ES2299524T3

ES2299524T3 - Compuestos heteroaromaticos biciclicos.

Info

Publication number: ES2299524T3
Application number: ES01982306T
Authority: ES
Inventors: Cornelis Marius Timmers; Willem Frederik Johan Karstens
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2001-09-17
Publication date: 2008-06-01
Anticipated expiration: 2021-09-17
Also published as: NO328683B1; CY1107308T1; US20070197527A1; KR20030040483A; SK287554B6; US7229990B2; EP1886999A2; ECSP034523A; CA2422054A1; DE60132607T2; HUP0302648A2; EP1322651B1; IL154624A0; ZA200301588B; NO20031314D0; PL207755B1; HRP20030220A2; SK3312003A3; AU1392902A; CN1247594C

Abstract

Un compuesto heteroaromático bicíclico seleccionado del grupo que consiste en 5-amino-2-metiltio-4-(3-(aliloxicarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]-pirimidina-6-carboxamida terc-butílica, 5-amino-2-metiltio-4-(3-((morfolin-4il)-carbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida ter-butílica ó 5-amino-2-metiltio-4-(3-1,2,3,6-tetrahidropiridinocarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica.

Description

Compuestos heteroaromáticos bicíclicos.

La invención se refiere a compuestos que tienen actividad de agonista o antagonista de hormona glicoproteína, en particular a compuestos que tienen actividad de hormona luteinizante (LH). La invención se refiere además a derivados heteroaromáticos bicíclicos, a composiciones farmacéuticas que los contienen así como el empleo de estos compuestos en terapia médica, en particular para su uso como control de la fertilidad.

Las gonadotropinas ejercen un importante papel en diversidad de funciones corporales que incluyen el metabolismo, la regulación de la temperatura y el proceso reproductor. La gonadotropina hipofiseal FSH, por ejemplo, juega un papel fundamental en la estimulación de desarrollo y maduración de folículos mientras que la LH induce la ovulación (Sharp, R.M. Clin. Endocrinol. 33:787-807, 1990; Dorrington y Amstrong, Recent Prog. Horm. Res. 35:301-342, 1979). Actualmente, la LH se aplica clínicamente en combinación con FSH, por estimulación ovárica, es decir, hiperestimulación ovárica para fertilización in vitro (IVF) e inducción de la ovulación en mujeres no fértiles anovulatoriamente (Insler, V., Int. J. Fertility 33:85-97, 1988, Navot y Rosenwaks, J. Vitro Fert. Embryo Transfer 5:3-13, 1988), así como para hipogonadismo masculino e infertilidad masculina.

Las gonadotropinas actúan sobre tipos de células gonadales específicas para iniciar la diferenciación ovárica y testicular y la esteroidogénesis. Las acciones de estas hormonas pituitarias y placentales están mediadas por receptores de membrana de plasma específicos que son miembros de la gran familia de receptores copulados con proteína G. Consisten en un polipéptido simple con siete dominios de transmembrana y son capaces de interactuar con proteínas G, lo que lleva a la activación de adenil ciclasa.

Las gonadotropinas destinadas a propósitos terapéuticos se pueden aislar de orina humana y son de baja pureza (Morse y col. Amer. J. Reproduct. Immunol. and Microbiology 17:143, 1988). Alternativamente, se pueden preparar como gonadotropinas recombinantes.

Lo mismo que con otras proteínas terapéuticas, es necesario administrar gonadotropinas o bien subcutáneamente o intra-muscularmente. Sería ventajoso, sin embargo, activar el receptor con una molécula pequeña que pudiera administrarse por vía oral o vía transdérmica.

La presente invención describe la preparación de tales análogos de hormona de bajo peso molecular que activan selectivamente uno de los receptores de gonadotropina. Esta podría ser considerada como una de las mayores ventajas de la presente invención.

Según esto, la invención se refiere a derivados heteroaromáticos bicíclicos según la fórmula general 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

1

donde

R^{1} es fenilo

R^{2} es metilo;

R^{3} es terc-butilo;

Y es N; Z es NH_{2}; A es S y B es N(H)

El fenilo en R^{1} está sustituido en la posición meta con NHR^{5} donde R^{5} es aliloxicarbonilo, morfolinocarbonilo o 1,2,3,6-tetrahidropiridinocarbonilo.

En los compuestos según la invención X1-X2 es S.

Según esto, la invención se refiere a compuestos seleccionados del grupo que consiste en 5-amino-2-metiltio-4-(3-(aliloxicarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica, 5-amini-2-metiltio-4-(3-((morfolin-4-il)-carbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida ter-butílica y 5-amino-2-metiltio-4-(3-1,2,3,6-tetrahidropiridinocarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica.

Se ha demostrado que compuestos según la invención son capaces de unirse a receptor de LH y mostrar actividad agonista de LH.

La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un derivado heteroaromático bicíclico o sales del mismo según la invención.

Por tanto, los compuestos según la invención pueden utilizarse en terapia. Otro aspecto de la invención se refiere a la manufactura de un medicamento para control de la fertilidad. Preferiblemente, los presentes compuestos se utilizan para activar el receptor de LH.

Para uso terapéutico, las sales de los compuestos según la invención son aquellas donde el contra-ión es farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, se pueden emplear también sales de adición de ácido a las bases según la invención, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable. Todas las sales, sean farmacéuticamente aceptables o no, están incluidas dentro del marco de la presente invención.

Entre los ejemplos de sales de adición de ácido, se incluyen las derivadas de ácidos minerales tales como ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, preferiblemente ácido clorhídico, y ácidos orgánicos tales como ácido cítrico, ácido tartárico, ácido acético, ácido láctico, ácido maleico, ácido malónico, ácido fumárico, ácido glicólico, ácido succínico y similares.

Las vías adecuadas de administración para los compuestos según la invención o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, citadas aquí también como ingrediente activo, son inyecciones intramusculares, inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas o inyecciones intraperitoneales, administración oral y administración intranasal. Preferiblemente, los compuestos se pueden administrar por vía oral. La dosis exacta y el régimen de administración del ingrediente activo, o una composición farmacéutica del mismo, será necesariamente dependiente del efecto terapéutico que trata de alcanzarse (tratamiento de infertilidad, contracepción), y puede variar con el compuesto particular, vía de administración, y la edad y estado de sujeto individual al que se ha de administrar el medicamento.

En general, la administración parenteral requiere dosis más bajas que otros métodos de administración que son más dependientes de la adsorción. Sin embargo, una dosis para humanos contiene preferiblemente 0,0001-25 mg por kg de peso del cuerpo. La dosis deseada puede estar presente como dosis unitaria o como subdosis múltiples que se administran a intervalos apropiados a lo largo del día o, en el caso de pacientes mujer, como dosis que se administran a intervalos diarios apropiados a lo largo del ciclo menstrual. La dosificación así como el régimen de administración puede diferir entre un paciente femenino o masculino.

En el caso de aplicaciones in vitro o ex vivo, como en aplicaciones IVF, los compuestos de la invención se han de utilizar en medios de incubación a una concentración de aproximadamente 0,01-5 \mu/ml.

La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto heteroaromático bicíclico según la invención en mezcla con auxiliares farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Los auxiliares deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la composición y no perjudiciales para el paciente que lo recibe. Las composiciones farmacéuticas incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluida transdérmica, bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las composiciones se pueden preparar por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, utilizando métodos tales como los descritos en Gennaro y col., Remington Pharmaceutical Sciences (18ª edición, Mack Publishing Company, 1990, véase especialmente la Parte 8: Pharmaceutical Preparations and their Manufacture).

Estos métodos incluyen la etapa de poner en asociación el ingrediente activo con cualquier agente auxiliar. El (los) agente(s) auxiliar(es), llamados también ingredientes accesorios, incluyen los convencionales en la técnica (Gennaro, antes citado) tales como cargas, aglutinantes, diluyentes, disgregantes, lubricantes, colorantes, agentes para dar sabor y agentes humectantes.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades de dosis discretas tales como píldoras, tabletas o cápsulas, o como un polvo o gránulos, o como una solución o suspensión. El ingrediente activo se puede presentar también como bolus o pasta. Las composiciones pueden además estar en forma de supositorio o como enema para administración rectal.

Para la administración parenteral, las composiciones adecuadas incluyen inyección estéril acuosa y no-acuosa. Las composiciones se pueden presentar en dosis unitaria o en recipientes multidosis, por ejemplo viales cerrados y ampollas, y se pueden almacenar en estado desecado por congelación (liofilizado) que únicamente requiere la adición de vehículo líquido estéril, por ejemplo agua, antes del uso.

Las composiciones, o formulaciones, adecuadas para administración por inhalación nasal incluyen polvos o nieblas que pueden generarse mediante aerosoles a presión con dosis medidas, nebulizadores o insufladores.

Los derivados heteroaromáticos bicíclicos de la invención se pueden administrar también en la forma de dispositivos farmacéuticos implantables, que consisten en un núcleo de material activo, encajado en una membrana que regula la velocidad de liberación. Estos implantes se aplican subcutáneamente o localmente, y liberarán el ingrediente activo a una velocidad aproximadamente constante a lo largo de un período de tiempo relativamente grande, que va de semanas a años. Métodos para la preparación de dispositivos farmacéuticos implantables son conocidos como tales en la especialidad, por ejemplo los descritos en la Patente europea 0.303.306 (AKZO N. V.).

Según esto, los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para los mismos propósitos clínicos que la HL natural, con la ventaja de que presentan propiedades de estabilidad alteradas y pueden administrarse de manera diferente.

Los compuestos de la presente invención en los que B=NH, representados por la fórmula (I-a) se pueden preparar en general mediante la condensación, conocida en la técnica, de un ácido de fórmula (II) con una amina de fórmula (III).

2

La reacción antes mencionada se lleva a cabo a temperatura ambiente en un disolvente adecuado, por ejemplo, un disolvente aprótico tal como N,N-dimetilformamida (DMF) o diclorometano, utilizando un reactivo de copulación tal como tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N.N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU) o hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP) y una base amina terciaria, por ejemplo N,N-diisopropiletilamina (DiPEA).

Un método adecuado para la preparación de ácidos intermedios (II) es la saponificación mediada por base, conocida en la técnica, de ésteres de etilo de la estructura general (VI). La saponificación tiene lugar en presencia de una base tal como hidróxido de litio, hidróxido de potasio o hidróxido de sodio en dioxano acuoso a temperatura elevada (40ºC a reflujo), seguido por tratamiento con ácido.

3

Las tienopiri(mi)dinas de la fórmula general (XXIV) son accesibles por tratamiento de cloruros (XV) con mercaptoacetato de etilo bajo la influencia de una base fuerte. En un experimento típico, se hace reaccionar un equivalente de cloruro (XV) con 1,5 equivalentes de mercaptoacetato de etilo y 2 equivalentes de terc-butóxido de potasio en THF. En estas condiciones, el sulfuro acíclico sufre una ciclación espontánea para formar tienopiri(mi)dina de la fórmula general (XXIV). Si R^{1} es (hetero)arilo, sustituido con un grupo que arrastra un electrón tal como nitro, la ciclación antes mencionada se realiza por un procedimiento en dos etapas, que supone el aislamiento del tioéter intermediario, seguido de tratamiento con una base terciaria tal como DIPEA en tolueno/EtOH a la temperatura de reflujo, para efectuar la formación de anillo de tiofeno.

4

Los compuestos de fórmula (XXI) donde Y = N representados por la fórmula (XXI-a) se pueden preparar por diversos métodos que están en la bibliografía.

5

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Por ejemplo, los derivados de fórmula (XXI-a) donde R^{1} = arilo(6-14C) pueden sintetizarse por condensación de ésteres etílicos (XXVII), donde W es como se ha definido previamente, con aldehidos (XXVIII) y compuestos (XXIX), que pueden ser isotiourea (XXIX-a), isourea (XXIX-b), guanidinas monosustituidas (XXIX-c), guanidinas disustituidas (XXIX-d) o amidinas (XXIX-e).

6

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En un experimento típico, los componentes (XXVII), (XXVIII) y (XXIXa-e) se suspenden en un disolvente apropiado, por ejemplo, etanol, metanol, N.N-dimetilformamida, N-metilpirrolidinona, tetrahidrofurano o piridina y se añade una base tal como carbonato de potasio, acetato de sodio, metóxido de sodio o etóxido de sodio. La reacción tiene lugar a temperatura elevada (70ºC a reflujo). Véase, por ejemplo, S. Kambe, K. Saito y H- Kishi, Syntesis: 287, 1979; A.M. Abd-Elfattah, S.M. Hussain y A.M. El-Reedy, Tetrahedron 39: 3197, 1983; S.M. Hussain, A.A. El-Barbary y S.A. Mansour, J. Heterocicl. Chem. 22: 169, 1985. En el caso en que W = C(O)OEt, tiene lugar aromatización en la adición de oxidante, tal como DDQ u oxígeno. Las ciclaciones mencionadas se puede llevar a cabo también sobre un soporte sólido tal como resina Merrifield utilizando un ligando apropiado, véase por ejemplo A.I. Mrzinzik y E.R. Felder, J. Org. Chem. 63: 723. 1998; T. Masquelin, D. Sprenger, R. Baer, F. Gerber e Y. Mercadal, Helv. Chim. Acta 81: 646, 1998.

Los compuestos de fórmula general (XX) donde Y=N, representados por la fórmula (XX-a) se pueden preparar a través de una estrategia de condensación similar, utilizando malonitrilo

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Alternativamente, los compuestos de fórmula general (XX) son accesibles por amonolisis de cloruros de fórmula (XV), utilizando amoníaco acuoso y un co-disolvente orgánico apropiado tal como 1,4-dioxano. Esta transformación se puede llevar a cabo también con cloruro de amonio y una base amina terciaria tal como DiPEA en un disolvente aprótico tal como DMF.

8

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El cloruro de la fórmula general (XV) se puede sintetizar por una reacción conocida en la técnica de lactamas (XXI) con POCl_{3} en un disolvente apropiado, tal como 1,4-dioxano, a temperaturas elevadas (60ºC a reflujo)

9

Los métodos para determinar la unión a receptor así como los ensayos in vitro e in vivo para determinar la actividad biológica de gonadotropinas son muy conocidos. En general, el receptor expresado se pone en contacto con el compuesto que se va a ensayar y se mide la unión o estimulación o inhibición de una respuesta funcional.

Para medir la respuesta funcional, se expresa ADN aislado que codifica el gen de receptor de LH, preferiblemente el receptor humano, en células huésped adecuadas. Estas células pueden ser células de ovario de hamster chino, pero también son adecuadas otras células. Preferiblemente las células son de origen mamífero (Jia y col., Mol. Endocrin., 5:759-776, 1991.

Los métodos para construir líneas celulares que expresan LH recombinante son muy conocidas en la especialidad (Sambrook y col., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratoy Press, Cold Spring Harbor, última edición). La expresión de receptor se consigue por expresión del ADN que codifica la proteína deseada. Las técnicas para mutagénesis dirigida a sede, ligado de sentencias adicionales, PCR, y construcción de sistemas de expresión adecuados son todos, por ahora, muy conocidos en la especialidad. Se pueden construir sintéticamente porciones o todo el ADN que codifica la proteína deseada utilizando técnicas de fase sólida convencionales, preferiblemente incluyendo sedes de restricción para facilitar el ligado. A las secuencias que codifican el ADN, se pueden proporcionar elementos de control adecuados para transcripción y traducción de la secuencia de codificación incluida. Como es bien sabido, se dispone ahora de sistemas de expresión que son compatibles con una amplia variedad de huéspedes, que incluyen huéspedes procarióticos como bacterias y huéspedes eucarióticos tales como levaduras, células de vegetales, células de insecto, células de mamífero, células de aves y similares.

Las células que expresan el receptor se ponen en contacto entonces con el compuesto de ensayo para observar la unión o estimulación o inhibición de una respuesta funcional.

Alternativamente, se pueden utilizar membranas celulares aisladas que contienen el receptor expresado para medir la unión del compuesto.

Para medir la unión se pueden utilizar compuestos marcados radiactivamente o fluorescentemente. Como compuesto de referencia se puede emplear LH recombinante humana. En la alternativa también se pueden realizar ensayos de unión competitiva.

Otro ensayo supone análisis de selección (screening) para compuestos agonistas de receptor de LH por determinación de la estimulación de la acumulación de AMPc mediada por receptor. Según esto, tal método supone la expresión del receptor sobre la superficie celular de una célula huésped y la exposición de la célula al compuesto de ensayo. Se mide entonces la cantidad de AMPc. El nivel de AMPc se reducirá o incrementará, dependiendo del efecto inhibidor o estimulante del compuesto de ensayo sobre la unión a receptor.

Además de la medición directa de por ejemplo niveles de AMPc en la célula expuesta, se pueden utilizar líneas celulares que además de la transfección con ADN que codifica receptor sean transfectadas también con un segundo ADN que codifica un gen informador, cuya expresión responde al nivel de cAMP. Estos genes reformadores pueden ser inducibles por AMPc o pueden construirse de tal manera que se conecten a elementos de respuesta a AMPc. En general, la expresión del gen informador puede ser controlada por cualquier elemento de respuesta que reaccione al cambio de niveles de AMPc. Los genes informadores adecuados son, por ejemplo, LacZ, fosfatasa alcalina, luciferasa de luciérnaga y proteína de fluorescencia verde. Los principios de tales ensayos de transactivación son bien conocidos en la técnica y están descritos, por ejemplo, en Stratowa, Ch., Himmler, A y Czernilofsky, A.P. (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:574.

Para seleccionar compuestos activos, los ensayos a 10^{-5}M deben dar por resultado una actividad de más del 20% de la actividad máxima cuando se utiliza LH como referencia. Otro criterio puede ser el valor de EC_{50} que debe ser <10^{-5}M preferiblemente <10^{-7}M.

El especialista se dará cuenta de que los valores de EC_{50} deseables dependen del compuesto ensayado. Por ejemplo, un compuesto con una EC_{50} inferior a 10^{-5}M está considerada en general como un candidato para selección del fármaco. Preferiblemente, este valor es inferior a 10^{-7}M, más preferiblemente 10^{-8}M. Sin embargo, un compuesto que tenga una EC_{50} más alta pero que sea selectivo para el receptor particular, puede ser incluso un buen candidato.

El análisis de selección para compuestos agonistas de receptor de LH se puede realizar también utilizando un bioensayo de células Leydig de ratón (Van Damme, M. Robersen, D. y Diezfalusy, E. (1974), Acta Endocrinol. 77: 655-671 Mannaerts, B. Kloosterboer, H. y Schuurs, A. (1987), Neuroendocrinology of Reproduction, R. Rolland y col. Eds, Elsevier Science Publishers B.V., 49-58). En este ensayo, la estimulación de producción de testosterona mediada por receptor de LH se puede medir en células Leydig aisladas de ratones macho.

Para medir la actividad in vivo de compuestos agonistas de receptor de LH, se puede estudiar la inducción de ovulación en ratones inmaduros. En este ensayo, se puede cebar ratones hembra inmaduros con FSH urinaria y tratarse, aproximadamente 48 horas después, con compuesto agonista de LH. Los animales se sacrifican después del tratamiento con LH y se puede comprobar microscópicamente el número de óvulos en el oviducto.

Los compuestos de la presente invención se pueden aplicar clínicamente en aquellos regímenes en los que ahora se emplea LH o hCG. Estos incluyen la substitución de LH entre sujetos con hipogonadismo hipogonadal, ya sea masculino o femenino, administración en mitad del ciclo para inducir la ovulación (inducción de ovulación (OI) o hiperestimulación controlada (COH) o estimulación del corpus luteum.

Ejemplos

Ejemplo 1

5-Amino-2-metiltio-4-(3-(metoxicarboniloxi)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxi-amida terc-butílica (a) 5-Ciano-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-6-hidroxipirimidina

Se agitó a 60ºC durante 5 horas una mezcla de sulfato de S-metilisotiourea (139 mg), 3-metoxibenzaldehido (243 \mul), cianoacetato de etilo (112 \mul) y carbonato de potasio (145 mg) en etanol absoluto (2 ml). La mezcla de reacción se enfrió a 0ºC en baño de hielo, se filtró y el residuo se calentó en agua (H_{2}O) hasta obtener una solución transparente. Se aciduló la solución con HCl acuoso 2N a pH 2 y se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. Los cristales resultantes se recogieron por filtración y se secaron al vacío.

Rendimiento:: 186 mg

MS-ESI: [M+H]^{+} = 274,2

TLC:: R_{f} = 0,50, gel de sílice, diclorometano (CH_{2}Cl_{2})/metanol (CH_{2}OH) = 9/l (v/v).

(b) 6-Cloro-5-ciano-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-pirimidina

Se añadió oxicloruro de fósforo (0,75 ml) a una solución agitada de 5-ciano-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-6-hidro-
xi-pirimidina (ejemplo 1 a, 305 mg) en 1,4-dioxano seco (1 ml). Se añadió una gota de N,N-dimetilanilina. Al cabo de 3 horas a 80ºC, se enfrió la mezcla a 0ºC en un baño de hielo y se le añadió lentamente hielo triturado. Después de cesar la reacción exotérmica, se añadió H_{2}O (3 ml). Se recogieron los sólidos por filtración y se secaron al vacío.

Rendimiento:: 244 mg

MS-ESI: [M+H]^{+} = 292,2

TLC: R_{f} = 0,86, gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}.

(c) 5-Amino-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxilato de etilo

Se añadió terc-butóxido de potasio (150 mg) a una solución agitada de 2-mercaptoacetato de etilo (92 \mul) y
6-cloro-5-ciano-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-pirimidina (Ejemplo 1b, 244 mg) en tetrahidrofurano seco (THF) (4 ml). Al cabo de 1 hora, la mezcla se enfrió a 0ºC en baño de hielo, se diluyó con H_{2}O (10 ml). Los sólidos se recogieron por filtración y se secaron al vacío.

Rendimiento:: 260 mg

MS-ESI: [M+H]^{+} = 376,2

TLC: Rf = 0,44, gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}.

(d) Ácido 5-amino-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxílico

Se disolvió 5-Amino-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxílato de etilo (Ejemplo 1c, 9,27 g) en una mezcla de 1,4-dioxano (270 ml) y H_{2}O (30 ml). Se añadió hidróxido de litio (10 g) y la mezcla se agitó a 80ºC durante 48 horas. Se separó, por evaporación,1,4-dioxano de la mezcla y el residuo se recogió en H_{2}O. La solución remanente se aciduló a pH 2 por adición de HCl acuoso 3N. El precipitado resultante se separó por filtración y se lavó con H_{2}O. Las trazas de agua en el precipitado se eliminaron por co-evaporación con 1,4-dioxano y luego con éter dietílico y se secó al vacío a 50ºC durante toda la noche.

Rendimiento:: 8,45 g

MS-ESI: [M+H]^{+} = 348,0

TLC: R_{f} = 0,2, gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH = 9/1 (v/v).

(e) 5-Amino-2-metiltio-4-(3-metoxifenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica

Se disolvió ácido 5-amino-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxílico (Ejemplo 1d, 7,0 g) en CH_{2}Cl_{2} seco (100 ml). Se añadieron tetrafluoroborato de benzotriazol-1-il-N,N,N,N'-tetrametiluronio (TBTU) (8,0 g), N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) (6,6 ml) y terc-butilamina (4,0 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 5%), (2* 100 ml) y HCl acuoso 1M. Esta capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y se concentró al vacío. El compuesto del título se purificó por cromatografía sobre gel de sílice con heptano (heptano/acetato de etilo (EtOAc) = 1/0 a 3/2 (v/v) como eluyente.

Rendimiento:: 6,5 g

MS-ESI: [M+H]^{+} = 403,0

HPLC: R_{f} = 33,56 min, columna 5 \mum Luna (C-18(2) 100* 2,0 mm, flujo 0,25 ml/min, temperatura de la estufa 40ºC, detección 210 nm + 254 nm, eluyente H_{2}O/acetonitrilo(CH_{3}CN)/ CH_{3}- OH= 70/28,5/1,5 a 0/95/5 (v/v) en 50 minutos.

(f) 5-Amino-2-metiltio-4-(3-hidroxifenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica

Se disolvió 5-amino-2-metiltio-4-(3-metoxifenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica (Ejemplo 1e, 1,8 g) en CH_{2}Cl_{2} (30 ml) y la solución resultante se enfrió hasta 0ºC. Se añadió, gota a gota, una solución de tribromuro de boro (1,28 ml) en CH_{2}Cl_{2} seco (30 ml) y la mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. Se añadió, gota a gota, NaHCO_{3} saturado acuoso a la mezcla de reacción hasta que cesaba la reacción exotérmica. Se separó después CH_{2}Cl_{2} de la mezcla por evaporación y se añadió una gran cantidad de EtOAc. La capa orgánica se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado, se secó (MgSO_{4}) y se concentró al vacío.

Rendimiento:: 1,3 g

MS-ESI: [M+H]^{+} = 389,2

HPLC: R_{f} = 17,44 min, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 1e) eluyente H_{2}O/CH_{3}CN)/CH_{3}OH = 90/ 9,5/0,5 a 0/95/5 (v/v) en 50 minutos.

(g) 5-Amino-2-metiltio-4-(3-(metoxicarboniloxi)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica

Se disolvió 5-amino-2-metiltio-4-(3-hidroxifenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica (Ejemplo
1f,100 mg) en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml). Se añadieron DIPEA (500 \mul) y cloroformiato de metilo (199 \mul) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción se lavó con H_{2}O. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y se concentró a presión reducida. El compuesto del título se purificó por H^LC utilizando columna Luna C-18 con el siguiente gradiente CH_{3}CN/H_{2}O = 10/90 a 90/10 (v/v) en 30 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título desde una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.

Rendimiento:: 93 mg

MS-ESI: [M+H]^{+} = 447,4

HPLC: R_{f} = 17,56 min, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 1e) eluyente H_{2}O/CH_{3}CN) = 40/60 a 0/100 (v/v) en 25 min.

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Ejemplo 2

5-Amino-2-metiltio-4-(p-nitro-fenoxicarboniloxi)-fenilo)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica

Se llevó a cabo la reacción de 5-amino-2-metiltio-4-(3-hidroxifenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica (ejemplo 1 f, 400 mg) con cloroformiato de p-nitrofenilo (207 mg) según los métodos descritos en el Ejemplo 1h. La evaporación del disolvente a presión reducida condujo al compuesto del título bruto.

Rendimiento:: 569

MS-ESI:: [M+H] = 554,6

TLC:: R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).

Ejemplo 3

5-Amino-2-metiltio-4-(3-(1,2,3,6-tetrahidropiridinicarboniloxi)-fenil)-tieno[2,3-d]dipiridin-6-carboxamida terc-butílica

Se disolvió 5-amino-2-metiltio-4-(p-nitro-fenoxicarboniloxi)-fenilo)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica (Ejemplo 2, 142 mg) en CH_{2}Cl_{2}. Se añadieron 1,2,3,6-tetrahidropiridina (117 \mul) y DIPEA (224 \mul) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con H_{2}O. La capa orgánica se concentró a presión reducida. El compuesto del título se purificó por HPLC utilizando columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: CH_{3}CN/H_{2}O = 20/80 (v/v) en 45 minutos. El compuesto del título se liofilizó entonces desde una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.

Rendimiento:: 76 mg

MS-ESI: [M+H]^{+} = 498,2

HPLC: R_{f} = 13,90 min, columna Luna C-18 (2) 150*4,60 mm, flujo 1 ml/min, detección 210 nm, eluyente H_{2}O/CH_{3}CN) = 40/60 a 0/100 (v/v) en 15 minutos.

Ejemplo 4

5-Amino-2-metiltio-4-(3-(p-toluenosulfonamido)-fenil)-tieno[2,3-d]piridina-6-carboxamida terc.butílica (a) 5-Ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-hidroxi-pirimidina

Se agitó a 60ºC durante 16 horas una mezcla de sulfato de S-metil isotiourea (69,0 g), 3-nitrobenzaldehido (75,0 g), cianoacetato de etilo (56,0 ml) y carbonato de potasio (72,5 g) en EtOH absoluto (1500 ml). La mezcla de reacción se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. El precipitado resultante. El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con EtOH absoluto y se disolvió en agua caliente (100ºC). La solución se enfrió a temperatura ambiente, se aciduló con HCl 2N a pH 2 y se enfrió a 0ºC en agua de hielo. El precipitado resultante se recogió por filtración y se lavó con agua. El agua residual del precipitado se separó por evaporación con 1,4-dioxano.

Rendimiento: 54,0 mg

MS-ESI:: [M+H]* = 289,0

TLC:: R_{f} = 0,3, gel de sílice, DCM/MeOH = 9/1 (v/v).

(b) 6-Cloro-5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-pirimidina

Se añadió POCl_{3} (100 ml) a una solución agitada de 5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-hidroxi-pirimidina (Ejemplo 4(a), 25,0 g) en 1,4-dioxano seco (300 ml). Al cabo de 3 horas a 90ºC, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en 1,4-dioxano (100 ml) y la solución resultante se enfrió a 8ºC. Se añadió cuidadosamente agua con hielo. El precipitado resultante se recogió por filtración y se lavó con agua. El agua residual del precipitado se separó por evaporación con 1,4-dioxano.

Rendimiento:: 26,0 g

MS-ESI: [M+H]* = 307,0

TLC: R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).

(c) Etil 5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-(etoxicarbonilmetiltio).pirimidina

Se añadió DIPEA (15,7 ml) a una solución agitada de 2-mercaptoacetato de etilo (9,3 ml) y 6-cloro-5-ciano-4-(3-nitrofenil).2.metiltio-pirimidina (Ejemplo 4(b), 26,0 g) en una mezcla de EtOH (259 ml) y DCM (250 ml). Después de 1 hora a temperatura ambiente, se añadió HCl acuoso 0,1N (500 ml) a la mezcla que se extrajo entonces con DCM (3*500 ml), se secó (mgSO_{4}) y se concentró a presión reducida.

Rendimiento:: 28,0 g

MS-ESI:: [M+H]* = 390.4

TLC:: R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v,v).

(d) 5-Amino-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6.carboxilato de etilo

Se agitó a temperatura de reflujo (100ºC) durante 16 horas una mezcla de etil 5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-(etoxicarbonilmetiltio)-pirimidina (Ejemplo 4(c) 28,0 g) y DIPEA (30 ml) en una mezcla de tolueno (150 ml y EtOH (150 ml). Se enfrió entonces la mezcla hasta temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. Se separó la DIPEA residual por evaporación con tolueno.

Rendimiento:: 28,0 g

MS-ESI:: [M+H]* = 391,2

TLC:: R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v,v).

(e) 5-Amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica

Se disolvió 5-amino-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]-pirimidina-6-carboxilato de etilo (Ejemplo 4d, 780 mg) en 1,4-dioxano (10 ml). Se añadieron etanol (10 ml) y cloruro de estaño(II) (1,1 g) y la mezcla de reacción se agitó durante toda la noche a 90ºC. Después de concentrarse la mezcla de reacción al vacío, se volvió a disolver en EtOAc (50 ml) y se lavó con NaOH acuoso 4M (10 ml), se secó (MgSO_{4}) y se concentró a presión reducida. El grupo éster etílico en el derivado resultante 5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]-pirimidin-6-carboxilato de etilo (558 mg) se saponificó al correspondiente ácido (430 mg) utilizando el método descrito en el Ejemplo 1d y se hizo reaccionar subsiguientemente con terc-butilamina (200 \mul) para formar la correspondiente terc-butilamida (según el Ejemplo 1e). El compuesto del título s purificó por cromatografía sobre gel de sílice con heptano/EtOAc = 3/1 (v/v) como eluyente.

Rendimiento:: 391 mg

MS-ESI:: [M+H]* = 388,0

TLC:: R_{f} = 0,43, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v,v).

(f) 5-Amino.2-metiltio-4-(3-p-toluenosulfonamido)-fenil)tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica

Se disolvió en piridina seca (5 ml) 5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica (Ejemplo 4e, 100 mg) en piridina seca (5 ml). Se añadió cloruro de toluensulfonilo (70 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con HCl acuoso 0,1M. Se secó la capa orgánica (MgSO_{4}) y se concentró a presión reducida. El compuesto del título se purificó por cromatografía sobre gel de sílice con heptano/EtOAc = 3/2 (v/v) como eluyente.

Rendimiento:: 63 mg

MS-ESI: [M+H]^{+} = 542,4

HPLC: R_{f} = 23,46 min, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 1e) eluyente tampón fosfato 50 mM pH2,1/H_{2}O/CH_{3}CN/CH_{3}CH) = 10/72/17/1 a 10/18/68/4 (v/v) en 50 minutos.

Ejemplo 5

5-Amino-2-metiltio-4-(3-(metoxicarbonilamino)-fenil)tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica

Se disolvió en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml) 5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica (Ejemplo 4e, 100 mg). Se añadieron cloroformiato de etilo (199 \mul) y DIPEA (500 \mul) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se lavó la mezcla de reacción con H_{2}O. Se secó la capa orgánica (MgSO_{4}) y se concentró a presión reducida. Se purificó el compuesto del título por HPLC utilizando columna Luna C-18 con el siguiente gradiente CH_{3}CN/CH_{3}CN acuoso al 10% = 10/90 a 90/10 (v/v) en 30 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título desde una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.

Rendimiento:: 80 mg

MS-ESI: [M+H]^{+} = 446,2

HPLC: R_{f} = 20,44 min, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 1e) eluyente tampón fosfato 50 mM pH2,1/ H_{2}O/CH_{3}CN/ = 10/72/18 a 10/18/72 (v/v) en 20 minutos.

Ejemplo 6

5-Amino-2-metiltio-4-(3-(aliloxicarbonilamino)-fenil)tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica

Se llevó a cabo la reacción de 5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica (Ejemplo 4e, 100 mg) (5 ml) con cloroformiato de alilo (274 \mul) utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 5. Se purificó el compuesto del título por HPLC utilizando columna Luna C-18 con el siguiente gradiente CH_{3}CN/CH_{3}CN acuoso al 10% = 10/90 a 90/10 (v/v) en 30 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título desde una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.

Rendimiento:: 66 mg

MS-ESI: [M+H]^{+} = 472,2

HPLC: R_{f} = 22,37 min, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 1e) eluyente tampón fosfato 50 mM pH2,1/ H_{2}O/CH_{3}CN/ = 10/72/18 a 10/18/72 (v/v) en 20 minutos.

Ejemplo 7

5-Amino-2-metiltio-4-(3-(p-nitro-fenoxicarbonilamino)-fenil)tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica

Se disolvió 5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica (Ejemplo 4e, 1g) en CH_{2}Cl_{2} seco (100 ml). A continuación, se añadió una solución de cloroformiato de p-nitro-fenilo (520 mg) en CH_{2}Cl_{2} seco (10 ml), gota a gota y la reacción resultante se agitó a temperatura ambiente. Al cabo de 1 hora, la mezcla de reacción se lavó con H_{2}O. Se secó la capa orgánica (MgSO_{4}) y se concentró a presión reducida.

Rendimiento:: 1,42 g

MS-ESI: [M+H]^{+} = 553,6

TLC: R_{f} = 0,7, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).

Ejemplo 8

5-Amino-2-metiltio-4-(3-(morfolin-4-il)-carbonilamino)-fenil)tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica

Se disolvió 5-amino-2-metiltio-4-(3-(p-nitro-fenoxicarbonilamino)-fenil)tieno-[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida
terc-butílica (Ejemplo 7, 142 mg) en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml). Se añadieron morfolina (112 \mul) y DIPEA (225 \mul) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con H_{2}O. La capa orgánica se concentró a presión reducida. El compuesto del título se purificó por HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: H_{2}O/CH_{3}N = 80/20 a 0/1000 (v/v) en 45 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título a partir de una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.

Rendimiento:: 22 mg

MS-ESI: [M+H]^{+} = 501,2

HPLC:: R_{f} = 8,62 minutos, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 3), eluyente H_{2}O/CH_{3}CN = 40/60 a 0/100 (v/v) en 15 minutos.

Ejemplo 9

5-Amino-2-metiltio-4-(3-(1,2,3,6-tetrahidropiridinocarbonilamino)-fenil)tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc- butílica

Se llevó a cabo la copulación de 5-amino-2-metiltio-4-(3-(p-nitro-fenoxi-carbonilamino)-fenil)tieno-[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida terc-butílica (Ejemplo 7, 142 mg) con 1,2,3,6-tetrahidropiridina (118 \mul) según los métodos descritos en el Ejemplo 8. El compuesto del título se purificó por HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: H_{2}O/CH_{3}N = 80/20 a 0/100 (v/v) en 45 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título a partir de una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.

Rendimiento:: 22 mg

MS-ESI: [M+H]^{+} = 497,2

HPLC:: R_{f} = 11,19 minutos, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 3), eluyente H_{2}O/CH_{3}CN = 40/60 a 0/100 (v/v) en 15 minutos.

Ejemplo 10

Bioactividad de CHO-LH y CHO-FSH in vitro

Se ensayó la actividad agonista para LH de compuestos en células de ovario de hamster chino (CHO) transfectadas establemente con receptor humano de LH y co-transfectadas con un elemento (CRE) de respuesta de AMPc/promotor que dirige la expresión de un gen informador de luciferasa de luciérnaga. La unión de ligando al receptor de LH copulado con Gs dará lugar a un incremento de AMPc, que a su vez inducirá una transactivación de la construcción de informador de luciferasa. La señal de luciferasa se cuantificó utilizando un contador de luminiscencia. Se calcularon cuantitativamente, para los compuestos de ensayo, los valores de EC_{50} (concentración del compuesto de ensayo que causaba una estimulación de la mitad de la máxima (50%). Se utilizó el programa de ordenador GraphPad PRISM, versión 3,0 (GraphPad software Inc., San Diego, con este propósito. Los resultados indicaron que el valor de EC_{50} para los compuestos de los Ejemplos 6, 8 y 9 eran más bajos de 10^{-8}M.

Claims

1. Un compuesto heteroaromático bicíclico seleccionado del grupo que consiste en 5-amino-2-metiltio-4-(3-(alilo-
xicarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]-pirimidina-6-carboxamida terc-butílica, 5-amino-2-metiltio-4-(3-((morfolin-4-
il)-carbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida ter-butílica ó 5-amino-2-metiltio-4-(3-1,2,3,6-tetrahidropiridinocarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica.

2. El compuesto según la reivindicación 1 para utilizarlo en terapia.

3. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto hetero-aromático bicíclico según la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo, en mezcla con una substancia auxiliar farmacéuticamente aceptable.

4. Utilización de un compuesto heteroaromático bicíclico según la reivindicación 1 o una sal o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable para la manufactura de un medicamento para el control de la fertilidad.