JP2008161165A

JP2008161165A - 競合オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子検出法

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Publication number: JP2008161165A
Application number: JP2006357509A
Authority: JP
Inventors: Yasumasa Mitani; 康正三谷; Takeshi Kikuchi; 菊池　　健
Original assignee: Dnaform KK
Current assignee: Dnaform KK
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2008-07-17

Abstract

【課題】本発明は、等温増幅法を用いた遺伝子の検出方法において、非標的塩基配列上からの相補鎖合成を様々な核酸配列においても確実に防止し、より正確かつ感度の良い遺伝子検出方法を提供する。
【解決手段】等温増幅法を用いた遺伝子の検出方法において、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止することを特徴とする、遺伝子の検出方法。
【選択図】図４

Description

本発明は、等温増幅法を用いた遺伝子の検出法において、非標的塩基配列上からの相補鎖合成を様々な核酸配列においても確実に防止し、より正確かつ感度の良い遺伝子検出方法を提供する。より詳細には、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いて、該非標的塩基配列における相補鎖合成を防止する方法に関する。

遺伝子工学分野においては、遺伝的な特徴を直接的に分析しうる方法として、標的塩基配列の相補性に基づく分析が知られている。このような分析では、試料中に存在する標的塩基配列のコピー数が少ない場合には、一般にその検出が容易ではないため、標的塩基配列そのものを予め増幅することが必要となる。特に、特異性良く標的塩基配列を増幅することが重要である。

さらに、標的塩基配列上における遺伝子の変異は、タンパク質の構造的・機能的変化の原因となる。そのため、変異の検出は遺伝的疾患の診断や治療に対して有用な情報を与えとされており、その変異のうち、ある集団内で１％以上の頻度で存在する変異を多型、もしくは遺伝子多型と言い、特に近年、一塩基多型（以下、ＳＮＰｓ；ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓと省略する）の変化により様々な疾患に関与すると言われている。

一方、単にＳＮＰと疾患の連鎖関係のみならず、特定の薬剤の代謝に関わるＳＮＰを診断すること、副作用を生じる恐れのあるような薬剤の投薬を判断したり、投薬量を変更したりするような薬剤関連のＳＮＰ診断も重要になりつつある。さらに、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ヘリコバクター・ピロリ等の細菌やウイルスのサブタイプも一種の多型と考えられているが、各種薬剤の治療効果はこれらのサブタイプによって異なる。特にピロリ菌などの除菌に関与する菌の特定の変異を診断することで除菌治療効果が効果的かどうか判断する診断方法も確立されつつある。よって、菌やウイルス等の多型を調べることも、治療方法の選択、特に最適な薬剤の決定において重要な情報を与えると考えられる。

標的塩基配列の増幅（核酸増幅）は、主に、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により行われ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法［特許文献１］、［特許文献２］、［特許文献３］さらには、ＰＣＲ法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法［非特許文献１］がある。これらの方法は、鋳型となる二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（変性）、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、およびプライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つの段階からなる反応を繰り返すことにより、ＤＮＡまたはＲＮＡからの目的遺伝子の増幅を可能とするものである。これらの方法では、反応溶液を上記３段階のそれそれに適した温度に調節する計３工程の繰り返しが必要とされる。さらに、それを応用した標的塩基配列の変異を検出する方法としては、検出すべき変異を含む配列に相補的な配列を有するように設計したプライマーを用いてＰＣＲを行う方法［非特許文献２］、［非特許文献３］が知られているが、ＰＣＲに基づく塩基配列の検出は、常にプライマーの非特異的なアニールによる問題が伴う［非特許文献４］。つまり、完全に相補的な塩基配列でなくてもプライマーがアニールして相補鎖が合成され、指数的な増幅が生じる。よって通常の条件ではＰＣＲ法によって変異やＳＮＰｓのような１塩基の相違を識別することは困難である。

さらに、核酸増幅法による変異型遺伝子の検出を行なう場合には、利用する核酸増幅法の特異性が特に重要となる。一方で、核酸増幅方法としては、ＰＣＲ法以外にも様々な方法が開発されており、例えば、鎖置換増幅法［特許文献４］、自己維持配列増幅法（３ＳＲ法）、Ｑβレプリカーゼ法［特許文献５］、ＮＡＳＢＡ法［特許文献６］、ＬＡＭＰ法［特許文献７］、ＩＣＡＮ法［特許文献８］、ローリングサークル法［特許文献９］に記載の方法などが知られているが、どれも完全な方法とは言いがたい。

以上の問題点を解決すべく、本発明者らはＳＭＡＰ法（ＳＭａｒｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｓｓ法）［特許文献１０］を用いた正確かつ感度や特異性のよい検出方法を報告した。この方法では、標的塩基配列の識別のための配列がプライマーからの相補鎖合成によって初めてもたらされ、しかもこの配列がプライマーからの増幅産物に折り返し、その増幅の特異性をあげるとともに、自身を鋳型とする相補鎖合成の起点となるため、標的塩基配列に対し、正確に増幅させることが可能となる。しかし、このような方法を用いても、核酸の塩基配列によってはプライマーの非標的塩基配列上への非特異的なアニールによる相補鎖合成を完全に防止することは困難であった。
米国特許第４６８３１９５号明細書米国特許第４６８３２０２号明細書米国特許第４８００１５９号明細書ＳＤＡ法；特公平７−１１４７１８号公報日本国特許第２７１０１５９号公報日本国特許第２６５０１５９号公報国際公開第００／２８０８２号国際公開第０２／１６６３９号国際公開第２００４／０４００１９号特願２００５−５１６６４２号ＲＴ−ＰＣＲ法；ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，ｐｐ１４６−１５２，１９９２ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１７：ｐ２５０３１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５：ｐ５３５１９８９Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ１１４：ｐ１０５１９８９Ｓ．Ｋｗｏｋｅｔ．ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１８：ｐ９９９１９９０

本発明は、等温増幅法を用いた遺伝子の検出方法において、非標的塩基配列上からの相補鎖合成を様々な核酸配列においても確実に防止し、より正確かつ感度の良い遺伝子検出方法を提供する。

本発明は以下の（１）〜（９）を提供する。（１）等温増幅法を用いた遺伝子の検出方法において、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止することを特徴とする、遺伝子の検出方法。（２）等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列における変異部位に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止することを特徴とする、（１）記載の方法。（３）等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列における変異部位に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、標的塩基配列にアニールしうるプライマーまたは増幅産物の３’末端が、非標的塩基配列にアニーリングすることを防止することを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。（４）前記の等温増幅法がＳＭＡＰ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＩＣＡＮ法、ＴＲＣ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法のいずれかである、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。（５）前記オリゴヌクレオチドが３’末端より伸長反応が起こらないように設計されたオリゴヌクレオチドである、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。（６）前記オリゴヌクレオチドがその３’末端より伸長反応が起こらないように修飾された、または、オリゴヌクレオチドの３’末端より伸長反応が起こらないように標的塩基配列と非相同的な配列をもたせたものである、（５）に記載の方法。（７）前記修飾が３’末端水酸基のアミノ化またはリン酸化である、（６）に記載の方法。（８）前記オリゴヌクレオチドが、核酸またはペプチド核酸またはＬＮＡまたは非天然核酸、もしくは、それら２種類以上からなる混合されたものである、（１）〜（７）のいずれか１つに記載の方法。（９）検出すべき変異が１塩基多型または点変異または挿入または欠失または繰り返し配列である、（１）〜（８）のいずれか１つに記載の方法。

本発明により、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いて、該非標的塩基配列における相補鎖合成を防止する効果が得られる。本法は、感染症から、ＳＮＰ、変異など、幅広い増幅、検出の分野に応用可能なものである。

以下、本発明について詳細に説明する。ＳＭＡＰ法とは本発明者らが発明した等温核酸増幅法であり、鎖置換反応を利用した核酸の増幅法において、標的核酸が増幅された場合にのみステム−ループ形成可能なプライマーを特定の条件を満たすように設計し、このプライマーと５’末端部分に折返し配列を有するプライマーとを組み合わせて用いることにより、特異的かつ効率的に標的核酸を増幅できることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。ＳＭＡＰ法は、標的核酸を特異的かつ効率的に増幅しうるプライマーセット、およびこれを用いた核酸増幅法を提供することを目的とする。

ＳＭＡＰ法によるプライマーセットは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるものであり、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなるものであるプライマーセットである。

さらに、本発明による核酸増幅法は、鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、（ａ）標的核酸配列を含む鋳型核酸を用意する工程、（ｂ）本発明によるプライマーセットを用意する工程、および（ｃ）前記鋳型核酸の存在下において、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程、を含んでなるものである。

本発明によれば、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、等温条件下で連続して標的核酸を合成することが可能となる。従って、本発明によるプライマーセットおよびそれを用いた核酸増幅法は、サーマルサイクラー等の特別な装置を必要とせず、また、温度調整に要する時間も必要ないため、短時間で増幅産物を得ることを可能とする。さらに、本発明によるプライマーセットは高度に特異的な核酸増幅を可能とするため、これを用いることにより、遺伝子中における変異、特に一塩基変異の有無、特定の核酸配列中における配列の欠失または挿入の有無などを、増幅産物の検出によって判定することが可能となる。

さらに、本発明者らは、鋳型における変異の存在または不存在のいずれかによって鋳型とのミスマッチを生じる核酸試薬による等温での核酸増幅反応を利用した変異検出法において、該核酸増幅反応をミスマッチ識別能を有する物質の存在下で行なうことにより、より正確な変異の検出が可能となることを見出した。

従って、本発明の第二の態様によれば、ミスマッチ結合タンパク質などのミスマッチ識別能を有する物質の存在下において、鋳型における変異の存在または不存在のいずれかによって鋳型とのミスマッチを生じる核酸試薬を用いた等温での核酸増幅反応を行なうことにより、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法が提供される。

ＳＭＡＰ法におけるプライマーセットは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるものである。該プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるものである。また、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなるものである。

本発明において「標的塩基配列」、「標的核酸」、「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または該配列を有する核酸を意味し、さらに、検出すべき変異や多型が含まれる塩基配列をも意味する。言いかえれば、本発明におけるプライマーがアニールする領域に挟まれて存在する塩基配列が、本発明における標的塩基配列を構成する。それに対し、非標的塩基配列とは、検出対象ではない塩基配列を意味し、状況によっては、変異や多型が含まれる塩基配列を意味する。言いかえれば、検出対象ではない核酸試料における上記「標的塩基配列」に相当する部分の配列が、本発明の非標的塩基配列を構成すると言える。

本発明の検出対象が野性型である場合、野性型の核酸試料中の変異部位を含む塩基配列は「標的塩基配列」であり、変異型の核酸試料中の変異部位を含む塩基配列は「非標的塩基配列」となる。一方、検出対象が変異型である場合は、変異型の核酸試料中の変異部位を含む塩基配列は「標的塩基配列」であり、野性型の核酸試料中の変異部位を含む塩基配列は「非標的塩基配列」となる。本発明における（非）標的塩基配列とは、プライマーが増幅するべき配列でない部分、さらにはセンス鎖の塩基配列に加えて、その相補鎖、すなわちアンチセンス鎖の塩基配列も含む。変異、または変異部位とは、標的塩基配列および非標的塩基配列上において変異を生じうる部位の塩基配列で、該変異には多型、ＳＮＰｓが含まれる。また点変異とは、１塩基変異を生じることで、そこからコードされるアミノ酸が置換されるものや置換されないものも含み、さらに、１塩基の変異のみならず、数塩基の変異を伴う場合もある。

本発明において「変異」とは、核酸配列中に対照核酸配列とは異なる塩基（二本鎖核酸の場合には塩基対）が存在することを意味する。また、本発明において「対照核酸」とは、ある特定の塩基配列に関して、標準的な塩基配列、例えば標準的な遺伝子型、であるとされる野生型（Ｗｉｌｄｔｙｐｅ。正常型（ｎｏｒｍａｌｔｙｐｅ）とも称される。）の配列を有する核酸をいう。これに対し、「被検核酸」とは、本発明による変異検出法において、対照核酸と異なる塩基（変異）を有するか否かを調べる対象となる核酸を意味し、換言すれば、核酸試料中に存在する核酸であって、変異に係る塩基を除いて対照核酸と同一の配列を有するものを意味する。さらに、本発明において「変異に係る塩基」または「変異に係るヌクレオチド残基」とは、核酸中における変異の部位に存在する塩基またはヌクレオチド残基を意味し、従って、対照核酸の変異部位に含まれる塩基またはヌクレオチド残基および変異型の核酸の変異部位に含まれる塩基またはヌクレオチド残基のどちらをも意味する。例えば、遺伝子病が疑われる患者の遺伝子における変異を検出する場合において、変異を有することが疑われる患者の遺伝子は被検核酸であり、この遺伝子に対応する健常者の遺伝子は対照核酸である。

鋳型とは、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ「相補鎖」は、鋳型に対応する鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることができる。また、核酸の合成とは、合成起点となったオリゴヌクレオチドからの核酸の伸長を意味する。合成に加えて、更に他の核酸の生成と、この生成された核酸の伸長反応とが連続して起きるとき、一連の反応を総合して増幅という。

本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（ＷｈｉｔｅｈｅａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。さらに、アニールとハイブリダイズは、核酸がワトソン−クリックのモデルに基づく塩基対結合によって２重らせん構造（ｄｏｕｂｌｅｈｅｌｉｘｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成することを意味する。したがって、塩基対結合を構成する核酸鎖が１本鎖であっても、分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、アニール、あるいはハイブリダイズである。本発明において、アニールとハイブリダイズは、核酸が塩基対結合による２重らせん構造を構成する点で同義である。塩基対結合した３’末端が相補鎖合成の起点となるときに、特にアニールという場合がある。ただし、ハイブリダイズが相補鎖合成の起点となることを否定するものではない。

核酸、或いは、核酸試料はＤＮＡ、またはＲＮＡ、あるいはそれらのキメラ分子であってもよく、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。また部分的に、あるいは全体が完全に人工的な構造からなるヌクレオチド誘導体でも、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、あるいは相補鎖合成のための鋳型として機能する限り、本発明の核酸に含まれる。人工塩基として、例えば、２−ａｍｉｎｏ−６−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｕｒｉｎｅｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｏｎｅ、５−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｏｎｅ、２−ａｍｉｎｏ−６−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）ｐｕｒｉｎｅ、ｐｙｒｒｏｌｅ−２−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ、９−Ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏ［（４，５）−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ、５−ｉｏｄｏ−２−ｏｘｏ（１Ｈ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ２−ｏｘｏ−（１Ｈ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ、２−ａｍｉｎｏ−６−（２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）ｐｕｒｉｎｅ、７−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅなどがあげられるが、これに限定するものではない。本発明において用いられる「核酸」という用語は、任意の未修飾ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。被検核酸および対照核酸は、典型的には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなどのＤＮＡ、またはｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、合成ＲＮＡなどのＲＮＡである。本発明における核酸の構成塩基数は制限されない。核酸は、用語ポリヌクレオチドと同義であり、オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの中でも特に構成塩基数が少ないものを示す用語として用いる。一般には２〜１００塩基長、より一般的には２〜５０塩基長程度のポリヌクレオチドを指してオリゴヌクレオチドと呼ぶが、これらの数値に限定されるものではない。ポリヌクレオチドという用語は、便宜的に、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ−オリゴ核酸などの人工合成核酸をも含むものとする。被検核酸および対照核酸は、試験実施者が自由に選択することができる。さらに、検出を行う際には、これらの核酸が混在していてもよい。

プライマーセットに含まれるプライマーやプローブは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成される。本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオチド三リン酸をいい、例えば、ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α−チオ−リボヌクレオチド）等がある。

また、プライマーやプローブには、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブ、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーや、そのプローブ等も含まれる。

プライマーセットに含まれるプライマーやプローブは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ＡＢＩ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍＩｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止する。さらに、遺伝子の変異検出方法においては、非標的塩基配列における変異部位に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止する。より詳細には、非標的塩基配列における変異部位に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチド（競合オリゴヌクレオチド）を用いることにより、標的塩基配列にアニールしうるプライマーまたは増幅産物の３’末端が、非標的塩基配列にアニーリングすることを防止する。これらのオリゴヌクレオチドは特異的アニールのために、非標的塩基配列上の特定部位を含む５〜１００塩基長の領域、特に１０〜３０塩基長の領域に対し、これと相補的配列を含むことが好ましい。

前記オリゴヌクレオチドは、３’末端より伸長反応が起こらないように設計されたオリゴヌクレオチドである。より詳細には、前記オリゴヌクレオチドがその３’末端より伸長反応が起こらないように修飾された、または、オリゴヌクレオチドの３’末端より伸長反応が起こらないように標的塩基配列と非相同的な配列をもたせたものである。該修飾塩基の部位は特に限定されないが、３’末端の塩基であることが好ましい。また、塩基の修飾方法は特に限定されず、アミノ化またはリン酸化であることが好ましいが、これに限定するものではない。例えば、ビオチン化、蛍光色素、リン酸化、チオール化、アミノ化、ホスホロチオエート化、ハロゲン化などによる塩基の修飾でもかまはない。

前記オリゴヌクレオチドの３’末端を修飾する場合、変異部位は競合オリゴヌクレオチドの中央付近に存在することが好ましいが、これに限定されるものではない。

本発明は、等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出法において、非標的塩基配列上からの相補鎖合成を様々な核酸配列においても確実に防止する。より詳細には、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いて、該非標的塩基配列における相補鎖合成を防止する。さらに詳細には、非標的塩基配列に特異的にアニールしうる競合オリゴヌクレオチドを用いて、該非標的塩基配列に特異的でないプライマーがアニーリングし、非特異的な相補鎖合成することを防止する。

ペプチド核酸からなる競合オリゴヌクレオチドは、本発明において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を競合オリゴヌクレオチドの全部、もしくは、その一部として用いることができる。ＰＮＡは、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース主鎖が、ペプチド主鎖で置換された構造を有する。ペプチド主鎖としては、アミド結合によって結合したＮ−（２−アミノエチル）グリシンの反復単位が挙げられる。ＰＮＡのペプチド主鎖に結合させる塩基としては、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、イノシン、ウラシル、５−メチルシトシン、チオウラシルおよび２，６−ジアミノプリンなどの天然に存在する塩基、ブロモチミン、アザアデニンおよびアザグアニンなどの人工塩基が挙げられるが、これのみに限定するものではない。

前記ＰＮＡは、公知の製造法によって、各核酸塩基を結合させたモノマーを製造後、得られたモノマーを、公知の一般的ペプチド合成方法に従い反応させることができる。固相合成法に従い、自動シンセサイザーを用いて、所望の塩基配列となるように合成させればよい。上記方法は、市販の試薬および原料を用いることが可能であり、市販の試薬を常法に従い適当に誘導体化して、例えば原料とするアミノ酸の反応に関与しないＮ末端、Ｃ末端、側鎖官能基等の保護反応を行なって使用することができる。得られた核酸塩基結合ＰＮＡは、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動クロマトグラフィー、溶媒抽出、塩析等の通常の分離手段により容易に単離精製することができる。

ＰＮＡは通常のオリゴヌクレオチドに比較して核酸に対する結合力が強いため、オリゴの設計条件によっては、より確実な変異部位の増幅抑制が可能となる。ＰＮＡを競合オリゴヌクレオチドとして用いる場合、非標的塩基配列上の変異部位に相補的な配列はその３’末端でも５’末端でも中央付近であってもよい。また、該ＰＮＡからなる競合オリゴヌクレオチドの長さは、５〜５０塩基、より望ましくは７〜２５塩基長であることが好ましいが、これに限定されるものではない。

ＬＮＡは、糖−リン酸骨格においてリボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子間がメチレン架橋で結合された、２つの環状構造を持つ核酸である。ＬＮＡを含むオリゴがＤＮＡとアニールすると二本鎖のコンフォメーションが変化し、熱安定性が上昇する。ＬＮＡは通常のオリゴヌクレオチドに比較して核酸に対する結合力が強いため、オリゴの設計条件によっては、より確実な変異部位のブロックが可能となる。ＬＮＡを競合オリゴヌクレオチドとして用いる場合、非標的塩基配列上の変異部位に相補的な配列はその３’末端でも５’末端でも中央付近であってもよい。また、該ＬＮＡからなるブロックオリゴの長さは、５〜５０塩基、より望ましくは７〜２５塩基長であることが好ましいが、これに限定されるものではない。ＬＮＡのみで合成されたオリゴヌクレオチドでも、ＬＮＡを一部に含むオリゴヌクレオチド、さらには、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他、人工的な核酸などを複数組み合わせたオリゴヌクレオチドを本発明の競合オリゴヌクレオチドとして用いてもかまわない。

本発明の変異検出方法において、前記検出は内部標準と比較して行うことも可能である。内部標準は、たとえば同一の核酸試料に由来し変異や多型が存在しないことが明らかな核酸を用いることができる。ゲノムの塩基配列の解析を目的とする場合には、ゲノムにおいて変異や多型が知られていない塩基配列を内部標準として利用することが望ましい。あるいはｍＲＮＡを鋳型として本発明の検出方法を行う場合には、たとえばいずれの細胞でも一定の発現量が観察される遺伝子を内部標準とすることが望ましい。これら内部標準に対しても、その塩基配列を標的塩基配列として本発明と同じ条件で相補鎖合成反応を行い、その生成物の量を対照として変異を検出すべき塩基配列から得られた結果と比較することが可能である。

本発明の変異検出方法の利用本発明の検出方法は、あらゆる核酸に対して応用することが可能である。たとえば原核細胞や真核細胞のゲノム、ウイルスのゲノムＤＮＡやゲノムＲＮＡ、マイコプラズマやリケッチアのような細胞内寄生体のゲノム、これらの生物種のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ、更にこれらの遺伝子ソースから誘導されたライブラリーや、ライブラリーから単離されたクローンなどを示すことが可能である。変異や多型を検出すべき遺伝子がＲＮＡであれば、逆転写酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼの作用によってｃＤＮＡとすることが可能である。本発明の試料とする核酸は、一般に生物学的な試料に含まれる。生物学的試料とは、動物、植物、あるいは微生物の組織、細胞、培養物、排泄物あるいはそれらの抽出物を示すことが可能である。本発明は、これらの生物学的試料に含まれる、その生物に由来する核酸、あるいはその生物を宿主としている感染性の寄生生物、微生物、並びにウイルスに由来する核酸等を検出対象とすることが可能である。また本発明における核酸は、前記生物学的試料に含まれる核酸から誘導されたものであってもよい。たとえば、ｍＲＮＡをもとに合成されたｃＤＮＡや、生物学的試料に由来する核酸をもとに増幅された核酸等を本発明による検出方法の試料とすることが可能である。これらの遺伝子は、変性によって１本鎖とすることにより、あるいは後で述べるように２本鎖のまま、本発明による検出方法の試料とすることが可能である。

核酸増幅反応において用いられる、標的核酸配列を含む鋳型核酸、または核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または生体由来試料、食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料から調製することができる。

逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ）、例えばＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼ、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼ等も挙げられる。例えば、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが可能である。

核酸増幅反応では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行なうこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。

核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（Ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｅｒＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｍＤＮＡポリメラーゼ、ＡａｃＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。

核酸増幅反応において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。

核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Ｔｍ）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。

さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。

さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。

本発明によるオリゴヌクレオチド、プローブならびにプライマーセットを用いる核酸増幅反応は、等温で実施可能である。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、この核酸増幅反応は、鋳型核酸または核酸試料と本発明によるプローブならびにプライマーセットとを含んでなる核酸増幅用溶液を用意する工程、およびこの核酸増幅用溶液を等温でインキュベートする工程を含んでなる。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。

一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プローブまたはプライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプローブまたはプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プローブまたはプライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。

上記の核酸増幅反応においては、非天然ヌクレオチドを含む核酸を鋳型核酸とすることも可能である。本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドに含まれる塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンもしくはウラシル）以外の塩基を含むヌクレオチドであって、核酸配列中に取り込まれうるものを意味し、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、ｉｓｏＧ，ｉｓｏＣ等が挙げられる。非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅には、一般に、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる。一方で、上記核酸増幅反応は、例えば５０℃前後の等温で行うことが可能であるため、従来のＰＣＲ法と比較して核酸増幅酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）が失活する可能性が低い。従って、本発明によるプライマーセットによる核酸増幅反応は、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅にも有効である。非天然ヌクレオチドを含む核酸の増幅に用いられる酵素は、そのような標的核酸を増幅可能なものであればよく、特に限定されないが、特に取り込み効率の観点から、Ｙ１８８Ｌ／Ｅ４７８Ｑ変異型ＨＩＶＩ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、９°ＮＤＮＡポリメラーゼ、ＨｏｔＴｕｂＤＮＡポリメラーゼ等が好適である。さらに、核酸増幅酵素の耐熱性を向上させる物質、例えばトレハロースなど、を反応溶液に添加することもでき、これにより、より効率的に非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅を行うことができる。

本発明による核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出が可能である。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマトグラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。さらに、本発明による核酸増幅法では、核酸増幅反応における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例えば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法がある。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬（例えば、ＥｒｉｏｃｈｒｏｍｅＢｌａｃｋＴ、ＨｙｄｒｏｘｙＮａｐｈｔｈｏｌＢｌｕｅ等）を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察することにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、Ｃａｌｃｅｉｎなどを利用することにより、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。

本発明による核酸増幅法ならびに検出においては、通常のｄＮＴＰの代わりに、ビオチンや蛍光物質で標識された塩基を基質として使用することができ、これにより、ビオチンや蛍光物質で標識されたＤＮＡプローブを調製することも可能である。さらには、それらビオチンや標識物質などの何らかの構造を介して増幅産物の有無を確認することも可能である。

さらに、本発明によるプライマーセットは、ＬＡＭＰ法またはＳＤＡ法において利用される「アウタープライマー」を含むものとすることができ、これにより、核酸増幅の効率を向上させることが可能となる。アウタープライマーとしては、鋳型核酸上において標的核酸配列の外側に位置する部分に相補鎖合成起点を提供しうるプライマーを用いることができる。

本発明による核酸増幅法により、ＤＮＡチップに固定するための一本鎖核酸、塩基配列決定のための一本鎖ＤＮＡプローブ、長鎖ＰＣＲ法のためのメガプライマー等を簡便かつ迅速に作製することができる。また、本発明による核酸増幅法により、目的に応じて、標的核酸のセンス配列のみまたはアンチセンス配列のみを選択的に増幅することも可能である。

本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応を利用して、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定することが可能である。この目的のためには、変異部位が前記配列（Ａ）、前記配列（Ｂ）または前記配列（Ｃ）に含まれるようにプライマーセットを設計することができ、これにより、増幅産物の有無を確認することによって前記変異の有無を判定することが可能となる。従って、本発明によれば、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、（ａ）核酸試料を用意する工程、（ｂ）本発明によるプライマーセットであって、前記変異を有するか、または該変異を有さない核酸配列を標的核酸配列とし、該変異に係るヌクレオチド残基が配列（Ａ）、配列（Ｂ）または配列（Ｃ）に含まれるように設計されたプライマーセットと、競合オリゴヌクレオチドを用意する工程、および（ｃ）前記核酸試料の存在下において、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程、を含んでなる方法が提供される。

本発明による変異検出法では、目的とする変異を有する核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が該変異の存在を示し、増幅産物の不在または減少が該変異の不在を示す。一方で、目的とする変異を有さない核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が該変異の不在を示し、増幅産物の不在または減少が該変異の存在を示す。ここで、「増幅産物の減少」とは、得られた増幅産物の量が、核酸試料中に標的核酸配列が存在する場合に得られる増幅産物の量に比較して減少していることを意味する。

本発明の一つの実施態様によれば、本発明による変異検出法の工程（ｂ）において、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（Ａ）に含まれるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異に係るヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列（Ａ）の５’末端（第一のプライマーにおける３’末端に対応する）に含まれるものとされる。また、第一のプライマーに含まれる配列（Ａｃ’）は、前記配列（Ａ）に相補的な配列とすることが好ましい。

本発明の他の実施態様によれば、本発明による変異検出法の工程（ｂ）において、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（Ｃ）に含まれるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（Ｃ）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（Ｃ）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異に係るヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列（Ｃ）の５’末端（第二のプライマーにおける３’末端に対応する）に含まれるものとされる。また、第二のプライマーに含まれる配列（Ｃｃ’）は、前記配列（Ｃ）に相補的な配列とすることが好ましい。

本発明の他の実施態様によれば、本発明による変異検出法の工程（ｂ）において、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（Ｂ）に含まれるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（Ｂ’）が伸長鎖上の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。また、第一のプライマーに含まれる配列（Ｂ’）は、前記配列（Ｂ）と同一の配列とすることが好ましい。

上述の配列（Ｂ）における変異の検出について、さらに詳細に説明する。図１に示す作用機序において、配列（Ｂ’）が配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする現象は、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。第一のプライマーによる伸長反応によって生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。しかし、このステム−ループ構造は安定的には存在せず、特に、そのステムを形成する配列（Ｂ’）と配列（Ｂｃ）部分との間に相補的でないヌクレオチドが存在する場合には、非常に不安定となり、あるいは、ステムが全く形成されない。この場合には、鋳型上の配列（Ａ）とプライマー中の配列（Ａｃ’）とのハイブリダイゼーションの方が優位となり、配列（Ａ）の部分が一本鎖とならないため、次の第一のプライマーがアニーリングできなくなる。そのため、図１に示される連続した反応を起こすことが極めて困難となる。

被検核酸を含む核酸試料は、被検体、例えばヒトまたは非ヒト動物から取得することができる。その場合には、該被検体からの所望の組織、臓器および細胞などのサンプルから当技術分野において公知の方法により核酸を抽出することができ、必要に応じて、抽出の後に核酸断片の大きさおよび精製純度などの条件を適度な状態に調整することもできる。その後、さらに、一般的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによる増幅反応を行うことにより、核酸試料中の被検核酸を増幅してもよい。

被検核酸および対照核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明において用いられる「二本鎖核酸」という用語は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡのいずれをも意味する。二本鎖核酸は、そのまま核酸試料として用いてもよいし、ファージまたはプラスミドなどのベクターで増幅されたものを用いてもよい。

本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による変異検出法における核酸増幅反応は、競合オリゴヌクレオチドやミスマッチ認識タンパク質の存在下で行なわれ、これにより、より正確に変異を検出することが可能となる。

ＤＮＡの２本鎖において部分的に対合できない（ミスマッチ）塩基対が生じたときに、細菌や酵母等には、これを修復するための機構があることが既に知られている。この修復は「ミスマッチ結合タンパク質」（「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される）と呼ばれるタンパク質によって行なわれるものであり、ＭｕｔＳタンパク質、ＭｕｔＭタンパク質、ＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ）に結合したＭｕｔＳタンパク質などの様々なミスマッチ結合タンパクの使用が報告されている。さらに、近年、ミスマッチ結合タンパク質を利用してミスマッチを検出する遺伝子診断法が開発されている。核酸中における特定のヌクレオチドにおける多型および突然変異の検出法としては、例えば、変異のない対照核酸と、変異が存在することが疑われる被検核酸とをハイブリダイズさせ、そこにミスマッチ認識タンパク質を導入することによりミスマッチを検出する方法が知られている。

本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組み合わせ、またはＧとＣの組み合わせ）ではないことを意味する。ミスマッチには、１つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、１または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。

本発明による変異検出法においても、これらのミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、その特異性（正確さ）を向上させることができる。本発明による変異検出法では、核酸試料に含まれる被検核酸が、変異部位において標的核酸配列と異なるヌクレオチドを有する場合には、第一のプライマーに含まれる配列（Ａｃ’）もしくは第二のプライマーに含まれる配列（Ｃｃ’）の被検核酸へのハイブリダイゼーションが妨げられるか、または第一のプライマーに含まれる配列（Ｂ’）によるステム−ループ構造の形成が妨げられるため、増幅産物が得られないか、または増幅産物の量が減少することとなる。しかしながら、これらのハイブリダイゼーションまたはステム−ループ構造の形成が完全には妨げられない場合もあり、その場合には、これらの配列において少量のヘテロ二本鎖構造が生ずる。本発明において「ヘテロ二本鎖構造」とは、実質的には相補的な二本鎖構造であるが、１または複数のミスマッチを有することにより非相補的な領域を含む二本鎖構造を意味する。このようなヘテロ二本鎖構造により、本来的には生成しないはずの誤った増幅産物がもたらされる。そこで、核酸増幅反応に用いられる反応液中にミスマッチ結合タンパク質を添加しておけば、上記のようなヘテロ二本鎖構造にこのミスマッチ結合タンパク質が結合し、その後の増幅反応が妨げられる。従って、ミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能となる。

本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよく、例えば、当業者に公知のいずれのものであってもよい。また、本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。タンパク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの方法が知られている。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＭ、ＭｕｔＳおよびそれらの類似体など、多くのものが知られている。本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、または酵母に由来するものとされ、より好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、またはＭｕｔＬとされる。

ミスマッチ結合タンパク質は、一本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は、一本鎖結合タンパク質により阻害されることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、一本鎖結合タンパク質を併用することが好ましい。また、ミスマッチ結合タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の誤った結合は、あらかじめ活性剤を用いてミスマッチ結合タンパク質を活性化しておくことにより阻害されることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、活性剤によりあらかじめ活性化されたものを用いることが好ましい。

一本鎖核酸にミスマッチ結合タンパク質が結合するのを阻害するために使用する一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、当技術分野において公知の任意のＳＳＢとすることができる。好ましいＳＳＢとしては、エシエリキア・コリ、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、およびＴ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質、ならびに他の種に由来するこれらの相当物が挙げられる。この場合に使用されるミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、レゾルバーゼなどが挙げられ、好ましくはＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物とされ、より好ましくはＭｕｔＳとされる。

ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤は、当業者であれば適宜選択することができるため、特に限定されないが、好ましくは、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＡＤＰ（アデノシン５’−二リン酸）、ＡＴＰ−γ−Ｓ（アデノシン５’−Ｏ−（３−チオ三リン酸））、ＡＭＰ−ＰＮＰ（アデノシン５’−［β，γ−イミド］三リン酸）などの化合物とされ、あるいは、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされる。ミスマッチ結合タンパク質の活性化は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤とを、室温で数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。

本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による変異検出法は、遺伝子病の罹病が疑われる被検体において特定の遺伝子が変異を有するか否かを調べるため、患者由来の遺伝子と健常者の遺伝子が同一の塩基配列を有するか否かを調べるために利用することができる。本発明による変異検出法においては、被検遺伝子のいかなる位置に存在する変異をも検出することが可能である。

さらに、本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応によれば、核酸試料中の核酸配列における配列の欠失または挿入の有無を判定することが可能である。この目的のためには、欠失または挿入に係る部位が、配列（Ａ）、配列（Ｂ）もしくは配列（Ｃ）に含まれるか、または配列（Ａ）と配列（Ｂ）との間もしくは配列（Ａ）と配列（Ｃ）との間に配置されるようにプライマーセットを設計することができ、これにより、増幅産物の有無を確認することによって配列の欠失または挿入の有無を判定することが可能となる。従って、本発明によれば、核酸試料中の核酸配列における配列の欠失または挿入の有無を判定する方法であって、（ａ）核酸試料を用意する工程、（ｂ）本発明によるプライマーセットであって、欠失または挿入に係る配列を含むか、または該配列を含まない核酸配列を標的核酸配列とし、欠失または挿入に係る部位が、配列（Ａ）、配列（Ｂ）もしくは配列（Ｃ）に含まれるか、または配列（Ａ）と配列（Ｂ）との間もしくは配列（Ａ）と配列（Ｃ）との間に配置されるように設計されたプライマーセットと競合オリゴヌクレオチドを用意する工程、および（ｃ）前記核酸試料の存在下において、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程、を含んでなる方法が提供される。

本発明による欠失／挿入判定法では、目的とする欠失または挿入に係る配列を有する核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が欠失または挿入に係る配列の存在を示し、増幅産物の不在または減少が欠失または挿入に係る配列の不在を示す。一方で、目的とする欠失または挿入に係る配列を有さない核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が欠失または挿入に係る配列の不在を示し、増幅産物の不在または減少が欠失または挿入に係る配列の存在を示す。ここで、「増幅産物の減少」とは、得られた増幅産物の量が、核酸試料中に標的核酸配列が存在する場合に得られる増幅産物の量に比較して減少していることを意味する。

本発明の一つの実施態様によれば、本発明による欠失／挿入判定法の工程（ｂ）において、欠失または挿入に係る部位が前記配列（Ａ）に含まれるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第一のプライマーに含まれる配列（Ａｃ’）は、前記配列（Ａ）に相補的な配列とすることが好ましい。

本発明の他の実施態様によれば、本発明による欠失／挿入判定法の工程（ｂ）において、欠失または挿入に係る部位が前記配列（Ｃ）に含まれるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（Ｃ）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（Ｃ）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第二のプライマーに含まれる配列（Ｃｃ’）は、前記配列（Ｃ）に相補的な配列とすることが好ましい。

本発明の他の実施態様によれば、本発明による欠失／挿入判定法の工程（ｂ）において、欠失または挿入に係る部位が前記配列（Ｂ）に含まれるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（Ｂ’）が伸長鎖上の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。その詳細は、本発明による変異検出法について上述したとおりである。また、第一のプライマーに含まれる配列（Ｂ’）は、前記配列（Ｂ）と同一の配列とすることが好ましい。

本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による欠失／挿入判定法の工程（ｂ）において、欠失または挿入に係る部位が前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）との間に配置されるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（Ｂ’）が伸長鎖上の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、第一のプライマーに含まれる配列（Ｂ’）と伸長鎖上の配列（Ｂｃ）とが適切な距離を維持していないため、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となる。従って、この場合には、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。

本発明の他の実施態様によれば、本発明による欠失／挿入判定法の工程（ｂ）において、欠失または挿入に係る部位が前記配列（Ａ）と前記配列（Ｃ）との間に配置されるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（Ｂ’）が伸長鎖上の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。例えば、配列（Ａ）と配列（Ｃ）との間における長い配列の挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれている場合には、核酸増幅の速度（効率）が著しく低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。また、配列（Ａ）と配列（Ｃ）との間における配列の欠失により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれており、かつこの欠失により配列（Ｂ）の一部または全部が失われている場合には、第一のプライマーに含まれる配列（Ｂ’）が伸長鎖上にハイブリダイズできないため、ステム−ループ構造の形成が不可能となるか、または困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。さらに、配列（Ａ）と配列（Ｃ）との間における配列の欠失により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれており、かつこの欠失による配列（Ｂ）の部分的欠失が生じない場合にも、核酸増幅の速度（効率）が低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。

本発明による欠失／挿入判定法では、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれをも標的核酸配列とすることができる。ＲＮＡとしては、例えば、ｍＲＮＡ、スプライスドＲＮＡ、アンスプライスドＲＮＡ等が挙げられ、また、核、細胞質などに存在するＲＮＡ、感染したウイルス、細菌などに由来するＲＮＡ等、生体から取得することのできる全ての種類のＲＮＡが挙げられる。ＤＮＡとしては、天然に存在するＤＮＡのみならず、人工的に組み換えられたＤＮＡ配列を挙げることもできる。現在、様々な遺伝子または核酸断片の配列を組み換えることが可能となっており、本発明による欠失／挿入判定法によれば、天然には存在しない組換え配列を検出することも可能である。

本発明の好ましい実施態様によれば、上記の欠失または挿入に係る配列は、真核生物のゲノム上の遺伝子に含まれるイントロン配列とされる。これにより、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡをともに含む核酸試料を用いた場合に、標的とする遺伝子の配列中にイントロンが存在するか否かを判定することができ、その結果、イントロンが存在しないと判定された場合には、標的とする遺伝子のｍＲＮＡが存在するものと、すなわち、標的とする遺伝子が発現しているものと判定することができる。本発明のさらに好ましい実施態様によれば、前記標的核酸配列はｍＲＮＡとされる。

標的とする遺伝子のｍＲＮＡ（イントロンの欠失を有する）を標的核酸配列とし、イントロン配列の欠失に係る部位が前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）との間に配置されるように設計されたプライマーセットを用いる実施態様について詳述する。この実施態様では、まず、第一のプライマーの３’末端に存在する配列（Ａｃ’）が鋳型にアニールして伸長反応が起こり、さらに、該プライマーからの伸長反応産物が目的の領域を合成していた場合にのみ、該プライマーの５’末端に存在する配列（Ｂ’）が自己伸長産物上の隣のエクソンに対応する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズすることが可能となる。すなわち、伸長反応産物が二つのエクソンを順番通りに連結させた配列を有するｍＲＮＡの目的領域を合成したときにはじめて図１に示されるステム−ループ構造が形成され、一本鎖となった鋳型上の配列（Ａ）に新たな第一のプライマーがアニーリングすることが可能となる。この第一のプライマーの５’末端部分によるステム−ループ構造の形成は、上述のように、鋳型上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）が適切な間隔で存在するときに効率良く繰り返されるため、イントロン配列を含まないｍＲＮＡを鋳型にする時のみ増幅が起き、イントロン配列を含むようなゲノムＤＮＡでは増幅は起きないこととなる。この反応を等温で繰り返すことによって正確に目的核酸の増幅を行うことができ、また、このステム−ループ構造の形成がサイクルごとに正確に繰り返されるため、目的核酸のみを正確に増幅することが可能となる。また、ＰＣＲ法などでは、多くの場合、非特異的な増幅が起こり、目的とするｍＲＮＡのみを増幅し、これを定量することは非常に困難であったが、本発明による欠失／挿入判定法は非常に特異性が高いために、非特異増幅を起こすことなく、標的とするｍＲＮＡのみを特異的に増幅することができるので、その定量性も向上する。また、この原理により、煩雑で時間のかかるＤＮａｓｅ処理などを行い、検体中のＤＮＡを壊してＲＮＡを獲得する工程を省略することが可能となり、ｍＲＮＡの自然崩壊を減らすことができ、より迅速な定性または定量の診断が行えるようになる。

本発明による核酸増幅法、変異検出法、または欠失／挿入判定法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による、競合オリゴヌクレオチドとプライマーセットを含んでなる。また、本発明による核酸増幅法、変異検出法、または欠失／挿入判定法は、本発明によるプライマーセット以外のプライマーを必要としないという利点を有する。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるキットは、本発明によるプライマーセット以外のプライマー成分を含まないものとされる。さらに、本発明によるプライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが固相担体と結合可能な部位を含む場合には、本発明によるキットは該固相担体をさらに含んでなることが好ましい。また、核酸増幅反応に用いられる基質が固相担体と結合可能な部位を含む場合にも、本発明によるキットは該固相担体をさらに含んでなることが好ましい。本発明によるキットはさらに、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液などの上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。

本発明の好ましい実施態様によれば、前記キットは、本発明による競合オリゴヌクレオチドとプライマーセットおよび核酸増幅反応に必要とされる他の試薬類を含有する反応容器を含んでなるものとされる。他の試薬類としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液などの上述の試薬類が挙げられる。このようなキットを用いることにより、前記反応容器に鋳型核酸または核酸試料を添加し、該反応容器を一定の温度に保つだけで核酸増幅反応を行なうことが可能となる。さらには、プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが固相担体を含んでいる場合には、増幅産物が生成すると同時に該固相担体が凝集するため、透明または半透明の反応容器を用いることによりこの凝集を反応容器の外部から観察することが可能である。従って、この場合には、反応容器の開封をすることなく増幅産物を検出することができるため、操作が簡便であり、さらには他のサンプルとの間での核酸増幅物のコンタミネーションを防止することもできる。

本発明の第二の態様によれば、競合オリゴヌクレオチドとミスマッチ結合タンパク質などのミスマッチ識別能を有する物質の存在下において、鋳型における変異の存在または不存在のいずれかによって鋳型とのミスマッチを生じる核酸試薬を用いた核酸増幅反応を行なうことにより、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法が提供される。この態様において用いられる「変異」という用語は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失および挿入のいずれをも包含する。

本明細書において「ミスマッチ識別能を有する物質」とは、二本鎖核酸中にミスマッチが含まれている場合に、そのミスマッチ部位に結合するか、またはこの部位を切断する物質をいう。プライマーとＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅反応において、鋳型における標的核酸配列上にミスマッチ識別能を有する物質が結合した二本鎖部分が存在すると、プライマーからの伸長鎖がその部分に到達してもその二本鎖構造が解消されないため、プライマー伸長反応がそこで停止し、従って、増幅産物が得られない。また、核酸増幅反応において、鋳型における標的核酸配列が切断された場合にも、増幅産物が得られない。ミスマッチ識別能を有する物質は、好ましくはミスマッチ部分に結合する物質とされ、これは有機化合物、無機化合物もしくはタンパク質、またはこれらの複合体であってもよいが、特に好ましくは、ミスマッチ部分に結合するミスマッチ結合タンパク質とされる。ミスマッチ結合タンパク質の詳細については上述したとおりであるが、好ましくはＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物とされ、より好ましくはＭｕｔＳとされる。また、ミスマッチ結合タンパク質は、その起源生物によって耐熱性に差が見られる。当業者であれば、核酸増幅反応において設定される温度に応じて適切なミスマッチ結合タンパク質を選択することができる。例えば、好温菌由来のＭｕｔＳは、本発明において好適に用いることができる。

上記の核酸増幅反応は、当技術分野において公知のいずれの方法によるものであってもよく、また、本発明による核酸増幅法によるものであってもよい。特に、等温で行なわれる核酸増幅反応が好適に用いられ、このような核酸増幅反応は、上述の本発明による核酸増幅法のみならず、等温下での核酸増幅法として知られる方法、例えば、ＳＤＡ法、改良ＳＤＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などに従って行なうことができる。

一つの実施態様によれば、本発明の第二の態様による変異検出法は、以下の工程：
（ａ）核酸試料を用意する工程；
（ｂ）変異に係る部位を含む標的核酸配列を増幅しうるプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものであり、さらに競合オリゴヌクレオチドを含む、プライマーセットを用意する工程；および
（ｃ）ミスマッチ識別能を有する物質の存在下において、前記核酸試料を鋳型とする前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなるものである。

標的核酸配列を増幅しうる上記の競合オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットは、利用する核酸増幅法に応じて適宜設計することができる。特に、該プライマーセットは標的核酸配列を等温下で増幅しうるものであることが好ましく、その場合には、核酸増幅反応は等温で行なうことができる。

上記の１以上のミスマッチは、１塩基のミスマッチ、連続した複数のミスマッチ、または非連続的な複数のミスマッチとすることができる。また、該ミスマッチの数の上限は、ハイブリダイズすべき２本の核酸が二本鎖の状態を維持しうる程度の数であればよく、従って、ハイブリダイゼーションにより対合するヌクレオチドの数によって異なるが、好ましくは５塩基、より好ましくは３塩基、さらに好ましくは２塩基とされる。

変異の存在または不存在によってミスマッチを生じる上記の競合オリゴヌクレオチドやプライマーは、検出の対象とする変異を有する標的核酸配列と該変異を有さない標的核酸配列とを比較することにより、当業者であれば適宜設計することができる。すなわち、これら２つの標的核酸配列の間で異なるヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするように、前記プライマーを設計すればよい。その際、前記プライマーは、変異を有する標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の不存在によってミスマッチを生じるものとなり、一方で、変異を有さない標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の存在によってミスマッチを生じるものとなる。

好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーとされる。この第一のプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（Ａ）と前記配列（Ａｃ’）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。あるいは、この第一のプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（Ｂｃ）と前記配列（Ｂ’）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することもできる。

他の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれる第二のプライマーとされる。この第二のプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（Ｃ）と前記配列（Ｃｃ’）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。

他の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれてもよい第三のプライマーをさらに含んでなるものとされる。この第三のプライマーは、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。

上記核酸増幅反応の他の条件は、本発明による核酸増幅法と同様に設定することができる。例えば、上記核酸増幅反応では、好ましくは上述の鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される。また、必要に応じて、上述の融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤などを用いてもよい。

この実施態様による変異検出法を行なった結果、変異の存在によりミスマッチを生じる競合オリゴヌクレオチドやプライマーを用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在しないものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在するものと判定することができる。一方で、変異の不存在によりミスマッチを生じるプライマーを用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在するものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在しないものと判定することができる。

この実施態様に従って本発明の第二の態様による変異検出法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、該キットは、前記ミスマッチ識別能を有する物質、および前記の競合オリゴヌクレオチドやプライマーセットを含んでなる。また、該キットは、好ましくは上述の鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなるものとされる。さらに、該キットは、上述の融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤、ｄＮＴＰ、緩衝液などの上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。

他の一つの実施態様によれば、本発明の第二の態様による変異検出法は、以下の工程：
（ａ）核酸試料を用意する工程；
（ｂ）変異に係る部位を含む標的核酸配列を増幅しうるプライマーセットと競合オリゴヌクレオチドを用意する工程；
（ｃ）標的核酸配列にハイブリダイズする核酸断片であって、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されてなる、核酸断片を用意する工程；および
（ｄ）ミスマッチ識別能を有する物質および前記核酸断片の存在下において、前記核酸試料を鋳型とする前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなるものである。

変異の存在または不存在によってミスマッチを生じる上記核酸断片は、検出の対象とする変異を有する標的核酸配列と該変異を有さない標的核酸配列とを比較することにより、当業者であれば適宜設計することができる。すなわち、これら２つの標的核酸配列の間で異なるヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするように、前記核酸断片を設計すればよい。その際、前記核酸断片は、変異を有する標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の不存在によってミスマッチを生じるものとなり、一方で、変異を有さない標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の存在によってミスマッチを生じるものとなる。

また、上記核酸断片は、核酸増幅反応において用いられる温度、例えば、２０℃〜８０℃の範囲の温度において、標的核酸配列にハイブリダイズするものであればよい。該核酸断片の鎖長は特に制限されるものではないが、好ましくは５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜２５ヌクレオチドとされる。該核酸断片は、必要に応じて、修飾塩基（天然では存在しない塩基）を含むこともできる。また、該核酸断片は、その一方または両方の末端部において、標識、またはアミノ基などの活性基を含んでいてもよい。

標的核酸配列を増幅しうる上記のプライマーセットや競合オリゴヌクレオチドは、利用する核酸増幅法に応じて適宜設計することができる。特に、該プライマーセットは標的核酸配列を等温下で増幅しうるものであることが好ましく、その場合には、核酸増幅反応は等温で行なうことができる。

好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーとされる。他の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれる第二のプライマーとされる。さらに他の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれてもよい第三のプライマーをさらに含んでなるものとされる。

この実施態様による変異検出法を行なった結果、変異の存在によりミスマッチを生じる核酸断片を用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在しないものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在するものと判定することができる。一方で、変異の不存在によりミスマッチを生じる核酸断片を用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在するものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在しないものと判定することができる。

この実施態様に従って本発明の第二の態様による変異検出法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、該キットは、前記ミスマッチ識別能を有する物質、前記プライマーセット、および前記核酸断片を含んでなる。また、該キットは、好ましくは上述の鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなるものとされる。さらに、該キットは、上述の融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤、ｄＮＴＰ、緩衝液などの上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。

以下に実験実施例を示すが、本発明は、これに限定されるものではない。
実施例１

核酸試料の調製は、以下のとおり行なった。ヒトＥＧＦＲｅｘｏｎ２１の野生型配列（２５７３Ｔ）を含むプラスミド（濃度６０００コピー／μＬ）及びヒトＥＧＦＲｅｘｏｎ２１の変異型配列（２５７３Ｇ）を含むプラスミド（濃度６０００コピー／μＬ）を９８℃、３分熱処理後、氷冷したものを核酸試料とした。

ＳＭＡＰ法による増幅は以下のように行った。反応系の組成（２５μＬ）は以下の通りである。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．４ｍＭｄＮＴＰｓ、０．６ＭＢｅｔａｉｎｅ、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、８ｍＭＭｇＳＯ_４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１／１００，０００ｄｉｌｕｔｅｄＳＹＢＲ^ＲＧｒｅｅｎＩ、６ＵＡａｃポリメラーゼ、１μＬ核酸試料（反応系あたり６０００コピーとなるように添加）、２．０μＭＦＰ、２．０μＭＴＰ、１．０μＭＢＰ、０．２５μＭＯＰ１、０．２５μＭＯＰ２、１０μＭの競合オリゴヌクレオチド（ＣＯ）存在下と非存在下で反応を行った。上記の反応組成で６０℃、１時間反応を行った。反応はＭＸ−３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用い、経時的に蛍光強度を測定しながら行った。変異型プラスミドは１連、野生型プラスミドは９連で行った。

結果は図５のとおりである。ＥＧＦＲｅｘｏｎ２１変異型（２５７３Ｇ）増幅プライマーセットを用い、変異型プラスミドを増幅した場合、競合オリゴヌクレオチドの有無に関わらず約１８分で増幅が確認された。野生型プラスミドを増幅した場合、競合オリゴヌクレオチドを添加しない系は９例中５例で６０分以内に増幅が確認された（図５のａ）。一方、競合オリゴヌクレオチドを添加した系では６０分以内に増幅が確認された例は無かった（図５のｂ）。

実施例２

核酸試料の調製は以下のとおり行なった。ヒトＥＧＦＲｅｘｏｎ１９の野生型配列を含むプラスミド（濃度６０００コピー／μＬ）及びヒトＥＧＦＲｅｘｏｎ１９の変異型配列（ｄｅ１２２３５−２２４９）を含むプラスミド（濃度６０００コピー／μＬ）を９８℃、３分熱処理後、氷冷したものを核酸試料とした。

ＳＭＡＰ反応による増幅反応は以下のように行なった。反応系の組成（２５μＬ）は以下の通りである。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．４ｍＭｄＮＴＰｓ、０．６ＭＢｅｔａｉｎｅ、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、８ｍＭＭｇＳＯ_４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１／１００，０００ｄｉｌｕｔｅｄＳＹＢＲ^ＲＧｒｅｅｎＩ、６ＵＡａｃポリメラーゼ、１μＬ核酸試料（反応系あたり６０００コピーとなるように添加）、２．０μＭＦＰ、２．０μＭＴＰ、１．０μＭＢＰ、０．２５μＭＯＰ１、０．２５μＭＯＰ２、１０μＭの競合オリゴヌクレオチド（ＣＯ）存在下と非存在下で反応を行った。上記の反応組成で６０℃、１時間反応を行った。反応はＭＸ−３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用い、経時的に蛍光強度を測定しながら行った。変異型プラスミドは１連、野生型プラスミドは９連で行った。

結果は図６に示した。ＥＧＦＲｅｘｏｎ１９変異型（ｄｅ１２２３５−２２４９）増幅プライマーセットを用い、変異型プラスミドを増幅した場合、競合オリゴヌクレオチドの有無に関わらず約２４分で増幅が確認された。野生型プラスミドを増幅した場合、競合オリゴヌクレオチドを添加しない系は９例中９例で６０分以内に増幅が確認された（ａ）。一方、競合オリゴヌクレオチドを添加した系では６０分以内に増幅が確認された例は無かった（ｂ）。

本発明の変異検出方法は、複数の領域における塩基配列が予測されたとおりでなければ一定レベルの増幅生成物を生じることができず、非特異的相補鎖合成を防止することができるため正確かつ感度のよい検出が可能となる。本発明の変異検出方法は、類似した塩基配列の厳密な識別を可能とする。たとえば、ヒトＣＹＰ２Ｃ９のように相互に類似する塩基配列を含む遺伝子の間で、類似する塩基配列の中に存在するＳＮＰｓを正確に検出できる。本発明は、テーラーメード医療を支える薬剤代謝遺伝子の解析技術としても有用である。薬剤代謝遺伝子は、薬剤に対する感受性を左右する重要な遺伝子で、その活性の違いは薬剤の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子に見出されるわずかな塩基配列の相違に起因しており、ヒトゲノムプロジェクトの成果がもたらす薬剤代謝遺伝子の解析に本発明はかかる高い利用価値を有する。また、ＨＬＡや血小板同種抗原、あるいは病原微生物のタイピングのような、類似する塩基配列を含む複数の遺伝子間の微細な塩基配列の相違の検出にも有用である。さらに、ガン特異的な変異の検出にも応用可能であり、さらには、ガン特有の微量の変異検出においても、本法を用いることで、感度よく、正確に、微量変異を検出できるものと考えられる。

図１は、ＳＮＡＰ法に用いられるプライマーセットを模式的に示した図であるが、用いるプライマーの本数は、これに限定されるものではない。さらに図１はＳＭＡＰ法の核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図であるが、用いるプライマーの本数ならびに増幅順序などは、これに限定されるものではない。図２は、ＳＭＡＰ法の核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図であるが、用いるプライマーの本数ならびに増幅順序などは、これに限定されるものではない。図３は、等温での核酸増幅反応を利用して行なった時に、遺伝子の一塩基変異の検出におけるミスマッチ結合タンパク質の効果を示す図であるが、１塩基変異のみの検出に限定されるものではない。図４は、等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列における変異部位に特異的にアニールしうる競合オリゴヌクレオチドを用いることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止することを示した図であるが、用いるプライマーや競合オリゴヌクレオチドの本数ならびに本作用原理などは、これに限定されるものではない。

Claims

等温増幅法を用いた遺伝子の検出方法において、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止することを特徴とする、遺伝子の検出方法。
等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列における変異部位に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止することを特徴とする、請求項１記載の方法。
等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列における変異部位に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを用いることにより、標的塩基配列にアニールしうるプライマーまたは増幅産物の３’末端が、非標的塩基配列にアニーリングすることを防止することを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
前記の等温増幅法がＳＭＡＰ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＩＣＡＮ法、ＴＲＣ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法のいずれかである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドが３’末端より伸長反応が起こらないように設計されたオリゴヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドがその３’末端より伸長反応が起こらないように修飾された、または、オリゴヌクレオチドの３’末端より伸長反応が起こらないように標的塩基配列と非相同的な配列をもたせたものである、請求項５に記載の方法。
前記修飾が３’末端水酸基のアミノ化またはリン酸化である、請求項６に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドが、核酸またはペプチド核酸またはＬＮＡまたは非天然核酸、もしくは、それら２種類以上からなる混合されたものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
検出すべき変異が１塩基多型または点変異または挿入または欠失または繰り返し配列である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。