ES2287943T3 - Procedimiento para la preparacion de un compuesto epoxidado. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a esquemas múltiples de reacción nuevos, a nuevas etapas de proceso y a nuevos intermedios para la síntesis de epoximexrenona y otros compuestos de fórmula (I), en la que -A-A representa al grupo -CHR{sup,4}-CHR{sup,5} o CR{sup,4}=CR{sup,5}; R{sup,3}, R{sup,4} y R{sup,5} se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en hidrógeno, haluro, hidroxi, alquilo ligero, alcoxi ligero, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano, ariloxi; R{sup,1}, representa un alcoxicarbonilo ligero con orientación alfa o un radical hidroxialquilo. -B-B- representa al grupo - CHR{sup,6}-CHR{sup,7} o un grupo con orientación alfa o beta de fórmula (III), en la que R{sup,6} y R{sup,7} se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en hidrógeno, haluro, alcoxi ligero, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxi y R{sup,8} y R{sup,9} se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en hidrógeno, haluro, alcoxi ligero, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxi o R{sup,8} y R{sup,9} juntos forman una estructura de anillo carbocíclico o heterocíclico o R{sup,8} y R{sup,9} junto con o R{sup,6} o R{sup,7} forman una estructura de anillo carbocíclico o heterocíclico fusionado al anillo D pentacíclico.
Description
Procedimiento para la preparación de un
compuesto epoxidado.
Esta invención se refiere a nuevos
procedimientos para la preparación de un compuesto epoxidado,
especialmente los de la serie del 20-espiroxano y
sus análogos. Lo más particularmente, la invención se dirige a un
método nuevo y ventajoso para la preparación de
\gamma-lactona de
9,11-\alpha-epoxi-17\alpha-hidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato
de metilhidrógeno (esplerenona; epoximexrenona).
Métodos para la preparación de compuestos de la
serie del 20-espiroxano se describen en la Patente
de EE.UU. 4.559.332. Los compuestos producidos de acuerdo con el
procedimiento de la patente '332 tienen un anillo E abierto que
contiene oxígeno, de la fórmula general:
en la
que
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-,
R^{1} representa un radical
alcoxi(inferior)-carbonilo o hidroxicarbonilo
orientado en \alpha,
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo orientado en \alpha
o \beta
siendo
R^{6} y R^{7} hidrógeno,
X representa dos átomos de hidrógeno u oxo,
Y^{1} e Y^{2} representan juntos el puente
de oxígeno -O-, o
Y^{1} representa hidroxi, e
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi inferior o,
si X representa H_{2}, también alcanoiloxi inferior,
y sales de tales compuestos en los
que X representa oxo e Y^{2} representa hidroxi, es decir los
correspondientes ácidos
17\beta-hidroxi-21-carboxílicos.
La llegada de usos clínicos nuevos y extendidos
para epoximexrenona crea una necesidad de procedimientos mejorados
para la fabricación de esta y otros esteroides relacionados.
El principal objetivo de la presente invención
es el suministro de un procedimiento mejorado para la preparación
de epoximexrenona, otros 20-espiroxanos y otros
esteroides que tienen características estructurales comunes. Entre
los objetivos particulares de la invención están: proporcionar un
procedimiento mejorado que produzca productos de Fórmula IA y otros
compuestos relacionados con alto rendimiento; el suministro de un
procedimiento tal que implique un mínimo de etapas de aislamiento;
y el suministro de un procedimiento tal que pueda ejecutarse con
coste de capital razonable y hacerse funcionar con un coste de
conversión razonable.
De acuerdo con esto, la presente invención se
dirige a
(1) Un procedimiento para la formación de un
compuesto epoxídico que comprende poner en contacto un compuesto de
substrato que tiene un doble enlace olefínico con un compuesto de
peróxido en presencia de un activador de peróxido, correspondiendo
dicho activador de peróxido a la fórmula:
en donde Rº es un substituyente que
tiene una fuerza de retirada de electrones no menor que la del
monoclorometilo, en presencia de un tampón apropiado, y en donde la
reacción se efectúa a un pH en el intervalo de aproximadamente 3 a
aproximadamente
7.
(2) El procedimiento de acuerdo con el punto (1)
anterior, en el que dicho activador de peróxido corresponde a la
fórmula
en la que X^{1}, X^{2} y
X^{3} se seleccionan del grupo que consiste en halo, hidrógeno,
alquilo, haloalquilo, ciano y cianoalquilo, R^{p} se selecciona
del grupo que consiste en arileno y
-(CX^{4}X^{5})_{n}-, y n es 0 ó 1, siendo al menos uno
de X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y X^{5} halo o
perhaloalquilo.
(3) El procedimiento de acuerdo con el punto (2)
anterior, en el que n es 0 y al menos dos de X^{1}, X^{2} y
X^{3} son halo o perhaloalquilo.
(4) El procedimiento de acuerdo con el punto (2)
anterior, en el que la totalidad de X^{1}, X^{2}, X^{3},
X^{4} y X^{5} es halo o perhaloalquilo.
(5) El procedimiento de acuerdo con el punto (1)
anterior, en el que dicho activador de peróxido es una
trihaloacetamida.
(6) El procedimiento de acuerdo con el punto (5)
anterior, en el que dicho activador de peróxido es
tricloroacetamida.
(7) El procedimiento de acuerdo con el punto (1)
anterior, en el que dicho compuesto de substrato corresponde a la
Fórmula:
en la
que
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-,
R^{3}, R^{4} y R^{5} se seleccionan del
grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo
C_{1}-C_{7}, alcoxi
C_{1}-C_{7}, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi,
R^{1} representa un radical
alcoxi(C_{1}-C_{7})-carbonilo
o hidroxicarbonilo orientado en alfa,
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
\vskip1.000000\baselineskip
donde
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o R^{8} y R^{9} comprenden
juntos una estructura anular carbocíclica o heterocíclica, o R^{8}
o R^{9} junto con R^{6} o R^{7} comprenden una estructura
anular carbocíclica o heterocíclica condensada al anillo D
pentacíclico.
(8) El procedimiento de acuerdo con el punto (1)
anterior, en el que dicho compuesto de substrato se selecciona del
grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y el producto de la reacción de
epoxidación se selecciona del grupo que consiste
en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Modalidades preferidas adicionales de la
presente invención son objeto de las reivindicaciones independientes
9 a 27.
El nuevo procedimiento se describe con detalle
en la Descripción de Modalidades Preferidas.
Un compuesto de Fórmula IV corresponde a la
estructura:
en la
que:
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-,
R^{3}, R^{4} y R^{5} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo C_{1}-C_{2}, alcoxi
C_{1}-C_{7}, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi,
R^{1} representa un radical
alcoxi(C_{1}-C_{2})-carbonilo
o hidroxicarbonilo orientado en alfa, R^{2} es un
alquil(C_{1}-C_{7})-sulfoniloxi
o aciloxi o un haluro;
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
donde
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o R^{8} y R^{9} comprenden
juntos una estructura anular carbocíclica o heterocíclica, o R^{8}
o R^{9} junto con R^{6} o R^{7} comprenden una estructura
anular carbocíclica o heterocíclica condensada al anillo D
pentacíclico.
Un compuesto de Fórmula IVA corresponde a la
Fórmula IV en la que R^{8} y R^{9} junto con el carbono de
anillo al que están ligados forman la estructura:
donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) son como se definen
anteriormente.
Un compuesto de Fórmula IVB corresponde a la
Fórmula IVA en la que R^{8} y R^{9} juntos forman la estructura
de Fórmula XXXIII:
Los compuestos de Fórmulas IVB, IVD y IVE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las Fórmulas IV, IVA
o IVB en las que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}-,
R^{3} es hidrógeno y R^{1} es alcoxicarbonilo, preferiblemente
metoxicarbonilo. Los compuestos dentro del alcance de la Fórmula IV
pueden prepararse haciendo reaccionar un reactivo
alquil(inferior)-sulfonilante o acilante, o
un agente generador de haluro, con un compuesto correspondiente
dentro del alcance de la Fórmula V.
Un compuesto de Fórmula V corresponde a la
estructura:
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{1}, R^{3}, R^{8} y R^{9} son como
se definen en la Fórmula
IV.
Un compuesto de Fórmula VA corresponde a la
Fórmula V en la que R^{8} y R^{9} con el carbono de anillo al
que están ligados forman juntos la estructura:
donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) son como se definen
anteriormente.
Un compuesto de Fórmula VB corresponde a la
Fórmula VA en la que R^{8} y R^{9} forman juntos la estructura
de Fórmula XXXIII:
Los compuestos de Fórmulas VIC, VID y VIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las Fórmulas V, VA o
VB en las que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}-,
R^{3} es hidrógeno y R^{1} es alcoxicarbonilo, preferiblemente
metoxicarbonilo. Los compuestos dentro del alcance de la Fórmula V
pueden prepararse haciendo reaccionar un alcóxido de metal alcalino
con un compuesto correspondiente de Fórmula VI.
Un compuesto de Fórmula VI corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} son como se
definen en la Fórmula
IV.
Un compuesto de Fórmula VIA corresponde a la
Fórmula VI en la que R^{8} y R^{9} junto con el carbono de
anillo al que están ligados forman la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) son como se definen
anteriormente.
Un compuesto de Fórmula VIB corresponde a la
Fórmula VIA en la que R^{8} y R^{9} forman juntos la estructura
de Fórmula XXXIII:
Los compuestos de Fórmulas VIC, VID y VIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las Fórmulas VI, VIA
o VIB en la que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos de Fórmula VI, VIA, VIB y VIC
se preparan hidrolizando un compuesto correspondiente a la Fórmula
VII, VIIA o VIIC, respectivamente.
Un compuesto de Fórmula VII corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} son como se
definen en la Fórmula
IV.
Un compuesto de Fórmula VIIA corresponde a la
Fórmula VII en la que R^{8} y R^{9} junto con el carbono de
anillo al que están ligados forman la estructura:
donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) son como se definen
anteriormente.
Un compuesto de Fórmula VIIB corresponde a la
Fórmula VIIA en la que R^{8} y R^{9} forman juntos la estructura
de Fórmula XXXIII:
Los compuestos de Fórmula VIIC, VIID y VIIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las Fórmulas VII,
VIIA o VIIB en las que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Un compuesto dentro del alcance de la Fórmula
VII pueden prepararse mediante cianuración de un compuesto dentro
del alcance de la Fórmula VIII.
Un compuesto de Fórmula VIII corresponde a la
estructura:
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} son como se
definen en la Fórmula
IV.
Un compuesto de Fórmula VIIIA corresponde a la
Fórmula VIII en la que R^{8} y R^{9} junto con el carbono de
anillo al que están ligados forman la estructura:
donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) son como se definen
anteriormente.
Un compuesto de Fórmula VIIIB corresponde a la
Fórmula VIIIA en la que R^{8} y R^{9} forman juntos la
estructura de Fórmula XXXIII:
Los compuestos de Fórmulas VIIIC, VIIID y VIIIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las Fórmulas VIII,
VIIOA o VIIIB en las que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
Fórmula VIII se preparan oxidando un substrato que comprende un
compuesto de Fórmula XIII como la descrita posteriormente aquí
mediante fermentación eficaz para introducir un grupo
11-hidroxi en el substrato en orientación
\alpha.
Un compuesto de Fórmula XIV corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} son como se
definen en la Fórmula
IV.
Un compuesto de Fórmula XIVA corresponde a la
Fórmula XIV en la que R^{8} y R^{9} junto con el carbono de
anillo al que están ligados forman la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) son como se definen
anteriormente.
Un compuesto de Fórmula XVB corresponde a la
Fórmula XVA en la que R^{6} y R^{9} junto con el carbono de
anillo al que están ligados forman la estructura de Fórmula
XXXIII:
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de Fórmulas XVC, XVD y XVE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las Fórmulas XV, XVA
o XVB en las que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
Fórmula XV pueden prepararse mediante la cianuración de un compuesto
correspondiente dentro del alcance de la Fórmula XVI.
Un compuesto de Fórmula XXI corresponde a la
estructura:
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} son como se
definen en la Fórmula
IV.
Un compuesto de Fórmula XXIA corresponde a la
Fórmula XXI en la que R^{8} y R^{9} junto con el átomo de anillo
al que están ligados forman la estructura:
donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) son como se definen
anteriormente.
Un compuesto de Fórmula XXIB corresponde a la
Fórmula XXIA en la que R^{8} y R^{9} forman juntos la estructura
de Fórmula XXXIII:
Los compuestos de Fórmulas XXIC, XXID y XXIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las Fórmulas XXI,
XXIA o XXIB en las que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
Fórmula XXI pueden prepararse hidrolizando un compuesto
correspondiente dentro del alcance de la Fórmula XXII.
Un compuesto de Fórmula XXII corresponde a la
estructura:
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} son como se
definen en la Fórmula
IV.
Un compuesto de Fórmula XXIIA corresponde a la
Fórmula XXII en la que R^{8} y R^{9} junto con el átomo de
anillo al que están ligados forman la estructura:
donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) son como se definen
anteriormente.
Un compuesto de Fórmula XXIIB corresponde a la
Fórmula XXIIA en la que R^{8} y R^{9} forman juntos la
estructura de Fórmula XXXIII:
Los compuestos de Fórmulas XXIIC, XXIID y XXIIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las Fórmulas XXII,
XXIIA o XXIIB en las que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
Fórmula XXII pueden prepararse mediante la cianuración de un
compuesto dentro del alcance de la Fórmula XXIII.
Un compuesto de Fórmula XXIII corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} son como se
definen en la Fórmula
IV.
Un compuesto de Fórmula XXIIIA corresponde a la
Fórmula XXIII en la que R^{8} y R^{9} junto con el carbono de
anillo al que están ligados forman la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) son como se definen
anteriormente.
Un compuesto de Fórmula XXIIIB corresponde a la
Fórmula XXIIIA en la que R^{8} y R^{9} forman juntos la
estructura de Fórmula XXXIII:
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de Fórmulas XXIIIC, XXIIID y
XXIIIE, respectivamente, corresponden a cualquiera de las Fórmulas
XXIII, XXIIIA o XXIIIB en las que cada uno de -A-A-
y -B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
Fórmula XXIII pueden prepararse mediante la oxidación de un
compuesto de Fórmula XXIV, según se describe posteriormente
aquí.
Un compuesto de Fórmula 104 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que -A-A-,
-B-B- y R^{3} son como se definen en la Fórmula
IV; y R^{11} es alquilo C_{1} a
C_{4}.
Un compuesto de Fórmula 104A corresponde a la
Fórmula 104 en la que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
Fórmula 104 pueden prepararse mediante la descomposición térmica de
un compuesto de Fórmula 103.
Un compuesto de Fórmula 103 corresponde a la
estructura:
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3} y R^{11} son como se definen en la
Fórmula 104 y R^{12} es alquilo inferior C_{1} a
C_{4}.
Un compuesto de Fórmula 103A corresponde a la
Fórmula 103 en la que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
Fórmula 103 pueden prepararse mediante la reacción de un compuesto
correspondiente de Fórmula 102 con un malonato de dialquilo en
presencia de una base tal como un alcóxido de metal alcalino.
Un compuesto de Fórmula 102 corresponde a la
estructura:
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3} y R^{11} son como se definen en la
Fórmula
104.
Un compuesto de Fórmula 102A corresponde a la
Fórmula 102 en la que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
Fórmula 102 pueden prepararse mediante la reacción de un compuesto
correspondiente de Fórmula 101 con un compuesto de trialquilsulfonio
en presencia de una base.
Un compuesto de Fórmula 101 corresponde a la
estructura:
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3} y R^{11} son como se definen en la
Fórmula
104.
Un compuesto de Fórmula 101A corresponde a la
Fórmula 101 en la que cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
Fórmula 101 pueden prepararse mediante la reacción de
11a-hidroxiandrosteno-3,17-diona
u otro compuesto de Fórmula XXXVI con un ortoformiato de trialquilo
en presencia de un ácido.
Basándose en la descripción del esquema de
reacción que se indica posteriormente aquí, será evidente cuáles de
estos compuestos tienen la mayor utilidad.
Otros objetivos y características serán en parte
evidentes y en parte se apuntarán posteriormente aquí.
La Fig. 1 es un diagrama de flujo esquemático de
un procedimiento para la bioconversión de canrenona o un derivado de
canrenona en el correspondiente compuesto hidroxilado en
11\alpha;
la Fig. 2 es un diagrama de flujo esquemático de
un procedimiento preferido para la bioconversión de la
11-\alpha-hidroxilación de
canrenona y derivados de canrenona;
la Fig. 3 es un diagrama de flujo esquemático de
un procedimiento particularmente preferido para la bioconversión de
la 11-\alpha-hidroxilación de
canrenona y derivados de canrenona;
la Fig. 4 muestra la distribución del tamaño de
partícula para canrenona preparada de acuerdo con el procedimiento
de la Fig. 2; y
la Fig. 5 muestra la distribución del tamaño de
partícula para canrenona cuando se esteriliza en el fermentador de
transformación de acuerdo con el procedimiento de la Fig. 3.
Caracteres de referencia correspondientes
indican partes correspondientes a lo largo de los dibujos.
De acuerdo con la presente invención, se ha
ideado un nuevo procedimiento para la preparación de epoximexrenona
y otros compuestos correspondientes a la Fórmula I:
en la
que:
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-,
R^{3}, R^{4} y R^{5} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi,
R^{1} representa un radical
alcoxi(inferior)-carbonilo o hidroxialquilo
orientado en alfa,
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
donde
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo,
alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y ariloxi, y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo,
alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o
R^{8} y R^{9} comprenden juntos una estructura anular
carbocíclica o heterocíclica, o R^{8} o R^{9} junto con R^{6}
o R^{7} comprenden una estructura anular carbocíclica o
heterocíclica condensada al anillo D pentacíclico.
A no ser que se indique otra cosa, los radicales
orgánicos denominados "inferiores" en la presente descripción
contienen como mucho 7, y preferiblemente de 1 a 4, átomos de
carbono.
Un radical
alcoxi(inferior)-carbonilo es preferiblemente
uno derivado de un radical alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de
carbono, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo,
isobutilo, sec-butilo y terc-butilo;
se prefieren especialmente metoxicarbonilo, etoxicarbonilo e
isopropoxicarbonilo. Un radical alcoxi inferior es preferiblemente
uno derivado de los radicales alquilo
C_{1}-C_{4} mencionados anteriormente,
especialmente de un radical alquilo C_{1}-C_{4}
primario; se prefiere especialmente metoxi. Un radical alcanoílo
inferior es uno derivado de un alquilo de cadena lineal que tiene
de 1 a 7 átomos de carbono; se prefieren especialmente formilo y
acetilo.
Un puente de metileno en la posición 15,16 está
preferiblemente orientado en \beta.
Una clase preferida de compuestos que pueden
producirse de acuerdo con el método de la invención son los
compuestos de 20-espiroxano descritos en la Patente
de EE.UU. 4.559.332, es decir los correspondientes a la Fórmula
IA:
donde:
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-,
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo orientado en alfa o
beta de fórmula IIIA:
R^{1} representa un radical
alcoxi(inferior)-carbonilo o hidroxicarbonilo
orientado en alfa,
X representa dos átomos de hidrógeno, oxo o
=S,
Y^{1} e Y^{2} representan juntos el puente
de oxígeno -O-, o
Y^{1} representa hidroxi, e
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi inferior o,
si X representa H_{2}, también alcanoiloxi inferior.
Preferiblemente, los compuestos de
20-espiroxano producidos mediante el nuevo método de
la invención son los de Fórmula 1 en la que Y^{1} e Y^{2}
representan juntos el puente de oxígeno -O-.
Compuestos especialmente preferidos de la
Fórmula I son aquellos en los que X representa oxo.
De los compuestos de
20-espiroxano de Fórmula IA en la que X representa
oxo, los más especialmente preferidos son aquellos en los que
Y^{1} junto con Y^{2} representa el puente de oxígeno -O-.
Como ya se mencionó, el ácido
17\beta-hidroxi-21-carboxílico
también puede estar en forma de sus sales. Se tienen en cuenta
especialmente sales metálicas y de amonio, tales como sales de
metales alcalinos y metales alcalinotérreos, por ejemplo sales
sódicas, cálcicas, magnésicas y, preferiblemente, potásicas, y sales
de amonio derivadas de amoníaco o una base que contiene nitrógeno
orgánico adecuada, preferiblemente fisiológicamente tolerable. Como
bases, se tienen en cuenta no solo las aminas, por ejemplo
alquil(inferior)-aminas (tales como
trietilamina),
hidroxi-alquil(inferior)-aminas
[tales como 2-hidroxietilamina,
di-(2-hidroxietil)-amina o
tri-(2-hidroxietil)-amina],
cicloalquilaminas (tales como diciclohexilamina) o bencilaminas
(tales como bencilamina y
N,N'-dibenciletilendiamina), sino también compuestos
heterocíclicos que contienen nitrógeno, por ejemplo los de carácter
aromático (tales como piridina o quinolina) o los que tienen un
anillo heterocíclico al menos parcialmente saturado (tales como
N-etilpiperidina, morfolina, piperazina o
N,N'-dimetilpiperazina).
También se incluyen entre los compuestos
preferidos sales de metales alcalinos, especialmente sales
potásicas, de compuestos de la Fórmula IA en la que R^{1}
representa alcoxicarbonilo, representando X oxo y representando cada
uno de Y^{1} o Y^{2} hidroxi.
Compuestos especialmente preferidos de la
Fórmula I y IA son, por ejemplo, los siguientes:
- 9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-metoxicarbonil-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
- 9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-etoxicarbonil-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
- 9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-isopropoxicarbonil-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
\vskip1.000000\baselineskip
y el análogo 1,2-deshidro de
cada uno de los compuestos,
- 9\alpha,11\alpha-epoxi-6\alpha,7\alphaa-metilen-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
- 9\alpha,11\alpha-epoxi-6\beta,7\beta-metilen-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
- 9\alpha,\alpha-epoxi-6\beta,7\beta;15\beta,16\beta-bismetilen-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
\vskip1.000000\baselineskip
y el análogo 1,2-deshidro de
cada uno de estos compuestos,
- ácido 9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-metoxicarbonil-17\beta-hidroxi-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
- ácido 9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-etoxicarbonil-17\beta-hidroxi-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
- ácido 9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-isopropoxicarbonil-17\beta-hidroxi-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
- ácido 9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-6\alpha,7\beta-metilen-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
- ácido 9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-6\beta,7\beta-metilen-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
- ácido 9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-6\beta,7\beta;15\beta,16\beta-bismetilen-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico y sales de metales alcalinos, especialmente la sal potásica, o amonio de cada uno de estos ácidos, y también un análogo 1,2-deshidro correspondiente de cada uno de los ácidos carboxílicos mencionados o de una sal de los mismos.
- Éster metílico, éster etílico y éster isopropílico de ácido 9\alpha,11\alpha-epoxi-15\beta,16\beta-metilen-3,21-dioxo-20-espirox-4-eno-7\alpha-carboxílico,
- éster metílico, éster etílico y éster isopropílico de ácido 9\alpha,11\alpha-epoxi-15\beta,16\beta-metilen-3,21-dioxo-20-espirox-1,4-dien-7\alpha-carboxílico,
\vskip1.000000\baselineskip
y también éster metílico, éster etílico y éster
isopropílico de ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-3-oxo-20-espirox-4-eno-7\alpha-carboxílico,
- 9\alpha,11\alpha-epoxi-6\beta,6\beta-metilen-20-espirox-4-en-3-ona,
- 9\alpha,11\alpha-epoxi-6\beta,7\beta;15\beta,16\beta-bismetilen-20-espirox-4-en-3-ona,
\vskip1.000000\baselineskip
y también éster metílico, éster etílico y éster
isopropílico de ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-17\alpha(3-hidroxipropil)-3-oxo-androst-4-eno-7\alpha-carboxílico,
- 9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-17\alpha-(3-hidroxipropil)-6\alpha,7\alpha-metilen-androst-4-en-3-ona,
- 9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-17\alpha-(3-hidroxipropil)-6\beta,7\beta-metilen-androst-4-en-3-ona,
- 9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-17\alpha-(3-hidroxipropil)-6\alpha,7\beta,15\beta,16\beta-bismetilen-androst-4-en-3-ona,
incluyendo análogos
17\alpha-(3-acetoxipropílicos) y
17\alpha-(3-formiloxipropílicos) de los compuestos
de androstano mencionados, y también análogos
1,2-deshidro de todos los compuestos mencionados de
la serie de la
androst-4-en-3-ona
y
20-espirox-4-en-3-ona.
\vskip1.000000\baselineskip
Los nombres químicos de los compuestos de las
Fórmulas I y IA y de compuestos análogos que tienen los mismos
residuos estructurales característicos se derivan de acuerdo con la
nomenclatura normal de la siguiente manera: para compuestos en los
que Y^{1} junto con Y^{2} representa -O-, a partir de
20-espiroxano (por ejemplo un compuesto de la
Fórmula IA en la que X representa oxo e Y^{1} junto con Y^{2}
representa -O- se deriva de
20-espiroxan-21-ona);
para aquellos en los que cada uno de Y^{1} e Y^{2} representa
hidroxi y X representa oxo, de ácido
17\beta-hidroxi-17\alpha-pregneno-21-carboxílico;
y para aquellos en los que cada uno de Y^{1} e Y^{2} representa
hidroxi y X representa dos átomos de hidrógeno, de
17\beta-hidroxi-17\alpha-(3-hidroxipropil)-androstano.
Puesto que las formas cíclicas y de cadena abierta, es decir
lactonas y ácidos
17\beta-hidroxi-21-carboxílicos
y su sales, respectivamente, están tan estrechamente relacionados
entre sí y las últimas pueden considerarse meramente una forma
hidratada de las primeras, han de entenderse anteriormente y
posteriormente aquí, a no ser que se indique específicamente otra
cosa, tanto en productos finales de la fórmula I como en materiales
de partida y productos intermedios de estructura análoga, en cada
caso todas las formas mencionadas conjuntamente.
De acuerdo con la invención, el siguiente
esquema de procedimiento se ha ideado para la preparación de
compuestos de fórmula I con alto rendimiento y a coste razonable.
Este esquema de síntesis avanza a través de la preparación de una
serie de productos intermedios.
Esquema 1 (Partiendo de Canrenona o
un Material
Relacionado)
Un esquema de procesamiento preferido para la
preparación de compuestos de Fórmula I comienza ventajosamente con
canrenona o un material de partida relacionado correspondiente a la
fórmula XIII
en la
que
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-,
R^{3}, R^{4} y R^{5} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi,
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
donde
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo,
alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y ariloxi, y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo,
alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y ariloxi o R^{8}
y R^{9} comprenden juntos una estructura anular carbocíclica o
heterocíclica, o R^{8} o R^{9} junto con R^{6} o R^{7}
comprenden una estructura anular carbocíclica o heterocíclica
condensada al anillo D pentacíclico.
Usando un procedimiento de bioconversión del
tipo ilustrado en las Figs. 1 y 2, un grupo
11-hidroxi de orientación \alpha se introduce en
el compuesto de Fórmula XIII, produciendo de ese modo un compuesto
de Fórmula VIII:
donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} son como se
definen
anteriormente.
Preferiblemente, el compuesto de Fórmula XIII
tiene la estructura
y el producto hidroxilado en
11\alpha tiene la
estructura
en cada una de las
cuales
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-,
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
X representa dos átomos de hidrógeno, oxo o
=S,
Y^{1} e Y^{2} representan juntos el puente
de oxígeno -O-, o
Y^{1} representa hidroxi, e
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi inferior o,
si X representa H_{2}, también alcanoiloxi inferior, y sales de
compuestos en los que X representa oxo e Y^{2} representa hidroxi,
y el compuesto de Fórmula VIII producido en la reacción corresponde
a la Fórmula VIIIA
en la que -A-A-,
-B-B-, Y^{1}, Y^{2} y X son como se definen en
la Fórmula XIIIA. Más preferiblemente, R^{8} y R^{9} forman
juntos la estructura de
20-espiroxano:
-A-A- y -B-B-
son cada uno -CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es
hidrógeno.
Entre los organismos preferidos que pueden
usarse en la etapa de hidroxilación están Aspergillus
ochraceus NRRL 405, Aspergillus ochraceus ATCC 18500,
Aspergillus niger ATCC 16888 y ATCC 26693, Aspergillus
nidulans ATCC 11267, Rhizopus oryzae ATCC 11145,
Rhizopus stolonifer ATCC 6227b, Streptomyces fradiae
ATCC 10745, Bacillus megaterium ATCC 14945, Pseudomonas
cruciviae ATCC 13262, y Trichothecium roseum ATCC 12543.
Otros organismos preferidos incluyen Fusarium oxysporum
f.sp.cepae ATCC 11171 y Rhizopus arrhizus ATCC 11145.
Otros organismos que han exhibido actividad para
esta reacción incluyen Absidia coerula ATCC 6647, Absidia
glauca ATCC 22752, Actinomucor elegans ATCC 6476,
Aspergillus flavipes ATCC 1030, Aspergillus fumigatus
ATCC 26934, Beauveria bassiana ATCC 7159 y ATCC 13144,
Botryosphaeria obtusa IMI 038560, Calonectria decora
ATCC 14767, Chaetomium cochliodes ATCC 10195, Corynespora
cassiicola ATCC 16718, Cunninghamella blakesleeana ATCC
8688a, Cunninghamella echinulata ATCC 3655, Cunninghamella
elegans ATCC 9245, Curvularia clavata ATCC 22921,
Curvularia lunata ACTT 12071, Cylindrocarpon
radicicola ATCC 1011, Epicoccum humicola ATCC 12722,
Gongronella butleri ATCC 22822, Hypomyces chrysospermus,
Mortierella isabellina ATCC 42613, Mucor mucedo ATCC
4605, Mucor griseo-cyanus ATCC 1207A,
Myrothecium verrucaria ATCC 9095, Nocardia corallina,
Paecilomyces carneus ATCC 46579, Penicillum patulum
ATCC 24550, Pithomyces atro-olivaceus IFO
6651, Pithomyces cynodontis ATCC 26150, Pycnosporium
sp. ATCC 12231, Saccharopolyspora erythrae ATCC 11635,
Sepedonium chrysospermum ATCC 13378, Stachylidium
bicolor ATCC 12672, Streptomyces hygroscopicus ATCC
27438, Streptomyces purpurascens ATCC 25489,
Syncephalastrum racemosum ATCC 18192, Thamnostylum
piriforme ATCC 8992, Thielavia terricola ATCC 13807 y
Verticillium theobromae ATCC 12474.
Organismos adicionales que puede esperarse que
muestren actividad para la 11\alpha-hidroxilación
incluyen Cephalosporium aphidicola (Phytochemistry (1996),
42(2), 411-415), Cochliobolus lunatas
(J. Biotechnol. (1995), 42(2), 145-150),
Tieghemella orchidis (Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7),
871-876), Tieghemella hyalospora
(Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7), 871-876),
Monosporium olivaceum (Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973),
5(2), 103-110), Aspergillus ustus
(Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2),
103-110), Fusarium graminearum (Acta
Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2),
103-110), Verticillium glaucum (Acta
Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2),
103-110) y Rhizopus nigricans (J. Steroid
Biochem. (1987), 28(2), 197-201).
Como preparación para la fermentación a escala
de producción para la hidroxilación de canrenona u otros substratos
de Fórmula XIII, un inóculo de células se prepara en un sistema de
fermentación de siembra que comprende un fermentador de siembra o
una serie de dos o más fermentadores de siembra. Una suspensión de
esporas de reserva de trabajo se introduce en el primer fermentador
de siembra, junto con una solución de nutrientes para el
crecimiento de células. Si el volumen de inóculo deseado o necesario
para la producción supera el producido en el primer fermentador de
siembra, el volumen del inóculo puede ampliarse progresivamente y
geométricamente mediante progresión a través de los restantes
fermentadores en el tren de fermentación de siembra.
Preferiblemente, el inóculo producido en el sistema de fermentación
de siembra es de volumen suficiente y células viables para alcanzar
un inicio rápido de la reacción en el fermentador de producción,
ciclos discontinuos de producción relativamente cortos y alta
actividad de fermentación de producción. Cualquiera que sea el
número de recipientes en un tren de fermentadores de siembra, los
fermentadores de siembra segundo y subsiguientes están dimensionados
preferiblemente a fin de que la extensión de la dilución en cada
etapa del tren sea esencialmente la misma. La dilución inicial de
inóculo en cada fermentador de siembra puede ser aproximadamente la
misma que la dilución en el fermentador de producción. La canrenona
u otro substrato de Fórmula XIII se carga al fermentador de
producción junto con inóculo y solución de nutrientes y la reacción
de hidroxilación se efectúa allí.
La suspensión de esporas cargada al sistema de
fermentación de siembra procede de un vial de suspensión de esporas
de reserva de trabajo tomada de una pluralidad de viales que
constituyen un banco de células de reserva de trabajo que se
almacena bajo condiciones criogénicas antes del uso. El banco de
células de reserva de trabajo se deriva a su vez de un banco de
células de trabajo original que se ha preparado de la siguiente
manera. Un espécimen de esporas obtenido a partir de una fuente
apropiada, por ejemplo ATCC, se suspende inicialmente en un medio
acuoso tal como, por ejemplo, solución salina, solución de
nutrientes o una solución tensioactiva (por ejemplo, un
tensioactivo no iónico tal como Tween 20 a una concentración de
aproximadamente 0,001% en peso) y la suspensión se distribuye entre
placas de cultivo, teniendo cada placa una mezcla de nutrientes
sólida, basada típicamente en un polisacárido no digerible tal como
agar, donde se propagan las esporas. La mezcla de nutrientes sólida
contiene preferiblemente entre aproximadamente 0,5% y
aproximadamente 5% en peso de glucosa, entre aproximadamente 0,05%
y aproximadamente 5% en peso de una fuente de nitrógeno, por ejemplo
peptona, entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 0,5% en peso
de una fuente de fósforo, por ejemplo un fosfato de amonio o metal
alcalino tal como hidrogenofosfato dipotásico, entre aproximadamente
0,25% y aproximadamente 2,5% en peso de lisado o extracto de
levadura (u otra fuente de aminoácidos, tal como extracto de carne
o infusión de cerebro-corazón), entre
aproximadamente 1% y aproximadamente 2% en peso de agar u otro
polisacárido no digerible. Opcionalmente, la mezcla de nutrientes
sólida puede comprender y/o contener además entre aproximadamente
0,1% y aproximadamente 5% en peso de extracto de malta. El pH de la
mezcla de nutrientes sólida está preferiblemente entre
aproximadamente 5,0 y aproximadamente 7,0, ajustado según se
requiera mediante hidróxido de metal alcalino o ácido
ortofosfórico. Entre los medios de crecimiento sólidos útiles están
los siguientes:
- 1. Medio Sólido Nº 1:
- 1% de glucosa, 0,25% de extracto de levadura, 0,3% de K_{2}HPO_{4} y 2% de agar (Bacto); pH ajustado hasta 6,5 con NaOH al 20%.
- 2. Medio Sólido Nº 2:
- 2% de peptona (Bacto), 1% de extracto de levadura (Bacto), 2% de glucosa y 2% de agar (Bacto); pH ajustado hasta 5 con H_{3}PO_{4} al 10%.
- 3. Medio Sólido Nº 3:
- 0,1% de peptona (Bacto), 2% de extracto de levadura (Bacto), 2% de glucosa y 2% de agar (Bacto); pH como tal 5,3.
- 4. Medio Líquido:
- 5% de melazas residuales; 0,5% de licor de impregnación de maíz, 0,25% de glucosa, 0,25% de NaCl y 0,5% de KH_{2}PO_{4}, pH ajustado hasta 5,8.
5. Agar Micológico de Difco (pH bajo).
El número de placas de agar usado en el
desarrollo de un banco de células de reserva original puede
seleccionarse con vistas a demandas futuras para reserva original,
pero típicamente se preparan así de 15 a aproximadamente 30 placas.
Después de un período de crecimiento adecuado, por ejemplo de 7 a 10
días, las placas se rascan en presencia de un vehículo adecuado,
típicamente solución salina o tampón, para recoger las esporas y la
suspensión de reserva original resultante se divide entre pequeños
viales, por ejemplo un ml, en cada uno de una pluralidad de viales
de 1,5 ml. Para preparar una suspensión de esporas de reserva de
trabajo para el uso en operaciones de fermentación de investigación
o producción, el contenido de uno o más de estos viales de reserva
original de segunda generación puede distribuirse entre e incubarse
sobre placas de agar de la manera descrita anteriormente para la
preparación de suspensión de esporas de reserva original. Cuando se
contemplan operaciones de fabricación habituales, tanto como de 100
a 400 placas pueden usarse para generar una reserva de trabajo de
segunda generación. Cada placa se rasca en un vial de reserva de
trabajo separado, conteniendo cada vial típicamente un ml del
inóculo producido. Para la conservación permanente, tanto la
suspensión de reserva original como el inóculo de producción de
segunda generación se almacenan ventajosamente en el espacio de
vapor de un recipiente de almacenamiento criogénico que contiene
N_{2} líquido u otro líquido criogénico.
En el procedimiento ilustrado en la Fig. 1, se
prepara medio de crecimiento acuoso que incluye una fuente de
nitrógeno tal como peptona, un derivado de levadura o equivalente,
glucosa y una fuente de fósforo tal como una sal de fosfato.
Esporas del microorganismo se cultivan en este medio en el sistema
de fermentación de siembra. El microorganismo preferido es
Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500). La reserva de
siembra así producida se introduce a continuación en el fermentador
de producción junto con el substrato de Fórmula XIII. El caldo de
fermentación tanto se agita como se airea durante un tiempo
suficiente para que la reacción avance hasta el grado de terminación
deseado.
El medio para el fermentador de siembra
comprende preferiblemente una mezcla acuosa que contiene entre
aproximadamente 0,5% y aproximadamente 5% en peso de glucosa, entre
aproximadamente 0,05% y aproximadamente 5% en peso de una fuente de
nitrógeno, por ejemplo peptona, entre aproximadamente 0,05% y
aproximadamente 0,5% en peso de una fuente de fósforo, por ejemplo
un fosfato de amonio o metal alcalino tal como fosfato amónico
monobásico o hidrogenofosfato dipotásico, entre aproximadamente
0,25% y aproximadamente 2,5% en peso de lisado o extracto de
levadura (u otra fuente de aminoácidos tal como materiales solubles
del destilador), entre aproximadamente 1% y aproximadamente 2% en
peso de agar u otro polisacárido no digerible. Un medio de
crecimiento de siembra particularmente preferido contiene de
aproximadamente 0,05% a aproximadamente 5% en peso de una fuente de
nitrógeno tal como peptona, entre aproximadamente 0,25% y
aproximadamente 2,5% en peso de levadura autolizada o extracto de
levadura, entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 5% en peso de
glucosa y entre aproximadamente 0,05% en peso y aproximadamente
0,5% de una fuente de fósforo tal como fosfato amónico monobásico.
Operaciones de procesamiento especialmente económicas se
proporcionan mediante el uso de otro cultivo de siembra preferido
que contiene entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 5% en peso
de licor de impregnación de maíz, entre aproximadamente 0,25% y
aproximadamente 2,5% de levadura autolizada o extracto de levadura,
entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 5% en peso de glucosa
y entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 0,5% en peso de
fosfato amónico monobásico. El licor de impregnación de maíz es una
fuente particularmente económica de proteínas, péptidos,
carbohidratos, ácidos orgánicos, vitaminas, iones metálicos,
materias traza y fosfatos. Licores de maceración de otros granos
pueden usarse en lugar de o además del licor de impregnación de
maíz. El pH del medio se ajusta preferiblemente dentro del
intervalo de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 7,0, por
ejemplo mediante la adición de un hidróxido de metal alcalino o
ácido ortofosfórico. Cuando el licor de impregnación de maíz sirve
como una fuente de nitrógeno y carbono, el pH se ajusta
preferiblemente dentro del intervalo de aproximadamente 6,2 a
aproximadamente 6,8. El medio que comprende peptona y glucosa se
ajusta preferiblemente hasta un pH entre aproximadamente 5,4 y
aproximadamente 6,2. Entre los medios de crecimiento útiles para el
uso en la fermentación de siembra:
- 1. Medio Nº 1:
- 2% de peptona, 2% de levadura autolizada (o extracto de levadura) y 2% de glucosa; pH ajustado hasta 5,8 con NaOH al 20%.
- 2. Medio Nº 2:
- 3% de licor de impregnación de maíz, 1,5% de extracto de levadura, 0,3% de fosfato amónico monobásico y 3% de glucosa; pH ajustado hasta 6,5 con NaOH al 20%.
Las esporas del microorganismo se introducen en
este medio desde un vial que contiene típicamente alrededor de
10^{9} esporas por ml de suspensión. La productividad óptima de la
generación de semillas se consigue cuando la dilución con medio de
crecimiento al comienzo de un cultivo de siembra no reduce la
densidad de población de esporas por debajo de aproximadamente
10^{7} por ml. Preferiblemente, las esporas se cultivan en el
sistema de fermentación de siembra hasta que el volumen micelial
empaquetado (PMV) en el fermentador de siembra es al menos
aproximadamente 20%, preferiblemente de 35% a 45%. Puesto que el
ciclo en el recipiente de fermentación de siembra (o cualquier
recipiente de una pluralidad que comprende un tren de fermentación
de siembra) depende de la concentración inicial de ese recipiente,
puede ser deseable proporcionar dos o tres fases de fermentación de
siembra para acelerar el procedimiento global. Sin embargo, es
preferible evitar el uso de significativamente más de tres
fermentadores de siembra en serie, ya que la actividad puede
comprometerse si la fermentación de siembra se hace pasar a través
de un número de fases excesivo. La fermentación de cultivos de
siembra se efectúa bajo agitación a una temperatura en el intervalo
de aproximadamente 23ºC a aproximadamente 37ºC, preferiblemente en
el intervalo de entre aproximadamente 24ºC y aproximadamente
28ºC.
El cultivo procedente del sistema de
fermentación de siembra se introduce en un fermentador de
producción, junto con un medio de crecimiento de producción. En una
modalidad de la invención, canrenona no estéril u otro substrato de
Fórmula XIII sirve como el substrato para la reacción.
Preferiblemente, el substrato se añade al fermentador de producción
en la forma de una suspensión al 10% a 30% en peso en medio de
crecimiento. Para incrementar la superficie específica disponible
para la reacción de 11\alpha-hidroxilación, el
tamaño de partícula del substrato de Fórmula XIII se reduce
haciendo pasar el substrato a través de un micronizador fuera de
línea antes de la introducción en el fermentador. Una reserva de
alimentación de nutrientes estéril que contiene glucosa y una
segunda solución de nutrientes estéril que contiene un derivado de
levadura tal como una levadura autolizada (o una formulación de
aminoácidos equivalente basada en fuentes alternativas tales como
materiales solubles del destilador) también se introducen
separadamente. El medio comprende una mezcla acuosa que contiene
entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 5% en peso de glucosa,
entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 5% en peso una fuente
de nitrógeno, por ejemplo peptona, entre aproximadamente 0,05% y
aproximadamente 0,5% en peso de una fuente de fósforo, por ejemplo
un fosfato de amonio o metal alcalino tal como hidrogenofosfato
dipotásico, entre aproximadamente 0,25% y aproximadamente 2,5% en
peso de lisado o extracto de levadura (u otra fuente de aminoácidos
tal como materiales solubles del destilador), entre aproximadamente
1% y aproximadamente 2% en peso de agar u otro polisacárido no
digerible. Un medio de crecimiento de producción particularmente
preferido contiene de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 5% en
peso de una fuente de nitrógeno tal como peptona, entre
aproximadamente 0,25% y 2,5% en peso de una levadura autolizada o
extracto de levadura, entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente
5% en peso de glucosa y entre aproximadamente 0,05% y
aproximadamente 0,5% en peso de una fuente de fósforo tal como
fosfato amónico monobásico. Otro medio de producción preferido
contiene entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 5% en peso
licor de impregnación de maíz, entre aproximadamente 0,25% y
aproximadamente 2,5% de levadura autolizada o extracto de levadura,
entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 5% en peso de glucosa y
entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 0,5% en peso de
fosfato amónico monobásico. El pH del medio de fermentación de
producción se ajusta preferiblemente de la manera descrita
anteriormente para el medio de fermentación de siembra, con los
mismos intervalos preferidos para el pH del medio basado en
peptona/glucosa y el medio basado en licor de impregnación de maíz,
respectivamente. Medios de crecimiento de bioconversión útiles se
indican posteriormente:
- 1. Medio Nº 1:
- 2% de peptona, 2% de levadura autolizada (o extracto de levadura) y 2% de glucosa; pH ajustado hasta 5,8 con NaOH al 20%.
- 2. Medio Nº 2:
- 1% de peptona, 1% de levadura autolizada (o extracto de levadura) y 2% de glucosa; pH ajustado hasta 5,8 con NaOH al 20%.
- 3. Medio Nº 3:
- 0,5% de peptona, 0,5% de levadura autolizada (o extracto de levadura) y 0,5% de glucosa; pH ajustado hasta 5,8 con NaOH al 20%.
- 4. Medio Nº 4:
- 3% de licor de impregnación de maíz, 1,5% de extracto de levadura, 0,3% de fosfato amónico monobásico y 3% de glucosa; pH ajustado hasta 6,5 con NaOH al 20%.
- 5. Medio Nº 5:
- 2,55% de licor de impregnación de maíz, 1,275% de extracto de levadura, 0,255% de fosfato amónico monobásico y 3% de glucosa; pH ajustado hasta 6,5 con NaOH al 20%.
- 6. Medio Nº 6:
- 2,1% de licor de impregnación de maíz, 1,05% de extracto de levadura, 0,21% de fosfato amónico monobásico y 3% de glucosa; pH ajustado hasta 6,5 con NaOH al 20%.
Las soluciones de canrenona no estéril y de
nutrientes estéril se alimentan en cadena al fermentador de
producción en de cinco a veinte, preferiblemente de diez a quince,
porciones, preferiblemente substancialmente iguales, durante el
ciclo discontinuo de producción. Ventajosamente, el substrato se
introduce inicialmente en una cantidad suficiente para establecer
una concentración de entre aproximadamente 0,1% en peso y
aproximadamente 3% en peso, preferiblemente entre aproximadamente
0,5% y aproximadamente 2% en peso, antes de la inoculación con
caldo de fermentación de siembra, a continuación se añade
periódicamente, convenientemente cada 8 a 24 horas, hasta una
proporción acumulativa de entre aproximadamente 1% y aproximadamente
8% en peso. Cuando se añade substrato adicional cada espacio de 8
horas, la adición total puede ser ligeramente inferior, por ejemplo
de 0,25% a 2,5% en peso, que en el caso en el que el substrato se
añade solo en una base diaria. En el último caso, puede necesitarse
que la adición de canrenona acumulativa esté en el intervalo de 2% a
aproximadamente 8% en peso. La mezcla de nutrientes suplementaria
alimentada durante la reacción de fermentación es preferiblemente
un concentrado, por ejemplo una mezcla que contiene entre
aproximadamente 40% y aproximadamente 60% en peso de glucosa
estéril y entre aproximadamente 16% y aproximadamente 32% en peso de
extracto de levadura estéril u otra fuente estéril de derivado de
levadura (u otra fuente de aminoácidos). Puesto que el substrato
alimentado al fermentador de producción de la Fig. 1 no es estéril,
se añaden periódicamente antibióticos al caldo de fermentación para
controlar el crecimiento de organismos no deseados. Antibióticos
tales como kanamicina, tetraciclina y cefalexina pueden añadirse
sin afectar desventajosamente al crecimiento y la bioconversión.
Preferiblemente, estos se introducen en el caldo de fermentación en
una concentración, por ejemplo, de entre aproximadamente 0,0004% y
aproximadamente 0,002% basado en la cantidad total del caldo, que
comprende, por ejemplo, entre aproximadamente 0,0002% y
aproximadamente 0,0006% de sulfato de kanamicina, entre
aproximadamente 0,0002% y aproximadamente 0,006% de HCl de
tetraciclina y/o entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente
0,003% de cefalexina, de nuevo basado en la cantidad total de
caldo.
Típicamente, el ciclo discontinuo de
fermentación de producción está en la proximidad de
80-160 horas. Así, porciones de cada uno del
substrato de Fórmula XIII y las soluciones de nutrientes se añaden
típicamente cada 2 a 10 horas, preferiblemente cada 4 a 6 horas.
Ventajosamente, también se incorpora un antiespumante en el sistema
de fermentación de siembra y en el fermentador de producción.
Preferiblemente, en el procedimiento de la Fig.
1, la carga de inóculo al fermentador de producción es de
aproximadamente 0,5% a aproximadamente 7%, más preferiblemente de
aproximadamente 1% a aproximadamente 2%, en volumen basado en la
mezcla total del fermentador, y la concentración de glucosa se
mantiene entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 1,0%,
preferiblemente entre aproximadamente 0,025% y aproximadamente 0,5%,
más preferiblemente entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente
0,25% en peso con adiciones periódicas que son preferiblemente en
porciones de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 0,25% en peso,
basado en la carga de la partida total. La temperatura de
fermentación se controla convenientemente dentro de un intervalo de
aproximadamente 20ºC a aproximadamente 37ºC, preferiblemente de
aproximadamente 24ºC a aproximadamente 28ºC, pero puede ser deseable
reducir la temperatura durante la reacción, por ejemplo en
incrementos de 2ºC, para mantener el volumen micelial empaquetado
(PMV) por debajo de aproximadamente 60%, más preferiblemente por
debajo de aproximadamente 50%, y de ese modo evitar que la
viscosidad del caldo de fermentación interfiera con la mezcladura
satisfactoria. Si el crecimiento de biomasa se extiende por encima
de la superficie del líquido, el substrato retenido dentro de la
biomasa puede arrastrarse de la zona de reacción y hacerse no
disponible para la reacción de hidroxilación. Para la
productividad, es deseable alcanzar un PMV en el intervalo de 30 a
50%, preferiblemente de 35% a 45%, dentro de las primeras 24 horas
de la reacción de fermentación, pero posteriormente las condiciones
se manejan preferiblemente para controlar el crecimiento adicional
dentro de los límites indicados anteriormente. Durante la reacción,
el pH del medio de fermentación se controla a entre aproximadamente
5,0 y aproximadamente 6,5, preferiblemente entre aproximadamente
5,2 y aproximadamente 5,8, y el fermentador se agita a una velocidad
de entre aproximadamente 400 y aproximadamente 800 rpm. Un nivel de
oxígeno disuelto de al menos aproximadamente 10% de saturación se
alcanza aireando la partida a entre aproximadamente 0,2 y
aproximadamente 1,0 vvm y manteniendo la presión en el espacio
libre del fermentador a entre aproximadamente atmosférica y
aproximadamente 1,0 bares manométricos, lo más preferiblemente en
la proximidad de aproximadamente 0,7 bares manométricos. La
velocidad de agitación también puede incrementarse según sea
necesario para mantener niveles de oxígeno disuelto mínimos.
Ventajosamente, el oxígeno disuelto se mantiene muy por encimad de
10%, de hecho tan alto como 50%, para promover la conversión de
substrato. Mantener el pH en el intervalo de 5,5 \pm 0,2 también
es óptimo para la bioconversión. La espumación se controla según
sea necesario mediante la adición de un agente antiespumante común.
Después de que se haya añadido todo el substrato, la reacción se
continúa preferiblemente hasta que la relación molar del producto
de Fórmula VIII a substrato de Fórmula XIII sin reaccionar restante
es al menos aproximadamente 9 a 1. Tal conversión puede alcanzarse
dentro del ciclo discontinuo de 80-160 horas
indicado anteriormente.
Se ha encontrado que las concentraciones altas
están asociadas con el agotamiento de niveles de nutrientes
iniciales por debajo del nivel de carga inicial, y mediante el
control de la velocidad de aireación y la velocidad de agitación
para evitar salpicaduras del substrato fuera del caldo líquido. En
el procedimiento de la Fig. 1, el nivel de nutrientes se agotó
hasta y a continuación se mantuvo a no más de aproximadamente 60%,
preferiblemente aproximadamente 50%, del nivel de carga inicial;
mientras que en los procedimientos de las Figs. 2 y 3, el nivel de
nutrientes se redujo hasta y se mantuvo a no más de aproximadamente
80%, preferiblemente aproximadamente 70%, del nivel de carga
inicial. La velocidad de aireación preferiblemente no es mayor que
un vvm, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,5
vvm; mientras que la velocidad de agitación preferiblemente no es
mayor que 600 ppm.
Un procedimiento particularmente preferido para
la preparación de un compuesto de Fórmula VIII se ilustra en la
Fig. 2. De nuevo, el microorganismo preferido es Aspergillus
ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500). En este procedimiento, el
medio de crecimiento comprende preferiblemente entre aproximadamente
0,5% y aproximadamente 5% en peso de licor de impregnación de maíz,
entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 5% en peso de glucosa,
entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 3% en peso de extracto
de levadura y entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 0,5% en
peso de fosfato amónico. Sin embargo, también pueden usarse otros
medios de crecimiento de producción que se describen aquí. El
cultivo de siembra se prepara esencialmente de la manera descrita
para el procedimiento de la Fig. 1, usando cualquiera de los medios
de fermentación de siembra descritos aquí. Una suspensión de
canrenona no micronizada u otro substrato de Fórmula XIII en el
medio de crecimiento se prepara asépticamente en un mezclador,
preferiblemente a una concentración relativamente alta de entre
aproximadamente 10% y aproximadamente 30% en peso de substrato.
Preferiblemente, la preparación aséptica puede comprender
esterilización o pasteurización de la suspensión después de la
mezcladura. Toda la cantidad de suspensión de substrato estéril
requerida para una partida de producción se introduce en el
fermentador de producción al principio de la dosificación de la
partida, o mediante alimentación en cadena periódica. El tamaño de
partícula del substrato se reduce moliendo en húmedo en una bomba
de cizallamiento en línea que transfiere la suspensión al
fermentador de producción, obviando así la necesidad de usar un
micronizador fuera de línea. Cuando se alcanzan condiciones
asépticas mediante pasteurización en vez de esterilización, la
extensión de la aglomeración puede ser insignificante, pero el uso
de una bomba de cizallamiento puede ser deseable para proporcionar
control positivo del tamaño de partícula. El medio de crecimiento
estéril y la solución de glucosa se introducen en el fermentador de
producción esencialmente de la misma manera que se describe
anteriormente. Todos los componentes de alimentación al fermentador
de producción se esterilizan antes de la introducción, de modo que
no se requieren antibióticos.
Preferiblemente, en la operación del
procedimiento de la Fig. 2, el inóculo se introduce en el
fermentador de producción en una proporción de entre
aproximadamente 0,5% y aproximadamente 7%, la temperatura de
fermentación está entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente
37ºC, preferiblemente entre aproximadamente 24ºC y aproximadamente
28ºC, y el pH se controla entre aproximadamente 4,4 y
aproximadamente 6,5, preferiblemente entre aproximadamente 5,3 y
aproximadamente 5,5, por ejemplo mediante la introducción de
amoníaco gaseoso, hidróxido amónico acuoso, hidróxido de metal
alcalino acuoso o ácido ortofosfórico. Como en el procedimiento de
la Fig. 1, la temperatura se ajusta preferiblemente para controlar
el crecimiento de la biomasa de modo que el PMV no supere
55-60%. La carga de glucosa inicial está
preferiblemente entre aproximadamente 1% y aproximadamente 4% en
peso, lo más preferiblemente de 2,5% a 3,5% en peso, pero
preferiblemente se deja que caiga por debajo de aproximadamente
1,0% en peso durante la fermentación. Glucosa complementaria se
alimenta periódicamente en porciones de entre aproximadamente 0,2%
y aproximadamente 1,0% en peso basado en la carga de la partida
total, a fin de mantener la concentración de glucosa en la zona de
fermentación dentro de un intervalo de entre aproximadamente 0,1% y
aproximadamente 1,5% en peso, preferiblemente entre aproximadamente
0,25% y aproximadamente 0,5%. Opcionalmente, fuentes de nitrógeno y
fósforo pueden complementarse junto con la glucosa. Sin embargo,
debido a que toda la carga de canrenona se realiza al principio del
ciclo discontinuo, el suministro requerido de nutrientes que tienen
nitrógeno y fósforo también puede introducirse al mismo tiempo,
permitiendo el uso solo de una solución de glucosa para la
complementación durante la reacción. La velocidad y la naturaleza de
la agitación es una variable significativa. La agitación
moderadamente vigorosa promueve la transferencia de masa entre el
substrato sólido y la fase acuosa. Sin embargo, debe usarse un
propulsor de bajo cizallamiento para evitar la degradación de la
mielina de los microorganismos. La velocidad de agitación óptima
varía dentro del intervalo de 200 a 800 rpm, dependiendo de la
viscosidad del caldo de cultivo, la concentración de oxígeno y las
condiciones de mezcladura que se ven afectadas por la configuración
del recipiente, el separador y el propulsor. Normalmente, una
velocidad de agitación preferida está en el intervalo de
350-600 rpm. Preferiblemente, el propulsor de
agitación proporciona una función de bombeo axialmente descendente a
fin de ayudar a una buena mezcladura de la biomasa fermentada. La
partida se airea preferiblemente a una velocidad de entre
aproximadamente 0,3 y aproximadamente 1,0 vvm, preferiblemente de
0,4 a 0,8 vvm, y la presión en el espacio libre del fermentador
está preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 1,0
bares manométricos. La temperatura, la agitación, la aireación y la
retropresión se controlan preferiblemente para mantener el oxígeno
disuelto en el intervalo de al menos aproximadamente 10% en volumen
durante la bioconversión. El ciclo discontinuo total está
típicamente entre aproximadamente 100 y aproximadamente 140
horas.
Aunque el principio de operación para el
procedimiento de la Fig. 2 se basa en la introducción inicial de
substancialmente toda la carga de canrenona, se entenderá que el
crecimiento del caldo de fermentación puede llevarse a cabo antes
de que se cargue el grueso de la canrenona. Opcionalmente, alguna
porción de la canrenona también puede añadirse posteriormente a la
dosificación de la partida. Generalmente, sin embargo, al menos
aproximadamente 75% de la carga de canrenona estéril debe
introducirse en el fermentador de transformación en menos de 48
horas después del inicio de la fermentación. Por otra parte, es
deseable introducir al menos aproximadamente 25% en peso de la
canrenona al principio de la fermentación, o al menos dentro de las
primeras 24 horas, para promover la generación de la enzima o las
enzimas de bioconversión.
En un procedimiento preferido adicional que se
ilustra en la Fig. 3, toda la carga de la partida y la solución de
nutrientes se esterilizan en el recipiente de fermentación de
producción antes de la introducción del inóculo. Las soluciones de
nutrientes que pueden usarse, así como las preferencias entre ellas,
son esencialmente las mismas que en el procedimiento de la Fig. 2.
En esta modalidad de la invención, la acción de cizallamiento del
propulsor agitador rompe los aglomerados de substrato que de otro
modo tienden a formarse durante la esterilización. Se ha encontrado
que la reacción avanza satisfactoriamente si el tamaño de partícula
medio de la canrenona es menor que aproximadamente 200 \mu y al
menos 75% en peso de las partículas son menores que 240 \mu. Se
ha encontrado que el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo un
propulsor de turbina de disco, a una velocidad adecuada en el
intervalo de 200 a 800 rpm, con una velocidad periférica de al menos
aproximadamente 400 cm/s, proporciona una velocidad de
cizallamiento suficiente para mantener tales características de
tamaño de partícula a pesar de que tiende a producirse aglomeración
durante la esterilización dentro del fermentador de producción. La
operación restante del procedimiento de la Fig. 3 es esencialmente
la misma que en el procedimiento de la Fig. 2. Los procedimientos
de las Figs. 2 y 3 ofrecen varias ventajas claras sobre el
procedimiento de la Fig. 1. Una ventaja particular es la
susceptibilidad de uso de una base de nutrientes de bajo coste tal
como licor de impregnación de maíz. Pero se consiguen ventajas
adicionales al eliminar la necesidad de antibióticos, simplificar
los procedimientos de alimentación y permitir la esterilización por
partidas de la canrenona u otro substrato de Fórmula XIII. Otra
ventaja particular es la capacidad de usar una solución de glucosa
simple en lugar de una solución de nutrientes compleja para la
complementación durante el ciclo de reacción.
En los procedimientos representados en las Figs.
1 a 3, el producto de Fórmula VIII es un sólido cristalino que,
junto con la biomasa, puede separarse del caldo de reacción mediante
filtración o centrifugación a baja velocidad. Alternativamente, el
producto puede extraerse de todo el caldo de reacción con
disolventes orgánicos. El producto de Fórmula VIII se recupera
mediante extracción con disolvente. Para una recuperación máxima,
tanto el filtrado en fase líquida como la torta de biomasa del
filtro o la centrífuga se tratan con disolvente de extracción, pero
habitualmente \geq 95% del producto está asociado con la biomasa.
Típicamente, pueden usarse disolventes de hidrocarburo, éster,
hidrocarburo clorado y cetona para la extracción. Un disolvente
preferido es el acetato de etilo. Otros disolventes típicamente
adecuados incluyen tolueno y
metil-isobutil-cetona. Para la
extracción de la fase líquida, puede ser conveniente usar un volumen
de disolvente aproximadamente igual al volumen de solución de
reacción con el que entra en contacto. Para recuperar el producto de
la biomasa, la última se suspende en el disolvente, preferiblemente
en gran exceso con relación a la carga inicial de substrato, por
ejemplo de 50 a 100 ml de disolvente por gramo de carga de canrenona
inicial, y la suspensión resultante preferiblemente se somete a
reflujo durante un período de 20 minutos a varias horas para
asegurar la transferencia de producto a la fase de disolvente desde
ranuras y poros de la biomasa. Posteriormente, la biomasa se retira
mediante filtración o centrifugación y la torta filtrante
preferiblemente se lava tanto con disolvente reciente como con agua
desionizada. Los lavados acuosos y de disolvente se combinan a
continuación y se deja que las fases se separen. El producto de
Fórmula VIII se recupera mediante cristalización en la solución.
Para maximizar el rendimiento, el micelio se pone en contacto dos
veces con disolvente reciente. Después de una sedimentación para
permitir la separación completa de la fase acuosa, el producto se
recupera de la fase de disolvente. Lo más preferiblemente, el
disolvente se retira bajo vacío hasta que comienza la
cristalización, a continuación el extracto concentrado se enfría
hasta una temperatura de 0 a 20ºC, preferiblemente de
aproximadamente 10ºC a aproximadamente 15ºC, durante un tiempo
suficiente para la precipitación y el crecimiento del cristal,
típicamente de 8 a 12 horas.
Los procedimientos de la Fig. 2 y especialmente
el de la Fig. 3 se prefieren particularmente. Estos procedimientos
funcionan a baja viscosidad y son susceptibles de control estrecho
de parámetros de procesamiento tales como el pH, la temperatura y
el oxígeno disuelto. Por otra parte, las condiciones estériles se
conservan fácilmente sin recurrir a antibióticos.
El proceso de bioconversión es exotérmico, de
modo que el calor debe retirarse, usando un fermentador con camisa
o un serpentín de enfriamiento dentro del fermentador de producción.
Alternativamente, el caldo de reacción puede hacerse circular a
través de un intercambiador de calor externo. El oxígeno disuelto se
mantiene preferiblemente a un nivel de al menos aproximadamente 5%,
preferiblemente al menos aproximadamente 10%, en volumen,
suficiente para proporcionar energía para la reacción y asegurar la
conversión de la glucosa en CO_{2} y H_{2}O, regulando la
velocidad de aire introducido en el reactor en respuesta a una
medida del potencial de oxígeno en el caldo. El pH se controla
preferiblemente entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 6,5.
En cada uno de los procedimientos alternativos
para la 11-hidroxilación del substrato de Fórmula
XIII, la productividad está limitada por la transferencia de masa
desde el substrato sólido hasta la fase acuosa, o la superficie de
contacto de fases, donde se entiende que se produce la reacción.
Según se indica anteriormente, la productividad no está
significativamente limitada por las velocidades de transferencia de
masa con tal de que el tamaño de partícula medio del substrato se
reduzca hasta menos de aproximadamente 300 \mu y al menos 75% en
peso de las partículas sean menores que 240 \mu. Sin embargo, la
productividad de estos procedimientos puede potenciarse
adicionalmente en ciertas modalidades alternativas que proporcionan
una carga substancial de canrenona u otro substrato de Fórmula XIII
al fermentador de producción en un disolvente orgánico. De acuerdo
con una opción, el substrato se disuelve en un disolvente inmiscible
con agua y se mezcla con el inóculo del medio de crecimiento acuoso
y un tensioactivo. Disolventes inmiscibles con agua útiles incluyen,
por ejemplo, DMF, DMSO, ácidos grasos
C_{6}-C_{12}, n-alcanos
C_{6}-C_{12}, aceites vegetales, sorbitanes y
soluciones acuosas de tensioactivos. La agitación de esta carga
genera un sistema de reacción en emulsión que tiene un área
interfacial extendida para la transferencia de masa de substrato
desde la fase líquida orgánica hasta los sitios de reacción.
Una segunda opción es disolver inicialmente el
substrato en un disolvente miscible con agua tal como acetona,
metil-etil-cetona, metanol, etanol o
glicerol en una concentración substancialmente mayor que su
solubilidad en agua. Preparando la solución de substrato inicial a
temperatura elevada, la solubilidad se incrementa, incrementando
adicionalmente de ese modo la cantidad de substrato en forma de
solución introducida en el reactor y potenciando finalmente la
carga útil del reactor. La solución de substrato caliente se carga
al reactor de fermentación de producción junto con la carga acuosa
relativamente fría que comprende medio de crecimiento e inóculo.
Cuando la solución de substrato se mezcla con el medio acuoso, se
produce la precipitación del substrato. Sin embargo, bajo
condiciones de sobresaturación substancial y agitación moderadamente
vigorosa, la nucleación se favorece sobre el crecimiento cristalino
y se forman partículas muy finas de gran superficie específica. La
gran superficie específica promueve la transferencia de masa entre
la fase líquida y el substrato sólido. Por otra parte, la
concentración en equilibrio de substrato en la fase líquida acuosa
también se potencia en presencia de un disolvente miscible con
agua. De acuerdo con esto, se promueve la productividad.
Aunque el microorganismo no necesariamente puede
tolerar una alta concentración de disolvente orgánico en la fase
acuosa, puede usarse ventajosamente una concentración de etanol, por
ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 3% a aproximadamente 5%
en peso.
Una tercera opción es solubilizar el substrato
en una solución acuosa de ciclodextrina. Ciclodextrinas ilustrativas
incluyen
hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
y metil-\beta-ciclodextrina. La
relación molar de substrato:ciclodextrina puede ser de
aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:1,5 de
substrato:ciclodextrina. La mezcla de substrato:ciclodextrina puede
añadirse a continuación asépticamente al reactor de
bioconversión.
La 11\alpha-hidroxicanrenona y
otros productos del procedimiento de
11\alpha-hidroxilación (Fórmulas VIII y VIIIA)
pueden aislarse filtrando el medio de reacción y extrayendo el
producto de la biomasa recogida sobre el medio de filtración.
Disolventes orgánicos convencionales, por ejemplo acetato de etilo,
acetona, tolueno, hidrocarburos clorados y
metil-isobutil-cetona, pueden usarse
para la extracción. El producto de Fórmula VIII puede
recristalizarse a continuación en un disolvente orgánico del mismo
tipo. Los compuestos de Fórmula VIII tienen valor substancial como
productos intermedios para la preparación de compuestos de Fórmula I
y especialmente de Fórmula IA.
Preferiblemente, los compuestos de Fórmula VIII
corresponden a la Fórmula VIIIA en la que -A-A- y
-B-B- son -CH_{2}-CH_{2}-,
R^{3} es hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior y R^{8} y
R^{9} constituyen juntos el anillo de
20-espiroxano:
Además, de acuerdo con el procedimiento del
esquema 1, el compuesto de Fórmula VIII se hace reaccionar bajo
condiciones alcalinas con una fuente de ion cianuro para producir un
compuesto de enamina de Fórmula VII
en la que -A-A-,
R^{3}, -B-B-, R^{8} y R^{9} son como se
definen anteriormente. Cuando el substrato corresponde a la Fórmula
VIIIA, el producto es de Fórmula
VIIA
en la que -A-A-,
-B-B-, R^{3}, Y^{1}, Y^{2} y X son como se
definen en la Fórmula
XIII.
La cianuración del substrato hidroxilado en
11\alpha de Fórmula VIII puede llevarse a cabo haciéndolo
reaccionar con una fuente de ion cianuro tal como una
cetonacianhidrina, lo más preferiblemente acetonacianhidrina, en
presencia de una base y una sal de metal alcalino, lo más
preferiblemente LiCl. Alternativamente, la cianuración puede
efectuarse sin una cianhidrina usando un cianuro de metal alcalino
en presencia de un ácido.
En el procedimiento de la cetonacianhidrina, la
reacción se efectúa en solución, preferiblemente usando un
disolvente polar aprótico tal como dimetilformamida o
dimetilsulfóxido. La formación de la enamina requiere al menos dos
moles de fuente de ion cianuro por mol de substrato, y
preferiblemente se usa un ligero exceso de la fuente de cianuro. La
base es preferiblemente una base nitrogenada tal como una
dialquilamina, trialquilamina, alcanolamina, piridina o similares.
Sin embargo, también pueden usarse bases inorgánicas tales como
carbonatos de metales alcalinos o hidróxidos de metales alcalinos.
Preferiblemente, el substrato de Fórmula VIII está presente
inicialmente en una proporción de entre aproximadamente 20 y
aproximadamente 50% en peso y la base está presente en una
proporción de entre 0,5 y 2 equivalentes por equivalente de
substrato. La temperatura de la reacción no es crítica, pero la
productividad se potencia mediante la operación a temperatura
elevada. Así, por ejemplo, cuando se usa trietilamina como la base,
la reacción se efectúa ventajosamente en el intervalo de
aproximadamente 80ºC a aproximadamente 90ºC. A tales temperaturas,
la reacción avanza hasta la terminación en de aproximadamente 5 a
aproximadamente 20 horas. Cuando se usa diisopropiletilamina como la
base y la reacción se efectúa a 105ºC, la reacción se completa en 8
horas. Al final del período de reacción, el disolvente se retira
bajo vacío y el aceite residual se disuelve en agua y se neutraliza
hasta pH 7 con ácido diluido, preferiblemente clorhídrico. El
producto precipita en esta solución y posteriormente se lava con
agua destilada y se seca al aire. El HCN liberado puede separarse
por arrastre con un gas inerte y extinguirse en una solución
alcalina. El precipitado secado se recoge en cloroformo u otro
disolvente adecuado. A continuación, se extrae con ácido
concentrado, por ejemplo HCl 6N. El extracto se neutraliza hasta pH
7 mediante la adición de una base inorgánica, preferiblemente un
hidróxido de metal alcalino, y se enfría hasta una temperatura en el
intervalo de 0ºC. El precipitado resultante se lava y se seca, y a
continuación se recristaliza en un disolvente adecuado, por ejemplo
acetona, para producir un producto de Fórmula VII adecuado para el
uso en la siguiente etapa del procedimiento.
Alternativamente, la reacción puede efectuarse
en un sistema disolvente acuoso que comprende un disolvente
orgánico miscible con agua tal como metanol o en un sistema bifásico
que comprende agua y un disolvente orgánico tal como acetato de
etilo. En esta alternativa, el producto puede recuperarse diluyendo
la solución de reacción con agua y posteriormente extrayendo el
producto usando un disolvente orgánico tal como cloruro de metileno
o cloroformo, y a continuación reextrayendo del extracto orgánico
usando ácido mineral concentrado, por ejemplo HCl 2N. Véase la
Patente de EE.UU. 3.200.113.
De acuerdo con una alternativa adicional más, la
reacción puede efectuarse en un disolvente miscible con agua tal
como dimetilformamida, dimetilacetamida,
N-metilpirrolidona o dimetilsulfóxido, después de lo
cual la solución del producto de reacción se diluye con agua y se
hace alcalina, por ejemplo mediante la adición de un carbonato de
metal alcalino, a continuación se enfría hasta de 0 a 10ºC, haciendo
de ese modo que el producto precipite. Preferiblemente, el sistema
se extingue con un hipohalito de metal alcalino u otro reactivo
eficaz para evitar el desprendimiento de cianuro. Después de la
filtración y el lavado con agua, el producto precipitado es adecuado
para el uso en la siguiente etapa del procedimiento.
De acuerdo con una alternativa adicional más, el
producto de enamina de Fórmula VII puede producirse mediante la
reacción de un substrato de Fórmula VIII en presencia de una fuente
de protones, con un exceso de cianuro de metal alcalino,
preferiblemente NaCN, en un disolvente acuoso que comprende un
disolvente polar aprótico miscible con agua, tal como
dimetilformamida o dimetilacetamida. La fuente de protones es
preferiblemente un ácido mineral o un ácido carboxílico C_{1} a
C_{5}, prefiriéndose particularmente el ácido sulfúrico.
Anómalamente, no necesita añadirse fuente de protones discreta
cuando el reactivo de cianuración es LiCN comercial en DMF.
El ion cianuro se carga preferiblemente a la
reacción en una proporción de entre aproximadamente 2,05 y
aproximadamente 5 equivalentes molares por equivalente de
substrato. Se cree que el ácido mineral u otra fuente de protones
promueve la adición de HCN a través de los dobles enlaces 4,5 y 6,7,
y está presente preferiblemente en una proporción de al menos un
equivalente molar por equivalente molar de substrato; pero el
sistema de reacción debe permanecer básico manteniendo un exceso de
cianuro de metal alcalino sobre el ácido presente. La reacción se
lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de al menos
aproximadamente 75ºC, típicamente de 60ºC a 100ºC, durante un
período de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas,
preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 3 horas.
Al final del período de reacción, la mezcla de reacción se enfría,
preferiblemente aproximadamente hasta temperatura ambiente; la
enamina obtenida como producto se precipita acidificando la mezcla
de reacción y mezclándola con agua fría, preferiblemente a
aproximadamente temperatura de baño de hielo. Se cree que la
acidificación cierra la 17-lactona, que tiende a
abrirse bajo las condiciones básicas imperantes en la cianuración.
La mezcla de reacción se acidifica convenientemente usando el mismo
ácido que está presente durante la reacción, preferiblemente ácido
sulfúrico. Se añade preferiblemente agua en una proporción de entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 50 equivalentes molares por mol
de producto.
Los compuestos de Fórmula VII tienen valor
substancial como productos intermedios para la preparación de
compuestos de Fórmula I y especialmente de Fórmula IA.
Preferiblemente, los compuestos de Fórmula VII corresponden a la
Fórmula VIIA en la que -A-A- y -B-B-
son -CH_{2}-CH_{2}-, R^{3} es hidrógeno,
alquilo inferior o alcoxi inferior y R^{8} y R^{9} constituyen
juntos el anillo de 20-espiroxano:
Lo más preferiblemente, el compuesto de Fórmula
VII es
5'R(5'\alpha),7'\beta-20'-aminohexadecahidro-11'\beta-hidroxi-10'\alpha,13'\alpha-dimetil-3',5-dioxoespiro[furano-2(3H),17'\alpha(5'H)-[7,4]meteno[4H]ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carboni-
trilo.
trilo.
En la siguiente etapa de la síntesis del Esquema
1, la enamina de Fórmula VII se hidroliza para producir un compuesto
dicetónico de Fórmula VI
donde -A-A-,
R^{3}, -B-B-, R^{8} y R^{9} son como se
definen para Fórmula VIII. Cualquier ácido orgánico o mineral
acuoso puede usarse para la hidrólisis. Se prefiere el ácido
clorhídrico. Para potenciar la productividad, un disolvente
orgánico miscible con agua, tal como un alcanol inferior, se usa
preferiblemente como un codisolvente. El ácido debe estar presente
en una proporción de al menos un equivalente por equivalente de
substrato de Fórmula VII. En un sistema acuoso, el substrato de
enamina VII puede convertirse substancialmente en la dicetona de
Fórmula VII en un período de aproximadamente 5 horas a
aproximadamente 80ºC. La operación a temperatura elevada incrementa
la productividad, pero la temperatura no es crítica. Temperaturas
adecuadas se seleccionan basándose en la volatilidad del sistema
disolvente y el
ácido.
Preferiblemente, el substrato de enamina de
Fórmula VII corresponde a la Fórmula VIIA
y el producto dicetónico
corresponde a la Fórmula
VIA
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, Y^{1}, Y^{2} y X
son como se definen en la Fórmula
VIIIA.
Al final del período de reacción, la solución se
enfría hasta entre 0ºC y 25ºC para cristalizar el producto. Los
cristales de producto pueden recristalizarse en un disolvente
adecuado tal como isopropanol o metanol para producir un producto
de Fórmula VI adecuado para el uso en la siguiente etapa del
procedimiento; pero la recristalización habitualmente no es
necesaria. Los productos de Fórmula VI tienen valor substancial como
productos intermedios para la preparación de compuestos de Fórmula
I, y especialmente de Fórmula IA. Preferiblemente, los compuestos
de Fórmula VI corresponden a la Fórmula VIA en la que
-A-A- y -B-B- son
-CH_{2}-CH_{2}-, R^{3} es hidrógeno, alquilo
inferior o alcoxi inferior y R^{8} y R^{9} constituyen juntos el
anillo de 20-espiroxano:
Lo más preferiblemente, el compuesto de Fórmula
VI es
4'S(4'\alpha),7'\alpha-hexadecahidro-11'\alpha-hidroxi-10'\beta,13'\beta-dimetil-3',5,20'-trioxoespiro[furano-2(3H),17'\beta-[4,7]metano[17H]ciclopenta[a]fenantreno]-5'\beta(2'H)-carbonitrilo.
Se prefiere que la enamina obtenida como
producto de Fórmula VII se produzca a partir del compuesto de
Fórmula VIII de la manera descrita anteriormente, y se convierta in
situ en la dicetona de Fórmula VI. En esta etapa, un substrato de
Fórmula VIII se hace reaccionar con un exceso de cianuro de metal
alcalino en un disolvente acuoso que contiene una fuente de
protones, u opcionalmente un exceso de cetonacianhidrina en
presencia de una base y LiCl, según se describe anteriormente aquí.
Sin embargo, en lugar de enfriar la mezcla de reacción, acidificar
y añadir agua en proporciones calculadas para provocar la
precipitación de la enamina, se evita preferiblemente el
enfriamiento substancial de la mezcla de reacción. Agua y un ácido,
preferiblemente un ácido mineral tal como sulfúrico, se añaden en
efecto a la mezcla al final de la reacción de cianuración y la
proporción de ácido añadida es suficiente para neutralizar el
cianuro de metal alcalino en exceso, que normalmente requiere la
introducción de al menos un equivalente molar de ácido por mol de
substrato de Fórmula VIII, preferiblemente entre aproximadamente 2
y aproximadamente 5 equivalentes molares por equivalente de
substrato. Sin embargo, la temperatura se mantiene suficientemente
alta y la dilución suficientemente mayor, de modo que se evite la
precipitación substancial y se permita que la hidrólisis de la
enamina en la dicetona avance en fase líquida. Así, el
procedimiento avanza con interrupción mínima y alta productividad.
La hidrólisis se efectúa preferiblemente a una temperatura de al
menos 80ºC, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente
90ºC a aproximadamente 100ºC, durante un período típicamente de
aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas, más preferiblemente
de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 horas. A continuación, la
mezcla de reacción se enfría, preferiblemente hasta una temperatura
de entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 15ºC, ventajosamente
en un baño de hielo hasta de aproximadamente 5ºC a aproximadamente
10ºC, para la precipitación de la dicetona obtenida como producto
de Fórmula VI. El producto sólido puede recuperarse, por ejemplo
mediante filtración, y las impurezas retirarse mediante lavado con
agua.
En la siguiente etapa de la síntesis del Esquema
1, el compuesto dicetónico de Fórmula VI se hace reaccionar con un
alcóxido de metal alcalino para abrir el puente cetónico entre las
posiciones 4 y 7, segmentar el enlace entre el grupo carbonilo y el
carbono 4 y formar un substituyente alcanohidroxicarbonilo orientado
en \alpha en la posición 7 y eliminar el cianuro en el carbono 5.
El producto de esta reacción es un compuesto de hidroxiéster
correspondiente a la Fórmula V
donde -A-A-,
R^{3}, -B-B-, R^{8} y R^{9} son como se
definen en la Fórmula VIII y R^{1} es
alcoxi(inferior)-carbonilo o
hidroxicarbonilo. El alcóxido metálico usado en la reacción
corresponde a la Fórmula R^{10}OM donde M es un metal alcalino y
R^{10}O- corresponde al substituyente alcoxi de R^{1}. Los
rendimientos de esta reacción son los más satisfactorios cuando el
alcóxido metálico es metóxido potásico o sódico, pero pueden usarse
otros alcóxidos inferiores. Se prefiere particularmente un alcóxido
potásico. También pueden usarse fenóxidos, otros arilóxidos, así
como arilsulfuros. La reacción se lleva a cabo convenientemente en
presencia de un alcohol correspondiente a la Fórmula R^{10}OH
donde R^{10} es como se define anteriormente. Pueden usarse otros
disolventes convencionales. Preferiblemente, el substrato de Fórmula
VI está presente en una proporción de entre aproximadamente 2% y
aproximadamente 12% en peso, más preferiblemente al menos
aproximadamente 6% en peso, y R^{10}OM está presente en una
proporción de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 4 moles
por mol de substrato. La temperatura no es crítica, pero la
temperatura elevada potencia la productividad. El tiempo de
reacción está típicamente entre aproximadamente 4 y aproximadamente
24 horas, preferiblemente de aproximadamente 4 a 16 horas.
Convenientemente, la reacción se lleva a cabo a temperatura de
reflujo atmosférica dependiendo del disolvente
usado.
\newpage
En la conversión de la dicetona de Fórmula VI en
el hidroxiéster de Fórmula VI, el ion cianuro obtenido como
subproducto puede reaccionar con el producto para formar
5-cianoéster. Debido a que el equilibrio es más
favorable a bajas concentraciones, la reacción se efectúa
preferiblemente a una dilución bastante alta, por ejemplo, tan alta
como 40:1 para la reacción con metóxido Na. Se ha encontrado que
puede conseguirse una productividad significativamente superior
mediante el uso de metóxido potásico en lugar de metóxido sódico,
debido a que una dilución en el intervalo de aproximadamente 20:1
generalmente es insuficiente para minimizar la extensión de la
cianuración inversa cuando el metóxido potásico es el reactivo.
Se ha descubierto además que la reacción de
cianuración inversa puede inhibirse tomando medidas químicas o
físicas apropiadas para retirar ion cianuro obtenido como
subproducto de la zona de reacción. Así, la reacción de la dicetona
con el alcóxido de metal alcalino puede llevarse a cabo en presencia
de un agente precipitante para ion cianuro tal como, por ejemplo,
una sal que comprende un catión que forma un compuesto de cianuro
insoluble. Tales sales, por ejemplo, pueden incluir yoduro de zinc,
sulfato férrico o esencialmente cualquier haluro, sulfato u otra
sal de un metal alcalinotérreo o de transición que sea más soluble
que el cianuro correspondiente. Si está presente yoduro de zinc en
proporciones en el intervalo de aproximadamente 1 equivalente por
equivalente de substrato dicetónico, se ha observado que la
productividad de la reacción se incrementa substancialmente en
comparación con el procedimiento que se efectúa en ausencia de un
haluro de metal alcalino.
Incluso cuando se usa un agente precipitante
para la retirada del ion cianuro, sigue siendo preferible efectuar
una dilución bastante alta, pero mediante el uso de un agente
precipitante la relación molar de disolvente a substrato dicetónico
puede reducirse significativamente en comparación con reacciones en
ausencia de tal agente. La recuperación del hidroxiéster de Fórmula
V puede llevarse a cabo de acuerdo con los procedimientos bien
extractivos o bien no extractivos descritos posteriormente.
Preferiblemente, el substrato dicetónico de
Fórmula VI corresponde a la Fórmula VIA
y el producto de hidroxiéster
corresponde a la Fórmula
VA
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, Y^{1}, Y^{2} y X
son como se definen en la Fórmula XIIIA y R^{1} es como se define
en la Fórmula
V.
Los productos de Fórmula V tienen valor
substancial como productos intermedios para la preparación de
compuestos de Fórmula I, y especialmente de Fórmula IA.
Preferiblemente, el compuesto de Fórmula V corresponde a la Fórmula
VA en la que -A-A- y -B-B- son
-CH_{2}-CH_{2}-, R^{3} es hidrógeno, alquilo
inferior o alcoxi inferior y R^{8} y R^{9} constituyen juntos el
anillo de 20-espiroxano:
Lo más preferiblemente, el compuesto de Fórmula
V es \gamma-lactona de
11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato
de metilhidrógeno.
El compuesto de Fórmula V puede aislarse
acidificando la solución de reacción, por ejemplo con HCl
concentrado, y enfriando hasta temperatura ambiente y extrayendo el
producto con un disolvente orgánico tal como cloruro de metileno o
acetato de etilo. El extracto se lava con una solución de lavado
alcalina acuosa, se seca y se filtra, después de lo cual el
disolvente se retira. Alternativamente, la solución de reacción que
contiene el producto de Fórmula V puede extinguirse con ácido
concentrado. La solución de producto se concentra, se enfría hasta
de 0 a 25ºC y el sólido obtenido como producto se aísla mediante
filtración.
De acuerdo con un modo preferido de recuperación
del producto de Fórmula V, metanol y HCl se retiran mediante
destilación después de la conclusión del período de reacción,
añadiéndose agua y ácido antes o durante la destilación. La adición
de agua antes de la destilación simplifica las operaciones, pero la
adición progresiva durante la destilación permite que el volumen en
el hervidor se mantenga substancialmente constante. El producto de
Fórmula V cristaliza en las colas del hervidor a medida que avanza
la destilación. Este modo de recuperación proporciona un producto
cristalino de alta calidad sin operaciones de extracción.
De acuerdo con una alternativa adicional, la
solución de reacción que contiene el producto de Fórmula V puede
extinguirse con ácido mineral, por ejemplo HCl 4N, después de lo
cual el disolvente se retira mediante destilación. La retirada del
disolvente también es eficaz para retirar HCl residual del producto
de reacción. Se ha encontrado que no son necesarias múltiples
extracciones de disolvente para la purificación del compuesto de
Fórmula V cuando el compuesto de Fórmula V sirve como un producto
intermedio en un procedimiento para la preparación de
epoximexrenona, según se describe aquí. De hecho, tales extracciones
a menudo pueden eliminarse totalmente. Cuando se usa extracción con
disolvente para la purificación del producto, es deseable
complementar los lavados de disolvente con salmuera y lavados
cáusticos. Pero cuando se eliminan las extracciones con disolvente,
los lavados con salmuera y cáusticos son demasiados. Eliminar las
extracciones y los lavados potencia significativamente la
productividad del procedimiento, sin sacrificar el rendimiento o la
calidad del producto, y también elimina la necesidad de secado de
la solución lavada con un desecante tal como sulfato sódico. El
producto de
11\alpha-hidroxi-7\alpha-alcoxicarbonilo
en bruto se recoge de nuevo en el disolvente para la siguiente
etapa de reacción del procedimiento, que es la conversión del grupo
11-hidroxi en un buen grupo de salida en la posición
11, produciendo de ese modo un compuesto de Fórmula IV:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde -A-A-,
R^{3}, -B-B-, R^{8} y R^{9} son como se
definen en la Fórmula VIII, R^{1} es como se define en la Fórmula
V y R^{2} es alquil(inferior)-sulfoniloxi,
arilsulfoniloxi, aciloxi o haluro. Preferiblemente, el hidroxilo en
11\alpha se esterifica mediante la reacción con un haluro de
alquil(inferior)-sulfonilo, un haluro de
acilo o un anhídrido de ácido que se añade a la solución que
contiene el producto intermedio de Fórmula V. Se prefieren haluros
de alquil(inferior)-sulfonilo, y
especialmente cloruro de metanosulfonilo. Alternativamente, el
grupo hidroxi en 11\alpha podría convertirse en un haluro mediante
la reacción de un reactivo adecuado tal como bromuro de tionilo,
cloruro de tionilo, cloruro de sulfurilo o cloruro de oxalilo.
Otros reactivos para formar ésteres de ácido
11\alpha-sulfónico incluyen cloruro de tosilo,
cloruro de bencenosulfonilo y anhídrido trifluorometanosulfónico.
La reacción se efectúa en un disolvente que contiene un eliminador
de haluro de hidrógeno tal como trietilamina o piridina. También
pueden usarse bases inorgánicas tales como carbonato K o Na. La
concentración inicial del hidroxiéster de Fórmula V está
preferiblemente entre aproximadamente 5% y aproximadamente 50% en
peso. El reactivo de esterificación está presente preferiblemente en
un ligero exceso. El cloruro de metileno es un disolvente
particularmente adecuado para la reacción, pero también pueden
emplearse otros disolventes tales como dicloroetano, piridina,
cloroformo, metil-etil-cetona,
dimetoxietano,
metil-isobutil-cetona, acetona,
otras cetonas, éteres, acetonitrilo, tolueno y tetrahidrofurano. La
temperatura de reacción está gobernada principalmente por la
volatilidad del disolvente. En el cloruro de metileno, la
temperatura de reacción está preferiblemente en el intervalo de
entre aproximadamente -10ºC y aproximadamente
10ºC.
\newpage
Preferiblemente, el substrato de hidroxiéster de
Fórmula V corresponde a la Fórmula VA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y el producto corresponde a la
Fórmula
IVA
\vskip1.000000\baselineskip
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, Y^{1}, Y^{2} y X
son como se definen en la Fórmula XIII, R^{1} es
alcanoiloxi(inferior)-carbonilo o
hidroxicarbonilo y R^{2} es como se define en la Fórmula
IV.
Los productos de Fórmula IV tienen valor
substancial como productos intermedios para la preparación de
compuestos de Fórmula I, y especialmente de Fórmula IA.
Preferiblemente, los compuestos de Fórmula IV corresponden a la
Fórmula IVA en la que -A-A- y -B-B-
son -CH_{2}-CH_{2}-, R^{3} es hidrógeno,
alquilo inferior o alcoxi inferior y R^{8} y R^{9} constituyen
juntos el anillo de 20-espiroxano:
Lo más preferiblemente, el compuesto de Fórmula
IV es \gamma-lactona de
17\alpha-hidroxi-11\alpha-(metilsulfonil)oxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato
de metilhidrógeno.
Si se desea, el compuesto de Fórmula IV puede
aislarse mediante la retirada del disolvente. Preferiblemente, la
solución de reacción se lava en primer lugar con una solución de
lavado alcalina acuosa, por ejemplo NaOH 0,5-2N,
seguido por un lavado con ácido, por ejemplo HCl
0,5-2N. Después de la retirada del disolvente de
reacción, el producto se recristaliza, por ejemplo recogiendo el
producto en cloruro de metileno y a continuación añadiendo otro
disolvente, tal como éter etílico, que disminuye la solubilidad del
producto de Fórmula IV, haciendo que precipite en forma
cristalina.
En la recuperación del producto de Fórmula IV, o
en la preparación de la solución de reacción para la conversión del
producto intermedio de Fórmula IV en el producto intermedio de
Fórmula II como se describe adicionalmente posteriormente aquí,
todas las extracciones y/o etapas de lavado pueden eliminarse si la
solución se trata en su lugar con resinas de intercambio iónico
para la retirada de impurezas ácidas y básicas. La solución se
trata en primer lugar con una resina de intercambio aniónico y a
continuación con una resina de intercambio catiónico.
Alternativamente, la solución de reacción puede tratarse en primer
lugar con adsorbentes inorgánicos tales como alúmina básica o
sílice básica, seguido por un lavado con ácido diluido. La sílice
básica o la alúmina básica pueden mezclarse típicamente con la
solución de reacción en una proporción de entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 50 g por kg de producto, preferiblemente entre
aproximadamente 15 y aproximadamente 20 g por kg de producto. Ya se
usen resinas de intercambio iónico o adsorbentes inorgánicos, los
tratamientos pueden llevarse a cabo simplemente suspendiendo la
resina o el adsorbente inorgánico con la solución de reacción bajo
agitación a temperatura ambiente y a continuación retirando la
resina o el adsorbente inorgánico mediante filtración.
\newpage
Alternativamente, el compuesto obtenido como
producto de Fórmula IV se convierte en forma en bruto como una
solución concentrada mediante la retirada de una porción del
disolvente. Esta solución concentrada se usa directamente en la
siguiente etapa del procedimiento, que es la retirada del grupo de
salida en 11\alpha del compuesto de Fórmula IV, produciendo de
ese modo un enéster de Fórmula II:
donde -A-A-,
R^{3}, -B-B-, R^{8} y R^{9} son como se
definen en la Fórmula VIII y R^{1} es como se define en la
Fórmula V. Para los propósitos de esta reacción, el substituyente
R^{2} del compuesto de Fórmula IV puede ser cualquier grupo de
salida cuya separación sea eficaz para generar un doble enlace entre
los carbonos 9 y 11. Preferiblemente, el grupo de salida es un
substituyente alquil(inferior)-sulfoniloxi o
aciloxi que se retira mediante reacción con un ácido y una sal de
metal alcalino. Pueden usarse ácidos minerales, pero se prefieren
ácidos alcanoicos inferiores. Ventajosamente, el reactivo para la
reacción incluye además una sal de metal alcalino del ácido
alcanoico utilizado. Se prefiere particularmente que el grupo de
salida comprenda mesiloxi y el reactivo para la reacción comprenda
ácido fórmico o ácido acético y una sal de metal alcalino de uno de
estos ácidos u otro ácido alcanoico inferior. Cuando el grupo de
salida es mesiloxi y el reactivo de retirada es ácido fórmico y
formiato potásico, se observa una relación relativamente alta de
9,11- a 11,12-olefina. Si está presente agua libre
durante la retirada del grupo de salida, tienden a formarse
impurezas, particularmente una
7,9-lactona
que es difícil de retirar del
producto final. De ahí que se use anhídrido acético u otro agente de
secado para retirar el agua presente en el ácido fórmico. El
contenido de agua libre en la mezcla de reacción antes de la
reacción debe mantenerse a un nivel por debajo de aproximadamente
0,5%, preferiblemente por debajo de aproximadamente 0,1%, según se
mide mediante análisis de Karl Fischer para el agua, basándose en la
solución de reacción total. Aunque se prefiere que la mezcla de
reacción se mantenga tan seca como sea practicable, se han
conseguido resultados satisfactorios con 0,3% en peso de agua.
Preferiblemente, la mezcla de la carga de reacción contiene entre
aproximadamente 4% y aproximadamente 50% en peso del substrato de
Fórmula IV en el ácido alcanoico. Se incluye preferiblemente entre
aproximadamente 4% y aproximadamente 20% en peso de la sal de metal
alcalino del ácido. Cuando se usa anhídrido acético como el agente
de secado, está preferiblemente presente en una proporción de entre
aproximadamente 0,05 moles y aproximadamente 0,2 moles por mol de
ácido
alcanoico.
Se ha encontrado que las proporciones de
7,9-lactona obtenida como subproducto y
11,12-olefina en la mezcla de reacción son
relativamente bajas cuando el reactivo eliminador comprende una
combinación de ácido trifluoroacético, anhídrido trifluoroacético y
acetato potásico como el reactivo para la eliminación del grupo de
salida y la formación del enéster (9,11-olefina).
El anhídrido trifluoroacético sirve como el agente de secado, y debe
estar presente en una proporción de al menos aproximadamente 3% en
peso, más preferiblemente al menos aproximadamente 15% en peso, lo
más preferiblemente aproximadamente 20% en peso, basado en el
reactivo eliminador de ácido trifluoroacético.
Alternativamente, los grupos de salida en
11\alpha del compuesto de Fórmula IV pueden eliminarse para
producir un enéster de Fórmula II calentando una solución de
Fórmula IV en un disolvente orgánico tal como DMSO, DMF o DMA.
Además, el compuesto de Fórmula IV se hace
reaccionar inicialmente con un alcanoato de alquenilo tal como
acetato de isopropenilo en presencia de un ácido, tal como ácido
toluenosulfónico o un ácido mineral anhidro tal como ácido
sulfúrico, para formar el éster 3-enólico:
del compuesto de Fórmula IV.
Alternativamente, el éster 3-enólico puede formarse
mediante el tratamiento con un anhídrido de ácido y una base tales
como ácido acético y acetato sódico. Alternativas adicionales
incluyen el tratamiento con ceteno en presencia de un ácido para
producir IV(Z). El producto intermedio de Fórmula
IV(Z) se hace reaccionar posteriormente con un formiato o
acetato de metal alcalino en presencia de ácido fórmico o acético
para producir el acetato de
\Delta-9,11-enol de Fórmula
IV(Y):
que a continuación puede
convertirse en el enéster de Fórmula II en un disolvente orgánico,
preferiblemente un alcohol tal como metanol, bien mediante la
descomposición térmica del acetato de enol o bien mediante la
reacción del mismo con un alcóxido de metal alcalino. La reacción de
eliminación es altamente selectiva para el enéster de Fórmula II
con preferencia a la 11,12-olefina y la
7,9-lactona, y esta selectividad se conserva a
través de la conversión del acetato de enol en la
enona.
Preferiblemente, el substrato de Fórmula IV
corresponde a la Fórmula IVA
y el producto de enéster
corresponde a la Fórmula
IIA
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, Y^{1}, Y^{2} y X
son como se definen en la Fórmula XIII y R^{1} es como se define
en la Fórmula
V.
Si se desea, el compuesto de Fórmula II puede
aislarse retirando el disolvente, recogiendo el producto sólido en
agua fría y extrayendo con un disolvente orgánico, tal como acetato
de etilo. Después de las etapas de lavado y secado apropiadas, el
producto se recupera retirando el disolvente de extracción. El
enéster se disuelve a continuación en un disolvente apropiado para
la conversión en el producto de Fórmula I. Alternativamente, el
enéster puede aislarse añadiendo agua a la solución de producto
concentrada y filtrando el producto sólido, retirando de ese modo
preferentemente la 7,9-lactona.
Alternativamente, el hidroxiéster de Fórmula V
puede convertirse en el enéster de Fórmula II sin aislamiento del
compuesto intermedio de Fórmula IV. En este método, el hidroxiéster
se recoge en un disolvente orgánico, tal como cloruro de metileno;
y se añade a la solución bien un agente acilante, por ejemplo
cloruro de metanosulfonilo, o bien un reactivo halogenante, por
ejemplo cloruro de sulfurilo. La mezcla se agita y, cuando está
implicada halogenación, se añade un eliminador de HCl tal como
imidazol. La mezcladura de la base con la solución es altamente
exotérmica y por lo tanto debe realizarse a una velocidad controlada
con enfriamiento total. Después de la adición de base, la mezcla
resultante se calienta hasta temperatura moderada, por ejemplo, de
0ºC a temperatura ambiente o ligeramente mayor, y se hace
reaccionar durante un período típicamente de 1 a 4 horas. Después
de que se complete la reacción, el disolvente se separa por
arrastre, preferiblemente bajo condiciones de alto vacío (por
ejemplo, de 610 a 711 mm [de 24 a 28 pulgadas] de Hg) a de -10ºC a
+15ºC, más preferiblemente de aproximadamente 0ºC a aproximadamente
5ºC, para concentrar la solución y retirar la base en exceso. El
substrato se redisuelve a continuación en un disolvente orgánico,
preferiblemente un disolvente halogenado tal como cloruro de
metileno, para la conversión en el enéster.
El reactivo de eliminación de grupos de salida
se prepara preferiblemente mezclando un ácido orgánico, una sal de
ácido orgánico y un agente de secado, preferiblemente ácido fórmico,
formiato de metal alcalino y anhídrido acético, respectivamente, en
un reactor seco. La adición de anhídrido acético es exotérmica y da
como resultado la liberación de CO, de modo que la velocidad de
adición debe controlarse de acuerdo con esto. Para promover la
retirada de agua, la temperatura de esta reacción se mantiene
preferiblemente en el intervalo de 60 a 90ºC, lo más
preferiblemente de aproximadamente 65 a aproximadamente 75ºC. Este
reactivo se añade a continuación a la solución de producto del
compuesto de Fórmula IV para efectuar la reacción de eliminación.
Después de 4-8 horas, la mezcla de reacción se
calienta preferiblemente hasta una temperatura de al menos
aproximadamente 85ºC, pero no por encima de aproximadamente 95ºC,
hasta que se ha retirado todo el destilado volátil, y a
continuación durante un período adicional para completar la
reacción, típicamente de aproximadamente 1 a 4 horas. La mezcla de
reacción se enfría y, después de la recuperación mediante técnicas
de extracción estándar, el enéster puede recuperarse según se desee
evaporando el disolvente.
Se ha encontrado además que el enéster de
Fórmula II puede recuperarse de la solución de reacción mediante un
procedimiento alternativo que evita la necesidad de etapas de
extracción después de la reacción de eliminación, proporcionando de
ese modo ahorros en el coste como una mejora en el rendimiento y/o
una mejora en la productividad. En este procedimiento, el producto
de enéster se precipita mediante la dilución de la mezcla de
reacción con agua después de la retirada del ácido fórmico. El
producto se aísla a continuación mediante filtración. No se
requieren extracciones.
De acuerdo con una alternativa adicional para la
conversión del hidroxiéster de Fórmula V en el enéster de Fórmula
II sin aislamiento del compuesto de Fórmula IV, el grupo hidroxi en
11\alpha del hidroxiéster de Fórmula V se reemplaza por halógeno,
y el enéster de Fórmula II se forma a continuación in situ mediante
deshidrohalogenación térmica. La substitución del grupo hidroxi por
halógeno se efectúa mediante reacción con haluro de sulfurilo,
preferiblemente cloruro de sulfurilo, en frío en presencia de un
eliminador de haluro de hidrógeno tal como imidazol. El
hidroxiéster se disuelve en un disolvente tal como tetrahidrofurano
y se enfría hasta de 0ºC a -70ºC. El haluro de sulfurilo se añade y
la mezcla de reacción se calienta hasta temperatura moderada, por
ejemplo temperatura ambiente, durante un tiempo suficiente para
completar la reacción de eliminación, típicamente de 1 a 4 horas.
El procedimiento de esta modalidad no solo combina dos etapas en una
sino que elimina el uso de: un disolvente de reacción halogenado,
un ácido (tal como ácido acético) y un reactivo de secado
(anhídrido acético o sulfato sódico). Por otra parte, la reacción no
requiere condiciones de reflujo y evita la generación de CO
obtenido como subproducto que resulta cuando se usa ácido acético
como un reactivo de secado.
De acuerdo con una modalidad particularmente
preferida del Esquema 1, el compuesto dicetónico de Fórmula VI
puede convertirse en epoximexrenona u otro compuesto de Fórmula I
sin aislar ningún producto intermedio en forma purificada. De
acuerdo con este procedimiento preferido, la solución de reacción
que contiene el hidroxiéster se extingue con una solución de ácido
fuerte, se enfría hasta temperatura ambiente y a continuación se
extrae con un disolvente de extracción apropiado. Ventajosamente,
una solución acuosa de sal inorgánica, por ejemplo solución salina
al 10% en peso, se añade a la mezcla de reacción antes de la
extracción. El extracto se lava y se seca mediante destilación
azeotrópica para la retirada del metanol disolvente que queda de la
reacción de segmentación
de cetona.
de cetona.
La solución concentrada resultante que contiene
entre aproximadamente 5% y aproximadamente 50% en peso de compuesto
de Fórmula V se pone en contacto a continuación en frío con un
reactivo acilante o alquilsulfonilante para formar el éster
sulfónico o éster de ácido dicarboxílico. Después de que la reacción
de alquilsulfonación o carboxilación se complete, la solución de
reacción se hace pasar sobre una columna de resina de intercambio
ácida y a continuación una básica para la retirada de impurezas
básicas y ácidas. Después de cada paso, la columna se lava con un
disolvente apropiado, por ejemplo cloruro de metileno, para la
recuperación de éster sulfónico o dicarboxílico residual de la
misma. El eluato combinado y las fracciones de lavado se combinan y
se reducen, preferiblemente bajo vacío, para producir una solución
concentrada que contiene el éster sulfónico o el éster
dicarboxílico de Fórmula IV. Esta solución concentrada se pone en
contacto a continuación con un reactivo seco que comprende un
agente eficaz para la retirada del grupo de salida 11\alpha-éster
y la eliminación del hidrógeno para formar un doble enlace 9,11.
Preferiblemente, el reactivo para la retirada del grupo de salida
comprende la solución de reactivos de secado de ácido
fórmico/formiato de metal alcalino/anhídrido acético descrita
anteriormente. Después de que se complete la reacción, la mezcla de
reacción se enfría y el ácido fórmico y/u otros componentes
volátiles se retiran bajo vacío. Este residuo se enfría hasta
temperatura ambiente, se somete a etapas de lavado apropiadas y a
continuación se seca para dar una solución concentrada que contiene
el enéster de Fórmula II.
En una modalidad especialmente preferida del
Esquema I, el disolvente se retira de la solución de reacción bajo
vacío y el producto de Fórmula IV se somete a reparto entre agua y
un disolvente orgánico apropiado, por ejemplo acetato de etilo. La
capa acuosa se reextrae a continuación con el disolvente orgánico y
el reextracto se lava con una solución alcalina, preferiblemente
una solución de un hidróxido de metal alcalino que contiene un
haluro de metal alcalino. La fase orgánica se concentra,
preferiblemente bajo vacío, para dar el producto de enéster de
Fórmula II. El producto de Fórmula II puede recogerse a continuación
en un disolvente orgánico, por ejemplo cloruro de metileno, y
hacerse reaccionar adicionalmente de la manera descrita
posteriormente para producir el producto de Fórmula I.
De acuerdo con la presente invención, se ha
descubierto que pueden conseguirse numerosas mejoras en la síntesis
de epoximexrenona mediante el uso de una trihaloacetamida en lugar
de un trihaloacetonitrilo como un activador de peróxido para la
reacción de epoxidación. De acuerdo con un procedimiento
particularmente preferido, la epoxidación se lleva a cabo mediante
la reacción del substrato de Fórmula IIA con peróxido de hidrógeno
en presencia de tricloroacetamida y un tampón apropiado, en donde
la reacción se efectúa a un pH en el intervalo de aproximadamente 3
a aproximadamente 7, lo más preferiblemente entre aproximadamente 5
y aproximadamente 7. Sin embargo, a pesar de estas consideraciones,
una reacción satisfactoria se ha conseguido fuera de los intervalos
de pH preferidos.
Resultados especialmente favorables se obtienen
con un tampón que comprende hidrogenofosfato dipotásico y/o con un
tampón que comprende una combinación de hidrogenofosfato dipotásico
y dihidrogenofosfato potásico en proporciones relativas de entre
aproximadamente 1:4 y aproximadamente 2:1, lo más preferiblemente en
el intervalo de aproximadamente 2:3. También pueden usarse tampones
de borato, pero generalmente dan conversiones menores que el
fosfato dipotásico o K_{2}HPO_{4} o mezclas de
K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}. Cualquiera que sea la
constitución del tampón, debe proporcionar un pH en el intervalo
indicado anteriormente. Aparte de la composición global del tampón
o el pH preciso que pueda impartir, se ha observado que la reacción
avanza mucho más eficazmente si al menos una porción del tampón
está comprendida por ion hidrogenofosfato dibásico. Se cree que
este ion puede participar esencialmente como un catalizador
homogéneo en la formación de un aducto o complejo que comprende el
promotor e ion hidroperóxido, cuya generación puede a su vez ser
esencial para el mecanismo de reacción de epoxidación global. Así,
el requerimiento cuantitativo para hidrogenofosfato dibásico
(preferiblemente a partir de K_{2}HPO_{4}) puede ser solo una
pequeña concentración catalítica. Generalmente, se prefiere que
esté presente HPO_{4} en una proporción de al menos
aproximadamente 0,1 equivalentes, por ejemplo entre aproximadamente
0,1 y aproximadamente 0,3 equivalentes, por equivalente de
substrato.
La reacción se lleva a cabo en un disolvente
adecuado, preferiblemente cloruro de metileno, pero alternativamente
pueden usarse otros disolventes halogenados tales como clorobenceno
o dicloroetano. También se han encontrado satisfactorios el tolueno
y mezclas de tolueno y acetonitrilo. Sin someterse a una teoría
particular, se postula que la reacción avanza lo más eficazmente en
un sistema bifásico en el que se forma un producto intermedio de
hidroperóxido y se distribuye a la fase orgánica de bajo contenido
de agua, y reacciona con el substrato en la fase orgánica. Así, los
disolventes preferidos son aquellos en los que la solubilidad en
agua es baja. La recuperación eficaz de tolueno se promueve
mediante la inclusión de otro disolvente tal como acetonitrilo.
En la conversión de substratos de Fórmula II en
productos de Fórmula I, el tolueno proporciona una ventaja de
procesamiento ya que los substratos son libremente solubles en
tolueno y los productos no. Así, el producto precipita durante la
reacción cuando las conversiones alcanzan el intervalo de
40-50%, produciendo una mezcla trifásica de la que
el producto puede separarse cómodamente mediante filtración. El
metanol, el acetato de etilo, el acetonitrilo solo, el THF y
THF/agua no han resultado ser tan eficaces como los disolventes
halogenados o el tolueno para llevar a cabo la conversión de esta
etapa del procedimiento.
Aunque la tricloroacetamida es un reactivo
altamente preferido, también pueden usarse otras trihaloacetamidas
tales como la trifluoroacetamida. También pueden ser útiles la
trihalometilbenzamida u otro compuesto que tenga un resto de
arileno entre el grupo trihalometilo que retira electrones y el
carbonilo de la amida. También pueden usarse
3,3,3-trihalopropionamidas, pero con resultados
menos favorables. Genéricamente, el activador de peróxido puede
corresponder a la fórmula:
RºC(O)NH_{2}
donde Rº es un grupo que tiene una
fuerza de retirada de electrones (según se mide mediante la
constante sigma) al menos tan alta como la del grupo
monoclorometilo. Más particularmente, el activador de peróxido puede
corresponder a la
fórmula:
donde X^{1}, X^{2} y X^{3} se
seleccionan independientemente de entre halo, hidrógeno, alquilo,
haloalquilo y ciano y cianoalquilo, y R^{p} se selecciona de
entre arileno y -(CX^{4}X^{5})_{n}-, donde n es 0 ó 1,
siendo al menos uno de X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y X^{5}
halo o perhaloalquilo. Cuando cualquiera de X^{1}, X^{2},
X^{3}, X^{4} o X^{5} no es halo, es preferiblemente
haloalquilo, lo más preferiblemente perhaloalquilo. Activadores
particularmente preferidos incluyen aquellos en los que n es 0 y al
menos dos de X^{1}, X^{2} y X^{3} son halo; o en los que la
totalidad de X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y X^{5} son halo
o perhaloalquilo. Cada uno de X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y
X^{5} es preferiblemente Cl o F, lo más preferiblemente Cl,
aunque también pueden ser adecuados haluros mixtos, como lo pueden
ser percloroalquilo o perbromoalquilo y combinaciones de los
mismos.
mismos.
Preferiblemente, el activador de peróxido está
presente en una proporción de al menos aproximadamente 1
equivalente, más preferiblemente entre aproximadamente 1,5 y
aproximadamente 2 equivalentes, por equivalente de substrato
inicialmente presente. Debe cargarse peróxido de hidrógeno a la
reacción en un exceso al menos moderado, o añadirse progresivamente
a medida que avanza la reacción de epoxidación. Aunque la reacción
consume solo de uno a dos equivalentes de peróxido de hidrógeno por
mol de substrato, el peróxido de hidrógeno se carga preferiblemente
en exceso substancial con relación al substrato y el activador
inicialmente presentes. Sin limitar la invención a una teoría
particular, se cree que el mecanismo de reacción implica la
formación de un aducto del activador y OOH^{-}, que la formación
de esta reacción es reversible favoreciendo el equilibrio o la
reacción inversa, y que por lo tanto es necesario un exceso inicial
substancial de peróxido de hidrógeno para conducir la reacción en
la dirección directa. La temperatura de la reacción no es
estrechamente crítica y puede llevarse a cabo eficazmente dentro
del intervalo de 0 a 100ºC. La temperatura óptima depende de la
selección del disolvente. Generalmente, la temperatura preferida
está entre aproximadamente 20ºC y 30ºC, pero, en ciertos
disolventes, por ejemplo tolueno, la reacción puede efectuarse
ventajosamente en el intervalo de 60-70ºC. A 25ºC,
la reacción requiere típicamente menos de 10 horas, típicamente de
3 a 6 horas. Si es necesario, pueden añadirse activador y peróxido
de hidrógeno adicionales al final del ciclo de reacción para
alcanzar la conversión completa del substrato.
Al final del ciclo de reacción, la fase acuosa
se retira, la solución de reacción orgánica se lava preferiblemente
para la retirada de impurezas solubles en agua, después de lo cual
el producto puede recuperarse mediante la retirada del disolvente.
Antes de la retirada del disolvente, la solución de reacción debe
lavarse, con al menos un lavado de suave a moderadamente alcalino,
por ejemplo carbonato sódico. Preferiblemente, la mezcla de
reacción se lava sucesivamente con: una solución reductora suave tal
como una solución débil (por ejemplo, 3% en peso) de sulfito sódico
en agua; una solución alcalina, por ejemplo NaOH o KOH
(preferiblemente aproximadamente 0,5N); una solución ácida tal como
HCl (preferiblemente aproximadamente 1N) y un lavado neutro final
que comprende agua o salmuera, preferiblemente salmuera saturada
para minimizar las pérdidas de producto. Antes de la retirada del
disolvente de reacción, puede añadirse ventajosamente otro
disolvente tal como un disolvente orgánico, preferiblemente etanol,
de modo que el producto puede recuperarse mediante cristalización
después de la destilación para la retirada del disolvente de
reacción más volátil.
Debe entenderse que el nuevo método de
epoxidación que utiliza tricloroacetamida u otro nuevo activador de
peróxido tiene aplicación mucho más allá de los diversos esquemas
para la preparación de epoximexrenona y de hecho puede usarse para
la formación de epóxidos a través de dobles enlaces olefínicos en
una amplia variedad de substratos sometidos a reacción en fase
líquida. La reacción es particularmente eficaz en compuestos
insaturados en los que los carbonos olefínicos están
tetrasubstituidos y trisubstituidos, es decir,
R^{a}R^{b}C=CR^{c}R^{d} y R^{a}R^{b}C=CR^{c}H, donde
R^{a} a R^{d} representan substituyentes distintos de hidrógeno.
La reacción avanza lo más rápidamente y completamente cuando el
substrato es un compuesto cíclico con un doble enlace
trisubstitudo, o un compuesto bien cíclico o bien acíclico con
dobles enlaces tetrasubstituidos.
Substratos ejemplares para esta reacción
incluyen \Delta-9,11-canrenona
y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a que la reacción avanza más rápidamente
y completamente con dobles enlaces trisubstituidos y
tetrasubstituidos, es especialmente eficaz para la epoxidación
selectiva a través de tales dobles enlaces en compuestos que pueden
incluir otros dobles enlaces en los que los carbonos olefínicos
están monosubstituidos o incluso disubstituidos.
Debe entenderse adicionalmente que la reacción
puede usarse ventajosamente en la epoxidación de dobles enlaces
monosubstituidos o incluso disubstituidos, tales como la
11,12-olefina en diversos substratos esteroideos.
Sin embargo, debido a que epoxida preferentemente los dobles enlaces
más altamente substituidos, por ejemplo la
9,11-olefina, con alta especificidad, el
procedimiento de la invención es especialmente eficaz para alcanzar
altos rendimientos y productividad en las etapas de epoxidación de
los diversos esquemas de reacción descritos en cualquier parte
aquí.
Se ha observado que el procedimiento mejorado es
de aplicación particularmente ventajosa para la preparación de
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
mediante la epoxidación
de:
\vskip1.000000\baselineskip
Se han demostrado múltiples ventajas para el
procedimiento de la invención en el que se usa tricloroacetamida en
lugar de tricloroacetonitrilo como el reactivo de transferencia de
oxígeno para la reacción de epoxidación. El sistema de reactivo de
tricloroacetamida proporciona un estrecho regiocontrol para la
epoxidación a través de dobles enlaces con olefinas disubstituidas
y \alpha,\beta-cetoolefinas en la misma
estructura molecular. Así, el rendimiento de reacción, el perfil
del producto y la pureza final se potencian substancialmente. Se ha
observado además que la generación de oxígeno en exceso substancial
observada con el uso de trihaloacetonitrilo no se experimenta con
la tricloroacetamida, impartiendo una seguridad mejorada al
procedimiento de epoxidación. Además, en contraste con la reacción
promovida con tricloroacetonitrilo, la reacción de tricloroacetamida
exhibe efectos exotérmicos mínimos, facilitando así el control del
perfil térmico de la reacción. Se observa que los efectos de la
agitación son mínimos y el comportamiento del reactor más
consistente, una ventaja adicional sobre el procedimiento de
tricloroacetonitrilo. La reacción es más susceptible de aumento a
escala que en la reacción promovida por tricloroacetonitrilo. El
aislamiento y la purificación del producto es simple, no existe una
oxidación de Bayer-Villager observable de la función
carbonilo (conversión promovida por peróxido de cetona en éster)
según se experimentaba, por ejemplo, usando ácido
m-cloroperoxibenzoico u otros perácidos, y el
reactivo es económico, fácilmente disponible y se maneja
fácilmente.
El nuevo método de epoxidación de la invención
es altamente útil como la etapa concluyente de la síntesis del
Esquema 1. En una modalidad particularmente preferida, el
procedimiento global del Esquema 1 avanza como sigue:
Se prepararon superficies de cultivo inclinadas
con un medio de crecimiento como el indicado en la Tabla 1
Para producir cultivos de primera generación,
una colonia de Aspergillus ochraceus se suspendió en agua
destilada (2 ml) en un tubo de ensayo y partes alícuotas de 0,15 ml
de esta suspensión se aplicaron a cada una de las superficies de
cultivo inclinadas que se había preparado como se describe
anteriormente. Las superficies de cultivo inclinadas se incubaron
durante 7 días a 25ºC, después de lo cual la apariencia del cultivo
superficial era la de un micelio algodonoso blanco. El reverso se
pigmentó de naranja en la parte inferior, de
amarillo-naranja en la parte superior.
Las superficies de cultivo inclinada de primera
generación se suspendieron en una solución estéril (4 ml) que
contenía tensioactivo no iónico Tween 80 (3% en peso) y partes
alícuotas de 0,15 ml de esta suspensión se usaron para inocular
superficies de cultivo inclinadas de segunda generación que se
habían preparado con el medio de crecimiento indicado en la Tabla
2.
Las superficies de cultivo inclinadas de segunda
generación se incubaron durante 10 días a 25ºC, produciendo una
masa pesada de esporas de color dorado; pigmentada en el reverso de
naranja pardo.
Se preparó un medio protector que tenía la
composición indicada en la Tabla 3.
Cultivos de cinco de las superficies de cultivo
inclinadas de segunda generación se suspendieron en la solución
protectora (15 ml) en un matraz de 100 ml. La suspensión se
distribuyó en partes alícuotas (0,5 ml cada una) entre tubos de 100
x 10 mm para la liofilización. Estas se precongelaron a de -70ºC a
-80ºC en un baño de acetona/hielo seco durante 20 minutos y a
continuación se transfirieron inmediatamente a una cámara de secado
preenfriada hasta de -40 a -50ºC. Las partes alícuotas precongeladas
se liofilizaron a una presión residual de 50 \mu de Hg y \leq
-30ºC. Al final de la liofilización, de dos a tres gránulos de gel
de sílice estéril se añadieron a cada tubo con indicador de humedad
y selladura a la llama.
Para obtener superficies de cultivo inclinadas
madre para fermentación a escala industrial, una sola parte
alícuota de cultivo liofilizado, que se había preparado de la manera
descrita anteriormente, se suspendió en agua destilada (1 ml) y
partes alícuotas de 0,15 ml de la suspensión se usaron para inocular
superficies de cultivo inclinadas que se habían provisto de un
medio de crecimiento que tenía la composición indicada en la Tabla
2. Las superficies de cultivo inclinadas madre se incubaron durante
7 días a 25ºC. Al final de la incubación, el cultivo desarrollado
sobre las superficies de cultivo inclinadas se conservó a 4ºC.
Para preparar un cultivo en superficie de
cultivo inclinada habitual, el cultivo de una superficie de cultivo
madre se suspendió en una solución estéril (4 ml) que contenía Tween
80 (3% en peso) y la suspensión resultante se distribuyó en partes
alícuotas de 0,15 ml entre superficies de cultivo inclinadas que se
habían revestido con el medio de crecimiento descrito en la Tabla
3. Los cultivos en superficie de cultivo inclinada habituales
pueden usarse para inocular los matraces de siembra primarios para
fermentaciones de laboratorio o industriales.
Para preparar un cultivo en matraz de siembra
primario, el cultivo de una superficie de cultivo inclinada
habitual, que se había preparado como se describe anteriormente, se
retiró y se suspendió en una solución (10 ml) que contenía Tween 80
(3% en peso). Una parte alícuota de 0,1 ml de la suspensión
resultante se introdujo en un matraz de reacción de 500 ml con
pantallas que contenía un medio de crecimiento que tenía la
composición indicada en la Tabla 4.
El matraz de siembra se incubó en una batidora
giratoria (200 rpm, 5 cm de desplazamiento) durante 24 horas a
28ºC, produciendo de ese modo un cultivo en la forma de micelios
similares a pellas que tenían diámetros de 3 a 4 mm. Durante la
observación microscópica, se encontró que el cultivo de siembra era
un cultivo puro, con crecimiento sinemático, con grandes hifas y
bien arrolladas. El pH de la suspensión era de 5,4 a 5,6. El PMV
era de 5 a 8% según se determinaba mediante centrifugación (3000 rpm
x 5 min).
Un cultivo en matraz de transformación se
preparó inoculando un medio de crecimiento (100 ml) que tenía la
composición indicada en la Tabla 4 en un segundo matraz agitador de
500 ml con biomasa (1 ml) procedente del matraz de cultivo de
siembra. La mezcla resultante se incubó en una batidora giratoria
(200 rpm, 5 cm de desplazamiento) durante 18 horas a 28ºC. El
cultivo se examinó y se encontró que comprendía micelios similares a
pellas con un diámetro de 3-4 mm. Durante el examen
microscópico, se determinó que el cultivo era un cultivo puro, con
crecimiento sinemático y filamentoso en el que las células apicales
estaban llenas de citoplasma y las células antiguas estaban poco
vacuoladas. El pH de la suspensión de cultivo era de 5 a 5,2 y se
determinó mediante centrifugación que el PMV estaba entre 10% y
15%. De acuerdo con esto, los cultivos se consideraban adecuados
para la transformación de canrenona en
11\alpha-hidroxicanrenona.
La canrenona (1 g) se micronizó hasta
aproximadamente 5 \mu y se suspendió en agua estéril (20 ml). A
esta suspensión se añadieron: una solución de glucosa estéril al
40% (p/v); una solución estéril al 16% (p/v) de levadura
autolizada; y una solución de antibióticoS estéril; todas en las
proporciones indicadas para un tiempo de reacción de 0ºC en la
Tabla 5. La solución de antibióticos se ha preparado disolviendo
sulfato de kanamicina (40 mg), HCl de tetraciclina (40 mg) y
cefalexina (200 mg) en agua (100 ml). La suspensión de esteroide, la
solución de glucosa y la solución de levadura autolizada se
añadieron gradualmente al cultivo contenido en el matraz de
batimiento.
batimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Según avanzaba la reacción, la mezcla de
reacción se analizaba periódicamente para determinar el contenido
de glucosa y mediante cromatografía en capa fina para determinar la
conversión en 11\alpha-hidroxicanrenona.
Substrato de canrenona y nutrientes adicionales se añadieron a la
mezcla de reacción de fermentación durante la reacción a
velocidades controladas para mantener el contenido de glucosa en el
intervalo de aproximadamente 0,1% en peso. El esquema de adición
para la suspensión de esteroide, la solución de glucosa, la solución
de levadura autolizada y la solución de antibióticos se indica en
la Tabla 5. La reacción de transformación continuaba durante 96
horas a 25ºC en una batidora giratoria (200 rpm y 5 cm de
desplazamiento). El pH variaba entre 4,5 y 6 durante la
fermentación. Siempre que el PMV ascendiera hasta o por encima de
60%, una porción de 10 ml de cultivo de caldo se retiraba y se
reemplaza por 10 ml de agua destilada. La desaparición de canrenona
y la aparición de 11\alpha-hidroxicanrenona se
verificaron durante la reacción muestreando el caldo a intervalos
de 4, 7, 23, 31, 47, 55, 71, 80 y 96 horas después del comienzo del
ciclo de fermentación, y analizando la muestra mediante TLC. El
avance de la reacción que se determinaba a partir de estas muestras
se indica en la Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se preparó un cultivo en matraz de siembra
primario de la manera descrita en el Ejemplo 1. Se preparó una
mezcla de nutrientes que tenía la composición indicada en la Tabla
7.
Una carga inicial de esta mezcla de nutrientes
(4 l) se introdujo en un fermentador de transformación de volumen
geométrico 10 l. El fermentador era de configuración cilíndrica con
una relación de altura a diámetro de 2,58. Estaba provisto de un
agitador de turbina de 400 rpm que tenía dos ruedas de disco Nº 2
con 6 álabes cada una. El diámetro externo de los propulsores era
80 mm, cada uno de los álabes tenía 25 mm de dimensión radial y 30
mm de altura, la rueda superior se situó 280 mm por debajo de la
parte superior del recipiente, la rueda inferior estaba 365 mm por
debajo de la parte superior y las pantallas para el recipiente
tenían 210 mm de alto y se extendían radialmente internamente 25 mm
desde la pared vertical interior del recipiente.
El cultivo de siembra (40 ml) se mezcló con la
carga de nutrientes en el fermentador y el cultivo de transformación
se estableció mediante incubación durante 22 horas a 28ºC y una
velocidad de aireación de 0,5 l/1 min a una presión de 0,5
kg/cm^{2}. A las 22 horas, el PMV del cultivo era
20-25% y el pH de 5 a 5,2.
Se preparó una suspensión que comprendía
canrenona (80 g) en agua estéril (400 ml) y una porción de 10 ml se
añadió a la mezcla en el fermentador de transformación. Al mismo
tiempo, una solución de glucosa estéril al 40% (p/v), una solución
estéril al 16% (p/v) de levadura autolizada y una solución de
antibióticos estéril se añadieron en las proporciones indicadas en
la Tabla 8 a un tiempo de reacción de 0 horas. La solución de
antibióticos se preparó de la misma manera descrita en el Ejemplo
1.
A medida que la reacción avanzaba, la mezcla de
reacción se analizó periódicamente para determinar el contenido de
glucosa y mediante cromatografía en capa fina para determinar la
conversión en 11\alpha-hidroxicanrenona.
Basándose en el análisis de TLC de las muestras de caldo de reacción
según se describe posteriormente aquí, se añadió canrenona
adicional a la mezcla de reacción a medida que se consumía el
substrato de canrenona. Los niveles de glucosa también se
verificaron y, siempre que la concentración de glucosa cayera hasta
aproximadamente 0,05% en peso o menos, se añadía solución de
glucosa complementaria para llevar la concentración hasta
aproximadamente 0,25% en peso. También se añadieron nutrientes y
antibióticos en momentos discretos durante el ciclo de reacción. El
esquema de adición para la suspensión de esteroide, la solución de
glucosa, la solución de levadura autolizada y la solución de
antibióticos se indica en la Tabla 8. La reacción de transformación
continuaba durante 90 horas con una velocidad de aireación de 0,5
volúmenes de aire por volumen de líquido por minuto (vvm) a una
presión de descarga positiva de 0,3 kg/cm^{2}. La temperatura se
mantuvo a 28ºC hasta que el PVM alcanzaba 45%, a continuación se
disminuyó hasta 26ºC y se mantuvo a esa temperatura a medida que el
PVM crecía desde 45% hasta 60%, y posteriormente se controló a
24ºC. La velocidad de agitación inicial era 400 rpm, incrementándose
hasta 700 rpm después de 40 horas. El pH se mantuvo a entre 4,7 y
5,3 mediante adiciones de ácido ortofosfórico 2M o NaOH 2M, según
esté indicado. La espumación se controló añadiendo unas pocas gotas
de antiespumante SAG 471 a medida que la espuma se desarrollaba. La
desaparición de canrenona y la aparición de
11\alpha-hidroxicanrenona se verificaron a
intervalos de 4 horas durante la reacción mediante análisis de TLC
de las muestras de caldo. Cuando la mayoría de la canrenona había
desaparecido del caldo, se añadieron incrementos adicionales.
Después de que se hubieran realizado todas las
adiciones de canrenona, la reacción se terminó cuando el análisis
de TLC mostraba que la concentración de substrato de canrenona con
relación a producto de 11\alpha-hidroxicanrenona
había caído hasta aproximadamente 5%.
Al final del ciclo de reacción, el caldo de
fermentación se filtró a través de gasa para la separación del
micelio del caldo líquido. La fracción micelial se resuspendió en
acetato de etilo usando aproximadamente 65 volúmenes (5,2 litros
por gramo de canrenona cargada a lo largo del transcurso de la
reacción). La suspensión micelial en acetato de etilo se sometió a
reflujo durante 1 hora bajo agitación, se enfrió hasta
aproximadamente 20ºC y se filtró en un Buchner. La torta micelial
se lavó subsiguientemente con acetato de etilo (5 volúmenes por g
de carga de canrenona; 0,4 l) y agua desionizada (500 ml) para
desplazar el extracto de acetato de etilo de la torta. La torta
filtrante se descartó. El extracto rico, el lavado de disolvente y
el lavado de agua se recogieron en un separador y a continuación se
dejaron reposar durante 2 horas para la separación de fases.
La fase acuosa se descartó a continuación y la
fase orgánica se concentró bajo vacío hasta un volumen residual de
350 ml. Las colas del hervidor se enfriaron hasta 15ºC y se
mantuvieron bajo agitación durante aproximadamente una hora. La
suspensión resultante se filtró para retirar el producto cristalino
y la torta filtrante se lavó con acetato de etilo (40 ml). Después
de secar, se determinó que el rendimiento de
11\alpha-hidroxicanrenona era 60 g.
Se preparó una suspensión de esporas a partir de
una superficie de cultivo inclinada habitual de la manera descrita
en el Ejemplo 1. En un matraz de fondo redondo de 2000 ml con
pantallas (3 pantallas, cada una de 50 mm x 30 mm) una parte
alícuota (0,5 ml) de la suspensión de esporas se introdujo en una
solución de nutrientes (500 ml) que tenía la composición indicada
en la Tabla 4. La mezcla resultante se incubó en el matraz durante
24 horas a 25ºC en una batidora alterna (120 recorridos por min;
desplazamiento 5 cm), produciendo de ese modo un cultivo que,
durante el examen microscópico, se observó que aparecía como un
cultivo puro con hifas bien arrolladas. El pH del cultivo estaba
entre aproximadamente 5,3 y 5,5 y el PMV (según se determinaba
mediante centrifugación a 3000 rpm durante 5 min) era de 8 a
10%.
Usando el cultivo así preparado, se preparó un
cultivo de siembra en un fermentador de acero inoxidable de
configuración cilíndrica vertical, que tenía un volumen geométrico
de 160 l y una relación de dimensiones de 2,31 (altura = 985 mm;
diámetro = 425 mm). El fermentador estaba provisto de un agitador de
tipo turbina de disco que tenía dos ruedas, teniendo cada rueda 6
álabes con un diámetro externo de 240 mm, teniendo cada álabe una
dimensión radial de 80 mm y una altura de 50 mm. La rueda superior
estaba situada a una profundidad de 780 mm desde la parte superior
del fermentador y la segunda a una profundidad de 995 mm. Pantallas
verticales que tenían una altura de 890 mm se extendían radialmente
internamente 40 mm desde la pared vertical interior del
fermentador. El agitador se hizo funcionar a 170 rpm. Una mezcla de
nutrientes (100 ml) que tenía la composición indicada en la Tabla 9
se introdujo en el fermentador, seguido por una porción de
preinóculo (1 l) preparada como se describe anteriormente y que
tenía un pH de 5,7.
(Continuación)
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla inoculada se incubó durante 22 horas
con una velocidad de aireación de 0,5 l/l-min, a una
presión de descarga de 0,5 kg/cm^{2}. La temperatura se controló
a 28ºC hasta que el PMV alcanzaba 25% y a continuación se disminuyó
hasta 25ºC. El pH se controló en el intervalo de 5,1 a 5,3. El
crecimiento de volumen micelial se muestra en la Tabla 10, junto
con el pH y los perfiles de oxígeno disuelto de la reacción de
cultivo de siembra.
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\newpage
(Continuación)
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el cultivo de siembra así producido, se
llevó a cabo un experimento de fermentación en un fermentador de
acero inoxidable cilíndrico vertical que tenía un diámetro de 1,02
m, una altura de 1,5 m y un volumen geométrico de 1,4 m^{3}. El
fermentador estaba provisto de un agitador de turbina que tenía dos
propulsores, uno situado 867 cm por debajo de la parte superior del
reactor y el otro situado a 1435 cm de la parte superior. Cada
rueda estaba provista de seis álabes, cada uno de 95 cm de dimensión
radial y 75 de altura. Pantallas verticales de 1440 cm de altura se
extendían radialmente internamente 100 cm desde la pared vertical
interior del reactor. Se preparó una mezcla de nutrientes que tenía
la composición indicada en la Tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una carga inicial (700 l) de esta mezcla de
nutrientes (pH = 5,7) se introdujo en el fermentador, seguido por
el inóculo de siembra de este ejemplo (7 l) preparado como se
describe anteriormente.
El inóculo que contenía la mezcla de nutrientes
se incubó durante 24 horas a una velocidad de aireación de 0,5
l/l-min a una presión de descarga de 0,5
kg/cm^{2}. La temperatura se controló a 28ºC y la velocidad de
agitación era 110 rpm. El crecimiento del volumen de micelio se
muestra en la Tabla 12, junto con el pH y los perfiles de oxígeno
disuelto de la reacción de cultivo de siembra.
Al final de la incubación, se observó la
formación de pellas miceliales, pero las pellas eran generalmente
pequeñas y estaban relativamente libremente empaquetadas. Un micelio
difuso estaba suspendido en el caldo. El pH final era de 5,1 a
5,3.
Al cultivo de transformación así producido se
añadió una suspensión de canrenona (1,250 kg; micronizada hasta 5
\mu) en agua estéril (5 l). Solución de aditivos estéril y
solución de antibióticos se añadieron en las proporciones indicadas
en el tiempo de reacción 0 en la Tabla 14. La composición de la
solución de aditivos se indica en la
Tabla 13.
Tabla 13.
La bioconversión se llevó a cabo durante
aproximadamente 96 horas con aireación a 0,5
l/l-min, a una presión de descarga de 0,5
kg/cm^{2} y un pH que variaba entre 4,7 y 5,3, ajustado según
fuera necesario mediante adiciones de NaOH 7,5M o H_{3}PO_{4}
4M. La velocidad de agitación era inicialmente 100 rpm, se
incrementaba hasta 165 rpm a las 40 horas y 250 rpm a las 64 horas.
La temperatura inicial era 28ºC, disminuía hasta 26ºC cuando el PMV
alcanzaba 45%, y disminuía hasta 24ºC cuando el PMV ascendía hasta
60%. Se añadió SAG 471 en gotas finas según fuera necesario para
controlar la espumación. Los niveles de glucosa en la fermentación
se verificaron a intervalos de 4 horas y, siempre que la
concentración de glucosa cayera por debajo de 1 gpl, se añadió un
incremento de solución de aditivos estéril (10 ml) a la partida. La
desaparición de canrenona y la aparición de
11\alpha-hidroxicanrenona también se verificaron
durante la reacción mediante HPLC. Cuando al menos 90% de la carga
de canrenona inicial se había convertido en
11\alpha-hidroxicanrenona, se añadió un
incremento de 1,250 kg de canrenona. Cuando se observaba que 90% de
la canrenona en ese incremento se había convertido, se introducía
otro incremento de 1,250 kg. Usando el mismo criterio, se añadieron
incrementos adicionales (1,250 kg cada uno) hasta que se había
introducido la carga del reactor total (20 kg). Después de que toda
la carga de canrenona se hubiera aportado al reactor, la reacción se
terminó cuando la concentración de canrenona sin reaccionar era 5%
con relación a la cantidad de
11\alpha-hidroxicanrenona producida. El esquema
para la adición de canrenona, la solución de aditivos estéril y la
solución de antibióticos es como se muestra en la Tabla 14.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando la bioconversión era completa, los
micelios se separaron del caldo mediante centrifugación en una
centrífuga de canasta. Se determinó mediante HPLC que el filtrado
contenía solo 2% de la cantidad total de
11\alpha-hdiroxicanrenona en el caldo recogido, y
por lo tanto se eliminó. Los micelios se suspendieron en acetato de
etilo (1000 l) en un depósito de extracción de 2 m^{3} de
capacidad. Esta suspensión se calentó durante 1 hora bajo agitación
y condiciones de reflujo de acetato de etilo, a continuación se
enfrió y se centrifugó en una centrífuga de canasta. La torta
micelial se lavó con acetato de etilo (200 l) y posteriormente se
descargó. El extracto de disolvente rico en esteroide se dejó
reposar durante 1 hora para la separación de la fase acuosa. La fase
acuosa se extrajo con una cantidad adicional de acetato de etilo
disolvente (200 l) y a continuación se descartó. Las fases de
disolvente combinadas se clarificaron mediante centrifugación y se
pusieron en un concentrador (volumen geométrico 500 l) y se
concentraron bajo vacío hasta un volumen residual de 100 l. Al
llevar a cabo la evaporación, la carga final al concentrador de
extracto combinado y soluciones de lavado era 100 l, y este volumen
se mantuvo constante mediante adiciones continuas o periódicas de
solución combinada a medida que el disolvente se eliminaba. Después
de que la etapa de evaporación fuera completa, las colas del
hervidor se enfriaron hasta 20ºC y se removieron durante 2 horas, y
a continuación se filtraron en un filtro de Buchner. El recipiente
del concentrador se lavó con acetato de etilo (20 l) y esta solución
de lavado se usó a continuación para lavar la torta sobre el
filtro. El producto se secó bajo vacío durante 16 horas a 50ºC. El
rendimiento de 11\alpha-hidroxicanrenona era 14
kg.
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Esporas liofilizadas de Aspergillus
ochraceus NRRL 405 se suspendieron en un medio de crecimiento de
licor de impregnación de maíz (2 ml) que tenía la composición
indicada en la Tabla 15.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La suspensión resultante se usó en un inóculo
para la propagación de esporas sobre placas de agar. Se prepararon
10 placas de agar, teniendo cada una un medio de crecimiento sólido
de glucosa/extracto de levadura/fosfato/agar que tenía la
composición indicada en la Tabla 16:
\vskip1.000000\baselineskip
Una parte alícuota de 0,2 ml de la suspensión se
transfirió a la superficie de cada placa. Las placas se incubaron a
25ºC durante 10 días, después de lo cual las esporas procedentes de
todas las placas se recogieron en un medio protector criogénico
estéril que tenía la composición indicada en la Tabla 17:
La suspensión resultante se dividió entre 20
viales, transfiriéndose un ml a cada vial. Estos viales constituyen
un banco de células original que puede ser explotado para producir
bancos de células de trabajo para el uso en la generación de
inóculo para la bioconversión de canrenona en
11\alpha-hidroxicanrenona. Los viales que
comprenden el banco de células original se almacenaron en la fase de
vapor de un congelador de nitrógeno líquido a -130ºC.
Para comenzar la preparación de un banco de
células de trabajo, las esporas de un solo vial del banco de células
original se resuspendieron en un medio de crecimiento estéril (1
ml) que tenía la composición indicada en la Tabla 15. Esta
suspensión se dividió en 10 partes alícuotas de 0,2 ml y cada parte
alícuota se usó para inocular una placa de agar que tenía un medio
de crecimiento sólido que tenía la composición indicada en la Tabla
16. Estas placas se incubaron durante 10 días a 25ºC. Para el tercer
día de incubación, la cara interior del medio de crecimiento era
parda-naranja. Al final de la incubación había una
fuerte producción de esporas de color dorado. Las esporas de cada
placa se recogieron mediante el procedimiento descrito anteriormente
aquí para la preparación del banco de células original. Se preparó
un total de 100 viales, conteniendo cada uno 1 ml de suspensión.
Estos viales constituían el banco de células de trabajo. Los viales
del banco de células de trabajo también se conservaron mediante
almacenamiento en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno
líquido a -130ºC.
Medio de crecimiento (50 ml) que tenía la
composición indicada en la Tabla 15 se cargó a un matraz Erlenmeyer
de 250 ml. Una parte alícuota (0,5 ml) de suspensión de células de
trabajo se introdujo en el depósito y se mezcló con el medio de
crecimiento. La mezcla inoculada se incubó durante 24 horas a 25ºC
para producir un cultivo de siembra primario que tenía un
porcentaje de volumen micelial empaquetado de aproximadamente 45%.
Durante la inspección visual se encontró que el cultivo comprendía
micelios similares a pellas de 1 a 2 mm de diámetro, y durante la
observación microscópica aparecía como un cultivo puro.
La cultivación de un cultivo de siembra
secundario se inició introduciendo un medio de crecimiento que tenía
la composición indicada en la Tabla 15 en un matraz de Fernbach de
2,8 l e inoculando el medio con una porción (10 ml) del cultivo de
siembra primario de este ejemplo, cuya preparación era como la
descrita anteriormente. La mezcla inoculada se incubó a 25ºC
durante 24 horas en una batidora giratoria (200 rpm, 5 cm de
desplazamiento). Al final de la incubación, el cultivo exhibía las
mismas propiedades que se describen anteriormente para el cultivo
de siembra primario y era adecuado para el uso en una fermentación
de transformación en la que canrenona se bioconvertía en
11\alpha-hidroxicanrenona.
La transformación se efectuó en un transformador
Braun E Biostat configurado como sigue:
- Capacidad:
- 15 litros con fondo redondo
- Altura:
- 53 cm
- Diámetro:
- 20 cm
- H/D:
- 2,65
- Propulsores:
- 7,46 cm de diámetro, seis álabes de 2,2 x 1,4 cm cada uno
- Espaciamiento de propulsores:
- 65,5, 14,5 y 25,5 cm desde el fondo del depósito
- Pantallas:
- cuatro 1,9 x 48 cm
- Pulverizador:
- 10,1 cm de diámetro, 21 orificios - 1 mm de diámetro
- Control de temperatura:
- proporcionado por medio de una camisa externa del recipiente
Canrenona en una concentración de 20 g/l se
suspendió en agua desionizada (4 l) y una porción (2 l) de medio de
crecimiento que tenía la composición indicada en la Tabla 18 se
añadió mientras la mezcla del fermentador se removía a 300 rpm.
La suspensión resultante se agitó durante 15
minutos, después de lo cual el volumen se llevó hasta 7,5 l con
agua desionizada adicional. En este punto el pH de la suspensión se
ajustó desde 5,2 hasta 6,5 mediante la adición de solución de NaOH
al 20% en peso y la suspensión se esterilizó a continuación
calentando a 121ºC durante 30 minutos en el fermentador Braun E. El
pH después de la esterilización era 6,3 \pm 0,2 y el volumen
final era 7,0 l. La suspensión esterilizada se inoculó con una
porción (0,5 l) del cultivo de siembra secundario de este ejemplo
que se ha preparado como se describe anteriormente, y el volumen se
llevó hasta 8,0 l mediante la adición de solución de glucosa
estéril al 50%. La fermentación se llevó a cabo a una temperatura de
28ºC hasta que el PMV alcanzaba 50%, a continuación se disminuía
hasta 26ºC y se disminuía adicionalmente hasta 24ºC cuando el PMV
superaba 50% para mantener un PMV constante por debajo de
aproximadamente 60%. Se introdujo aire a través del pulverizador a
una velocidad de 0,5 vvm basada en el volumen de líquido inicial y
la presión en el fermentador se mantuvo a 700 milibares
manométricos. La agitación comenzó a 600 rpm y se incrementó por
etapas hasta 1000 rpm según fuera necesario para mantener el
contenido de oxígeno disuelto por encima de 30% en volumen. La
concentración de glucosa se verificó. Después de que la
concentración de glucosa alta inicial cayera por debajo de 1%
debido al consumo por la reacción de fermentación, se proporcionó
glucosa complementaria a través de una solución de glucosa estéril
al 50% en peso para mantener la concentración en el intervalo de
0,05% a 1% a través del resto del ciclo discontinuo. Antes de la
inoculación el pH era 6,3 \pm 0,2. Después de que el pH cayera
hasta aproximadamente 5,3 durante el período de fermentación
inicial, se mantuvo en el intervalo de 5,5 \pm 0,2 durante el
resto del ciclo mediante la adición de hidróxido amónico. La espuma
se controló añadiendo un agente antiespumante de polietilenglicol
vendido bajo la denominación comercial SAG 471 por OSI Specialties,
Inc.
El crecimiento del cultivo tuvo lugar
principalmente durante las primeras 24 horas del ciclo, momento en
el cual el PMV era aproximadamente 40%, el pH era aproximadamente
5,6 y el contenido de oxígeno disuelto era aproximadamente 50% en
volumen. La conversión de canrenona comenzaba incluso cuando el
cultivo estaba creciendo. Las concentraciones de canrenona y
11\alpha-hidroxicanrenona se verificaron durante
la bioconversión analizando diariamente muestras. Las muestras se
extrajeron con acetato de etilo caliente y la solución de muestra
resultante se analizó mediante TLC y HPLC. La bioconversión se
consideraba completa cuando la concentración de canrenona residual
era aproximadamente 10% de la concentración inicial. El tiempo de
conversión aproximado era de 110 a 130 horas.
Cuando la bioconversión era completa, biomasa
micelial se separó del caldo mediante centrifugación. El
sobrenadante se extrajo con un volumen igual de acetato de etilo y
la capa acuosa se descartó. La fracción micelial se resuspendió en
acetato de etilo usando aproximadamente 65 volúmenes por g de
canrenona cargado al reactor de fermentación. La suspensión
micelial se sometió a reflujo durante 1 hora bajo agitación, se
enfrió hasta aproximadamente 20ºC y se filtró en un embudo de
Buchner. La torta filtrante micelial se lavó dos veces con 5
volúmenes de acetato de etilo por g de canrenona cargado al
fermentador y a continuación se lavó con agua desionizada (1 l)
para desplazar el acetato de etilo residual. El extracto acuoso, el
disolvente rico, el lavado de disolvente y el lavado acuoso se
combinaron. La torta micelial agotada restante bien se descartó o
bien se extrajo de nuevo, dependiendo del análisis de esteroides
residuales en la misma. Las fases líquidas combinadas se dejaron
sedimentar durante 2 horas. Posteriormente, la fase acuosa se separó
y se descartó y la fase orgánica se concentró bajo vacío hasta que
el volumen residual era aproximadamente 500 ml. La botella del
hervidor se enfrió a continuación hasta aproximadamente 15ºC con
agitación lenta durante aproximadamente 1 hora. El producto
cristalino se recuperó mediante filtración y se lavó con acetato de
etilo refrigerado (100 ml). El disolvente se retiró de los
cristales mediante evaporación y el producto cristalino se secó bajo
vacío a 50ºC.
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Esporas liofilizadas de Aspergillus
ochraceus ATCC 18500 se suspendieron en un medio de crecimiento
de licor de impregnación de maíz (2 ml) como se describe en el
Ejemplo 4. Se prepararon 10 placas de agar, también de la manera
del Ejemplo 4. Las placas se incubaron y se recogieron como se
describe en el Ejemplo 4 para proporcionar un banco de células
original. Los viales que comprenden el banco de células original se
almacenaron en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno
líquido a -130ºC.
A partir de un vial del banco de células
original, se preparó un banco de células de trabajo como se describe
en el Ejemplo 4 y se almacenó en el congelador de nitrógeno a
1-30ºC.
Medio de crecimiento (300 ml) que tenía la
composición indicada en la Tabla 19 se cargó a un matraz de 2 l con
pantallas. Una parte alícuota (3 ml) de suspensión de células de
trabajo se introdujo en el matraz. La mezcla inoculada se incubó
durante de 20 a 24 horas a 28ºC en una batidora giratoria (200 rpm,
5 cm de desplazamiento) para producir un cultivo de siembra
primario que tenía un porcentaje de volumen micelial empaquetado de
aproximadamente 45%. Durante la inspección visual se encontró que
el cultivo comprendía micelios similares a pellas de 1 a 2 mm de
diámetro; y durante la observación microscópica aparecía como un
cultivo puro.
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La cultivación de un cultivo de siembra
secundario se inició introduciendo 8 l de medio de crecimiento que
tenía la composición indicada en la Tabla 19 en un fermentador de
vidrio de 14 l. Inocúlese el fermentador con de 160 ml a 200 ml del
cultivo de siembra primario de este ejemplo, cuya preparación era
como se describe anteriormente.
La mezcla inoculada se cultivó a 28ºC durante
18-20 horas, agitación a 200 rpm, la velocidad de
aireación era 0,5 vvm. Al final de la propagación, el cultivo
exhibía las mismas propiedades que se describen anteriormente para
la siembra primaria.
La transformación se efectuó en un fermentador
de 60 l, substancialmente de la manera descrita en el Ejemplo 4,
excepto que el medio de crecimiento tenía la composición indicada en
la Tabla 20 y la carga inicial de cultivo de siembra secundario era
de 350 ml a 700 ml. La velocidad de agitación era inicialmente 200
rpm, pero se incrementaba hasta 500 rpm según fuera necesario para
mantener el oxígeno disuelto por encima de 10% en volumen. El
tiempo de bioconversión aproximado para 20 g/l de canrenona era de
80 a 160 horas.
Usando una suspensión de esporas procedente del
banco de células de trabajo producido de acuerdo con el método
descrito en el Ejemplo 4, se prepararon cultivos de siembra
primarios y secundarios, también substancialmente de la manera
descrita en el Ejemplo 4. Usando cultivos de siembra secundarios
producidos de esta manera, se realizaron dos experimentos de
bioconversión de acuerdo con un procedimiento modificado del tipo
ilustrado en la Fig. 1, y se realizaron dos experimentos con el
procedimiento ilustrado en la Fig. 2. El medio de crecimiento de
transformación, los programas de adición de canrenona, los tiempos
de recogida y los grados de conversión para estos experimentos se
indican en la Tabla 21. El experimento R2A usaba un programa de
adición de canrenona basado en el mismo principio que el Ejemplo 3,
mientras que el experimento R2C modificaba el esquema del Ejemplo 3
realizando solo dos adiciones de canrenona, una al principio de la
dosificación de la partida y una después de 24 horas. En los
experimentos 2RB y 2RD, toda la carga de canrenona se introducía al
principio de la dosificación de la partida y el procedimiento se
llevaba a cabo generalmente de la manera descrita en el Ejemplo 4,
excepto que la carga de canrenona se esterilizaba en un recipiente
separado antes de que se cargara al fermentador y la glucosa se
añadía a medida que avanzaba la dosificación de la partida. Se usó
un mezclador de Waring para reducir trozos gruesos producidos
durante la esterilización. En los experimentos R2A y R2B, la
canrenona se introdujo en la partida en solución en metanol,
aspecto en el cual estos experimentos diferían adicionalmente de los
experimentos de los Ejemplos 3 y 4, respectivamente.
En los experimentos R2A y R2B, la concentración
de metanol se acumulaba hasta aproximadamente 6,0% en la cerveza de
fermentación, lo que se encontró que era inhibidor para el
crecimiento del cultivo y la bioconversión. Sin embargo, basándose
en los resultados de estos experimentos, se concluyó que el metanol
u otro disolvente miscible con agua podía servir eficazmente a
concentraciones inferiores para incrementar la carga de canrenona y
proporcionar canrenona como un precipitado de partículas finas que
proporciona una gran área interfacial para el suministro de
canrenona que ha de someterse a la reacción.
La canrenona resultaba estable a la temperatura
de esterilización (121ºC) pero se agregaba en trozos gruesos. Se
empleó un mezclador de Waring para triturar los grumos en partículas
finas, que se convertían satisfactoriamente en producto.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando una suspensión de esporas procedente del
banco de células de trabajo producido de acuerdo con el método
descrito en el Ejemplo 4, se prepararon cultivos de siembra
primarios y secundarios, también substancialmente de la manera
descrita en el Ejemplo 4. La descripción y los resultados del
Ejemplo 7 se muestran en la Tabla 22. Usando cultivo de siembra
secundario producido de esta manera, se llevó a cabo una
bioconversión (R3C) substancialmente como se describe en el Ejemplo
3, y se llevaron a cabo tres bioconversiones de acuerdo con el
procedimiento descrito generalmente en el Ejemplo 5. En los tres
últimos experimentos (R3A, R3B y R3C) la canrenona se esterilizó en
un depósito portátil, junto con el medio de crecimiento, excepto
para la glucosa. La glucosa se alimentó asépticamente desde otro
depósito. La suspensión de canrenona esterilizada se introdujo en
el fermentador bien antes de la incubación o bien durante la fase
inicial de la bioconversión. En el experimento R3B, canrenona
estéril complementaria y medio de crecimiento se introdujeron en
46,5. Los grumos de canrenona formados durante la esterilización se
disgregaron a través de un mezclador de Waring produciendo así una
suspensión en partículas finas que entraba en el fermentador. El
medio de crecimiento de transformación, los programas de adición de
canrenona, los programas de adición de nutrientes, los tiempos de
recogida y los grados de conversión para estos experimentos se
indican en las
Tablas 22 y 23.
Tablas 22 y 23.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido al crecimiento filamentoso, un caldo de
fermentador altamente viscoso se observó en los cuatro experimentos
de este ejemplo. Para vencer los obstáculos que creaba la alta
viscosidad con respecto a la aireación, la mezcladura, el control
del pH y el control de la temperatura, la velocidad de aireación y
la velocidad de agitación se incrementaron durante estos
experimentos. Las conversiones avanzaban satisfactoriamente bajo
las condiciones más intensas, pero se formaba una torta densa por
encima de la superficie de caldo líquido. Algo de canrenona sin
reaccionar era arrastrado fuera del caldo por esta torta.
La descripción y los resultados del Ejemplo 8 se
resumen en la Tabla 24. Se realizaron cuatro experimentos de
fermentación en los que se producía
11\alpha-hidroxicanrenona mediante bioconversión
de canrenona. En dos de estos experimentos (R4A y R4D), la
bioconversión se efectuaba substancialmente de la misma manera que
los experimentos R3A y R3B del Ejemplo 6. En la prueba R4C, la
canrenona se convirtió en
11\alpha-hidroxicanrenona generalmente de la
manera descrita en el Ejemplo 3. En el experimento R4B, el
procedimiento se llevó a cabo generalmente como se describe en el
Ejemplo 4, es decir con esterilización de canrenona y medio de
crecimiento en el fermentador justo antes de la inoculación, todos
los nutrientes de nitrógeno y fósforo se introdujeron al principio
de la dosificación de la partida, y una solución complementaria que
contenía glucosa solo se alimentó al fermentador para mantener el
nivel de glucosa a medida que avanzaba la dosificación de la
partida. En el último procedimiento (experimento R4B) la
concentración de glucosa se verificó cada 6 horas y se añadió
solución de glucosa según estuviera indicado para controlar niveles
de glucosa en el intervalo de 0,5 a 1%. Los programas de adición de
canrenona para estos experimentos se indican en la Tabla 25.
(Continuación)
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\vskip1.000000\baselineskip
Todos los fermentadores se hicieron funcionar
bajo alta agitación y aireación durante la mayoría del ciclo de
fermentación debido a que la cerveza de fermentación se había vuelto
altamente viscosa en menos de aproximadamente un día después de la
inoculación.
\newpage
El medio de crecimiento de transformación, los
programas de adición de canrenona, los tiempos de recogida y los
grados de conversión para los experimentos de este Ejemplo se
indican en la Tabla 26.
Se llevaron a cabo cuatro experimentos de
bioconversión substancialmente de la manera descrita para el
experimento R4B del Ejemplo 8, excepto según se describe
posteriormente. En el experimento R5B, el propulsor de disco de
turbina superior usado para la agitación en los otros experimentos
se reemplazó por un propulsor marino de bombeo descendente. La
acción de bombeo descendente vertía axialmente el caldo en el centro
del fermentador y reducía la formación de torta. Se añadió metanol
(200 ml) inmediatamente después de la inoculación en el experimento
R5D. Puesto que la canrenona se esterilizaba en el fermentador,
todos los nutrientes excepto la glucosa se añadieron al principio
de la dosificación de la partida, obviando la necesidad de
alimentación en cadena de fuentes de nitrógeno, fuentes de fósforo o
antibióticos.
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Para mantener la inmersión del crecimiento en
fase sólida por encima de la superficie del líquido, se añadió
medio de crecimiento (2 l) a cada fermentador 96 horas después del
principio de la dosificación de la partida. Los problemas de
mezcladura no se vencían totalmente bien mediante la adición de
medio de crecimiento o bien mediante el uso de un propulsor de
bombeo descendente (experimento R5B), pero los resultados de los
experimentos demostraban la viabilidad y las ventajas del
procedimiento, indicaban que podía proporcionarse una mezcladura
satisfactoria de acuerdo con prácticas convencionales.
\newpage
Se llevaron a cabo tres experimentos de
bioconversión substancialmente de la manera descrita en el Ejemplo
9. Los medios de crecimiento de transformación, los programas de
adición de canrenona, los tiempos de recogida y los grados de
conversión para los experimentos de este Ejemplo se indican en la
Tabla 27:
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Medio de crecimiento (1,3 l) y agua estéril (0,8
l) se añadieron después de 71 horas en el experimento R6A a torta
micelial sumergida que había crecido por encima de la superficie del
caldo líquido. Con el mismo propósito, medio de crecimiento (0,5 l)
y agua estéril (0,5 l) se añadieron después de 95 horas en el
experimento R6B. Los datos del balance de materia mostraban que
podía determinarse un mejor balance de masa cuando la acumulación de
torta por encima de la superficie de líquido se minimizaba.
\newpage
Se realizaron experimentos de fermentación para
comparar la preesterilización de canrenona con la esterilización de
canrenona y medio de crecimiento en el fermentador de
transformación. En el experimento R7A, el procedimiento se llevó a
cabo según se ilustra en la Fig. 2, bajo condiciones comparables a
las de los experimentos R2C, R2D, R3A, R3B, R3D, R4A y R4D. El
experimento R7B era como se ilustra en la Fig. 3 bajo condiciones
comparables a las de los Ejemplos 4, 9 y 10 y el experimento R4B.
El medio de crecimiento de transformación, los esquemas de adición
de canrenona, los tiempos de recogida y los grados de conversión
para los experimentos de este Ejemplo se indican en la Tabla 28:
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Un balance de masa sobre la muestra final tomada
del experimento R7B era 89,5%, indicando que no había pérdida de
substrato significativa o degradación en la bioconversión. Se
determinó que la mezcladura era adecuada para ambos
experimentos.
La concentración de glucosa residual estaba por
encima del intervalo de control de 5-10 gpl deseado
durante las 80 horas iniciales. El comportamiento del experimento
aparentemente estaba inalterado por una torta clara que se acumulaba
en el espacio libre de ambos fermentadores.
\newpage
La eficacia de extracción se determinó en una
serie de experimentos de extracción de 1 l según se resume en la
Tabla 29. En cada uno de estos experimentos, se extrajeron
esteroides del micelio usando acetato de etilo (1 l/l de volumen de
fermentación). Se realizaron dos extracciones secuenciales en cada
experimento. Basándose en RP-HPLC, aproximadamente
80% del esteroide total se recuperó en la primera extracción; y la
recuperación se incrementaba hasta 95% mediante la segunda
extracción. Una tercera extracción habría recuperado otro 3% de
esteroide. El 2% restante se pierde en la fase acuosa sobrenadante.
El extracto se llevó hasta sequedad usando vacío pero no se lavó
con ningún disolvente adicional. El seguimiento con disolvente
mejoraría la recuperación desde la extracción mínima si estuviera
justificado por la economía del procedimiento.
Metil-isobutil-cetona
(MIBK) y tolueno se evaluaron como disolventes de
extracción/cristalización para
11\alpha-hidroxicanrenona a la escala de 1 l de
caldo. Usando el protocolo de extracción que se describe
anteriormente aquí, tanto la MIBK como el tolueno eran comparables
al acetato de etilo tanto en eficacia de extracción como en
comportamiento de cristalización.
Como parte de la evaluación de los
procedimientos de las Figs. 2 y 3, se efectuaron estudios del tamaño
de partícula sobre el substrato de canrenona proporcionado al
principio del ciclo de fermentación en cada uno de estos
procedimientos. Según se describe anteriormente, la canrenona
alimentada al procedimiento de la Fig. 1 se micronizó antes de la
introducción en el fermentador. En este procedimiento, la canrenona
no se esteriliza, controlándose el crecimiento de microorganismos
no deseados mediante la adición de antibióticos. Los procedimientos
de las Figs. 2 y 3 esterilizan la canrenona antes de la reacción. En
el procedimiento de la Fig. 2, esto se efectúa en un mezclador
antes de la introducción de la canrenona en el fermentador. En el
procedimiento de la Fig. 3, una suspensión de canrenona en medio de
crecimiento se esteriliza en el fermentador al principio de la
dosificación de la partida. Según se analiza anteriormente aquí, la
esterilización tiende a provocar la aglomeración de partículas de
canrenona. Debido a la solubilidad limitada de la canrenona en el
medio de crecimiento acuoso, la productividad del procedimiento
depende de la transferencia de masa desde la fase sólida, y así
puede esperarse que dependa del área interfacial presentada por el
substrato en partículas sólido que a su vez depende de la
distribución de tamaños de partícula. Estas consideraciones servían
inicialmente como impedimentos para los procedimientos de las Figs.
2 y 3.
Sin embargo, se encontró que la agitación en el
mezclador de la Fig. 2 y el depósito de fermentación de la Fig. 3,
junto con la acción de la bomba de cizallamiento usada para la
transferencia en la partida de la Fig. 2, degradaban la
aglomeración hasta un intervalo de tamaño de partícula
razonablemente aproximado al de la canrenona no esterilizada y
micronizada alimentada al procedimiento de la Fig. 1. Esto se
ilustra mediante las distribuciones de tamaños de partícula para la
canrenona que está disponible a la salida del ciclo de reacción en
cada uno de los tres procedimientos. Véase la Tabla 30 y las Figs. 4
y 5.
A partir de los datos de la Tabla 30, se
apreciará que los agitadores y la bomba de cizallamiento eran
eficaces para reducir el tamaño de partícula medio de la canrenona
esterilizada hasta el mismo orden de magnitud que el substrato no
esterilizado, pero una diferencia de tamaño significativa permanecía
a favor del substrato no esterilizado. A pesar de esta diferencia,
los datos de comportamiento de reacción mostraban que los
procedimientos de preesterilización eran al menos tan productivos
como el procedimiento de la Fig. 1. Ventajas adicionales pueden
conseguirse en el procedimiento de la Fig. 2 mediante ciertas etapas
para reducir y controlar adicionalmente el tamaño de partícula, por
ejemplo, molienda en húmedo de canrenona esterilizada y/o
pasteurización en vez de esterilización.
Se preparó un cultivo de siembra de la manera
descrita en el Ejemplo 5. A las 20 horas, los micelios del
fermentador del inóculo eran pulposos con un PMV de 40%. Su pH era
5,4 y 14,8 gpl de glucosa permanecían sin usar.
Se preparó un medio de crecimiento de
transformación (35 l) que tenía la composición mostrada en la Tabla
20. En la preparación del medio de alimentación, glucosa y extracto
de levadura se esterilizaron separadamente y se mezclaron como una
sola alimentación a una concentración final de 30% en peso de
glucosa y 10% en peso de extracto de levadura. El pH de la
alimentación se ajustó hasta 5,7.
Usando este medio (Tabla 20), se realizaron dos
experimentos de bioconversión para la conversión de canrenona en
11\alpha-hidroxicanrenona. Cada uno de los
experimentos se efectuó en un fermentador de 60 l provisto de un
agitador que comprendía un propulsor de turbina de Rushton y dos
propulsores Lightnin' A315.
La carga inicial del medio de crecimiento al
fermentador eran 35 l. Canrenona micronizada y no esterilizada se
añadió hasta una concentración inicial de 0,5%. El medio en el
fermentador se inoculó con un cultivo de siembra preparado de la
manera descrita en el Ejemplo 5 con una relación de inoculación
inicial de 2,5%. La fermentación se llevó a cabo a una temperatura
de 28ºC, una velocidad de agitación de 200 a 500 rpm, una velocidad
de aireación de 0,5 vvm y una contrapresión suficiente para mantener
un nivel de oxígeno disuelto de al menos 20% en volumen. El cultivo
de transformación desarrollado durante el experimento de producción
estaba en la forma de pellas ovaladas muy pequeñas (aproximadamente
1-2 mm). Canrenona y nutrientes complementarios se
alimentaron en cadena al fermentador generalmente de la manera
descrita en el Ejemplo 1. Se realizaron adiciones de nutrientes
cada 4 horas en una relación de 3,4 g de glucosa y 0,6 g de extracto
de levadura por litro de caldo en el fermentador.
Se indican en la Tabla 31 la velocidad de
aireación, la velocidad de agitación, el oxígeno disuelto, el PMV y
el pH imperantes a intervalos indicados durante cada uno de los
experimentos de este Ejemplo, así como las adiciones de glucosa
realizadas durante la dosificación de la partida. La Tabla 32
muestra el perfil de conversión de canrenona. El experimento R11A
se terminó después de 46 horas. El experimento R11B continuaba
durante 96 horas. En el último experimento, se alcanzaba 93% de
conversión a las 81 horas; se realizaba una adición de alimentación
más a las 48 horas y a continuación se terminaba la alimentación.
Apréciese que se producía un cambio significativo en la viscosidad
entre el momento en el que la alimentación se detenía y el final del
experimento.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
\newpage
Se probaron diversos cultivos con respecto a la
eficacia en la bioconversión de canrenona en
11\alpha-hidroxicanrenona de acuerdo con los
métodos descritos generalmente anteriormente.
Un banco de células de trabajo de cada una de
Aspergillus niger ATCC 11394, Rhizopus arrhizus ATCC
11145 y Rhizopus stolonifer ATCC 6227b se preparó de la
manera descrita en el Ejemplo 5. Medio de crecimiento (50 ml) que
tenía la composición indicada en la Tabla 18 se inoculó con la
suspensión de esporas (1 ml) procedente del banco de células de
trabajo y se puso en una incubadora. Se preparó un cultivo de
siembra en la incubadora mediante fermentación a 26ºC durante
aproximadamente 20 horas. La incubadora se agitó a una velocidad de
200 rpm.
Partes alícuotas (2 ml) del cultivo de siembra
de cada microorganismo se usaron para inocular matraces de
transformación que contenían el medio de crecimiento (30 ml) de la
Tabla 18. Cada cultivo se usó para la inoculación de dos matraces,
un total de seis. Se disolvió canrenona (200 mg) en metanol (4 ml) a
36ºC y una parte alícuota de 0,5 ml de esta solución se introdujo
en cada uno de los matraces. La bioconversión se llevó a cabo
generalmente bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 5 con
adiciones de solución de glucosa al 50% en peso (1 ml) cada día.
Después de las primeras 72 horas se realizaron las siguientes
observaciones sobre el desarrollo de micelios en los matraces de
fermentación de transformación respectivos:
ATCC 11394 - buen crecimiento uniforme
ATCC 11145 - buen crecimiento en las primeras 48
horas, pero los micelios se agrupaban en una bola; sin creci-
{}\hskip2.6cm miento aparente en las últimas 24 horas
{}\hskip2.6cm miento aparente en las últimas 24 horas
ATCC 6227b - buen crecimiento; masa micelial que
forma una bola agrupada.
Se tomaron muestras del caldo para analizar la
extensión de la bioconversión. Después de tres días, la fermentación
que usaba ATCC 11394 proporcionaba una conversión en
11\alpha-hidroxicanrenona de 80 a 90%; ATCC 11145
proporcionaba una conversión de 50% y ATCC 6227b proporcionaba una
conversión de a 80 a 90%.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Usando substancialmente el método descrito en el
Ejemplo 15, los microorganismos adicionales se probaron con
respecto a la eficacia en la conversión de canrenona en
11\alpha-hidroxicanrenona. Los organismos probados
y los resultados de las pruebas se indican en la Tabla 33:
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\newpage
Diversos microorganismos se probaron con
respecto a la eficacia en la conversión de canrenona en
9\alpha-hidroxicanrenona. Los medios de
fermentación para los experimentos de este Ejemplo se prepararon
como se indica en la
Tabla 34:
Tabla 34:
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| Harina de habas de soja: | |
| \hskip0.5cm dextrosa | 20 g |
| \hskip0.5cm harina de habas de soja | 5 g |
| \hskip0.5cm NaCl | 5 g |
| \hskip0.5cm extracto de levadura | 5 g |
| \hskip0.5cm KH_{2}PO_{4} | 5 g |
| \hskip0.5cm agua | hasta 1 l |
| \hskip0.5cm pH | 7,0 |
| Peptona/extracto de levadura/glucosa | |
| \hskip0.5cm glucosa | 40 g |
| \hskip0.5cm bactopeptona | 10 g |
| \hskip0.5cm extracto de levadura | 5 g |
| \hskip0.5cm agua | hasta 1 l |
| Mueller-Hinton: | |
| \hskip0.5cm infusión de ternero | 300 g |
| \hskip0.5cm casaminoácidos | 17,5 g |
| \hskip0.5cm almidón | 1,5 g |
| \hskip0.5cm agua | hasta 1 l |
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Los hongos se hicieron crecer en medio de harina
de habas de soja y en peptona/extracto de levadura/glucosa; los
atinomicetos y las eubacterias se hicieron crecer en harina de habas
de soja (más 0,9% en peso de formiato Na para las
biotransformaciones) y en caldo de
Mueller-Hinton.
Los cultivos iniciadores se inocularon con
reservas de esporas congeladas (20 ml de harina de habas de soja en
un matraz Erlenmeyer de 250 ml). Los matraces se cubrieron con un
filtro para leche y se bioprotegieron. Los cultivos iniciadores (de
24 a 48 horas de antigüedad) se usaron para inocular cultivos
metabólicos (también 20 ml en un matraz Erlenmeyer de 250 ml) - con
un volumen de cruce de 10% a 15% - y los últimos se incubaron
durante de 24 a 48 horas antes de la adición de substrato esteroideo
para la reacción de transformación.
Se disolvió/suspendió canrenona en metanol (20
mg/ml), se esterilizó por filtración y se añadió a los cultivos
hasta una concentración final de 0,1 mg/ml. Todos los matraces de
fermentación de transformación se batieron a 250 rpm
(desplazamiento 5,1 cm (2 pulgadas)) en una cámara de temperatura
controlada a 26ºC y 60% de humedad.
Las biotransformaciones se recogieron a las 5 y
las 48 horas, o las 24 horas, después de la adición del substrato.
La recogida comenzaba con la adición de acetato de etilo (23 ml) o
cloruro de metileno al matraz de fermentación. Los matraces se
batieron a continuación durante 2 minutos y el contenido de cada
matraz se vertió en un tubo cónico de 50 ml. Para separar las
fases, los tubos se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 minutos en
una unidad a temperatura ambiente. La capa orgánica de cada tubo se
transfirió a un vial de vidrio de borosilicato de 20 ml y se
evaporó en un Speed Vac. Los viales se taparon y se almacenaron a
-20ºC.
Para obtener material para la determinación de
la estructura, las biotransformaciones aumentaron a escala hasta
500 ml incrementando el número de fermentaciones en matraz de
batimiento hasta 25. En el momento de la recogida (24 ó 48 horas
después de la adición de substrato), se añadió acetato de etilo a
cada matraz individualmente y los matraces se taparon y se pusieron
de nuevo en la batidora durante 20 minutos. Los contenidos de los
matraces se vertieron a continuación en botellas de polipropileno y
se centrifugaron para separar las fases, o en un embudo separador
en el que las fases se dejaban separar mediante gravedad. La fase
orgánica se secó, dando extractos en bruto de esteroides contenidos
en la mezcla de reacción.
\newpage
El producto de reacción se analizó en primer
lugar mediante cromatografía sobre placas (254 nm) con reverso
fluorescente de gel de sílice (250 \mum). Se añadió acetato de
etilo (500 \mul) a cada vial que contenía extracto de acetato de
etilo secado procedente de la mezcla de reacción. Se efectuaron
análisis adicionales mediante cromatografía líquida de alta
resolución y espectrometría de masas. Las placas se revelaron en un
medio de cloroformo/metanol 95:5 v/v.
Se efectuó un análisis adicional mediante
cromatografía líquida de alta resolución y espectrometría de masas.
Se usó una HPLC Waters con software Millennium, detector de serie de
fotodiodos y automuestreador. La HPLC en fase inversa usaba un
cartucho de 4 mm NovaPak C-18 (4 \mum de tamaño de
partícula) RadialPak. El gradiente de disolvente lineal de 25
minutos comenzaba con la columna iniciada en agua:acetonitrilo
(75:25) y terminaba con agua:acetonitrilo (25:75). Esto era seguido
por un gradiente de tres minutos hasta 100% de acetonitrilo y 4
minutos de lavado isocrático antes de la regeneración de la columna
en las condiciones iniciales.
Para LC/MS, se añadió acetato amónico tanto al
acetonitrilo como a las fases acuosas a una concentración de 2 nM.
La cromatografía no se veía afectada significativamente. El eluyente
de la columna se dividió 22:1, con la mayoría del material dirigida
al detector de PDA. El 4,5% restante del material se dirigió a la
cámara de ionización de electropulverización de un espectrómetro de
masas Sciex API III. La espectrometría de masas se efectuó en el
modo positivo. Una línea de datos analógicos procedente del detector
de PDA durante la HPLC transfería un cromatograma de una sola
longitud de onda al espectrómetro de masas para el coanálisis de los
datos de UV y MS.
Los patrones de fragmentación espectrométricos
de masas resultaban útiles al clasificar entre los substratos
hidroxilados. Las dos canrenonas hidroxiladas esperadas,
11\alpha-hidroxi y
9\alpha-hidroxi, perdían agua a diferentes
frecuencias de una manera consecuente que podía usarse como un
diagnóstico. Además, la 9\alpha-hidroxicanrenona
formaba un aducto de amonio más fácilmente que la
11\alpha-hidroxicanrenona. Se indica en la Tabla
35 un resumen de los datos de TLC, HPLC/UV y LC/MS para
fermentaciones de canrenona, mostrando que los microorganismos
probados eran eficaces en la bioconversión de canrenona en
9\alpha-hidroxicanrenona. De estos, el
microorganismo preferido era Corynespora cassiicola ATCC
16718.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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Se probaron diversos cultivos con respecto a la
eficacia en la bioconversión de androstenodiona en
11\alpha-hidroxiandrostenodiona de acuerdo con
los métodos descritos generalmente anteriormente.
Un banco de células de trabajo de cada una de
Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500); Aspergillus
niger ATCC 11394; Aspergillus nidulans ATCC 11267;
Rhizopus oryzae ATCC 11145; Rhizopus stolonifer ATCC
6227b; Trichothecium roseum ATCC 12519 y ATCC 8685 se
preparó esencialmente de la misma manera descrita en el Ejemplo 4.
Medio de crecimiento (50 ml) que tenía la composición dada en la
Tabla 18 se inoculó con una suspensión de esporas (1 ml) procedente
del banco de células de trabajo y se puso en una incubadora. Se
preparó un cultivo de siembra en la incubadora mediante
fermentación a 26ºC durante aproximadamente 20 horas. La incubadora
se agitó a una velocidad de 200 rpm.
Partes alícuotas (2 ml) del cultivo de siembra
de cada microorganismo se usaron para inocular matraces de
transformación que contenían el medio de crecimiento (30 ml) de la
Tabla 15. Cada cultivo se usó para la inoculación de dos matraces,
un total de 16. Se disolvió androstenodiona (300 mg) en metanol (6
ml) a 36ºC y una parte alícuota de 0,5 ml de esta solución se
introdujo en cada uno de los matraces. La bioconversión se llevó a
cabo generalmente bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 6
durante 48 horas. Después de 48 horas, las muestras del caldo se
reunieron y se extrajeron con acetato de etilo como en el Ejemplo
17. El acetato de etilo se concentró mediante evaporación y las
muestras se analizaron mediante cromatografía en capa fina para
determinar si estaba presente un producto que tenía una movilidad
cromatográfica similar a la del patrón de
11\alpha-hidroxiandrostenodiona (Sigma Chemical
Co., St. Louis). Los resultados se muestran en la Tabla 36. Los
resultados positivos se indican como "+".
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Los datos de la Tabla 36 demuestran que cada uno
de los cultivos listados era capaz de producir un compuesto a
partir de androstenodiona que tenía el mismo valor de Rf que el del
patrón de 11\alpha-hidroxiandrostenodiona.
Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC
18500) se probó de nuevo mediante el mismo procedimiento descrito
anteriormente y los productos de cultivo se aislaron y se
purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice en
fase normal usando metanol como disolvente. Las fracciones se
analizaron mediante cromatografía en capa fina. Las placas de TLC
eran gel de sílice 60\ring{A} Whatman K6F, tamaño 10 x 20, 250
\mu de grosor. El sistema disolvente era metanol:cloroformo 5:95
v/v. El producto cristalizado y el patrón de
11\alpha-hidroxiandrostenodiona se analizaron
ambos mediante espectroscopía de LC-MS y NMR. Ambos
compuestos daban perfiles y pesos moleculares similares.
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Se probaron diversos microorganismos con
respecto a la eficacia en la conversión de mexrenona en
11\beta-hidroximexrenona. Los medios de
fermentación para este ejemplo se prepararon como se describe en la
Tabla 34.
Las condiciones de fermentación y los métodos
analíticos eran los mismos que los del Ejemplo 17. Las placas de
TLC y el sistema disolvente eran como los descritos en el Ejemplo
18. La explicación razonada para el análisis cromatográfico es como
sigue: la 11\alpha-hidroximexrenona y la
11\alpha-hidroxicanrenona tienen la misma
movilidad cromatográfica. La
11\alpha-hidroxicanrenona y la
9\alpha-hidroxicanrenona exhiben el mismo patrón
de movilidad que la
11\alpha-hidroxiandrostenodiona y la
11\beta-hidroxiandrostenodiona. Por lo tanto, la
11\beta-hidroximexrenona debe tener la misma
movilidad que la 9\alpha-hidroxicanrenona. Por lo
tanto, los compuestos extraídos del medio de crecimiento se
analizaron frente a 9\alpha-hidroxicanrenona como
patrón. Los resultados se muestran en la Tabla 37.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(Continuación)
Estos datos sugieren que la mayoría de los
organismos listados en esta tabla producen un producto similar o
idéntico a 11\beta-hidroximexrenona a partir de
mexrenona.
Esquema 1: Etapa
1
A un reactor vitrificado de 189 l (50 galones)
se cargaron 61,2 g de (57,8 kg) de DMF seguido por 23,5 kg de
11-hidroxicanrenona 1 con remoción. Se añadieron a
la mezcla 7,1 kg de cloruro de litio. La mezcla se agitó durante 20
minutos y se cargaron 16,9 kg de acetonacianhidrina seguido por 5,1
kg de trietilamina. La mezcla se calentó hasta 85ºC y se mantuvo a
esta temperatura durante 13-18 horas. Después de la
reacción, se añadieron 353 l de agua seguidos por 5,6 kg de
bicarbonato sódico. La mezcla se enfrió hasta 0ºC, se transfirió a
un reactor vitrificado de 756 l (200 galones) que se extinguió con
130 kg de solución de hipoclorito sódico al 6,7% lentamente. El
producto se filtró y se lavó con porciones de 3 x 40 l de agua para
dar 21,4 kg de la enamina obtenida como producto.
Esquema 1: Etapa
2
Se cargaron en un reactor vitrificado de 756 l
(200 galones) 50 kg de la enamina 2, aproximadamente 445 l de ácido
clorhídrico diluido 0,8N y 75 l de metanol. La mezcla se calentó
hasta 80ºC durante 5 horas y se enfrió hasta 0ºC durante 2 horas.
El producto sólido se filtró para dar 36,5 kg de dicetona obtenida
como producto seca.
Esquema 1: Etapa
3A
Un matraz de fondo redondo de 5 l de 4 bocas se
equipó con removedor mecánico, embudo de adición de igualación de
presión con tubo de entrada de nitrógeno, termómetro y condensador
con burbujeador. El burbujeador se conectó a través de un tubo de
Tygon a dos separadores de 2 l, el primero de los cuales estaba
vacío y se situaba para evitar la resucción del material en el
segundo separador (1 l de solución concentrada de hipoclorito
sódico) hacia el recipiente de reacción. La dicetona 3 (79,50 g;
[peso no corregido con respecto a la pureza, que era 85%]) se
añadió al matraz en 3 l de metanol. Una solución metanólica de
metóxido sódico al 25% (74,83 g) se puso en el embudo y se añadió
gota a gota, con remoción bajo nitrógeno, durante un período de 10
minutos. Después de que la adición fuera completa, la mezcla de
reacción amarilla anaranjada se calentó hasta reflujo durante 20
horas. Después de este período, se añadieron 167 ml de HCl 4N
(¡Precaución: desprendimiento de HCN en este punto!) gota a gota a
través del embudo de adición a la mezcla de reacción todavía a
reflujo. La mezcla de reacción se aclaraba en color hasta un
naranja dorado claro. El condensador se reemplazó a continuación
por una columna de separación y 1,5 l de metanol se retiraron
mediante destilación mientras 1,5 l de agua se añadían
simultáneamente al matraz a través del embudo, de acuerdo con la
velocidad de destilación. La mezcla de reacción se enfrió hasta
temperatura ambiente y se extrajo dos veces con partes alícuotas de
2,25 l de cloruro de metileno. Los extractos combinados se lavaron
sucesivamente con partes alícuotas de 750 ml de solución saturada
de NaCl fría, NaOH 1N y de nuevo con NaCl saturado. La capa orgánica
se secó sobre sulfato sódico durante la noche, se filtró y se
redujo en volumen hasta -250 ml a vacío. Se añadió tolueno (300 ml)
y el cloruro de metileno restante se separó por arrastre bajo
presión reducida, tiempo durante el cual el producto comenzaba a
formarse sobre las paredes del matraz como un sólido blanco. El
contenido del matraz se enfrió durante la noche y el sólido se
retiró mediante filtración. Se lavó con 250 ml de tolueno y dos
veces con partes alícuotas de 250 ml de éter y se secó sobre un
embudo de vacío para dar 58,49 g de sólido blanco que era 97,3%
puro mediante HPLC. Al concentrar las aguas madres, se obtenían 6,76
g adicionales de producto puro al 77,1%. El rendimiento total,
ajustado para la pureza, era 78%.
Esquema 1: Etapa
3B
Un matraz de 4 bocas de 5 l se equipó como en el
ejemplo anterior, excepto que no se instaló sistema de separación
más allá del burbujeador. Una cantidad de 138,70 g del hidroxiéster
se añadió al matraz, seguido por 1425 ml de cloruro de metileno,
con agitación bajo nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió hasta
-5ºC usando un baño de sal/hielo. Se añadió rápidamente cloruro de
metanosulfonilo (51,15 g, 0,447 mol), seguido por la lenta adición
gota a gota de trietilamina (54,37 g) en 225 ml de cloruro de
metileno. La adición, que requería -30 minutos, se ajustó de modo
que la temperatura de la reacción nunca excediera aproximadamente
5ºC. La remoción se continuó durante una hora después de la adición
y el contenido de la reacción se transfirió a un embudo separador
de 12 l, al que se añadían 2100 ml de cloruro de metileno. La
solución se lavó sucesivamente con partes alícuotas de 700 ml de
cada uno de HCl 1N frío, NaOH 1N y solución saturada de NaCl. Los
lavados acuosos se combinaron y reextrajeron con 3500 ml de cloruro
de metileno. Todos los lavados orgánicos se combinaron en una jarra
de 9 l, a la que se añadieron 500 g de alúmina neutra, grado de
actividad II, y 500 g de sulfato sódico anhidro. El contenido de la
jarra se mezcló bien durante 30 minutos y se filtró. El filtrado se
llevó hasta sequedad a vacío para dar una espuma amarilla gomosa.
Esta se disolvió en 350 ml de cloruro de metileno y se añadieron
gota a gota con remoción 1800 ml de éter. La velocidad de adición se
ajustó de modo que aproximadamente la mitad del éter se añadiera
durante 30 minutos. Después de que se hubieran añadido
aproximadamente 750 ml, el producto empezó a separarse como un
sólido cristalino. El éter restante se añadió en 10 minutos. El
sólido se retiró mediante filtración y la torta filtrante se lavó
con 2 l de éter y se secó en un horno de vacío a 50ºC durante la
noche, para dar 144,61 g (88%) de sólido casi blanco, p.f.
149-150ºC. El material preparado de este modo es
típicamente 98-99% puro mediante HPLC (% de área).
En un experimento, se obtuvo material que tenía un punto de fusión
de 153-153,5ºC, con una pureza, según se determinaba
mediante el área de HPLC, de 99,5%.
Esquema 1: Etapa 3C: Método
A
Un matraz de cuatro bocas de 1 l se equipó como
en el segundo ejemplo. Se añadieron al matraz ácido fórmico (250
ml) y anhídrido acético (62 ml) con remoción bajo nitrógeno. Se
añadió formiato potásico (6,17 g) y la mezcla de reacción se
calentó con un baño de aceite hasta una temperatura interna de 40ºC
(esto se repitió más tarde a 70ºC con mejores resultados) durante
16 horas. Después de 16 horas, el mesilato 5 se añadió y la
temperatura interna se incrementó hasta 100ºC. El calentamiento y la
remoción se continuaron durante 2 horas, después de las cuales el
disolvente se retiró a vacío en un evaporador giratorio. El residuo
se agitó con 500 ml de agua de hielo durante 15 minutos y a
continuación se extrajo dos veces con partes alícuotas de 500 ml de
acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron
sucesivamente con partes alícuotas de 250 ml de solución saturada
de cloruro sódico (dos veces), solución de hidróxido sódico 1N y de
nuevo con cloruro sódico saturado. La fase orgánica se secó a
continuación sobre sulfato sódico, se filtró y se llevó hasta
sequedad a vacío para dar una espuma blanca amarillenta, que se
pulverizaba hasta un vidrio cuando se tocaba con una espátula. El
polvo que se formaba, 14,65 g, se analizó como una mezcla de 82,1%
de 6, 7,4% de 8 y 5,7% de 9 (mediante el % de área de HPLC).
Esquema 1: Etapa 3C: Método
B
Un matraz de fondo redondo de 5 l se equipó como
en el ejemplo anterior y 228,26 g de ácido acético y 41,37 g de
acetato sódico se añadieron con remoción bajo nitrógeno. Usando un
baño de aceite, la mezcla se calentó hasta una temperatura interna
de 100ºC. Se añadió el mesilato (123,65 g) y el calentamiento se
continuó durante treinta minutos. Al final de este período, el
calentamiento se detuvo y se añadieron 200 ml de agua de hielo. La
temperatura caía hasta 40ºC y la remoción se continuó durante 1
hora, después de la cual la mezcla de reacción se vertió lentamente
en 1,5 l de agua fría en un matraz removido de 5 l. El producto se
separó como un aceite gomoso. El aceite se disolvió en 1 l de
acetato de etilo y se lavó con 1 l de cada uno de solución saturada
fría de cloruro sódico, hidróxido sódico 1N y finalmente de nuevo
cloruro sódico saturado. La fase orgánica se secó sobre sulfato
sódico y se filtró. El filtrado se llevó hasta sequedad a vacío para
dar una espuma que colapsaba hasta un aceite gomoso. Este se
trituró con éter durante algún tiempo y finalmente se solidificó.
El sólido se filtró y se lavó con más éter para proporcionar 79,59 g
de un sólido amarillo-blanco. Este consistía en
70,4% del \Delta^{9,10}-enéster 6 deseado, 12,3%
del \Delta^{11,12}-enéster 8, 10,8% de la
7\alpha,9\alpha-lactona 9 y 5,7% de 5 sin
reaccionar.
Esquema 1: Etapa
3D
Un reactor de 500 ml de 4 bocas con camisa se
equipó con removedor mecánico, condensador/burbujeador, termómetro
y embudo de adición con tubo de entrada de nitrógeno. El reactor se
cargó con 8,32 g del enéster en bruto en 83 ml de cloruro de
metileno, con remoción bajo nitrógeno. A esto se añadieron 4,02 g de
fosfato potásico dibásico, seguido por 12 ml de
tricloroacetonitrilo. Agua de enfriamiento externa se hizo pasar a
través de la camisa del reactor y la mezcla de reacción se enfrió
hasta 8ºC. Se añadieron al embudo de adición 36 ml de peróxido de
hidrógeno al 30% durante un período de 10 minutos. La mezcla de
reacción inicialmente de color amarillo claro se volvía casi
incolora después de que la adición fuera completa. La mezcla de
reacción permanecía a 9 \pm 1ºC a lo largo de la adición y
durante la remoción nocturna continuada (23 horas totales). Se
añadió cloruro de metileno (150 ml) a la mezcla de reacción y todo
el contenido se añadió a -250 ml de agua de hielo. Esto se extrajo
tres veces con partes alícuotas de 150 ml de cloruro de metileno.
Los extractos de cloruro de metileno combinados se lavaron con 400
ml de solución fría de sulfito sódico al 3% para descomponer
cualquier peróxido residual. Esto fue seguido por un lavado de 330
ml de hidróxido sódico 1N frío, un lavado de 400 ml de ácido
clorhídrico 1N frío y finalmente un lavado con 400 ml de salmuera.
La fase orgánica se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y la
torta filtrante se lavó con 8 ml de cloruro de metileno. El
disolvente se retiró a vacío para dar 9,10 g de producto en bruto
como un sólido amarillo claro. Este se recristalizó en -25 ml de
2-butanona para dar 5,52 g de cristales casi
blancos. Una recristalización final en acetona (-50 ml) daba 3,16 g
de cristales aciculares largos, pf 241-243ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema 1: Etapa 3: Opción
1
Se cargó dicetona (20 g) a un reactor limpio y
secado, seguido por la adición de 820 ml de MeOH y 17,6 ml de
solución de NaOMe al 25%/MeOH. La mezcla de reacción se calentó
hasta una condición de reflujo (-67ºC) durante
16-20 horas. El producto se extinguió con 40 ml de
HCl 4N. El disolvente se retiró a presión atmosférica mediante
destilación. Se añadieron 100 ml de tolueno y el metanol residual se
retiró mediante destilación azeotrópica con tolueno. Después de la
concentración, el hidroxiéster 4 en bruto se disolvió en 206 ml de
cloruro de metileno y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió cloruro de
metanosulfonilo (5 ml) seguido por una adición lenta de 10,8 ml de
trietilamina. El producto se agitó durante 45 minutos. El disolvente
se retiró mediante destilación a vacío para dar el mesilato 5 en
bruto.
En un reactor secado separado se añadieron 5,93
g de formiato potásico, 240 ml de ácido fórmico y seguido por 118
ml de anhídrido acético. La mezcla se calentó hasta 60ºC durante 4
horas.
La mezcla de ácido fórmico se añadió a la
solución de mesilato concentrado 5 preparada anteriormente. La
mezcla se calentó hasta 95-105ºC durante 2 horas.
La mezcla obtenida como producto se enfrió hasta 50ºC y los
componentes volátiles se retiraron mediante destilaciones a vacío a
50ºC. El producto se sometió a reparto entre 275 ml de acetato de
etilo y 275 ml de agua. La capa acuosa se reextrajo con 137 ml de
acetato de etilo, se lavó con 240 ml de solución fría de hidróxido
sódico 1N y a continuación 120 ml de NaCl saturado. Después de la
separación de fases, la capa orgánica se concentró bajo destilación
a vacío para dar el enéster en bruto.
El producto se disolvió en 180 ml de cloruro de
metileno y se enfrió hasta de 0 a 15ºC. Se añadieron 8,68 g de
hidrogenofosfato dipotásico seguido por 2,9 ml de
tricloroacetonitrilo. Una solución de 78 ml de peróxido de
hidrógeno al 30% se añadió a la mezcla durante un período de 3
minutos. La mezcla de reacción se agitó a 0-15ºC
durante 6-24 horas. Después de la reacción, la
mezcla bifásica se separó. La capa orgánica se lavó con 126 ml de
solución de sulfito sódico al 3%, 126 ml de solución de hidróxido
sódico 0,5N, 126 ml de ácido clorhídrico 1N y 126 ml de salmuera al
10%. El producto se secó sobre sulfato magnésico anhidro o se filtró
sobre Celite y el disolvente cloruro de metileno se retiró mediante
destilación a presión atmosférica. El producto se cristalizó en
metil-etil-cetona dos veces para dar
7,2 g de eplerenona.
\newpage
Esquema 1: Etapa 3: Opción
2
Un matraz de fondo redondo de 5 l de 4 bocas se
equipó con removedor mecánico, embudo de adición con tubo de
entrada de nitrógeno, termómetro y condensador con burbujeador unido
a un lavador de hipoclorito sódico. La dicetona (83,20 g) se añadió
al matraz en 3,05 de metanol. El embudo de adición se cargó con
67,85 g de una solución al 25% (p:p) de metóxido sódico en metanol.
Con remoción bajo nitrógeno, el metóxido se añadió gota a gota al
matraz durante un período de 15 minutos. Se desarrolló una
suspensión naranja/amarilla oscura. La mezcla de reacción se
calentó hasta reflujo durante 20 horas y se añadieron gota a gota
175 ml de ácido clorhídrico 4N mientras el reflujo continuaba.
(¡Precaución, desprendimiento de HCN durante esta operación!). El
condensador de reflujo se reemplazó por una columna de separación y
1,6 l de metanol se retiraron mediante destilación mientras 1,6 l
de solución acuosa de cloruro sódico al 10% se añadían gota a gota a
través del embudo, a una velocidad para adaptarse a la velocidad de
destilación. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura
ambiente y se extrajo dos veces con 2,25 l de partes alícuotas de
cloruro de metileno. Los extractos combinados se lavaron con partes
alícuotas frías de 750 ml de hidróxido sódico 1N y solución saturada
de cloruro sódico. La capa orgánica se secó mediante destilación
azeotrópica del metanol a una atmósfera, hasta un volumen final de 1
l (0,5% del total se retiraba para el análisis).
La solución orgánica (hidroxiéster) concentrada
se añadió de nuevo al matraz de reacción original equipado como
anteriormente, pero sin el separador de HCl. El matraz se enfrió
hasta 0ºC y se añadieron 30,7 g de cloruro de metanosulfonilo con
agitación bajo nitrógeno. El embudo de adición se cargó con 32,65 g
de trietilamina, que se añadió gota a gota durante un período de 15
minutos, manteniendo la temperatura a 5ºC. La agitación se continuó
durante 2 horas, mientras que la mezcla de reacción se calentaba
hasta temperatura ambiente. Una columna que consistía en 250 g de
resina de intercambio iónico ácida Dowex 50 W x
8-100 se preparó y se lavó antes de usar con 250 ml
de agua, 250 ml de metanol y 500 ml de cloruro de metileno. La
mezcla de reacción se hizo pasar descendentemente por esta columna
y se recogió. Se preparó una columna reciente y el procedimiento
anterior se repitió. Una tercera columna de 250 g, que consistía en
resina de intercambio iónico básica Dowex 1 x
8-200, se preparó y se pretrató como en el
tratamiento de la resina ácida descrito anteriormente. La mezcla de
reacción se hizo pasar descendentemente por esta columna y se
recogió. Se preparó una cuarta columna de la resina básica y la
mezcla de reacción de nuevo se hizo pasar descendentemente por la
columna y se recogió. Cada pasada por la columna era seguida por
dos lavados de 250 ml de cloruro de metileno por la columna, y cada
pasada requería \sim10 minutos. Los lavados con disolvente se
combinaron con la mezcla de reacción y el volumen se redujo a vacío
hasta \sim500 ml y 2% de esto se retiró para qc. El resto se
redujo adicionalmente hasta un volumen final de 150 ml (solución de
mesilato en bruto).
Al dispositivo de reacción original de 5 l se
añadieron 960 ml de ácido fórmico, 472 ml de anhídrido acético y
23,70 g de formiato potásico. Esta mezcla se calentó con agitación
bajo vacío hasta 70ºC durante 16 horas. La temperatura se
incrementó a continuación hasta 100ºC y la solución de mesilato en
bruto se añadió durante un período de 30 minutos a través del
embudo de adición. La temperatura caía hasta 85ºC a medida que el
cloruro de metileno se separaba por destilación de la mezcla de
reacción. Después de que la totalidad de él se hubiera retirado, la
temperatura ascendió de nuevo hasta 100ºC y se mantuvo así durante
2,5 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta 40ºC y el ácido
fórmico se retiró bajo presión hasta que se había alcanzado el
volumen de remoción mínimo (-150 ml). El residuo se enfrió hasta
temperatura ambiente y se añadieron 375 ml de cloruro de metileno.
El residuo diluido se lavó con porciones frías de 1 l de solución
saturada de cloruro sódico, carbonato sódico 1N y de nuevo con
solución de cloruro sódico. La fase orgánica se secó sobre sulfato
magnésico (150 g) y se filtró para dar una solución parda rojiza
oscura (solución de enéster en bruto).
Un reactor de 1l de 4 bocas con camisa se equipó
con removedor mecánico, condensador/burbujeador, termómetro y
embudo de adición con tubo de entrada de nitrógeno. El reactor se
cargó con la solución de enéster en bruto (60 g estimados) en 600
ml de cloruro de metileno, con remoción bajo nitrógeno. Se añadieron
a esto 24,0 g de fosfato potásico dibásico, seguido por 87 ml de
tricloroacetonitrilo. Agua de enfriamiento externa se hizo pasar a
través de la camisa del reactor y la mezcla de reacción se enfrió
hasta 10ºC. Al embudo de adición se añadieron 147 ml de peróxido de
hidrógeno al 30% durante un período de 30 minutos. La mezcla de
reacción inicialmente de color pardo rojizo oscuro se volvía
amarilla clara después de que la adición fuera completa. La mezcla
de reacción permanecía a 10 \pm 1ºC a través de la adición y
durante la remoción nocturna continuada (23 horas totales). Las
fases se separaron y la porción acuosa se extrajo dos veces con
porciones de 120 ml de cloruro de metileno. Las fases orgánicas
combinadas se lavaron a continuación con 210 ml de solución de
sulfito sódico al 3%. Esto se repitió una segunda vez, después de lo
cual las partes tanto orgánica como acuosa eran negativas con
respecto al peróxido mediante el papel de ensayo de almidón/yoduro.
La fase orgánica se lavó sucesivamente con partes alícuotas de 210
ml de hidróxido sódico 1N frío, ácido clorhídrico 1N y finalmente
dos lavados con salmuera. La fase orgánica se secó azeotrópicamente
hasta un volumen de \sim100 ml, se añadió disolvente reciente
(250 ml) y se destiló azeotrópicamente hasta los mismos 100 ml y el
disolvente restante se retiró a vacío para dar 57,05 g de producto
en bruto como una espuma amarilla gomosa. Una porción (51,01 g) se
secó adicionalmente hasta un peso constante de 44,3 g y se analizó
cuantitativamente mediante HPLC. Se probó en 27,1% de EPX.
11\alpha-Hidroxiandrostenodiona
(429,5 g) e hidrato de ácido toluenosulfónico (7,1 g) se cargaron a
un matraz de reacción bajo nitrógeno. Se añadió etanol (2,58 l) al
reactor y la solución resultante se enfrió hasta 5ºC. Se añadió
ortoformiato de trietilo (334,5 g) a la solución durante un período
de 15 minutos a de 0ºC a 15ºC. Después de que la adición de
ortoformiato de trietilo fuera completa, la mezcla de reacción se
calentó hasta 40ºC y se hizo reaccionar a esa temperatura durante 2
horas, después de las cuales la temperatura se incrementó hasta
reflujo y la reacción continuó bajo reflujo durante 3 horas
adicionales. La mezcla de reacción se enfrió bajo vacío y el
disolvente se retiró bajo vacío para dar
3-etoxiandrosta-3,5-dien-17-ona.
Se puso cianuro sódico (1,72 g) en un matraz de
3 bocas de 25 ml equipado con un removedor mecánico. Se añadió agua
(2,1 ml) y la mezcla se removió con calentamiento hasta que los
sólidos se disolvían. Se añadió dimetilformamida (5 ml) seguido por
11\alpha-hidroxicanrenona (5,0 g). Una mezcla de
agua (0,4 ml) y ácido sulfúrico (1,49 g) se añadió a la mezcla. La
mezcla se calentó hasta 85ºC durante 2,5 horas, momento en el cual
el análisis por HPLC mostraba la conversión completa en producto.
La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente. Se
añadió ácido sulfúrico (0,83 g) y la mezcla se agitó durante media
hora. La mezcla de reacción se añadió a 60 ml de agua enfriada en
un baño de hielo. El matraz se lavó con 3 ml de DMF y 5 ml de agua.
La suspensión se agitó durante 40 min y se filtró. La torta
filtrante se lavó dos veces con 40 ml de agua y se secó en un horno
de vacío a 60ºC durante la noche para dar la
11\alpha-hidroxienamina, es decir,
5'R(5'\alpha),7'\beta-20'-aminohexadecahidro-11'\beta-hidroxi-10'\alpha,13'\alpha-dimetil-3',5-dioxoespiro[furano-2(3H),17'\alpha(5'H)-[7,4]meteno[4H]ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo
4,9 g).
Se añadió cianuro sódico (1,03 g) a un matraz de
3 bocas de 50 ml equipado con un removedor mecánico. Se añadió agua
(1,26 ml) y el matraz se calentó ligeramente para disolver el
sólido. Se añadió dimetilacetamida [o dimetilformamida] (9 ml)
seguida por 11\alpha-hidroxicanrenona (3,0 g). Una
mezcla de ácido sulfúrico (0,47 ml) y agua (0,25 ml) se añadió al
matraz de reacción mientras se removía. La mezcla se calentó hasta
95ºC durante 2 horas. El análisis por HPLC indicaba que la reacción
era completa. Se añadió ácido sulfúrico (0,27 ml) y la mezcla se
agitó durante 30 min. Se introdujeron agua (25 ml) y ácido sulfúrico
(0,90 ml) adicionales y la mezcla de reacción se agitó durante 16
horas. La mezcla se enfrió a continuación en un baño de hielo hasta
5-10ºC. El sólido se aisló filtrando a través de un
filtro de vidrio sinterizado seguido por lavado dos veces con agua
(20 ml). La dicetona sólida, es decir,
4'S(4'\alpha),7'\alpha-hexadecahidro-11\alpha-hidroxi-10'\beta,13'\beta-dimetil-3',5,20'-trioxoespiro[furano-2(3H),17'\beta-[4,7]metano[17H]ciclopenta[a]fenantreno]-5'\beta(2'H)-carbonitrilo,
se secó en un horno de vacío para dar 3,0 g de un sólido.
Una suspensión de 5,0 g de la dicetona producida
de la manera descrita en el Ejemplo 31 en metanol (100 ml) se
calentó hasta reflujo y una solución al 25% de metóxido potásico en
metanol (5,8 ml) se añadió durante 1 min. La mezcla se hacía
homogénea. Después de 15 min, estaba presente un precipitado. La
mezcla se calentó a reflujo y de nuevo se volvía homogénea después
de aproximadamente 4 horas. El calentamiento a reflujo se continuó
durante un total de 23,5 horas y se añadió HCl 4,0N (10 ml). Un
total de 60 ml de una solución de cianuro de hidrógeno en metanol
se retiró mediante destilación. Se añadió agua (57 ml) al residuo de
destilación durante 15 min. La temperatura de la solución se elevó
hasta 81,5ºC durante la adición de agua y 4 ml adicionales de
solución de cianuro de hidrógeno/metanol se retiraron mediante
destilación. Después de que la adición de agua fuera completa, la
mezcla se volvía turbia y la fuente de calor se retiraba. La mezcla
se agitó durante 3,5 horas y el producto cristalizó lentamente. La
suspensión se filtró y el sólido recogido se lavó con agua, se secó
en una corriente de aire sobre el embudo y se secó a 92ºC (660 mm
[26 pulgadas] de Hg) durante 16 horas para dar 2,98 g de un sólido
blanquecino. El sólido era 9,14% del hidroxiéster, es decir
\gamma-lactona de
11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato
de metilhidrógeno, en peso. El rendimiento era 56,1%.
La dicetona preparada de la manera descrita en
el Ejemplo 31 se cargó a un matraz de reacción de 3 bocas limpiado
y secado equipado con un termómetro, un separador de Dean Stark y un
removedor mecánico. Se cargó metanol (24 ml) al reactor a
temperatura ambiente (22ºC) y la suspensión resultante se removió
durante 5 min. Una solución al 25% en peso de metóxido sódico en
metanol (52,8 ml) se cargó al reactor y la mezcla se agitó durante
10 minutos a temperatura ambiente, durante los cuales la mezcla de
reacción se convertía en una solución transparente de color pardo
claro y se observaba una ligera exoterma (2-3ºC). La
velocidad de adición se controló para evitar que la temperatura de
la vasija superara 30ºC. La mezcla se calentó posteriormente hasta
condiciones de reflujo (aproximadamente 67ºC) y se continuó bajo
reflujo durante 16 horas. A continuación, una muestra se recogió y
se analizó mediante HPLC con respecto a la conversión. La reacción
se continuó bajo reflujo hasta que la dicetona residual no era más
de 3% de la carga de dicetona. Durante el reflujo, HCl 4N (120 ml)
se cargó a la vasija de reacción dando como resultado la generación
de HCN que se extinguió en un lavador.
Después de la conclusión de la reacción,
90-95% del metanol disolvente se separó por
destilación de la mezcla de reacción a presión atmosférica. La
temperatura de la columna durante la destilación variaba de
67-75ºC y el destilado que contenía HCN se trató
con sosa cáustica y lejía antes de la eliminación. Después de la
retirada del metanol, la mezcla de reacción se enfrió hasta
temperatura ambiente, empezando a precipitar producto sólido cuando
la mezcla se enfriaba en el intervalo de 40-45ºC.
Una solución acuosa que contenía opcionalmente 5% en peso de
bicarbonato sódico (1200 ml) a 25ºC se cargó a la suspensión
enfriada y la mezcla resultante se enfrió a continuación hasta 0ºC
en aproximadamente 1 h. El tratamiento con bicarbonato sódico era
eficaz para eliminar dicetona sin reaccionar residual de la mezcla
de reacción. La suspensión se agitó a 0ºC durante 2 h para
completar la precipitación y la cristalización, después de lo cual
el producto sólido se recuperó mediante filtración y la torta
filtrante se lavó con agua (100 ml). El producto se secó a
80-90ºC bajo vacío de 660 mm (26 pulgadas) de
mercurio hasta peso constante. El contenido de agua después del
secado era menor que 0,25%. El rendimiento molar ajustado era
alrededor de 77-80% en peso.
La dicetona que se preparaba de acuerdo con el
Ejemplo 31 (1 equivalente) se hizo reaccionar con metóxido sódico
(4,8 equivalentes) en un metanol disolvente en presencia de óxido de
zinc (1 equivalente). El tratamiento del producto de reacción puede
estar bien de acuerdo con el procedimiento extractivo descrito aquí
o bien ser mediante un procedimiento no extractivo en el que se
eliminan extracciones con cloruro de metileno, lavados con salmuera
y sosa cáustica y etapas de secado con sulfato sódico. Además, en el
procedimiento no extractivo, el tolueno se reemplazaba por solución
de bicarbonato sódico al 5% en peso.
El hidroxiéster preparado mediante el Ejemplo 34
(1,97 g) se combinó con tetrahidrofurano (20 ml) y la mezcla
resultante se enfrió hasta -70ºC. Se añadió cloruro de sulfurilo
(0,8 ml) y la mezcla se agitó durante 30 min, después de lo cual se
añadió imidazol (1,3 g). La mezcla de reacción se calentó hasta
temperatura ambiente y se agitó durante 2 h adicionales. La mezcla
se diluyó a continuación con cloruro de metileno y se extrajo con
agua. La capa orgánica se concentró para dar enéster en bruto (1,97
g). Una pequeña muestra del producto en bruto se analizó mediante
HPLC. El análisis mostraba que la relación de
9,11-olefina:11,12-olefina:7,9-lactona
era 75,5:7,2:17,3. Cuando se llevaba a cabo a 0ºC pero por lo demás
como se describe anteriormente, la reacción daba un producto en el
que la distribución de
9,11-olefina:11,12-olefina:7,9-lactona
era 77,6:6,7:15,7. Este procedimiento combina en una etapa la
introducción de un grupo de salida y la eliminación del mismo para
la introducción de la estructura 9,11-olefínica del
enéster, es decir la reacción con cloruro de sulfurilo hace que el
grupo 11\alpha-hidroxi del hidroxiéster de Fórmula
V se reemplace por haluro y eso es seguido por deshidrohalogenación
hasta la estructura \Delta-9,11. Así, la formación
del enéster se efectúa sin el uso de un ácido fuerte (tal como
fórmico) o un agente de secado tal como anhídrido acético. También
se elimina la etapa de reflujo del procedimiento alternativo que
genera monóxido de carbono.
El hidroxiéster (20 g) preparado mediante el
Ejemplo 34 y cloruro de metileno (400 ml) se añadieron a un matraz
de fondo redondo de 3 bocas limpio y seco equipado con un removedor
mecánico, embudo de adición y termopar. La mezcla resultante se
removió a temperatura ambiente hasta que se obtenía una solución
completa. La solución se enfrió hasta 5ºC usando un baño de hielo.
Se añadió cloruro de metanosulfonilo (5 ml) a la solución de
CH_{2}Cl_{2} que contenía el hidroxiéster, seguido rápidamente
por la lenta adición gota a gota de trietilamina (10,8 ml). La
velocidad de adición se ajustó de modo que la temperatura de la
reacción no superara 5ºC. La reacción era muy exotérmica; por lo
tanto era necesario enfriamiento. La mezcla de reacción se agitó a
aproximadamente 5ºC durante 1 h. Cuando la reacción era completa
(análisis de HPLC y TLC), la mezcla se concentró a aproximadamente
0ºC bajo vacío de 660 mm (26 pulgadas) de Hg hasta que se convertía
en una suspensión espesa. La suspensión resultante se diluyó con
CH_{2}Cl_{2} (160 ml) y la mezcla se concentró a aproximadamente
0ºC bajo vacío de 660 mm (26 pulgadas) de Hg para obtener un
concentrado. Se encontró que la pureza del concentrado (producto de
mesilato de Fórmula IV en la que R^{3} = H y -A-A-
y -B-B- son ambos
-CH_{2}-CH_{2}-, es decir
\gamma-lactona de
11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato
de metilhidrógeno con respecto a \gamma-lactona
de
17\alpha-hidroxi-11\alpha-(metilsulfonil)oxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato
de metilhidrógeno) era 82% (% de área de HPLC). Este material se
usó para la siguiente reacción sin aislamiento.
Se añadieron formiato potásico (4,7 g), ácido
fórmico (16 ml) y anhídrido acético (8 ml, 0,084 mol) a un reactor
limpio y seco equipado con removedor mecánico, condensador, termopar
y manta calentadora. La solución resultante se calentó hasta 60ºC y
se agitó durante aproximadamente 4-8 horas. La
adición de anhídrido acético es exotérmica y generaba gas (CO), de
modo que la velocidad de adición tenía que ajustarse para controlar
tanto la temperatura como la generación de gas (presión). El tiempo
de reacción para preparar el reactivo eliminador activo dependía de
la cantidad de agua presente en la reacción (el ácido fórmico y el
formiato potásico contenían aproximadamente 3-5% de
agua cada uno). La reacción de eliminación es sensible a la cantidad
de agua presente; si hay >0,1% de agua (KF), el nivel de la
impureza de 7,9-lactona puede incrementarse. Este
subproducto es difícil de retirar del producto final. Cuando el KF
mostraba <0,1% de agua, el agente eliminador activo se transfirió
al concentrado de mesilato (0,070 mol) preparado en la etapa
previa. La solución resultante se calentó hasta 95ºC y el material
volátil se separó por destilación y se recogió en un separador de
Dean Stark. Cuando cesaba el desprendimiento de materia volátil, el
separador de Dean Stark se reemplazó por el condensador y la mezcla
de reacción se calentó durante 1 h adicional a 95ºC. Al terminar
(análisis de TLC y HPLC; <0,1% del material de partida), el
contenido se enfrió hasta 50ºC y se inició la destilación a vacío
(660 mm [26 pulgadas] de Hg/50ºC). La mezcla se concentró hasta una
suspensión espesa y a continuación se enfrió hasta temperatura
ambiente. La suspensión resultante se diluyó con acetato de etilo
(137 ml) y la solución se agitó durante 15 min y se diluyó con agua
(137 ml). Las capas se separaron y la capa inferior acuosa se
reextrajo con acetato de etilo (70 ml). La solución de acetato de
etilo combinada se lavó una vez con solución de salmuera (120 ml) y
dos veces con solución de NaOH 1N enfriada con hielo (120 ml) cada
una. El pH de la solución acuosa se midió y la capa orgánica se
lavó de nuevo si el pH del licor de lavado gastado era <8. Cuando
se observaba que el pH del lavado gastado era >8, la capa de
acetato de etilo se lavaba una vez con solución de salmuera (120 ml)
y se concentraba hasta sequedad mediante evaporación giratoria
usando un baño de agua a 50ºC. El enéster resultante, un producto
sólido, es decir, \gamma-lactona de
17\alpha-hidroxi-3-oxopregno-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato
de metilhidrógeno, pesaba 92 g (rendimiento 77% en moles).
El hidroxiéster (100 g; 0,22 moles) preparado
mediante el Ejemplo 34 se cargó a un matraz de fondo redondo de 3
bocas de 2 l equipado con removedor mecánico, embudo de adición y
termopar. Se usó un baño de enfriamiento circulante con control de
temperatura automático. El matraz se secó antes de la reacción
debido a la sensibilidad del cloruro de metanosulfonilo al agua.
Se cargó al matraz cloruro de metileno (1 l) y
el hidroxiéster se disolvió en el mismo bajo agitación. La solución
se enfrió hasta 0ºC y se cargó al matraz cloruro de metanosulfonilo
(25 ml; 0,32 mol) a través del embudo de adición. Se cargó al
reactor trietilamina (50 ml; 0,59 mol) a través del embudo de
adición y el embudo se enjuagó con cloruro de metileno adicional
(34 ml). La adición de trietilamina era altamente exotérmica. El
tiempo de adición era alrededor de 10 min bajo agitación y
enfriamiento. La mezcla de carga se enfrió hasta 0ºC y se mantuvo a
esa temperatura bajo agitación durante 45 min adicionales, durante
los cuales el espacio libre del matraz de reacción se barrió con
nitrógeno. Una muestra de la mezcla de reacción se analizó a
continuación mediante cromatografía en capa fina y cromatografía
líquida de alta resolución para comprobar la terminación de la
reacción. La mezcla se removió posteriormente a 0ºC durante 30 min
adicionales y se comprobó de nuevo con respecto a la terminación de
la reacción. El análisis mostraba que la reacción era
substancialmente completa en este punto; el cloruro de metileno
disolvente se separó por arrastre a 0ºC bajo vacío de 660 mm (26
pulgadas) de mercurio. El análisis por cromatografía de gases del
destilado indicaba la presencia tanto de cloruro de metanosulfonilo
como de trietilamina. A continuación, se cargó cloruro de metileno
(800 ml) al reactor y la mezcla resultante se agitó durante 5 min a
una temperatura en el intervalo de 0-15ºC. El
disolvente se separó de nuevo por arrastre a 0-5ºC
bajo vacío de 660 mm (26 pulgadas) de mercurio dando el mesilato de
Fórmula IV en la que R^{3} es H, -A-A- y
-B-B- son -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{1} es metoxicarbonilo. La pureza del producto era
aproximadamente 90-95% del área.
Para preparar un reactivo de eliminación,
formiato potásico (23,5 g; 0,28 mol), ácido fórmico (80 ml) y
anhídrido acético (40 ml) se mezclaron en un reactor secado
separado. El ácido fórmico y el anhídrido acético se bombearon al
reactor y la temperatura se mantuvo a no más de 40ºC durante la
adición del anhídrido acético. La mezcla del reactivo de
eliminación se calentó hasta 70ºC para retirar el agua del sistema
de reacción. Esta reacción se continuó hasta que el contenido de
agua era inferior a 0,3% en peso según se medía mediante análisis de
Karl Fisher. La solución del reactivo de eliminación se transfirió
a continuación al reactor que contenía la solución concentrada de
mesilato en bruto preparada como se describe anteriormente. La
mezcla resultante se calentó hasta una temperatura máxima de 95ºC y
el destilado volátil se recogió hasta que no se generaba más
destilado. La destilación cesaba a aproximadamente 90ºC. Después de
que la destilación fuera completa, la mezcla de reacción se agitó a
95ºC durante 2 h adicionales y la terminación de la reacción se
comprobó por cromatografía en capa fina. Cuando la reacción era
completa, el reactor se enfriaba hasta 50ºC y el ácido fórmico y el
disolvente se retiraban de la mezcla de reacción bajo vacío de 660
mm (26 pulgadas) de mercurio a 50ºC. El concentrado se enfrió hasta
temperatura ambiente y posteriormente se introdujo acetato de etilo
(688 ml) y la mezcla de acetato de etilo y concentrado se removió
durante 15 min. En este punto, una solución de salmuera al 12% (688
ml) se introdujo para ayudar a retirar impurezas solubles en agua de
la fase orgánica. Las fases se dejaron sedimentar a continuación
durante 20 min. La capa acuosa se transfirió a otro recipiente al
que se cargaba una cantidad adicional de acetato de etilo (350 ml).
Esta reextracción de la capa acuosa se llevó a cabo durante 30 min,
después de los cuales las fases se dejaron sedimentar y las capas de
acetato de etilo se combinaron. A las capas de acetato de etilo
combinadas se cargó solución saturada de cloruro sódico (600 ml) y
se llevó a cabo remoción durante 30 min. Las fases se dejaron
sedimentar a continuación. La capa acuosa se retiró. Se llevó a
cabo un lavado con cloruro sódico adicional (600 ml). La fase
orgánica se separó del segundo licor de lavado gastado. La fase
orgánica se lavó a continuación con hidróxido sódico 1N (600 ml)
bajo agitación durante 30 min. Las fases se sedimentaron durante 30
min para retirar la capa acuosa. El pH de la capa acuosa se
comprobó y se encontró que era >7. Un lavado adicional se llevó a
cabo con cloruro sódico saturado (600 ml) durante 15 min. La fase
orgánica se concentró finalmente bajo vacío de 660 mm (26 pulgadas)
de mercurio a 50ºC y el producto se recuperó mediante filtración. El
producto final era un sólido pardo espumoso cuando se secaba. El
secado adicional a 45ºC bajo presión reducida durante 24 h daba 95,4
g del producto de enéster que se ensayaba en 68,8%. El rendimiento
molar era 74,4% corregido tanto para el hidoxiéster de partida como
para el enéster final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 37,
excepto que las múltiples etapas de lavado se evitaron tratando la
solución de reacción con una resina de intercambio iónico, alúmina
básica o sílice básica. Las condiciones para el tratamiento con
sílice básica se indican en la Tabla 38. Cada uno de estos
tratamientos se encontró eficaz para la retirada de impurezas sin
los lavados múltiples del Ejemplo 44.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Acetato potásico (4 g) y ácido trifluoroacético
(42,5 ml) se mezclaron en un reactor de 100 ml. Se añadió ácido
trifluoroacético (9,5 ml) a la mezcla a una velocidad controlada
para mantener la temperatura durante la adición por debajo de 30ºC.
La solución se calentó a continuación hasta 30ºC durante 30 min para
proporcionar un reactivo de eliminación útil para convertir el
mesilato de Fórmula IV en el enéster de Fórmula II.
El reactivo de eliminación de TFA/anhídrido de
TFA preformado se añadió a una solución previamente preparada del
mesilato de Fórmula IV. La mezcla resultante se calentó a 40ºC
durante 4½ h, comprobándose periódicamente el grado de conversión
mediante TLC o HPLC. Cuando la reacción era completa, la mezcla se
transfirió a un matraz de una boca y se concentró hasta sequedad
bajo presión reducida a temperatura ambiente (22ºC). Se añadió
acetato de etilo (137 ml) a la mezcla para obtener la disolución
completa del material en fase sólida después de lo cual una mezcla
de agua/salmuera (137 ml) se añadió y la mezcla bifásica resultante
se agitó durante 10 min. Se dejó a continuación que las fases se
separaran durante 20 min. La concentración de salmuera era 24% en
peso. La fase acuosa se puso en contacto con una cantidad adicional
de acetato de etilo (68 ml) y la mezcla bifásica así preparada se
agitó durante 10 min, después de lo cual se dejó reposar durante 15
min para la separación de fases. Las capas de acetato de etilo
procedentes de las dos extracciones se combinaron y se lavaron con
salmuera al 24% en peso (120 ml), otra parte alícuota de salmuera al
24% en peso (60 ml), solución de hidróxido sódico 1N (150 ml) y
otra porción de salmuera (60 ml). Después de cada adición de fase
acuosa, la mezcla se agitó durante 10 min y se dejó reposar durante
15 min para la separación. La solución resultante se concentró
hasta sequedad bajo presión reducida a 45ºC usando un aspirador de
agua. El producto sólido (8,09 g) se analizó mediante HPLC y se
encontró que incluía 83,4% de área del enéster, 2,45% de área de la
11,12-olefina, 1,5% de la
7,9-lactona y 1,1% de mesilato sin reaccionar.
El mesilato que tiene la estructura preparada
para el Ejemplo 23 (1,0 g), acetato de isopropenilo (10 g) y ácido
p-toluenosulfónico (5 mg) se pusieron en un matraz
de 50 ml y se calentaron hasta 90ºC con agitación. Después de 5
horas la mezcla se enfrió hasta 25ºC y se concentró a vacío a 10 mm
de Hg. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (20 ml) y se lavó
con NaHCO_{3} acuoso al 5%. La capa de CH_{2}Cl_{2} se
concentró a vacío para dar 1,47 g de un aceite color canela. Este
material se recristalizó en CH_{2}Cl_{2}/Et_{2}O para dar 0,50
g de acetato de enol de Fórmula IV(Z).
Este material se añadió a una mezcla de acetato
sódico (0,12 g) y ácido acético (2,0 ml) que se había calentado
previamente hasta 100ºC con remoción. Después de 60 minutos la
mezcla se enfrió hasta 25ºC y se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (20
ml). La solución se lavó con agua (20 ml) y se secó sobre
MgSO_{4}. El agente de secado se retiró mediante filtración y el
filtrado se concentró a vacío para dar 0,4 g de la
9,11-olefina deseada, IV(Y). El producto en
bruto contenía menos de 2% de la impureza de
7,9-lactona.
Una mezcla de 2 g de mesilato y 5 ml de DMSO en
un matraz se calentó a 80ºC durante 22,4 horas. El análisis por
HPLC de la mezcla de reacción indicaba que no se detectaba material
de partida. Se añadió a la reacción agua (10 ml) y el precipitado
se extrajo con cloruro de metileno tres veces. Las capas de cloruro
de metileno combinadas se lavaron con agua, se secaron sobre
sulfato sódico y se concentraron para dar el enéster.
En un matraz piriforme de 50 ml bajo remoción,
el enéster de Fórmula IIA (1,07 g ensayando 74,4% de enéster),
tricloroacetamida (0,32 g) y hidrogenofosfato dipotásico (0,70 g)
como sólido se mezclaron con cloruro de metileno (15,0 ml). Se
obtuvo una solución transparente. Se añadió peróxido de hidrógeno
(30% en peso; 5,0 ml) a través de una pipeta durante un período de
1 min. La mezcla resultante se agitó durante 6 h a temperatura
ambiente, punto en el cual el análisis por HPLC mostraba que la
relación de epoximexrenona a enéster en la mezcla de reacción era
aproximadamente 1:1. Se añadió a la mezcla de reacción
tricloroacetamida adicional (0,32 g) y la reacción continuó bajo
agitación durante 8 horas más, tiempo después del cual se observó
que la proporción restante de enéster se había reducido hasta 10%.
Se añadió tricloroacetamida adicional (0,08 g) y la mezcla de
reacción se dejó reposar durante la noche, punto en el cual solo
0,5% de enéster sin reaccionar permanecía con relación a la
epoximexrenona en la mezcla.
El enéster de Fórmula IIA (5,4 g, ensayando
74,4% de enéster) se añadió a un reactor de 100 ml.
Tricloroacetamida (4,9 g) e hidrogenofosfato potásico (3,5 g),
ambos en forma sólida, se añadieron al enéster seguido por cloruro
de metileno (50 ml). La mezcla se enfrió hasta 15ºC y peróxido de
hidrógeno al 30% (25 g) se añadió durante un período de 10 min. La
mezcla de reacción se dejó llegar hasta 20ºC y se agitó a esa
temperatura durante 6 h, punto en el cual la conversión se comprobó
mediante HPLC. Se determinó que el enéster restante era menos de 1%
en peso.
La mezcla de reacción se añadió a agua (100 ml),
se dejó que las fases se separan y la capa de cloruro de metileno
se retiró. Se añadió hidróxido sódico (0,5N, 50 ml) a la capa de
cloruro de metileno. Después de 20 min, se dejó que las fases se
separan, se añadió HCl (0,5 N; 50 ml) a la capa de cloruro de
metileno, después de lo cual las fases se dejaron separar y la fase
orgánica se lavó con salmuera saturada (50 ml). La capa de cloruro
de metileno se secó sobre sulfato magnésico anhidro y el disolvente
se retiró. Se obtuvo un sólido blanco (5,7 g). La capa acuosa de
hidróxido sódico se acidificó y se extrajo y el extracto se trató
para dar 0,2 g adicionales de producto. El rendimiento de
epoximexrenona era 90,2%.
El enéster de Fórmula IIA se convirtió en
epoximexrenona de la manera descrita en el Ejemplo 43, con las
siguientes diferencias: la carga inicial estaba comprendida por
enéster (5,4 g ensayando 74,4% de enéster), tricloroacetamida (3,3
g) e hidrogenofosfato dipotásico (3,5 g). Se añadió solución de
peróxido de hidrógeno (12,5 ml). La reacción se efectuó durante la
noche a 20ºC, después de lo cual la HPLC mostraba una conversión de
90% de éster en epoximexrenona. Se añadieron tricloroacetamida
adicional (3,3 g) y peróxido de hidrógeno al 30% (5,0 ml) y la
reacción se llevó a cabo durante 6 h adicionales, punto en el cual
el enéster residual era solo 2% basado en la carga de enéster.
Después del tratamiento como se describe en el Ejemplo 43,
resultaban 5,71 g de epoximexrenona.
El enéster de Fórmula IIA se convirtió en
epoximexrenona de la manera descrita generalmente en el Ejemplo 43.
En la reacción de este Ejemplo, la carga de enéster era 5,4 g
(ensayando 74,4% de enéster), la carga de tricloroacetamida era 4,9
g, la carga de peróxido de hidrógeno era 25 g, la carga de
hidrogenofosfato dipotásico era 3,5 g. La reacción se efectuó a
20ºC durante 18 h. El enéster residual era menos de 2%. Después del
tratamiento, resultaban 5,71 g de epoximexrenona.
El enéster de Fórmula IIA se convirtió en
epoximexrenona de la manera descrita en el Ejemplo 43, excepto que
la temperatura de reacción en este Ejemplo era 28ºC. Los materiales
cargados en el reactor incluían enéster (2,7 g), tricloroacetamida
(2,5 g), hidrogenofosfato dipotásico (1,7 g), peróxido de hidrógeno
(17,0 g) y cloruro de metileno (50 ml). Después de 4 h de reacción,
el enéster sin reaccionar era solo 2% basado en la carga de
enéster. Después del tratamiento como se describe en el Ejemplo 43,
se obtenían 3,0 g de epoximexrenona.
El enéster de Fórmula IIA (27 g ensayando 72% de
enéster) se disolvió en cloruro de metileno (150 ml), después de lo
cual se añadió tricloroacetamida (14,9 g) bajo agitación lenta. La
temperatura de la mezcla se ajustó hasta 25ºC y la solución de
hidrogenofosfato dipotásico (10,6 g) en agua (10,6 ml) se removió en
la solución de substrato de enéster bajo agitación de 400 rpm.
Peróxido de hidrógeno (solución al 30% en peso; 69,4 ml) se añadió
a la solución de substrato/fosfato/tricloroacetamida durante un
período de 3-5 min. No se observó exoterma o
desprendimiento de oxígeno. La mezcla de reacción así preparada se
removió a 400 rpm y 25ºC durante 18,5 h. No se observó
desprendimiento de oxígeno a lo largo del transcurso de la reacción.
La mezcla de reacción se diluyó con agua (69,4 ml) y la mezcla se
agitó a aproximadamente 250 rpm durante 15 min. No era necesario
control de la temperatura para esta operación y se efectuó
esencialmente a temperatura ambiente (siendo aceptable cualquier
temperatura en el intervalo de 5-25ºC). Las capas
acuosa y orgánica se dejaron separar y la capa de cloruro de
metileno inferior se retiró.
La capa acuosa se reextrajo con cloruro de
metileno (69,4 ml) durante 15 min bajo agitación de 250 rpm. Se
dejó que las capas se separan y la capa inferior de cloruro de
metileno se retiró. La capa acuosa (177 g; pH = 7) se sometió a
determinación de peróxido de hidrógeno. El resultado (12,2%) que
indica que solo 0,0434 moles de peróxido de hidrógeno se consumían
en la reacción era 0,0307 moles de olefina. La reextracción con una
pequeña cantidad de volumen de cloruro de metileno era suficiente
para asegurar que no había pérdida de epoximexrenona en la capa
acuosa. Este resultado se confirmó con la aplicación de una segunda
extracción grande con cloruro de metileno en la que solo se
recuperaba tricloroacetamida.
Las soluciones de cloruro de metileno combinadas
procedentes de las extracciones descritas anteriormente se
combinaron y se lavaron con solución de sulfito sódico al 3% en peso
(122 ml) durante al menos 15 min, a aproximadamente 250 rpm. Se
observó una prueba de yoduro de almidón negativa (papel KI; sin
color observado; en una prueba positiva una coloración púrpura
indica la presencia de peróxido) al final del período de
remoción.
Se dejó que las capas acuosa y orgánica se
separaran y la capa inferior de cloruro de metileno se retiró. La
capa acuosa (pH = 6) se descartó. Apréciese que la adición de
solución de sulfito sódico puede provocar una ligera exoterma de
modo que tal adición debe llevarse a cabo bajo control de
temperatura.
La fase de cloruro de metileno se lavó con
hidróxido sódico 0,5N (61 ml) durante 45 min a aproximadamente 250
rpm y una temperatura en el intervalo de 15-25ºC (pH
= 12-13). Las impurezas derivadas de
tricloroacetamida se retiraron en este procedimiento. La
acidificación de la fracción acuosa alcalina seguida por extracción
del cloruro de metileno confirmaban que se perdía muy poca
epoximexrenona en esta operación.
La fase de cloruro de metileno se lavó una vez
con ácido clorhídrico 0,1 N (61 ml) durante 15 min bajo 250 rpm de
agitación a una temperatura en el intervalo de
15-25ºC. Se dejó a continuación que las capas se
separaran y la capa inferior de cloruro de metileno se retiró y se
lavó de nuevo con cloruro sódico acuoso al 10% en peso (61 ml)
durante 15 min a 250 rpm a una temperatura en el intervalo de
15-25ºC. De nuevo, se dejó que las capas se
separaran y la capa orgánica se retiró. La capa orgánica se filtró a
través de un bloque de Solkafloc y a continuación se evaporó hasta
sequedad bajo presión reducida. El secado se completó con una
temperatura del baño de agua de 65ºC. Se obtuvo un sólido
blanquecino (17,95 g) y se sometió a ensayo de HPLC. El ensayo de
epoximexrenona era 66,05%. Un rendimiento molar ajustado para la
reacción era 93,1%.
El producto se disolvió en
metil-etil-cetona caliente (189 ml)
y la solución resultante se destiló a presión atmosférica hasta que
se habían retirado 95 ml de la cetona disolvente. La temperatura se
disminuyó hasta 50ºC a medida que el producto cristalizaba. La
agitación se continuó a 50ºC durante 1 h. La temperatura se
disminuyó a continuación hasta 20-25ºC y la remoción
continuó durante otras 2 h. El sólido se filtró y se enjuagó con
MEK (24 ml) y el sólido se secó hasta un peso constante de 9,98 g,
que mediante ensayo de HPLC contienen 93,63% de epoximexrenona.
Este producto se redisolvió en MEK caliente (106 ml) y la solución
caliente se filtró a través de un filtro lineal de 10 micras bajo
presión. Otros 18 ml de MEK se aplicaron como un enjuague y la
solución de MEK filtrada se destiló a presión atmosférica hasta que
se habían retirado 53 ml de disolvente. La temperatura se disminuyó
hasta 50ºC a medida que el producto cristalizaba; y la agitación se
continuó a 50ºC durante 1 h. La temperatura se disminuyó a
continuación hasta 20-25ºC y se mantuvo a esa
temperatura mientras la remoción se continuaba durante otras 2 h. El
producto sólido se filtró y se enjuagó con MEK (18 ml). El producto
sólido se secó hasta un peso constante de 8,32 g que contenían 99,6%
de epoximexrenona por ensayo de HPLC cuantitativa. La pérdida final
durante el secado era menor que 1,0%. El rendimiento global de
epoximexrenona de acuerdo con la reacción y el tratamiento de este
Ejemplo es 65,8%. Este rendimiento global reflejaba un rendimiento
de reacción de 93%, una recuperación por cristalización inicial de
78,9% y una recuperación por recristalización de 89,5%.
\vskip1.000000\baselineskip
El enéster de Fórmula IIA se convirtió en
eplerenona en el método descrito generalmente en el Ejemplo 46,
excepto que se usó tolueno como el disolvente. Los materiales
cargados al reactor incluían enéster (2,7 g), tricloroacetamida
(2,05 g), hidrogenofosfato dipotásico (1,7 g), peróxido de hidrógeno
(17,0 g) y tolueno (50 ml). Se dejó que la reacción alcanzara la
exoterma hasta 28ºC y se completó en 4 horas. La mezcla trifásica
resultante se enfrió hasta 15ºC, se filtró, se lavó con agua y se
secó a vacío para dar 2,5 g de producto.
\vskip1.000000\baselineskip
Un compuesto denominado XVIIA (compuesto XVII en
el que -A-A- y -B-B- son ambos
-CH_{2}-CH_{2}-) (40,67 g) se disolvió en
cloruro de metileno (250 ml) en un matraz de 3 bocas de un litro y
se enfrió mediante mezcla de hielo/sal externamente. Se añadieron
fosfato dipotásico (22,5 g) y tricloroacetonitrilo (83,5 g) y la
mezcla se enfrió hasta 2ºC, después de lo cual se añadió lentamente
peróxido de hidrógeno al 30% (200 g) durante un período de 1 hora.
La mezcla de reacción se removió a 12ºC durante 8 horas y 14 horas a
temperatura ambiente. Una gota de la capa orgánica se recogió y se
comprobó con respecto a cualquier enona de partida y se encontró
que era <0,5%. Se añadió agua (400 ml), se agitó durante 15 min y
las capas se separaron. La capa orgánica se lavó sucesivamente con
200 ml de yoduro potásico (10%), 200 ml de tiosulfato sódico (10%) y
100 ml de solución saturada de bicarbonato sódico separando las
capas cada vez. La capa orgánica se secó sobre sulfato magnésico
anhidro y se concentró para dar epóxido en bruto (41 g). El producto
cristalizaba en acetato de etilo:cloruro de metileno para dar 14,9 g
de material puro.
El compuesto XVIIA (18,0 g) se disolvió en 250
ml de cloruro de metileno y se enfrió hasta 10ºC. Bajo remoción, se
añadió ácido m-cloroperbenzoico sólido
(50-60% puro, 21,86 g) durante 15 min. No se observó
ascenso en la temperatura. La mezcla de reacción se removió durante
3 horas y se comprobó con respecto a la presencia de la dienona. La
mezcla de reacción se trató sucesivamente con solución de sulfito
sódico (10%), solución de hidróxido sódico (0,5N), solución de
ácido clorhídrico (5%) y finalmente con 50 ml de solución saturada
de salmuera. Después del secado con sulfato magnésico anhidro y la
evaporación, resultaban 17,64 g del epóxido y se usaron
directamente en la siguiente etapa. Se encontró que el producto
contenía producto de oxidación de Baeyer-Villiger
que se había retirado mediante trituración en acetato de etilo
seguido por cristalización en cloruro de metileno. A una escala de
500 g, el ácido m-clorobenzoico precipitado se
filtró seguido por el tratamiento habitual.
El compuesto XVIIA (2 g) se disolvió en 25 ml de
cloruro de metileno. Se añadieron tricloroacetamida (2 g) y fosfato
dipotásico (2 g). Bajo agitación, a temperatura ambiente, se añadió
peróxido de hidrógeno al 30% (10 ml) y la remoción continuó durante
18 horas para dar el epóxido (1,63 g). No se formaba producto de
Baeyer-Villiger.
(Solo
referencia)
Se cargó hidróxido potásico (56,39 g; 1005,03
mmol; 3,00 eq.) a un matraz de 2000 ml y se suspendió con
dimetilsulfóxido (750,0 ml) a temperatura ambiente. Una trienona
correspondiente a la Fórmula XX (en la que R^{3} es H y
-A-A- y -B-B- son cada uno
-CH_{2}-CH_{2}-) (100,00 g; 335,01 mmol; 1,00
eq.) se cargó al matraz junto con THF (956,0 ml). Se cargó al
matraz metilsulfato de trimetilsulfonio (126,14 g; 670,02 mmol; 2,00
eq.) y la mezcla resultante se calentó a reflujo, de 80 a 85ºC,
durante 1 h. La conversión en el
17-espirooximetileno se comprobó mediante HPLC.
Aproximadamente 1 l de THF se separó por arrastre de la mezcla de
reacción bajo vacío, después de lo cual se cargó agua (460 ml)
durante un período de 30 min mientras la mezcla de reacción se
enfriaba hasta 15ºC. La mezcla resultante se filtró y el producto de
oxirano sólido se lavó dos veces con partes alícuotas de 200 ml de
agua. Se observó que el producto era altamente cristalino y la
filtración se llevó a cabo fácilmente. Posteriormente, el producto
se secó bajo vacío a 40ºC. Se aislaron 104,6 g del producto
esteroideo de
3-metilenol-éter-\Delta-5,6,9,11,17-oxirano.
(Solo
referencia)
Se cargó etóxido sódico (41,94 g; 616,25 mmol;
1,90 eq.) a un reactor de 500 ml seco bajo una atmósfera de
nitrógeno. Se cargó etanol (270,9 ml) al reactor y el metóxido
sódico se suspendió en el etanol. Se cargó a la suspensión malonato
de dietilo (103,90 g; 648,68 mmol; 2,00 eq.), después de lo cual el
esteroide de oxirano preparado de la manera descrita en el Ejemplo
52 (104,60 g; 324,34 mmol; 1,00 eq.) se añadió y la mezcla
resultante se calentó hasta reflujo, es decir de 80 a 85ºC. El
calentamiento se continuó durante 4 h, después de lo cual la
terminación de la reacción se comprobó mediante HPLC. Se cargó agua
(337,86 ml) a la mezcla de reacción durante un período de 30 min
mientras la mezcla se estaba enfriando hasta 15ºC. La remoción se
continuó durante 30 min y a continuación la suspensión de reacción
se filtró produciendo una torta filtrante que comprendía un polvo
amorfo fino. La torta filtrante se lavó dos veces con agua (200 ml
cada una) y posteriormente se secó a temperatura ambiente bajo
vacío. Se aislaron 133,8 g del producto intermedio de
3-metilenol-éter-\Delta5,6,9,11,17-espirolactona-21-metoxicarbonilo.
(Solo
referencia)
El producto intermedio de
3-metilenol-éter-\Delta5,6,9,11,17-espirolactona-21-metoxicarbonilo
(Fórmula XVIII donde R^{3} es H y -A-A- y
-B-B- y son cada uno
-CH_{2}-CH_{2}-; 133,80 g; 313,68 mmol; 1,00
eq.) que se producía en el Ejemplo 53 se cargó al reactor junto con
cloruro sódico (27,50 g; 470,52 mmol; 1,50 eq.). Dimetilformamida
(709 ml) y agua (5 ml) se cargaron a un reactor de 2000 ml bajo
agitación. La mezcla resultante se calentó hasta reflujo, de 138 a
142ºC, durante 3 h, después de lo cual la mezcla de reacción se
comprobó con respecto a la terminación de la reacción mediante HPLC.
Posteriormente se añadió agua a la mezcla durante un período de 30
min mientras la mezcla se estaba enfriando hasta 15ºC. La agitación
se continuó durante 30 min, después de lo cual la suspensión de
reacción se filtró recuperando producto de reacción sólido amorfo
como una torta filtrante. La torta filtrante se lavó dos veces
(partes alícuotas de 200 ml de agua), después de lo cual se secó.
La
3-metilenol-éter-17-espirolactona
obtenida como producto se secó dando 91,6 g (82,3% de rendimiento;
96% de área de ensayo).
(Solo
referencia)
El éter enólico producido de acuerdo con el
Ejemplo 54 (91,60 g; 258,36 mmol; 1,00 eq.), etanol (250 ml), ácido
acético (250 ml) y agua (250 ml) se cargaron a un reactor de 2000 ml
y la suspensión resultante se calentó hasta reflujo durante 2 h. Se
cargó agua (600 ml) durante un período de 30 min mientras la mezcla
de reacción se estaba enfriando hasta 15ºC. La suspensión de
reacción se filtró posteriormente y la torta filtrante se lavó dos
veces con agua (partes alícuotas de 200 ml). La torta filtrante se
secó a continuación; se aislaron 84,4 g de
3-cetona-\Delta-4,5,9,11,17-espirolactona
obtenida como producto (compuesto de Fórmula XVII en la que R^{3}
es H y -A-A- y -B-B- son
-CH_{2}-CH_{2}-; 95,9% de rendimiento).
(Solo
referencia)
El compuesto XVIIA (1 kg; 2,81 moles) se cargó
junto con tetracloruro de carbono (3,2 l) a un matraz de 22 l de 4
bocas. Se añadió a la mezcla N-bromosuccinimida (538
g) seguida por acetonitrilo (3,2 l). La mezcla resultante se
calentó hasta reflujo y se mantuvo a la temperatura de reflujo de
68ºC durante aproximadamente 3 h, produciendo una solución naranja
transparente. Después de 5 h de calentamiento, la solución se volvía
oscura. Después de 6 h, el calor se retiró y la mezcla de reacción
se muestreó. El disolvente se separó por arrastre bajo vacío y se
añadió acetato de etilo (6 l) al residuo del fondo del hervidor. La
mezcla resultante se removió, después de lo cual se añadió una
solución de bicarbonato sódico al 5% (4 l) y la mezcla se removió
durante 15 min, después de lo cual se dejó que las fases
sedimentaran. La capa acuosa se retiró y solución de salmuera
saturada (4 l) se introdujo en la mezcla que a continuación se
removió durante 15 min. Las fases se separaron de nuevo y la capa
orgánica se separó por arrastre bajo vacío produciendo una
suspensión espesa. Se añadió a continuación dimetilformamida (4 l)
y la separación por arrastre continuó hasta una temperatura de la
vasija de 55ºC. Las colas del hervidor se dejaron reposar durante la
noche y se añadieron DABCO (330 g) y bromuro de litio (243 g). La
mezcla se calentó a continuación hasta 70ºC. Después de una hora y
media de calentamiento, se recogió una muestra de cromatografía
líquida y, después de 3,50 h de calentamiento, se añadió DABCO
adicional (40 g). Después de 4,5 h de calentamiento, se introdujo
agua (4 l) y la mezcla resultante se enfrió hasta 15ºC. La
suspensión se filtró y la torta se lavó con agua (3 l) y se secó
sobre el filtro durante la noche. La torta húmeda (978 g) se cargó
de nuevo al matraz de 22 l y se añadió dimetilformamida (7 l). La
mezcla así producida se calentó hasta 105ºC, punto en el cual la
torta se había recogido totalmente en solución. El calor se retiró
y la mezcla del matraz se removió y se enfrió. Se aplicó agua de
hielo a la camisa del reactor y la mezcla dentro del reactor se
enfrió hasta 14ºC y se mantuvo durante 2 horas. La suspensión
resultante se filtró y se lavó dos veces con partes alícuotas de 2,5
l de agua. La torta filtrante se secó bajo vacío durante la noche.
Se obtuvieron 510 g de un producto sólido pardo claro.
(Solo
referencia)
A un matraz de 2 l de 4 bocas se cargaron:
9,11-epoxicanrenona según se produce en el Ejemplo
56 (100,00 g; 282,1 mmol; 1,00 eq.), dimetilformamida (650,0 ml),
cloruro de litio (30,00 g; 707,7 mmol; 2,51 eq.) y
acetonacianhidrina (72,04 g; 77,3 ml; 846,4 mmol; 3,00 eq.). La
suspensión resultante se removió mecánicamente y se trató con
tetrametilguanidina (45,49 g; 49,6 ml; 395,0 mmol; 1,40 eq.). El
sistema se filtró a continuación con un condensador enfriado con
agua y un condensador de hielo seco (cargado con hielo seco en
acetona) para evitar el escape de HCN. El conducto de ventilación
desde el condensador de hielo seco se introducía en un lavador
cargado con un gran exceso de lejía de cloro. La mezcla se calentó
hasta 80ºC.
Después de 18 h, se obtuvo una solución parda
rojiza oscura que se enfrió hasta temperatura ambiente con remoción.
Durante el procedimiento de enfriamiento, se pulverizó nitrógeno en
la solución para retirar HCN residual haciendo que el conducto de
ventilación se introdujera en la lejía del lavador. Después de 2 h,
la solución se trató con ácido acético (72 g) y se removió durante
30 min. La mezcla en bruto se vertió a continuación en agua de
hielo (2 l) con remoción. La suspensión removida se trató
adicionalmente con HCl acuoso al 10% (400 ml) y se removió durante
1 h. A continuación, la mezcla se filtró para dar un sólido rojo
ladrillo oscuro (73 g). El filtrado se puso en un embudo separador
de 4 l y se extrajo con cloruro de metileno (3 x 800 ml); y las
capas orgánicas se combinaron y se reextrajeron con agua (2 x 2 l).
La solución de cloruro de metileno se concentró a vacío para dar 61
g de un aceite rojo oscuro.
Después de que se dejara que las fracciones de
lavado acuosas se asentaran durante la noche, se desarrollaba un
precipitado considerable. El precipitado se recogió mediante
filtración y se determinó que era enamina obtenida como producto
pura (14,8 g).
Después de secado, el sólido rojo original (73
g) se analizó mediante HPLC y puede determinarse que el principal
componente era la 9,11-epoxienamina. La HPLC
mostraba además que la enamina era el componente principal del
aceite rojo obtenido a partir de tratamiento con cloruro de
metileno. El rendimiento molar calculado de enamina era 46%.
(Solo
referencia)
9,11-epoxienamina (4,600 g;
0,011261 mol; 1,00 eq.) como la preparada de acuerdo con el Ejemplo
57 se introdujo en un matraz de fondo redondo de 1000 ml. Metanol
(300 ml) y HCl acuoso al 0,5% en peso (192 ml) se añadieron a la
mezcla que posteriormente se sometió a reflujo durante 17 h.
Posteriormente, el metanol se retiró bajo vacío reduciendo la
cantidad de material en la vasija del hervidor hasta 50 ml y
haciendo que se formara un precipitado blanco. Se añadió agua (100
ml) a la suspensión que posteriormente se filtró produciendo una
torta sólida blanca que se lavó tres veces con agua. El rendimiento
del producto de 9,11-epoxidicetona sólido era 3,747
g (81,3%).
(Solo
referencia)
La epoxidicetona preparada de acuerdo con el
Ejemplo 58 (200 mg; 0,49 mmol) se suspendió en metanol (3 ml) y se
añadió a la mezcla
1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
(DBU). Al calentar bajo reflujo durante 24 h, la mezcla se hacía
homogénea. Se concentró a continuación hasta sequedad a 30ºC en un
evaporador giratorio y el residuo se sometió a reparto entre
cloruro de metileno y HCl 3,0N. La concentración de la fase orgánica
daba un sólido amarillo (193 mg) que se determinó que era
epoximexrenona al 22% en peso. El rendimiento era 20%.
(Solo
referencia)
A 100 mg de la dicetona suspendida en 1,5 ml de
metanol se añadieron 10 microlitros (0,18 eq.) de una solución al
25% (p/p) de metóxido sódico en metanol. La solución se calentó
hasta reflujo. Después de 30 min, no quedaba dicetona y estaba
presente el 5-cianoéster. A la mezcla se añadieron
46 microlitros de solución de metóxido sódico al 25% (p/p) en
metanol. La mezcla se calentó a reflujo durante 23 horas, momento en
el cual el producto principal era eplerenona según se juzgaba
mediante HPLC.
(Solo
referencia)
A 2 g de la dicetona suspendida en 30 ml de
metanol seco se añadieron 0,34 ml de trietilamina. La suspensión se
calentó a reflujo durante 4,5 horas. La mezcla se agitó a 25ºC
durante 16 horas. La suspensión resultante se filtró para dar 1,3 g
del 5-cianoéster como un sólido blanco.
A 6,6 g de la dicetona suspendida en 80 ml de
metanol se añadieron 2,8 ml de trietilamina. La mezcla se calentó a
reflujo durante 4 horas y se agitó a 25ºC durante 88 horas, tiempo
durante el cual el producto cristalizaba en solución. La filtración
seguida por un lavado con metanol daba 5,8 g del cianoéster como un
polvo blanco. El material se recristalizó en cloroformo/metanol
para dar 3,1 g de material cristalino que era homogéneo mediante
HPLC.
En vista de lo anterior, se observará que se
alcanzan los diversos objetivos de la invención y se obtienen otros
resultados ventajosos.
Claims (27)
1. Un procedimiento para la formación de un
compuesto epoxídico, que comprende poner en contacto un compuesto de
substrato que tiene un doble enlace olefínico con un compuesto de
peróxido en presencia de un activador de peróxido, correspondiendo
dicho activador de peróxido a la fórmula:
en la que Rº es un substituyente
que tiene una fuerza de retirada de electrones no menor que la del
monoclorometilo, en presencia de un tampón apropiado, y en donde la
reacción se efectúa a un pH en el intervalo de aproximadamente 3 a
aproximadamente
7.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho activador de peróxido corresponde
a la fórmula
donde X^{1}, X^{2} y X^{3} se
seleccionan del grupo que consiste en halo, hidrógeno, alquilo,
haloalquilo, ciano y cianoalquilo, R^{p} se selecciona del grupo
que consiste en arileno y -(CX^{4}X^{5})_{n}- y n es 0
ó 1, siendo al menos uno de X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y
X^{5} halo o
perhaloalquilo.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que n es 0 y al menos dos de X^{1},
X^{2} y X^{3} son halo o perhaloalquilo.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la totalidad de X^{1}, X^{2},
X^{3}, X^{4} y X^{5} es halo o perhaloalquilo.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho activador de peróxido es una
trihaloacetamida.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que dicho activador de peróxido es
tricloroacetamida.
7. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho compuesto de substrato corresponde
a la Fórmula:
en la
que
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-,
R^{3}, R^{4} y R^{5} se seleccionan del
grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo
C_{1}-C_{7}, alcoxi
C_{1}-C_{7}, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi,
R^{1} representa un radical
alcoxi(C_{1}-C_{7})-carbonilo
o hidroxicarbonilo orientado en alfa,
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
donde
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o R^{8} y R^{9} comprenden
juntos una estructura anular carbocíclica o heterocíclica, o R^{8}
o R^{9} junto con R^{6} o R^{7} comprenden una estructura
anular carbocíclica o heterocíclica condensada al anillo D
pentacíclico.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho compuesto de substrato se
selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y el producto de la reacción de
epoxidación se selecciona del grupo que consiste
en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que dicho compuesto de Fórmula II se prepara
retirando un grupo de salida en 11\alpha de un compuesto de
Fórmula IV:
en la
que:
R^{1} representa un radical
alcoxi(C_{1}-C_{7})-carbonilo
o hidroxicarbonilo orientado en alfa;
R^{2} es un
alquil(C_{1}-C_{7})-sulfoniloxi
o aciloxi o un haluro;
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3}, R^{9} y R^{5} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo C_{1}-C_{7}, alcoxi
C_{1}-C_{7}, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi;
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
donde
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi; y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o R^{8} y R^{9} comprenden
juntos una estructura anular carbocíclica o heterocíclica, o R^{8}
o R^{9} junto con R^{6} o R^{7} comprenden una estructura
anular carbocíclica o heterocíclica condensada al anillo D
pentacíclico.
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que dicho compuesto de Fórmula IV se prepara
haciendo reaccionar un reactivo
alquil(C_{1}-C_{7})-sulfonilante
o acilante o un agente generador de haluro y, si está presente un
agente generador de haluro, un eliminador de haluro de hidrógeno con
un compuesto de Fórmula V:
en la
que:
R^{1} representa un radical
alcoxi(C_{1}-C_{7})-carbonilo
o hidroxicarbonilo orientado en alfa;
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3}, R^{4} y R^{5} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo C_{1}-C_{7}, alcoxi
C_{1}-C_{7}, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi;
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
donde
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi; y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o R^{8} y R^{9} comprenden
juntos una estructura anular carbocíclica o heterocíclica, o R^{8}
o R^{9} junto con R^{6} o R^{7} comprenden una estructura
anular carbocíclica o heterocíclica condensada al anillo D
pentacíclico.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que el compuesto de Fórmula V se prepara
haciendo reaccionar un compuesto de Fórmula VI con un alcóxido de
metal alcalino correspondiente a la Fórmula R^{10}OM en la que M
es un metal alcalino y R^{10}O- corresponde al substituyente
alcoxi de R^{1}, teniendo dicho compuesto de Fórmula VI la
estructura:
en la
que:
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3}, R^{4} y R^{5} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo C_{1}-C_{7}, alcoxi
C_{1}-C_{7}, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi;
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
donde
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi; y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o R^{8} y R^{9} comprenden
juntos una estructura anular carbocíclica o heterocíclica, o R^{8}
o R^{9} junto con R^{6} o R^{7} comprenden una estructura
anular carbocíclica o heterocíclica condensada al anillo D
pentacíclico.
12. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que el compuesto de Fórmula VI se prepara
hidrolizando un compuesto correspondiente a la Fórmula VII:
en la
que:
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3}, R^{4} y R^{5} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo C_{1}-C_{7}, alcoxi
C_{1}-C_{7}, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi;
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
donde
\newpage
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi; y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o R^{8} y R^{9} comprenden
juntos una estructura anular carbocíclica o heterocíclica, o R^{8}
o R^{9} junto con R^{6} o R^{7} comprenden una estructura
anular carbocíclica o heterocíclica condensada al anillo D
pentacíclico.
13. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el compuesto de Fórmula VII se prepara
haciendo reaccionar un compuesto de Fórmula VIII con una fuente de
ion cianuro en presencia de una sal de metal alcalino, teniendo
dicho compuesto de Fórmula VIII la estructura:
en la
que:
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3}, R^{4} y R^{5} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo C_{1}-C_{7}, alcoxi
C_{1}-C_{7}, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi;
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
donde
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi; y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o R^{8} y R^{9} comprenden
juntos una estructura anular carbocíclica o heterocíclica, o R^{8}
o R^{9} junto con R^{6} o R^{7} comprenden una estructura
anular carbocíclica o heterocíclica condensada al anillo D
pentacíclico.
14. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que el compuesto de Fórmula VIII se prepara
oxidando un compuesto de substrato correspondiente a la Fórmula XIII
mediante fermentación en presencia de un microorganismo eficaz para
introducir un grupo 11-hidroxi en dicho substrato en
orientación \alpha, correspondiendo dicho compuesto de substrato a
la fórmula:
en la
que:
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3}, R^{4} y R^{5} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo C_{1}-C_{7}, alcoxi
C_{1}-C_{7}, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi;
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
donde
R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi; y
R^{8} y R^{9} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alcoxi
C_{1}-C_{7}, acilo, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo,
aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o R^{8} y R^{9} comprenden
juntos una estructura anular carbocíclica o heterocíclica, o R^{8}
o R^{9} junto con R^{6} o R^{7} comprenden una estructura
anular carbocíclica o heterocíclica condensada al anillo D
pentacíclico.
15. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho compuesto de substrato corresponde
a la Fórmula IIA:
en la
que
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-,
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
R^{1} representa un radical
alcoxi(C_{1}-C_{7})-carbonilo
o hidroxicarbonilo orientado en alfa,
X representa dos átomos de hidrógeno u oxo,
Y^{1} e Y^{2} representan juntos el puente
de oxígeno -O-, o
Y^{1} representa hidroxi, e
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{7} o, si X representa H_{2}, también
alcanoiloxi C_{1}-C_{7},
y sales de compuestos en los que X representa
oxo e Y^{2} representa hidroxi.
16. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15, en el que dicho compuesto de Fórmula IIA se
prepara retirando un grupo de salida en 11\alpha de un compuesto
de Fórmula IVA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-,
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R^{1} representa un radical
alcoxi(C_{1}-C_{7})-carbonilo
o hidroxicarbonilo orientado en alfa,
R^{2} es
alquil(C_{1}-C_{7})-sulfoniloxi
o aciloxi,
X representa dos átomos de hidrógeno u oxo,
Y^{1} e Y^{2} representan juntos el puente
de oxígeno -O-, o
Y^{1} representa hidroxi, e
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{7} o, si X representa H_{2}, también
alcanoiloxi C_{1}-C_{7},
y sales de compuestos en los que X representa
oxo e Y^{2} representa hidroxi.
17. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que dicho compuesto de Fórmula IVA se
prepara haciendo reaccionar un reactivo
alquil(C_{1}-C_{7})-sulfonilante
o acilante o un agente generador de haluro y, si está presente un
agente generador de haluro, un eliminador de haluro de hidrógeno con
un compuesto de Fórmula VA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-,
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R^{1} representa un radical
alcoxi(C_{1}-C_{7})-carbonilo
o hidroxicarbonilo orientado en alfa,
X representa dos átomos de hidrógeno u oxo,
Y^{1} e Y^{2} representan juntos el puente
de oxígeno -O-, o
Y^{1} representa hidroxi, e
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{7} o, si X representa H_{2}, también
alcanoiloxi C_{1}-C_{7},
y sales de compuestos en los que X representa
oxo e Y^{2} representa hidroxi.
18. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, en el que el compuesto de Fórmula VA se prepara
haciendo reaccionar un compuesto de Fórmula VIA con un alcóxido de
metal alcalino correspondiente a la Fórmula R^{10}OM en la que M
es un metal alcalino y R^{10}O- corresponde al substituyente
alcoxi de R^{1}, teniendo dicho compuesto de Fórmula VIA la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-,
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
X representa dos átomos de hidrógeno u oxo,
Y^{1} e Y^{2} representan juntos el puente
de oxígeno -O-, o
Y^{1} representa hidroxi, e
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{7} o, si X representa H_{2}, también
alcanoiloxi C_{1}-C_{7},
y sales de compuestos en los que X representa
oxo e Y^{2} representa hidroxi.
\newpage
19. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 18, en el que el compuesto de Fórmula VIA se prepara
hidrolizando un compuesto correspondiente a la Fórmula VIIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-,
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
X representa dos átomos de hidrógeno u oxo,
Y^{1} e Y^{2} representan juntos el puente
de oxígeno -O-, o
Y^{1} representa hidroxi, e
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{7} o, si X representa H_{2}, también
alcanoiloxi C_{1}-C_{7},
y sales de compuestos en los que X representa
oxo e Y^{2} representa hidroxi.
20. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que el compuesto de Fórmula VIIA se prepara
haciendo reaccionar un compuesto de Fórmula VIIIA con una fuente de
ion cianuro en presencia de una sal de metal alcalino, teniendo
dicho compuesto de Fórmula VIIIA la estructura:
en la
que
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-,
\newpage
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo orientado en alfa o
beta:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
X representa dos átomos de hidrógeno u oxo,
Y^{1} e Y^{2} representan juntos el puente
de oxígeno -O-, o
Y^{1} representa hidroxi, e
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{7} o, si X representa H_{2}, también
alcanoiloxi C_{1}-C_{7},
y sales de compuestos en los que X representa
oxo e Y^{2} representa hidroxi.
21. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho compuesto de substrato corresponde
a la Fórmula IIB:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
22. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 21, en el que dicho compuesto de Fórmula IIB se
prepara retirando un grupo 11-metilsulfoniloxi de un
compuesto de Fórmula IVB:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
23. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22, en el que dicho compuesto de Fórmula IVB se
prepara haciendo reaccionar un agente metilsulfonilante con un
compuesto de Fórmula VB:
\vskip1.000000\baselineskip
24. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 23, en el que dicho compuesto de Fórmula VB se
prepara haciendo reaccionar un compuesto de Fórmula VIB con un
metóxido de metal alcalino, teniendo dicho compuesto de Fórmula VIB
la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
25. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24, en el que el compuesto de Fórmula VB se prepara
hidrolizando un compuesto correspondiente a la Fórmula VIIB:
\vskip1.000000\baselineskip
26. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, en el que el compuesto de Fórmula VIIB se prepara
haciendo reaccionar un compuesto de Fórmula VIIIB con una fuente de
ion cianuro en presencia de una sal de metal alcalino, teniendo
dicho compuesto de Fórmula VIIIB la estructura:
27. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 26, en el que el activador de
peróxido es tricloroacetamida.
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