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ES2292245T3 - Celulas madre mesenquimaticas cd45+ y/o fibroblasto+humanas. - Google Patents

Celulas madre mesenquimaticas cd45+ y/o fibroblasto+humanas. Download PDF

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ES2292245T3
ES2292245T3 ES99926044T ES99926044T ES2292245T3 ES 2292245 T3 ES2292245 T3 ES 2292245T3 ES 99926044 T ES99926044 T ES 99926044T ES 99926044 T ES99926044 T ES 99926044T ES 2292245 T3 ES2292245 T3 ES 2292245T3
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ES
Spain
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cells
cell
population
stem cells
mesenchymal stem
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES99926044T
Other languages
English (en)
Inventor
Janice M. Davis-Sproul
Mark Aaron Moorman
Renee Marie Mcneil
Donald William Jr. 3024 Ward Road SIMONETTI
Lora Catherine Hammill
Stewart Craig
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Osiris Therapeutics Inc
Original Assignee
Osiris Therapeutics Inc
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Publication date
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract

Una población aislada de células madre mesenquimáticas humanas que comprende células madre mesenquimáticas humanas, que se ha enriquecido para CD45+, de modo que la población celular contiene menos del 5% de células que no son células CD45+.

Description

Células madre mesenquimáticas CD45+ y/o fibroblasto+humanas.
Antecedentes de la invención
Esta solicitud se basa en la solicitud provisional de Estados Unidos Nº de serie 60/087.123 presentada el 29 de mayo de 1998.
Las células madre mesenquimáticas (MSC) son los blastocitos pluripotenciales de formación encontrados entre otros en médula ósea, sangre, dermis y periostio que son capaces de diferenciarse en más de un tipo específico de tejido mesenquimático o conectivo (es decir, los tejidos del cuerpo que soportan los elementos especializados; por ejemplo, los tejidos adiposo, óseo, estroma, cartilaginoso, conectivos elástico y fibroso) dependiendo de diversas influencias de factores bioactivos, tales como citoquinas. El potencial de diferenciarse en células tales como osteoblastos y condrocitos se retiene después del aislamiento y expansión en cultivo; la diferenciación sucede cuando las células se inducen in vitro en condiciones específicas o se colocan in vivo en el sitio de tejido dañado.
Los epítopos de la superficie de las células madre mesenquimáticas humanas (hMSC) son reactivos con ciertos anticuerpos monoclonales conocidos como SH2, SH3 y SH4 descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359. Estos anticuerpos pueden usarse como reactivos para explorar y capturar la población de células madre mesenquimáticas a partir de una población celular heterogénea, tal como existe, por ejemplo, en la médula ósea.
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son los blastocitos pluripotenciales de formación encontrados entre otros en médula ósea y sangre periférica que son capaces de diferenciarse en cualquiera de los tipos específicos de células hematopoyéticas o sanguíneas, tales como eritrocitos, linfocitos, macrófagos y megacariocitos. La expresión de un antígeno o antígenos particulares en la superficie celular o en el citoplasma y la intensidad de expresión indican la fase de maduración y compromiso de linaje de la célula madre hematopoyética. Las células madre hematopoyéticas humanas (hHSC) son reactivas con ciertos anticuerpos monoclonales, tales como CD34, reconocidos como específicos para células hematopoyéticas.
Por tanto, las células madre hematopoyéticas humanas y las células madre mesenquimáticas humanas han sido fácilmente distinguibles por sus perfiles inmunoespecíficos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una población de células madre mesenquimáticas humanas potenciada en células que son positivas para los marcadores de anticuerpos CD45. Como se ha indicado anteriormente en este documento, una célula madre mesenquimática es una que es capaz de diferenciarse en más de un tipo específico de célula de tejido mesenquimático. Los solicitantes han proporcionado una población de células madre mesenquimáticas precursoras ("pre-MSC") que es positiva para CD45. Estas células madre mesenquimáticas precursoras pueden diferenciarse en los diversos linajes mesenquimáticos, por ejemplo, los linajes de condrocitos, adipocitos y osteoblastos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una población de células madre mesenquimáticas humanas que son CD45 positivas y positivas para al menos uno de los marcadores SH2, SH3 o SH4. Las células madre mesenquimáticas de la presente invención son preferiblemente positivas para al menos el marcador SH3. En otro aspecto, las células madre mesenquimáticas precursoras son positivas para el marcador SH2.
Estas células madre mesenquimáticas precursoras pueden obtenerse usando anticuerpos contra marcadores de células mesenquimáticas y hematopoyéticas. Inesperadamente, se descubrió que una cantidad significativa de células positivas para marcadores seleccionados de células madre mesenquimáticas estaban adicionalmente caracterizadas como CD45 positivas. CD45 es un marcador habitualmente encontrado en leucocitos y células hematopoyéticas y no en células madre mesenquimáticas cultivadas. Aunque no se pretender limitarse por ninguna teoría, se cree que la población de células de la presente invención comprende de células precursoras a células madre mesenquimáticas más maduras, aunque no comprometidas.
La invención proporciona adicionalmente un método para recuperar una población aislada de células madre mesenquimáticas humanas CD45+ de médula ósea u otra fuente de células madre mesenquimáticas de un individuo (i) obteniendo tejido de médula ósea u otra fuente de tejido de células madre mesenquimáticas de un donante; (ii) aislando una población de células enriquecida en células madre mesenquimáticas de la misma; y (iii) seleccionando adicionalmente células CD45+ de la población de células madre mesenquimáticas humanas para obtener una población de células madre mesenquimáticas que esté enriquecida en células madre mesenquimáticas CD45+.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para recuperar una población aislada de células madre mesenquimáticas humanas CD45+ que también son positivas para al menos un marcador SH2, SH3 o SH4 de médula ósea u otra fuente de células madre mesenquimáticas de un individuo (i) obteniendo tejido de médula ósea u otra fuente de células madre mesenquimáticas de un donante, (ii) aislando una población de células enriquecida en células madre mesenquimáticas de la misma; (iii) seleccionando de la población celular una población de células madre mesenquimáticas que sea positiva para al menos un marcador SH2, SH3 o SH4; y (iv) seleccionado adicionalmente células CD45+ de la población de células madre mesenquimáticas humanas de la etapa (iii) para obtener una población de células madre mesenquimáticas que sea positiva para al menos un marcador SH2, SH3 o SH4 y CD45+. En una realización preferida, la población celular CD45 es al menos SH3 positiva.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra histogramas FACScan para la expresión de antígenos de superficie celular CD45 en las tres fracciones de células madre mesenquimáticas humanas: Fig. 1A pre-fraccionamiento; Fig. 1B fracción negativa a selección SH3; Fig. 1C fracción positiva a selección SH3.
La Figura 2 muestra los resultados del ensayo de deposición de calcio descrito en el Ejemplo 5.
Descripción detallada de la invención
La presente invención implica el aislamiento y potenciación de una subpoblación de células madre mesenquimáticas humanas. En una realización, la presente invención proporciona una población de células que tienen un fenotipo SH3+/CD45+ y que se cree que son células madre mesenquimáticas precursoras. La población de células madre mesenquimáticas humanas de la presente invención es capaz de diferenciarse en los linajes celulares de condrocitos, adipocitos y osteoblastos.
Las células madre mesenquimáticas de la presente invención pueden aislarse de sangre periférica o médula ósea. "Aisladas" como se usa en este documento significa que las células se ponen en condiciones diferentes a su entorno natural. El término "aisladas" no excluye el uso posterior de estas células después de ello en combinaciones o mezclas con otras células. Se ha descrito un método para preparar cultivos de células madre mesenquimáticas de médula humana en la Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359. Los especialistas en la técnica conocen varias técnicas para el aislamiento rápido de células madre mesenquimáticas. Los enfoques para el aislamiento de células madre mesenquimáticas incluyen leucoféresis, fraccionamiento en gradiente de densidad, inmunoselección y separación por adhesión diferencial.
Las células de la presente invención se mantienen en medios de cultivo que pueden ser medios sin suero definidos químicamente o pueden ser un "medio completo", tal como el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco Suplementado con suero al 10% (DMEM). Se describen medios sin suero definidos químicamente adecuados en la Patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/464.599 y WO96/39487, y se describen "medios completos" en la Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359. El Medio Definido Químicamente comprende un medio esencial mínimo tal como el Medio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) (Gibco), suplementado con albúmina de suero humano, lipoproteína Ex Cyte humana, transferrina, insulina, vitaminas, aminoácidos esenciales y no esenciales, piruvato sódico, glutamina y un mitógeno. Estos medios estimulan el crecimiento de células madre mesenquimáticas sin diferenciación.
Las células madre mesenquimáticas de la presente invención aisladas de sangre periférica o médula ósea pueden adicionalmente expandirse en cultivo. Las células pueden expandirse, antes o después de su congelación. Los medios descritos en este documento también son adecuados para la expansión en cultivo de las células madre mesenquimáticas.
Las células madre mesenquimáticas aisladas de la presente invención pueden purificarse adicionalmente. En una realización preferida, "purificada" indica que la población celular contiene menos del 5% de impurezas, siendo las impurezas, por ejemplo, células que no son CD45+. La población celular purificada después puede usarse en combinaciones o mezclas según sea apropiado.
La presente invención contempla cualquier medio adecuado para emplear anticuerpos monoclonales para separar células madre mesenquimáticas de otras células, por ejemplo, las recuperadas de médula ósea. Por consiguiente, se incluye en la presente invención un método para producir una población de células madre mesenquimáticas que comprende las etapas de proporcionar una suspensión celular de tejido que contiene células madre mesenquimáticas; poner en contacto la suspensión celular con uno o una combinación de anticuerpos monoclonales que reconocen un epítopo en las células madre mesenquimáticas; y separar y recuperar de la suspensión celular las células unidas por los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden unirse a una fase sólida y utilizarse para capturar células madre mesenquimáticas de muestras tisulares. Las células unidas después pueden separarse de la fase sólida por métodos conocidos dependiendo de la naturaleza del anticuerpo y la fase sólida.
Los sistemas basados en anticuerpos monoclonales apropiados para preparar la población celular deseada incluyen columna de perlas magnéticas/partículas paramagnéticas utilizando anticuerpos para selección positiva o negativa; separación basada en afinidad a biotina o estreptavidina; y clasificación por citometría de flujo de elevada velocidad de células madre mesenquimáticas teñidas por inmunofluorescencia mezcladas en una suspensión de otras células. Por tanto, el método de la presente invención incluye el aislamiento de una población de hMSC y su potenciación usando anticuerpos monoclonales producidos contra antígenos superficiales expresados por hMSC derivadas de médula, es decir SH2, SH3 o SH4. Los depósitos de los cultivos de línea celular identificados como SH2, SH3 y SH4 están en el depósito de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, y están asignados a los números de acceso de la ATCC HB 10743, BH 10744 y HB 10745, respectivamente. Estos anticuerpos monoclonales proporcionan sondas eficaces que pueden utilizarse para identificar, cuantificar, y purificar células madre mesenquimáticas, independientemente de su fuente en el cuerpo.
En una realización, el aislamiento de la población celular de la presente invención puede comprender utilizar una combinación de uno o más anticuerpos que reconocen un marcador conocido en las células madre mesenquimáticas así como un anticuerpo que reconoce CD45. Un método para dicha preparación de las células precursoras de la presente invención es seleccionar primero una población de células que expresan un marcador que identifica células madre mesenquimáticas, por ejemplo, SH3 o SH2 por selección inmunomagnética de una muestra celular de médula ósea humana de baja densidad. Como alternativa, se contempla que la selección celular inicial puede basarse en el marcador CD45 y la población celular puede caracterizarse adicionalmente usando los anticuerpos monoclonales hMSC.
En otra realización, se contempla que una población celular puede seleccionarse en base al marcador CD14. CD14 es una proteína de membrana que funciona como un receptor para endotoxinas (lipopolisacárido, LPS) y se expresa en gran medida en la superficie de monocitos, pero no se expresa por progenitores mieloides.
Por tanto, en un aspecto, en ciertas realizaciones descritas en este documento, la población de células madre mesenquimáticas Población 1 (Pob. 1) se identifica por FACS por el brillo relativo de los anticuerpos teñidos con inmunofluorescencia unidos a la misma como SH2 y SH3 brillante/CD45 débil/CD14 débil. En comparación, SH2 y SH3 están presentes en MSC expandidas en cultivo; CD45 está ausente en MSC expandidas en cultivo; y CD14 está ausente en MSC expandidas en cultivo.
En un aspecto adicional más de la invención, puede seleccionarse una población celular en base a un marcador superficial de fibroblastos, por ejemplo el anticuerpo anti-fibroblastos encontrado en microperlas anti-fibroblastos Miltenyi (Miltenyi Nº catalog. 506-01).
Se contempla adicionalmente que los métodos descritos anteriormente en este documento pueden aplicarse a una población de células madre mesenquimáticas expandidas en cultivo de modo que las células que tienen un fenotipo Pob. 1 puedan aislarse de la población de células madre mesenquimáticas expandidas en cultivo.
La presente invención se refiere a diversos métodos para utilizar las células madre mesenquimáticas humanas CD45+ de la presente invención para propósitos terapéuticos y/o de diagnóstico. Estos usos incluyen regenerar tejidos mesenquimáticos que se han dañado a través de una lesión aguda, expresión genética anormal o enfermedad adquirida; tratar a un hospedador que tiene tejido mesenquimático dañado por la retirada de pequeñas alícuotas de médula ósea, aislamiento de sus células madre mesenquimáticas y el tratamiento del tejido dañado con las hMSC CD45+ combinadas con un material vehículo biocompatible adecuado para suministrar las MSC a los sitios de tejido dañado; producir diversos tejidos mesenquimáticos; detectar y evaluar factores de crecimiento o factores inhibidores pertinentes para la auto-regeneración de las MSC y la diferenciación en linajes mesenquimáticos comprometidos; y desarrollar linajes celulares mesenquimáticos y ensayar factores con desarrollo de tejido mesenquimático.
Las hMSC de la presente invención pueden usarse en una diversidad de modos. Por ejemplo, las hMSC pueden emplearse como parte de una terapia de reemplazo celular. Específicamente, las hMSC pueden infundirse solas o añadidas a células de médula ósea para procedimientos de transplante de médula ósea. Otras aplicaciones también contempladas particularmente son ortopédicas, tales como aumento de la formación ósea. Otras aplicaciones incluyen, por ejemplo, el tratamiento de osteoartritis, osteoporosis, afecciones traumáticas o patológicas que implican cualquiera de los tejidos conectivos, tales como defectos óseos, defectos del tejido conectivo, defectos esqueléticos o defectos del cartílago. También se contempla que puede introducirse material genético exógeno en las células mientras están ex vivo, y que las células pueden readministrarse para la producción de proteínas exógenas in vivo. La modificación genética de las células madre mesenquimáticas se analiza más completamente en la Patente de Estados Unidos Nº 5.591.625.
La presente invención no se limita a un método específico para recuperar las células. Por ejemplo, dichas células pueden aislarse por procedimientos que no usen anticuerpos, con la condición de que las células sean positivas para CD45 y son positivas para al menos uno de SH2, SH3 o SH4, preferiblemente al menos SH3, y sean capaces de diferenciarse en uno o más de un linaje de células mesenquimáticas, y preferiblemente en la mayoría, sino todos, los linajes de células mesenquimáticas. En una realización particularmente preferida, las células también son capaces de auto-renovación. Por tanto, una célula madre mesenquimática humana que sea SH3+ y CD45+ de acuerdo con la invención puede recuperarse por técnicas diferentes al uso de anticuerpos SH3+ y CD45+. Por tanto, la expresión "célula madre mesenquimática humana que es SH3+ y CD45+" significa una célula madre que tiene ambos marcadores y que es capaz de diferenciarse en más de un linaje de células madre mesenquimáticas.
A continuación se proporcionan ejemplos para ilustrar adicionalmente y describir la presente invención; sin embargo, no se pretende que el alcance de la presente invención se limite por ellos.
Ejemplo 1 Aislamiento de hMSC de Médula Ósea Humana
Se obtuvieron aspirados de médula ósea de tres voluntarios, donantes 271, 281 y 332. Se realizó una centrifugación por densidad de los aspirados de médula ósea usando solución de Densidad de Flotación de Terapia Celular Activada (ACT) (1,0720 g/ml) en tubos cónicos (Dendreon, Mountain View CA) y se aislaron las células de la fracción de baja densidad. Las células se lavaron y se resuspendieron en PBS de Dulbecco a una concentración de 2 x 10^{7} células/ml. Las células se incubaron con anticuerpo de bloqueo (1 mg IgG humana/ml en PBS sin azida) durante 10 minutos a 4ºC con rotación seguido de una incubación de 30 minutos a 4ºC con 1 \mug de anticuerpos SH3/1 x 10^{7} células. Las células de los donantes 1 y 2 se lavaron dos veces con PBS/BSA al 0,5% y se resuspendieron en PBS a 2 x 10^{7} células/ml. Se añadieron perlas Dynal (lavadas 3 veces con PBS) y la suspensión se mezcló durante 30 minutos a 4ºC. Las células unidas se separaron magnéticamente de las células no unidas. Las células del donante 332 se lavaron 2x con tampón de Miltenyi y se incubaron durante 20 minutos a 4ºC con mezcla con perlas de anticuerpo de rata anti-lgG2 de ratón (1 ml de microperlas por 5 x 10^{8} células) (50 nm Miltenyi Biotec, Auburn, CA) y se seleccionaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se analizaron tres poblaciones celulares de cada donante: la fracción de inicio (células sin separar de baja densidad), células SH3 seleccionadas (células unidas a las perlas magnéticas derivatizadas) y células SH3 no seleccionadas (células que no se unieron a las perlas derivatizadas). Los contenidos de células madre hematopoyéticas y mesenquimática de las tres muestras se ensayaron como se describe a continuación.
Cantidades de Células. Las cantidades de células contenidas en las fracciones se muestran en la Tabla 1. Las fracciones SH3 seleccionadas contenían un 4,2, 4,8, y 6,2% de las células de inicio. Las fracciones SH3 no seleccionadas produjeron un 88, 70, y 87% de las células de inicio.
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TABLA 1
1 
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Ensayo F de Unidades Formadores de Colonias. El ensayo CFU-F mide colonias que han crecido en medios de cultivo completos. Se suspendieron células nucleadas en medio hMSC a una concentración de 2 x 10^{6} células en 40 ml, y se sembraron en placas de cultivo tisular de 100 mm a 5 x 10^{5} células por placa. Después de 14 días se fijaron las células con glutaraldehído y se tiñeron con violeta de cristal. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2
2 
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La fracción SH3 seleccionada mostró enriquecimiento para las colonias en comparación con la muestra celular de inicio; de hecho, la fracción seleccionada en Miltenyi (donante 332) tuvo demasiadas colonias para contarlas. En la fracción SH3 no seleccionada uno de los 3 ensayos CFU-F tuvo solamente 0,7 colonias por 50.000 células sembradas, mientras que los otros 2 cultivos no tuvieron crecimiento de colonias.
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TABLA 3
3 
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Cultivo de células madre mesenquimáticas. Se añadieron 3,2 x 10^{6} células de los Donantes 271 y 281 en 2 pocillos de una placa de 6 pocillos. Las células se recogieron después de 13 días en cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Para la muestra del donante 332 cada pocillo se sembró con 0,8 x 10^{6} células. En el Día 11, en base al examen microscópico, se recogieron dos de los cuatro pocillos de células SH3 seleccionadas. Todos los demás pocillos se recogieron después de 14 días en cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Los resultados de los cultivos de MSC mostraron que las células SH3 seleccionadas se expandieron con la misma o mayor eficacia que la fracción celular de inicio y las células recogidas tenían la morfología y fenotipo distintivos de MSC. En medio de cultivo completo de MSC después del cultivo primario el rendimiento celular de esta fracción SH3 no seleccionada fue bajo (1,3, 3,8, y 1,6%) en comparación con las fracciones celulares de inicio (17,5, 19,4, y 44,5%, respectivamente).
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TABLA 4
5 
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TABLA 5
6 
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Las células de los donantes 271 y 281 continuaron en cultivo y las células del Pase 1 se recogieron y se examinaron por citometría de flujo; las células eran MSC por morfología y fenotipo. La observación visual de estos cultivos durante P0 mostró que las colonias tipo MSC también contenían células con perlas magnéticas unidas. Las células se volvieron a sembrar en matraces o pocillos dependiendo de las células totales disponibles. Las células se recogieron después de 8 días en cultivo.
TABLA 6
7 
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Se analizaron las células cultivadas de la recogida SH3 seleccionada del Día 11. Las células eran SH2+, SH3+, SH4+ y CD45-, correspondientes a un fenotipo de célula madre mesenquimática cultivada madura.
Análisis de Citometría de Flujo. Las fracciones celulares del Donante 332 se analizaron usando marcadores antigénicos SH3 y CD45. La Figura 1 muestra el histograma FACS del análisis CD45.
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TABLA 7a
8 
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TABLA 7b
9 
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Los resultados de las Tablas 7a y b del análisis de flujo de la muestra del donante 332 demostraron una pureza de SH3 del 98,8% con siendo más del 99,5% de estas células CD45+. La cantidad total de células CD45- en la muestra fue del 0,42%.
Los resultados indicaron que el precursor para la célula madre mesenquimática observado en cultivo era SH3 positivo y CD45 positivo y esta célula puede aislarse usando anticuerpos contra SH3 junto con perlas inmunomagnéticas u otros métodos de inmunoselección.
Ejemplo 2 Aislamiento de MSC usando selección de células SH2
Se usaron anticuerpos anti-SH2 conjugados con biotina y microperlas magnéticas de anticuerpos de rata anti-IgG1 de ratón para aislar dos fracciones de células de las células de médula ósea de baja densidad: SH2 unidas y SH2 no unidas. Estas fracciones celulares se pusieron en condiciones de cultivo de MSC convencionales para determinar el potencial proliferativo MSC de la población celular contenida en estas fracciones.
Las microperlas anti-IgG1 eran de Miltenyi Lote Nº NE7200. La Columna VS era de Miltenyi Lote Nº 0231. Los filtros de pre-separación eran de 30 \mum de Miltenyi Lote Nº 55. Tampón de Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. Se realizó tinción de flujo usando las instrucciones sugeridas por el fabricante. El análisis de flujo se realizó usando el FACS Calibur o el FACS Vantage. La viabilidad celular y la cantidad de células se determinaron usando azul tripán.
Se aislaron células de baja densidad de un aspirado de médula ósea humana (donante Nº 426) usando solución BDS72 de Dendreon (Seattle, WA) siguiendo una centrifugación por densidad de los aspirados de médula ósea. Se retiraron alícuotas como controles para el análisis de flujo y cultivo celular. Las células restantes se diluyeron a un recuento celular de 2 x 10^{7} células/ml usando tampón de Miltenyi. Las células se incubaron con IgG a 40 \mul por ml de suspensión celular durante 10 minutos a 4ºC con mezcla. La células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se incubó con el anticuerpo anti-SH2 a 10 \mug por 1 x 10^{7} células durante 30 minutos a 4ºC con mezcla. Las células se lavaron dos veces con tampón frío. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (80 \mul de tampón por 10^{7} células). Se añadieron microperlas anti-lgG1 (20 \mul de perlas por 10^{7} células). La mezcla se incubó a 4ºC durante 15 minutos con mezcla. Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la mezcla y lavar las células. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (0,5 ml de tampón por 10^{8} células). La columna VS se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. El pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "SH2 no unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "SH2 no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "SH2 unida". Se añadieron cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se preparó una columna nueva y se añadieron las células del tubo "SH2 unida" a la segunda columna. La suspensión de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "SH2 no unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "SH2 no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "SH2 unida". Se añadieron cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se realizaron recuentos celulares y ensayos de viabilidad. Las células de las fracciones unida y no unida se tiñeron para el análisis de flujo. Las células no unidas y unidas se pusieron en cultivo. Las células se recogieron después de 14 días. Las células de la fracción de células de baja densidad y la fracción SH2 unida se tiñeron para el análisis de flujo.
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TABLA 8
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TABLA 9
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TABLA 10
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La selección de células SH2 de células de médula ósea de baja densidad usando el sistema de microperlas Miltenyi produjo menos del 2% de las células de baja densidad en la fracción SH2 unida. El aislamiento produjo una fracción celular que contenía células que eran un 98,3% SH2+. Las células SH2 unidas eran un 90% confluyentes con células ahusadas después de 14 días en cultivo en condiciones de cultivo de MSC convencionales. El cultivo de las células SH2 unidas produjo una población de células adherentes que tenían un fenotipo MSC por análisis de flujo y morfología. Se aislaron muy pocas células adherentes de la fracción de células SH2 no unidas. Estos resultados muestran que SH2 es un antígeno presente en el precursor MSC así como en las MSC expandidas en cultivo.
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Ejemplo 3 Aislamiento de Cultivos MSC P0 usando Selección de Células CD45
Se ha informado de que cultivos MSC P0 contienen una media del 9% de células CD45+ (intervalo, del 0,5 al 50%), mientras que el fenotipo expandido en cultivo de MSC es CD45 negativo. Se realizó una selección CD45 de células P0 en tres donantes para determinar si las MSC podrían cultivarse a partir de la fracción de células CD45 unidas.
Las microperlas anti-CD45 eran de Miltenyi (Lote Nº NE5848). La Columna de Separación de Células Grandes era de Miltenyi (Nº Cat. 422-02). Tampón de Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. La tinción de flujo se realizó usando las instrucciones sugeridas por el fabricante. El análisis de flujo se realizó usando el FACS Calibur o el FACS Vantage. Se determinaron la viabilidad celular y la cantidad de células usando azul tripán.
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Las MSC P0 se obtuvieron de las células de médula ósea humana de baja densidad (donantes Nº 394 (0), Nº 386 (0) y Nº 381 (0)). Se retiraron muestras de 0,5 - 5,0 x 10^{6} células como controles para el análisis de flujo. Las células restantes se diluyeron a un recuento celular de 2 x 10^{7} células/ml usando Tampón de Miltenyi; si el recuento era < 2 x 10^{7} células/ml se saltaba esta etapa. Las células se incubaron con IgG a 40 \mul por ml de suspensión celular durante 10 minutos a 4ºC con mezcla. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 1100 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (80 \mul de tampón por 10^{7} células). Se añadieron microperlas anti-CD45 (20 \mul de perlas por 10^{7} células). La mezcla se incubó a 4ºC durante 15 minutos con mezcla. Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la mezcla y lavar las células. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1100 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (0,5 ml de tampón por 10^{8} células). La Columna de Separación de Células Grandes se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió a la columna y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "CD45 no unida". La columna se aclaró tres veces con 0,5 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "CD45 no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "CD45 unida". Se añadió un ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se preparó una columna de células grandes nueva siguiendo las instrucciones del fabricante y las células del tubo "CD45 unida" se añadieron a la segunda columna. La suspensión de células/microperlas se añadió a la columna y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "CD45 no unida". La columna se aclaró tres veces con 0,5 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "CD45 no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "CD45 unida". Se añadió un ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se realizaron recuentos celulares y ensayos de viabilidad. Las células de las fracciones unida y no unida (Nº 394) y la fracción no unida (Nº 386 y Nº 381) se tiñeron para el análisis de flujo. Las células se pusieron en cultivo. Las células se recogieron y se pasaron hasta que estuvo disponible una cantidad adecuada de células para el análisis de flujo.
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TABLA 21
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La selección CD45 de MSC P0 produjo una población celular que era < 2% de la población P0 de inicio. Las células CD45 unidas cultivadas aisladas a partir de las MSC P0 produjeron MSC definidas por citometría de flujo y morfología. La fracción celular CD45 no unida aislada de MSC P0 también produjo MSC definidas por citometría de flujo y morfología. El fenotipo del precursor MSC parecía ser CD45 débil.
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Ejemplo 4 Aislamiento de MSC usando Selección CD45
Se seleccionaron células de baja densidad aisladas de médula ósea usando directamente microperlas Miltenyi anti-CD45 conjugadas (Miltenyi Lote Nº NE5848) siguiendo las instrucciones del fabricante. La Columna VS era de Miltenyi (Lote Nº 0231). Los filtros de pre-separación de 30 \mum eran de Miltenyi (Lote 55). Tampón de Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. La tinción de flujo se realizó usando las instrucciones sugeridas por el fabricante. El análisis de flujo se realizó usando el FACS Calibur o el FACS Vantage. Se determinaron la viabilidad celular y la cantidad de células usando azul tripán.
Se aislaron células de baja densidad de aspirado de médula ósea humana (donante Nº 358) usando solución BDS72 de Dendreon siguiendo una centrifugación por densidad de los aspirados de médula ósea. Se retiraron alícuotas como controles para el análisis de flujo y cultivo celular. Las células restantes se diluyeron a un recuento celular de 2 x 10^{7} células/ml usando tampón de Miltenyi. Las células se incubaron con IgG a 40 \mul por ml de suspensión celular durante 10 minutos a 4ºC con mezcla. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (80 \mul de tampón por 10^{7} células). Se añadieron microperlas anti-CD45 (20 \mul de perlas por 10^{7} células). La mezcla se incubó a 4ºC durante 20 minutos con mezcla. Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la mezcla y lavar las células. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (0,5 ml de tampón por 10^{8} células). La columna VS se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. El pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "CD45 no unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "CD45 no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "CD45 unida". Se añadieron cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se preparó una columna nueva y las células del tubo "CD45 unida" se añadieron a la segunda columna. El pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "CD45 no unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "CD45 no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "CD45 unido". Se añadieron cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se realizaron recuentos celulares y ensayos de viabilidad. Las células de las fracciones unida y no unida se tiñeron para el análisis de flujo. Las células se pusieron en cultivo. Se recogieron y se contaron las células.
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TABLA 25
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Estaba presente el cuarenta y siete por ciento de las células en la fracción CD45 unida. Esta población celular CD45 unida era el 99% CD45 positiva por análisis de flujo y era capaz de producir MSC en P0 definido por la morfología. La fracción celular CD45 no unida era el 35% de las células totales seleccionadas y era el 51,5% CD45 positiva. La intensidad de fluorescencia de las células CD45 no unidas era muy inferior a la de las células CD45 unidas. Esta fracción celular también era capaz de producir MSC en cultivo P0 definido por la morfología. Este experimento proporciona evidencias adicionales de que el precursor MSC es CD45 positivo con una intensidad de tinción débil.
Ejemplo 5 Aislamiento de MSC usando Selección Celular de Fibroblastos
Se desarrollaron microperlas anti-fibroblastos para la separación de células basada en la expresión de un antígeno específico de fibroblastos. Como las MSC cultivadas tienen una morfología de fibroblastos, se usaron microperlas anti-fibroblastos para seleccionar una fracción de células a partir de células de médula ósea de baja densidad. Las células que se unieron y las que no se unieron se pusieron en condiciones de cultivo de MSC convencionales y se observaron.
Las microperlas anti-fibroblastos eran de Miltenyi (Lote Nº NE630). La Columna VS era de Miltenyi (Lote Nº 0231). Los filtros de pre-separación de 30 \mum eran de Miltenyi (Lote Nº 55). Tampón de Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. La tinción de flujo se realizó siguiendo las instrucciones sugeridas por el fabricante. El análisis de flujo se realizó usando el FACS Calibur o el FACS Vantage. Se determinaron la viabilidad celular y la cantidad de células usando azul tripán.
Los ensayos se realizaron del siguiente modo para medir el potencial osteogénico y adipogénico de las células.
Ensayo de adipogénesis. Se sembraron las células en una placa de 6 pocillos (2 x 10^{5} células/pocillo) en medios hMSC. Las MSC confluyentes se indujeron por pulsos con medios de elevado contenido de glucosa que contenían dexametasona, insulina, 3-isobutil-1-metil-xantina e indometacina. Al final del periodo de cultivo, las placas se fijaron con formalina al 10%, se tiñeron con Aceite Rojo "O" y se contratiñeron con hematoxilina. Se observó la formación de vacuolas lipídicas que se tiñeron de rojo y se semi-cuantificaron por porcentaje de área superficial de pocillo.
Ensayo de deposición de calcio osteogénico. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (3 x 10^{4} células/pocillo). A los pocillos marcados como "OS" se les suministró medios hMSC que contenían suplementos de ácido ascórbico-2-fosfato, dexametasona y \beta-glicerofosfato. A los pocillos marcados como "Control" se les suministró medios hMSC convencionales. Se realizaron cambios de los medios dos veces a la semana durante 14 a 16 días La deposición aumentada de calcio se midió a través de ensayos colorimétricos semi-cuantitativos.
Se aislaron células de baja densidad de aspirados de médula ósea humana (donantes Nº 373, Nº 386 y Nº 421) usando solución BDS72 de Dendreon siguiendo una centrifugación por densidad de los aspirados de médula ósea. Se retiraron alícuotas como controles para cultivo celular. Las células restantes se diluyeron a un recuento celular de 2 x 10^{7} células/ml usando tampón de Miltenyi. Las células se incubaron con IgG a 40 \mul por ml de suspensión celular durante 10 minutos a 4ºC con mezcla. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (80 \mul de tampón por 10^{7} células). Se añadieron microperlas anti-fibroblastos (20 \mul de perlas por 10^{7} células). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos con mezcla. Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la mezcla y lavar las células. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (1 ml de tampón por 10^{8} células). La columna VS se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. El pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "fibroblasto-unida". Se añadieron cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se preparó una columna nueva y las células del tubo "fibroblasto-unida" se añadieron a la segunda columna. El pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "fibroblasto-unida". Se añadieron cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se realizaron recuentos celulares y ensayos de viabilidad. Las células de los donantes 373 y 386 se pusieron en cultivo. Las células se recogieron y se pasaron. Las células P0 del control de baja densidad y los cultivos de células fibroblasto-unidas del donante 373 se tiñeron para el análisis de flujo. Las células P0 del donante 386 se pusieron en el ensayo de diferenciación osteogénica in vitro y el ensayo adipogénico in vitro. Los cultivos de los ensayos adipogénicos mostraron adipogénesis significativa de las MSC.
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TABLA 26
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TABLA 33
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Los resultados del ensayo de calcio para las fracciones celulares de baja densidad y fibroblasto-unida del Donante 386(1) se muestran en la Tabla 39 y la Figura 2.
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TABLA 34
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La fracción celular fibroblasto-unida de células de médula ósea de baja densidad representaba el 3-9% de la población celular nucleada de inicio y se adherían a poliestireno. En condiciones de cultivo de MSC convencionales, la fracción celular fibroblasto-unida produjo una población de MSC definida por citometría de flujo, ensayos biológicos y morfología.
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Ejemplo 6 Aislamiento de MSC usando Selección Celular de Fibroblastos y CD14
Las microperlas anti-fibroblastos eran de Miltenyi (Lote Nº NE6836). La Columna VS era de Miltenyi (Lote Nº 0231). Los filtros de pre-separación de 30 \mum eran de Miltenyi (Lote Nº 55). Tampón de Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. Las perlas magnéticas anti-CD14 eran de Dynal (Lote Nº A93900). La tinción de flujo se realizó siguiendo las instrucciones sugeridas por el fabricante. El análisis de flujo se realizó usando el FACS Calibur o el FACS Vantage. Se determinaron la viabilidad celular y la cantidad de células usando azul tripán.
Se aislaron células de baja densidad a partir de un aspirado de médula ósea humana (donante Nº 391) usando solución BDS72 de Dendreon siguiendo una centrifugación por densidad de los aspirados de médula ósea. Se retiraron alícuotas como controles para cultivo celular. Las células restantes se diluyeron a un recuento celular de 2 x 10^{7} células/ml usando tampón de Miltenyi. Las células se incubaron con IgG a 40 \mul por ml de suspensión celular durante 10 minutos a 4ºC con mezcla. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (80 \mul de tampón por 10^{7} células). Se añadieron microperlas anti-fibroblastos (20 \mul de perlas por 10^{7} células). La mezcla se incubó a 4ºC durante 15 minutos con mezcla. Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la mezcla y lavar las células. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (1 ml de tampón por 10^{8} células). La columna VS se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. El pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "fibroblasto-unida". Se añadieron cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se preparó una columna nueva y las células del tubo "fibroblasto-unida" se añadieron a la segunda columna. El pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "fibroblasto-unida". Se añadieron cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se realizaron recuentos celulares y ensayos de viabilidad. Las células no unidas se pusieron en cultivo. Las células unidas se incubaron con perlas magnéticas anti-CD14 Dynal a una concentración celular de 2 x 10^{7} células por ml y una concentración de perlas de 2 x 10^{7} perlas por ml durante 1 hora a 4ºC con mezcla. La suspensión de células/perlas se puso cerca del imán manual Dynal durante 2 minutos. Después de 2 minutos, las células no unidas se decantaron en un tubo etiquetado "CD14 no unida". El tubo de células/perlas se retiró del imán y se añadieron 5 ml de tampón para resuspender las células. La suspensión de células/perlas se puso cerca del imán manual Dynal durante 2 minutos. Después de 2 minutos, las células no unidas se decantaron en un tubo etiquetado "CD14 no unida". El tubo de células/perlas se retiró del imán y se añadieron 5 ml de tampón para resuspender las células. La suspensión de células/perlas se puso cerca del imán manual Dynal durante 2 minutos. Después de 2 minutos, las células no unidas se decantaron en un tubo etiquetado "CD14 no unida". El tubo de células/perlas se retiró del imán y se añadieron 5 ml de tampón para resuspender las células. Las células que permanecieron unidas a las perlas se contaron y se pusieron en cultivo en dos pocillos de 10 cm^{2}. Las células del tubo sin unión se colocaron cerca del imán manual durante 2 minutos. Las células no unidas se decantaron, se contaron y se sembraron en un pocillo de 10 cm^{2}. Las células se recogieron después de 14 días. Las células cultivadas a partir de las fracciones celulares de baja densidad y fibroblasto-unida/CD14 unida se tiñeron para el análisis de flujo.
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TABLA 35
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TABLA 39
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Para definir adicionalmente el fenotipo del precursor MSC, se realizó una selección celular secuencial usando microperlas Miltenyi para seleccionar células fibroblasto-unidas, seguida del uso de perlas magnéticas Dynal para aislar células CD14 unidas a partir de la fracción fibroblasto-unida. Esto es posible ya que el tamaño de las microperlas es demasiado pequeño para impedir la selección con Dynal.
Usando esta técnica, la fracción celular fibroblasto-unida/CD14 unida era aproximadamente el 1,3% de la población celular de baja densidad de inicio. Las células fibroblasto-unidas/CD14 unidas, cuando se colocan en condiciones de MSC convencionales, se adherían a matraces de poliestireno y después de 14 días de cultivo, producían una población de MSC definida por análisis de flujo y morfología.
En base a esta única selección, parecería que el precursor MSC es una célula fibroblasto+, CD14+. Esto es inesperado ya que la MSC expandida en cultivo es una célula fibroblasto+, CD14 negativa.
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Ejemplo 7 Aislamiento de MSC usando Selección Celular de Fibroblastos y Clasificación por Flujo
Las microperlas anti-fibroblastos eran de Miltenyi (Lote Nº NE7105). La Columna VS era de Miltenyi (Lote Nº 0231). Los filtros de pre-separación de 30 \mum eran de Miltenyi (Lote Nº 55). Tampón de Miltenyi: solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 suplementada con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. La tinción de flujo se realizó siguiendo las instrucciones sugeridas por el fabricante. El análisis de flujo se realizó usando el FACS Calibur o el FACS Vantage. La clasificación por flujo se realizó en el FACS Vantage. La determinación de viabilidad celular y cantidad de células se hizo usando azul tripán. El potencial osteogénico se midió usando el método descrito en el Ejemplo 5 y con un ensayo de cubo osteogénico in vivo descrito, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.486.359. Se realizaron ensayos adipogénicos de acuerdo con métodos descritos en el Ejemplo 5.
Los ensayos de condrogénesis se realizaron del siguiente modo. Las células se sedimentaron en un tubo cónico de 15 ml (2,5 x 10^{5} células/gránulo) en medios condrogénicos, compuestos por elevado contenido de glucosa, dexametasona y TGF-\beta3. Los gránulos se sometieron a histología para embeberlos, seccionarlos de forma delgada y teñirlos histoquímicamente. La presencia de condrocitos se detectó usando Azul de Toluidina, que tiñe proteoglicanos y con un anticuerpo específico para colágeno de tipo II.
Se aislaron células de baja densidad de aspirados de médula ósea humana (donantes Nº 401 y Nº 438) usando solución BDS72 de Dendreon siguiendo una centrifugación por densidad de los aspirados de médula ósea. Se retiraron alícuotas como controles para el análisis de flujo y cultivo celular. Las células restantes se diluyeron a un recuento celular de 2 x 10^{7} células/ml usando tampón de Miltenyi. Las células se incubaron con IgG a 40 \mul por ml de suspensión celular durante 10 minutos a 4ºC con mezcla. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (80 \mul de tampón por 10^{7} células). Se añadieron microperlas anti-fibroblastos (20 \mul de perlas por 10^{7} células). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos con mezcla. Se añadió tampón de Miltenyi para diluir la mezcla y lavar las células. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento celular se resuspendió en tampón de Miltenyi (1 ml de tampón por 10^{8} células). La columna VS se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. El pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "fibroblasto-unida". Se añadieron cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se preparó una columna nueva y las células del tubo "fibroblasto-unida" se añadieron a la segunda columna. El pre-filtro se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante. La suspensión de células/microperlas se añadió al pre-filtro y la suspensión se drenó a través de la columna. El efluente se recogió como la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se aclaró dos veces con 3 ml de tampón de Miltenyi y este efluente se añadió a la fracción "fibroblasto-no unida". La columna se retiró del imán y se colocó sobre un tubo etiquetado "fibroblasto-unida". Se añadieron cinco ml de tampón de Miltenyi a la columna y se usó un émbolo de jeringa para empujar las células en el tubo. Se realizaron recuentos celulares y ensayos de viabilidad.
Las células de la fracción fibroblasto-no unida se tiñeron para el análisis de flujo. Las células de la fracción fibroblasto-unida se incubaron con anticuerpos anti-SH3, anti-CD45 y anti-CD14. Se clasificaron las células: el Donante 401 se clasificó en dos grupos: población 1 y población 2. El Donante 438 se clasificó en tres grupos: población 1, población 1a y población 2. Las células de la fracción fibroblasto-no unida (solamente Donante 401) y las poblaciones clasificadas se pusieron en cultivo. Las células P0 se recogieron y se pasaron. Las células P1 de los cultivos de baja densidad y población 1 del donante Nº 401 se tiñeron para citometría de flujo y se pusieron en el ensayo de cubo in vivo. Las células P1 para el donante Nº 438 se pasaron. Las células P2 de los cultivos de baja densidad, población 1 y población 1a del donante Nº 438 se tiñeron para citometría de flujo y se pusieron en los ensayos biológicos in vitro (osteogénico, adipogénico y condrogénico).
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TABLA 46
48 
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TABLA 47
49 
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TABLA 48
50 
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TABLA 49
51 
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TABLA 50
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TABLA 51
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TABLA 52
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Todas las muestras medidas positivas se evaluaron por criterios de aceptación establecidos.
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TABLA 53
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Todas las muestras medidas positivas se evaluaron por criterios de aceptación establecidos.
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TABLA 54a
56 
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TABLA 54b
57 
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TABLA 54c
58 
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Todas las muestras medidas positivas se evaluaron por criterios de aceptación establecidos.
Para definir adicionalmente el fenotipo del precursor MSC, las células de médula ósea de baja densidad fibroblasto-unidas se tiñeron con anticuerpos anti-SH3 y anti-CD14 y se clasificaron usando citometría de flujo.
Esto provocó la clasificación de la población 1, población 1a y población 2. Estas tres poblaciones eran SH3+ brillante. La Población 1 era CD14+ con una intensidad de tinción débil. La Población 1a era CD45+ con una intensidad de tinción débil. La Población 2 era CD14+ con una intensidad de tinción brillante. Se cultivaron MSC de las fracciones celulares de la Población 1 y la Población 1a, confirmado por análisis de flujo y ensayos biológicos in vitro e in vivo. Se estimó que está presente una célula de la Población 1/1a en 10^{5} células de médula ósea de baja
densidad.

Claims (19)

1. Una población aislada de células madre mesenquimáticas humanas que comprende células madre mesenquimáticas humanas, que se ha enriquecido para CD45+, de modo que la población celular contiene menos del 5% de células que no son células CD45+.
2. La población aislada de células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1, en la que las células madre mesenquimáticas humanas que son CD45+ son adicionalmente reactivas con al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado entre el grupo compuesto por anticuerpo SH2, anticuerpo SH3 y anticuerpo SH4.
3. La población celular aislada de la reivindicación 2, en la que las células madre mesenquimáticas humanas son SH3+ y CD45+.
4. La población celular aislada de la reivindicación 2, en la que las células madre mesenquimáticas humanas son SH2+ y CD45+.
5. Una composición que comprende una población aislada de células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1 que alberga un marcador superficial de fibroblastos.
6. La composición de la reivindicación 5 que comprende adicionalmente células CD14+.
7. Un proceso para aislar una población de células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1, que comprende
(a) obtener una población enriquecida de células madre mesenquimáticas humanas; caracterizado por
(b) seleccionar de la población celular de (a) células que son CD45+, utilizando un anticuerpo que reconoce CD45.
8. Un proceso para aislar una población de células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1 que son SH3+ y CD45+, que comprende
(a) obtener una población enriquecida de células madre mesenquimáticas humanas que son SH3+; caracterizado por:
(b) seleccionar de la población celular de (a) células que son CD45+, utilizando un anticuerpo que reconoce CD45.
9. Un proceso para aislar una población de células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1 que son SH2+ y CD45+, que comprende
(a) obtener una población enriquecida de células madre mesenquimáticas humanas que son SH2+; caracterizado por
(b) seleccionar de la población celular de (a) células que son CD45+, utilizando un anticuerpo que reconoce CD45.
10. Un proceso para aislar una población de células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1 que son fibroblastos SH3+ y CD45+, que comprende
(a) obtener una población enriquecida de células madre mesenquimáticas humanas; caracterizado por
(b) seleccionar de la población celular de (a) células que son fibroblastos SH3+ y CD45+, utilizando un anticuerpo que reconoce CD45.
11. Uso de células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 1 para fabricar preparaciones farmacéuticas para tratar a un paciente.
12. El uso de la reivindicación 11, en el que las células madre mesenquimáticas humanas son SH3+ y CD45+.
13. El uso de la reivindicación 11, en el que las células madre mesenquimáticas humanas son SH2+ y CD45+.
14. El uso de la reivindicación 11, en el que la preparación farmacéutica tiene que administrarse para generar formación ósea.
15. El uso de la reivindicación 11, en el que la preparación farmacéutica tiene que administrarse para tratar o reparar un defecto del tejido conectivo en el paciente.
16. El uso de la reivindicación 15, en el que el defecto es un defecto óseo.
17. El uso de la reivindicación 15, en el que el defecto es un defecto de cartílago.
18. El uso de la reivindicación 11, en el que la preparación farmacéutica tiene que administrarse para potenciar el injerto de células madre hematopoyéticas o progenitoras en un individuo que lo necesite.
19. Células madre mesenquimáticas humanas CD45+ aisladas de la reivindicación 1 transfectadas con material genético exógeno que codifica una proteína a expresar.
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