ES2291233T3 - Procedimiento para la purificacion escalable de adn plasmidico. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de purificación de ADN plasmídico superenrrollado a partir de un lisado celular de una fermentación microbiana, que comprende añadir silicato de calcio cristalizado hidratado al lisado celular para adsorber y retirar las impurezas residuales del ADN plasmídico superenrrollado.
Description
Procedimiento para la purificación escalable de
ADN plasmídico.
La presente invención se refiere a
procedimientos escalables de aislamiento de ADN plasmídico de
calidad clínica a partir de células microbianas. Los procedimientos
ejemplificados descritos en la presente memoria exponen un
protocolo escalable económicamente favorable para la purificación de
ADN plasmídico de calidad clínica a partir de E. coli que no
se basa en etapas cromatográficas costosas durante el procesamiento
corriente abajo de la preparación de plásmido, haciendo así a esta
metodología especialmente trasladable a procedimientos comerciales
de purificación de plásmido a gran escala.
Los avances en las áreas de terapia génica y
vacunación de ADN han creado una necesidad de fabricación y
purificación a gran escala de ADN plasmídico de calidad clínica.
Como se señala en una revisión reciente (Prazeres y col., 1999,
TIBTech 17: 169-174), a pesar del trabajo
previo sobre metodología de purificación de ADN plasmídico a
pequeña escala, ha sido difícil ampliar la escala de fabricación y
purificación de ADN plasmídico de calidad clínica. Han sido
especialmente problemáticas las etapas de procesamiento corriente
abajo, que en su mayor parte se han basado en la lisis alcalina de
las células recogidas, seguido de precipitación con acetato de
amonio y etapas de procesamiento corriente abajo adicionales que se
basan en gran medida en etapas de exclusión por tamaño, intercambio
aniónico y cromatografía en fase inversa. Además, debería observarse
que el gasto de materias primas tales como resinas y tampones para
etapas cromatográficas múltiples se vuelve prohibitivo debido al
alto coste unitario y a la baja capacidad para moléculas de ADN
grandes. Es conocido que se han utilizado el detergente catiónico
CTAB y diversas formas de sílice para preparaciones de ADN
plasmídico a pequeña escala y no diseñadas para producir vacuna
plasmídica de calidad clínica. La capacidad de estas etapas de
eliminar ciertas impurezas no se ha reconocido ni tiene utilidad
para el diseño de procedimiento escalable. Jones (1963,
Nature 199: 280-282) da a conocer el uso de
CTAB para aislar ADN. Del Sal y col. (1989, BioTechniques
7(5): 514-519) y Gustincich y col. (1991,
BioTechniques 11(3): 298-301) utilizan
CTAB para precipitar ADN plasmídico a partir de lisados de E.
coli. clarificados a pequeña escala y ADN genómico a partir de
preparaciones a pequeña escala de sangre humana completa,
respectivamente. Ishaq y col. (1990, BioTechniques
9(1): 19-24) da a conocer la aplicación de
ADN plasmídico precipitado con CTAB a pequeña escala a una columna
giratoria PZ523, proporcionando un producto purificado que es al
menos adecuado como molde para subclonación y secuenciación
didesoxi. Nada en esta técnica enseña ni sugiere el uso de etapas de
precipitación basadas en detergente para producir lotes de calidad
clínica de plásmido de ADN.
Vogelstein y Gillespie (1979, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76(2): 615-619) dan a
conocer una técnica para separar digestiones de enzima de
restricción de ADN de geles de agarosa, en la que el ADN se une a
vidrio (sílice) en presencia de yoduro de sodio concentrado, se
lava con etanol y se eluye a baja concentración de sal. Boom y
col. (1990, J. Clin. Microbiol. 28(3):
495-503) y Carter y Milton (1993, Nucleic Acids
Res. 21(4): 1044) dan a conocer procedimientos para el
aislamiento de ADN plasmídico que es adecuado para secuenciación de
ADN. El ADN plasmídico en presencia del agente caotrópico
tiocianato de guanidinio se une a sílice en forma de tierra de
diatomeas. Se lava el ADN plasmídico inmovilizado con etanol y se
eluye a bajas concentraciones de sal. Se dan a conocer ligeras
variaciones de esta técnica en (1) publicación PTC WO 91/10331; (2)
publicación PTC WO 98/04730, así como (3) patente de EE.UU. nº
5.075.540, concedida a Little el 24 de diciembre de 1999, que da a
conocer un procedimiento de aislamiento de ADN plasmídico que
depende de la adsorción del ADN sobre tierra de diatomeas en
presencia de un agente caotrópico, seguido de separación y elución
del ADN; y (4) patente de EE.UU. nº 5.808.041, concedida a Padhye y
col. el 15 de septiembre de 1998, que da a conocer un procedimiento
de aislamiento de ácido nucleico utilizando una composición que
comprende gel de sílice y partículas de vidrio en presencia de un
agente caotrópico. De nuevo, estas técnicas no se han aplicado
exitosamente a metodología para preparaciones de plásmido de ADN a
gran escala necesaria para la generación de cantidades de gramos de
ADN plasmídico para formulaciones de calidad clínica para
administración a seres humanos y otros huéspedes potenciales.
La patente de EE.UU. nº 4.923.978, concedida a
McCormick el 8 de mayo de 1990, da a conocer el uso de sílice para
purificar ADN preferiblemente mediante unión a materiales
proteicos.
La patente de EE.UU. nº 5.576.196, concedida a
Horn y col. el 19 de noviembre de 1996, da a conocer el uso de
sílice para purificar ADN preferiblemente mediante unión a ARN.
Las patentes de EE.UU. nº 5.523.392 y 5.525.319,
concedidas a Woodward y col. el 4 de junio de 1996 y el 11 de junio
de 1996, respectivamente, dan a conocer silicatos de boro,
fosfosilicatos y silicatos de aluminio que pueden utilizarse como
superficies de unión para la purificación de ADN.
La solicitud internacional PCT PCT/US96/20034
(publicación internacional número WO 98/01464) da a conocer el uso
de silicato de calcio hidratado para separar selectivamente
compuestos orgánicos de fluidos biológicos tales como sangre. El
documento EP 0832897 da a conocer una composición de silicato de
circonio hidratado para la purificación de ácidos nucleicos.
De nuevo, ninguna de las referencias
anteriormente identificadas proporciona una orientación adecuada al
experto en la materia para proporcionar una metodología para
preparar lotes de plásmido de ADN de calidad clínica escalables que
estén sustancialmente libres de proteína de célula huésped,
endotoxina de célula huésped, ADN genómico, ARN genómico y
degradados de plásmido tales como formas lineales y de círculo
abierto. Con este fin, sería extremadamente útil identificar un
procedimiento de purificación de plásmido escalable que elimine el
requisito de etapas de cromatografía prohibitivamente costosas
mientras que proporciona también cantidades de gramos de una
preparación de plásmido de ADN que es de calidad clínica para uso en
al menos aplicaciones de vacunación humana y terapia génica humana.
La presente invención se dirige a y satisface estas necesidades
dando a conocer un procedimiento de purificación de plásmido
escalable que utiliza preferiblemente un detergente catiónico tal
como CTAB para precipitar selectivamente ADN plasmídico en una etapa
corriente arriba en combinación con etapas de adsorción en cargas a
gran escala corriente abajo utilizando silicato de calcio cristalino
hidratado (de aquí en adelante "hcCaSiO_{3}") o cualquier
compuesto de acción similar para eliminar los contaminantes
restantes tales como ADN genómico, ARN genómico, proteína,
endotoxina de huésped y degradados de plásmido tales como formas
lineales y de círculo abierto.
La presente invención se refiere a
procedimientos de aislamiento de ADN plasmídico de calidad clínica a
partir de células microbianas, a procedimientos que representan un
procedimiento de fabricación económico escalable que proporciona
alternativas para la producción y purificación de ADN plasmídico de
calidad clínica a gran escala. La presente invención se refiere
además a varios procedimientos básicos postlíticos que contribuyen
a la naturaleza económica escalable del procedimiento de
purificación de plásmido de ADN. Más específicamente, las etapas
postlíticas incluyen, pero sin limitación, (1) una etapa de
precipitación/disolución de dos partes en la que se precipita el
ADN plasmídico con un detergente (tal como CTAB) en una etapa o por
etapas, acoplada con la concentración y disolución selectiva del
ADN plasmídico precipitado con CTAB con una solución salina; (2) la
eliminación de endotoxina y otras impurezas restantes mediante
adsorción sobre silicato de calcio cristalizado hidratado
(hcCaSiO_{3}), de nuevo, en una etapa o por etapas; y (3) la
concentración del ADN plasmídico purificado mediante precipitación
alcohólica (incluyendo, pero sin limitación, etanol, metanol e
isopropanol), u otro procedimiento de concentración incluyendo,
pero sin limitación, ultrafiltración. Estas etapas pueden
utilizarse en combinación, en combinación adicional con etapas de
purificación adicionales conocidas en la técnica, y/o en las que se
omite al menos una de las etapas anteriormente mencionadas,
preferiblemente en combinación con otra metodología conocida en la
técnica por estar asociada a la tecnología de purificación de
plásmido de ADN.
Los procedimientos de la presente invención
permiten la purificación de plásmido de ADN de calidad clínica a
partir de células microbianas incluyendo, pero sin limitación,
células bacterianas, células de planta, levadura, baculovirus,
siendo E. coli el huésped microbiano preferido. El ADN
plasmídico de calidad clínica purificado mediante los
procedimientos descritos en la presente memoria es extremadamente
útil para administración a seres humanos como vacuna o excipiente de
terapia génica.
Una ventaja del procedimiento de purificación de
plásmido de la presente invención es debida en parte al
descubrimiento de que la precipitación por etapas de ADN con CTAB
junto con la eliminación de las impurezas restantes mediante
adsorción sobre hcCaSiO_{3} elimina impurezas problemáticas,
incluyendo ADN genómico, ARN y degradados de ADN tales como ADN
lineal, con una selectividad hasta ahora desconocida. Un diseño de
procedimiento completo que incorpora estas etapas de
precipitación/purificación está en el núcleo de la invención dada a
conocer en la presente memoria. El procedimiento dado a conocer es
también escalable.
Otra ventaja del procedimiento de purificación
de la presente invención es la eliminación de la necesidad de
costosas resinas de cromatografía basadas en polímero mediante el
enfoque alternativo de precipitación selectiva y adsorción para
preparaciones plasmídicas a gran escala.
Otra ventaja del procedimiento de purificación
de la presente invención es que es fundamentalmente trasladable a
operación a escala de fabricación. Las unidades operativas consisten
en precipitación, filtración, adsorción y secado. El uso de tierra
de diatomeas permite una torta de filtrado incompresible, evitando
los problemas de incrustación a menudo asociados a productos de
fermentación.
Otra ventaja del procedimiento de purificación
de la presente invención es que evita la necesidad de añadir ARNasa
recombinante, una enzima costosa, para la retirada de ARN en cada
vez más etapas durante el procedimiento.
Otra ventaja del procedimiento de purificación
de la presente invención es que la precipitación con un detergente
de cadena larga tal como CTAB proporciona reducciones en los
volúmenes de procesamiento corriente abajo que son importantes en la
eliminación de corrientes de desecho que contienen disolvente a
escala de fabricación.
Es aún otra ventaja del procedimiento de
purificación de la presente invención que la precipitación
alcohólica (tal como etanólica) es un modo ideal para conseguir un
producto a granel estable que puede resuspenderse a altas
concentraciones sin el daño por cizallamiento previsto que aparece
durante la concentración basada en membrana.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento rentable para la purificación a gran
escala de ADN plasmídico de calidad clínica a partir de huéspedes
procarióticos tales como E. coli.
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Es además un objeto de la presente invención
proporcionar etapas postlíticas que den como resultado un
procedimiento económico escalable para la purificación a gran
escala (concretamente escalable) de ADN plasmídico incluyendo, pero
sin limitación, las etapas postlíticas de (i) precipitación de ADN
plasmídico con un detergente (tal como CTAB) en una etapa o por
etapas, acoplada con la concentración y disolución selectiva del ADN
plasmídico precipitado con CTAB con una disolución salina; (ii)
eliminación de endotoxina y otras impurezas restantes mediante
adsorción sobre silicato de calcio cristalizado hidratado
(hcCaSiO_{3}) en una etapa o por etapas; y (iii) concentración
del ADN plasmídico purificado mediante alcohol (tal como
precipitación etanólica) u otro procedimiento de concentración
incluyendo, pero sin limitación, la ultrafiltración. Estas etapas
pueden utilizarse en combinación, en combinación adicional con
etapas de purificación adicionales conocidas en la técnica, y/o en
la que se omite la primera de las etapas anteriormente mencionadas,
preferiblemente en combinación con otra metodología conocida en la
técnica por estar asociada a la tecnología de purificación de
plásmido de ADN.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar procedimientos para un procedimiento rentable para
purificación a gran escala (concretamente, escalable) de ADN
plasmídico de calidad clínica a partir de huéspedes procarióticos
que comprende las etapas de: (i) lisis celular; (ii) clarificación
del lisado con filtración auxiliada por tierra de diatomeas; (iii)
precipitación selectiva de ADN plasmídico utilizando bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB), seguido de filtración para recoger una
torta de filtrado que contiene ADN plasmídico; (iv) disolución
selectiva de la torta de filtrado que contiene ADN plasmídico con
disolución salina; (v) adsorción de impurezas residuales sobre
silicato de calcio hidratado seguido de filtración; y (vi)
precipitación de ADN plasmídico purificado utilizando alcohol
(incluyendo, pero sin limitación, alcohol).
Como se utilizan intercambiablemente en la
presente memoria, los términos "ADN plasmídico de calidad
clínica" y "ADN plasmídico de calidad farmacéutica"
designan una preparación de ADN plasmídico aislado a partir de
células procarióticas que es de un nivel de pureza aceptable para
administración a seres humanos para cualquier indicación
profiláctica o terapéutica conocida incluyendo, pero sin limitación,
aplicaciones de terapia génica y aplicaciones de vacunación de
ADN.
Como se utiliza en la presente memoria, "ADN
plasmídico no superenrrollado" designa cualquier ADN que no sea
ADN plasmídico superenrrollado, incluyendo cualquier otra forma de
ADN plasmídico tal como círculo abierto con muesca y lineal, así
como ADN genómico de huésped.
Como se utiliza en la presente memoria,
"CTAB" designa bromuro de hexadeciltrimetilamonio o bromuro de
cetiltrimetilamonio.
Como se utiliza en la presente memoria,
"hcCaSiO_{3}" designa silicato de calcio cristalino
hidratado.
Como se utiliza en la presente memoria,
"tampón STET" designa un tampón que comprende
Tris-HCl aproximadamente 50 mM (\simpH
7,0-9,0), EDTA aproximadamente
50-100 mM, aproximadamente 8% de sacarosa y
aproximadamente 2% de Triton®-X100.
Como se utiliza en la presente memoria,
"IPA" designa isopropanol.
Como se utiliza en la presente memoria,
"PEG" designa polietilenglicol.
Como se utiliza en la presente memoria,
"ADNg" designa ADN genómico.
Como se utiliza en la presente memoria,
"ARNg" designa ARN genómico.
Como se utiliza en la presente memoria,
"LRA^{TM}" designa agente de eliminación de lípidos (lipid
removal agent)^{TM}.
Como se utiliza en la presente memoria,
"EDTA" designa ácido etilendiaminotetraacético.
Como se utiliza en la presente memoria,
"SC" designa superenrrollado.
Como se utiliza en la presente memoria,
"OC" designa circular abierto.
Como se utiliza en la presente memoria,
"NTU" designa unidades de turbidez normalizada.
Como se utiliza en la presente memoria, "l"
designa litros.
Como se utiliza en la presente memoria,
"HPLC" designa cromatografía líquida de alta resolución.
La Figura 1 muestra el diagrama de flujo del
procedimiento que comprende un procedimiento básico de cuatro etapas
que elimina los desechos celulares mediante clarificación. La
precipitación por etapas con CTAB y la adsorción con silicato de
calcio eliminan ARN, ADN, proteína y endotoxina de huésped, así como
degradados de plásmido de ADN circular abierto y lineal. Se crea un
polvo bruto estable mediante precipitación etanólica.
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La Figura 2 muestra el perfil de concentración
durante la precipitación por etapas con CTAB. Se precipita ADN
plasmídico durante un estrecho aumento de detergente. La etapa es
selectiva para la eliminación de proteína, ARN y endotoxina, que
permanecen solubles.
La Figura 3 muestra la disolución selectiva de
ADN plasmídico por NaCl 0,2 M mediante electroforesis en gel de
agarosa. El ADN genómico de huésped es sólo parcialmente soluble y
se elimina mediante filtración después de disolverlo con NaCl 0,2 M.
A NaCl 1,2 M, el ADNg es soluble.
Las Figuras 4A-D muestran la
purificación mediante adsorción de impurezas en hcCaSiO_{3}
(LRA^{TM}). (A) Adsorción de equilibrio de ADN plasmídico frente a
concentración de cloruro de sodio. (B) Adsorción de ADN genómico o
de huésped medido por qPCR. El LRA^{TM} elimina selectivamente el
ADN después de 5 h de puesta en contacto con mezcla a una
concentración de NaCl 1,2 M. El rendimiento de plásmido es de
aproximadamente 60%. (C) Adsorción selectiva de degradados de
plásmido sobre hcCaSiO_{3} en NaCl 1,2 M. Electroforesis en gel de
agarosa de muestras en fase líquida en contacto con hcCaSiO_{3} en
función de la concentración de hcCaSiO_{3} (carril 1: 32 g de
hcCaSiO_{3}/g de ADN; carril 2: 35 g de hcCaSiO_{3}/g de ADN;
carril 3: 40 g de hcCaSiO_{3}/g de ADN; carril 4: 42 g de
hcCaSiO_{3}/g de ADN; carril 5: 45 g de hcCASiO_{3}/g de ADN).
Se eliminan los productos lineales, de círculo abierto relajado y
multímeros (M). (D) Adsorción selectiva de degradados de plásmido
sobre hcCaSiO_{3} en NaCl 0,5 M. Electroforesis en gel de agarosa
de muestras en fase líquida en contacto con 32 g de hcCaSiO_{3}
por g de ADN total en función del tiempo (carril 1: 3,3 h, carril 2:
6,2 h, carril 3: 10,8 h, carril 4: 21,5 h). Se eliminan los
productos lineales, de círculo abierto relajado y multímeros
(M).
La Figura 5 muestra la precipitación de
impurezas por CTAB al 0,25-0,30% p/v utilizando el
analizador de tamaño de partícula Lasentec®. La adición de CTAB al
1% p/v en NaCl 40 mM a lisado clarificado en tampón STET se detiene
a los 100 minutos basándose en el cambio brusco del recuento de
partículas. Se eliminan las impurezas precipitadas por filtración.
Se añade CTAB adicional para precipitar el plásmido
superenrrollado.
La Figura 6 muestra la composición de ADN de
las muestras de etapas de procedimiento dadas a conocer en la
sección 1 de los ejemplos. El plásmido superenrrollado se visualiza
en la banda inferior. Las bandas superiores representan diversas
impurezas de ADN, incluyendo plásmido de círculo abierto y plásmido
lineal, multímeros plasmídicos y ADN genómico. Se describen el
lisado clarificado con tierra de diatomeas (carril 1, desde la
izquierda); filtrado de corte bajo con CTAB al 0,23% p/v (carril 2);
filtrado de corte alto con CTAB al 0,30% p/v que no contiene ADN
(carril 3); precipitado de corte alto en NaCl 0,4 M (carril 4);
precipitado de corte alto en NaCl 0,475 M (carril 5); precipitado de
corte alto en NaCl 0,5 M (carril 6); filtrado de 0,8 \mum después
de la etapa de adsorción en hcCaSiO3 (carril 7); producto de
hcCaSiO3 sometido a precipitación con etanol y redisolución en agua
estéril (carril 8).
La presente invención se refiere a una
metodología escalable que representa alternativas de fabricación no
costosas para la producción de ADN plasmídico de calidad clínica.
Más específicamente, la base de la invención se refiere a varias
etapas corriente abajo (concretamente postlíticas) que incluyen (1)
una etapa de precipitación/disolución de dos partes en la que se
precipita el ADN plasmídico con un detergente (tal como CTAB) en una
etapa o por etapas, acoplado con la concentración y disolución
selectiva del ADN plasmídico precipitado con CTAB con una
disolución salina; (2) eliminación de endotoxina y otras impurezas
restantes mediante adsorción sobre silicato de calcio cristalizado
hidratado (hcCaSiO_{3}), de nuevo, en una etapa o por etapas; y
(3) concentración del ADN plasmídico purificado con alcohol
(incluyendo, pero sin limitación, precipitación basada en etanol,
metanol o isopropanol u otro procedimiento concentrador incluyendo,
pero sin limitación, ultrafiltración. Como se ejemplifica en la
presente memoria, las etapas (1) y (2) están asociadas a etapas de
filtración posteriores para separar físicamente diversas impurezas
de lisado celular del objeto del procedimiento de purificación, el
ADN plasmídico superenrrollado.
Está dentro del alcance de la presente invención
añadir o restar a estas tres etapas básicas para formular un
procedimiento de purificación escalable global que dé como resultado
la recogida de ADN plasmídico de calidad clínica. Por lo tanto, se
pretende que pueda omitirse la etapa de precipitación de ADN
plasmídico basada en detergente. Este procedimiento simplificado
puede incluir etapas "no básicas" adicionales para complementar
el procedimiento de purificación global. Sin embargo, las etapas
básicas de (1) precipitación con detergente y disolución salina
selectiva, (2) adsorción a hcCaSiO_{3} y (3) concentración de ADN
plasmídico, proporcionarán más probablemente la base desde la que
expandir los procedimientos de purificación para dar como resultado
un procedimiento escalable global que incorpore etapas
complementarias adicionales. Estas etapas complementarias pueden
añadirse a la discreción del experto, dependiendo de la calidad
global del ADN plasmídico que se requiera para un lote específico.
Con este fin, se presentan en la presente memoria diversos ejemplos
de uso de estas tres etapas básicas como base para un procedimiento
escalable global para ejemplificar, pero ciertamente no limitar, la
presente invención. El experto puede considerar etapas de
purificación de plásmido conocidas para proporcionar un esquema que
dé como resultado una calidad apropiada de pureza de plásmido de
ADN. Por ejemplo, las solicitudes internacionales PCT nº
PCT/US95/09749 /WO96/02658) y PCT/US/07083 (WO96/36706) proporcionan
orientación en cuanto a etapas corriente abajo basadas en
cromatografía alternativas que pueden utilizarse en combinación con
las etapas de purificación básicas mencionadas en este párrafo,
proporcionando un protocolo de purificación eficaz. Ambas
descripciones muestran eventos corriente abajo (posteriores a una
etapa de intercambio de calor) que incluyen clarificación,
ultrafiltración con benzonasa para eliminación de ADN y proteína,
intercambio iónico para más proteína y cromatografía en fase
inversa para endotoxina, impurezas Lin/OC y una ultrafiltración
final para concentrar. En consecuencia, si se emplea sólo
hcCaSiO_{3}, dicho protocolo debería precederse por
clarificación, ultrafiltración y cromatografía de intercambio iónico
como se describe en los documentos WO 96/02658 y WO 96/36706.
Una realización de la presente invención se
refiere a un procedimiento de purificación de ADN plasmídico
superenrrollado a partir de un lisado celular de una fermentación
microbiana, que comprende precipitar ADN plasmídico superenrrollado
mediante una precipitación inducida por detergente. Esta parte de la
invención está ejemplificada por, pero no limitada a, el uso del
detergente bromuro de cetriltrimetilamonio (CTAB). El detergente de
interés puede añadirse en una etapa o por etapas. Es un ejemplo de
adición por etapas del detergente la adición por etapas de CTAB (en
este caso, alimentación de una disolución de CTAB al 1% p/v a lisado
clarificado en tampón STET) con una primera precipitación inducida
por CTAB de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 0,28% para
precipitar desechos y ADN plasmídico no superenrrollado, seguida de
una segunda precipitación inducida por CTAB de aproximadamente
0,30% a aproximadamente 0,33% para precipitar el ADN plasmídico
superenrrollado, coincidiendo estos intervalos mejor con el uso de
tampón de lisis STET (Tris-HCl aproximadamente 50 mM
(\simpH 7,0-9,0), EDTA aproximadamente
50-100 mM, aproximadamente 8% de sacarosa y
aproximadamente 2% de Triton®-X100). Estará dentro del alcance del
experto alterar los intervalos de precipitación por etapas para
ajustarse a cualquier peculiaridad de los diversos sistemas de
tampón incluyendo, pero no necesariamente con limitación, la
inclusión de un detergente basado en Triton® o EDTA catiónico
divalente dentro del tampón de lisis, de tal modo que se separe
primero por precipitación una cantidad manejable de impurezas de la
disolución de tampón restante que comprende ADN plasmídico
superenrrollado, que se precipita después con una precipitación
inducida por CTAB adicional. Como se observa anteriormente con
referencia al uso de un tampón STET convencional, será también útil
añadir compuestos tales como EDTA y/o detergentes basados en
Triton® a concentraciones útiles a los diversos tampones para ayudar
a promover la precipitación de ADN plasmídico. Con este fin, es
útil un tampón STET como tampón de lisis celular al contener
cantidades eficaces de Triton® y EDTA. Estos compuestos están por
tanto presentes durante la etapa de lisis, inhibiendo el EDTA la
actividad ADNasa mediante asociación con iones metálicos divalentes
que de otro modo activan la ADNasa. Además, el Triton® disuelve la
membrana celular de E. coli. Ambos componentes se llevan a
la(s) etapa(s) de CTAB. El EDTA sigue desempeñando un
papel favorable, puesto que los iones metálicos divalentes evitarán
la complejación del plásmido con CTAB. Es más importante el efecto
del Triton® en la selección de una concentración eficaz de CTAB
para un corte de una etapa o varias etapas para precipitar ADN
plasmídico superenrrollado. El Triton® interactúa con CTAB,
haciendo necesario añadir CTAB a un cierto nivel umbral (por
ejemplo, 0,23%, 0,25%, 0,30%, etc., basado en una disolución de
alimentación de CTAB al 1% añadida a un lisado clarificado en el
tampón STET) antes de que el ADN plasmídico superenrrollado pueda
precipitar. Por lo tanto, el intervalo de concentración de CTAB
depende tanto de la concentración de Triton® como de la de ADN. Con
este fin, se preconiza un intervalo por etapas de, por ejemplo,
0,25-0,28% de CTAB y 0,28-0,33% de
CTAB (de nuevo basado en una alimentación de CTAB al 1% p/v) por lo
siguiente: la baja cantidad de corte es una función de la
concentración de Triton®, puesto que el Triton® se une a 22
moléculas de CTAB por micela de Triton®, suponiendo que cada micela
contiene 140 moléculas de Triton, mientras que la cantidad de corte
alto es una función de la concentración de ADN, puesto que cada
molécula de plásmido se une a 0,9 equivalentes de CTAB por unidad
repetitiva de nucleótido de ADN. En este caso particular que se
describe en el ejemplo 1, el intervalo citado de
0,25-0,28% de CTAB para precipitación de corte bajo
corresponde a la adición de una disolución de CTAB al 1% a un
lisado de tampón STET que contiene 1% de Triton. El intervalo de
corte alto de 0,28-0,33% corresponde a la adición
de una disolución de CTAB al 1% a la disolución de corte bajo
filtrada que derivaba de una disolución de lisado clarificado
original que contenía 0,34 mg/ml de ADN plasmídico de
aproximadamente 84% de pureza. El experto puede acoplar bien la
cantidad de CTAB (para una precipitación en una etapa o por etapas
de ADN plasmídico superenrrollado) con un tampón particular como se
describe en la sección 1 de los ejemplos (inspección visual de la
precipitación de ADN) o sección 2 de los ejemplos (utilizando un
analizador de tamaño de partícula para inspeccionar la
precipitación de ADN). En el último ejemplo, cuando se utiliza un
tampón STET convencional, el experto observará la precipitación
mediante una sonda de turbidez Lasentec® en tiempo real, sabiendo
que termina aproximadamente a 0,25% por correlación de esta
concentración de CTAB con la concentración de Triton®, que es
constante de carga a carga (establecida en la lisis). Se completa
después el mismo procedimiento con Lasentec® a medida que precipita
el ADN, sabiendo que hay aproximadamente 1 mg/ml de ADN que
corresponde al aumento de 0,03% (diferencial de 0,25 a 0,28)
necesario para precipitar. El experto será consciente de estas
cifras en el caso sin Triton® (o concentraciones de Triton® que
difieran del tampón STET convencional), como con el enfoque de
lisis por NaOH/KOAc, o si la fermentación da como resultado una
concentración muy diferente de plásmido. Por lo tanto, lo primero
afecta a la cantidad de corte bajo y lo último afecta a la de corte
alto de CTAB. Se prefiere que pueda determinarse un intervalo de
corte bajo y alto mediante un analizador de tamaño de partícula tal
como un analizador de tamaño de partícula Lasentec®. Este
procedimiento aumenta la exactitud para definir más estrechamente
los intervalos de corte bajo y alto a medida que se produce la
precipitación por CTAB del plásmido en un intervalo estrecho de
CTAB. Por lo tanto, estos intervalos pueden aproximarse mediante la
medida de variables importantes (tales como concentración de
Triton® y ADN plasmídico) y pueden identificarse también
específicamente mediante análisis visual, o preferiblemente guiado
por instrumentos, de las partículas en disolución a diversas
concentraciones de CTAB. Se ejemplifica en la presente memoria que
el uso de un tampón STET convencional y una disolución de CTAB al 1%
p/v (en NaCl 40 mM) da como resultado cortes bajo y alto de CTAB
óptimos de aproximadamente 0,25-0,28% p/v (bajo) y
0,30-0,33% (alto). Se entenderá que dichos valores
se aplican a situaciones en las que se alimenta CTAB al lisado
clarificado en tampón STET utilizando una disolución de
alimentación de CTAB al 1% p/v. Es aceptable, sólo por ejemplo,
duplicar la concentración de la disolución de alimentación de CTAB
(por ejemplo, una alimentación de CTAB al 2% p/v) y añadir la mitad
del volumen (para la misma masa de CTAB). En este caso, las
concentraciones de corte bajo y corte alto serían aproximadamente
0,29-0,33% y 0,35-0,40%,
respectivamente. Estas cifras se normalizan fácilmente convirtiendo
a partir de un valor numérico basado en el porcentaje en
peso/volumen (%p/v) en un procedimiento sencillo basado en la masa
de CTAB añadida por litro de lisado clarificado. Por ejemplo, en el
mismo supuesto que se ejemplifica en la sección 1 de los ejemplos
(un tampón STET convencional), se alcanzaría una concentración de
CTAB de corte bajo añadiendo de 3,3 a 3,9 g de CTAB por litro de
lisado clarificado, mientras que se alcanzaría una concentración de
CTAB de corte alto añadiendo (más allá de la adición de corte bajo
inicial) CTAB hasta una cantidad final de 4,3 a 5,0 g de CTAB por
litro de lisado clarificado. Se asociará una sola etapa de
detergente basada en CTAB o por etapas con una etapa de filtración
para generar un precipitado de torta de filtración (que contiene
ADN plasmídico superenrrollado) para posterior disolución salina.
Además, sigue siendo una etapa corriente abajo preferida la
concentración de ADN plasmídico superenrrollado mediante
precipitación etanólica o ultrafiltración. Se prefiere el uso de una
precipitación basada en alcohol (tal como etanol) porque es
posible, como se muestra en la presente memoria, precipitar y
concentrar adicionalmente al final el ADN superenrrollado mediante
precipitación etanólica, dando como resultado un precipitado en
polvo que contiene el ADN plasmídico superenrrollado. Será evidente
que esta etapa corriente abajo puede utilizarse con cualquiera de
las diversas combinaciones de etapas tempranas para purificar
finalmente el ADN plasmídico superenrrollado de cualquier impureza
restante, concentrando también el ADN plasmídico y permitiendo la
resuspensión en un volumen de tampón más manejable. Esta
realización abarca también procedimientos descritos en este párrafo
en combinación con al menos la adición de una etapa que incluye,
pero no está necesariamente limitada a, la clarificación del lisado
celular antes de la adición de CTAB. Se utiliza tierra de diatomeas
(TD) para ejemplificar esta etapa, pero puede sustituirse la TD por
otros componentes para clarificar el lisado celular incluyendo,
pero sin limitación, otros auxiliares de filtración basados en
celulosa tales como Solka Floc y Esosorb (Graver). La TD u otro
material utilizado para clarificar el lisado celular puede
eliminarse mediante cualquier técnica de separación
líquido-sólido conocida en la técnica incluyendo,
pero en modo alguno con limitación, filtración y centrifugación.
Puede incorporarse también cualquier procedimiento que incorpore una
etapa de clarificación de lisado a las etapas de concentración
dadas a conocer en la presente memoria incluyendo, pero sin
limitación, precipitación etanólica o ultrafiltración, como se
discute en la presente memoria.
La presente invención proporciona un
procedimiento de purificación de ADN plasmídico superenrrollado a
partir de un lisado celular de una fermentación microbiana en el
que la etapa básica es una adición de silicato de calcio
cristalizado hidratado (hcCaSiO_{3}) al lisado celular. Se muestra
en la presente memoria que tanto la adición en una etapa como por
etapas de hcCaSiO_{3} al lisado celular da como resultado la
adsorción de impurezas residuales del ADN plasmídico
superenrrollado. Como se observa anteriormente, otro aspecto de
esta parte de la invención se refiere a la(s)
etapa(s) de adsorción del párrafo anterior junto con al menos la adición de una etapa que incluye, pero no está necesariamente limitada a, la clarificación del lisado celular antes de la adición de CTAB. De nuevo, la TD es el ejemplo, pero no limita esta etapa adicional. Cualquiera de las combinaciones de etapas de procedimiento designadas en este párrafo puede incorporar también una etapa de concentración de ADN plasmídico superenrrollado incluyendo, pero sin limitación, precipitación etanólica o ultrafiltración, como se describe en la presente memoria. La adición de una o más etapas más allá de la etapa de adsorción en hcCaSiO_{3} (tal como clarificación de lisado y/o una etapa de concentración con etanol o ultrafiltración) puede producirse si se utilizan etapas sencillas o múltiples de adsorción. En esta etapa del esquema de purificación básico, las impurezas primarias son CTAB, endotoxina, ADN genómico y degradados plasmídicos. Otras impurezas residuales (presentes a menores concentraciones) incluyen proteínas, ARN y quizás Triton®. El silicato de calcio hidratado se unirá a todas estas impurezas. La cantidad precisa de hcCaSiO_{3} necesaria para la adición está regida por (1) la cantidad de impurezas presentes; (2) las condiciones tampón (concretamente la concentración salina) y (3) quizás otras variables que incluyen la temperatura y el tipo de sal utilizado a lo largo del procedimiento de purificación. La cantidad de impurezas presentes puede depender, pero no está necesariamente limitada a, (i) cuánto CTAB se añadió, si se utilizó algo, (ii) diferencias de lote a lote en el caldo de fermentación que podrían afectar a la masa de ADN genómico, degradados plasmídicos y endotoxina, y (iii) el procedimiento de lisis empleado, que podría afectar también a la cantidad de ADN genómico, degradados plasmídicos y endotoxina. A la vista de estas variables, resultará evidente que puede variar la cantidad de hcCaSiO_{3} para añadir durante un procedimiento específico. Se prevé que la cantidad de hcCaSiO_{3} para añadir estará en el intervalo de hasta aproximadamente 200 g/l, dependiendo de las condiciones descritas anteriormente, así como de las diferencias potenciales dependiendo del lote de hcCaSiO_{3} puesto a disposición durante ese procedimiento específico. La sección 1 de los ejemplos proporciona orientación sobre un intervalo de aproximadamente 25 g/l a aproximadamente 75 g/l. Pero, de nuevo, las condiciones para la adsorción de hcCaSiO_{3} pueden escalarse hacia arriba o hacia abajo con relación a las condiciones explicadas anteriormente, necesitando potencialmente así la adición de hcCaSiO_{3} en el extremo superior del intervalo, hacia 200 g/l. Además, se muestra en la presente memoria que una mayor concentración de NaCl aumenta la capacidad del LRA^{TM} por ADN y otras impurezas. El efecto del LRA^{TM} para ADN plasmídico se muestra sólo en la Figura 4A, pero la alta concentración salina parece aumentar también la capacidad del LRA^{TM} de unirse a ADN genómico y otras impurezas. Por lo tanto, será útil en algunos casos considerar concentraciones salinas superiores, que deberían permitir el uso de una menor cantidad del hcCaSiO_{3} respectivo. Se espera que las concentraciones salinas útiles puedan estar en el intervalo de, por ejemplo con NaCl, hasta aproximadamente NaCl 5 M.
etapa(s) de adsorción del párrafo anterior junto con al menos la adición de una etapa que incluye, pero no está necesariamente limitada a, la clarificación del lisado celular antes de la adición de CTAB. De nuevo, la TD es el ejemplo, pero no limita esta etapa adicional. Cualquiera de las combinaciones de etapas de procedimiento designadas en este párrafo puede incorporar también una etapa de concentración de ADN plasmídico superenrrollado incluyendo, pero sin limitación, precipitación etanólica o ultrafiltración, como se describe en la presente memoria. La adición de una o más etapas más allá de la etapa de adsorción en hcCaSiO_{3} (tal como clarificación de lisado y/o una etapa de concentración con etanol o ultrafiltración) puede producirse si se utilizan etapas sencillas o múltiples de adsorción. En esta etapa del esquema de purificación básico, las impurezas primarias son CTAB, endotoxina, ADN genómico y degradados plasmídicos. Otras impurezas residuales (presentes a menores concentraciones) incluyen proteínas, ARN y quizás Triton®. El silicato de calcio hidratado se unirá a todas estas impurezas. La cantidad precisa de hcCaSiO_{3} necesaria para la adición está regida por (1) la cantidad de impurezas presentes; (2) las condiciones tampón (concretamente la concentración salina) y (3) quizás otras variables que incluyen la temperatura y el tipo de sal utilizado a lo largo del procedimiento de purificación. La cantidad de impurezas presentes puede depender, pero no está necesariamente limitada a, (i) cuánto CTAB se añadió, si se utilizó algo, (ii) diferencias de lote a lote en el caldo de fermentación que podrían afectar a la masa de ADN genómico, degradados plasmídicos y endotoxina, y (iii) el procedimiento de lisis empleado, que podría afectar también a la cantidad de ADN genómico, degradados plasmídicos y endotoxina. A la vista de estas variables, resultará evidente que puede variar la cantidad de hcCaSiO_{3} para añadir durante un procedimiento específico. Se prevé que la cantidad de hcCaSiO_{3} para añadir estará en el intervalo de hasta aproximadamente 200 g/l, dependiendo de las condiciones descritas anteriormente, así como de las diferencias potenciales dependiendo del lote de hcCaSiO_{3} puesto a disposición durante ese procedimiento específico. La sección 1 de los ejemplos proporciona orientación sobre un intervalo de aproximadamente 25 g/l a aproximadamente 75 g/l. Pero, de nuevo, las condiciones para la adsorción de hcCaSiO_{3} pueden escalarse hacia arriba o hacia abajo con relación a las condiciones explicadas anteriormente, necesitando potencialmente así la adición de hcCaSiO_{3} en el extremo superior del intervalo, hacia 200 g/l. Además, se muestra en la presente memoria que una mayor concentración de NaCl aumenta la capacidad del LRA^{TM} por ADN y otras impurezas. El efecto del LRA^{TM} para ADN plasmídico se muestra sólo en la Figura 4A, pero la alta concentración salina parece aumentar también la capacidad del LRA^{TM} de unirse a ADN genómico y otras impurezas. Por lo tanto, será útil en algunos casos considerar concentraciones salinas superiores, que deberían permitir el uso de una menor cantidad del hcCaSiO_{3} respectivo. Se espera que las concentraciones salinas útiles puedan estar en el intervalo de, por ejemplo con NaCl, hasta aproximadamente NaCl 5 M.
Otra realización de la presente invención se
refiere a purificar ADN plasmídico superenrrollado a partir de un
lisado celular de una fermentación microbiana, que comprende la
incorporación de tres etapas de procedimiento distintas, a saber
(i) precipitar el ADN plasmídico superenrrollado mediante una
precipitación inducida por detergente y redisolver la torta de
filtrado resultante en una disolución salina; (ii) añadir
hcCaSiO_{3} al plásmido superenrrollado redisuelto para adsorber
impurezas residuales del ADN plasmídico superenrrollado, dando como
resultado una disolución que contiene ADN plasmídico
superenrrollado; y (iii) concentrar el ADN plasmídico
superenrrollado. De nuevo, es un detergente ejemplar el CTAB, que
puede añadirse en una etapa o por etapas, ejemplificado en la
presente memoria en parte por una adición por etapas del detergente
(CTAB en forma de una alimentación al 1% p/v) en un tampón de
lisado basado en STET con un primer corte a una [CTAB] de 0,25% a
aproximadamente 0,28% y un segundo corte a una [CTAB] de
aproximadamente 0,30% a aproximadamente 0,33%. Como se observa a lo
largo de esta memoria descriptiva (y se ejemplifica en la sección 1
de los ejemplos (indicación visual) y la sección 2 de los
ejemplos), está dentro del alcance del experto, con esta memoria
descriptiva delante, alterar los intervalos de precipitación por
etapas para ajustarse a cualquier peculiaridad de los diversos
sistemas de tampón de tal modo que se precipite en primer lugar una
cantidad manejable de impurezas de la disolución tampón restante
que comprende ADN plasmídico superenrrollado, que se precipita
después con una precipitación inducida por CTAB adicional. De nuevo,
será también útil añadir componentes tampón tales como EDTA y/o
detergentes basados en Triton a concentraciones útiles a los
diversos tampones para ayudar a promover la precipitación de ADN
plasmídico. Se realiza una disolución salina de la torta de
filtrado recogida (que comprende ADN plasmídico superenrrollado) en
una disolución tampón de fuerza iónica y composición óptimas. Se
añade sal a una concentración óptima para disolver el plásmido sin
disolver el ADN genómico y otras impurezas. Esta concentración se
determina midiendo la concentración de plásmido superenrrollado en
disolución a diversos aumentos de sal o, indirectamente, midiendo la
viscosidad de la disolución. Las etapas adicionales (una o
cualquier combinación) de las etapas básicas mencionadas
anteriormente pueden incluir, pero sin limitación, clarificación de
lisado y/o una etapa de concentración con etanol o ultrafiltración,
como se discute en la presente memoria.
Otra realización comprende la incorporación de
etapas adicionales, a saber una clarificación inicial del lisado
celular, al procedimiento básico para proporcionar un esquema de
purificación mejorado. Esta realización particular de la invención
comprende etapas de procesamiento corriente abajo que incluyen (i)
clarificación de lisado, preferiblemente con filtración auxiliada
por tierra de diatomeas o centrifugación, (ii) precipitación en una
etapa o por etapas de ADN plasmídico con un detergente tal como
CTAB, disolución salina de la torta de filtrado resultante; (iii)
eliminación de las impurezas restantes mediante adsorción sencilla o
por etapas sobre hcCaSiO_{3}; y (iv) posterior precipitación
alcohólica (por ejemplo etanólica) del ADN plasmídico purificado,
que proporciona un producto bruto estable del que pueden prepararse
fácilmente disoluciones de formulación concentradas.
Otra realización de la presente invención que se
basa en etapas adicionales más allá del procedimiento básico
incluye una etapa corriente arriba de lisis celular, que puede
realizarse mediante cualquier número de procedimientos ahora
disponibles para el experto. Por lo tanto, la combinación de etapas
de procedimiento puede incluir una etapa de lisis celular corriente
arriba incluyendo, por ejemplo, el siguiente procedimiento: (i)
lisis celular; (ii) clarificación del lisado como se discute en la
presente memoria, (iii) precipitación sencilla o por etapas de ADN
plasmídico con un detergente tal como CTAB; (iv) disolución
selectiva de plásmido con disolución salina; (v) eliminación de las
impurezas restantes mediante adsorción sencilla o por etapas sobre
hcCaSiO_{3}; y (vi) posterior precipitación con alcohol (por
ejemplo etanólica) del ADN plasmídico purificado, que proporciona
un producto bruto estable del que pueden prepararse fácilmente
disoluciones de formulación concentradas. Se contempla cualquier
procedimiento conocido de lisis celular para esta etapa corriente
arriba. La metodología de lisis celular preferida se da a conocer en
la presente memoria.
Una realización adicional de la presente
invención se refiere a un procedimiento mediante el cual se combina
una etapa adicional de clarificación de lisado con las etapas de
procedimiento básicas, lisis celular y una etapa de disolución
salina, dando como resultado el siguiente procedimiento por etapas
incluyendo, pero sin limitación, las etapas de (i) lisis celular;
(ii) clarificación de lisado, preferiblemente con filtración
auxiliada por tierra de diatomeas o centrifugación; (iii)
precipitación selectiva de ADN plasmídico con un detergente tal
como CTAB; (iv) disolución selectiva del ADN plasmídico con
disolución salina; (v) adsorción de impurezas residuales sobre
hcCaSiO_{3}; y (vi) precipitación de ADN plasmídico purificado
utilizando alcohol (tal como etanol). Se discuten en la presente
memoria alternativas al uso de CTAB para materiales de precipitación
de plásmido, precipitación alcohólica y clarificación.
Los procedimientos de la presente invención
permiten la purificación de plásmido de ADN de calidad clínica a
partir de células microbianas incluyendo, pero sin limitación,
células bacterianas, células de planta, levadura, baculovirus,
siendo E. coli el huésped microbiano preferido. El ADN
plasmídico de calidad clínica purificado mediante los
procedimientos descritos en la presente memoria es extremadamente
útil para administración a seres humanos como vacuna o vehículo de
terapia génica.
La presente invención se refiere a metodología a
gran escala que representa alternativas de fabricación no costosas
para la producción de ADN plasmídico de calidad clínica. La esencia
de la invención se basa en varias etapas de procesamiento corriente
abajo que incluyen (i) precipitación por etapas de ADN plasmídico
con CTAB; (ii) disolución selectiva de plásmido con disolución
salina; (iii) eliminación de las impurezas restantes mediante
adsorción sobre silicato de calcio cristalizado hidratado; seguido
de concentración del producto final. El núcleo de la presente
invención comprende las etapas anteriores en un procedimiento de
diseño escalable para generar preparaciones de plásmido de ADN
adecuadas para administración humana.
La presente invención se refiere a
procedimientos de aislamiento de ADN plasmídico de calidad clínica a
partir de células microbianas. Los procedimientos de purificación
plasmídica de la presente invención están basados en parte en
operaciones que incluyen, pero no necesariamente limitadas a, (i)
lisis celular; (ii) clarificación de lisado con filtración
auxiliada con tierra de diatomeas; (iii) precipitación por etapas de
ADN plasmídico con CTAB en presencia de una cantidad útil de tierra
de diatomeas; (iv) disolución selectiva del sedimento de CTAB con
una disolución salina; (v) eliminación de las impurezas restantes
mediante adsorción sobre silicato de calcio cristalizado hidratado;
y (vi) precipitación alcohólica posterior del ADN plasmídico
purificado, que proporciona un producto bruto estable a partir del
cual pueden prepararse fácilmente disoluciones de formulación
concentradas.
En un aspecto preferido de la invención, la
preparación de plásmido a gran escala implica varias etapas de
procesamiento corriente abajo que incluyen (i) precipitación por
etapas de ADN plasmídico con CTAB; (ii) disolución selectiva de
plásmido con disolución salina; (iii) eliminación de las impurezas
restantes mediante adsorción sobre silicato de calcio cristalizado
hidratado; y (iv) preferiblemente la posterior precipitación
alcohólica (tal como etanólica) del ADN plasmídico purificado, que
proporciona un producto bruto estable a partir del cual pueden
prepararse fácilmente disoluciones de formulación concentradas. Será
conocido por el experto que los aspectos del procedimiento de
diseño son intercambiables, incluyendo la etapa (iv), como se da a
conocer en la presente memoria.
En otra realización preferida de la presente
invención, la lisis celular es seguida por filtración con tierra de
diatomeas en una cantidad que clarifica eficazmente el lisado
celular. Esta etapa inicial es seguida por al menos las etapas
corriente abajo adicionales como se observan anteriormente, a saber
(i) precipitación por etapas del ADN plasmídico con CTAB; (ii)
disolución selectiva de plásmido con disolución salina; (iii)
eliminación de las impurezas restantes mediante adsorción sobre
silicato de calcio cristalizado hidratado; y (iv) preferiblemente,
una precipitación etanólica del ADN plasmídico purificado.
En otra realización preferida de la presente
invención, la lisis celular completa antes de la clarificación de
lisado implica la transferencia de células recogidas del caldo de
fermentación, o del caldo de fermentación, directamente con o sin
tratamiento con lisozima, preferiblemente con un tratamiento con
lisozima, mediante un aparato de intercambio de calor como se da a
conocer en las solicitudes de patente internacional PCT nº
PCT/US95/09749 (WO 96/02658) y PCT/US96/07083 (WO 96/36706). Esta
etapa de lisis es seguida por la inclusión de las siguientes etapas
posteriores a la lisis celular incluyendo, pero sin limitación, (i)
una precipitación de dos etapas selectiva de ADN plasmídico
utilizando un detergente catiónico, preferiblemente CTAB; (ii)
disolución selectiva de plásmido con una disolución salina; (iii)
adsorción de impurezas residuales sobre silicato de calcio
hidratado; y (iv) precipitación de ADN plasmídico purificado
utilizando un alcohol (incluyendo, pero sin limitación, etanol,
metanol o isopropanol) antes de la formulación final de la
preparación de plásmido de calidad clínica. Con este fin, este
aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la
purificación de ADN plasmídico superenrrollado a partir de una
fermentación microbiana, que comprende (a) recoger células
microbianas a partir de un caldo de fermentación; (b) resuspender
las células recogidas en un tampón STET convencional y añadir a las
células microbianas recogidas una cantidad suficiente de una
disolución de lisis; (c) calentar las células microbianas de la
etapa b) a una temperatura entre aproximadamente 60ºC a
aproximadamente 70ºC hasta aproximadamente 100ºC en un
intercambiador de flujo continuo formando un lisado celular; (d)
enfriar el lisado celular; (e) clarificar el lisado celular
utilizando filtración con tierra de diatomeas; (f) precipitar los
desechos celulares residuales e impurezas con una primera
precipitación inducida por cetiltrimetilamonio; (g) precipitar
selectivamente el ADN plasmídico superenrrollado con una segunda
precipitación inducida por cetiltrimetilamonio; (h) redisolver el
ADN plasmídico superenrrollado en un tampón que comprende NaCl en el
intervalo de 0,2 m a 2 m; (i) adsorber las impurezas residuales
sobre silicato de calcio cristalizado hidratado dentro del tampón
de la etapa (h); (j) precipitar el ADN plasmídico superenrrollado
con etanol; (k) filtrar para recoger y lavar el precipitado; (l)
secar para eliminar el etanol; (m) redisolver el ADN plasmídico
superenrrollado en un tampón de formulación fisiológicamente
aceptable; y (n) esterilizar mediante filtración a través de un
filtro de 0,22 \mum. Está también dentro del alcance de esta parte
de la invención omitir las etapas (j)-(n) esterilizando el tampón
de la etapa (i), seguido de concentración de ADN mediante
precipitación con etanol, dando como resultado un precipitado en
polvo que contiene el ADN plasmídico superenrrollado. Como se
describe en la presente memoria, la primera y segunda etapas de
precipitación inducida por CTAB (mediante una alimentación de CTAB
al 1% p/v en un tampón STET convencional) pueden estar eficazmente
en el intervalo de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 0,28% en
el primer corte y de aproximadamente 0,30% a aproximadamente 0,33%
para un segundo corte. Se observa de nuevo que está dentro del
alcance del experto, con esta memoria descriptiva delante, alterar
los intervalos de precipitación por etapas para ajustarse a
cualquier peculiaridad de los diversos sistemas de tampón, de tal
modo que se precipite en primer lugar una cantidad manejable de
impurezas de la disolución tampón restante que comprende ADN
plasmídico superenrrollado, que se precipita después con una
precipitación inducida por CTAB adicional. Pueden añadirse
componentes tales como EDTA y/o detergentes basados en Triton, como
se discute en la presente memoria, siendo útiles a concentraciones
biológicamente activas en los diversos tampones para ayudar a
promover la precipitación de ADN plasmídico.
En otra realización preferida de la presente
invención, la lisis celular completa antes de la clarificación de
lisado implica la transferencia de células recogidas del caldo de
fermentación, o del caldo de fermentación, directamente con o sin
lisozima, preferiblemente en presencia de lisozima, mediante un
aparato de intercambio de calor como se da a conocer en las
solicitudes internacionales PCT nº PCT/US95/09749 (WO96/02658) y
PCT/US96/07083 (WO96/36706). Este procedimiento de lisis celular
inicia el protocolo que incluye, pero sin limitación, (i)
clarificación de lisado con filtración auxiliada por tierra de
diatomeas; (ii) precipitación selectiva de una etapa de ADN
plasmídico utilizando un detergente catiónico, preferiblemente CTAB;
(iii) disolución selectiva de plásmido con una disolución salina;
(iv) adsorción de impurezas residuales sobre silicato de calcio
hidratado; y (v) precipitación de ADN plasmídico purificado
utilizando un alcohol, antes de la formulación final de la
preparación de plásmido de calidad clínica. Con este fin, este
aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la
purificación de ADN plasmídico superenrrollado a partir de un lisado
celular de una fermentación microbiana a gran escala que comprende:
(a) recoger células microbianas de un caldo de fermentación; (b)
resuspender las células recogidas en un tampón STET convencional y
añadir a las células microbianas recogidas una cantidad suficiente
de una disolución de lisis; (c) calentar las células microbianas de
la etapa b) a una temperatura entre 60ºC y 70ºC hasta
aproximadamente 100ºC en un intercambiador de calor de flujo
continuo formando un lisado celular; (d) enfriar el lisado celular;
(e) clarificar el lisado celular utilizando filtración con tierra
de diatomeas; (f) precipitar el ADN plasmídico superenrrollado con
bromuro de cetriltrimetilamonio; (g) redisolver el ADN plasmídico
superenrrollado en un tampón que comprende NaCl en el intervalo de
0,2 m a 2 m; (h) adsorber las impurezas residuales sobre silicato
de calcio cristalino hidratado en el tampón de la etapa (g); (i)
precipitar el ADN plasmídico superenrrollado con etanol; (j) filtrar
para recoger y lavar el precipitado; (k) secar para eliminar el
etanol; (l) redisolver el ADN plasmídico superenrrollado purificado
en un tampón de formulación fisiológicamente aceptable; y (m)
esterilizar mediante filtración a través de un filtro de 0,22
\mum. Está también dentro del alcance de esta parte de la
invención omitir las etapas (i)-(m) esterilizando el tampón de la
etapa (h), seguido de concentración de ADN mediante precipitación
etanólica, dando como resultado un precipitado en polvo que
contiene el ADN plasmídico superenrrollado. Es una temperatura de
lisis preferida de la etapa (b) de aproximadamente 70ºC a
aproximadamente 80ºC, mientras que un corte de CTAB sencillo puede
estar preferiblemente a una concentración de CTAB de aproximadamente
0,30% a aproximadamente 0,33% (mediante una alimentación de CTAB al
1% p/v en un tampón STET convencional), estando de nuevo
posiblemente influido por las condiciones tampón. Los componentes
del tampón tales como EDTA y Triton están disponibles, como se
observa en otro lugar, para adición a tampones para potenciar la
recogida de ADN plasmídico.
En otra realización preferida, la lisis celular
se lleva a cabo mediante modificación de las técnicas descritas por
Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acid Res., 7:
1513-1523), modificación en la que las células se
lisan utilizando hidróxido de sodio diluido seguido de
neutralización con KOAc. Esta etapa de lisis celular es seguida
después por la inclusión de las siguientes etapas posteriores a la
lisis celular incluyendo, pero sin limitación, (i) clarificación de
lisado con filtración auxiliada por tierra de diatomeas, (ii)
precipitación selectiva de ADN plasmídico utilizando un detergente
catiónico, preferiblemente CTAB; (iii) disolución selectiva de
plásmido con una disolución salina y (iv) adsorción de impurezas
residuales sobre silicato de calcio hidratado antes de la
formulación final de la preparación de plásmido de calidad clínica.
Con este fin, un aspecto de esta parte de la invención se refiere a
un procedimiento para la purificación de ADN plasmídico
superenrrollado a partir de un lisado celular de una fermentación
microbiana a gran escala que comprende: (a) recoger células
microbianas de un caldo de fermentación; (b) resuspender las células
recogidas en un tampón STET convencional y añadir a las células
microbianas recogidas una cantidad suficiente de lisozima/base/KOAc
para promover la lisis celular, formando un lisado celular; (c)
clarificar el lisado celular utilizando filtración con tierra de
diatomeas; (d) precipitar el desecho celular residual e impurezas
con una primera precipitación inducida por cetiltrimetilamonio; (e)
precipitar selectivamente el ADN plasmídico superenrrollado con una
segunda precipitación inducida por cetitrimetilamonio; (f)
redisolver el ADN plasmídico superenrrollado en un tampón que
comprende NaCl en el intervalo de 0,2 m a 2 m; (g) adsorber las
impurezas residuales sobre silicato de calcio cristalizado
hidratado con el tampón de la etapa (f); (h) precipitar el ADN
plasmídico superenrrollado con etanol; (i) filtrar para recoger y
lavar el precipitado; (j) secar para eliminar el etanol; (k)
redisolver el ADN plasmídico superenrrollado purificado en un
tampón de formulación fisiológicamente aceptable; y (l) esterilizar
por filtración a través de un filtro de 0,22 \mum. Está también
dentro del alcance de esta parte de la invención omitir las etapas
(h)-(l) esterilizando el tampón de la etapa (g), seguido de
concentración de ADN mediante precipitación etanólica, dando como
resultado un precipitado en polvo que contiene el ADN plasmídico
superenrrollado. Como se describe en la presente memoria, las
primera y segunda etapas de precipitación inducidas por CTAB
(mediante una alimentación de CTAB al 1% p/v en un tampón STET
convencional) pueden estar eficazmente en el intervalo de
aproximadamente 0,25% a aproximadamente 0,28% de primer corte y de
aproximadamente 0,30% a aproximadamente 0,33% para un segundo
corte. Se observa de nuevo que está dentro del alcance del experto,
con esta memoria descriptiva delante, alterar los intervalos de
precipitación por etapas para ajustarse a cualquier peculiaridad de
los diversos sistemas de tampón, de tal modo que precipite en primer
lugar una cantidad manejable de impurezas de la disolución tampón
restante que comprende ADN plasmídico superenrrollado, que se
precipita después con una precipitación inducida por CTAB
adicional. Pueden añadirse componentes de tampón tales como EDTA y/o
detergentes basados en Triton, siendo útiles dichos componentes a
concentraciones biológicamente eficaces en los diversos tampones
para ayudar a promover la precipitación de ADN plasmídico.
En otra realización preferida, la lisis celular
se lleva a cabo mediante el procedimiento de Birnboim & Doly
modificado en el que, como se observa anteriormente, se lisan
células utilizando hidróxido de sodio diluido seguido por
neutralización con KOAc. Esta etapa de lisis celular es seguida
después por la inclusión de las siguientes etapas posteriores a la
lisis celular incluyendo, pero sin limitación, (i) clarificación de
lisado con filtración auxiliada por tierra de diatomeas; (ii)
precipitación selectiva de ADN plasmídico utilizando un detergente
catiónico, preferiblemente CTAB; (iii) disolución selectiva de
plásmido con una disolución salina y (iv) adsorción de impurezas
residuales sobre silicato de calcio hidratado; y (v) precipitación
de ADN plasmídico purificado utilizando etanol, antes de la
formulación final de la preparación de plásmido de calidad clínica.
Un aspecto de esta parte de la invención se refiere a un
procedimiento para la purificación de ADN plasmídico
superenrrollado a partir de un lisado celular de una fermentación
microbiana a gran escala, que comprende (a) recoger células
microbianas a de una fermentación a gran escala; (b) resuspender las
células recogidas en un tampón STET convencional y añadir a las
células microbianas recogidas una cantidad suficiente de
lisozima/base/KOAc para promover la lisis celular, formando un
lisado celular; (c) clarificar el lisado celular utilizando
filtración con tierra de diatomeas; (d) precipitar ADN plasmídico
superenrrollado con bromuro de cetiltrimetilamonio; (e) redisolver
el ADN plasmídico superenrrollado en un tampón que comprende NaCl en
el intervalo de 0,2 m a 2 m; (f) adsorber las impurezas residuales
sobre silicato de calcio cristalizado hidratado; (g) precipitar el
ADN plasmídico superenrrollado con etanol; (h) filtrar para recoger
y lavar el precipitado; (i) secar para eliminar el etanol; (j)
redisolver el ADN plasmídico superenrrollado en un tampón de
formulación fisiológicamente aceptable; y (k) esterilizar mediante
filtración a través de un filtro de 0,22 \mum. Está también dentro
del alcance de esta parte de la invención omitir las etapas (g)-(k)
esterilizando el tampón de la etapa (f), seguido de concentración
de ADN mediante precipitación etanólica, dando como resultado un
precipitado en polvo que contiene el ADN plasmídico
superenrrollado. Es una temperatura de lisis preferida de la etapa
(b) de aproximadamente 70ºC a aproximadamente 80ºC, mientras que un
corte sencillo de CTAB (mediante una alimentación de CTAB al 1% p/v
en tampón STET convencional) puede estar preferiblemente a una
concentración de CTAB de aproximadamente 0,30 a aproximadamente
0,33%, de nuevo estando posiblemente influenciado por las
condiciones de tampón. Los componentes del tampón tales como EDTA y
Triton están disponibles, como se observa en otro lugar, para
adición a tampones para potenciar la recuperación de ADN
plasmídico.
Se disuelven las células microbianas recogidas
en tampón STET y se añade lisozima como se describe anteriormente.
Resulta fácilmente evidente para los expertos en la materia que
pueden hacerse modificaciones de esta fórmula de tampón básico y
son adecuadas para uso en la presente invención. Se pretende que
estén dentro del alcance del procedimiento de la presente invención
las modificaciones de esta fórmula de tampón básico que no afectan
ni alteran sustancialmente el resultado del presente procedimiento.
Sin embargo, en una realización preferida de la presente invención,
la precipitación selectiva de ADN plasmídico con CTAB como se
describe a lo largo de esta memoria descriptiva se lleva a cabo en
presencia de un tampón fisiológicamente aceptable que comprende un
quelante que elimina eficazmente cationes divalentes tales como
Mg^{++} y Ca^{++}. El magnesio es un cofactor esencial para la
ADNasa y el calcio compleja con ADN plasmídico, evitando la
precipitación por CTAB. Se ejemplifica en la presente memoria y se
prefiere que el quelante sea EDTA. Sin embargo, puede añadirse
cualquier quelante que elimine cationes divalentes tales como
Mg^{++} y Ca^{++} a los tampones utilizados para practicar los
procedimientos de purificación de ADN plasmídico dados a conocer en
la presente memoria. Se ha mostrado por los inventores que las
concentraciones de EDTA de 1 mM, 5 mM, 10 mM y 100 mM son eficaces
en la promoción de la precipitación de ADN plasmídico inducida por
CTAB. Por lo tanto, puede utilizarse cualquier concentración
fisiológicamente aceptable de un quelante de elección, incluyendo
EDTA, que promueva la precipitación de ADN plasmídico inducida por
CTAB a lo largo de las etapas de precipitación de ADN plasmídico por
etapas iniciales.
La tierra de diatomeas (TD) es un material en
polvo de cohesión suelta formado casi enteramente por los fragmentos
de concha de diatomeas hidratadas. Habitualmente de textura fina y
de color gris o blanco, la tierra de diatomeas está compuesta en
gran medida por dióxido de silicio o sílice en su forma pura,
teniendo un contenido de sílice del orden del 94%. La tierra de
diatomeas está disponibles comercialmente en tres formas: natural,
calcinada y calcinada con fundente. La forma calcinada de TD se
genera mediante calcinación a altas temperaturas, mientras que la
TD calcinada con fundente se prepara mediante calcinación en
presencia de fundente tal como ceniza de sosa o cloruro de sodio.
La tierra de diatomeas está disponible de múltiples fuentes
comerciales y todas y cada una de las formas comerciales están
contempladas para uso en la práctica de los procedimientos de la
presente invención incluyendo, pero sin limitación, Celpure 65,
Celpure 100, Celpure 300, Celpure 100 y LRA^{TM} (todas de
Advanced Minerals), así como auxiliares de filtrado celulósicos
tales como Solka Floc. Como se observa anteriormente y se
ejemplifica en la presente memoria, la clarificación del lisado
celular mediante filtración auxiliada por tierra de diatomeas es
una etapa de procesamiento corriente abajo preferida, puesto que
esta etapa parece ser más escalable y el ADN plasmídico menos
proclive a los efectos de cizalla de la centrifugación a gran
escala. Sin embargo, pueden utilizarse otras alternativas para
eliminar desechos celulares del huésped y ADN genómico, tales como
centrifugación.
En una realización especialmente preferida de la
presente invención, la precipitación selectiva de ADN plasmídico
con CTAB descrita a lo largo de esta memoria descriptiva se consigue
por etapas, precipitando selectivamente desechos celulares, ADNg y
algunos degradados de ADN a una concentración de CTAB de corte bajo,
seguido de una segunda precipitación de ADN plasmídico inducida por
CTAB de corte alto. Aunque se prefiere el CTAB para la
precipitación selectiva por etapas de ADN plasmídico, otros
compuestos que pueden ser útiles incluyen, pero sin limitación,
C16: cloruro de cetiltrimetilamonio; C16: bromuro o cloruro de
cetildimetiletilamonio; C16: bromuro o cloruro de cetilpiridinio;
C14: bromuro o cloruro de tetradeciltrimetilamonio; C12: bromuro o
cloruro de dodeciltrimetilamonio; C12: bromuro de
dodecildimetil-2-fenoxietilamonio;
C16: sal cloruro o bromuro de hexadecilamina; C16: bromuro o
cloruro de hexadecilpiridinio; y sal dodecilamina o cloruro de C12.
Estará dentro del alcance del experto ensayar sustitutos potenciales
para el detergente ejemplificado en la presente memoria para
identificar un compuesto que precipite eficazmente ADN plasmídico
superenrrollado de las diversas impurezas de lisado celular.
En la presente invención, se lleva a cabo la
adsorción en cargas corriente debajo de impurezas en presencia de
un silicato de calcio hidratado (hcCaSiO_{3}) tal como el silicato
de calcio hidratado sintético LRA^{TM} (Advanced Minerals
Corporation, Lompoc, CA 93438). También es posible sustituir por
adsorción en modo columna la etapa de adsorción de silicato de
calcio hidratado (hcCaSiO_{3}). Por ejemplo, si se utiliza
LRA^{TM}, se realiza en primer lugar una decantación por
sedimentación para eliminar los finos de LRA^{TM}, seguido de
empaquetado del LRA^{TM} en una columna. Se aplican diez volúmenes
de columna de NaCl (a la misma concentración de NaCl que la
disolución de alimentación de plásmido) a la columna, seguido de
aplicación de la disolución de plásmido. El ADN plasmídico
superenrrollado es la primera forma de ADN en eluir en el efluente.
Las fracciones posteriores contendrán degradados de plásmido y ADN
genómico. La endotoxina y CTAB se eliminan también al estar
estrechamente unidas a la columna. No se reúnen las fracciones que
contienen impurezas de ácido nucleico. Se describe un material de
silicato de calcio hidratado en la solicitud internacional PCT
PCT/US96/20034 (WO98/01464). Como se indica en el documento
WO98/01464, son conocidos muchos procedimientos en la técnica para
la preparación de compuestos de hcCaSiO_{3} (por ejemplo, véase
Taylor, 1964, ed., "The Chemistry of Cements", Academic Press.
Como se observa adicionalmente en el documento WO98/01464, el tamaño
de partícula de hcCaSiO_{3} puede ser de aproximadamente 0,01
\mum a aproximadamente 0,10 \mum, como se determina mediante
procedimientos conocidos tales como medidas de rayos X y/o
microscopía electrónica. De estas pequeñas partículas, pueden estar
presentes agregados del orden de aproximadamente 100 \mum. Como se
observa a continuación, una realización preferida muestra el
hcCaSiO_{4} con una retención en un tamiz de malla 325 de menos de
aproximadamente 10% en peso, más preferiblemente menos de
aproximadamente 8% en peso. En muchas realizaciones preferidas, el
hcCaSiO_{3} está en forma de polvo con una superficie específica
mayor que aproximadamente 75 m^{2}/g, y preferiblemente entre
aproximadamente 75 m^{2}/g y aproximadamente 200 m^{2}/g. Es un
material de silicato de calcio hidratado preferido utilizado en la
presente memoria un polvo fino preparado mediante reacción
hidrotérmica de tierra de diatomeas, óxido de calcio hidratado
(hidróxido de calcio) y agua. El producto fino es una forma
cristalina que comprende aproximadamente 47% de sílice (SiO_{2})
en peso, una cantidad estequiométrica de calcio (CaO)
aproximadamente al 32% en peso, aproximadamente 2,5% en peso de
aluminio (Al_{2}O_{3}), aproximadamente 1,2% en peso de sodio
(Na_{2}O) y potasio (K_{2}O) combinados, aproximadamente 0,7% en
peso de hierro (reseñado como Fe_{2}O_{3}), aproximadamente
0,6% en peso de magnesio (MgO), siendo el resto (aproximadamente
16,6%) H_{2}O. Esta forma preferida posee una retención en un
tamiz de malla 325 de aproximadamente 6% en peso y superficie
específica de aproximadamente 120 m^{2}/g (determinada utilizando
el procedimiento BET). Los intervalos de porcentaje en peso de los
componentes anteriormente identificados de CaSiO_{3} pueden
incluir, pero no están necesariamente limitados a: SiO_{2}
(45-95%), CaO (5-35%), H_{2}O
(1-20%) y, en algunos casos, de aproximadamente 1%
a aproximadamente 10% de diversas impurezas incluyendo, pero no
necesariamente con limitación, Al_{2}O_{3}, metales alcalinos
tales como óxidos de sodio (Na_{2}O) y potasio (K_{2}O), óxido
de hierro (Fe_{2}O_{3}) y óxido de magnesio (MgO), así como
pequeñas cantidades de aluminio soluble. Está dentro del alcance
del experto sustituir formas alternativas de materiales basados en
calcio hidratado para uso en la etapa de adsorción que pueden
unirse selectivamente a fragmentos mayores de ADN como se
ejemplifica con LRA^{TM}, Matrex^{TM} (Amicon) e hidroxiapatito
[fosfato de calcio (dibásico)]. Independientemente, un silicato de
calcio hidratado sintético con características similares al
LRA^{TM} (como se da a conocer en el documento WO 98/01464) es un
material adsorbente preferido para eliminar degradados de ADN
residuales tales como formas relajadas abiertas y lineales, ADN y
ARN de huésped, endotoxina, proteínas y eliminar aditivos de
detergente tal como CTAB.
Por lo tanto, los procedimientos descritos en la
presente memoria darán como resultado conseguir la separación entre
diversas formas de plásmido (ADN plasmídico superenrrollado [el
producto pretendido para uso como vacuna de ADN o vehículo de
terapia génica], ADN plasmídico relajado abierto, ADN plasmídico
lineal y concatómeros de ADN plasmídico) y para eliminar
contaminantes del huésped tales como LPS (endotoxina), ARNg, ADNg y
proteínas residuales.
El plásmido para aislar y purificar mediante el
procedimiento de la presente invención puede ser cualquier molécula
de ADN extracromosómica. Los plásmidos pueden ser de alto número de
copias por célula o bajo número de copias por célula. Los plásmidos
pueden ser también virtualmente de cualquier tamaño. Resulta
fácilmente evidente para los expertos en la materia que
virtualmente cualquier plásmido en las células microbianas puede
aislarse mediante el procedimiento de la presente invención.
El procedimiento de la presente invención es
adecuado para uso con fermentaciones microbianas en general.
Resulta fácilmente evidente para los expertos en la materia que son
adecuadas una amplia variedad de células microbianas para uso en el
procedimiento de la presente invención incluyendo, pero sin
limitación, células bacterianas, células vegetales, células
fúngicas incluyendo levadura, y baculovirus. Es una fermentación
bacteriana preferida una fermentación de E. coli que
contiene el plásmido para aislar y purificar. Resulta fácilmente
evidente para los expertos en la materia que son adecuadas
fermentaciones bacterianas distintas de fermentaciones de E.
coli para uso en la presente invención. Las fermentaciones
bacterianas a gran escala de la presente invención pueden crecer en
cualquier medio líquido que sea adecuado para el crecimiento de las
bacterias que se están utilizando. Aunque la metodología dada a
conocer es aplicable a volúmenes de fermentación menores, es un
aspecto especialmente útil de la presente invención la escalabilidad
a fermentaciones de células microbianas a gran escala. El término
"gran escala" como se utiliza en la presente memoria se
considera que es volúmenes de fermentación celular totales mayores
que aproximadamente 5 l, o células recogidas de un volumen de
fermentación mayor de aproximadamente 5 l. La metodología de
fermentación a gran escala de la presente invención es aplicable a
lotes de tamaño clínico que representan, pero sin limitación,
fermentaciones de aproximadamente 100-200 l.
Una realización de la presente invención que
comprende cada una de estas etapas identificadas anteriormente
consiste en las siguientes etapas: (i) filtración por flujo
tangencial del caldo de fermentación para concentrar y diafiltrar
células que contienen ADN plasmídico; (ii) resuspensión de células;
(iii) incubación a 37ºC de suspensión celular con lisozima
recombinante; (iv) lisis celular mediante calentamiento rápido,
seguido de enfriamiento del lisado; (vi) clarificación de lisado
utilizando filtración con tierra de diatomeas; (v) precipitación
del desecho celular residual e impurezas tales como ADN genómico con
la adición de CTAB; (vi) precipitación selectiva de ADN plasmídico
con CTAB; (vii) redisolución selectiva de ADN plasmídico; (viii)
adsorción por cargas de endotoxina residuales y CTAB sobre silicato
de calcio; (ix) adsorción por cargas de proteína residual, ácido
nucleico y otras impurezas sobre silicato de calcio cristalino; (x)
precipitación de ADN plasmídico con etanol; (xi) filtración para
recoger y lavar el precipitado; (xii) secado a vacío para eliminar
el etanol; (xiii) redisolución del ADN plasmídico purificado en
tampón de formulación; y (xiv) filtración estéril a 0,22 \mum.
En otra realización de la presente invención, se
incuban células no recogidas del caldo de fermentación con lisozima
a 37ºC durante aproximadamente 1 hora, y se bombea la suspensión
celular a través de un intercambiador de calor que consigue una
temperatura de salida de 75-80ºC. Esto es seguido
por bombeo a través de un segundo intercambiador de calor para
enfriar el lisado a 20-25ºC. Se somete el material
de lisado a (i) clarificación de lisado utilizando filtración con
tierra de diatomeas, (ii) precipitación del desecho celular residual
e impurezas tales como ADN genómico con la adición de CTAB, (iii)
precipitación selectiva de ADN plasmídico con CTAB, (iv) disolución
selectiva de ADN plasmídico, (v) adsorción por cargas de endotoxina
residual y CTAB sobre silicato de calcio cristalino hidratado; (vi)
adsorción por cargas de proteína residual, ácido nucleico y otras
impurezas sobre silicato de calcio; (vii) precipitación de ADN
plasmídico con etanol; (viii) filtración para recoger y lavar el
precipitado; (ix) secado a vacío para eliminar etanol; (x)
disolución del ADN plasmídico purificado en tampón de formulación; y
(xi) filtración estéril a 0,22 \mum.
Se recogen las células microbianas que contienen
el plásmido del medio de fermentación proporcionando una pasta o
suspensión celular. Es adecuado cualquier medio convencional para
recoger células de un medio líquido incluyendo, pero sin
limitación, centrifugación o microfiltración. Se genera una pasta
celular recogiendo células microbianas que contienen ADN plasmídico
del caldo de fermentación. La recolección consiste en: (i)
concentrar las células por un factor de cuatro utilizando filtración
de flujo tangencial a través de una membrana A/G Tech de un peso
molecular nominal de 500 kDa y (ii) diafiltrar las células
concentradas con tres volúmenes equivalentes de solución salina 120
mM esterilizada. Se resuspenden las células recogidas en tampón STET
esterilizado (sacarosa al 8% p/v, Tris-HCl 50 mM,
EDTA 100 mM, Triton X-100 al 2% v/v, pH 8,5) a una
dilución correspondiente a una densidad óptica de 30 a 600 nm. Se
calienta la suspensión a 37ºC y se añade lisozima
Ready-Lyse^{TM} de Epicentre Technologies a una
concentración de 500 kU/l. Después de 45 minutos a 37ºC, se bombea
la suspensión celular a través de un serpentín de transferencia de
calor sumergido en agua hirviendo, de modo que su temperatura
alcance 70ºC tras salir del serpentín. Se enfría después el lisado
aproximadamente a 20ºC mediante flujo a través de un serpentín de
transferencia de calor sumergido en baño de agua con hielo. La etapa
de lisis que comprende la transferencia de la suspensión celular a
través de un aparato de intercambio de calor se da a conocer en las
solicitudes internacionales PCT nº PCT/US95/09749 (WO 96/02658) y
PCT/US96/07083 (WO 96/36706). Brevemente, se resuspenden las
células microbianas recogidas en tampón STET y se añade lisozima
como se describe anteriormente. Resulta fácilmente evidente para
los expertos en la materia que pueden hacerse modificaciones de
esta fórmula de tampón básica y son adecuadas para uso en la
presente invención. Se pretende que las modificaciones a esta
fórmula de tampón básica que no afectan ni alteran el resultado del
presente procedimiento estén dentro del alcance del procedimiento
de la presente invención. Sin embargo, se prefiere especialmente que
esta etapa tenga lugar en presencia de un tampón fisiológicamente
aceptable que comprende un quelante que elimina eficazmente
cationes divalentes tales como Mg^{++} y Ca^{++}, tal como EDTA.
Como se observa anteriormente, puede utilizarse cualquier
concentración de quelante que promueva la precipitación de ADN
plasmídico inducida por CTAB, que se ha ejemplificado en un amplio
intervalo de concentración de EDTA de aproximadamente 1 mM a más de
100 mM. Estos intervalos de concentración de EDTA son el resultado
de la precipitación inducida por CTAB óptima de ADN plasmídico
superenrrollado, inhibiendo también la actividad ADNasa. El
intervalo de pH del tampón puede ajustarse según los mejores
resultados proporcionados por la cepa particular de bacterias que se
esté utilizando. El intervalo de pH preferido es de aproximadamente
8,0-8,5. Se calienta después la suspensión
aproximadamente a 60-100ºC, prefiriéndose
aproximadamente 70-80ºC, en un intercambiador de
calor de flujo continuo. Esto es seguido por enfriamiento a
20-25ºC en un segundo intercambiador de calor. Se
contempla también un procedimiento alternativo de lisis de Birnboim
y Doly (1979, Nucleic Acid Res. 7:
1513-1523). En este procedimiento, se lisan las
células utilizando hidróxido de sodio diluido seguido de
neutralización con KOAc. Se omite el SDS de la etapa alcalina para
evitar interferencia con la precipitación de ADN inducida por CTAB.
El rendimiento de lisis no estaba afectado por la eliminación de
SDS.
Se añade después tierra de diatomeas
(Celpure^{TM}, Advanced Minerals) al lisado enfriado a una
concentración de 30 g/l. Se filtra la suspensión resultante, y se
lava la torta para recoger el producto líquido. Se mezcla después
Celpure^{TM} con el lisado clarificado aproximadamente a 10 g/l.
Precipitan desechos celulares finamente divididos residuales y
otras impurezas, incluyendo ADN genómico y degradados de ADN
circular relajado y lineal a partir del lisado clarificado
añadiendo una disolución de CTAB al 1,0% p/v en NaCl 40 mM a una
concentración final de CTAB del 0,1-0,3% p/v. Se
filtra la suspensión resultante, después de proporcionar una
recirculación inicial hasta que su turbidez es menor de 10 NTU. Se
añade Celpure^{TM} al filtrado a una concentración de
alimentación de sólidos de aproximadamente 10 g/l. Esto proporciona
un matriz sobre la que precipita el ADN plasmídico tras aumentar la
concentración de CTAB a 0,25%-0,45% p/v utilizando CTAB al 1,0% p/v
en NaCl 40 mM. Se filtra la suspensión y se recircula el filtrado
hasta que su turbidez es menor de 10 NTU. En el ejemplo 1, se lavó
la torta de filtrado impregnada con ADN plasmídico resultante con
CTAB al 0,30-0,33% p/v en NaCl 40 mM. El experto en
la materia comprenderá que los intervalos de CTAB de corte bajo y
alto pueden manipularse dependiendo de las variaciones de la
concentración de ADN plasmídico, fuerza iónica y/o temperatura. Se
disuelve después la torta de filtrado en NaCl aproximadamente 0,2 M
a aproximadamente 2,0 M con Tris 100 mM (pH 8,2). Se redisuelve el
ADN plasmídico a medida que el NaCl se intercambia por CTAB. De
nuevo, el experto puede elegir diversas concentraciones salinas
para lavar y/o redisolver la torta de filtrado. Se filtra la
suspensión sobre una membrana de acero inoxidable para eliminar la
Celpure^{TM}, después de proporcionar una recirculación inicial
para conseguir una baja turbidez. Se somete el filtrado a dos etapas
de adsorción por cargas utilizando hcCaSiO_{3} (por ejemplo,
LRA^{TM} de Advanced Minerals). La primera etapa de adsorción
elimina la endotoxina residual y CTAB; la segunda elimina las
proteínas residuales, degradados de ADN circular relajado y lineal,
así como ADN y ARN de hospedador. Se añade LRA^{TM} a 45 g por g
de ADN en la primera etapa de adsorción. Se incuba la suspensión
resultante a 20ºC durante 1 hora y se filtra. Se lava la torta de
filtrado con NaCl 1,2 M, o una concentración salina razonable, como
se observa anteriormente. Se añade LRA^{TM} reciente al filtrado
y disolución de lavado a 50 g por g de ADN, y se incuba la
suspensión resultante a 20ºC durante aproximadamente 5 horas. Se
filtra después la suspensión para eliminar el LRA^{TM}, y se lava
la torta de filtrado resultante con NaCl 1,2 M. Resultará evidente
para el experto en la materia que las etapas de adsorción por
cargas anteriores pueden llevarse a cabo suspendiendo el silicato de
calcio en disolución que contiene precipitado de CTAB
reconstituido, o las etapas de adsorción por cargas pueden
completarse utilizando una columna empaquetada que comprende
hcCaSiO_{3}, como se observa anteriormente con referencia al uso
de columna de hcCaSiO_{3} para uso en el tratamiento del
intermedio de CTAB disuelto. Se añade un volumen equivalente de
etanol absoluto al filtrado y lavado de la segunda etapa de
hcCaSiO_{3} para precipitar el ADN plasmídico purificado. Se
recoge el precipitado resultante mediante filtración y se lava
inmediatamente con etanol absoluto. Se seca el precipitado lavado a
vacío a 20ºC para eliminar el etanol y se almacena posteriormente a
4ºC hasta reformulación. Tras reformulación en un tampón adecuado
para inyección, se somete la disolución de ADN plasmídico
purificada a una filtración estéril a 0,22 \mum. Como alternativa,
puede aislarse el producto bruto en polvo del precipitado etanólico
si el precipitado forma una pasta imposible de filtrar. Se
centrifuga la pasta precipitada y se añade la pasta a EtOH al 100%,
que se mezcla en un homogeneizador de alta velocidad tal como un
rotor-estator. Se deshidrata simultáneamente la
pasta y se muele en húmedo en partículas duras. Estas partículas son
susceptibles de filtración y secado.
Como se observa anteriormente, en lugar de
precipitar un polvo bruto, la preparación de ADN plasmídico
purificado puede transferirse a un vehículo o disolución tampón
farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o disoluciones tampón
farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica e incluyen
aquellos descritos en una variedad de textos tales como
"Remington's Pharmaceutical Sciences". Cualquier procedimiento
adecuado para concentrar una muestra de ADN es adecuado para uso en
la presente invención. Dichos procedimientos incluyen
ultrafiltración, precipitación alcohólica, liofilización y
similares, prefiriéndose purificación etanólica. La preparación de
plásmido purificado puede esterilizarse mediante cualquier
procedimiento de esterilización que no afecte a la utilidad del
producto de ADN tal como esterilización por pasada a través de una
membrana que tenga un tamaño de poro suficientemente pequeño, por
ejemplo, 0,22 micrómetros y menor.
El producto final contiene calcio que se segrega
del estado débilmente unido en hcCaSiO_{3}. Una preparación
típica podría tener aproximadamente 1,6% p/p en el producto
precipitado. Para la preparación de formulaciones clínicas, el
calcio residual puede eliminarse mediante procedimientos
convencionales que implican EDTA. Por ejemplo, la complejación de
calcio mediante la adición de EDTA puede realizarse junto con
ultrafiltración o precipitación, y el complejo de
calcio-EDTA eliminarse por lavado con los licores de
precipitación o corrientes de permeado de ultrafiltración. Como
alternativa, una columna quelante pequeña que contiene EDTA
eliminaría más eficazmente el calcio sin introducir EDTA en la
corriente de procedimiento.
Los procedimientos de la presente invención
permiten la purificación de plásmido de ADN de calidad clínica a
partir de organismos que incluyen, pero en modo alguno con
limitación, levadura y E. coli. El ADN plasmídico de calidad
clínica purificado mediante los procedimientos descritos en la
presente memoria es extremadamente útil para administración a seres
humanos como vacuna o vehículo de terapia génica.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar el procedimiento de la presente invención.
El siguiente protocolo para la purificación de
ADN plasmídico a partir de E. coli dio como resultado el
aislamiento de aproximadamente 730 mg de ADN plasmídico
superenrrollado purificado. Se muestra en la Figura 1 un esquema del
procedimiento de purificación de plásmido básico dado a conocer en
la presente memoria.
Lisis celular: Se descongelaron 600 ml de
pasta celular utilizando agua corriente caliente y se resuspendieron
en 5,4 l de tampón STET. La dilución de 10 veces proporcionó una
suspensión con una densidad óptica de 30 a 600 nm. Se añadieron
después a la suspensión celular 400 \mul de lisozima
Ready-Lyse (Epicentre, 30 kU/\mul). Se elevó la
temperatura de la suspensión celular diluida a aproximadamente 40ºC.
Después de 45 minutos de mezclado, se lisaron térmicamente las
células mediante un serpentín de acero inoxidable electropulido
sumergido en un baño de agua hirviendo. Se ajustó la velocidad de
flujo de modo que la temperatura del fluido que sale del
intercambiado de calor fuera aproximadamente de 70ºC. Se limpió
después el serpentín de lisis con agua exenta de pirógenos, se
sumergió en un baño de hielo y agua y se utilizó para enfriar el
lisado caliente hasta 30ºC. Se enfrió el lisado al cabo de 30
minutos de la terminación de la lisis térmica. El volumen de lisado
total fue de 5,6 l.
Clarificación: Se utilizó Celpure P300
(Advanced Minerals) a una concentración de alimentación de sólidos
de 30 g/l para clarificar el lisado enfriado. Se mezcló Celpure P300
con el lisado, y se dividió la suspensión resultante en cuatro
partes. La cantidad de Celpure puede variarse en un amplio intervalo
dependiendo de la escala de operación final, el tamaño de filtro
deseado y de la configuración y la velocidad de producción diseñada
de la instalación de fabricación. Consideraciones similares dictan
las cantidades de tierra de diatomeas en las etapas de filtración
de bajo corte y alto corte descritas en la presente memoria. Se
filtró separadamente cada parte a través de una malla de acero
inoxidable de 25 \mum contenida en una carcasa de filtro de 15,24
cm. Se recirculó inicialmente el filtrado hasta que su turbidez se
redujo aproximadamente a 10 NTU. Después de cada filtración, se
utilizó aire a presión para desplazar el fluido intersticial en la
torta de filtrado. El volumen total de lisado clarificado fue de
5,05 l. La concentración de ADN total y la pureza del ADN plasmídico
superenrrollado, medidas por un ensayo de HPLC analítico, fueron de
0,338 g/l y 83,6%, respectivamente.
Sonda de CTAB: Se empleó una sonda rápida
de CTAB para determinar las concentraciones de CTAB de corte bajo y
alto aproximadas. Se añadieron cantidades progresivas de CTAB al
1,0% p/v en NaCl 40 mM a alícuotas de 500 \mul de lisado
clarificado en viales de vidrio de 1,5 ml. Se agitaron con vórtex
los viales y se inspeccionó visualmente la presencia de
precipitados de ADN. Basándose en los resultados de la sonda, se
asignaron concentraciones de CTAB de corte bajo y alto de 0,23 y
0,30% p/v, respectivamente.
Etapa de CTAB de corte bajo: Se añadió a
temperatura ambiente durante un periodo de tiempo de 43 minutos una
disolución de 1,5 l de CTAB al 1,0% p/v en NaCl 40 mM a 5,05 l de
lisado clarificado. Se añadieron después 34,2 g de Celpure 300. Se
filtró después la suspensión a través de una malla de acero
inoxidable de 25 \mum contenida en una carcasa de filtro de 15,24
cm de diámetro. Se recirculó inicialmente el filtrado hasta que su
turbidez fue constante. No se lavó la torta de filtrado, sino que se
secó utilizando aire a presión. El volumen final de filtrado que
contiene producto fue de 6,44 l.
Etapa de CTAB de corte alto: Se añadieron
29,3 g de Celpure P300 al filtrado de corte bajo. Se añadieron
después con agitación 650 ml de CTAB al 1,0% p/v en NaCl 40 mM a la
suspensión durante un periodo de tiempo de aproximadamente 30 min.
Los análisis por HPLC analítica revelaron que todo el ADN había
precipitado. Se filtró después la suspensión de corte alto a través
de una malla de acero inoxidable de 25 \mum contenida en una
carcasa de filtro de 15,24 cm de diámetro. Se recirculó el filtrado
hasta que se observó una turbidez constante. Se lavó la torta de
filtrado con una disolución de 1 l de CTAB al 0,3% p/v en NaCl 12 mM
después de completar la filtración de la suspensión de corte alto.
Se recogieron dos fracciones de lavado de 500 ml. Se secó después
parcialmente la torta lavada utilizando aire a presión, se recogió
de la carcasa de filtro y se pesó, determinando la masa de líquido
residual en la torta. La masa total de torta fue de 113 g. Celpure
y ADN precipitado contribuyeron aproximadamente con 29 y 2 g,
respectivamente, indicando que había aproximadamente 82 ml de
líquido residual en la torta lavada. La Figura 2 muestra un perfil
de concentración durante la etapa de precipitación con CTAB. Estos
datos muestran que el ADN plasmídico precipita en un aumento
estrecho de detergente. Esta etapa de precipitación por CTAB es
selectiva para la eliminación de proteína, ARN y endotoxina, que
permanecen solubles.
Redisolución selectiva de torta lavada de
corte alto: Se añadieron 700 ml de agua estéril a la torta
lavada de corte alto, llevando el volumen total de líquido a
aproximadamente 782 ml. Se añadieron aproximadamente 86 ml de NaCl
5 M a la suspensión, proporcionando una concentración de NaCl de
aproximadamente 0,5 M y redisolviendo el ADN plasmídico
superenrrollado. Se filtró la tierra de diatomeas residual a través
de una malla de acero inoxidable de 25 micrómetros contenida en una
carcasa de filtro de 15,24 cm de diámetro para separar la Celpure
del ADN plasmídico superenrrollado redisuelto. Se recirculó el
filtrado hasta que se obtuvo un filtrado transparente. Se lavó la
torta de filtrado con aproximadamente 1 l de NaCl 0,5 M para recoger
el líquido intersticial que contiene producto. Se recogió el lavado
de NaCl 0,5 M en cuatro fracciones. Se utilizó un ensayo de HPLC
analítica para ensayar en el filtrado de producto y las cuatro
fracciones de lavado la concentración de ADN total y la pureza de
ADN plasmídico superenrrollado. El volumen, concentración de ADN
total y composición del ADN superenrrollado del filtrado de
producto y lavados con NaCl 0,5 M fueron los siguientes: (i)
filtrado de producto: 800 ml, 1,933 g/l, 93,0%; (ii) fracción de
lavado 1: 200 ml, 0,203 g/l, 89,1%; (iii) fracción de lavado 2: 200
ml, 0,047 g/l, 70,3%; (iv) fracción de lavado 3: 300 ml, 0,018 g/l,
61,4% y (v) fracción de lavado 4: 300 ml, 0,015 g/l, 63,3%. Las
fracciones de lavado no se añadieron al filtrado de producto debido
a su baja pureza y concentración.
La Figura 3 muestra la disolución selectiva de
ADN plasmídico por NaCl 0,2 M mediante electroforesis en gel de
agarosa. El ADN genómico del huésped es sólo parcialmente soluble y
se elimina mediante filtración después de disolver con NaCl 0,2 M.
A NaCl 1,2 M, el ADNg es soluble. Será útil un intervalo de NaCl de
al menos aproximadamente 0,2 M a al menos aproximadamente 2 M para
la disolución selectiva del precipitado de CTAB.
Tratamiento de la carga con cantidades
progresivas de LRA^{TM}: Se añadieron 735 ml de precipitado
redisuelto en NaCl 0,5 M a temperatura ambiente a 45 g de
LRA^{TM} (Advanced Minerals). Se tomaron muestras de 500 \mul a
4,8, 9,9, 19,1 y 19,6 horas. La Tabla 1 expone las concentraciones
de ADN total y la composición de ADN plasmídico superenrrollado
medida mediante ensayo de HPLC analítica.
Periódicamente, se añadieron cantidades
progresivas de LRA^{TM} reciente a la suspensión y se tomaron
muestras a los siguientes tiempos:
- (i)
- se añadieron 4,6 g de LRA^{TM} a las 19,9 h (para 35 g de LRA^{TM}/g de ADN). Se tomaron muestras a las 21,6, 23,8 y 25,4 h;
- (ii)
- se añadieron 6,6 g de LRA^{TM} a las 25,8 h (para 39,5 g de LRA^{TM}/g de ADN). Se tomaron muestras a las 26,8, 27,8, 28,8 y 30,9 h;
- (iii)
- se añadieron 3,7 g de LRA^{TM} a las 32,2 h (para 42 g de LRA^{TM}/g de ADN). Se tomaron muestras a las 32,4, 34,4 y 40,8 h.
- (iv)
- se añadieron 3,98 g de LRA^{TM} a las 41 h (para 45 g de LRA^{TM}/g de ADN). Se tomaron muestras a las 41,8 y 42,6 h.
Como se expone en la Tabla 1, los aumentos
adicionales de pureza de plásmido (medidos por un ensayo de HPLC)
pueden correlacionarse con las adiciones periódicas de
LRA^{TM}.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 4A muestra que la adsorción plasmídica
óptima a silicato de calcio se produce a una concentración de NaCl
de aproximadamente 0,6 M, comparado con concentraciones mayores de
NaCl. Estará dentro del alcance del experto en la materia manipular
la concentración de NaCl dentro de este intervalo indicado sin
afectar a la capacidad del LRA^{TM} de adsorber ADN plasmídico
superenrrollado. La optimización de esta etapa implicaría una
investigación de todos los factores que pertenecen al fenómeno
subyacente de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y
electrostáticas. Entre dichas variables están la concentración
salina, el tipo de sal, la temperatura, el pH y el tipo de
adsorbente. Por ejemplo, podría esperarse que otros adsorbentes
basados en calcio que se unen a ADN proporcionen la separación bajo
un esquema de optimización que implique las variables de fase en
disolución anteriores.
Eliminación y lavado del LRA^{TM}:
Después de 42,9 h, se centrifugó la suspensión de LRA^{TM} a 19ºC
y 8 krpm durante 25 minutos. Se recogió el sobrenadante de 400 ml
resultante. Se añadieron 200 ml de NaCl 0,5 M reciente al sedimento
de LRA^{TM}. Se utilizaron una espátula estéril y agitación
vigorosa durante 10 s para resuspender el sedimento de LRA^{TM}.
Se sometió el LRA^{TM} resuspendido a centrifugación durante 10
min a 8 krpm. Se recogieron los sobrenadantes y se lavó el sedimento
de LRA^{TM} dos veces más de esta manera. Se ensayaron en el
primer sobrenadante (400 ml) y los tres lavados (3 x 200 ml) la
concentración de ADN total y la composición de ADN plasmídico
superenrrollado. Se exponen los resultados en la Tabla 2. No se
añadieron los lavados al producto sobrenadante. Se esterilizó
después por filtración el producto sobrenadante a través de una
unidad de filtración a vacío desechable de 0,8 \mum para eliminar
el LRA^{TM} residual.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 4B muestra la adsorción de ADN
genómico o del huésped con el tiempo. Más específicamente, este dato
muestra que el LRA^{TM} elimina selectivamente el ADN después de
5 horas de mezcla de contacto a una concentración de NaCl 1,2 M,
dando como resultado un rendimiento de plásmido de aproximadamente
60%. La Figura 4C es una electroforesis en gel de agarosa de
muestras en fase líquida durante la puesta en contacto de LRA^{TM}
a NaCl 1,2 M. Este dato muestra la eliminación de productos
lineales (Lin), de círculo abierto relajado (OC) y multímeros (M),
mientras que el ADN plasmídico superenrrollado (SC) permanece. Los
carriles 1-5 representan puntos temporales
crecientes y los carriles 6-8 representan lavados de
LRA^{TM} filtrado. La Figura 4D muestra la adsorción selectiva de
degradados de plásmido sobre hcCaSiO_{3} en NaCl 0,5 M. Se muestra
la electroforesis en gel de agarosa de muestras en fase líquida en
contacto con 32 g de hcCaSiO_{3} por g de ADN total en función del
tiempo.
Precipitación etanólica del producto de
LRA^{TM}. Se añadieron lentamente 400 ml de etanol absoluto a
400 ml de filtrado post-LRA^{TM}. Se completó la
adición de etanol durante un periodo de 2 h, proporcionando una
concentración de etanol final de 50% v/v. La disolución se volvió
muy turbia en el intervalo de etanol al 36 a 38% v/v . En este
punto, se detuvo la adición de etanol durante 30 min para permitir
el crecimiento de partículas. La inspección detallada reveló
partículas finas filtrables. Después de un tiempo de mezclado de 30
minutos, se filtró la suspensión por un filtro estéril de 0,22
\mum (Millipore, membrana GP Express, 50 cm^{2}). Se utilizaron
aproximadamente 500 ml de etanol absoluto para lavar la torta. Se
transfirió después la unidad de filtración a una estufa de vacío y
se secó durante 2 h a 27ºC y 97,93 kPa. Se recogieron 730 mg de
polvo seco y se almacenaron en un vial de vidrio tintado
estéril
a -20ºC.
a -20ºC.
La Tabla 3 resumen la pureza y rendimiento
(medido mediante un ensayo HPLC analítico) en cada etapa del
procedimiento. Se consiguieron rendimientos de aproximadamente 100%
mediante CTAB de corte bajo, CTAB de corte alto y redisolución del
precipitado de corte alto.
La Tabla 4 resume la eliminación de proteína y
endotoxina. Se ensaya en el producto precipitado con etanol final la
eliminación de ARN residual, ADN genómico, endotoxina, proteína,
CTAB, lisozima, LRA^{TM} y Celpure P300.
La Figura 6 ilustra la composición de ADN de
muestras de etapas de procedimiento descritas en esta sección de
ejemplos. Se visualiza el plásmido superenrrollado en la banda
inferior. Las bandas superiores representan diversas impurezas de
ADN, Incluyendo plásmido de círculo abierto y lineal, multímeros
plasmídicos y ADN genómico. Se expone el lisado clarificado con
tierra de diatomeas (carril 1, desde la izquierda); el filtrado de
corte bajo con CTAB al 0,23% p/v (carril 2): el filtrado de corte
alto con CTAB al 0,30% p/v que no contiene ADN (carril 3); el
precipitado de corte alto en NaCl 0,4 M (carril 4); el precipitado
de corte alto en NaCl 0,475 M (carril 5); el precipitado de corte
alto en NaCl 0,5 M (carril 6); el filtrado de 0,8 \mum después de
la etapa de adsorción de LRA (carril 7); el producto de LRA sometido
a precipitación etanólica y redisolución en agua estéril (carril
8). Una comparación de los carriles 1 y 8 revela que hay una
reducción sustancial de las impurezas de tipo degradado de ADN.
La precipitación de CTAB puede controlarse
estrechamente utilizando, por ejemplo, un analizador de tamaño de
partícula Lasentec®. Se precipitan los desechos celulares finamente
divididos residuales y otras impurezas, incluyendo ADN genómico y
degradados de ADN circular relajado y lineal, del lisado clarificado
añadiendo una disolución de CTAB al 1,0% p/v en NaCl 40 mM hasta
una concentración final de 0,25-0,28% p/v de CTAB.
La precipitación de las impurezas se controla a tiempo real
utilizando un analizador de tamaño de partícula Lasentec®. La
adición de CTAB se detiene después de que el recuento de partículas
totales caiga bruscamente. Esto es justo suficiente CTAB para
precipitar ADN lineal y circular relajado, dejando el ADN
superenrrollado en disolución. Se filtra después la carga para
eliminar las impurezas precipitadas. Se añade CTAB a la carga hasta
una concentración final de 0,30-0,33% p/v de CTAB
para precipitar el ADN superenrrollado. La Figura 5 muestra la
precipitación de impurezas con 0,25-0,30% de CTAB
utilizando un analizador de tamaño de partícula Lasentec®. Se
detiene la adición de CTAB a los 100 minutos basándose en un cambio
brusco en el recuento de partículas. Se eliminan las impurezas
precipitadas mediante filtración. Se añade CTAB adicional para
precipitar el plásmido superenrrollado.
La presente invención no está limitada en su
alcance por las realizaciones específicas descritas en la presente
memoria.
Claims (21)
1. Un procedimiento de purificación de ADN
plasmídico superenrrollado a partir de un lisado celular de una
fermentación microbiana, que comprende añadir silicato de calcio
cristalizado hidratado al lisado celular para adsorber y retirar las
impurezas residuales del ADN plasmídico superenrrollado.
2. Un procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el lisado celular se clarifica antes de la adición del
silicato de calcio cristalizado hidratado.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1,
que comprende:
(a) precipitar el ADN plasmídico superenrrollado
mediante una precipitación inducida por detergente;
(b) redisolver el ADN plasmídico superenrrollado
precipitado en una disolución salina;
(c) añadir silicato de calcio cristalizado
hidratado al plásmido superenrrollado resuspendido para adsorber y
retirar las impurezas residuales del ADN plasmídico superenrrollado,
dando como resultado una disolución que contiene el ADN plasmídico
superenrrollado; y
(d) concentrar el ADN plasmídico
superenrrollado.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3,
en el que el detergente de la etapa (a) es bromuro de
hexadeciltrimetilamonio.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4,
en el que la etapa de precipitación inducida por bromuro de
hexadeciltrimetilamonio se produce en un tampón STET
convencional.
6. Un procedimiento según la reivindicación 4 o
la reivindicación 5, en el que se añade bromuro de
hexadeciltrimetilamonio en un procedimiento de dos etapas, en el que
se produce una primera precipitación inducida por bromuro de
hexadeciltrimetilamonio para precipitar desechos y ADN plasmídico no
superenrrollado, y se produce una segunda precipitación inducida por
bromuro de hexadeciltrimetilamonio para precipitar el ADN plasmídico
superenrrollado.
7. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en el que el lisado celular se clarifica
antes de la precipitación inducida por detergente.
8. Un procedimiento según la reivindicación 2 o
la reivindicación 7, en el que el lisado celular se clarifica
mediante la adición de tierra de diatomeas.
9. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que el ADN plasmídico
superenrrollado se concentra mediante un procedimiento seleccionado
del grupo constituido por precipitación alcohólica y
ultrafiltración.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9,
en el que el ADN plasmídico superenrrollado se concentra mediante
precipitación etanólica.
11. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que el silicato de calcio
cristalizado hidratado se añade por etapas.
12. Un procedimiento según la reivindicación 6,
que comprende:
(a) recoger células microbianas de un caldo de
fermentación;
(b) añadir a las células microbianas recogidas
una cantidad suficiente de disolución de lisis;
(c) calentar las células microbianas de la etapa
(b) a una temperatura entre 70ºC y 100ºC en un intercambiador de
calor de flujo continuo formando un lisado celular;
(d) enfriar el lisado celular;
(e) clarificar el lisado celular utilizando
filtración con tierra de diatomeas;
(f) precipitar el desecho celular residual e
impurezas con una primera precipitación inducida por bromuro de
hexadeciltrimetilamonio;
(g) precipitar selectivamente el ADN plasmídico
superenrrollado con una segunda precipitación inducida por bromuro
de hexadeciltrimetilamonio;
\newpage
(h) redisolver el ADN plasmídico superenrrollado
en un tampón que comprende NaCl en el intervalo de 0,2 M a 2 M para
la disolución selectiva de ADN plasmídico;
(i) adsorber las impurezas residuales sobre
silicato de calcio cristalizado hidratado en el tampón de la etapa
(h);
(j) precipitar el ADN plasmídico superenrrollado
con etanol;
(k) filtrar para recoger y lavar el
precipitado;
(l) secar para eliminar el etanol;
(m) redisolver el ADN plasmídico superenrrollado
purificado en un tampón de formulación fisiológicamente aceptable;
y
(n) esterilizar la disolución tamponada de la
etapa (m) que contiene el ADN plasmídico superenrrollado purificado
mediante filtración a través de un filtro de 0,22 \mum.
13. Un procedimiento según la reivindicación 6,
que comprende las etapas (a) a (i) de la reivindicación 12, en el
que se esteriliza el tampón de la etapa (i) y se concentra el ADN
mediante precipitación etanólica, dando como resultado un
precipitado en polvo que contiene el ADN plasmídico
superenrrollado.
14. Un procedimiento según la reivindicación 4 o
la reivindicación 5, que comprende:
(a) recoger células microbianas a partir de un
caldo de fermentación;
(b) añadir a las células microbianas recogidas
una cantidad suficiente de disolución de lisis;
(c) calentar las células microbianas de la etapa
(b) a una temperatura entre 70ºC y 100ºC en un intercambiador de
calor de flujo continuo formando un lisado celular;
(d) enfriar el lisado celular;
(e) clarificar el lisado celular utilizando
filtración con tierra de diatomeas;
(g) precipitar el ADN plasmídico superenrrollado
con bromuro de hexadeciltrimetilamonio;
(g) redisolver el ADN plasmídico superenrrollado
en un tampón que comprende NaCl en el intervalo de 0,2 M a 2 M para
la disolución selectiva de ADN plasmídico;
(h) adsorber las impurezas residuales sobre
silicato de calcio cristalizado hidratado en el tampón de la etapa
(g);
(i) precipitar el ADN plasmídico superenrrollado
con etanol;
(j) filtrar para recoger y lavar el
precipitado;
(k) secar para eliminar el etanol;
(l) redisolver el ADN plasmídico superenrrollado
purificado en un tampón de formulación fisiológicamente aceptable;
y
(m) esterilizar la disolución tamponada de la
etapa (m) que contiene el ADN plasmídico superenrrollado purificado
mediante filtración a través de un filtro de 0,22 \mum.
15. Un procedimiento según la reivindicación 4 o
la reivindicación 5, que comprende las etapas (a) a (h) de la
reivindicación 14, en el que se esteriliza el tampón de la etapa (h)
y se concentra el ADN mediante precipitación etanólica, dando como
resultado un precipitado en polvo que contiene el ADN plasmídico
superenrrollado.
16. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, en el que las células microbianas de la
etapa (b) se calientan en la etapa (c) hasta una temperatura de
aproximadamente 70ºC a aproximadamente 80ºC.
17. Un procedimiento según la reivindicación 6,
que comprende:
(a) recoger células microbianas de un caldo de
fermentación;
(b) añadir a las células microbianas recogidas
una cantidad suficiente de lisozima/base/KOAc para promover la lisis
celular, formando un lisado celular;
(c) clarificar el lisado celular utilizando
filtración con tierra de diatomeas;
(d) precipitar el desecho celular residual e
impurezas con una primera precipitación inducida por bromuro de
hexadeciltrimetilamonio;
(e) precipitar selectivamente el ADN plasmídico
superenrrollado con una segunda precipitación inducida por bromuro
de hexadeciltrimetilamonio;
(f) redisolver el ADN plasmídico superenrrollado
en un tampón que comprende NaCl en el intervalo de 0,2 M a 2 M para
la disolución selectiva de ADN plasmídico;
(g) adsorber las impurezas residuales sobre
silicato de calcio cristalizado hidratado en el tampón de la etapa
(f);
(h) precipitar el ADN plasmídico superenrrollado
con etanol;
(i) filtrar para recoger y lavar el
precipitado;
(j) secar para eliminar el etanol;
(k) redisolver el ADN plasmídico superenrrollado
purificado en un tampón de formulación fisiológicamente aceptable;
y
(l) esterilizar la disolución tamponada de la
etapa (k) que contiene el ADN plasmídico superenrrollado purificado
mediante filtración a través de un filtro de 0,22 \mum.
18. Un procedimiento según la reivindicación 6,
que comprende las etapas (a) a (g) de la reivindicación 17, en el
que se esteriliza el tampón restante de la etapa (g) y se concentra
el ADN plasmídico superenrrollado mediante precipitación etanólica,
dando como resultado un precipitado en polvo que contiene el ADN
plasmídico superenrrollado.
19. Un procedimiento según la reivindicación 4 o
la reivindicación 5, que comprende:
(a) recoger células microbianas de un caldo de
fermentación;
(b) añadir a las células microbianas recogidas
una cantidad suficiente de lisozima/base/KOAc para promover la lisis
celular, formando un lisado celular;
(c) clarificar el lisado celular utilizando
filtración con tierra de diatomeas;
(d) precipitar el ADN plasmídico superenrrollado
con bromuro de hexadeciltrimetilamonio;
(e) redisolver el ADN plasmídico superenrrollado
en un tampón que comprende NaCl en el intervalo de 0,2 M a 2 M para
la disolución selectiva de ADN plasmídico;
(f) adsorber las impurezas residuales sobre
silicato de calcio cristalizado hidratado en el tampón de la etapa
(e);
(g) precipitar el ADN plasmídico superenrrollado
con etanol;
(h) filtrar para recoger y lavar el
precipitado;
(i) secar para eliminar el etanol;
(j) redisolver el ADN plasmídico superenrrollado
purificado en un tampón de formulación fisiológicamente aceptable;
y
(k) esterilizar la disolución tamponada de la
etapa (j) que contiene el ADN plasmídico superenrrollado purificado
mediante filtración a través de un filtro de 0,22 \mum.
20. Un procedimiento según la reivindicación 4 o
la reivindicación 5, que comprende las etapas (a)-(f) de la
reivindicación 19, en el que se esteriliza el tampón de la etapa (f)
y se concentra el ADN mediante precipitación etanólica, dando como
resultado un precipitado en polvo que contiene el ADN plasmídico
superenrrollado.
21. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 20, en el que la(s) etapa(s) de
precipitación inducida por bromuro de hexadeciltrimetilamonio se
produce(n) en un tampón STET convencional.
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