ES2281935T3

ES2281935T3 - Antigeno cancerigeno humano ny eso-1/ca6 y gen que codifica para el mismo.

Info

Publication number: ES2281935T3
Application number: ES98949385T
Authority: ES
Inventors: Rong Fu Wang; Steven A. Rosenberg
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1997-10-08
Filing date: 1998-09-21
Publication date: 2007-10-01
Anticipated expiration: 2018-09-21
Also published as: EP1021535B1; WO1999018206A2; EP1021535A2; WO1999018206A3; ATE356206T1; DE69837273D1; AU9572098A; DE69837273T2

Abstract

Péptido cancerígeno aislado que comprende la secuencia de aminoácidos MLMAQEALAF LMAQGAMLAA QERRVPRAAE VPGAQGQQGP RGREEAPRGV RMAARLQG (SEC ID nº: 5), o una parte funcional o derivado del mismo, en el que dicha parte funcional o derivado se reconoce inmunológicamente por linfocitos T citotóxicos específicos para antígeno, específicos para el péptido que presenta la secuencia de la SEC ID nº: 5 de la figura 3A.

Description

Antígeno cancerígeno humano NY ESO-1/CA6 y gen que codifica para el mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al área dela terapéutica y el diagnóstico del cáncer incluyendo una vacuna contra el cáncer. Más específicamente, la invención se refiere a un péptido cancerígeno humano nuevo o una parte funcional o derivado del mismo, derivado de un marco de lectura abierto alternativo del gen de NY ESO-1/CAG-3, y a un ácido nucleico aislado que codifica para el péptido cancerígeno.

Antecedentes de la invención

La transferencia adoptiva de linfocitos que se infiltran en el tumor (TIL) puede mediar la remisión tumoral en pacientes con melanoma metastásico, sugiriendo que existen antígenos de rechazo del tumor reconocidos por células T en estas células tumorales. La disponibilidad de tales células T ha hecho posible clonar y secuenciar los genes que codifican para antígenos del melanoma humano. Los antígenos identificados hasta la fecha del melanoma humano pueden dividirse en dos clases basándose en sus patrones de expresión. Los antígenos de la primera clase están codificados por genes que se expresan sólo en tumores y testículos, pero no en otros tejidos humanos normales. MAGE1, MAGE3, GAGE y BAGE son ejemplos de esta clase. La segunda clase de antígenos representa antígenos de diferenciación codificados por genes que se expresan sólo en melanocitos, melanomas, y retina normal. MART-1/Melan-A, gp100 y tirosina son ejemplos de esta clase. Todos estos antígenos son proteínas propias no mutadas. Sin embargo, se identificaron también varios antígenos mutados que van a reconocerse por células T, incluyendo CDK-4, B-catenina y Mum-1. La identificación de los epítopos antigénicos reconocidos por células T derivados de los productos génicos correspondientes es importante no sólo para entender el mecanismo de la respuesta inmunitaria frente a antígenos propios, sino también para desarrollar nuevas estrategias inmunoterapéuticas eficaces con estos antígenos o péptidos sintéticos para el tratamiento de pacientes con cáncer.

Estudios previos mostraron que la infusión de TIL586 más IL-2 en un paciente autólogo con melanoma dio como resultado la remisión objetiva de la metástasis. Más recientemente, se clonó el gen de la proteína 1 relacionada con tirosinasa (TRP-1 o gp75), que codifica para el antígeno tumoral reconocido por TIL586 en asociación con HLA-A31. De manera interesante, el producto del gen, gp75, se identificó originalmente como un antígeno reconocido por anticuerpos IgG en el suero de un paciente con melanoma metastático. Se descubrió que el gen se expresaba sólo en melanoma, líneas celulares de melanocitos normales, y retina, pero no otros tejidos normales sometidos a prueba. Por tanto, este gen es un miembro de la segunda clase de antígenos que incluye MART-1/Melan-A, gp100 y tirosinasa.

Wang, R. F. et al. J. Exp. Med. Vol. 183, págs. 1131-1140 (1996) notificaron la identificación de un péptido cancerígeno codificado a partir de una secuencia de marco de lectura abierto alternativo dentro del gen TRP-1 que se reconoce específicamente por las células TIL 586 clonadas. Wang, R.F. et al J. Exp. Med. volumen 184, págs. 2207-2216 (1996) identificaron un segundo antígeno tumoral, TRP-2, reconocido por un clon de CTL restringido por HLA-A31 derivado de la línea celular TIL 586.

La presente invención consiste en la identificación y el aislamiento de antígenos tumorales nuevos distintos de TRP-1 y TRP-2 que son reconocidos por clones de CTL derivados de la línea celular TIL 586. Los péptidos cancerígenos de la invención son útiles como inmunógenos y vacunas para inhibir o prevenir cáncer en un mamífero y como un agente de diagnóstico para detectar cáncer o precáncer.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un péptido nuevo y partes del mismo reconocidas como un antígeno cancerígeno por linfocitos T.

Los péptidos cancerígenos de la presente invención están codificados por todo o una parte de un marco de lectura abierto alternativo (SEC ID nº: 3) del gen NY ESO-1/CAG-3 (término utilizado de manera intercambiable en la presente memoria con CAG-3) (SEC ID nº: 1). CAG-3 es un posible antígeno tumoral que puede provocar una respuesta inmunitaria específica para antígeno por las células T.

Un aspecto de la invención es un péptido cancerígeno aislado que comprende la secuencia de aminoácidos MLMAQEALAF LMAQGAMLAA QERRVPRAAE VPGAQGQQGP RGREEAPRGV RMAARLQG (SEC ID nº: 5), o una parte funcional o derivado del mismo, en el que dicha parte funcional o derivado se reconoce inmunológicamente por linfocitos T citotóxicos específicos para antígeno para el péptido que presenta la secuencia de la SEC ID nº: 5 de la figura 3A.

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Otro aspecto de la presente invención es un péptido cancerígeno aislado, parte o derivado del mismo, codificado por

1

en el que la parte o derivado del mismo se reconoce por células T citotóxicas específicas para antígeno, específicas para el péptido que presenta la secuencia de la SEC ID nº: 5 de la figura 3A.

Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende por lo menos un péptido cancerígeno de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la presente invención es un inmunógeno que comprende el péptido cancerígeno de la invención solo o en combinación con por lo menos una molécula inmunoestimuladora, en el que dicho inmunógeno provoca linfocitos T citotóxicos específicos para antígeno. La composición farmacéutica es útil para tratar o prevenir cáncer en un mamífero, en la que se administra la composición farmacéutica al mamífero en una cantidad eficaz para prevenir o inhibir cáncer en el mamífero.

Un aspecto adicional de la invención es un ácido nucleico aislado que codifica para un péptido cancerígeno de la invención, en el que el ácido nucleico no codifica para la SEC ID nº: 4 de la figura 3A. La invención proporciona además oligonucleótidos que consisten en un ácido nucleico complementario a la parte de la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID nº: 3 que codifica para el péptido que presenta la secuencia de la SEC ID nº: 5 para su uso como sondas o cebadores.

La presente invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico mencionado anteriormente que codifica para un péptido cancerígeno de la invención solo o en combinación con una secuencia de ADN que codifica para por lo menos una molécula inmunoestimuladora.

La presente invención proporciona asimismo un virus recombinante que ha incorporado dentro del genoma viral o parte del mismo, el ácido nucleico mencionado anteriormente que codifica para un péptido cancerígeno de la invención.

La invención proporciona asimismo células aisladas transfectadas o transducidas con el vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico mencionado anteriormente que codifica un péptido cancerígeno de la invención solo o en combinación con una secuencia de ADN que codifica para por lo menos una molécula inmunoestimuladora. La presente invención proporciona asimismo células aisladas transfectadas o transducidas con el virus recombinante que ha incorporado dentro del genoma viral o parte del mismo, el ácido nucleico mencionado anteriormente que codifica para un péptido cancerígeno de la invención. Los vectores y las células pueden servir como vacunas en las que la expresión de un péptido cancerígeno da como resultado la estimulación de linfocitos T específicos para antígeno tumoral en un mamífero inmunizado con la vacuna.

La presente invención proporciona un método de producción de manera recombinante de un péptido cancerígeno de la invención que comprende:

a. insertar una secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº: 3 o parte o variante de la misma, dentro de un vector de expresión;

b. transferir el vector de expresión dentro de una célula huésped;

c. cultivar la célula huésped en condiciones apropiadas para la expresión del péptido cancerígeno o parte funcional o derivado del mismo; y

d. recoger el péptido cancerígeno recombinante, o parte funcional o derivado del mismo.

La presente invención también proporciona un método de detección in vitro de la presencia de cáncer o precáncer en un mamífero que comprende:

a. poner en contacto un ácido nucleico complementario a la parte de la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID nº: 3 que codifica para el péptido que presenta la secuencia de la SEC ID nº: 5, con por lo menos una muestra biológica de prueba de ARNm tomada del mamífero en condiciones que permiten formar un complejo entre la secuencia y el ARNm;

b. detectar el complejo;

c. comparar la cantidad de ARNm en la muestra de prueba con una cantidad de ARNm de una muestra biológica normal conocida, en la que un aumento de la cantidad de ARNm de la muestra de prueba es indicativo de cáncer o precáncer.

La presente invención también proporciona un método de detección in vitro del péptido cancerígeno de la invención en una muestra biológica que comprende:

a. poner en contacto la muestra con anticuerpos específicos para dicho péptido cancerígeno en condiciones para formar un complejo inmunitario, y

b. detectar la presencia del complejo inmunitario.

Otro aspecto más de la invención es un animal transgénico no humano que porta y expresa un gen que consiste en la SEC ID nº: 3 o una parte o derivado del mismo, en el que dicha parte o derivado codifica para un péptido reconocido inmunológicamente por linfocitos T citotóxicos específicos para antígeno, específicos para el péptido que presenta la secuencia de la SEC ID nº: 5 de la figura 3A. Tales animales transgénicos son útiles para seleccionar agentes terapéuticos útiles para tratar cáncer.

Otro aspecto de la presente invención es un linfocito T citotóxico humano específico para antígeno cancerígeno aislado provocado por el péptido cancerígeno de la invención.

Aún otro aspecto de la invención son anticuerpos monoclonales y policlonales o partes de unión a antígeno de los mismos que se unen al péptido cancerígeno codificado por la SEC ID nº: 3, para su uso en ensayos de diagnóstico y detección. Los anticuerpos monoclonales y policlonales pueden proporcionarse en forma de un kit solo, o junto con otros reactivos usados comúnmente en ensayos de diagnóstico y detección.

La presente invención proporciona asimismo una composición farmacéutica que comprende un virus recombinante que ha incorporado dentro del genoma viral o parte del mismo, el ácido nucleico mencionado anteriormente que codifica para un péptido cancerígeno de la invención, solo o en combinación con una molécula inmunoestimuladora exógena, fármaco quimioterapéutico, antibiótico, fármaco antifúngico, fármaco antiviral o combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona la utilización de una cantidad eficaz de un péptido cancerígeno de la invención solo o en combinación con una molécula de HLA o un fragmento de la misma para la preparación de un medicamento, en la que dicha cantidad es eficaz para prevenir o inhibir cáncer en un mamífero.

La presente invención proporciona la utilización de un virus recombinante que ha incorporado dentro del genoma viral o parte del mismo, el ácido nucleico mencionado anteriormente que codifica para un péptido cancerígeno de la invención, solo o en combinación con una molécula inmunoestimuladora, para la preparación de un medicamento, para prevenir o inhibir cáncer en un mamífero.

La presente invención proporciona la utilización de linfocitos T para la preparación de un medicamento, preferentemente para inhibir melanoma en un mamífero, en el que los linfocitos T se exponen in vitro a un péptido cancerígeno de la invención solo o en combinación con una molécula de MHC, o un fragmento de la misma, durante un tiempo suficiente para provocar linfocitos T específicos para péptido cancerígeno.

Las formas de realización preferidas del objetivo de la invención reivindicada en la presente solicitud se expone en las reivindicaciones 2 a 4, 6, 9, 11 a 13, 19 a 22, 26, 28 a 30, 39, 40 y 43.

Breve descripción de las figuras

Estos y otros objetos, características, y muchas de las ventajas que comportan la invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la descripción detallada siguiente haciendo referencia a los dibujos acompañantes:

Las figuras 1A a 1C muestran la liberación de GM-CSF de CTL clonados a partir de TIL586 en respuesta a la estimulación mediante diversas células que expresan el antígeno. Los clones de CTL se aislaron mediante el método de dilución limitante y se expandieron adicionalmente. 1A: Se midió la liberación de GM-CSF por el clon 4 de CTL tras el cultivo conjunto con diferentes células diana. 1B y 1C: En un experimento separado, se determinó la liberación de GM-CSF por los clones 5 y 10 de CTL tras el cultivo conjunto con diferentes estimuladores. NHEM680 es una línea celular de melanocitos normal positiva para HLA-A31, 397mel es una línea celular de melanocitos normal positiva para HLA-A31, 397mel es una línea celular de melanoma negativa para HLA-A31 y 586mel es una línea celular de melanoma positiva para HLA-A31.

La figura 2 muestra la liberación de GM-CSF del clon 5 de CTL y del clon 10 de CTL en respuesta a la estimulación por diversos antígenos tumorales conocidos.

La figura 3A: secuencia de nucleótidos y aminoácidos de NY-ESO-1. La numeración de la secuencia de nucleótidos de NY-ESO-1 comienza a partir del primer nucleótido en la región 5' no traducida. ORF1 representa el producto génico de NY-ESO-1, y ORF2 representa un producto génico de 58 aminoácidos traducido a partir de ORF2. Los péptidos antigénicos reconocidos por el clon 2 y 5 de CTL están puestos en una caja. Además, se subraya un péptido poco reconocido por el clon 5 de CTL.

La figura 3B: alineación de secuencia de la proteína ESO-ORF1 con el componente F de la enterobactina sintetasa (número de registro g250614) y proteína del tegumento del virus herpes simple de tipo 1 (número de registro. p10220). Los residuos se numeran representando el primer sitio de inicio el primer aminoácido. Se muestra también la alineación de ESO-ORF2 y la glutamato deshidrogenasa (número de registro g1942184). Se indica la sustitución de aminoácidos conservados mediante el símbolo +. La figura 4 muestra que las células COS-7 transfectadas con CAG-3 y una molécula de HLA-A31 se reconocen por linfocitos del clon 5 de CTL.

Las figuras 5A-5C: caracterización de ESO9-54 de 9-meros y ESO10-53 de 10-meros derivados del marco de lectura abierto normal. La figura 5A: se pulsaron células B de 586EBV o 1510EBV con péptidos ESO10-53 y ESO9-54 a diferentes concentraciones durante 120 min. Después de dos lavados con medio AIM-V con 120 UI de IL-2, se añadió el clon 5 de CTL (1 x 10^{5}/pocillo) y se incubó durante de 18 a 24 h. Se determinó la liberación de GM-CSF por el clon 5 de CTL mediante ELISA. La figura 5B: se lisaron células 586mel mediante el clon 5 de CTL, pero las células 397mel no se lisaron mediante el clon 5 de CTL a diferentes razones de E:T. La figura 5C: se marcaron células B de 586EBV y 1510EBV con cromo durante toda la noche. Se pulsó después el péptido ESO10-53 sobre las células 586EBV, 1510EBV, y T2 marcadas con cromo, durante 120 min. Se pulsó también un péptido irrelevante que contenía un motivo de unión a péptido HLA-A31 sobre las células B de 586EBV, 1510EBV marcadas con cromo como controles negativos. Después de la incubación del péptido y dos lavados, se determinó la citólisis de las células diana mediante el clon 5 de CTL en un ensayo de liberación de cromo de 4 h. Se usó T2 pulsadas con el péptido ESO10-53 para el control de la especificidad.

Las figuras 6A-6H. Los clones 2 y 14 de CTL reconocen el gen NY-ESO-1, pero no el péptido ESO10-53 derivado de la proteína NY-ESO-1. Los clones 2, 14 y 5 de CTL reconocieron NY-ESO-1 cuando se cotransfectaron con ADNc de HLA-A31 dentro de COS-7 (figura 6A, C, E y G). TIL1244, que reconoció TRP-2 pero no NY-ESO-1, se usó como un control de la especificidad. Las figuras 6B, D, F y H: los clones 2, 5, 14, de CTL y TIL1244 reconocieron 586mel. Sin embargo, los clones de CTL 2 y 14 no reconocieron el péptido ESO10-53, mientras que el clon 5 de CTL reconoció totalmente el péptido ESO10-53 cuando se pulsó sobre células B de 586EBV positivas para HLA-A31. TIL1244 reconoció el péptido TRP197-205 derivado de TRP-2, las células B de 586EBV solas o pulsadas con el péptido ORF3P a partir de un marco de lectura alternativo de TRP1, fueron controles negativos. 397mel es una línea tumoral positiva para NY-ESO-1, negativa para HLA-A31.

Las figuras 7A-7C: un marco de lectura abierto alternativo del gen NY-ESO-1 y péptidos antigénicos reconocidos por CTL. La figura 7A: identificación de péptidos antigénicos a partir del ORF2. Se sintetizaron treinta péptidos basándose en todos los posibles ORF y se seleccionaron. Se muestran datos representativos en la presente memoria. Se pulsaron siete péptidos derivados de ORF2 (véase la figura 3A) sobre células B de 1510EBV positivas para HLA-31 y se sometieron a prueba para detectar el reconocimiento de las células T basándose en la liberación de GM-CSF. Se usaron 1510EBV solas como control negativo. La figura 7B: se marcaron células B de 1510EBV con cromo durante 2 h. Se pulsó después el péptido ESORF2-10-18 sobre 1102EBV negativas para HLA-A31 (círculo abierto) y 1500EBV (cuadrado continuo) marcadas con cromo a diferentes concentraciones. Se usó 1510EBV pulsada con ESO10-53, que fue reconocida por el clon 5 de CTL, para el control de la especificidad (círculo continuo). Después de la incubación del péptido y tres lavados, se determinó la citólisis de células diana mediante el clon 2 de CTL en un ensayo de liberación de cromo de 4 h a una razón E:T de 20:1. La figura 7C. Se sometieron a prueba varias líneas tumorales y tumores de mama recientes para el reconocimiento por el clon 2 de CTL para determinar si ORF2 se traduce en diferentes tumores. Se incluyeron las células B de 1510EBV pulsadas con ESO10-53, ORF2-10-18, o solas para evaluar la reactividad y especificidad del clon 2 y 5 de CTL. Se indica la expresión de HLA-A31 en las células tumorales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención comprende péptidos cancerígenos, partes y derivados de los mismos que se reconocen inmunológicamente por linfocitos T del sistema inmunitario. La presente invención describe además epitopo(s) cancerígeno(s) antigénico(s) que está(n) contenido(s) en los péptidos cancerígenos. El epítopo cancerígeno antigénico provoca específicamente una respuesta inmunitaria mediada por células mediante la interacción con células T del sistema inmunitario. Esta interacción entre el epítopo cancerígeno antigénico y las células T provoca que las células T respondan frente, y prevengan, eliminen o reduzcan el cáncer en un mamífero, incluyendo seres humanos.

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El péptido cancerígeno y partes del mismo están ausentes de manera característica o presentes en niveles muy bajos en células normales de la mayoría de las fuentes tisulares y están presentes en niveles altos en células de precáncer y cáncer. La expresión del péptido cancerígeno a niveles altos se correlaciona con la transformación de células normales en una célula cancerígena o precancerígena.

Los péptidos cancerígenos de la presente invención forman parte de, o derivan de, cánceres que incluyen pero no se limitan a melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma de tipo no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer uterino, cáncer cervicouterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y adenocarcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de tiroides y similares.

El término melanoma incluye, pero no se limita a melanomas, melanomas metastásicos, melanomas derivados o bien de melanocitos o bien de nevo de células relacionado con melanocitos, melanocarcinomas, melanoepiteliomas, melanosarcomas, melanoma in situ, melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, melanoma de lentigo maligno, melanoma lentiginoso acral, melanoma invasivo o síndrome de melanoma y mola atípico familiar (FAM-M).

Son de particular interés péptidos cancerígenos, fragmentos o derivados de los mismos reconocidos por CTL autólogo en pacientes con cáncer, en particular melanoma. Son de interés además los péptidos cancerígenos, fragmentos o derivados de los mismos reconocidos por CTL restringidos por MHC (o HLA), en particular CTL restringidos por MHC de clase 1:

El "antígeno tumoral" comprende la proteína tumoral o cancerígena y cualquier parte o péptido de la proteína tumoral o cancerígeno que puede provocar una respuesta antitumoral en mamíferos. En una forma de realización, el antígeno tumoral incluye el producto génico de longitud completa traducido a partir del ORF2 del gen CAG-3. En otra realización, el antígeno tumoral o cancerígeno es de aproximadamente 10 aminoácidos de longitud.

Los "péptidos cancerígenos" tal como se utiliza el término en la presente memoria, comprende cualquier epítopo o fragmento de proteína tumoral o cancerígena, que actúa como un antígeno tumoral.

Los linfocitos T restringidos por MHC son útiles para identificar el producto génico, CAG-3, asociado con cáncer y precáncer. En una forma de realización, un péptido cancerígeno, fragmento o derivado del mismo de la presente invención comprende un epítopo cancerígeno antigénico reconocido inmunológicamente por linfocitos que se infiltran en el tejido (TIL) derivados de un tumor cancerígeno de un mamífero. Son de particular interés epítopos cancerígenos antigénicos reconocidos por células T (CD8^{+}) citotóxicas específicas para antígeno cancerígeno.

En una forma de realización de la invención, el péptido cancerígeno comprende la secuencia de aminoácidos:

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y una parte o derivado funcional de la misma.

En otra forma de realización, el péptido cancerígeno comprende la secuencia de aminoácidos:

AAQERRVPR

(SEC ID nº: 46).

En una forma de realización, el péptido cancerígeno comprende la secuencia de aminoácidos:

Número de posición

12345678910

LAAQERRVPR (SEC ID nº: 47), y epítopos cancerígenos, fragmentos, derivados y homólogos de los mismos. Están asimismo comprendidos dentro del alcance de la presente invención péptidos cancerígenos de la SEC ID nº: 47 que presentan una sustitución de aminoácidos en la posición 1, 2, 6, 9 o una combinación de los mismos siempre que el péptido sustituido mantenga la actividad funcional para estimular los linfocitos T citotóxicos específicos para péptido cancerígeno.

Está asimismo comprendido dentro del alcance de la presente invención un péptido cancerígeno que presenta de uno a aproximadamente 10 aminoácidos adicionales, en el extremo N terminal de la SEC ID nº: 47, preferentemente de uno a aproximadamente 5 aminoácidos, más preferentemente de uno a aproximadamente 3 aminoácidos en el extremo N terminal de la SEC ID nº: 47. En una forma de realización, los péptidos cancerígenos de la presente invención comprenden las secuencias de aminoácidos:

MLAAQERRVPR	\hskip0.3cm (SEC ID nº: 48);
AMLAAQERRVPR	(SEC ID nº: 49); y
GAMLAAQERRVPR	\hskip0.3cm (SEC ID nº: 50).

Los péptidos cancerígenos CAG-3 y el epítopo cancerígeno antigénico contenido dentro del antígeno tumoral de la presente invención se expresan en testículos normales pero no en otros tejidos normales. El antígeno tumoral de la presente invención se presenta en niveles significativamente inferiores comparados con los elevados niveles encontrados en células de precáncer y cáncer. La expresión elevada del antígeno tumoral se correlaciona con la transformación de células normales en una célula cancerígena o precancerígena. CAG-3 se expresa en diversos cánceres incluyendo melanoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga y cáncer de hígado.

Son de interés adicional los péptidos cancerígenos CAG-3, fragmentos o derivados de los mismos reconocidos por CTL restringidos por MHC, en particular CTL restringidos por MHC de clase I. Los CTL restringidos por HLA de clase I incluyen pero no se limitan a HLA-A31, HLAA3, HLA-A11, HLA-A33 y HLA-A68. Un subtipo de HLA preferido reconocido por los péptidos cancerígenos CAG-3 es el subtipo HLA-A31.

Otra forma de realización de la presente invención comprende derivados y variantes de los péptidos cancerígenos que presentan homología suficiente con respecto a CAG-3 o epítopos de los mismos para actuar eficazmente como péptidos cancerígenos. Tales péptidos pueden presentar cambios de aminoácidos conservados en una o más posiciones. Por cambios de aminoácidos conservados se quiere decir, un cambio de aminoácido en una posición particular que es del mismo tipo que el originalmente presente; es decir, un aminoácido hidrófobo intercambiado por un aminoácido hidrófobo, un aminoácido básico por un aminoácido básico, etc. Tales cambios de aminoácidos no modifican significativamente la configuración y la carga global del péptido y por lo tanto tales variantes mantienen o potencian la actividad anticancerígena de un péptido cancerígeno. Los ejemplos de tales cambios conservativos son bien conocidos por el experto en la materia y están dentro del alcance de la presente invención.

La presente invención se refiere asimismo a variantes funcionalmente equivalentes de los péptidos cancerígenos CAG-3. Las "variantes funcionalmente equivalentes" incluyen péptidos con homología de secuencia parcial, péptidos que presentan uno o más cambios de aminoácidos no conservativos y/o conservativos más específicos, conjugados de péptido, proteínas quiméricas, proteínas de fusión y ácidos nucleicos de péptido.

Los péptidos cancerígenos CAG-3, antígeno tumoral y sus epítopos cancerígenos antigénicos pueden purificarse y aislarse de fuentes naturales tales como aislados clínicos primarios, líneas celulares y similares. El péptido cancerígeno CAG-3 y partes del mismo son puros por lo menos en el 90%, preferentemente puros por lo menos en el 95% y tan puros como el 100%. Los péptidos cancerígenos y sus epítopos antigénicos también pueden obtenerse mediante síntesis química o mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Las técnicas para la síntesis química se describen en J.M. Steward y J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969; M. Bodansky et al. "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, segunda edición, 1976, y J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", volumen 2, pág. 46, Academic Press, New York, 1983 y E. Schroder y K. Kubke, "The Peptides", volumen 1, Academic Press, New York, 1965.

Los péptidos cancerígenos CAG-3 y sus epítopos cancerígenos antigénicos pueden formularse con vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones farmacéuticas mediante métodos conocidos en la técnica. La composición es útil como una vacuna para prevenir o tratar cáncer. La composición puede comprender además por lo menos una molécula inmunoestimuladora. Las moléculas inmunoestimuladoras que van a utilizarse junto con el péptido cancerígeno o parte del mismo para estimular respuestas de células T específicas del antígeno, incluyen pero no se limitan a una o más moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), tales como las moléculas de clase I y clase II, preferentemente una molécula de clase I. La composición puede comprender además otras moléculas estimuladoras incluyendo B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, CD72 y similares, y citocinas que incluyen pero no se limitan a IL-1 a IL-15, TNF\alpha, IFN\gamma, RANTES, G-CSF, M-CSF, IFN\alpha, CTAP III, ENA-78. GRO, I-309, PF-4, IP-10, LD-78, MGSA, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, o una combinación de las mismas, y similares para la inmunopotenciación.

La molécula estimuladora puede proporcionarse como una entidad físicamente separada o puede proporcionarse en la membrana de una célula presentadora de antígeno tal como una célula B, macrófago o célula dendrítica, en la membrana de un liposoma, o expresarse sobre la superficie de una célula transducida o transfectada. Las secuencias de ADN de las moléculas inmunoestimuladoras de MHC están disponibles de GenBank y similares.

Los péptidos cancerígenos CAG-3, antígeno tumoral y sus epítopos cancerígenos antigénicos son útiles para prevenir o tratar cáncer y útiles en ensayos de diagnóstico para detectar cáncer o precáncer en un mamífero, incluyendo seres humanos. Los péptidos cancerígenos o partes de los mismos pueden estar en forma de un derivado en el que se unen a él otros constituyentes tales como marcadores radiactivos, biotina, fluoresceína. Puede unirse también un agente de selección como diana al antígeno tumoral, péptidos cancerígenos o partes de los mismos que permite seleccionar como diana específica a un órgano específico, tumor o tipos celulares. Dichos agentes de selección como diana pueden ser hormonas, citocinas, receptores celulares y similares. El péptido cancerígeno, antígeno tumoral y partes de los mismos pueden prepararse en forma de un kit, solo o en combinación con otros reactivos.

Otro aspecto de la invención consiste en una vacuna útil para inducir inmunidad mediada por células específica para tumor contra un cáncer.

Los enfoques de la inmunoterapia del cáncer pueden dividirse en categorías activas o pasivas. La inmunoterapia activa implica la inmunización directa de pacientes con cáncer con antígenos cancerígenos en un intento de reforzar las respuestas inmunitarias frente al tumor. La inmunoterapia pasiva se refiere a la administración de reactivos inmunitarios, tales como células inmunitarias o anticuerpos con reactividad antitumoral con el objetivo de mediar directamente las respuestas antitumorales.

La mayoría de los intentos anteriores en inmunoterapia activa utilizaron o bien células cancerígenas intactas o extractos de células cancerígenas con la expectativa de que estos materiales contengan antígenos tumorales en una cantidad y forma que puedan estimular las respuestas inmunitarias. Sin embargo, la identificación molecular de antígenos cancerígenos ha abierto nuevas posibilidades para desarrollar inmunoterapias para el tratamiento del cáncer humano. Se presenta un resumen de estos enfoques en la tabla 1.

TABLA 1 Terapias de cáncer basadas en la identificación molecular de antígenos cancerígenos

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La inserción del gen que codifica para los antígenos cancerígenos CAG-3 dentro de los sistemas de expresión de alta eficacia tales como E. coli, levadura o baculovirus y similares, proporciona la oportunidad de obtener grandes cantidades de antígeno tumoral purificado para su uso en la inmunización. Alternativamente, los péptidos inmunodominantes de estos antígenos tumorales pueden sintetizarse fácilmente in vitro y purificarse en grandes cantidades para la inmunización solos o en una forma que pretende mejorar su inmunogenicidad tal como en combinación con un adyuvante, unido a lípidos/liposomas o péptidos cooperadores, o pulsado sobre células presentadoras de antígeno. La modificación de aminoácidos individuales de los péptidos inmunodominantes para mejorar la eficacia de unión a antígenos de MHC puede aumentar potencialmente la inmunogenicidad comparado con el péptido
nativo.

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Las técnicas recientes que utilizan ADN "desnudo" inyectado directamente en el músculo o en la piel han mostrado que aumentan tanto las reacciones inmunitarias celulares como humorales frente a antígenos codificados (Cooney, E.L., A.C. Collier, P.D. Greenberg, R.W. Coombs, J. Zarling, D.E. Arditti, M.C. Hoffman, S.L. Hu y L. Correy, 1991, Lancet 337:567; Wolff, J.A., R.W. Malone, P. Williams, W. Chong, G. Acsadi, A. Jani, y P.L. Felgner, 1990, Science 247:1465; Davis, H.L., RG. Whalen, y B.A. Demeniex, 1993, Hum. Gene Ther. 4:151; Yang, N.S., J. Burkholder, B. Roberts, B. Martinelli, y D. McCabe, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568; Williams, R.S., S.A. Johnston, M. Riedy, M.J. DeVit, S.G. McElligott, y J.C. Sanford, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726; Fynan, E.R., Webster, D.H. Fuller, J.R Haynes, J.C. Santoro, y H.L. Robinson, 1995, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:11478; Eisenbraum, M.D., D.H. Fuller, y J.R. Haynes, 1993, DNA and Cell Bio. 12:791; Fuller, D.H. y J.R. Haynes, 1994, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10(11):1433; Acsadi, G., G. Dickson, D.R. Love, A. Jani, F.S. Walsh, A. Gurusinghe, J.A. Wolff, y K.E. Davies, 1991, Nature 352:815). Las técnicas que utilizan vectores de ADN no viables presentan la ventaja de la facilidad de la preparación y seguridad de administración. La secuencia de ácido nucleico de la presente invención es útil como inmunógeno y como una vacuna de ADN contra el cáncer. La secuencia de ácido nucleico de la presente invención de péptidos cancerígenos CAG-3 puede administrarse usando una pistola génica en cantidades para provocar una respuesta celular frente a una célula cancerígena. Las cantidades en nanogramos son útiles para tales
fines.

Una forma eficaz de inmunización implica la incorporación de genes que codifican para moléculas inmunogénicas dentro de bacterias recombinantes tales como BCG, Salmonella o Listeria o dentro de virus recombinantes tales como vaccinia, viruela aviar o adenovirus y similares. Los genes que codifican para antígenos cancerígenos CAG-3 pueden expresarse o bien solos o bien en combinación con genes que codifican para moléculas inmunoestimuladoras u otros genes que pueden potenciar la respuesta inmunitaria tras la infección. Los estudios con antígenos tumorales modelo en modelos de ratón han mostrado que la incorporación del gen para la interleucina 2 (IL-2) o B7.1 puede aumentar la inmunogenicidad de los antígenos tumorales modelo e incluso mediar la remisión de metástasis establecidas en el pulmón que portan estos antígenos. También puede usarse inmunoterapia activa seguida por la administración exógena de citocinas inmunoestimuladoras tales como IL-2, IL-6, IL-10, o IL-15 para mejorar las respuestas inmunitarias.

La inmunoterapia pasiva con células inmunitarias modificadas genéticamente (comúnmente denominada inmunoterapia adoptiva) que puede reconocer antígenos tumorales humanos, es eficaz para mediar la remisión del cáncer en pacientes seleccionados con melanoma metastásico. Se han desarrollado técnicas in vitro en las que se sensibilizan linfocitos humanos in vitro frente a péptidos inmunodominantes del antígeno tumoral presentados sobre células presentadoras de antígeno. Mediante estimulación in vitro repetitiva, pueden derivarse células con una capacidad mucho mayor de reconocer antígenos tumorales humanos que las TIL que se usaron para clonar los genes que codifican para estos antígenos. Por tanto, mediante la sensibilización in vitro repetida con péptidos del cáncer, pueden derivarse linfocitos con de 50 a 100 veces más potencia de TIL. La transferencia adoptiva de estas células puede ser más eficaz para mediar la regresión del tumor in vivo de lo que son las TIL crecidas de manera convencional.

Para prevenir o inhibir cáncer, los péptidos cancerígenos o partes de los mismos pueden administrarse por medio de una de varias vías que incluyen pero no se limitan a la intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intratecal, intrapleural, intrauterina, rectal, vaginal, tópica, intratumoral y similares.

La administración puede ser mediante medios transmucosos o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se va a penetrar. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal sales biliares y derivados de ácido fusídico. Además, pueden usarse detergentes para facilitar la penetración. La administración transmucosal puede ser mediante pulverizadores nasales, por ejemplo, o supositorios. Para la administración oral, el péptido cancerígeno, antígeno tumoral, parte o variante del mismo se formula en una forma de administración oral convencional tal como cápsulas, comprimidos y tóxicos.

En general, es deseable proporcionar al destinatario una dosificación de péptido cancerígeno CAG-3 o parte del mismo de por lo menos aproximadamente 1 pg por kg de peso corporal, preferentemente por lo menos aproximadamente 1 ng por kg de peso corporal, más preferentemente por lo menos aproximadamente 1 \mug o superior por kg de peso corporal del destinatario. Se prefiere un intervalo de desde aproximadamente 1 ng por kg de peso corporal hasta aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal aunque puede administrarse una dosis superior o inferior. La dosis es eficaz para preparar, estimular y/o provocar la expansión clonal de linfocitos T específicos para el antígeno cancerígeno CAG-3, preferentemente linfocitos T citotóxicos, que a su vez pueden prevenir o inhibir cáncer en el destinatario.

La dosis se administra por lo menos una vez y puede proporcionarse como una administración en bolo o continua. Pueden preferirse administraciones múltiples de la dosis durante un periodo de varias semanas a meses. Las dosis posteriores pueden administrarse tal como se indicó.

Para prevenir cáncer en un mamífero, se administra una vacuna que comprende el péptido cancerígeno CAG-3 o una parte del mismo al mamífero en una cantidad eficaz para prevenir cáncer en el mamífero. Es de particular interés una vacuna que comprende la SEC ID nº: 46, 47 o una combinación de la misma.

Para reducir la carga tumoral en animales que presentan tumores, se administra una cantidad eficaz de un epítopo cancerígeno antigénico CAG-3 en un sitio de carga tumoral, siendo eficaz dicha carga para reducir el tamaño del tumor en el sitio.

Pueden obtenerse linfocitos citotóxicos autólogos o linfocitos que se infiltran en el tumor a partir de un paciente con cáncer. Los linfocitos se hacen crecer en cultivo y se expanden linfocitos específicos para antígeno cultivando en presencia de péptidos cancerígenos específicos o epítopos cancerígenos antigénicos solos o en combinación con por lo menos una molécula inmunoestimuladora con citocinas. Los linfocitos específicos de antígeno se infunden después otra vez en el paciente en una cantidad eficaz para reducir o eliminar los tumores en el paciente.

Después de la inmunización, puede valorarse la eficacia de la vacuna mediante la producción de células inmunitarias que reconocen el antígeno cancerígeno, tal como se valora mediante la actividad lítica específica, producción de citocinas específicas, remisión tumoral o combinación de estos. Si el mamífero que va a inmunizarse está ya aquejado de cáncer o metástasis de cáncer, la vacuna puede administrarse junto con otros tratamientos terapéuticos tales como inmunomoduladores, por ejemplo, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, interferón, factor de necrosis del tumor y similares, fármacos quimioterapéuticos tales como cisplatino, fármacos antivirales tales como ganciclovir, anfotericina B, antibióticos y similares.

Otro aspecto de la invención consiste en una secuencia de ADN que codifica para un péptido cancerígeno de la invención, en la que la secuencia de ADN no codifica para la SEC ID nº: 4 de la figura 3A.

En una forma de realización, la secuencia de ADN comprende la SEC ID nº: 3, una parte de la misma y una variante de secuencia funcionalmente equivalente de la misma que codifica para un péptido cancerígeno CAG-3 o partes del mismo reconocidas por linfocitos T específicos para antígeno cancerígeno CAG-3 incluyendo linfocitos que se infiltran en el tumor. Están asimismo comprendidas en la presente invención secuencias de ácido nucleico complementarias, así como anticomplementarias a la SEC ID nº: 3.

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En otra forma de realización, la secuencia de ADN comprende:

CCT CGG GGC CGG GAG GAG GCG CCC CGC GGG

(SEC ID nº: 51).

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En otra forma de realización, la secuencia de ADN de la presente invención codifica para el péptido cancerígeno LAAQERRVPR de la SEC ID nº: 47, el péptido cancerígeno, AAQERRVPR de la SEC ID nº: 46, epítopos cancerígenos, fragmentos, derivados u homólogos de los mismos.

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En una forma de realización, la secuencia de ADN comprende:

CTG GCG GCC CAG GAG AGG CGG GTG CCA CGG

(SEC ID nº: 52)

y variantes de la misma.

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En otra forma de realización, la secuencia de ADN comprende:

GCG GCC CAG GAG AGG CGG GTG CCA CGG

(SEC ID nº: 53)

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Debido a la degeneración del código genético, las variaciones en la secuencia de ADN darán como resultado la traducción de un péptido cancerígeno equivalente. Como resultado, se incluyen sustituciones en el ámbito de la invención siempre que la sustitución de cómo resultado la expresión de un péptido cancerígeno que se reconoce por células T restringidas por HLA específicas para antígeno, específicas para el péptido que presenta la secuencia de la SEC ID nº: 5.

Puede usarse todo o parte del marco de lectura abierto de la secuencia de ADN del gen CAG-3 que codifica para el péptido que presenta la secuencia de la SEC ID nº: 5 como sondas para identificar y aislar los homólogos del péptido cancerígeno en otras especies de mamífero. En una forma de realización, se usa una secuencia de ADNc humana para examinar una biblioteca de ADNc de mamífero para determinar una secuencia de ácido nucleico homóloga de murinos. Se seleccionan y secuencian clones positivos. Los ejemplos de fuentes tisulares a partir de los cuales puede sintetizarse la biblioteca de ADNc incluyen pero no se limitan a dermis, epidermis, tumores sólidos, melanomas, melanocitos, y similares. Un experto en la materia apreciará las condiciones de hibridación apropiadas que van a usarse para detectar los homólogos. Los métodos convencionales para la construcción de bibliotecas de hibridación de ácido nucleico y las técnicas de clonación se describen en Sambrook et al, (eds) (1989) en "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York y Ausubel et al. (eds) en "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley and Sons, New York, New York.

Otro aspecto de la invención consiste en sondas de ácido nucleico para la detección y cuantificación de ARN que transcribe los péptidos cancerígenos de la invención en muestras biológicas aisladas de un mamífero con cáncer. Las alteraciones en el nivel de ARN en relación con una muestra de ARN de control son útiles en el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad en el mamífero.

En una forma de realización, el ARNm se deriva del tejido de un paciente que se sospecha que presenta cáncer o precáncer y se compara con el ARNm derivado de un sujeto control sano. Un aumento cuantitativo y/o cualitativo del ARNm que codifica para un péptido cancerígeno de la invención en el paciente, comparado con el control, es indicativo de cáncer o precáncer en el paciente. El ARNm puede detectarse usando sondas de oligonucleótidos que pueden hibridar con el ARNm. En una forma de realización, la sonda puede hibridar con el producto de transcripción de la SEC ID nº: 51.

Pueden usarse combinaciones de pares de oligonucleótidos basados en la secuencia que codifica para el péptido cancerígeno de la invención, como cebadores de PCR para detectar ARNm en muestras biológicas usando el procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para amplificar secuencias de ARN seleccionadas. La presente invención comprende asimismo PCR in situ y RT-PCR in situ para la detección de ADN y ARN que codifican para los péptidos cancerígenos de la invención. Se prefiere la técnica cuando el número de copias de un ácido nucleico diana es muy bajo, o cuando deben distinguirse diferentes formas de ácidos nucleicos. El método es especialmente útil para detectar y diferenciar células cancerígenas y precancerígenas de células
normales.

La presente invención comprende asimismo un vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de ADN que codifica para un péptido cancerígeno de la invención. Opcionalmente, el vector también comprende una secuencia de ADN que codifica para por lo menos una molécula inmunoestimuladora. El vector también contiene un gen que codifica para una proteína fluorescente verde para su uso en la detección de la ubicación de péptidos cancerígenos CAG-3 en células y tejidos.

Los vectores de expresión eucariotas incluyen pero no se limitan a vectores retrovirales, vectores de virus vaccinia, vectores de adenovirus, vectores de virus herpes, vectores de virus de la viruela aviar, vectores de baculovirus, vectores de virus del papiloma humano, vectores de encefalitis equina, vectores de virus de la gripe y similares.

La presente invención comprende un virus recombinante que expresa un péptido cancerígeno CAG-3 de la invención. El virus recombinante también puede expresar por lo menos una molécula inmunoestimuladora. El virus recombinante puede provocar o regular por incremento una respuesta inmunitaria mediada por células en un mamífero con el fin de prevenir o tratar cáncer en el mamífero, particularmente seres humanos.

Una célula huésped infectada con el virus recombinante expresa el péptido cancerígeno de la invención, solo o en combinación con por lo menos una molécula inmunoestimuladora. La célula huésped también puede infectarse con un virus recombinante que expresa una molécula de HLA de clase I.

Los métodos para construir y expresar productos génicos exógenos a partir de vectores de virus vaccinia se dan a conocer por Perkus et al. Science 229:981-984, 1985, Kaufman et al. Int. J. Cancer 48:900-907, 1991, Moss Science 252:1662, 1991, Smith y Moss BioTechniques nov/dic, pág. 306-312,1984, y patente US nº 4.738.846. Sutter y Moss (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10847-10851, 1992) y Sutter et al (Virology 1994) dan a conocer la construcción y uso como vector, del virus Ankara recombinante que no se replica (MVA, Ankara vaccinia modificado) que puede usarse como un vector viral en la presente invención. Baxby y Paoletti (Vaccine 10:8-9, 1992) dan a conocer la construcción y uso como vector, de un virus de viruela que no se replica, incluyendo virus de la viruela del canario, virus de la viruela aviar y otras especies de aves para su uso como un vector viral en la presente invención.

Los vectores de la presente invención pueden colocarse en una célula huésped apropiada para la expresión del péptido cancerígeno de la invención o epítopo cancerígeno antigénico del mismo. Las líneas de células huésped eucariotas incluyen pero no se limitan a células COS, células Hela, células NIH/3T3, células de insecto, células presentadoras de antígeno tales como células dendríticas y similares. Opcionalmente, la célula huésped también puede expresar una molécula inmunoestimuladora. En el caso en el que las células huésped expresan tanto el péptido cancerígeno o el epítopo cancerígeno antigénico en combinación con por lo menos una molécula de MHC (o HLA), se prefiere que se use un sistema de expresión eucariota para permitir una glucosilación apropiada. La expresión tanto del antígeno cancerígeno como de la molécula inmunoestimuladora por la célula huésped proporciona péptido restringido por MHC necesario para células T específicas y la señal apropiada para que la célula T ayude en el reconocimiento y proliferación del antígeno o expresión clonal de células T específicas para antígeno. El resultado global es una regulación por incremento del sistema inmunitario. La regulación por incremento de la respuesta inmunitaria se manifiesta mediante un aumento de los linfocitos citotóxicos específicos para antígeno cancerígeno que pueden destruir o inhibir el crecimiento de las células cancerígenas o precancerígenas.

El ADN puede insertarse en la célula huésped mediante transfección, transducción, liposomas y similares mediante métodos conocidos en la técnica. (Sambrook et al., 1989, en: "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor press, Plainview, New York). Para liposomas, se prefieren lípidos catiónicos, por ejemplo, lípido policatiónico, dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DMRIE) formando un complejo con el fosfolípido neutro dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) tal como se da a conocer por Nabel, E.G. et al., 1992, Hum. Gene. Ther. 3:367-275; Nabel, GJ. et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:649-656; Stewart, MJ. et al. 1992 Hum. Gene Ther. 3:399-410; Nabel, GJ. et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11307-11311; y Harrison, G.S. et al. 1995 Bio Techniques 19:816-
823.

La proteína cancerígena recombinante de la invención, antígeno tumoral o epítopo cancerígeno antigénico expresado por las células huésped puede purificarse a partir de lisados celulares o sobrenadantes celulares mediante procedimientos de purificación de proteínas convencionales conocidos en la técnica. Éstos incluyen pero no se limitan a cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio iónico, isoelectroenfoque, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, HPLC, HPLC en fase inversa y similares. (Ausubel et al., 1987, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY). También puede usarse la cromatografía de inmunoafinidad para la purificación usando anticuerpos de proteínas anticancerígenas o fragmentos de unión a antígeno de los mismos tal como se describe en la presente memoria, como el agente de inmunoafinidad.

El virus recombinante también puede usarse como un terapéutico o vacuna. En tales casos, es deseable proporcionar al destinatario una dosificación del virus recombinante en el intervalo de desde aproximadamente 10^{5} hasta aproximadamente 10^{10} unidades formadoras de placa/mg de mamífero, aunque puede administrarse una dosis inferior o superior.

El vector viral recombinante puede introducirse en un mamífero o bien antes de cualquier evidencia de cáncer tal como melanoma o bien para mediar la remisión de la enfermedad en un mamífero aquejado de un cáncer tal como melanoma. Los ejemplos de métodos para administrar el vector viral en mamíferos incluyen, pero no se limitan a, exposición de células al virus recombinante ex vivo, o inyección del virus recombinante en el tejido aquejado o administración intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular y similares del virus. Alternativamente, el vector viral recombinante o la combinación de vectores virales recombinantes pueden administrarse localmente mediante inyección directa en la lesión cancerosa o aplicación tópica en un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. La cantidad de vector viral recombinante, que porta la secuencia de ácido nucleico de interés, se basa en el título de las partículas de virus. Un intervalo preferido para la inmunización es de aproximadamente 10^{5} a 10^{10} partículas de virus por mamífero, preferentemente un ser humano.

La invención proporciona un animal transgénico no humano al que se le ha incorporado en su genoma una o más copias de la secuencia de ADN que codifica para un péptido cancerígeno de la invención. El método general para producir animales transgénicos se describe en la patente US nº 5.175.384 de Krimpenfort et al., patente US nº 5.175.383 de Leder et al., patente US nº 5.175.385 de Wagner et al., patente US nº 4.870.009 de Evans et al., y patente US nº 5.174.986 de Berns. La incorporación del gen da como resultado la sobreexpresión, expresión alterada, o expresión de múltiples formas o variantes de los péptidos cancerígenos. El animal transgénico resultante es útil en estudios del desarrollo de antígenos tumorales o cancerígenos de la presente invención. El modelo animal es útil para seleccionar vacunas y fármacos quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer. El animal transgénico también es útil en estudios del desarrollo de cáncer.

Esta invención comprende además un anticuerpo aislado o parte de unión a antígeno del mismo provocado por la inmunización del péptido cancerígeno de la presente invención. En el caso en el que el péptido cancerígeno se comprende de sólo unos pocos aminoácidos, el péptido cancerígeno puede conjugarse con una proteína portadora con el fin de provocar una respuesta de anticuerpos. Las proteínas portadoras tales como KLH, toxoide tetánico y similares y los métodos de conjugación se conocen en la técnica. El anticuerpo presenta especificidad para y reacciona o se une con el péptido cancerígeno de la presente invención.

Las moléculas de anticuerpo a modo de ejemplo son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas o las partes de una molécula de inmunoglobulina que contiene el sitio de unión a antígeno, incluyendo las partes de moléculas de inmunoglobulina conocidas en la técnica como F (ab), F (ab'), F (ab')_{2}, anticuerpo quimérico humanizado, y F (v). Pueden producirse anticuerpos policlonales o monoclonales mediante métodos conocidos en la técnica. (Kohler y Milstein (1975) Nature 256, 495-497; Campbell "Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" en Burdon et al. (eds.) (1985) "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", volumen 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam). Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno también pueden producirse mediante ingeniería genética. La tecnología para la expresión tanto de genes de cadena pesada como ligera es el sujeto de las solicitudes de patente PCT: publicación número WO 901443, WO 9014424, Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281, y patente US nº 4.946.778. Se describen inmunoglobulinas humanizadas que presentan una o más regiones determinantes de la complementariedad y métodos de producción de los anticuerpos en las patentes US nº 5.585.089 y
nº 5.530.101.

En una forma de realización, los anticuerpos de la presente invención se usan en inmunoensayos para detectar péptidos cancerígenos de la invención en muestras biológicas. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden usarse para detectar péptidos cancerígenos en muestras de biopsia de tejido de un mamífero aquejado de cáncer. La valoración del antígeno cancerígeno en un tejido deseado puede usarse para pronosticar la evolución de la enfermedad en un mamífero o puede diagnosticar la eficacia de un tratamiento. El inmunoensayo puede ser un radioinmunoensayo, ensayo de inmunotransferencia de tipo Western, ensayo inmunofluorescente, inmunoensayo de enzimas, ensayo quimioluminiscente, ensayo inmunohistoquímico y similares y puede realizarse in vitro, in vivo o in situ. Se describen técnicas convencionales conocidas en la técnica para ELISA en "Methods in Immunodiagnosis", 2ª edición, Rose y Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell et al. "Methods and Immunology", W.A. Benjamin, Inc., 1964; y Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904. Se describen métodos convencionales para inmunohistoquímica en Harlow y Lane (eds) (1988) en "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Ausbel et al. (eds) (1987) en Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons (New York, NY). Las muestras biológicas apropiadas para tales ensayos de detección incluyen pero no se limitan a células, biopsias de tejido, sangre completa, plasma, suero, esputos, fluido cerebroespinal, fluido pleural, orina y similares.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención también pueden usarse en inmunoterapia. Los anticuerpos o fragmento de unión a antígeno de los mismos se proporcionan a un mamífero en una cantidad suficiente para prevenir, aliviar o atenuar la gravedad, grado o duración del cáncer.

Aunque la invención se describe anteriormente en relación con ciertas formas de realización específicas, se entenderá que son posibles muchas variaciones, y que pueden usarse materiales y reactivos alternativos sin apartarse de la invención. En algunos casos tales variaciones y sustituciones pueden requerir algo de experimentación, pero sólo implicarán pruebas de rutina.

Estos ejemplos que no están comprendidos en las reivindicaciones son únicamente a título comparativo.

Ejemplo 1 Materiales y métodos Productos químicos y reactivos

Se adquirieron los siguientes productos químicos y reactivos de las fuentes indicadas: medios RPMI 1640, AIM-V, Lipofectamina, G418 (GIBCO BRL, Gaithersberg, MD); el vector de expresión eucariota pCR3 (Invitrogen, San Diego, CA); anticuerpo monoclonal anti-HLA-A31 (One lambda, Canoga Park, CA); anticuerpo anti-immunoglobulina M conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA).

Linfocitos T citotóxicos (CTL) y líneas celulares

Se aislaron TIL 586 de la muestra tumoral de un paciente con melanoma metastásico y se hicieron crecer en medio que contenía IL-2 (6000 UI/ml) (Chiron) durante 32-60 días tal como se describió anteriormente (Topalian, S., D. Solomon, F. P. Avis, A. E. Chang, D. L. Freeksen, W. M. Linehan, M. T. Lotze, C. N. Robertson, C. A. Seipp, P. Simon, C. G. Simpson, y S. A. Rosenberg, 1988, J. Clin. Oncol. 6:839-53). TIL586 y TIL1244 eran predominantemente células T CD8^{+}. Se hicieron crecer TIL1200 en las mismas condiciones descritas para TIL586. TIL1244 reconoció el péptido TRP-2 en el contexto de HLA-A31 y -A33 (31). Los clones de células T se generaron mediante métodos de dilución limitante (a 1 célula/pocillo) a partir de la línea celular TIL586, usando PBL alogénico (1 x 10^{3} células/pocillo) como células alimentadoras en RPMI1640 que contenía suero AB humano al 10% y 500 UI de IL-2. Después de 12 días, se expandieron los clones de células T en medio AIM-V que contenía 6000 UI/ml de IL-2. Para obtener una expansión óptima, se usó el método de expansión OKT3, descrito por S. Riddell (32). Brevemente, en el día 0, se cultivaron de manera conjunta de 0, 5 x 10^{4} a 5 x 10^{5} células T con HLA-A31^{+} PBL (500:1, razón de PBL:célula T) y células B de 586EBV (100:1, razón de EBV:célula T) en 25 ml de RPMI 1640 que contenía suero humano al 11%, 30 ng/ml de anticuerpo OKT3, y antibióticos. En el día 1, se añadió, IL-2 a una concentración final de 180 UI/ml. Se cambió el medio por medio nuevo que contenía suero humano al 11% y 180 UI/ml de IL-2 en el día 5. El medio se cambió después cada 3 días. En los días 12 a 14, se recogieron las células T, se contaron y conservaron en frío.

Se establecieron las líneas celulares de melanoma 397mel, 397mel/A31, 586mel, 624mel, 624mel/A31 y líneas de células B 586EBV y 1510EBV transformadas con EBV en este laboratorio y se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10% (FCS). Se cultivaron melanocitos cultivados normales derivados del prepucio de lactantes (NHEM680 adquirida de Clonetics, CA) en medio de crecimiento de melanocitos (MGM; Clonetics, CA). El Dr. W. Leonard (NIH) proporcionó la línea celular COS-7.

Se limpiaron 295Br y 1315Br, digestos de tumor de mama conservados en frío recientes, con gradiente de Ficoll antes de su uso en ensayos de células T; se cultivaron células de fibroblastos 1295 del paciente autólogo durante de 22 a 64 días. 1315Br, cultivo A, eran células de tumor de mama que se hicieron crecer en ratones inmunodeficientes y cultivadas después en medio SFM de queratinocitos/FCS al 2% (Life Technologies), y 1315 Br, cultivo B, se hicieron crecer en Hams F12/FCS al 5% durante de 77 a 80 pasajes; estás células las proporcionó amablemente el Dr. Stephen Ethier, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI. 1398Br era una línea de tumor de mama inmortalizada con el virus de papiloma humano (HPV) E6/E7 establecida en el Surgery Branch, National Cancer Institute. Las líneas de tumor de próstata 1535Pro, 1542Pro, y fibroblastos 1510 eran líneas celulares inmortalizadas con HPV E6/E7.

Construcción de una biblioteca de ADNc

Se extrajo el ARN total de 586mel usando el reactivo Trizol (Life Technologies). Se purificó ARN Poli(A) a partir del ARN total mediante el sistema poly AT tract (Promega, Madison, WI) y después se convirtió en ADNc usando un kit de construcción de ADNc (Life Technologies) con un cebador de oligo(dT) que contenía un sitio NotI. Se ligó el ADNc a adaptadores BstXI y se digirieron con NotI, después se ligaron al vector de expresión pcDNA3.1. Se sometió a electroporación la biblioteca de ADNc en células DH10B (Life Technologies). Se prepararon conjuntos de ADN de plásmido, consistiendo cada uno en \sim 100 clones de ADNc, a partir de las bacterias.

Examinación de la biblioteca de ADNc y ensayo de secreción de GM-CSF

Se realizaron la transfección de ADN y el ensayo de GM-CSF tal como se describió previamente (Wang, R. F., P. F. Robbins, Y. Kawakami, X. Q. Kang, y S. A. Rosenberg, 1995, J. Exp. Med. 181:799-804). Brevemente, se mezclaron 200 \mug de ADN que portaba un fragmento diferente y 50 ng del ADN de HLA-A31 con 2 \mul de lipofectamina en 100 \mul de DMEM libre de suero durante 15-45 min. Se añadió después la mezcla de ADN/lipofectamina a las células COS-7 (5 X 10^{4}) y se incubaron durante toda la noche. Al siguiente día, se lavaron las células dos veces con medio DMEM. Se añadieron TIL586, clon 5 de CTL o clon 10 de CTL a una concentración de 5 X 10^{4} células/pocillo en medio AIM-V que contenía 120 UI/ml de IL-2. Después de 18-24 h de incubación, se recogieron 100 \mul de sobrenadante y se midió el GM-CSF en un ensayo de ELISA convencional (R + D Systems, Minneapolis, MN). Para los péptidos, se incubaron células 586EBV, 1510EBV y T2 con péptidos a 37°C durante 90 min, y después se lavaron tres veces con medio AIM-V que contenía 120 UI/ml de IL-2. Se añadieron células T y se incubaron durante 18-24 h adicionales, se recogieron 100 \mul de sobrenadante para el ensayo de GM-CSF. En algunos experimentos, se realizaron ensayos de liberación de IFN-\gamma usando un kit de ELISA convencional (Endogen, Woburn, MA).

Análisis de inmunotransferencia de tipo Northern

Se aisló ARN total mediante el método de centrifugación de isotiocianato de guanidina/cloruro de cesio. Se adquirió ARN total de tejido humano normal de Clontech (Palo Alto, CA). Se sometieron veinte microgramos de ARN total a electroforesis en un gel de agarosa formaldehído al 1,2% y se transfirieron a una membrana de nylon. Se marcó un fragmento de ADN de 0,8 kb del gen NY-ESO-1 con [\alpha-^{32}P]CTP mediante el método de cebado al azar. Se realizaron la hibridación previa e hibridación según el protocolo de QuickHyb (Stratagene, La Jolla, CA). Se lavaron las membranas dos veces con 2 x SSC/SCD al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 y dos veces con 0,1 x SSC/SDS al 0,1% a 60° durante 30 min. Se realizó la autoradiografía a -70ºC.

PCR con transcriptasa inversa

Se extrajo ARN total a partir de líneas de células tumorales tal como se describió anteriormente. Se utilizaron quinientos nanogramos de ARN total para la conversión de ARN a ADNc mediante la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV). Se amplificó después el ADNc mediante PCR usando los cebadores ESO-P2 (5'GCGGCTTCAGGGCTGAATGGATG) y ESO-P5 (5'-AAGCCGTCCTCCTCCAGCGACA) y el sistema de RT-PCT One-Step (Life Technologies). Se amplificaron los productos de PCR en condiciones de desnaturalización a 94ºC durante 30 s, hibridación a 55ºC durante 30 s, extensión a 72ºC durante 3 min durante 40 ciclos, y elongación final a 72ºC durante 10 min. Se analizaron los productos de PCR en un gel de agarosa al 3%.

Ensayos de lisis citotóxica

Se realizó el ensayo citolítico tal como se describió previamente (Kawakami, Y et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6458-62). Brevemente, se marcaron las células diana con cromo durante 90 min. Después de lavar tres veces, se incubaron las células con péptidos a una concentración de 1 \mug/ml durante 90 min. Se lavaron las células de nuevo, se contaron y se mezclaron después con TIL586 o clon 5 de CTL a la razón indicada de efector:dianas (E:T). Se midió la liberación de cromo después de 4 h de incubación. Se sintetizaron los péptidos mediante un método en fase sólida usando un sintetizador de péptidos (modelo AMS 422, Gilson Co., Inc., Worthington, OH). Se purificaron algunos péptidos mediante HPLC y tenían una pureza superior al 98%. Se confirmó la masa de algunos péptidos mediante análisis de espectrometría de masas. Para la titulación del péptido CAG-3 reconocido por TIL586, se incubaron células B de 586EBV con diversas concentraciones del péptido CAG-3 purificado o parte del mismo. Se determinó el porcentaje de lisis específica a partir de la ecuación (A-B)/(C-B) X 100 en la que A es la lisis de células B de 586EBV mediante TIL586 o clon 5 en presencia de un péptido, B es la liberación espontánea de células B 586EBV en presencia del mismo péptido pero en ausencia de células efectoras, y C es la liberación máxima de cromo. Se realizó la inhibición de la citólisis de la diana en frío usando células 586mel o 624mel marcadas con ^{51}Cr como dianas "calientes" y células B 586EBV y T2 pulsadas con péptidos como dianas "frías".

Ejemplo 2 Ensayo de protección in vivo

Para estudios de protección in vivo, se inmunizan ratones transgénicos MHLA-A31^{+} con 0,1 pg, 1 ng, 1 \mug, 1 mg o 100 mg de péptido cancerígeno (SEC ID nº: 4, 5, 14, 25, 34-38, 41, 42, 46 o 47), por vía intravenosa en el día cero y en el día 14, antes de la exposición subcutánea con 10^{4} células de melanoma de ratón CAG-3 B16 o exposición intravenosa con 5 x 10^{5} células de melanoma de ratón CAG-3 B16. Se observan los ratones que recibieron las células tumorales de manera subcutánea dos veces a la semana para determinar el desarrollo y tamaño del tumor. Se sacrifican los ratones que recibieron células tumorales de manera intravenosa en el día 12 y se determina el número de metástasis de pulmón tal como se describe por Houghton, A.N. 1994 J. Exp. Med. 180:1-40.

Ejemplo 3 Ensayo de tratamiento in vivo

Para el tratamiento in vivo, se exponen ratones transgénicos MHL-A31^{+} con o bien 1 x 10^{5} o bien 5 x 10^{5} células de melanoma de ratón CAG-3B16 por vía intravenosa con el fin de establecer metástasis pulmonares. Se vacunan posteriormente los ratones con un virus recombinante que expresa péptido cancerígeno (SEC ID nº: 4, 5, 14, 25, 34-38, 41, 42, 46 o 47) a 10^{5} UFP/mg de peso corporal. Se sacrifican los ratones en el día 12 y se determina el número de metástasis pulmonares en ratones vacunados frente a ratones no vacunados.

Ejemplo 4 Linfocitos T específicos para antígeno cancerígeno Inmunoterapia

Los linfocitos T sensibilizados previamente para un antígeno de melanoma pueden ser eficaces para tratar terapéuticamente mamíferos aquejados de un melanoma. Se aíslan linfocitos T de la sangre periférica o suspensiones de tumor de melanoma y se cultivan in vitro (Kawakami, Y. et al., 1988, J. Exp. Med. 168:2183-2191).

Se exponen los linfocitos T al péptido cancerígeno (SEC ID nº: 4, 5, 14, 25, 34-38, 41, 42, 46 o 47) a una concentración de 1 \mug/ml solo o en presencia de IL-2, se vuelven a sensibilizar y se expanden en cultivo. Se administran linfocitos T expuestos al péptido cancerígeno a un mamífero a aproximadamente de 10^{9} a 10^{12} linfocitos por mamífero. Se administran los linfocitos o bien por vía intravenosa, por vía intraperitoneal o bien por vía intralesional. Puede administrarse el tratamiento simultáneamente con otros tratamientos terapéuticos tales como citocinas, escisión quirúrgica de lesiones de melanoma y fármacos quimioterapéuticos.

Ejemplo 5 Tratamiento de pacientes con melanoma metastásico

En este protocolo, se inmunizan pacientes con melanoma avanzado con un epítopo cancerígeno antigénico.

Los pacientes que se pueden elegir para el ensayo deben presentar pruebas de melanoma metastásico que pueda medirse o evaluarse que ha fallado en el tratamiento eficaz convencional. Los pacientes deben presentar tumores que expresan el antígeno CAG-3 tal como se prueba mediante PCR o análisis de inmunotransferencia de tipo Northern de ARN de células tumorales.

Los pacientes reciben o bien 1 ng, 1 \mug, 1 mg o bien 500 mg/kg de peso corporal de un péptido cancerígeno (SEC ID nº: 4, 5, 14, 25, 34-38, 41, 42, 46 o 47) por vía intravenosa en el día 0, día 7 y día 14 solo o en combinación con IL-2 y/o una molécula inmunoestimuladora. Se evalúa en los pacientes la toxicidad, efectos inmunológicos y eficacia terapéutica.

Se someten a prueba los linfocitos tomados de los pacientes tratados para detectar respuesta específica frente al antígeno cancerígeno CAG-3 (SEC ID nº: 4, 5, 14, 25, 34-38, 41, 42, 46 o 47).

Se define una respuesta completa como la desaparición de todas las pruebas clínicas de la enfermedad que dura por lo menos cuatro semanas. Una respuesta parcial es una disminución del 50% o superior en la suma de los productos del diámetro perpendicular de todas las lesiones que pueden medirse durante por lo menos cuatro semanas sin aparición de nuevas lesiones o aumento de cualquier lesión. Se definen respuestas menores como una disminución del 25-49 en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones que pueden medirse sin aparición de nuevas lesiones y sin aumento de cualquier lesión. Cualquier paciente con menos de una respuesta parcial se considera como que no responde. La aparición de nuevas lesiones o un aumento superior al 25% en el producto de los diámetros perpendiculares de lesiones anteriores tras una respuesta parcial o completa se considera como una recaída.

Ejemplo 6 Reconocimiento de antígenos CAG-3 en células tumorales por clones de CTL

En estudios previos, se han aislado varios clones de células T a partir de la línea de células grandes TIL586 mediante el método de dilución limitante (Wang et al. 1996b, J. Exp. Med. 183:1131-1140). Varios clones reconocieron TRP-1 o TRP-2. Sin embargo, dos clones de células T aislados de la misma línea celular TIL586 no reconocieron ni a TRP-1 ni a TRP-2, pero pudieron reconocer a 586mel así como a melanocitos HLA-A31^{+} (figuras 1A a 1C). Estos resultados sugieren que estos clones de célula T reconocieron antígenos tumorales adicionales en las células tumorales 586mel. Estos clones de células T se expandieron después y se usaron los clones 5 y 10 de CTL para examinar bibliotecas de ADNc.

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Ejemplo 7 Identificación de un ADNc que codifica para un antígeno tumoral reconocido por clones de célula T

Para determinar la molécula HLA responsable de la presentación de antígeno frente a los clones 5 y 10 de CTL, se transfectó ADNc de HLA-31 en líneas tumorales 397mel y 624mel negativas para A31 y se sometieron a prueba para detectar el reconocimiento por el clon de CTL. Los transfectantes de 397mel y 624mel que expresan HLA-31 fueron reconocidos significativamente por los clones 5 y 10 de CTL (tabla 2).

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TABLA 2 La secreción específica de GM-CSF por los clones 5 y 10 de CTL está restringida por HLA-A31

4

Puesto que sólo estaba disponible un número limitado de células T, en primer lugar se probó si estas células T reconocían los antígenos tumorales previamente identificados o proteínas de diferenciación del linaje de los melanocitos. Se probó el reconocimiento de células COS-7 transfectadas con ADNc de HLA-31 y genes que codifican para los antígenos tumorales conocidos o antígenos supuestos incluyendo MART-1 (Kawakami et al. 1994a, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:3515-3519), gp75 (Wang et al. 1995, J. Exp. Med. 181:799-804), gplOO (Kawakami et al. 1994b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6458-6462), tirosinasa (Brichard et al. 1993, J. Exp. Med. 178: 489-495), y TRP-2 (Yokoyama et al. 1994, Biochim. Biophys. Acta 1217:317-321; Bouchard et al. 1994, Eur. J. Biochem. 219:127-134) por el clon 5 ó 10 de CTL. Las células COS transfectadas con HLA-31 solo, TRP-1 o TRP-2 solo no concedieron reconocimiento por los clones de células T (figura 2). Además, las células COS transfectadas con HLA-A31 y otros genes tumorales dejaron de estimular la liberación de GM-CSF de células T, indicando que el clon 5 ó 10 de células T no reconocieron estos antígenos tumorales, pero reconocieron un nuevo antígeno tumoral en el contexto de
HLA-31.

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Ejemplo 8 Clonación del gen CAG3

Para identificar el nuevo antígeno(s) tumoral(es) reconocido(s) por los clones 5 y 10 de CTL, se preparó una biblioteca de ADNc derivada de 586mel. Cada conjunto de ADNc consistía en \sim 100 clones de ADNc. Después de examinar un total de 2,5 x 10^{5} clones de ADNc, se identificaron 15 conjuntos de ADNc positivos que conferían reconocimiento de células T por el clon 5 ó 10 de CTL cuando se cotransfectaban en COS-7 junto con ADNc de HLA-31. Se sometieron a prueba los clones positivos a continuación para detectar el reconocimiento por tanto el clon 5 como 10 de CTL. Se encontró que ambos clones de CTL reconocían los mismos conjuntos de ADNc. Se aislaron colonias individuales de cada conjunto positivo y se sometieron a prueba para detectar la reactividad de células T. Se muestran datos representativos en la figura 4. El clon 5 de CTL reconoció COS-7 cotransfectadas con el clon 1 ó 2 de ADNc y HLA-31, pero no COS-7 solas, COS-7 cotransfectadas con el clon 1 ó 2 de ADNc o transfectadas sólo con el ADNc de HLA-31 (Figura 4). El análisis de secuenciación del ADN indicó que los 10 clones de ADNc positivos de diferentes conjuntos positivos se solapaban, y se muestra la secuencia de ADN y aminoácidos de estos clones en la figura 3A. Una búsqueda de todas las bases de datos disponibles reveló que la región codificante de este gen, llamado gen 3 del antígeno (CAG-3, número de entrada en Genbank AF038567), era idéntica a NY-ESO-1 que se notificó recientemente que era un antígeno reconocido por un anticuerpo del suero derivado de un paciente con cáncer esofágico (29). Este clon de ADNc más largo contenía 37 nucleótidos adicionales hacia 5' de la región no traducida del extremo 5' notificada previamente. Se descubrió que otras dos proteínas en las bases de datos contenían secuencias homólogas en una región limitada. El producto génico de NY-ESO-1 (se ha usado NY-ESO-1 para CAG-3 en el siguiente texto) presenta una semejanza del 52% con la proteína del tegumento (UL36) del virus herpes simple de tipo 1 en el segmento de 64 aminoácidos y una semejanza del 47% con el componente F de la enterobactina sintetasa (enzima que activa a serina) en la región de 48 aminoácidos (Figura 3B).

Ejemplo 9 Células de cáncer de mama reconocidas por clones de CTL

Se realizaron análisis de inmunotransferencia de tipo Northern usando ADNc de NY-ESO-1 como una sonda para evaluar el patrón de expresión en diferentes tejidos. Se mostró que el tejido de testículo era el único positivo en la expresión de NY-ESO-1 entre los tejidos humanos normales sometidos a prueba. Se descubrió que NY-ESO-1 se expresaba en varios tipos de cánceres incluyendo melanoma y cáncer de mama (datos no mostrados). Estos resultados concordaban con los datos expuestos anteriormente (29). Para determinar si los CTL reactivos para el melanoma reconocerían también otras células tumorales, se probó la reactividad de células T frente a células de tumor de mama y próstata positivas para HLA-31 por el clon 5 de CTL. Se usó IFN\gamma para controlar el reconocimiento de células T en estos experimentos porque las células de tumor de próstata solas secretan GM-CSF, pero no IFN-\gamma. Tal como se muestra en la tabla 3, el clon 5 de CTL pudo reconocer las células de tumor de mama recientes 1295Br y 1315Br positivas para HLA-A31, pero ni las células de tumor de mama recientes HLA-A31 1405Br y 1411Br, ni las células de fibroblastos 1295 positivas para HLA-A31 derivadas del paciente autólogo 1295. Además, el clon 5 de CTL reconoció las células 1315Br positivas para HLA-A31 (cultivo A y B) (tabla 3), pero no respondió a las células de cáncer de mama 1386Br cultivadas negativas para HLA-31, ni a los fibroblastos 1510 positivos para HLA-31 cultivados. Aunque el clon 5 de CTL no respondió de ninguna manera frente a las células 1315Br positivas para HLA-31 (cultivo A y B) en el experimento 1, experimentos adicionales mostraron el reconocimiento de células T de las células 1315Br positivas para HLA-31 cultivadas (cultivo A y B) (datos no mostrados). Se confirmó la expresión de HLA-31 y NY-ESO-1 en las células tumorales 1315Br y 1295Br recientes mediante análisis FACS y análisis de RT-PCR (datos no mostrados). Se detectó la expresión de NY-ESO-1 mediante RT-PCR usando los cebadores ESO-P2 y ESO-P5 en ambas células de tumor de mama recientes 1295 y 1315. El clon 5 de CTL no reconoció ni las células de tumor de próstata HLA-A31^{+} 1535 debido a la carencia de expresión de NY-ESO-1, ni las células de tumor de próstata HLA-A31-1542 (tabla 3). Estos resultados sugirieron plenamente que se expresaba un péptido antigénico de NY-ESO-1 a niveles suficientes sobre la superficie de células de tumor de mama para reconocerse por células T. Por lo tanto, NY-ESO-1 puede servir como una diana inmunitaria para la inmunoterapia de pacientes con cáncer de mama. También se expresa NY-ESO-1 en un alto porcentaje (aproximadamente del 67%) de carcinoma de pulmón de células pequeñas (datos no
mostrados).

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TABLA 3 Reconocimiento de células de tumor de mama por el 5º clon de CTL

5

Ejemplo 10 Epítopos peptídicos reconocidos por el clon 5 de CTL

Para seleccionar epítopos de la región codificante del ADN de CAG-3, se realizó una búsqueda del motivo del péptido HLA. Se muestran estos resultados en la tabla 4 y en la tabla 5.

TABLA 4

6

7

TABLA 5

8

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9

Se sintetizaron péptidos basándose en el motivo de unión a péptido para HLA-A31 (residuos hidrófobos en la posición 2 y residuos cargados positivamente en la posición 9) (Rammensee et al. 1995, Immunogenetics 41:178-228) y se sometieron a prueba para detectar la reactividad con el con 5 de CTL.

Estos péptidos se pulsaron sobre células B de 1510EBV positivas para HLA-A31 y se sometieron a prueba para determinar su capacidad de estimular la liberación de citocina por el clon 5 de CTL. Tal como se muestra en la tabla 6, el péptido de 10-meros ESO10-53 (ASGPGGGAPR), que comienza en la posición 53 de la proteína NY-ESO-1, se reconocía plenamente por el clon 5 de CTL, mientras que los péptidos de 9-meros que se solapaban, ESO9-54 así como ESO10-127, se reconocían débilmente cuando se pulsaban sobre células B de 1510EVB. El clon 10 de CTL reconoció el mismo péptido que el clon 5 de CTL (datos no mostrados). De manera interesante, el clon 2 de CTL no reconoció ninguno de estos péptidos (tabla 6), incluso aunque reconoció a 586mel y COS-7 transfectadas con NY-ESO-1 (véase a continuación). La reactividad del clon 5 de CTL no pudo detectarse cuando se usaron o bien el péptido ESO9-54 o bien el ESO10-127 a concentraciones inferiores a 100 nM para sensibilizar células del EBV.

TABLA 6

10

Ejemplo 11 Reconocimiento de péptidos modificados

Para examinar si el clon 5 de CTL reconocía también péptidos que contenían la secuencia de aminoácidos central con la extensión de residuos de aminoácidos o bien en el extremo N terminal o bien en el C terminal, se realizó el solapamiento de péptidos de 11 meros, 12-meros, 13-meros, 14-meros, y 15-meros, así como varios péptidos que contenían sustituciones en la posición 1, 2 ó 10 de ESO10-53 (tabla 7 y figura 3A). El clon 5 de CTL pudo reconocer péptidos de 11-meros, 12-meros, 13-meros, 14-meros, y 15-meros con extensiones de aminoácidos en el extremo N terminal del péptido central ESO-53, aunque los péptidos más largos parecen estimular la secreción de GM-CSF significativamente menos de lo que lo hizo el péptido de 10 meros ESO10-53 (tabla 7). Sin embargo, una extensión de sólo un único residuo de aminoácido en el extremo C terminal de ESO10-53 anuló su capacidad de estimular a las células T (tabla 7). El clon 5 de CTL no reconoció el péptido de 8-meros.

Los experimentos de titulación demostraron que la reactividad de CTL podía detectarse a concentraciones de 10 nM del péptido ESO10-53. La liberación de GM-CSF a partir del clon 5 de CTL aumentó con las concentraciones de péptido en aumento, y no se alcanzó meseta a una concentración de péptido 10 \muM (figura 5A). Además de medir la liberación de citocinas estimulada por ESO10-53, se examinó la capacidad de este péptido de sensibilizar las células diana para la lisis por el clon 5 de CTL. El clon 5 de CTL pudo lisar el tumor positivo para HLA-A31 de 586 mel, pero no el tumor negativo para HLA-A31 y el positivo para NY-ESO-1 de 397mel (figura 5B). El clon 5 de CTL lisó > 60% de o bien 586EBV o bien 1510EBV que se habían incubado con el péptido ESO10-53 a una razón E:T de 40:1, y se observó una lisis del 5-10% de las células diana a una razón E:T de 2,5:1 E:T. El clon de CTL no lisó ni las células B del 586EBV ni del 1515EBV B solo o pulsado con un péptido irrelevante, ni lisó el negativo para HLA-A31 Las células T2 se pulsaron con el péptido ESO10-53 (figura 5C).

A continuación se sometió a prueba si podía mejorarse el reconocimiento de las células T del péptido de 10-meros, sustituyendo aminoácidos en residuos de anclaje. Se produjeron diversos péptidos sintéticos con modificación en los residuos 1, 2 y 10 y se sometieron a prueba para el reconocimiento por el clon 5 de CTL cuando se pulsaron sobre las células B del 586EBV (tabla 7). Aún se reconocieron los péptidos de 10-meros modificados con una sustitución en la posición 2 derivados del tipo natural ASGPGGGAPR, por el clon 5 de CTL cuando se pulsaron sobre las células B del 586EBV. La reactividad de los péptidos que contenían una sustitución de o bien Ala, Ile, Leu o bien Val en la posición 2 fue inferior que la del péptido de tipo natural, mientras que un péptido que contenía una sustitución de Thr por Ser en la posición 2 dio como resultado una reactividad ligeramente superior que el péptido ESO10-53 de tipo natural. Por lo contrario, los péptidos que contenían sustituciones de Arg por Lys o His perdieron completamente su capacidad de estimular a las células T, lo que sugiere que la Arg en el extremo C terminal del péptido ESO10-53 representa un residuo de anclaje critico. Los péptidos con una sustitución en la posición 1 se reconocieron muy poco o no se reconocieron nada por el clon 5 de CTL (tabla 7). Estos resultados indican que el péptido ESO-53, ASGPGGGAPR, representa el mejor péptido para el reconocimiento de las células T.

Ejemplo 12 Péptidos antigénicos derivados de un marco de lectura abierto alternativo

Dos clones de CTL adicionales, los clones 2 y 14, parecieron reconocer las células 586 mel así como las células COS-7 transfectadas con ADNc de HLA-A31 y NY-ESO-1, pero no reconocieron el péptido ESO 10-53 (figura 6A-6H). Se usaron para controles de la especificidad el clon 5 de CTL y TIL1244. Los experimentos adicionales mostraron que el clon 2 de CTL no respondía frente a ninguno de los otros 19 péptidos que contenían el motivo de unión a HLA-A31 derivado del marco de lectura abierto normal de NY-ESO-1 (tabla 6). Para probar la hipótesis de que CTL puede reconocer un péptido de un producto génico traducido a partir de un marco de lectura abierto alternativo del mismo gen, se produjeron péptidos sintéticos con el motivo de unión a HLA-A31 basándose en la secuencia de aminoácidos predicha del segundo marco de lectura abierto (ORF2) (figura 3A). Inesperadamente, el clon 2 de CTL reconoció el ESORF2-9-19 (AAQERRVPR) así como los péptidos de solapamiento ESORF2-10-18 (LAAQERRVPR) cuando se pulsaron sobre células B de 1510EBV. Se muestran los datos representativos del clon 2 de CTL en la figura 7A. El clon 14 de CTL reconoció los mismos péptidos que el clon 2 de CTL (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que los clones 2 y 14 de CTL reconocieron un péptido derivado del ORF2 (figura 3A). Una búsqueda de bases de datos de proteínas reveló que la proteína de 58 amino ácidos de ORF2 presenta un 52% de similitud con la cadena A de la glutamato deshidrogenada en una región de 25 aminoácidos (34). Los experimentos de titulación de péptidos demostraron que el clon 2 de CTL podía lisar 1510EBV pulsado con ESORF2-10-18 (LAAQERRVPR) a concentraciones relativamente bajas de péptido, pero no lisó 1510EBV pulsado con ESO10-53 o 1102EBV negativo para HLA-A31 pulsado con ESORF2-10-18 (figura 7B). Además, el clon 2 de CTL también reconoció el solapamiento de péptidos de 11-meros, 12-meros, y 13-meros con extensiones de aminoácidos en el extremo N terminal del péptido ESORF2-10-18 a concentraciones relativamente altas (datos no mostrados).

Se llevaron a cabo experimentos adicionales para determinar si los clones de CTL reconocen el producto génico de ORF2 del NY-ESO-1 en otros tipos de tumores. Tal como se muestra en la figura 7C, el patrón de reconocimiento del clon 2 de CTL era similar al del clon 5 de CTL en las células tumorales. El clon 2 de CTL reconoció tumores de mama 1315Br y 1295Br recientes positivos para HLA-A31 así como 586mel y 1388mel, pero no reconoció el tumor de mama 1411Br reciente negativo para HLA-A31, 397mel, ni el fibroblasto 1295 negativo para HLA-A31. Aunque 1353mel expresa HLA-A31, ni el clon 2 ni el clon 5 de CTL respondieron a 1353mel debido a que 1353mel es un tumor negativo para NY-ESO-1. Tal como se demostró previamente, el clon 5 de CTL reconoció el péptido ESO10-53 ASGPGGGAPR y el clon 2 de CTL reconoció el péptido ORF2-10-18 LAAQERRVPR derivado del ORF2 tras la incubación con células B de 1510EBV (figura 7C). Estos resultados sugieren plenamente que el producto génico de ORF2 se tradujo, se procesó y se presentó en melanoma así como en tumores de mama. Por tanto, NY-ESO-1 codifica para dos proteínas diferentes: una proteína con 180 aminoácidos (ORF1) reconocida por los clones 5 y 10 de CTL, y una proteína con 58 aminoácidos (ORF2) reconocida por los clones 2 y 14 de CTL.

TABLA 7 Reconocimiento de los péptidos modificados por el 5º clon de CTL

11

Exposición NY-ESO-1 es una diana inmunitaria celular

Se han identificado cinco antígenos de diferenciación que incluyen tirosinasa, MART-1, gp 100, TRP-l/gp75 y TRP-2 como antígenos de melanoma reconocidos por las células T derivadas de TIL (13-19), que han mostrado estar asociados con la reactividad antitumoral in vivo. Hasta la fecha, las TIL disponibles en la Surgery Branch en el National Cancer Institute reconocen MAGE-1, BAGE y GAGE, que se expresan sólo en células de cáncer y testículos. En la presente memoria se muestra que NY-ESO-1, otro antígeno que participa en el cáncer, es un antígeno tumoral reconocido por células T restringidas por HLA-A31. Se aisló independientemente NY-ESO-1 usando el suero autólogo de un paciente con cáncer de esófago (29), lo que sugiere que el producto génico NY-ESO-1 era una diana inmunitaria para la inmunidad mediada por anticuerpos. Los resultados en este estudio proporcionan la prueba de que NY-ESO-1 también es una diana inmunitaria reconocida por las células T. Esto está apoyado además por un informe reciente de que CTL restringido por HLA-A2 reconoce NY-ESO-1 establecido en un paciente con melanoma (35). Se ha encontrado que varios antígenos tumorales, incluyendo MAGE-1, tirosinasa, TRP-1, reconocidos por CTL, son reactivos también con anticuerpos (36, 37). Puesto que NY-ESO-1 no se expresa en tejidos humanos normales excepto los testículos, que no expresan las moléculas MHC de clase I y se consideran como un sitio inmunológicamente privilegiado, este producto génico puede constituir una diana inmunitaria segura para la inmunoterapia de los pacientes con cáncer.

NY-ESO-1 es un antígeno de cáncer de mama

Basándose en su patrón de expresión génica, NY-ESO-1 pertenece a un miembro de una familia de antígenos (Ag) en expansión, que incluye MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE y HOM-MEL-40 (9-12,30). Sin embargo, NY-ESO-1 se expresa altamente en un porcentaje significativo de cánceres de mama, próstata y vejiga (29) en comparación con MAGE, BAGE y GAGE. De manera más importante, los clones CTL reconocieron dos tipos de células de cáncer de mama cultivadas y recientes positivas para HLA-A31 (tabla 2 y figura 7C). Para el conocimiento, esta es la primera demostración del reconocimiento de CTL de células de cáncer de mama positivas para NY-ESO-1. Aunque se informó de que la expresión de MAGE-1, MAGE-3 y otros se detectó por RT-PCR en tumores de mama a baja frecuencia (<5-10%), no se ha documentado el reconocimiento de CTL de estos tumores de mama por CTL específico para antígeno. Ha sido difícil generar CTL reactivos frente a mama de PBL in vitro aunque se ha notificado que las células T restringidas por MHC reconocen péptidos HER-2/neu en células de cáncer de mama (26-28). La identificación de péptidos NY-ESO-1 presentados en la superficie celular de cánceres de mama, es importante para el desarrollo de vacunas contra el cáncer específicas para antígeno para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama. El enfoque de clonación de CTL descrito en la presente memoria representa una estrategia para el aislamiento de antígenos de cáncer de mama.

Traducción de diferentes ORF como mecanismo para generar epítopos de células T

Para definir péptidos antigénicos, se encontró ASGPGGGAPR de 10-meros derivados de la proteína NY-ESO-1 como el mejor péptido antigénico reconocido por el clon 5 de CTL, aunque también se reconocieron los péptidos de 9-meros, 11-meros, 12-meros, 13-meros, 14-meros y 15-meros. Esta reactividad puede deberse a la presencia de dos residuos de prolina en estos péptidos. Los residuos de prolina en la secuencia peptídica central pueden hacer que los péptidos sobresalgan hacia fuera de la cavidad de unión a MHC, por tanto los residuos anclados en los péptidos más largos aún pueden fijarse dentro de la molécula HLA-A31. Una explicación alternativa es que los péptidos más largos pueden procesarse para proporcionar los péptidos más pequeños mediante las proteasas séricas o extracelulares (38). Sin embargo, cuando los péptidos más largos se pulsaron sobre las células B del 586EBV en condiciones libres de suero, aún se reconocieron por el clon 5 de CTL (datos no mostrados). Este experimento, sin embargo, no excluye la posibilidad de que estos péptidos más largos se procesen mediante las proteasas extracelulares. El péptido modificado, ATGPGGGAPR, con una sustitución de Thr por Ser parece mejorar ligeramente el reconocimiento de las células T. Se ha demostrado que los péptidos modificados pueden mejorar la afinidad de unión a la molécula de MHC de clase I, potenciando así la inmunogenicidad de péptidos (39). No está claro por qué el clon 5 de CTL reconoció el péptido ESO10-127 no relacionado, pero su reconocimiento fue débil y sólo pudo detectarse a una concentración de péptido relativamente alta.

De manera interesante, dos clones de CTL adicionales reconocieron COS-7 transfectada con NY-ESO-1 más ADNc de HLA-A31, pero no el péptido ESO10-53 que se derivó del ORF1 del gen NY-ESO-1 (figura 6A-6D). Análisis adicionales mostraron que el clon 2 de CTL reconoció un péptido del producto génico traducido a partir de un marco de lectura abierto alternativo (ORF2) de NY-ESO-1. Aunque existen varios ejemplos de que dos proteínas diferentes se traducen a partir de diferentes ORF de un único ARNm viral (40), se han notificado muy pocos casos de ARNm eucariótico único. Se han notificado dos ejemplos: TRP-1/gp75 que codifica para dos proteínas diferentes, gp75 reconocido por suero de un paciente con melanoma y un producto génico de 24 aminoácidos reconocido por CTL (24, 37); y antígeno de 43 kDa reconocido por CTL reactivos frente a carcinoma de células escamosas (41). De manera interesante, el gen p16 inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina también codifica para dos productos génicos, p16 y p19^{ARF}. Sin embargo, el producto génico de ORF alternativo, p19^{ARF} se traduce a partir de un transcrito de corte y empalme alternativamente y comparte una secuencia idéntica con el transcrito p16, excepto el primer exón (42). Estudios recientes mostraron que el producto del marco de lectura alternativo, p19^{ARF} desempeña un papel en la regulación del ciclo celular y supresión tumoral (43). El gen NY-ESO-1 notificado en la presente memoria codifica para dos proteínas diferentes: una proteína de 180 aminoácidos codificada por ORF1 y una proteína de 58 aminoácidos codificada por ORF2. El producto del ORF2 se sitúa dentro del ORF1. Sorprendentemente, los clones 5 y 10 de CTL reconocieron a péptidos antigénicos derivados del ORF1, mientras que los clones 2 y 14 de CTL reconocieron un péptido antigénico del ORF2. Ambos clones 2 y 5 de CTL reconocieron varios melanomas HLA-A31^{+} así como tumores de mama recientes (tabla 3 y figura 7C), lo que sugiere que la traducción del ORF2 alternativo puede servir como un mecanismo general in vivo para generar epítopos de células T.

Actualmente no se conoce el mecanismo por el que se traduce el ORF alternativo. Sin embargo, existen varias posibles explicaciones para la producción de marcos de lectura alternativos. El modelo de iniciación "leaky-scanning" es una posible explicación: los ribosomas pasan ocasionalmente por encima del primer AUG con una secuencia consenso KOZAK pequeña e inicia la traducción en AUG en el sentido 3' (43, 44). En el caso de NY-ESO-1, el codón de inicio para la traducción del ORF 1 no está en el contexto óptimo. Existen cuatro posibles codones de inicio que pueden usarse para traducir el ORF2. En el informe previo, se tradujo un epítopo de CTL a partir de un marco de lectura alternativo de gp75/TRP-1 (24). El reconocimiento del epítopo de ORF3 por CTL se afectó por la presencia del primer codón ATG usado para la traducción de la proteína gp75 y se suprimió completamente cuando se cambio el ATG interno que precede al epítopo de las células T (ORF3P) por ATC, lo que sugiere que la exploración ribosómica puede ser un posible mecanismo. En los estudios de la nucleoproteína de la gripe, se produjeron los epítopos de CTL por medio de un mecanismo de exploración ribosómica (44). Sin embargo, en un estudio similar, se sugirió el desplazamiento del marco ribosómico como mecanismo para la producción de epítopos de células T (45). También se han propuesto otros mecanismos para la producción de epítopos de células T derivados de genes diferentes. Por ejemplo, se identificaron varios epítopos de células T a partir de productos génicos traducidos a partir de un codón de inicio críptico de la región no traducida en 5´ (46,47), a partir de un marco de lectura abierto no definido por ATG (48), y a partir de intrones de transcrito (22,49,50). Puesto que ambos marcos de lectura abierto alternativos de gp75/ TRP-1 y NY- ESO-1 se sitúan dentro del marco de lectura abierto principal, es de interés particular entender el mecanismo subyacente.

Aunque existen sólo unos pocos ejemplos de la utilización de los marcos de lectura abiertos alternativos en eucariotas notificados en la bibliografía, se cree que se notificarán más ejemplos en el futuro, cuando los anticuerpos y CTL reactivos frente a tumor estén disponibles y se usen para identificar péptidos o proteínas diana. Por tanto, es importante entender el significado biológico de los productos génicos traducidos a partir de marcos de lecturas abiertos alternativos. Una posibilidad es que estos productos génicos sirven como dianas antigénicas de la maquinaria de procesamiento de antígenos para aumentar la eficacia y la capacidad de la vigilancia inmunitaria. La identificación de epítopos de células T derivados de diferentes marcos de lecturas abiertos de NY-ESO-1 sugiere que la identidad de los péptidos inmunogénicos para obtener vacunas contra el cáncer puede no limitarse sólo a péptidos derivados del marco de lectura abierto principal. No está claro en el momento actual si el producto génico del ORF2 de NY-ESO-1 y el producto génico del ORF3 de gp75/TRP-1 presentan funciones biológicas además de las respuestas inmunitarias de las células T.

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<110> THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as representend by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES

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<120> ANTÍGENO CANCERÍGENO HUMANO NY ESO-1/CAG-3 Y GEN QUE CODIFICA PARA EL MISMO

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<130> 218802

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<140> 98949385.3

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<141> 05-05-2000

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<160> 106

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 805

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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<210> 2

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<211> 540

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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13

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<210> 3

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<211> 174

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 180

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

15

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<210> 5

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<211> 58

212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\sa{Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg}

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<211> 9

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\sa{Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg}

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<210> 8

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<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Pro Arg Gly Ala Gly Ala Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Cys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Pro Arg Gly Ala Gly Ala Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ile Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Val Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Thr Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1Q

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Pro Arg Gly Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly}

\sac{Gly Ala Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46.

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Leu Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Met Leu Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ala Met Leu Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcggggcc gggaggaggc gccccgcggg

\hfill

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggcggccc aggagaggcg ggtgccacgg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggcccagg agaggcgggt gccacgg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> xaa no es aminoácido o de uno a aproximadamente 10 aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> xaa es Ala, Thr, val, Leu o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> xaa es Ser o sustitución conservativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> xaa es Arg o Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Leu Met Ala Gln Glu Ala Leu Ala Phe Leu Met Ala Gln Gly Ala}

\sac{Met Leu Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gly Arg Leu Tyr Leu Pro Leu Pro Pro Val Pro Val Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Pro Leu Leu Glu Phe Leu Met Pro Thr Leu Ala Arg Ser Leu}

\sac{Ala Ala Leu Pro Leu Glu Gly Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Glu Ala Leu Phe Leu Met Gln Met Ala Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ala Ala Ala Thr Gly Gly Asp Ala Arg Gln Leu Val Gly Tyr Leu}

\sac{Val Ser Gln Ser Gly Leu Pro Leu Asp Thr Ser Ala Leu Gln Ala Gln}

\sac{Leu Arg Glu Thr Leu Pro Pro His Met Val Pro Val Val Leu Leu Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Pro Thr Thr Asn Glu Ala Leu Arg Phe Leu Met Gln Gln Pro Asn}

\sac{Met Val Val Ala Pro Ser Lys Ala Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Leu Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu}

Claims

1. Péptido cancerígeno aislado que comprende la secuencia de aminoácidos MLMAQEALAF LMAQGAMLAA QERRVPRAAE VPGAQGQQGP RGREEAPRGV RMAARLQG (SEC ID nº: 5), o una parte funcional o derivado del mismo, en el que dicha parte funcional o derivado se reconoce inmunológicamente por linfocitos T citotóxicos específicos para antígeno, específicos para el péptido que presenta la secuencia de la SEC ID nº: 5 de la figura 3A.

2. Péptido cancerígeno aislado, parte funcional o derivado del mismo según la reivindicación 1, en el que los linfocitos T citotóxicos están restringidos por MHC de clase I.

3. Péptido cancerígeno aislado, parte funcional o derivado del mismo según la reivindicación 1 ó 2, en el que el péptido cancerígeno se deriva de un cáncer seleccionado de entre el grupo constituido por: un linfoma no Hodgkin, leucemia, linfoma de Hodgkin, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, metástasis, melanoma, adenocarcinoma, timoma, cáncer de colón, cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervicouterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer pancreático y sarcoma.

4. Péptido cancerígeno aislado, parte funcional o derivado del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido cancerígeno o parte funcional o derivado del mismo está presente en aislados de tumor de mama primario y células de melanoma.

5. Péptido cancerígeno aislado, parte o derivado del mismo, codificado por

20

21

6. Péptido cancerígeno aislado, parte o derivado del mismo, según la reivindicación 5, en el que el péptido comprende la secuencia de aminoácidos:

LAAQERRVPR o

AAQERRVPR.

7. Composición farmacéutica que comprende por lo menos un péptido cancerígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Inmunógeno que comprende el péptido cancerígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, solo o en combinación con por lo menos una molécula inmunoestimuladora, en el que dicho inmunógeno provoca linfocitos T citotóxicos específicos para antígeno.

9. Inmunógeno según la reivindicación 8, en el que la molécula inmunoestimuladora es una molécula HLA.

10. Ácido nucleico aislado que codifica para un péptido cancerígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ácido nucleico no codifica para la SEC ID nº: 4 de la figura 3A.

11. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico codifica para un producto génico del marco de lectura abierto alternativo.

12. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 11 que codifica para la secuencia de aminoácidos

22

13. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 12, en el que el ácido nucleico codifica para un péptido cancerígeno que presenta la secuencia de aminoácidos

LAAQERRVPR o AAQERRVPR.

14. Vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.

15. Célula aislada transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante según la reivindicación 14.

16. Célula aislada según la reivindicación 15, en la que la célula es una célula que presentadora de antígeno.

17. Oligonucleótido constituido por un ácido nucleico complementario a la parte de la secuencia de ácido nucleico

23

que codifica para el péptido que presenta la secuencia MLMAQEALAF LMAQGAMLAA QERRVPRAAE
VPGAQGQQGP RGREEAPRGV RMAARLQG (SEC ID nº: 5).

18. Virus recombinante que comprende un virus recombinante que ha incorporado a un genoma vírico o parte del mismo, el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.

19. Virus recombinante según la reivindicación 18, que comprende además por lo menos un gen que codifica para una molécula inmunoestimuladora.

20. Virus recombinante según la reivindicación 18, en el que el virus se selecciona de entre el grupo constituido por retrovirus, baculovirus, virus ankara, viruela aviar, adenovirus y virus vaccinia.

21. Virus recombinante según la reivindicación 18, en el que el ácido nucleico codifica para un péptido cancerígeno derivado de melanocitos.

22. Virus recombinante según la reivindicación 19, en el que la molécula inmunoestimuladora es una molécula HLA de clase I.

23. Célula aislada transformada o transfectada con el virus recombinante según las reivindicaciones 18 a 22.

24. Anticuerpo aislado o parte de unión a antígeno del mismo que se une al péptido cancerígeno codificado por

24

25. Método de producción de manera recombinante de un péptido cancerígeno, o parte funcional o derivado del mismo, según la reivindicación 1 que comprende:

a. insertar una secuencia de nucleótidos de

25

o una parte o una variante de la misma, dentro de un vector de expresión;

b. transferir el vector de expresión dentro de una célula huésped;

d. recoger el péptido cancerígeno recombinante o parte funcional o derivado del mismo.

26. Método según la reivindicación 25, que comprende además en la etapa (a) insertar una secuencia de nucleótidos que codifican para una molécula HLA de clase I, o parte de la misma, dentro del vector de expresión.

27. Método in vitro de detección de la presencia de cáncer o precáncer en un mamífero que comprende:

a. poner en contacto un ácido nucleico complementario a la parte de la secuencia de ácido nucleico de

26

que codifica para el péptido que presenta la secuencia MLMAQEALAF LMAQGAMLAA QERRVPRAA
VPGAQGQQGP RGREEAPRGV RMAARLQG (SEC ID nº: 5), con una muestra biológica de prueba de ARNm tomada del mamífero en condiciones que permite formar un complejo entre la secuencia y el ARNm;

b. detectar el complejo;

28. Método según la reivindicación 27, en el que el cáncer o precáncer es melanoma.

29. Método según la reivindicación 27, en el que la muestra biológica es de tejido de mama.

30. Método según la reivindicación 27, en el que el ácido nucleico es complementario a la secuencia de ácido nucleico CCTCGGGGCC GGGAGGAGGC GCCCCGCGGG (SEC ID nº: 51).

31. Método in vitro de detección del péptido cancerígeno, o parte funcional o derivado del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en una muestra biológica que comprende:

b. detectar la presencia del complejo inmunitario.

32. Utilización de una cantidad eficaz del péptido cancerígeno, o parte funcional o derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 solo o en combinación con una molécula HLA, para la preparación de un medicamento para prevenir o inhibir el cáncer en un mamífero.

33. Utilización de linfocitos T para la preparación de un medicamento, en la que los linfocitos T se exponen in vitro a un péptido cancerígeno, o parte funcional o derivado del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 solo o en combinación con una molécula de MHC, o un fragmento de la misma, durante un tiempo suficiente para provocar linfocitos T específicos para el péptido cancerígeno.

34. Utilización de una cantidad eficaz del péptido cancerígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, solo o en combinación con una molécula HLA o un fragmento de la misma, siendo dicha cantidad eficaz para prevenir o inhibir el cáncer en un mamífero, para la preparación de un medicamento.

35. Utilización de una cantidad eficaz de un virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 solo o en combinación con una molécula inmunoestimuladora exógena, siendo dicha cantidad eficaz para prevenir o inhibir el cáncer, para la preparación de un medicamento.

36. Composición farmacéutica que comprende el virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 solo o en combinación con una molécula inmunoestimuladora exógena, fármaco quimioterapéutico, antibiótico, fármaco antifúngico, fármaco antiviral o combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

37. Animal transgénico no humano que porta y expresa un gen que está constituido por

27

o una parte o un derivado del mismo,

en el que dicha parte o derivado codifica para un péptido que se reconoce inmunológicamente por linfocitos T citotóxicos específicos para antígeno, específicos para el péptido que presenta la secuencia de la SEC ID nº: 5 de la figura 3A.

38. Linfocito T citotóxico humano específico para antígeno cancerígeno aislado, provocado por el péptido cancerígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

39. Linfocito T citotóxico humano específico para antígeno cancerígeno según la reivindicación 38, en el que el linfocito reconoce una molécula HLA-A31.

40. Linfocito T citotóxico humano específico para antígeno cancerígeno según la reivindicación 38, en el que el linfocito reconoce una molécula HLA de clase I seleccionada de entre el grupo constituido por HLA-A3, HLA-A11, HLA-A33, y HLA-A68.

41. Uso de linfocitos T para la preparación de un medicamento para inhibir el melanoma en un mamífero, en la que los linfocitos T se exponen in vitro a un péptido cancerígeno o parte o variante del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, solo o en combinación con una molécula de MHC o un fragmento de la misma, durante un tiempo suficiente para provocar linfocitos T específicos para el péptido cancerígeno.

42. Utilización de un virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, solo o en combinación con una molécula inmunoestimuladora, para la preparación de un medicamento para prevenir o inhibir el cáncer en un mamífero.

43. Utilización según la reivindicación 42, en la que el mamífero expresa una molécula HLA de clase I de entre el grupo constituido por HLA-A31, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A33, o HLA-A68.