de la
región 3' de un gen, puesto que el cebador 3' está marcado con el
colorante fluorescente.
Por consiguiente, por un lado la redundancia de
los fragmentos de ADNc amplificados en el DDRT radioactivo
convencional, la cual no se puede detectar o, respectivamente, sólo
con una complejidad relativamente alta y, por otro lado, la menor
complejidad del producto de ADNc amplificado en el DDRT fluorescente
convencional en comparación con el DDRT radioactivo convencional
representan, junto con el riesgo de no advertir determinados genes
regulados, los problemas principales del método del DDRT
convencional y, respectivamente, del DDRT fluorescente.
La invención en la que se fundamenta la presente
solicitud pone a disposición un procedimiento, que puede ser
utilizado para el análisis de muestras de ARN y especialmente para
el análisis de genes regulados diferencialmente, no presentando este
procedimiento las citadas desventajas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para el análisis de una muestra de ARN,
preferentemente una muestra de ARNm, en donde
a) partiendo de una muestra de ARN,
preferentemente una muestra de ARNm utilizando un primer cebador, el
cual eventualmente está marcado con un primer colorante, se prepara
la primera cadena de una muestra de ADN complementario (muestra de
ADNc),
b) se prepara la segunda cadena de esta muestra
de ADNc utilizando un segundo cebador, el cual preferentemente está
marcado con un segundo colorante,
c) la muestra de ADNc se amplifica utilizando el
primer cebador que está marcado con un primer colorante y el
segundo cebador, que está marcado con un segundo colorante, y
d) se analiza la composición de la muestra de
ADNc amplificada y marcada.
La muestra de ARN contiene ARNm que se ha de
analizar. En una forma de ejecución preferida de la invención se
emplea en el procedimiento ARNm. Los ARN se pueden aislar por
ejemplo con ayuda de conocidos procedimientos tales como la
centrifugación con gradientes de densidad con CsCl_{2} o la
cromatografía en columna. Preferentemente, el ARN se aísla a partir
de una célula o, respectivamente, de una colonia de células o,
respectivamente, de un tejido. Eventualmente, se puede concentrar
el ARNm a partir del ARN, por ejemplo por cromatografía a través de
una columna de oligo(dT).
En el procedimiento se emplean un primer y un
segundo cebador. El primer cebador es el cebador que se emplea para
la transcripción inversa. El primer cebador se puede designar
también como cebador 3', puesto que hibridiza con el ARNm y define
el extremo 3' de la primera cadena del ADN complementario (ADNc). El
segundo cebador se emplea para sintetizar la segunda cadena del
ADNc. El segundo cebador se designa también como cebador 5', puesto
que hibridiza con la primera cadena del ADNc y define el extremo 5'
de la segunda cadena del ADNc.
El primer cebador y el segundo cebador están
marcados eventualmente con un colorante. El primer cebador se
emplea para la transcripción inversa (etapa a) del procedimiento) y
para la subsiguiente amplificación del ADNc (etapa c) del
procedimiento). El primer cebador, el cual se emplea para la RT o
bien está marcado con un colorante o no está marcado con un
colorante, lo último es el caso, por ejemplo, cuando la
transcriptasa inversa utilizada no acepta el cebador marcado. En
cualquier caso, el primer cebador está marcado cuando se emplea
para la amplificación de ADNc. El primer cebador, el cual se emplea
para la RT, y el primer cebador, el cual se emplea para la
amplificación, tienen preferentemente la misma secuencia.
El segundo cebador, el cual se utiliza tanto
para la síntesis de la segunda cadena del ADNc (etapa b) del
procedimiento) como también para la amplificación del ADNc (etapa c)
del procedimiento), está marcado preferentemente tanto durante la
síntesis de la segunda cadena como también durante la amplificación.
Preferentemente, en los dos casos, el segundo cebador tiene la
misma secuencia. Preferentemente, la síntesis de la segunda cadena
y la amplificación del ADNc son partes constituyentes de una
reacción, de manera que el segundo cebador es idéntico.
En formas de ejecución preferidas de la
invención el primer y segundo cebador son oligodesoxinucleótidos,
constituidos por desoxiadenosina (dA) desoxiguanosina
(dG),desoxiinosina (dI), desoxiuridina (dU), (desoxi-)timidina (dT)
y desoxicitidina (dC).
El primer y/o el segundo cebador pueden
presentar una secuencia de bases (secuencia de adenina, guanina,
citosina, timina; en lo sucesivo "secuencia"), la cual es
complementaria a la o las secuencias de uno o varios ácidos
nucleicos determinados. Un cebador, que es complementario de una
determinada secuencia, puede hibridizar con un ácido nucleico que
contenga esta secuencia complementaria o una secuencia, la cual se
derive de esta secuencia complementaria (o sea que presente una
cierta homología con esta secuencia complementaria). Por ejemplo, el
primer cebador puede hibridizar preferentemente con el ARNm. Por
extensión del cebador se crea la primera cadena del ADNc. Un
cebador puede presentar también una secuencia que sea idéntica o,
respectivamente, sensiblemente idéntica a la secuencia de un
determinado ácido nucleico. Este cebador puede hibridizar después
(bajo determinadas condiciones de reacción) con un ácido nucleico
que presente una secuencia complementaria a la del ácido nucleico
determinado. Por ejemplo, la secuencia del segundo cebador se deriva
de la secuencia del ARNm, es decir que la secuencia del segundo
cebador puede ser idéntica o, respectivamente, sensiblemente
idéntica a la secuencia del ARNm. Por eso, el segundo cebador puede
hibridizar (bajo determinadas condiciones de reacción) con un ácido
nucleico que presente una secuencia que sea complementaria a la
secuencia del ARNm, por ejemplo con la primera cadena del ADNc.
Las condiciones de reacción bajo las cuales el
primer y segundo cebador hibridizan con un ácido nucleico vienen
determinadas preferentemente por condiciones de temperatura y/o de
tampón. Las condiciones de temperatura se eligen preferentemente de
tal modo, que los cebadores hibridicen específicamente con la
secuencia complementaria del ácido nucleico, es decir que se
produzcan predominantemente "correctos" emparejamientos de
bases (A-T; G-C) y a ser posible
pocos emparejamientos de bases defectuosos, es decir se elige a ser
posible una temperatura de hibridación óptima (temperatura de
annealing) (por ejemplo Sambrook et al. (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press). Además de esto, se eligen determinadas
concentraciones salinas, especialmente concentraciones de
Mg^{2+}.
Un ácido nucleico, de cuya secuencia se deriva
la secuencia del primer y/o segundo cebador (es decir de la cual
éstas son complementarias o idénticas o, respectivamente,
sensiblemente idénticas) puede ser, por ejemplo, un ADN, por
ejemplo un ADNc, un gen o una parte de él o un ARN, preferentemente
un ARNm.
El segundo cebador puede presentar una secuencia
de bases casual, comprendiendo esto tanto los cebadores que
presentan una secuencia completa casual, como también aquellos
cebadores que presentan una secuencia parcialmente casual (casual,
por ejemplo, en lo referente a una o varias bases). Las secuencias
pueden ser casuales, pero pueden presentar al mismo tiempo una
determinada relación de cada una de las bases, por ejemplo todas las
bases pueden aparecer en igual relación, o una o varias bases se
presentan en mayor o menos proporción. Especialmente, también se
puede utilizar hipoxantina.
El segundo cebador puede presentar también una o
varias secuencias de bases concretas. Esta(s)
secuencia(s) concreta(s) se pueden seleccionar
casualmente, es decir no se derivan de secuencias conocidas. Con
tales cebadores se pueden identificar genes o, respectivamente,
proteínas nuevas, no identificadas hasta el momento.
El segundo cebador puede presentar una secuencia
de bases que se derive de secuencias conocidas, es decir que
corresponden a secuencias total o parcialmente conocidas (es decir,
que sea complementaria de estas secuencias o que sea idéntica o,
respectivamente, esencialmente idéntica a éstas). Por ejemplo, un
cebador puede presentar una secuencia, que presente una mayor o
menor coincidencia con una determinada secuencia de consenso o,
respectivamente, que sea correspondiente a esta. De esta manera se
puede identificar, por ejemplo, la expresión diferencial de
miembros conocidos y/o desconocidos de una determinada familia de
genes/familia de proteínas.
El segundo cebador puede presentar una secuencia
de bases que se derive de una determinada secuencia de aminoácidos
(por ejemplo, una secuencia consensual a nivel de aminoácido). En
este caso, los cebadores pueden estar degenerados, es decir que en
lo referente a una determinada secuencia de aminoácidos se tendrá en
cuenta la degeneración del código genético; el cebador representa
entonces una mezcla de moléculas de cebador, las cuales presentan
una secuencia de aminoácidos diferente y tienen en cuenta todas las
posibilidades de utilización del codón, para codificar la
correspondiente secuencia de aminoácidos (cebador degenerado).
Preferentemente, la secuencia del segundo
cebador presenta un punto de corte de restricción para una
endonucleasa de restricción.
El segundo cebador puede presentar
preferentemente una longitud de 8 a 20 nucleótidos para garantizar
una hibridación a ser posible específica. Sin embargo, la longitud
se elige de forma correspondiente a las respectivas secuencias del
cebador y/o a las condiciones de reacción. La longitud y secuencia
del primer y segundo cebador se eligen independientemente uno de
otro.
El primer y/o el segundo cebador pueden contener
también una secuencia que no sean necesarias para la hibridación o,
respectivamente, que no contribuyan a la hibridación. Estas otras
secuencias, por ejemplo pueden posibilitar o, respectivamente,
facilitar la ulterior caracterización o, respectivamente,
utilización de los ADNc amplificados. Preferentemente, estas otras
secuencias se localizan en el extremo 5' del cebador. Por ejemplo,
el cebador puede contener una secuencia que facilite una
subsiguiente secuenciación, por ejemplo una secuencia M13 y/o una
secuencia que facilite la preparación de una sonda marcada (por
ejemplo para la hibridación de Northern-Blots,
Southern-Blots y/o para la hibridación in
situ), por ejemplo una secuencia promotora T7, una secuencia
promotora T3 o una secuencia promotora SP6.
En la primera etapa del procedimiento se
transcribe inversamente ARNm, preparándose la primera cadena de un
ADNc (etapa a) del procedimiento). Para la RT se emplea un primer
cebador, el cual eventualmente está marcado con un colorante.
Preferentemente, el primer cebador presenta una secuencia
oligo(dT) ("(T)_{x}", indicando "X" el
número de radicales timidina) que hibridizan con el rabo poli (A) de
cada uno de los ARNm y de esta manera puede suministrar un extremo
3'-OH libre para la reacción de la polimerasa. La
secuencia oligo(dT) es preferentemente una secuencia de
10-20 radicales timidina (X =
10-20), de modo particularmente preferido es una
secuencia de 12 radicales timidina (X = 12) o, respectivamente, 15
radicales timidina (X=15).
\global\parskip0.950000\baselineskip
En una forma de ejecución particularmente
preferida, la secuencia del primer cebador presenta en el extremo
3' de la secuencia oligo-(dT) al menos un nucleótido más, pero
preferentemente dos nucleótidos, los cuales no pertenecen a la
secuencia oligo(dT), es decir que el primer nucleótido, que
se conecta en el extremo 3' de la secuencia oligo(dT)- es
diferente de la timidina. Preferentemente, el primer cebador
representa una mezcla de moléculas de cebador, las cuales se
diferencian en la secuencia de los nucleótidos que no pertenecen a
la secuencia oligo(dT). Por ejemplo, el primer cebador puede
presentar la secuencia 5'-(T)_{x}MN-3', en
donde M representa A (base adenina), C (base citosina) o G (base
guanina) y "N" representa A, C, G o T (base timina). Por
ejemplo, puede ser X=12 o 15:
| SEQ ID NO: 1: | 5'- TTTTTTTTTTTTMN -3' | (5' - (T)_{12}-MN-3'''), |
| SEQ ID NO: 2: | 5'- TTTTTTTTTTTTTTTMN -3' | (5' - (T)_{15}-MN-3'''). |
en
donde
- "M"
- es A, C o G, y
- "N"
- es A, C, G o T.
El primer cebador representa preferentemente una
mezcla de diferentes cebadores, los cuales se diferencian en la
secuencia que no pertenece a la secuencia oligo(dT).
5'-T_{(x)}MN-3'
puede ser una mezcla de moléculas de cebador con las secuencias:
5'-T_{(x)}AN-3'
5'-T_{(x)}CN-3'
5'-T_{(x)}GN-3'
con N=A,C,G.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente,
5'-T_{(x)}MN-3' es una mezcla de
moléculas de cebador con las secuencias:
5'-T_{(x)}MA-3'''
5'-T_{(x)}MC-3'
5'-T_{(x)}MG-3'
5'-T_{(x)}MT-3'
con M=A,C,G,
en donde las posibles bases A, C y G están
uniformemente representadas en la mezcla; por ejemplo
5'-(T)_{x}MN-3' es una mezcla de moléculas
de cebador con las secuencias: 5'-(T)_{x}AG,
5'-(T)_{x} CG, 5'-(T)_{x} GG, respectivamente,
5'-(T)_{x} AT, 5'-(T)_{x} CT, 5'-(T)_{x}
GT etc.. De esta manera se pueden poner a disposición cebadores
para la amplificación de diferentes ARNm de secuencia desconocida.
Al mismo tiempo se garantiza que los cebadores hibridizan
preferentemente con el extremo 3' de la secuencia complementaria (en
la cola poli(A) del ARNm).
Para la RT se utiliza preferentemente una
ADN-polimerasa dependiente del ARN, por ejemplo la
enzima transcriptasa inversa u otra polimerasa dependiente del ADN
con actividad de transcriptasa inversa, por ejemplo una polimerasa
correspondiente estable a la temperatura, la cual después se puede
utilizar también para la amplificación subsiguiente de ADNc (etapa
c) del procedimiento). En una forma de ejecución preferida de la
invención la síntesis de los dos cordones del ADNc es componente de
la etapa de procedimiento para la amplificación de ADNc, siendo la
etapa de procedimiento para la amplificación de ADNc preferentemente
una reacción PCR.
La transcripción inversa se puede llevar a cabo,
por ejemplo, a 37ºC - 50ºC, preferentemente a 40ºC - 45ºC y, de
modo particularmente preferido a 42ºC. Se utiliza preferentemente
una temperatura de hibridación que haga posible una hibridación
específica del primer cebador (a ser posible pocos emparejamientos
de bases defectuosos) y la cual garantice una actividad de la
polimerasa suficientemente elevada y con la cual se puedan obtener
productos transcritos a ser posible completos.
La segunda cadena del ADNc se sintetiza
utilizando un segundo cebador, el cual preferentemente está marcado.
El segundo cebador presenta preferentemente una longitud de al
menos 6 nucleótidos (6 meros), de modo particularmente preferido
una longitud de 10 (10meros) a 20 nucleótidos (20meros). En una
forma de ejecución particular de la invención el segundo cebador
presenta una longitud de 13 nucleótidos ("13meros"). La
secuencia del segundo cebador puede ser, por ejemplo,
"(N)_{x}", siendo "X " 6-20 y
"N", independientemente entre sí, es A, C, G o T.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En el caso del primer y segundo cebador se trata
preferentemente de oligonucleótidos sintéticos, los cuales, por
ejemplo, se pueden adquirir comercialmente o se sintetizan sobre una
fase sólida con ayuda de un procedimiento conocido (por ejemplo el
procedimiento de la fósforoamida según Caruthers et al.
(1983) Tetrahedron Letters 24, 245). Los cebadores están
constituidos preferentemente por los nucleótidos desoxiadenosina,
desoxiguanosina, desoxiinosina, desoxicitidina y
desoxitimidina.
En una forma de ejecución particularmente
preferida del procedimiento de la invención, la síntesis de la
segunda cadena del ADNc ya es parte componente de la reacción de
PCR, y se sintetiza bajo las condiciones de reacción bajo las cuales
se lleva a cabo la PCR.
Preferentemente, el primer y segundo cebador
están marcados de forma diferente. En principio, se puede utilizar
cualquier tipo de marcación, por ejemplo un cebador se puede acoplar
a digoxigenina o biotina, de modo que una molécula de ADNc
amplificada con ayuda de este cebador se puede detectar, por
ejemplo, con un anticuerpo o, respectivamente, enzima
correspondiente, o un cebador puede estar acoplado a un compuesto
químico, el cual permita la reacción de un sustrato después de su
adición, por ejemplo el sistema Atto-Phos (JBL
Scientific, San Luis Obispo, CA, USA) o un sustrato ECF
(Amersham-Pharmacia Biotech, Freiburg,
Deutschland).
No obstante, se prefiere particularmente la
marcación del primer y/o segundo cebador con colorantes
fluorescentes. Preferentemente, el primer cebador se marca con un
primer colorante fluorescente y el segundo cebador con un segundo
colorante fluorescente. El primer y el segundo colorante
fluorescente se eligen preferentemente de modo que sea posible una
clara distinción de los dos colorantes fluorescentes utilizados. En
este caso, la univocidad del resultado, es decir la diferencia
detectable de los motivos de marcación individuales de cada uno de
los ADNc depende tanto de los colorantes fluorescentes utilizados
como también de la sensibilidad del procedimiento analítico. Por lo
regular, para la evaluación se utilizan procedimientos analíticos
apoyados por ordenador. Por ejemplo, los colorantes fluorescentes
se pueden seleccionar de tal modo que las longitudes de onda de
excitación y/o las longitudes de onda de emisión, detectables, del
primer y del segundo colorante fluorescente se diferencien en 200
nm o más, por ejemplo en 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm.
Ejemplos de colorantes fluorescentes a los que
se pueden acoplar el primer y/o segundo cebador son Cy2, Cy3, Cy5,
FAM, 6-FAM
(6-carboxi-fluoresceína (azul)),
FITC (isotiocianato de fluoresceína), fluoresceína, HEX (4, 5,
2',4',5',7'-hexacloro-6-carboxifluoresceína
(verde)), 5-IAF, TAMRA
(6-carboxitetrametilrodamina (amarillo)), TET (4,
7, 2',
7'-tetracloro-6-carboxifluoresceína),
XRITC (isotiocianato de rodamina-X), ROX
(6-carboxirodamina (rojo)), Alexa488, Alexa532,
Alexa546, Alexa594, TexasRed y Lisamina.
Por ejemplo, son posibles las siguientes
combinaciones:
Cebador 1 marcado con Cy5 y cebador 2 marcado
con Alexa488; cebador 1 marcado con Cy5 y cebador 2 marcado con
FITC; cebador 1 marcado con Cy5 y cebador 2 marcado con FAM; cebador
1 marcado con Cy5 y cebador 2 marcado con Cy2; cebador 1 marcado
con Cy5 y cebador 2 marcado con Cy3; cebador 1 marcado con
fluoresceína y cebador 2 marcado con Texas Red; cebador 1 marcado
con fluoresceína y cebador 2 marcado con Lisamina; cebador 1 marcado
con fluoresceína y cebador 2 marcado con ROX; cebador 1 marcado con
fluoresceína-Cy3; cebador 1 marcado con Alexa 594 y
cebador 2 marcado con Alexa488; cebador 1 marcado con Alexa568 y
cebador 2 marcado con Alexa488; cebador 1 marcado con Alexa546 y
cebador 2 marcado con Alexa488; cebador 1 marcado con Alexa532 y
cebador 2 marcado con Alexa488; cebador 1 marcado con Texas Red y
cebador 2 marcado con Alexa 488; cebador 1 marcado con ROX y
cebador 2 marcado con Alexa488; cebador 1 marcado con Alexa488 y
cebador 2 marcado con Lisamina; cebador 1 marcado con Alexa488 y
cebador 2 marcado con Cy3; cebador 1 marcado con Alexa488 y cebador
2 marcado con ROX. Naturalmente también son posibles las
correspondientes combinaciones de cebadores, en las cuales los
colorantes fluorescentes utilizados para la marcación están
intercambiados en relación con el cebador 1 y el cebador 2 frente a
los ejemplos expuestos anteriormente.
Preferentemente, los colorantes fluorescentes se
acoplan al extremo 5' del cebador (oligonucleótido). En el caso de
un cebador oligo(dT) en el extremo 5' anterior al colorante
fluorescente puede estar localizado otro nucleótido más, diferente
a timidina, por ejemplo una guanosina. Además de esto, un colorante
fluorescente también se puede acoplar al oligonucleótido a través
de una base. Eventualmente, un colorante fluorescente se puede
acoplar también al primer cebador y/o segundo cebador a través de un
adecuado enlazador.
Ejemplos de cebadores marcados, los cuales se
pueden utilizar como primer y/o segundo cebador son:
- \quad
- 5'- CY5-G(T)_{15}MN -3', 5'- CY2-G(T)_{15}MN -3', 5'- CY3-G(T)_{15}MN -3',
- \quad
- 5'-FAM-G(T)_{15}MN -3', 5-6'-FAM-G(T)_{15}MN -3', 5'- FITC-G(T)_{15}MN -3',
- \quad
- 5'-fluoresceína-G(T)_{15}MN -3', 5'-HEX-G(T)_{15}MN -3', 5'-5-IAF-G(T)_{15}MN -3',
- \quad
- 5'- TAMRA-G(T)_{15}MN -3', 5'- TET-G(T)_{15}MN -3', 5'- XRITC-G(T)_{15}MN -3',
- \quad
- 5'- ROX-G(T)_{15}MN -3', 5'- Alexa488 -G(T)_{15}MN -3', 5'- Alexa532 -G(T)_{15}MN -3',
\global\parskip0.950000\baselineskip
- \quad
- 5'- Alexa546 -G(T)_{15}MN -3', 5'- Alexa594 -G(T)_{15}MN -3',
- \quad
- 5'- TexasRed -G(T)_{15}MN -3', 5'- Lisamina -G(T)_{15}MN -3' (los cebadores citados hasta ahora se utilizan preferentemente como primeros cebadores), 5'- CY5- (N)_{13}-3',
- \quad
- 5'- CY2- (N)_{13}-3', 5'- CY3- (N)_{13}-3', 5'- FAM - (N)_{13}-3', 5'- 6-FAM - (N)_{13}-3',
- \quad
- 5'-FITC- (N)_{13}-3', 5'- fluorsceína - (N)_{13}-3', 5'- HEX - (N)_{13}-3', 5'- 5-IAF - (N)_{13}-3',
- \quad
- 5'- TAMRA - (N)_{13}-3', 5'- TET - (N)_{13}-3', 5'- XRITC - (N)_{13}-3', 5'- ROX - (N)_{13}-3',
- \quad
- 5'- Alexa488- (N)_{13}-3', 5'- Alexa532- (N)_{13}-3', 5'- Alexa546- (N)_{13}-3', 5'- Alexa594-(N)_{13}-3', 5'- TexasRed - (N)_{13}-3 y 5'- Lisamina - (N)_{13}-3' (estos cebadores se utilizan preferentemente como segundos cebadores),
en
donde
- "M"
- es A, C o G, y
- "N"
- es A, C, G o T.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de la marcación del primer y/o del
segundo cebador con un colorante fluorescente hay que tener cuidado
de que las longitudes de onda de excitación se encuentren lo
suficientemente separadas para poder determinar después de la
excitación en base a qué longitud de onda se pudo observar una
emisión. Una buena combinación es, por ejemplo, una marcación Cy5
(excitación a 650 nm) por ejemplo del primer cebador (por ejemplo
de un cebador TX-MN) y una marcación basada en una
fluoresceína (excitación a 490 nm) del segundo cebador. La
utilización de dos cebadores marcados de diferente manera permite
una opinión unívoca sobre la composición del cebador de un
ADNc(s) amplificado, detectado, por ejemplo en el gel.
ADNc(s) amplificado, detectado, por ejemplo en el gel.
Si, por ejemplo, sólo se observa una emisión a
650 nm, entonces el ADNc fue amplificado con el cebador marcado con
Cy5, este ADNc posee al menos en un extremo el primer cebador (por
ejemplo el cebador (T)_{x}-MN). Si se
observa una emisión en una longitud de onda de emisión de 490 nm,
entonces en al menos un extremo el ADNc va provisto con el segundo
cebador. Si un determinado ADNc amplificado (en el gel) sólo emite a
una longitud de onda de excitación, entonces en la amplificación
sólo fue amplificado el ADNc con un cebador y, ciertamente, aquel
que fue amplificado con un colorante fluorescente que emite en la
correspondiente longitud de onda de excitación. Cuando un
determinado ADNc amplificado (en el gel), emite en dos longitudes de
onda de excitación, entonces este ADNc fue amplificado utilizando
el primer y/o segundo cebador.
La amplificación (preferentemente PCR) se lleva
a cabo utilizando una ADN-polimerasa,
preferentemente una ADN polimerasa dependiente del ADN, tratándose
de modo particularmente preferido de una
ADN-polimerasa estable a la temperatura, por
ejemplo una Taq-polimerasa,
VENT-polimerasa, AmpliTaq polimerasa, AmpliTaq Gold
polimerasa, entre otras. La PCR se lleva a cabo aplicando un perfil
de temperaturas, el cual permite una amplificación del ADNc,
preferentemente exponencial. Para ello se puede utilizar, por
ejemplo, el ciclo de temperaturas indicado en el Ejemplo 1.
Preferentemente, se realizan 30-40 o más ciclos.
A continuación de esto se analiza el ADNc
amplificado y marcado. El ADNc amplificado se puede separar, por
ejemplo, en un gel, en el que se localizan en diferentes bandas los
ADNc amplificados que se diferencian en su longitud. El análisis
ulterior de tales bandas puede tener lugar, por ejemplo, en
escáneres, los cuales excitan el colorante fluorescente en una
longitud de onda dada (la cual depende del colorante fluorescente
utilizado en cada caso) y/o que pueden detectar la luz que se emite
en el caso de una reacción química de un sustrato
quimioluminiscente. La luz fluorescente emitida se puede evaluar
después, por ejemplo con un programa de ordenador correspondiente,
y se puede recomponer en una imagen sobre gel (como se conoce, por
ejemplo, de autoradiografías). Como escáner se pueden utilizar, por
ejemplo, los Scanner Fluorimager 575, Fluorimager SI, Fluorimager
(Molecular Dynamics, Krefeld), Strom (Molecular Dynamics),
FLA-2000 (Fuji, Tokio, Japón), FMBioll (Hitachi, a
través de Biozym Diagnostic GmbH, Hess. Oldendorf),
Fluor-S-Multilmager y Molecular
Imager FX (BioRad, Munich).
En el procedimiento se emplea especialmente ARNm
(también "muestra de ARNm"), el cual se aísla a partir de una
célula. Por lo regular, una muestra de este tipo es una muestra
heterogénea de ARNm (es decir, contiene una mezcla de los ARNm
existentes en esa célula en el momento del aislamiento del ARN).
Esta muestra heterogénea de ARNm representa por lo regular los
genes expresados por una determinada célula en un determinado
momento y bajo determinadas condiciones, es decir la composición de
la muestra de ARNm depende por ejemplo del tipo de célula, del
estado diferencial, del ciclo celular y/o de del tratamiento previo
de la célula, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
Una forma de ejecución preferida de la invención
se refiere al análisis de una muestra heterogénea de ARNm, en el
que
a) partiendo de una muestra heterogénea de ARNm
utilizando un primer cebador, el cual eventualmente está marcado
con un primer colorante, se prepara la primera cadena de una muestra
de ADN complementario (muestra heterogénea de ADNc),
\global\parskip1.000000\baselineskip
b) se prepara la segunda cadena de esta muestra
heterogénea de ADNc utilizando un segundo cebador, el cual
preferentemente está marcado con un segundo colorante,
c) la muestra heterogénea de ADNc se amplifica
utilizando el primer cebador, el cual está marcado con un primer
colorante ("primer cebador marcado") y el segundo cebador, el
cual está marcado con un segundo colorante ("segundo cebador
marcado"), y
d) se analiza la composición de la muestra
heterogénea de ADNc, amplificada y marcada.
En el caso de los genes expresados por una
determinada célula en un determinado momento son particularmente
interesantes, los que se expresan diferencialmente o,
respectivamente, regulados. Aquí es especialmente interesante el
análisis comparativo de genes expresados diferencialmente. Una forma
de ejecución particular de la invención se refiere a un
procedimiento correspondientemente análogo para el análisis
comparativo de dos o más muestras heterogéneas de ARNm.
\vskip1.000000\baselineskip
Una forma de ejecución particular de la
invención se refiere a un procedimiento para el análisis comparativo
de una primera muestra heterogénea de ARNm con una o varias
muestras heterogéneas de ARNm ulteriores, en el que
a) partiendo de dos o más muestras heterogéneas
de ARNm por cada una de estas muestras de ARNm y utilizando un
primer cebador, el cual eventualmente está marcado con un primer
colorante, se prepara la respectiva primera cadena de una muestra
heterogénea, complementaria de ADN (muestra heterogénea de
ADNc),
b) después, para cada una de estas muestras se
prepara la respectiva segunda cadena de la muestra heterogénea de
ADNc utilizando un segundo cebador, el cual preferentemente está
marcado con un segundo colorante,
c) cada una de las muestras heterogéneas de ADNc
se amplifica utilizando el primer cebador marcado y el segundo
cebador marcado, y
d) se analiza la composición de cada muestra
heterogénea de ADNc, amplificada y marcada y se compara la
composición de las muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra forma de ejecución particular de la
invención se refiere a un procedimiento, en el que
a) partiendo de dos o mas muestras heterogéneas
de ARNm por cada una de estas muestras de ARNm y utilizando un
primer cebador, el cual eventualmente está marcado con un primer
colorante, se prepara la respectiva primera cadena de una muestra
heterogénea, complementaria de ADN (muestra heterogénea de
ADNc),
b) después, para cada una de estas muestras se
prepara la respectiva segunda cadena de la muestra heterogénea de
ADNc utilizando un segundo cebador, el cual preferentemente está
marcado con un segundo colorante,
c) cada una de las muestras heterogéneas de ADNc
se amplifica utilizando el primer cebador marcado y el segundo
cebador marcado, y
d) se analiza en qué o en cual de las muestras
están contenidas o no moléculas individuales de ARNm.
A continuación de la amplificación del ADNc y,
eventualmente, del análisis de la composición del ADNc se determina
cuáles de los ADNc amplificados presentan qué tipo de composición de
cebador, es decir cuáles de los ADNc fueron amplificados sólo con
el primer cebador, cuáles fueron amplificados con el segundo cebador
y cuáles fueron amplificados con el primer y el segundo cebador
(pertenencia de los ADNc amplificados diferencialmente con respecto
a los grupos 1)+2), 3) y 4)). La invención se refiere también a
procedimientos más desarrollados, en los que en virtud de la
composición del cebador de los ADNc amplificados se seleccionan
determinados ADNc amplificados y eventualmente se siguen analizando
y/o se siguen utilizando. Además de esto, la invención se refiere a
procedimientos más desarrollados, en los que se analiza la
distribución de la composición del cebador del conjunto de ADNc
amplificados en relación a los grupos 1)-4).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de procedimientos más desarrollados
son:
Un procedimiento para el análisis de una muestra
de ARN, preferentemente una muestra de ARNm, en el que
a) partiendo de una muestra de ARN,
preferentemente una muestra de ARNm utilizando un primer cebador, el
cual eventualmente está marcado con un primer colorante, se prepara
la primera cadena de una muestra de ADN complementario (muestra de
ADNc),
b) se prepara la segunda cadena de esta muestra
de ADNc utilizando un segundo cebador, el cual preferentemente está
marcado con un segundo colorante,
c) la muestra de ADNc se amplifica utilizando el
primer cebador que está marcado con un primer colorante y el
segundo cebador, que está marcado con un segundo colorante, y
d) se analiza la composición de la muestra de
ADNc amplificada y marcada, y
e) se determina la composición del cebador de
los ADNc amplificados.
\vskip1.000000\baselineskip
Un procedimiento para el análisis de una muestra
de ARN, preferentemente una muestra de ARNm, en el que
a) partiendo de una muestra de ARN,
preferentemente una muestra de ARNm utilizando un primer cebador, el
cual eventualmente está marcado con un primer colorante, se prepara
la primera cadena de una muestra de ADN complementario (muestra de
ADNc),
b) se prepara la segunda cadena de esta muestra
de ADNc utilizando un segundo cebador, el cual preferentemente está
marcado con un segundo colorante,
c) la muestra de ADNc se amplifica utilizando el
primer cebador que está marcado con un primer colorante y el
segundo cebador, que está marcado con un segundo colorante, y
d) se analiza la composición de la muestra de
ADNc amplificada y marcada,
e) se determina la composición del cebador de
los ADNc amplificados, y
f) se seleccionan y se siguen analizando los
ADNc con una determinada composición de cebador, preferentemente
aquellos que contienen tanto el primer cebador como también el
segundo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ARN o, respectivamente, las muestras de ARNm
que se utilizan para el análisis comparativo o, respectivamente,
para el procedimiento, se pueden aislar, por ejemplo, a partir de
diferentes células, cuyo tipo de expresión se ha de comparar entre
sí. En este caso, se puede tratar, por ejemplo, de muestras de ARNm
que proceden de diferentes células o, respectivamente, tipos de
células, las cuales se diferencian en su estadio de diferenciación
y/o de desarrollo o, respectivamente en el estadio de su ciclo
celular o que tienen una historia previa diferente (por ejemplo
diferentes condiciones de cultivo (por ejemplo pH, temperatura,
composición), que fueron tratadas con principio activos
farmacológicos o con sustancias potenciadoras/inhibidoras o,
respectivamente desencadenantes de enfermedades (por ejemplo
sustancias carcinógenas o mutagénicas) o que estuvieron expuestas a
éstas (por ejemplo luz UV)...). Estas muestras de ARN o,
respectivamente, ARNm se pueden comparar con muestras de ARN o,
respectivamente, ARNm que no fueron expuestas a estas sustancias o
no en esta medida. Las muestras de ARN o, respectivamente, ARNm se
pueden aislar a partir de determinados tejidos. Por ejemplo, se
pueden analizar comparativamente tejido sano en comparación con
tejido patológico, tejido joven en comparación con tejido viejo,
tejido tratado en comparación con tejido no tratado, tejido inducido
en comparación con tejido no inducido, tejido de diferentes
estadios de desarrollo y/o del ciclo celular y/o de diferenciación,
representando tejido en este caso tejido, órgano, tipo de célula,
células de cultivo, células de una línea celular, células de un
individuo.
El procedimiento se puede emplear para el
análisis de expresiones génicas diferenciales (de un tejido o de
una célula). El procedimiento se puede utilizar especialmente para
el análisis comparativo de la expresión génica diferencial (de dos o
más tejidos o, respectivamente, células).
El procedimiento se puede utilizar para la
identificación y/o caracterización de principios activos
farmacológicos. El procedimiento se puede utilizar, además, para la
identificación y/o caracterización de genes diana o,
respectivamente, proteínas diana. Tales genes diana o,
respectivamente, proteínas diana son especialmente genes o,
respectivamente, proteínas a las que se atribuye una función (a ser
posible específica) en la prevención, en el origen y/o progresión
o, respectivamente, curación de una enfermedad, en el proceso de
diferenciación, por ejemplo de la diferenciación celular
(eventualmente antes o después de la inducción) y/o en el proceso de
diferenciación de una enfermedad, en el ciclo celular o,
respectivamente, en el control del ciclo celular y/o del desarrollo
celular, por ejemplo en el proceso de envejecimiento celular.
En contraposición con el DDRT radiactivo
convencional, el procedimiento, resulta ventajoso, puesto que la
utilización de nucleótidos marcados radiactivamente o,
respectivamente, de cebadores marcados radiactivamente puede ser
reemplazada por la utilización de cebadores marcados
fluorescentemente. En contraposición con los conocidos DDRT
fluorescentes, en el nuevo procedimiento aquí descrito (variante
DDRT) se marcan cada ADNc amplificado por la utilización de dos
cebadores marcados de diferente manera, preferentemente con
colorantes fluorescentes con diferentes espectros de excitación. De
esta manera, en el caso de una evaluación correspondiente, es
posible la detección de cada ADNc marcado, amplificado, es decir que
la complejidad de los DNc amplificados se mantiene y es detectable
(los productos 1), 2), 3), y 4) son detectables; por ejemplo, se
mantiene la complejidad de las bandas en el gel). Además de esto,
son posibles opiniones unívocas sobre la composición del cebador de
un ADNc marcado y amplificado (es decir, es posible la clasificación
con respecto a 1), 2), 3) y 4)). Por ello, en virtud de la
composición de su cebador, es posible seleccionar los ADNc que deben
seguir analizándose, por ejemplo ADNc amplificados que realmente
proceden de la región 3' de la secuencia génica. Por ello, con este
procedimiento que se basa en la utilización de dos cebadores
marcados de diferente manera se puede reducir la complejidad para
aislar, en ciertas condiciones, ADNc redundantes y analizarlos. A
pesar de ello, todos los DNAc amplificados se captan al mismo
tiempo, como en el DDRT radiactivo convencional, y se pueden
analizar, una propiedad que no se presenta en el DDRT fluorescente
convencional.
Objeto de la invención es también un equipo
(kit) para ensayos para llevar a cabo el procedimiento.
Las enzimas utilizadas proceden de Gibco
BRL/Life Technologies (Karlsruhe, Alemania) (Reverse Transkriptase
y Taq Polymerase) y Promega (Heidelberg) (RNAsin).
Termociclador: Perkin Elmer GeneAmp PCR System
2400 (Perkin Elmer, Weiterstadt).
Tanda de reacción: 1 \mul de ARN (100
ng-1 \mug de ARN completo o, respectivamente, 1
ng-10 ng de
ARN-poli-A/ARNm), 1 \mul de
cebador 1 (10 \muM de cebador 1, por ejemplo
(T)_{x}-MA-3' o
Cy5-(T)_{x}MA-3', con M=A,C,G y
X=11-15), 8 \mul de H_{2}O (exento de nucleasa).
La tanda de reacción se incubó durante 5 minutos a 70ºC y, después,
sobre hielo.
Después se añadieron 5 veces 4 \mul de tampón
RT (Gibco BRL), 2 \mul de DTT [0,1 M], 1 \mul de transcriptasa
inversa SuperScript [200U/\mul] (Gibco BRL), 1 \mul de ARNsin
[40U/\mul] y 2 \mul de dNTP [250 \muM].
La transcripción inversa se llevó a cabo durante
60 min a 37º-50ºC y después se desactivó la enzima a 70ºC
(10 min).
(10 min).
A 2 \mul de la tanda de RT del ejemplo 1 se
añadieron 10 veces 2 \mul de tampón PCR (Gibco BRL), 0,9 \mul
de detergente W-1 [1%] (Gibco BRL), 0,75 \mul de
MgCl_{2} [50 mM] (Gibco BRL), 1,6 \mul de dNTP [250 \muM],
0,5 \mul de polimerasa Taq de ADN [5U/\mul] (Gibco BRL), en
cada caso 1 \mul de cebador 1 y cebador 2 ([10 \muM]; por
ejemplo
Cy5-T7-(T)_{x}-MA-3'
como cebador 1 (siendo "T7" un corte de la secuencia del
promotor T7) y fluoresceína-(N)_{x} con
X=10-25 y N= A, C, G, T), 10,25 \mul de
H_{2}O.
El PCR se llevó a cabo bajo las siguientes
condiciones:
5 minutos a 94ºC
40 veces: 1 minuto a 94ºC, 2 minutos a
40ºC-60ºC,1 minuto a 72ºC
7 minutos a 72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de finalizar el PCR la tanda de reacción
se conserva a 4ºC y después se separa sobre un gel de secuenciación
(poliacrilamida 5%; urea 8M).
Los ADNc amplificados y marcados se pueden
detectar por ejemplo con un scanner, que se excita con una longitud
de onda de 430 +/- 30 nm (para fluoresceína: longitud de onda de
excitación 490 nm, longitud de onda de emisión 520 nm) y 635 +/- 5
nm (para Cy5: longitud de onda de excitación 650 nm, longitud de
onda de emisión 675 nm). Un ejemplo de ello es el Molecular
Dynamics Storm lmager.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LUGAR: Frankfurt
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO FEDERADO: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 65926
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 069-305-7072
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 069-35-7175
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: -
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESIGNACIÓN DE LA INVENCIÓN: Pantalla diferencial en dos colores como procedimiento para detectar genes regulados
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN LEGIBLE DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS REFERENTES A SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: genoma de DNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN:1..14
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTROS DATOS:/nota= "M = A, C, G; N = A, C, G, T"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTTTT TTMN
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS REFERENTES A SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: cadena individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: genoma de DNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTROS DATOS:/nota= "M = A, C, G; N = A, C, G, T"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTTTT TTTTTMN
\hfill
Claims (12)
1. Un procedimiento para el análisis de una
muestra de ARN, en el que
a) partiendo de una muestra de ARN se prepara la
primera cadena de una muestra complementaria de ADN (muestra ADNc)
utilizando un primer cebador, el cual eventualmente está marcado con
un primer colorante,
b) se prepara la segunda cadena de esta muestra
de ADNc utilizando un segundo cebador, el cual preferentemente está
marcado con un segundo colorante,
c) se amplifica la muestra de ADNc utilizando un
primer cebador, el cual es secuencialmente idéntico al primer
cebador de la etapa a), y el cual está marcado con un primer
colorante, y un segundo cebador, el cual es secuencialmente
idéntico al segundo cebador de la etapa c), y el cual está marcado
con un segundo colorante, y
d) se analiza la composición de la muestra de
ADNc amplificada y marcada.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el primer cebador contiene una secuencia
oligo(dT).
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que la secuencia oligo(dT) del
primer cebador se compone de al menos 10 nucleótidos de
timidina.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el primer cebador en el extremo 3'
de la secuencia oligo(dT) contiene al menos dos nucleótidos
más, los cuales no pertenecen a la secuencia oligo(dT).
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer cebador representa una
mezcla heterogénea de moléculas de cebador, las cuales se
diferencian en la posición M o N de la secuencia de los nucleótidos
que no pertenecen a la secuencia oligo(dT).
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el segundo cebador tiene una
longitud de al menos 6 nucleótidos.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el primer y segundo colorante son
colorantes fluorescentes diferentes.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que los colorantes fluorescentes se
seleccionan a partir de los colorantes fluorescentes Cy2, Cy3, Cy5,
FAM, 6-FAM, FITC, fluoresceína, HEX,
5-IAF, TAMRA, TET, XRITC, ROX, Alexa488, Alexa532,
Alexa546, Alexa594, TexasRed y Lisamina.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que junto con una primera muestra de
ARN se analizan comparativamente, de manera análoga, una o varias
muestras más de ARN.
10. Utilización de un procedimiento según una de
las reivindicaciones 1 a 9 para el análisis de la expresión génica
diferencial.
11. Utilización de un procedimiento según una de
las reivindicaciones 1 a 9 para la identificación y/o
caracterización de principios activos farmacológicos.
12. Utilización de un procedimiento según una de
las reivindicaciones 1 a 9 para la identificación de genes
diana.
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