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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft das Gebiet der Krebsdiagnose und -therapeutik
einschließlich
einer Krebsvakzine. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neues
menschliches Krebspeptid oder ein funktionelles Teil oder Derivat
davon, das von einem alternativen offenen Leserahmen des NY ESO-1/CAG-3-Gens
abstammt, und eine isolierte Nukleinsäure, die für das Krebspeptid kodiert.
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Hintergrund der Erfindung
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Der
adoptive Transfer von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) kann
eine Tumorregression in Patienten mit metastatischem Melanom vermitteln,
was nahe legt, dass von T-Zellen erkannte Tumorabstoßungsantigene
auf diesen Tumorzellen vorhanden sind. Die Verfügbarkeit solcher T-Zellen machte
es möglich,
die Gene zu klonieren und zu sequenzieren, die für menschliche Melanomantigene
kodieren. Die bis jetzt aus menschlichen Melanomen identifizierten
Antigene können
in zwei Klassen basierend auf ihrem Expressionsmuster unterteilt
werden. Die Antigene der ersten Klasse werden durch Gene kodiert,
die lediglich im Tumor und Hoden, aber nicht anderen normalen menschlichen
Geweben exprimiert werden. MAGE1, MAGE3, GAGE und BAGE sind Beispiele
dieser Klasse. Die zweite Klasse von Antigenen stellt Differenzierungsantigene
dar, die durch Gene kodiert werden, die lediglich in Melanozyten,
Melanomen und normaler Retina exprimiert werden. MART-1/Melan-A, gp100
und Tyrosin sind Beispiele dieser Klasse. Alle diese Antigene sind
nicht mutierte Selbstproteine. Jedoch wurden auch mehrere mutierte
Antigene identifiziert, dass sie durch T-Zellen erkannt wurden,
einschließlich
CDK 4, B-Katenin und Mum-1. Eine Identifizierung der Antigenepitope,
die von T-Zellen erkannt werden und von den entsprechenden Genprodukten
abstammen, ist nicht nur für
ein Verstehen des Mechanismus einer Immunantwort gegenüber Selbstantigenen,
sondern auch zum Entwickeln neuer, wirksamer immuntherapeutischer
Strategien mit diesen Antigenen oder synthethezischen Peptiden für die Behandlung
von Patienten mit Krebs wichtig.
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Frühere Studien
zeigten, dass die Infusion von TIL586 zusammen mit IL-2 in einen
autologen Patienten mit Melanom zu der objektiven Regression von
Metastasen führte.
In neuerer Zeit wurde das Gen, Tyrosinase-verwandtes Protein 1 (TRP-1
oder gp75) kloniert, das für
das Tumorantigen kodiert, das durch TIL586 in Assoziation mit HLA-A31
erkannt wird. Interessanterweise wurde das Genprodukt, gp75, ursprünglich als
ein Antigen identifiziert, das von IgG-Antikörpern in dem Serum aus einem
Patienten mit metastatischem Melanom erkannt wurde. Es wurde festgestellt,
dass das Gen lediglich in Melanom, normalen Melanozyten-Zelllinien
und Retina, aber nicht in anderen normalen getesteten Geweben exprimiert
wird. Folglich ist dieses Gen ein Mitglied der zweiten Klasse von
Antigenen, einschließlich
MART-1/Melan-A,
gp100 und Tyrosinase.
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Wang,
R.F. et al., J. Exp. Med., Band 183, Seiten 1131-1140 (1996) berichten
die Identifizierung eines Krebspeptids, das durch eine Sequenz eines
alternativen offenen Leserahmens innerhalb des TRP-1-Gens kodiert
und spezifisch durch klonierte TIL-586-Zellen erkannt wird. Wang,
R.F. et al., J. Exp. Med., Band 184, Seiten 2207-2216 (1996) identifizierten
ein zweites Tumorantigen, TRP-2, das von einem HLA-A31-restringierten
CTL-Klon erkannt wurde, der von der TIL-586-Zelllinie abstammte.
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Die
Erfindung betrifft die Identifizierung und Isolierung neuer Tumorantigene,
die sich von TRP-1 und TRP-2 unterscheiden und von CTL-Klonen erkannt
werden, die von der TIL-586-Zelllinie abstammen. Die erfindungsgemäßen Krebspeptide
sind als ein Immunogen und eine Vakzine zum Hemmen oder Verhindern
von Krebs in einem Säuger
und als ein diagnostisches Mittel zum Nachweisen von Krebs oder
Vorkrebs verwendbar.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Eine
erfindungsgemäße Aufgabe
ist die Bereitstellung von einem neuen Peptid und Teilen davon, das/die
als ein Krebsantigen durch T-Lymphozyten erkannt wird/werden.
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Die
erfindungsgemäßen Krebspeptide
werden durch den gesamten oder einen Teil eines alternativen offenen
Leserahmens (SEQ ID NO: 3) des Gens von NY ESO-1/CAG-3 (der Begriff wird hierin austauschbar mit
CAG-3 verwendet) (SEQ ID NO: 1) kodiert. CAG-3 ist ein potentes
Tumorantigen, das zum Auslösen
einer Antigenspezifischen Immunantwort durch T-Zellen fähig ist.
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Ein
erfindungsgemäßer Aspekt
ist ein isoliertes Krebspeptid, das die Aminosäuresequenz
MLMAQEALAF
LMAQGAMLAA QERRVPRAAE VPGAQGQQGP RGREEAPRGV RMAARLQG (SEQ ID NO: 5)
umfasst, oder ein funktionelles Teil oder Derivat davon, wobei das
funktionelle Teil oder Derivat von Antigen-spezifischen cytotoxischen
T-Lymphozyten immunologisch erkannt wird, die für das Peptid mit der Sequenz
von SEQ ID NO: 5 von 3A spezifisch
sind.
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Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
ist ein isoliertes Krebspeptid, Teil oder Derivat davon, das von
(SEQ ID
NO: 3) kodiert wird, wobei das Teil oder Derivat davon von Antigen-spezifischen
cytotoxischen T-Zellen erkannt wird, die für das Peptid mit der Sequenz
von SEQ ID NO: 5 von
3A spezifisch
sind.
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Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein erfindungsgemäßes Krebspeptid
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfasst. Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist ein Immunogen,
das das erfindungsgemäße Krebspeptid
allein oder zusammen mit mindestens einem immunostimulatorischen
Molekül
umfasst, wobei das Immunogen Antigen-spezifische cytotoxische T-Lymphozyten
hervorruft. Die pharmazeuti sche Zusammensetzung ist zum Behandeln
oder Verhindern von Krebs in einem Säuger verwendbar, wobei die
pharmazeutische Zusammensetzung an den Säuger in einer Menge verabreicht
wird, die zum Verhindern oder Hemmen von Krebs in dem Säuger wirksam
ist.
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Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
ist eine isolierte Nukleinsäure,
die für
das erfindungsgemäße Krebspeptid
kodiert, wobei die Nukleinsäure
nicht für
SEQ ID NO: 4 von 3A kodiert. Erfindungsgemäß werden
ferner Oligonukleotide, die aus einer Nukleinsäure bestehen, die komplementär zu dem
Anteil der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NO: 3, die für
das Peptid mit der Sequenz von SEQ ID NO: 5 kodiert, ist, für eine Verwendung
als Sonden oder Primer bereitgestellt.
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Erfindungsgemäß wird ferner
ein rekombinanter Expressionsvektor bereitgestellt, der die vorstehend beschriebene
Nukleinsäure,
die für
das erfindungsgemäße Krebspeptid
kodiert, allein oder zusammen mit einer DNA-Sequenz, die für mindestens
ein immunostimulatorisches Molekül
kodiert, umfasst.
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Erfindungsgemäß wird auch
ein rekombinantes Virus bereitgestellt, das in das virale Genom
oder einen Teil davon die vorstehend beschriebene Nukleinsäure, die
für ein
erfindungsgemäßes Krebspeptid
kodiert, eingebaut hat.
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Erfindungsgemäß werden
auch isolierte Zellen bereitgestellt, die mit dem rekombinanten
Expressionsvektor, der die vorstehend beschriebene Nukleinsäure, die
für ein
erfindungsgemäßes Krebspeptid
kodiert, allein oder zusammen mit einer DNA-Sequenz, die für mindestens ein immunostimulatorisches
Molekül
kodiert, umfasst, transfiziert oder transduziert sind. Erfindungsgemäß werden
auch isolierte Zellen bereitgestellt, die mit dem rekombinanten
Virus, das in das virale Genom oder einen Teil davon die vorstehend
beschriebene Nukleinsäure,
die für
ein erfindungsgemäßes Krebspeptid
kodiert, eingebaut hat, transfiziert oder transduziert sind. Die
Vektoren und Zellen können
als Vakzinen dienen, wobei eine Expression eines Krebspeptids zu
der Stimulation von Tumorantigen-spezifischen T-Lymphozyten in einem
mit der Vakzine immunisierten Säuger führt.
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Erfindungsgemäß wird auch
ein Verfahren zum rekombinanten Herstellen eines erfindungsgemäßen Krebspeptids
bereitgestellt, umfassend:
- a. Inserieren einer
Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: oder eines Teils oder eine Variante
davon in einen Expressionsvektor,
- b. Transferieren des Expressionsvektors in eine Wirtszelle,
- c. Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression
des Krebspeptids oder funktionellen Teils oder Derivats davon geeignet
sind, und
- d. Gewinnen des rekombinanten Krebspeptids oder funktionellen
Teils oder Derivats davon.
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Erfindungsgemäß wird auch
ein in vitro-Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von Krebs oder
Vorkrebs in einem Säuger
bereitgestellt, umfassend:
- a. In-Kontakt-Bringen
einer Nukleinsäure,
die zu dem Teil der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NO: 3, die für
das Peptid mit der Sequenz von SEQ ID NO: 5 kodiert, komplementär ist, mit
einer biologischen Testprobe von mRNA, die aus dem Säuger entnommen
wurde, unter Bedingungen, die ermöglichen, dass sich ein Komplex
zwischen der Sequenz und der mRNA bildet,
- b. Nachweisen des Komplexes,
- c. Vergleichen der Menge an mRNA in der Testprobe mit einer
Menge an mRNA aus einer bekannten normalen biologischen Probe, wobei
eine erhöhte
Menge an mRNA aus der Testprobe für Krebs oder Vorkrebs indikativ
ist.
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Erfindungsgemäß wird auch
ein in vitro-Verfahren zum Nachweisen des erfindungsgemäßen Krebspeptids
in einer biologischen Probe bereitgestellt, umfassend:
- a. In-Kontakt-Bringen der Probe mit Antikörpern, die für das Krebspeptid
spezifisch sind, unter Bedingungen zum Bilden eines Immunkomplexes
und
- b. Nachweisen des Vorhandenseins des Immunkomplexes.
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Ein
noch weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
ist ein nicht menschliches transgenes Tier, das ein Gen, bestehend
aus SEQ ID NO: 3, oder ein Teil oder Derivat davon trägt und exprimiert,
wobei das Teil oder Derivat für
ein Peptid kodiert, das durch Antigen-spezifische cytotoxische T-Lymphozyten
immunologisch erkannt wird, die für das Peptid mit der Sequenz
von SEQ ID NO: 5 von 3A spezifisch
sind. Solche transgenen Tiere sind zum Screening von bei der Behandlung
von Krebs verwendbaren therapeutischen Mitteln nützlich.
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Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
ist ein isolierter Krebsantigen-spezifischer humaner cytotoxischer
T-Lymphozyt, der durch das erfindungsgemäße Krebspeptid hervorgerufen
wird.
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Ein
noch weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
sind isolierte monoklonale und polyklonale Antikörper oder Antigen-bindende
Teile davon, die an das durch SEQ ID NO: 3 kodierte Krebspeptid
binden, für
eine Verwendung in diagnostischen und Nachweisassays. Die monoklonalen
und polyklonalen Antikörper
können
in der Form eines Kits allein oder zusammen mit anderen Reagenzien
bereitgestellt werden, die üblicherweise
in diagnostischen und Nachweisassays verwendet werden.
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Erfindungsgemäß wird auch
eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein rekombinantes
Virus, das in das virale Genom oder ein Teil davon die vorstehend
beschriebene Nukleinsäure,
die für ein
erfindungsgemäßes Krebspeptid
kodiert, eingebaut hat, allein oder zusammen mit einem exogenen
immunostimulatorischen Molekül,
chemotherapeutischen Arzneimittel, Antibiotikum, antifungiziden
Arzneimittel, antiviralen Arzneimittel, oder einer Kombination davon
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfasst.
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Erfindungsgemäß wird die
Verwendung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Krebspeptids
allein oder zusammen mit einem HLA-Molekül oder einem Fragment davon
für die
Herstellung eines Medikaments bereitgestellt, wobei die Menge zum
Verhindern oder Hemmen von Krebs in einem Säuger wirksam ist.
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Erfindungsgemäß wird die
Verwendung eines rekombinanten Virus, das in das virale Genom oder
einen Teil davon die vorstehend beschriebene Nukleinsäure, die
für ein
erfindungsgemäßes Krebspeptid
kodiert, eingebaut hat, allein oder zusammen mit einem immunostimulatorischen
Molekül
für die
Herstellung eines Medikaments zum Verhindern oder Hemmen von Krebs
in einem Säuger
bereitgestellt.
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Erfindungsgemäß wird die
Verwendung von T-Lymphozyten für
die Herstellung eines Medikaments, vorzugsweise zum Hemmen von Melanom
in einem Säuger,
bereitgestellt, wobei T-Lymphozyten in vitro einem erfindungsgemäßen Krebspeptid
allein oder zusammen mit einem MHC-Molekül oder einem Fragment davon für eine Zeit
ausgesetzt werden, die ausreicht, um Krebspeptid-spezifische T-Lymphozyten
hervorzurufen.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
des erfindungsgemäß beanspruchten
Gegenstands sind in den Ansprüchen
2 bis 4, 6, 9, 11 bis 13, 19 bis 22, 26, 28 bis 30, 39, 40 und 43
dargelegt.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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Diese
und andere Aufgaben, Merkmale und viele der begleitenden erfindungsgemäßen Vorteile
werden beim Lesen der nachstehenden genauen Beschreibung besser
verstanden werden, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen
in Betracht gezogen werden:
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1A bis 1C zeigen
die GM-CSF-Freisetzung von aus TIL586 klonierten CTLs in Reaktion
auf eine Stimulation durch verschiedene Antigen-exprimierende Zellen.
CTL-Klone wurden durch das begrenzende Verdünnungsverfahren isoliert und
wurden weiter expandiert. 1A: GM-CSF-Freisetzung durch CTL-Klon
4 wurde nach Cokultivieren mit unterschiedlichen Zielzellen gemessen.
1B und 1C: In einem getrennten Experiment wurde die GM-CSF-Freisetzung
durch die CTL-Klone 5 und 10 nach Cokultivieren mit verschiedenen
Stimulatoren bestimmt. NHEM680 ist eine HLA-A31-positive normale
Melanozyten-Zelllinie, 397mel ist eine HLA-A31-positive normale
Melanozyten-Zelllinie, 397mel ist eine HLA-A31-negative Melanomzelllinie
und 586mel ist eine HLA-A31-positive Melanomzelllinie.
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2 zeigt
die GM-CSF-Freisetzung aus dem CTL-Klon 5 und CTL-Klon 10 in Reaktion
auf eine Stimulation durch verschiedene bekannte Tumorantigene.
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3A: Nukleotid- und Aminosäuresequenz
von NY-ESO-1. Die Nummerierung der Nukleotidsequenz von NY-ESO-1
beginnt von dem ersten Nukleotid in dem nicht translatierten 5'-Bereich. ORF1 entspricht dem
Genprodukt von NY-ESO-1 und ORF2 entspricht einem 58-Aminosäure-Genprodukt,
das aus dem ORF2 translatiert wird. Antigene Peptide, die von dem
CTL-Klon 2 und 5 erkannt werden, sind umrahmt. Zusätzlich ist
ein Peptid, das schlecht von dem CTL-Klon 5 erkannt wird, unterstrichen.
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3B:
Sequenzalignment des ESO-ORF1-Proteins mit Enterobactin-Synthetase-Komponente F (Zugangsnummer
g250614) und Tegument-Protein von Herpes simplex-Virus-Typ 1 (Zugangsnummer p10220).
Die Reste sind so nummeriert, dass die erste Startstelle die erste
Aminosäure
darstellt. Ein Alignment von ESO-ORF2 und Glutamatdehydrogenase
(Zugangsnummer g1942184) ist auch gezeigt. Die konservierte Aminosäuresubstitution
ist durch das +-Symbol angegeben.
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4 zeigt,
dass COS-7-Zellen, die mit CAG-3 und einem HLA-A31-Molekül transfiziert
wurden, durch CTL-Klon 5-Lymphozyten erkannt werden.
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5A-5C:
Charakterisierung des 9-mers ESO9-54 und des 10-mers ESO10-53, die sich von dem
normalen offenen Leserahmen ableiten. 5A: 586EBV- oder 1510EBV-B-Zellen
wurden mit ESO10-53- und ESO-9-54-Peptiden bei verschiedenen Konzentrationen
120 Minuten gepulst. Nach zwei Waschgängen mit AIM-V-Medium mit 120
IE IL-2 wurde der CTL-Klon 5 (1 × 105/Well)
hinzugegeben und 18 bis 24 Stunden inkubiert. Die GM-CSF-Freisetzung
durch den CTL-Klon 5 wurde durch ELISA bestimmt. 5B:
586mel-Zellen wurden durch den CTL-Klon 5 lysiert, aber 397mel-Zellen wurden
durch den CTL-Klon 5 bei verschiedenen E:T-Verhältnissen nicht lysiert. 5C:
586EBV- und 1510EBV-B-Zellen wurden mit Chrom über Nacht markiert. Das ESO10-53-Peptid
wurde sodann auf die Chrom-markierten 586EBV-, 1510EBV- und T2-Zellen
120 Minuten gepulst. Ein irrelevantes Peptid mit einem HLA-A31-Peptid-bindenden Motiv
wurde auch auf Chrom-markierte 586EBV-, 1510EBV-B-Zellen als Negativkontrollen
gepulst. Nach einer Peptidinkubation und zwei Waschgängen wurde
die Cytolyse von Zielzellen durch den CTL-Klon 5 in einem 4-ständigen Chromfreisetzungstest
bestimmt. Mit dem ESO10-53-Peptid gepulste T2-Zellen wurden für die Spezifizitätskontrolle
verwendet.
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6A-6H:
Die CTL-Klone 2 und 14 erkennen das NY-ESO-1-Gen, aber nicht das
von dem NY-ESO-1-Protein abgeleitete ESO10-53-Peptid. Die CTL-Klone
2, 14 und 5 erkannten NY-ESO-1, wenn sie mit HLA-A31-cDNA in COS-7
co-transfiziert wurden (6A, C,
E und G). TIL1244, die TRP-2 aber nicht NY-ESO-1 erkannten, wurde
als eine Spezifizitätskontrolle
verwendet. 6B, D, F und H: Die CTL-Klone
2, 5, 14 und TIL1244 erkannten 586mel. Jedoch erkannten die CTL-Klone 2 und 14 das
ESO10-53-Peptid nicht, wohingegen der CTL-Klon 5 das ESO10-53-Peptid
stark erkannte, wenn es auf HLA-A31-positive 586EBV-B-Zellen gepulst
worden war. TIL1244 erkannte das TRP197-205-Peptid, das sich von
TRP-2 ableitete. 586EBV-B-Zellen allein oder gepulst mit dem ORF3P-Peptid
aus einem alternativen Leserahmen von TRP1 waren Negativkontrollen.
397mel ist eine HLA-A31-negative,
NY-ESO-1-positive Tumorzelllinie.
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7A-7C:
Ein alternativer offener Leserahmen des NY-ESO-1-Gens und antigene
Peptide, die von CTL erkannt werden. 7A: Identifizierung
von antigenen Peptiden aus dem ORF2. Dreißig Peptide wurden basierend
auf allen möglichen
ORFs synthetisiert und gescreent. Beispielhafte Daten sind hier
gezeigt. Sieben Peptide, die sich von ORF2 ableiten (vgl. 3A), wurden auf HLA-A31-positive 1510EBV-B-Zellen gepulst
und auf eine T-Zell-Erkennung basierend auf einer GM-CSF-Freisetzung getestet.
1510EBV allein wurde als eine Negativkontrolle verwendet. 7B:
1510EBV-B-Zellen wurden mit Chrom 2 Stunden markiert. Das ESORF2-10-18-Peptid
wurde sodann auf die Chrom-markierten 1500EBV (ausgefülltes Quadrat)
und HLA-A31-negative 1102EBV (nicht ausgefüllter Kreis) bei verschiedenen
Konzentrationen gepulst. Mit ESO10-53, das durch den CTL-Klon 5
erkannt wurde, gepulste 1510EBV wurden für die Spezifitätskontrolle (ausgefüllter Kreis)
verwendet. Nach Peptidinkubation und drei Waschgängen wurde die Cytolyse von
Zielzellen durch den CTL-Klon 2 in einem 4-ständigen Chromfreisetzungstest
bei einem E:T-Verhältnis
von 20:1 bestimmt. 7C: Verschiedene Tumorzelllinien
und frische Brusttumore wurden auf eine Erkennung durch den CTL-Klon
2 getestet, um zu bestimmen, ob der ORF2 in verschiedenen Tumoren
translatiert wird. 1510EBV-B-Zellen, die mit ESO10-53, ORF2-10-18
gepulst waren, oder allein wurden eingeschlossen, um die Reaktivität und Spezifität der CTL-Klone
2 und 5 zu evaluieren. Die Expression von HLA-A31 auf den Tumorzellen
ist angegeben.
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Genaue Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung umfasst Krebspeptide, Teile und Derivate davon, die durch
T-Lymphozyten des Immunsystems immunologisch erkannt werden. Die
Erfindung beschreibt ferner (ein) antigene(s) Krebsepitop(e), das/die
in den Krebspeptiden enthalten ist/sind. Das antigene Krebsepitop
bewirkt spezifisch eine zelluläre
vermittelte Immunantwort durch Wechselwirkung mit T-Zellen des Immunsystems.
Diese Wechselwirkung zwischen dem antigenen Krebsepitop und den
T-Zellen bewirkt, dass die T-Zellen auf dem Krebs in einem Säuger, einschließlich Menschen,
reagieren und diesen verhindern, eliminieren oder vermindern.
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Das
Krebspeptid und Teile davon sind charakteristischerweise in normalen
Zellen des Hauptteils von Gewebequellen nicht vorhanden, oder in
sehr geringen Mengen vorhanden und sind in hohen Mengen aus Vorkrebs-
und Krebszellen vorhanden. Eine Expression des Krebspeptids bei
hohen Mengen korreliert mit einer Transformation von normalen Zellen
zu einer Vorkrebs- oder Krebszelle.
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Die
erfindungsgemäßen Krebspeptide
bilden einen Teil von Krebsarten oder leiten sich davon ab, einschließlich in
nicht begrenzender Weise primäres
oder metastatisches Melanom, Thymom, Lymphom, Sarkom, Lungenkrebs,
Leberkrebs, Nicht-Hodgkin's-Lymphom, Hodgkin's-Lymphom, Leukämien, Gebärmutterkrebs,
Cervixkrebs, Blasenkrebs, Nierenkrebs und Adenokarzinome wie Brustkrebs,
Prostatakrebs, Ovarialkrebs, Pankreaskrebs, Schilddrüsenkrebs
und dergleichen.
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Der
Begriff Melanom beinhaltet in nicht begrenzender Weise Melanome,
metastatische Melanome, Melanome, die sich von entweder Melanozyten
oder mit Melanozyten verwandten Nävuszellen ableiten, Melanokarzinome,
Melanoepitheliome, Melanosarkome, in situ-Melanom, superfizielles
ausbreitendes Melanom, nodulares Melanom, lentigomalignes Melanom,
akrales lentigenes Melanom, invasives Melanom oder familiäres atypisches
Muttermal- und Melanom (FAM-M)-Syndrom.
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Von
besonderem Interesse sind Krebspeptide, Fragmente oder Derivate
davon, die von autologen CTL in Patienten mit Krebs, insbesondere
Melanom, erkannt werden. Von weiterem Interesse sind Krebspeptide,
Fragmente oder Derivate davon, die von MHC (oder HLA)-restringierten
CTL, insbesondere MHC-Klasse I-restringierten CTLs, erkannt werden.
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Das „Tumorantigen" umfasst das Krebs-
oder Tumorprotein und jeglichen Teil oder jegliches Peptid des Krebs-
oder Tumorproteins, das zum Auslösen
einer Antitumorantwort in Säugern
fähig ist.
In einer Ausführungsform
beinhaltet das Tumorantigen das Volllängen-Genprodukt, das von dem
ORF2 des CAG-3-Gens translatiert wird. In einer weiteren Ausführungsform
weist das Tumor- oder Krebsantigen eine Länge von etwa 10 Aminosäuren auf.
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„Krebspeptide", wie hierin der
Begriff verwendet wird, umfassen ein jegliches Epitop oder Fragment eines
Krebs- oder Tumorproteins, das als ein Tumorantigen fungiert.
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Die
MHC-restringierten T-Lymphozyten sind zum Identifizieren des Genprodukts,
CAG-3, das mit Krebs und Vorkrebs assoziiert ist, verwendbar. In
einer Ausführungsform
umfasst ein erfindungsgemäßes Krebspeptid,
Fragment oder Derivat davon ein antigenes Krebsepitop, das durch
Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) immunologisch erkannt wird,
die von einem Krebstumor eines Säugers
abstammen. Von besonderem Interesse sind antigene Krebsepitope,
die von Krebsantigen-spezifischen cytotoxischen T-Zellen (CD 8+) erkannt werden.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
umfasst das Krebspeptid die Aminosäuresequenz:
und ein funktionelles Teil
oder Derivat davon.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst das Krebspeptid die Aminosäuresequenz: AAQERRVPR (SEQ.
ID NO: 46).
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In
einer Ausführungsform
umfasst das Krebspeptid die Aminosäuresequenz: Positionsnummer
und Krebsepitope, Fragmente und Derivate und Homologe
davon. Auch eingeschlossen in den Umfang der Erfindung sind Krebspeptide
der SEQ ID NO: 47 mit einer Aminosäuresubstitution an der Position
1, 2, 6, 9 oder einer Kombination davon, mit der Maßgabe, dass
das substituierte Peptid die funktionelle Aktivität bei einer
Stimulation von Krebspeptid-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten
beibehält.
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Auch
eingeschlossen in den Umfang der Erfindung ist ein Krebspeptid mit
einer bis etwa 10 zusätzlichen
Aminosäuren
an dem N-Terminus von SEQ ID NO: 47, vorzugsweise einer bis etwa
5 Aminosäuren,
mehr bevorzugt einer bis etwa 3 Aminosäuren an dem N-Terminus von
SEQ ID NO: 47. In einer Ausführungsform umfassen
die erfindungsgemäßen Krebspeptide
die Aminosäuresequenzen:
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Die
CAG-3-Krebspeptide und das antigene Krebsepitop das in dem erfindungsgemäßen Tumorantigen
enthalten ist, werden in normalem Hoden aber nicht in anderen normalen
Geweben exprimiert. Das erfindungsgemäße Tumorantigen ist in signifikant
niedrigeren Mengen in den meisten normalen Zellen im Vergleich zu
den erhöhten
Mengen, die in Vorkrebs- und Krebszellen gefunden werden, vorhanden.
Eine erhöhte
Expression des Tumorantigens korreliert mit einer Transformation
von normalen Zellen zu einer Vorkrebs- oder Krebszelle. CAG-3 wird
in einer Vielzahl von Krebsarten exprimiert, einschließlich Melanom,
Brustkrebs, Prostatakrebs, Ovarialkrebs, Lungenkrebs, Schilddrüsenkrebs,
Blasenkrebs und Leberkrebs.
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Von
weiterem Interesse sind CAG-3-Krebspeptide, Fragmente oder Derivate
davon, die von MHC-restringierten CTL, insbesondere MHC-Klasse I-restringierten
CTLs, erkannt werden. HLA-Klasse I-restringierte CTLs schließen in nicht
begrenzender Weise HLA-A31, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A33 und HLA-A68
ein. Ein bevorzugter HLA-Subtyp, der von den CAG-3-Krebspeptiden
erkannt wird, ist der HLA-A31-Subtyp.
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Eine
weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
umfasst Derivate und Varianten der Krebspeptide mit einer ausreichenden
Homologie zu CAG-3 oder Epitopen davon, um wirksam als Krebspeptide
zu fungieren. Solche Peptide können
konservative Aminosäureaustausche
an einer oder mehreren Positionen aufweisen. Unter konservativen
Aminosäureaustauschen
wird ein Aminosäureaustausch
bei einer spezifischen Position verstanden, die von der gleichen
Art wie die ursprünglich
vorhandene ist, d.h. eine hydrophobe Aminosäure wird für eine hydrophobe Aminosäure ausgetauscht,
eine basische Aminosäure
für eine
basische Aminosäure,
etc. Solche Aminosäureaustausche
verändern
nicht signifikant die Gesamtladung und -konfiguration des Peptids
und daher behalten solche Varianten die Antikrebsaktivität eines
Krebspeptids bei oder verstärken diese.
Beispiele solcher konservativer Austausche sind dem Fachmann bekannt
und liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
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Die
Erfindung betrifft auch funktionell äquivalente Varianten der CAG-3-Krebspeptide. „Funktionell äquivalente
Varianten” beinhalten
Peptide mit einer Teilsequenzhomologie, Peptide mit einem oder mehreren spezifischen
konservativen und/oder nicht konservativen Aminosäureaustauschen,
Peptidkonjugate, chimäre Proteine,
Fusionsproteine und Peptidnukleinsäuren.
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Die
CAG-3-Krebspeptide, das Tumorantigen und deren antigene Krebsepitope
können
aus natürlichen
Quellen wie aus primären
klinischen Isolaten, Zelllinien und dergleichen aufgereinigt und
isoliert werden. Das CAG-3-Krebspeptid und Teile davon sind mindestens
90% rein, vorzugsweise mindestens 95% rein und so rein wie 100%.
Die Krebspeptide und deren antigene Epitope können auch durch chemische Synthese
oder durch rekombinante DNA-Techniken, die auf dem Gebiet bekannt
sind, erhalten werden. Techniken für eine chemische Synthese sind
in J.M. Steward und J.D. Young, „Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco,
1969; M. Bodansky et al. „Peptide
Synthesis", John
Wiley & Sons,
zweite Ausgabe, 1976 und J. Meienhofer, „Hormonal Proteins and Peptides", Band 2, Seite 46,
Academic Press, New York, 1983 und E. Schroder und K. Kubke, „The Peptides", Band 1, Academic
Press, New York, 1965 beschrieben.
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Die
CAG-3-Krebspeptide und deren antigene Krebsepitope können mit
pharmazeutisch verträglichen Trägern in
pharmazeutische Zusammensetzungen durch bekannte Techniken formuliert
werden. Die Zusammensetzung ist als eine Vakzine zum Verhindern
oder Behandeln von Krebs verwendbar. Die Zusammensetzung kann ferner
mindestens ein immunostimulatorisches Molekül umfassen. Immunostimulatorische
Moleküle,
die zusammen mit dem Krebspeptid oder einem Teil davon zum Stimulieren
von Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten verwendet werden sollen,
beinhalten in nicht begrenzender Weise ein oder mehrere Haupthistokompatibilitätskomplex
(MHC)-Moleküle
wie Klasse I- und Klasse II-Moleküle, vorzugsweise ein Klasse
I-Molekül.
Die Zusammensetzung kann ferner andere Stimulatormoleküle, einschließlich B7.1,
B7.2, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, CD72 und dergleichen, und Cytokine,
die in nicht begrenzender Weise IL-1 bis IL-15, TNFα, IFNγ, RANTES,
G-CSF, M-CSF, IFNα,
CTAP III, ENA-78, GRO, I-309, PF-4, IP-10, LD-78, MGSA, MIP-1α, MIP-1β oder eine
Kombination davon einschließen,
und dergleichen für
eine Immunopotentierung umfassen.
-
Das
Stimulatormolekül
kann als eine physikalisch getrennte Einheit bereitgestellt werden
oder es kann in der Membran einer Antigen-präsentierenden Zelle wie einer
B-Zelle, einem Makrophagen oder einer dendritischen Zelle, in der
Membran eines Liposoms bereitgestellt oder auf der Oberfläche einer
transduzierten oder transfizierten Zelle exprimiert werden. DNA-Sequenzen
von MHC-immunostimulatorischen Molekülen sind von GenBank und dergleichen
erhältlich.
-
Die
CAG-3-Krebspeptide, das Tumorantigen und deren antigene Krebsepitope
sind zum Verhindern oder Behandeln von Krebs verwendbar und in diagnostischen
Tests zum Nachweisen von Krebs oder Vorkrebs in einem Säuger, einschließlich Menschen,
verwendbar. Die Krebspeptide oder Teile davon können in der Form eines Derivats
vorliegen, in dem andere Konstituenten daran angebracht sind, wie
Radiomarkierungen, Biotin, Fluorescein. Ein Zielmittel kann auch
an das Tumorantigen, die Krebspeptide oder Teile davon angebracht sein,
das ein spezifisches Abzielen auf ein spezifisches Organ, einen
spezifischen Tumor oder spezifische Zelltypen ermöglicht.
Solche Zielmittel können
Hormone, Cytokine, zelluläre
Rezeptoren und dergleichen sein. Das Krebspeptid, Tumorantigen und
Teile davon können
in der Form eines Kits, allein oder zusammen mit anderen Reagenzien
hergestellt werden.
-
Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
ist eine Vakzine, die zum Induzieren einer Tumor-spezifischen Zell-vermittelten
Immunität
gegen Krebs verwendbar ist.
-
Ansätze zur
Krebsimmunotherapie können
in aktive oder passive Kategorien eingeteilt werden. Eine aktive
Immunotherapie beinhaltet die direkte Immunisierung von Krebspatienten
mit Krebsantigenen in einem Versuch, Immunantworten gegenüber dem
Tumor zu erhöhen.
Eine passive Immunotherapie betrifft die Verabreichung von Immunreagenzien
wie Immunzellen oder Antikörpern
mit Antitumorreaktivität
mit dem Ziel einer direkten Vermittlung von Antitumorantworten.
-
Jüngste Versuche
bei einer aktiven Immunotherapie verwendeten entweder intakte Krebszellen
oder Krebszellextrakte mit der Erwartung, dass diese Materialien
Tumorantigene in einer Menge und Form enthielten, die zum Stimulieren
von Immunantworten fähig
sind. Diese molekulare Identifizierung von Krebsantigenen hat jedoch
neue Möglichkeiten
zum Entwickeln von Immunotherapien für die Behandlung von menschlichem Krebs
eröffnet.
Eine Zusammenfassung einiger dieser Ansätze ist in Tabelle 1 dargelegt.
-
Tabelle 1 Krebstherapien auf der Basis
der molekularen Identifizierung von Krebsantigenen
-
- 1. Aktive Immunotherapie mit:
a. immunodominanten
Peptiden
1) allein
2) kombiniert mit Adjuvanzien
3)
gebunden an Helferpeptide, Lipide oder Liposome
4) gepulst
auf Antigen-präsentierende
Zellen
b. immunodominanten Peptiden mit Aminosäuresubstitutionen
zur Erhöhung
der Bindung an MHC-Moleküle
c.
Proteinen allein oder zusammen mit Adjuvanzien
d. „nackter" DNA, die für Krebsantigene
kodiert
1) „Genrevolver" für eine intradermale
Injektion
2) intramuskuläre
Injektion
3) an Lipide gebunden
e. rekombinanten Viren
wie Vaccinia, Geflügelpocken
oder Adenovirus, die
1) für
Krebsantigene alleine kodieren
2) für Krebsantigene kodieren, zusammen
mit Genen, die für
Cytokine, co-stimulatorische Moleküle oder andere Gene kodieren,
um die Immunantwort zu erhöhen,
f.
rekombinanten Bakterien wie BCG, Salmonella oder Listeria, die für Krebsantigene
kodieren, allein oder zusammen mit immunostimulatorischen Molekülen,
- 2. Aktive Immunotherapie (vorstehend), gefolgt von der Verabreichung
von immunostimulatorischen Cytokinen,
1. IL-2
2. IL-6
3.
IL-10
4. IL-12
5. IL-15 und dergleichen.
- 3. Passive Immunotherapie mit Antitumor-Lymphozyten, die durch
in vitro-Sensibilisierung von TIL oder PBL gegenüber
1. immunodominanten
Peptiden, gepulst auf Antigen-präsentierende
Zellen (die CD8-Zellen hervorgerufen)
2. antigene Proteine,
die mit Antigen-präsentierenden
Zellen co-inkubiert wurden (exogenes Antigen-präsentierender Weg zur Hervorrufung
von CD4-Zellen)
hervorgerufen wurden.
-
Die
Insertion des Gens, das für
CAG-3-Krebsantigene kodiert, in Expressionssysteme mit hoher Wirksamkeit
wie E. coli, Hefe oder Baculovirus und dergleichen stellt die Möglichkeit
bereit, große
Mengen an aufgereinigtem Tumorantigen für eine Verwendung in der Immunisierung
zu erhalten. Alternativ dazu könnten
die immunodominanten Peptide aus diesen Tumorantigenen leicht in
vitro synthetisiert und in großen
Mengen für eine
Immunisierung allein oder in einer Form aufgereinigt werden, die
zum Verbessern ihrer Immunogenizität angedacht ist, wie in Verbindung
mit einem Adjuvanz, eine Bindung an Lipide/Liposome oder Helferpeptide, oder
gepulst auf Antigen-präsentierende
Zellen. Eine Modifizierung von individuellen Aminosäuren der
immunodominanten Peptide zur Verbesserung der Bindungswirksamkeit
an MHC-Antigene kann potentiell die Immunogenizität im Vergleich
zu dem nativen Peptid erhöhen.
-
Moderne
Techniken, die „nackte" DNA verwenden, die
direkt in Muskel oder in die Haut injiziert wird, haben gezeigt,
dass sie sowohl zelluläre
als auch humorale Immunreaktionen auf kodierte Antigene hervorrufen
(Cooney, E.L., A.C. Collier, P.D. Greenberg, R.W. Coombs, J. Zarling,
D.E. Arditti, M.C. Hoffman, S.L. Hu und L. Correy, 1991, Lancet
337:567; Wolff, J.A., R.W. Malone, P. Williams, W. Chong, G. Acsadi,
A. Jani, und P.L. Felgner, 1990, Science 247:1465; Davis, H.L.,
R.G. Whalen, und B.A. Demeniex, 1993, Hum. Gene Ther. 4:151; Yang,
N.S., J. Burkholder, 13. Roberts, B. Martinelli, und D. McCabe,
1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9568; Williams, R.S., S.A.
Johnston, M. Riedy, M.J. DeVit, S.G. McElligott, and J.C. Sanford,
1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726; Fynan, E.R., Webster,
D.H. Fuller, J.R. Haynes, J.C. Santoro, und H.L. Robinson, 1995,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478; Eisenbraum, M.D., D.H. Fuller,
und J.R. Haynes, 1993, DNA and Cell. Bio. 12:791; Fuller, D.H. und
J.R. Haynes, 1994, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10(11): 1433; Acsadi,
G., G. Dickson, D.R. Love, A. Jani, F.S. Walsh, A. Gurusinghe, J.A.
Wolff, und K.E. Davies, 1991, Nature 352:815). Techniken, die nicht
lebensfähige
DNA-Vektoren verwenden, weisen den Vorteil einer einfachen Herstellung und
Sicherheit einer Verabreichung auf. Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
ist als ein Immunogen und als eine DNA-Vakzine gegen Krebs verwendbar.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
von CAG-3-Krebspeptiden kann unter Verwen dung eines Genrevolvers
in Mengen verabreicht werden, die eine zelluläre Antwort gegenüber einer
Krebszelle hervorrufen. Nanogrammmengen sind für solche Zwecke verwendbar.
-
Eine
wirksame Form einer Immunisierung beinhaltet das Einbringen von
Genen, die für
immunogene Moleküle
kodieren, in rekombinante Bakterien wie BCG, Salmonella oder Listeria
oder in rekombinante Viren wie Vakzinia, Geflügelpocken oder Adenovirus und
dergleichen. Die Gene, die für
CAG-3-Krebsantigene kodieren, können
entweder allein oder zusammen mit Genen exprimiert werden, die für immunostimulatorische Moleküle oder
andere Gene kodieren, die die Immunantwort nach Infektion erhöhen können. Studien
mit Modelltumorantigenen in Mausmodellen zeigten, dass ein Einbringen
des Gens für
Interleukin-2 (IL-2) oder B7.1 die Immunogenizität von Modelltumorantigenen
erhöhen
und sogar die Regression von etablierten Lungenmetastasen, die diese
Antigene tragen, mediieren kann. Eine aktive Immunotherapie, gefolgt
von der exogenen Verabreichung von immunostimulatorischen Cytokinen
wie IL-2, IL-6, IL-10, IL-12 oder IL-15 kann auch zum Verbessern
von Immunantworten verwendet werden.
-
Eine
passive Immunotherapie mit genetisch modifizierten Immunzellen (herkömmlich als
adoptive Immunotherapie bezeichnet), die zum Erkennen von menschlichen
Tumorantigenen fähig
sind, ist beim Mediieren der Regression von Krebs in ausgewählten Patienten
mit metastatischem Melanom wirksam. In vitro-Techniken wurden entwickelt,
bei denen menschliche Lymphozyten in vitro gegenüber Tumorantigen-immunodominanten
Peptiden, die auf Antigen-präsentierenden
Zellen präsentiert
werden, sensibilisiert werden. Durch wiederholte in vitro-Stimulation
können
Zellen mit einer weitaus größeren Kapazität zum Erkennen
von menschlichen Tumorantigenen als die TIL, die zum Klonieren der
Gene, die für
diese Antigene kodieren, verwendet wurden, abgeleitet werden. Folglich
könnten
durch wiederholte in vitro-Sensibilisierung mit den Krebspeptiden Lymphozyten
mit einer 50- bis 100-fach
größeren Potenz
von TIL abgeleitet werden. Der adoptive Transfer dieser Zellen kann
beim Mediieren einer Tumorregression in vivo wirksamer sein als
derjenige von konventionell gewachsenen TIL.
-
Zum
Verhindern oder Hemmen von Krebs können die Krebspeptide oder
Teile davon über
einen von mehreren Wegen verabreicht werden, einschließlich in
nicht begrenzender Weise intravenös, intramuskulär, subkutan,
intradermal, intraperitone al, intrathekal, intrapleural, intrauterin,
rektal, vaginal, topisch, in den Tumor und dergleichen.
-
Eine
Verabreichung kann durch transmukosale oder transdermale Mittel
erfolgen. Für
eine transmukosale oder transdermale Verabreichung werden Penetrierungsmittel,
die für
die zu permeierende Barriere geeignet sind, in der Formulierung
verwendet. Solche Penetrierungsmittel sind allgemein bekannt und
beinhalten z.B. für
eine transmukosale Verabreichung Gallensäuresalze und Fusidinsäure-Derivate.
Zusätzlich
können Detergenzien
verwendet werden, um eine Permeation zu vereinfachen. Eine transmukosale
Verabreichung kann z.B. durch Nasensprays oder Suppositorien erfolgen.
Für eine
orale Verabreichung wird das Krebspeptid, Tumorantigen oder Teil
oder Variante davon in eine herkömmliche
orale Verabreichungsform wie Kapseln, Tabletten und Arzneimittel
formuliert.
-
Im
Allgemeinen ist es erwünscht,
den Empfänger
mit einer Dosis an CAG-3-Krebspeptid oder einem Teil davon von mindestens
etwa 1 pg/kg Körpergewicht,
vorzugsweise mindestens etwa 1 ng/kg Körpergewicht, mehr bevorzugt
mindestens etwa 1 μg
oder mehr pro Kilogramm Körpergewicht
des Empfängers
zu versorgen. Ein Bereich von etwa 1 ng/kg Körpergewicht bis etwa 100 mg/kg
Körpergewicht
ist bevorzugt, obwohl eine geringere oder höhere Dosis verabreicht werden
kann. Die Dosis ist für
ein Primen, Stimulieren und/oder Bewirken der klonalen Expansion
von CAG-3-Krebsantigen-spezifischen T-Lymphozyten, vorzugsweise
cytotoxischen T-Lymphozyten, wirksam, die ihrerseits zum Verhindern
oder Hemmen von Krebs in dem Empfänger fähig sind.
-
Die
Dosis wird mindestens einmal verabreicht und kann als ein Bolus
oder eine kontinuierliche Verabreichung bereitgestellt werden. Viele
Verabreichungen der Dosis über
einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten können bevorzugt sein. Anschließende Dosen
können
wie angegeben verabreicht werden.
-
Zum
Verhindern von Krebs in einem Säuger
wird eine Vakzine, die das CAG-3-Krebspeptid
oder einen Teil davon umfasst, an den Säuger in einer Menge verabreicht,
die zum Verhindern von Krebs in dem Säuger wirksam ist. Von besonderem
Interesse ist eine Vakzine, die SEQ ID NO: 46, 47 oder eine Kombination
davon umfasst.
-
Zum
Vermindern der Tumorlast in Tieren mit Tumoren wird eine wirksame
Menge eines CAG-3-Antigenkrebsepitops bei einer Stelle der Tumorlast
verabreicht, wobei die Menge zum Vermindern der Größe des Tumors
an der Stelle wirksam ist.
-
Autologe
cytotoxische Lymphozyten oder Tumor-infiltrierende Lymphozyten können aus
einem Patienten mit Krebs erhalten werden. Die Lymphozyten werden
in Kultur wachsen gelassen und Krebsartigen-spezifische Lymphozyten
werden durch Kultivieren in der Gegenwart von spezifischen Krebspeptiden
oder antigenen Krebsepitopen allein oder zusammen mit mindestens
einem immunostimulatorischen Molekül mit Cytokinen expandiert.
Die Antigen-spezifischen Lymphozyten werden sodann zurück in den
Patienten in einer Menge infundiert, die zum Vermindern oder Eliminieren
der Tumore in dem Patienten wirksam ist.
-
Nach
Immunisierung kann die Wirksamkeit der Vakzine durch Produktion
von Immunzellen, die das CAG-3-Krebsartigen erkennen, untersucht
werden, wie durch spezifische lytische Aktivität, spezifische Cytokinproduktion,
Tumorregression oder einer Kombination von diesen getestet. Falls
der zu immunisierende Säuger
bereits von Krebs oder Metastasenkrebs betroffen ist, kann die Vakzine
zusammen mit anderen therapeutischen Behandlungen wie Immunomodulatoren,
z.B. IL-2, IL-6, IL-10,
IL-12, IL-15, Interferon, Tumornekrosefaktor und dergleichen, chemotherapeutischen
Arzneimitteln wie Cisplatin, antiviralen Arzneimitteln, wie Gancyclovir,
Amphotericin B, Antibiotika und dergleichen verabreicht werden.
-
Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
ist eine DNA-Sequenz, die für
ein erfindungsgemäßes Krebspeptid
kodiert, wobei die DNA-Sequenz nicht für die SEQ ID NO: 4 von 3A kodiert. In einer Ausführungsform
umfasst die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 3, einen Teil davon und eine
funktionell äquivalente
Sequenzvariante davon, die für
ein CAG-3-Krebspeptid oder Teile davon kodieren, die von CAG-3-Krebsantigen-spezifischen
T-Lymphozyten, einschließlich
Tumor-infiltrierenden Lymphozyten, erkannt werden. Auch erfindungsgemäß umfasst
sind Nukleinsäuresequenzen,
die zu SEQ ID NO: 3 komplementär
als auch antikomplementär sind.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst die DNA-Sequenz:
CCT CGG GGC CGG GAG GAG GCG CCC CGC
GGG (SEQ ID NO: 51).
-
In
einer weiteren Auführungsform
kodiert die erfindungsgemäße DNA-Sequenz
für das
Krebspeptid LAAQERRVPR von SEQ ID NO: 47, das Krebspeptid AAQERRVPR
von SEQ ID NO: 46, Krebsepitope, Fragmente, Derivate oder Homologe
davon.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst die DNA-Sequenz:
CTG GCG GCC CAG GAG AGG CGG GTG CCA
CGG (SEQ ID NO: 52) und Varianten davon.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst die DNA-Sequenz:
GCG GCC CAG GAG AGG CGG GTG CCA CGG
(SEQ ID NO: 53).
-
Aufgrund
der Degeneriertheit des genetischen Codes werden Variationen in
der DNA-Sequenz zu einer Translation eines äquivalenten Krebspeptids führen. Als
ein Ergebnis sind Substitutionen in dem Umfang der Erfindung eingeschlossen,
sofern die Substitution zu einer Expression eines Krebspeptids führt, das
durch Antigenspezifische HLA-restringierte T-Zellen erkannt wird,
die für
das Peptid mit der Sequenz von SEQ ID NO: 5 spezifisch sind.
-
Der
gesamte oder ein Teil des offenen Leserahmens der DNA-Sequenz aus
dem CAG-3-Gen, das für das
Peptid mit der Sequenz von SEQ ID NO: 5 kodiert, kann als Sonden
verwendet werden, um die Homologen des Krebspeptids in anderen Säugerspezien
zu identifizieren und zu isolieren. In einer Ausführungsform
wird eine menschliche cDNA-Sequenz zum Screenen einer Säuger-cDNA-Bibliothek
für eine
homologe Maus-Nukleinsäuresequenz
verwendet. Positive Klone werden selektiert und sequenziert. Beispiele
für Gewebequellen,
aus denen die cDNA-Bibliothek synthetisiert werden kann, beinhalten
in nicht begrenzender Weise Haut, Epidermis, solide Tumore, Melanome,
Melanozyten und dergleichen. Der Fachmann wird die geeigneten Hybridisierungsbedingungen,
die zum Nachweisen der Homologen verwendet werden sollen, verstehen.
Herkömmliche
Verfahren für
eine Nukleinsäurehybridisierung,
Konstruktion von Bibliotheken und Klonierungstechniken sind in Sambrook
et al. (Hrsg.) (1989) in „Molecular
Cloning. A Laboratory Manual" Cold
Spring Harbor Press, Plainview, New York und Ausubel et al. (Hrsg.)
in "Current Protocols
in Molecular Biology" (1987),
John Wiley and Sons, New York, New York, beschrieben.
-
Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
sind Nukleinsauresonden für
den Nachweis und die Quantifizierung von RNA, die die erfindungsgemäßen Krebspeptide
transkribieren, in biologischen Proben, die aus einem Säuger mit
Krebs isoliert werden. Veränderungen
in der Menge an RNA relativ zu einer Kontroll-RNA-Probe sind bei
der Diagnose und Prognose der Erkrankung in dem Säuger verwendbar.
-
In
einer Ausführungsform
ist die mRNA von einem Gewebe eines Patienten abgeleitet, der in
Verdacht steht, Krebs oder Vorkrebs aufzuweisen, und wird mit mRNA,
die sich von einem gesunden Kontrollpatienten ableitet, verglichen.
Eine quantitative und/oder qualitative Erhöhung der mRNA, die für ein erfindungsgemäßes Krebspeptid
kodiert, in dem Patienten im Vergleich zu der Kontrolle ist für Krebs
oder Vorkrebs in dem Patienten indikativ. Die mRNA kann unter Verwendung
von Oligonukleotidsonden, die mit der mRNA hybridisierbar sind,
nachgewiesen werden. In einer Ausführungsform ist die Sonde mit
dem Transkriptionsprodukt von SEQ ID NO: 51 hybridisierbar.
-
Kombinationen
von Oligonukleotidpaaren basierend auf der Sequenz, die für das erfindungsgemäße Krebspeptid
kodiert, können
als PCR-Primer zum Nachweisen von mRNA in biologischen Proben unter
Verwendung des Verfahrens der reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
(RT-PCR) für
ein Amplifizieren von ausgewählten
RNA-Sequenzen verwendet werden. Erfindungsgemäß ist auch eine in situ-PCR und in situ-RT-PCR
zum Nachweis von DNA und RNA, die für die erfindungsgemäßen Krebspeptide
kodieren, umfasst. Die Technik wird bevorzugt, wenn die Kopienzahl
einer Zielnukleinsäure
sehr gering ist, oder wenn verschiedene Formen von Nukleinsäuren unterschieden
werden müssen.
Das Verfahren ist insbesondere beim Nachweisen und Differenzieren
von Vorkrebs- und Krebszellen von normalen Zellen verwendbar.
-
Erfindungsgemäß ist auch
ein rekombinanter Expressionsvektor umfasst, der die DNA-Sequenz
umfasst, die für
ein erfindungsgemäßes Krebspeptid
kodiert. Gegebenenfalls kann der Vektor auch eine DNA-Sequenz umfassen,
die für
mindestens ein immunostimulatorisches Molekül kodiert. Der Vektor kann
auch ein Gen, das für
grün fluoreszierendes
Protein kodiert, für
eine Verwendung zum Nachweisen einer Lokalisierung von CAG-3-Krebspeptiden
in Zellen und Geweben enthalten.
-
Eukaryotische
Expressionsvektoren beinhalten in nicht begrenzender Weise retrovirale
Vektoren, Vakziniavirus-Vektoren, Adenovirus-Vektoren, Herpesvirus-Vekto ren,
Geflügelpockenvirus-Vektoren,
Baaculovirus-Vektoren menschliches Papillomavirus-Vektoren, Pferdeenzephalitis-Vektoren,
Influenzavirus-Vektoren und dergleichen.
-
Erfindungsgemäß ist ein
rekombinantes Virus umfasst, das ein erfindungsgemäßes CAG-3-Krebspeptid
exprimiert. Das rekombinante Virus kann auch mindestens ein immunostimulatorisches
Molekül
exprimieren. Das rekombinante Virus ist zum Hervorrufen oder Hinaufregulieren
einer zellvermittelten Immunantwort in einem Säuger zum Zweck eines Verhinderns
oder Behandelns von Krebs in dem Säuger, insbesondere Menschen,
fähig.
-
Eine
Wirtszelle, die mit dem rekombinanten Virus infiziert ist, exprimiert
das erfindungsgemäße Krebspeptid
allein oder zusammen mit mindestens einem immunostimulatorischen
Molekül.
Die Wirtszelle kann auch mit einem rekombinanten Virus infiziert
sein, das ein HLA-Klasse I-Molekül
exprimiert.
-
Verfahren
zum Konstruieren und Exprimieren von exogenen Genprodukten aus rekombinanten
Vakziniavirus-Vektoren sind von Perkus et al., Science 229:981-984,
1985, Kaufman et al., Int. J. Cancer 48:900-907, 1991, Moss, Science
252:1662, 1991, Smith und Moss BioTechniques Nov/Dez, Seiten 306-312, 1984
und
US-PS 4,738,846 beschrieben.
Sutter und Moss (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10847-10851, 1992) und
Sutter et al. (Virology 1994) beschreiben die Konstruktion und Verwendung
des nicht replizierenden rekombinanten Ankara-Virus (MVA, modifiziertes
Vakzinia-Ankara) als Vektor, das als viraler Vektor erfindungsgemäß verwendet
werden kann. Baxby und Paoletti (Vaccine 10:8-9, 1992) beschreiben
die Konstruktion und Verwendung eines nicht replizierenden Pockenvirus
als Vektor, einschließlich
Canaripockenvirus, Geflügelpockenvirus
und anderer Vogelspezies für
eine erfindungsgemäße Verwendung
als viralen Vektor.
-
Die
erfindungsgemäßen Vektoren
können
in eine geeignete Wirtszelle für
die Expression des erfindungsgemäßen Krebspeptids
oder eines antigenen Krebsepitops davon eingebracht werden. Eukaryotische Wirtszelllinien
beinhalten in nicht begrenzender Weise COS-Zellen, CHO-Zellen, HeLa-Zellen,
NIH/3T3-Zellen, Insektenzellen, Antigen-präsentierende Zellen wie dendritische
Zellen und dergleichen. Gegebenenfalls kann die Wirtszelle auch
ein stimulatorisches Molekül
exprimieren. In dem Fall, bei dem die Wirtszellen sowohl das Krebspeptid
oder antigenes Krebsepitop zusammen mit mindestens einem MHC (oder
HLA)-Molekül
exprimieren, ist es bevorzugt, dass ein eukaryotisches Expressionssystem
verwendet wird, um eine korrekte Glykosylierung zu ermöglichen.
Die Expression sowohl des Krebsantigens als auch des immunostimulatorischen Moleküls durch
die Wirtszelle stellt das notwendige MHC-restringierte Peptid an
spezifische T-Zellen und das geeignete Signal an die T-Zelle bereit,
um bei der Antigenerkennung und Proliferation oder klonalen Expansion von
Antigen-spezifischen T-Zellen zu helfen. Das Gesamtergebnis ist
eine Hochregulierung des Immunsystems. Die Hochregulierung der Immunantwort
manifestiert sich durch eine Zunahme der Krebsantigen-spezifischen
cytotoxischen Lymphozyten, die Krebs- oder Vorkrebszellen zerstören oder
deren Wachstum hemmen können.
-
Die
DNA kann in die Wirtszelle durch Transfektion, Transduktion, Liposomen
und dergleichen durch bekannte Verfahren inseriert werden (Sambrook
et al., 1989, in: „Molecular
Cloning: A Laboratory Manual", Cold
Spring Harbor press, Plainview, New York). Für Liposomen sind kationische
Lipide, z.B. polykationisches Lipid, Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium
(DMRIE), komplexiert mit dem neutralen Phospholipid Dioleoylphosphatidylethanolamin
(DOPE), bevorzugt, wie von Nabel, E.G. et al., 1992, Hum. Gene. Ther.
3:367-275; Nabel, G.J. et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:649-656;
Stewart, M.J. et al. 1992 Hum Gene Ther. 3:399-410; Nabel, G.J.
et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11307-11311; und Harrison,
G.S. et al. 1995 Bio Techniques 19:816-823, beschrieben.
-
Das
erfindungsgemäße rekombinante
Krebspeptid, Tumorantigen, oder antigenes Krebsepitop, das von den
Wirtszellen exprimiert wird, kann aus Zelllysaten oder Zellüberständen durch
Standardproteinaufreinigungsverfahren, die bekannt sind, aufgereinigt
werden. Diese beinhalten in nicht begrenzender Weise Molekularsiebchromatographie,
Ionenaustauschchromatographie, isoelektrische Fokussierung, Gelelektrophorese,
Affinitätschromatographie,
HPLC, HPLC mit reverser Phase und dergleichen. (Ausubel et al.,
1987, in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and
Sons, New York, NY). Immunoaffinitätschromatographie kann auch
für eine
Aufreinigung unter Verwendung von Antikrebsproteinantikörpern oder
Antigen-bindenden Fragmenten davon, wie hierin beschrieben, als
das Immunoaffinitätsmittel
verwendet werden.
-
Das
rekombinante Virus kann auch als ein Therapeutikum oder eine Vakzine
verwendet werden. Bei solchen Verwendungen ist es wünschenswert,
dem Empfänger
eine Dosis eines rekombinanten Virus in dem Bereich von etwa 105 bis etwa 1010 Plaque-formende
Einheiten/mg Säuger
bereitzustellen obwohl eine geringere oder höhere Dosis verabreicht werden
kann.
-
Der
rekombinante virale Vektor kann in einen Säuger entweder vor einem jeglichen
Anzeichen von Krebs wie Melanom oder zum Mediieren einer Regression
der Erkrankung in einem Säuger
eingebracht werden, der von einem Krebs wie Melanom betroffen ist.
Beispiele für
Verfahren zum Verabreichen des viralen Vektors in Säuger beinhalten
in nicht begrenzender Weise ein Aussetzen der Zellen gegenüber dem
rekombinanten Virus ex vivo oder eine Injektion des rekombinanten
Virus in das betroffene Gewebe oder eine intravenöse, subkutane,
intradermale, intramuskuläre
Verabreichung des Virus und dergleichen. Alternativ dazu kann der
rekombinante virale Vektor oder eine Kombination von rekombinanten
viralen Vektoren lokal durch direkte Injektion in die krebsartige
Läsion
oder durch topische Verabreichung in einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen
Träger
verabreicht werden. Die Menge an rekombinantem viralem Vektor, der
die Nukleinsäuresequenz
von Interesse trägt,
basiert auf dem Titer von Viruspartikeln. Ein bevorzugter Bereich
für eine
Immunisierung beträgt
etwa 105 bis 1010 Viruspartikel
pro Säuger,
vorzugsweise einem Menschen.
-
Erfindungsgemäß wird ein
nicht menschliches transgenes Tier bereitgestellt, das in sein Genom
eine oder mehrere Kopien der DNA-Sequenz eingebaut hat, die für ein erfindungsgemäßes Krebspeptid
kodiert. Das allgemeine Verfahren zum Erzeugen von transgenen Tieren
ist in Krimpenfort et al.,
US-PS
5,175,384 , Leder et al.,
US-PS 5,175,383 ,
Wagner et al.,
US-PS 5,175,385 ,
Evans et al.,
US-PS 4,870,009 und
Berns,
US-PS 5,174,986 ,
beschrieben. Der Einbau des Gens führt zu einer Überexpression,
veränderten
Expression oder Expression von vielen Formen oder Varianten der
Krebspeptide. Das sich ergebende transgene Tier ist in Studien der
Entwicklung von Krebs oder des erfindungsgemäßen Tumorantigens verwendbar.
Das Tiermodell ist beim Screening von Vakzinen und chemotherapeutischen
Arzneimitteln für
eine Krebsbehandlung verwendbar. Das transgene Tier ist auch in
Studien der Entwicklung von Krebs verwendbar.
-
Erfindungsgemäß ist ferner
ein isolierter Antikörper
oder ein Antigen-bindender Teil davon umfasst, der durch Immunisierung
des erfindungsgemäßen Krebspeptids
hervorgerufen wird. In dem Fall, bei dem das Krebspeptid aus lediglich
wenigen Aminosäuren
zusammengesetzt ist, kann das Krebspeptid an ein Trägerprotein
konjugiert sein, um eine Antikörperantwort
hervorzurufen. Trägerproteine
wie KLH, Tetanustoxoid und dergleichen und Verfahren zum Konjugieren
sind bekannt. Der Antikörper
weist eine Spezifität
für das
erfindungsgemäße Krebspeptid
auf und reagiert damit oder bindet daran.
-
Beispielhafte
Antikörpermoleküle sind
intakte Immunglobulinmoleküle,
im Wesentlichen intakte Globulinmoleküle oder diejenigen Teile eines
Immunglobulinmoleküls,
die die Antigenbindestelle enthalten, einschließlich derjenigen Teile von
Immunglobulinmolekülen,
die als F (ab), F (ab'),
F (ab')
2,
humanisierter chimärer
Antikörper
und F (v) bekannt sind. Polyklonale oder monoklonale Antikörper können durch
bekannte Verfahren erzeugt werden. (Kohler und Milstein (1975) Nature
256, 495-497; Campbell „Monoclonal
Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent
and Human Hybridomas" in
Burdon et al. (Hrsg.) (1985) "Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Band 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam).
Die Antikörper
oder Antigen-bindenden Fragmente können auch durch genetische
Techniken erzeugt werden. Die Technologie für eine Expression von Genen
sowohl der schweren als auch der leichten Kette ist Gegenstand der
PCT-Patentveröffentlichungen:
WO 901443 ,
WO 9014424 , Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281,
und
US-PS 4,946,778 .
Humanisierte Immunoglobuline mit einem oder mehreren komplementären bestimmenden
Bereichen und Verfahren zum Herstellen der Antikörper sind in den US-PSen
5,585,089 und
5,530,101 beschrieben.
-
In
einer Ausführungsform
werden die erfindungsgemäßen Antikörper in
Immunoassays zum Nachweisen von erfindungsgemäßen Krebspeptiden in biologischen
Proben verwendet. Die Antikörper
oder Antigen-bindenden Fragmente davon können zum Nachweisen von Krebspeptiden
in Gewebebiopsieproben aus einem Säuger, der von Krebs betroffen
ist, verwendet werden. Eine Untersuchung des Krebsantigens in einem erkrankten
Gewebe kann zur Prognose der Progression der Erkrankung in einem
Säuger
verwendet werden oder kann die Wirksamkeit einer Behandlung diagnostizieren.
Der Immunoassay kann ein Radioimmunoassay, Western Blot-Assay, Immunofluoreszenzassay,
Enzymimmunoassay, Chemilumineszenzassay, immunohistochemischer Assay
und dergleichen sein und kann in vitro, in vivo oder in situ erfolgen.
Standardtechniken, die für
ELISA bekannt sind, sind in „Methods
in Immunodiagnosis",
2. Auflage, Rose und Bigazzi, Hrsg., John Wiley & Sons, 1980, Campbell et al., „Methods
and Immunology",
W.A. Benjamin, Inc., 1964, und Oellerich, M., 1984, J. Clin. Chem.
Clin. Biochem. 22:895-904, beschrieben. Herkömmliche Verfahren für eine Immunohistochemie
sind in Harlow und Lane (Hrsg.) (1988) in „Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, New York, Ausbel et al. (Hrsg.) (1987)
in Current Protocols In Molecular Biologo, John Wiley and Sons (New
York, NY), beschrieben. Biologische Proben, die für solche
Nachweisassays geeignet sind, beinhalten in nicht begrenzender Weise
Zellen, Gewebebiopsie, Gesamtblut, Plasma, Serum, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit,
Pleuralflüssigkeit,
Urin und dergleichen.
-
Die
erfindungsgemäßen Antikörper oder
Antigen-bindenden Fragmente können
auch in einer Immunotherapie verwendet werden. Die Antikörper oder
das Antigenbindende Fragment davon werden/wird an einen Säuger in
einer Menge bereitgestellt, die ausreichend ist, um die Schwere,
das Ausmaß oder
die Dauer des Krebs zu verhindern, zu verringern oder zu attenuieren.
-
Obwohl
die Erfindung vorstehend in Bezug auf spezifische Ausführungsformen
beschrieben wurde, wird es verstanden werden, dass viele Variationen
möglich
sind und dass alternative Materialien und Reagenzien verwendet werden
können,
ohne die Erfindung zu verlassen. In manchen Fällen können solche Variationen und
Substitutionen ein gewisses Experimentieren benötigen, aber werden lediglich
ein Routinetesten beinhalten.
-
Diejenigen
Beispiele, die nicht durch die Ansprüche umfasst sind, sind lediglich
für Vergleichszwecke angegeben.
-
Beispiel 1
-
Materialien und Verfahren
-
Chemikalien und Reagenzien
-
Die
nachfolgenden Chemikalien und Reagenzien wurden von den angegebenen
Quellen bezogen: RPMI 1640, AIM-V-Medien, Lipofectamin, G418 (GIBCO
BRL, Gaithersberg, MD); der eukaryotische Expressionsvektor pCR3
(Invitrogen, San Diego, CA); Anti-HLA-A31-monoklonaler Antikörper (One
lambda, Canoga Park, CA); Anti-Immunoglobulin-M-Antikörper, konjugiert
mit Fluoresceinisothiocyanat (Vector Laboratories, Inc., Burlingame,
CA).
-
Cytotoxische T-Lymphozyten (CLS's) und Zelllinien
-
TIL
586 wurden aus der Tumorspezies eines Patienten mit metastatischem
Melanom isoliert und in einem Medium mit IL-2 (6000 IE/ml) (Chiron)
32-60 Tage wie vorstehend beschrieben wachsen gelassen (Topalian,
S.D. Solomon, F.P. Avis, A.E. Chang, D.L. Freeksen, W.M. Linehan,
M.T. Lotze, C.N. Robertson, C.A. Seipp, P. Simon, C.G. Simpson,
und S.A. Rosenberg, 1988, J. Clin. Oncol. 6: 839-53). TIL586 und
TIL1244 waren vorherrschend CD8+-T-Zellen.
TIL1200 wurden unter den gleichen Bedingungen, wie sie für TIL586
beschrieben sind, wachsen gelassen. TIL1244 erkannten das TRP-2-Peptid
in dem Zusammenhang von HLA-A31 und -A33 (31). Die T-Zellklone oder
Kloide wurden durch begrenzte Verdünnungsverfahren (bei einer Zelle/Well)
aus der TIL586-Zelllinie unter Verwendung von allogenen PBL (1 × 103 Zellen/Well) als Zuführzellen in RPMI1640 mit 10%
humanem AB-Serum und 500 IE IL-2 erzeugt. Nach 12 Tagen wurden die
T-Zellklone in AIM-V-Medium mit 6000 IE/ml IL-2 expandiert. Um eine
optimale Expansion zu erhalten, verwendeten wir das OKT3-Expansionsverfahren,
das von S. Riddell (32) beschrieben wurde. Kurz gesagt, wurden an
dem Tag 0 5 × 104 bis 5 × 105 T-Zellen mit HLA-A31 +-PBL
(500:1, PBL:T-Zellverhältnis)
und 586EBV-B-Zellen (100:1, EBV:T-Zellverhältnis) in 25 ml RPMI 1640 mit
11% humanem Serum, 30 ng/ml OKT3 Ab und Antibiotika co-kultiviert.
Am Tag 1 wurde IL-2 bei einer Endkonzentration von 180 IE/ml hinzugegeben.
Das Medium wurde gegen frisches Medium mit 11% humanem Serum und
180 IE/ml IL-2 am Tag 5 ausgetauscht. Das Medium wurde sodann alle
3 Tage ausgetauscht. An den Tagen 12 bis 14 wurden die T-Zellen
geerntet, gezählt
und cryokonserviert.
-
Die
Melanomzelllinien 397mel, 397mel/A31, 586mel, 624mel, 624mel/A31
und EBV-transformierte B-Zelllinien 586EBV und 1510EBV wurden in
diesem Labor etabliert und in RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Kälberserum
(FCS) kultiviert. Normale kultivierte Melanozyten, die sich von
Kindervorhaut ableiteten (NHEM680, bezogen von Clonetics, CA), wurden
in Melanozytenwachstumsmedium (MGM, Clonetics, CA) kultiviert. Die
COS-7-Zelllinie wurde von Dr. W. Leonard (NIH) bereitgestellt.
-
295Br
und 1315Br, frische cryokonservierte Brusttumorverdauansätze, wurden
mit einem Ficollgradienten vor einer Verwendung in T-Zelltests aufgereinigt.
1295-Fibroblasten aus dem autologen Patienten wurden 22 bis 64 Tage
kultiviert. 1315Br, Kultur A, waren Brusttumorzellen, die in immunodefizitären Mäusen wachsen
ge lassen und sodann in Kerationzyten-SFM/2% FCS-Medium (Life Technologies)
kultiviert wurden, und 1315Br, Kultur B, wurden in Hams F12/5% FCS
für 77
bis 80 Passagen wachsen gelassen. Diese Zellen wurden freundlicherweise
von Dr. Stephen Ethier, University of Michigan, Ann Arbor, MI, bereitgestellt.
1398Br war eine menschliche Papilloma-Virus (HPV) E6/E7-immortalisierte
Brusttumorzelllinie, die in Surgery Branch, National Cancer Institute,
etabliert wurde. Die Prostatatumorzelllinien 1535Pro, 1542Pro und
1510-Fibroblasten waren HPV-E6/E7-immortalisierte Zelllinien.
-
Konstruktion der cDNA-Bibliothek-
-
Gesamt-RNA
wurde aus 586mel unter Verwendung eines Trizolreagenzes (Life Technologies)
extrahiert. Poly(A)-RNA wurde aus Gesamt-RNA durch das Poly-AT-Tract-System (Promega,
Madison, WI) aufgereinigt und sodann in cDNA unter Verwendung eines
cDNA-Konstruktionskits (Life Technologies) mit einem Oligo(dT)-Primer
mit einer NotI-Stelle umgewandelt. Die cDNA wurde in BstXI-Adaptoren
ligiert und mit NotI verdaut, sodann in den Expressionsvektor pcDNA3.1
ligiert. Die cDNA-Bibliothek wurde in DH10B-Zellen (Life Technologies)
elektroporiert. Plasmid-DNA-Pools,
die aus jeweils etwa 100 cDNA-Klonen bestanden, wurden aus Bakterien
hergestellt.
-
cDNA-Bibliothek-Screening und GM-CSF-Sekretionstest
-
Eine
DNA-Transfektion und ein GM-CSF-Test erfolgten wie früher beschrieben
(Wang, R.F., P.F. Robbins, Y. Kawakami, X.Q. Kang, und S.A. Rosenberg,
1995, J. Exp. Med. 181:799-804). Kurz gesagt wurden 200 μg an DNA,
die ein unterschiedliches Fragment trug, und 50 ng der HLA-A31-DNA
mit 2 μl
Lipofectamin in 100 μl
Serum-freiem DMEM 15-45 Minuten gemischt. Das DNA/Lipofectamin-Gemisch
wurde sodann zu den COS-7-Zellen (5 × 104)
gegeben und über
Nacht inkubiert. An dem darauf folgenden Tag wurden die Zellen zweimal
mit DMEM-Medium gewaschen. TIL586, CTL-Klon 5 oder CTL-Klon 10 wurden
bei einer Konzentration von 5 × 104 Zellen/Well in AIM-V-Medium mit 120 IE/ml
IL-2 hinzugegeben. Nach 18- bis 24-ständiger Inkubation wurden 100 μl an Überstand
gesammelt und GM-CSF wurde in einem Standard-ELISA-Test (R + D Systems,
Minneapolis, MN) gemessen. Für
die Peptide wurden 586EBV-, 1510EBV- und T2-Zellen mit Peptiden
bei 37°C
90 Minuten inkubiert und sodann dreimal mit AIM-V-Medium mit 120
IE/ml IL-2 gewaschen. T-Zellen wurden hinzugegeben und zusätzliche
18 bis 24 Stunden in kubiert, 100 μl
an Uberstand würden
für den GM-CSF-Test
gesammelt. In einigen Experimenten erfolgen IFN-γ-Freisetzungstests unter Verwendung
eines Standard-ELISA-Kits
(Endogen, Woburn, MA).
-
Northern Blot-Analyse
-
Gesamt-RNA
wurde durch das Guanidinisothiocyanat/Cäsiumchlorid-Zentrifugationsverfahren
isoliert. Gesamt-RNA aus normalem menschlichem Gewebe wurde von
Clontech (Palo Alto, CA) bezogen. 20 Mikrogramm an Gesamt-RNA wurden
einer Elektrophorese in einem 1,2%igen Formaldehydagarose-Gel unterzogen
und auf eine Nylonmembran überführt. Ein
0,8-kb-DNA-Fragment des NY-ESO-I-Gens wurde mit [α-32P]CTP durch das zufällige Primingverfahren markiert.
Eine Vorhybridisierung und eine Hybridisierung erfolgten gemäß des QuickHyb-Protokols
(Stratagene, La Jolla, CA). Membranen wurden zweimal mit 2 × SSC/0,1%
SCD bei Raumtemperatur 15 Minuten und zweimal mit 0,1 × SSC/0,1%
SDS bei 60° 30
Minuten gewaschen. Die Autoradiographie erfolgte bei –70°C.
-
Reverse Transkriptase-PCR
-
Gesamt-RNA
wurde aus Tumorzelllinien wie vorstehend beschrieben extrahiert.
500 Nanogramm an Gesamt-RNA wurden für eine Umwandlung von RNA in
cDNA durch Vogelmyoblastosevirus (AMV)-reverse Transkriptase verwendet.
cDNA wurde sodann durch PCR unter Verwendung der Primer ESO-P2 (5' GCGGCTTCAGGGCTGAATGGATG)
und ESO-P5 (5'-AAGCCGTCCTCCTCCAGCGACA)
und des One-Step-RT-PCT-Systems
(Life Technologies) amplifiziert. PCR-Produkte wurden unter Denaturierungsbedingungen
bei 94°C
für 30
Sekunden, Anlagerung bei 55°C
für 30
Sekunden, Verlängerung
bei 72°C
für 3 Minuten
für 40
Zyklen und Endverlängerung
bei 72°C
für 10
Minuten amplifiziert. PCR-Produkte wurden auf einem 3%igen Agarose-Gel
analysiert.
-
Tests einer cytotoxischen
Lyse
-
Der
cytolytische Test erfolgte wie früher beschrieben (Kawakami,
Y. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6458-62). Kurz gesagt
wurden die Zielzellen mit Chrom 90 Minuten markiert. Nach dreimaligem
Waschen wurden die Zellen mit Peptiden bei einer Konzentration von
1 μg/ml
90 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden wieder gewaschen, gezählt, und
sodann mit TIL586 oder dem CTL-Klon 5 bei dem angegebenen Verhältnis von
Effektor (E:T gemischt. Eine Chromfreisetzung wurde nach 4-ständiger Inkubation
gemessen. Die Peptide wurden durch ein Festphasenverfahren unter
Verwendung eines Peptidsynthesegeräts (Modell AMS 422, Gilson
Co., Inc., Worthington, OH) synthetisiert. Einige Peptide wurden
durch HPLC aufgereinigt und wiesen eine Reinheit von mehr als 98%
auf. Die Masse einiger Peptide wurde durch Massenspektrometrieanalyse
bestätigt.
Für eine
Titration des CAG-3-Peptids, das von TIL586 erkannt wurde, wurden
586EBV-B-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen des aufgereinigten
CAG-3-Peptids oder eines Teils davon inkubiert. Der Prozentsatz
einer spezifischen Lyse wurde aus der Gleichung (A-B)/(C-B) × 100 bestimmt,
worin A die Lyse von 586EBV-B-Zellen durch TIL586 oder dem Klon
5 in Gegenwart eines Peptids ist, B die spontane Freisetzung aus
586EBV-B-Zellen in der Gegenwart des gleichen Peptids aber ohne
Effektorzellen ist, und C die maximale Chromfreisetzung ist. Kalte
Zielhemmung einer Cytolyse erfolgte unter Verwendung von 51Cr-markierten 586mel- oder 624mel-Zellen
als „heißen" Zielen und mit Peptiden
gepulsten 586EBV-B- und T2-Zellen als „kalten" Zielen.
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Beispiel 2
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In vivo-Schutztest
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Für in vivo-Schutzuntersuchungen
werden MHLA-A31+-transgene Mäuse mit
0,1 pg, 1 ng, 1 μg,
1 mg oder 100 mg an Krebspeptid (SEQ ID NO: 4, 5, 14, 25, 34-38,
41, 42, 46 oder 47) intravenös
bei Tag 0 und Tag 14 vor einer subkutanen Challenge mit 104 CAG-3-B16-Mausmelanomzellen oder intravenösen Challenge
mit 5 × 105 CAG-3-B16-Mausmelanomzellen immunisiert.
Mäuse,
die Tumorzellen subkutan erhalten, wurden zweimal pro Woche auf
eine Tumorentwicklung beobachtet und die Größe wurde bestimmt. Mäuse, die
Tumorzellen intravenös
erhalten, wurden am Tag 12 getötet
und die Anzahl von Lungenmetastasen wurde wie von Houghton, A.N.,
1994, J. Exp. Med. 180:1-40 beschrieben bestimmt.
-
Beispiel 3
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In vivo-Behandlungstest
-
Für eine in
vivo-Behandlung wurden MHL-A31+-transgene
Mäuse entweder
1 × 105 oder 5 × 105 CAG-3-B16-Mäusemelanomzellen
intravenös
ausgesetzt, um pulmonale Metastasen zu etablieren. Mäuse wurden
anschließend
mit einem rekombinanten Virus, der ein Krebspeptid (SEQ ID NO: 4,
5, 14, 25, 34-38, 41, 42, 46 oder 47) ex primiert, bei 105 PFU/mg an, Körpergewicht vakziniert Mäuse wurden
am Tag 12 getötet und
die Anzahl von pulmonalen Metastasen in vakzinierten Mäusen gegenüber nicht
vakzinierten Mäusen
wurde bestimmt.
-
Beispiel 4
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Immunotherapie mit Krebsantigen-spezifischen
T-Lymphozyten
-
T-Lymphozyten,
die gegenüber
einem Melanomantigen vorsensibilisiert wurden, können bei einer therapeutischen
Behandlung von Säugern,
die von einem Melanom betroffen sind, wirksam sein. T-Lymphozyten werden
aus peripherem Blut oder Melanomtumorsuspensionen isoliert und in
vitro kultiviert (Kawakami, Y. et al., 1988, J. Exp. Med. 168:2183-2191).
-
Die
T-Lymphozyten wurden dem Krebspeptid (SEQ ID NO: 4, 5, 14, 25, 34-38,
41, 42, 46 oder 47) bei einer Konzentration von 1 μg/ml allein
oder in der Gegenwart von IL-2 ausgesetzt, erneut sensibilisiert
und in Kultur expandiert. Die dem Krebspeptid ausgesetzten T-Lymphozyten
werden einem Säuger
bei etwa 109 bis 1012 Lymphozyten
pro Säuger
verabreicht. Die Lymphozyten werden entweder intravenös, intraperitoneal
oder intraläsionär verabreicht.
Die Behandlung kann zusammen mit anderen therapeutischen Behandlungen
wie Cytokinen, chirurgischem Herausschneiden von Melanomläsionen und
chemotherapeutischen Arzneimitteln verabreicht werden.
-
Beispiel 5
-
Behandlung von Patienten mit metastatischem
Melanom
-
In
diesem Protokoll werden Patienten mit fortgeschrittenem Melanom
mit einem antigenen Krebsepitop immunisiert.
-
Für diesen
Versuch geeignete Patienten mussten einen Nachweis eines messbaren
oder evaluierbaren metastatischen Melanoms aufweisen, bei dem eine
wirksame Standardtherapie fehlschlug. Patienten mussten Tumore aufweisen,
die das CAG-3-Antigen
exprimieren, wie durch PCR oder Northern Blot-Analyse der Tumorzell-RNA
nachgewiesen.
-
Patienten
erhalten entweder 1 ng, 1 μg,
1 mg oder 500 mg/kg Körpergewicht
eines Krebspeptids (SEQ ID NO: 4, 5, 14, 25, 34-38, 41, 42, 46 oder
47) intravenös
bei Tag 0, Tag 7 und Tag 14 allein oder zusammen mit IL-2 und/oder
einem immunostimulatorischen Molekül. Patienten werden hinsichtlich
Toxizität,
immunologischer Wirkungen und therapeutischer Wirksamkeit evaluiert.
-
Lymphozyten,
die aus den behandelten Patienten entnommen werden, werden für eine spezifische Antwort
hinsichtlich des CAG-3-Krebsantigens (SEQ ID NO: 4, 5, 14, 25, 34-38,
41, 42, 46 oder 47) getestet.
-
Eine
vollständige
Antwort wird als das Verschwinden aller klinischer Nachweise einer
Erkrankung definiert, das mindestens vier Wochen anhält. Eine
Teilantwort ist eine 50%ige oder größere Verminderung der Summe
der Produkte des senkrechten Durchmessers aller messbaren Läsionen für mindestens
4 Wochen ohne Auftauchen neuer Läsionen
oder einer Zunahme jeglicher Läsionen.
Geringe Antworten werden als 25-49%ige Abnahme der Summe aller Produkte
der senkrechten Durchmesser aller messbaren Läsionen ohne Auftauchen neuer
Läsionen
und keiner Zunahme jeglicher Läsionen
definiert. Ein jeglicher Patient mit weniger als einer Teilantwort
wird als Nichtresponder angesehen. Das Auftauchen neuer Läsionen oder
eine mehr als 25%ige Zunahme des Produkts an senkrechten Durchmessern
von früheren
Läsionen
nach einer Teil- oder vollständigen
Antwort wird als ein Rückfall
betrachtet.
-
Beispiel 6
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Erkennung von CAG-3-Antigenen auf Tumorzellen
durch CTL-Klone
-
In
früheren
Studien haben wir eine Reihe von T-Zell-Klonen aus der TIL586-Massenzelllinie
durch das begrenzte Verdünnungsverfahren
(Wang et al., 1996b, J. Exp. Med. 183:1131-1140) isoliert. Mehrere
Klone erkannten TRP-1 oder TRP-2. Jedoch erkannten zwei T-Zellklone,
die aus der gleichen TIL586-Zelllinie isoliert wurden, weder TRP-1
noch TRP-2, aber waren fähig,
586mel als auch HLA-A31+-Melanozyten zu
erkennen (1A-1C). Diese
Ergebnisse legen nahe, dass diese T-Zellklone zusätzliche Tumorantigene auf den 586mel-Tumorzellen
erkannten. Diese T-Zellklone wurden sodann expandiert und die CTL-Klone
5 und 10 wurden zum Screening von cDNA-Bibliotheken verwendet.
-
Bispiel 7
-
Identifizierung einer cDNA, die für ein Tumorantigen
kodiert, das durch T-Zell klone erkannt wird
-
Zur
Bestimmung des HLA-Moleküls,
das für
ein Präsentieren
eines Antigens gegenüber
den CTL-Klonen 5 und 10 verantwortlich ist, transfizierten wir HLA-A31-cDNA
in die A31-negativen Tumorlinien 397mel und 624mel und untersuchten
auf eine Erkennung durch den CTL-Klon. Transfektanten von 397mel
und 624mel, die HLA-A31
exprimierten, wurden signifikant durch die CTL-Klone 5 und 10 (Tabelle
2) erkannt. Tabelle 2 Spezifische Sekretion von GM-CSF durch
die CTL-Klone 5 und 10 ist HLA-A31-restringiert
| | Stimulatoren | | GM-CSF-Sekretion
(pg/ml) |
| Zelllinien | Transfiziertes
Gen | HLA-A31-
Expression | Klon
5 | Klon
10 |
| Keine | Kein | – | < 50 | < 50 |
| 397mel | Kein | – | < 50 | < 50 |
| 397mel | HLA-A3
F | + | 3840 | 4280 |
| 624mel | Kein | – | < 50 | < 50 |
| 624mel | HLA-A31 | + | 4650 | 4320 |
| 586mel | Kein | + | 4050 | 3900 |
| 586EBVB | Kein | + | < 50 | < 50 |
-
GM-CSF
in dem Überstand
wurde nach 24-ständiger
Inkubation von 5 × 104 Zellen des CTL-Klons 5 oder 10 mit Melanomzelllinien
oder Medium allein gemessen.
-
Da
lediglich eine begrenzte Anzahl von T-Zellen verfügbar war,
untersuchten wir zuerst, ob diese T-Zellen vorher identifizierte
Tumorantigene oder Melanozytenlinien-Differentiationsproteine erkannten oder nicht.
Eine Erkennung von COS-7-Zellen, die mit einer HLA-A31-cDNA und
Genen, die für
die bekannten Tumorantigene oder putativen Antigene, einschließlich MART-1
(Kawakami et al., 1994a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515-3519),
gp75 (Wang et al., 1995, J. Exp. Med. 181:799-804), gp 100 (Kawakami
et al., 1994b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6458-6462), Tyrosinase
(Brichard et al., 1993, J. Exp. Med. 178:489-495), und TRP-2 (Yokoyama
et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta 1217:317-321; Bouchard et al.
1994, Eur. J. Biochem. 219:127-134) kodieren, transfiziert wurden,
durch den CTL-Klon 5 oder 10 wurde untersucht. COS-Zellen, die mit
HLA-A31 allein, TRP-1 oder TRP-2 allein transfiziert waren, verliehen
keine Erkennung durch die T-Zellklone (2). Außerdem konnten
die COS-Zellen, die mit HLA-A31 und anderen Tumorgenen transfiziert
worden waren, die GM-CSF-Freisetzung aus T-Zellen nicht stimulieren,
was anzeigt, dass der T-Zellklon 5 oder 10 diese Tumorantigene nicht
erkannte, aber ein neues Tumorantigen in dem Kontext von HLA-A31
erkannte.
-
Beispiel 8
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Klonieren des CAG-3-Gens
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Zum
Identifizieren des/der neuen Tumor-Ag(s), das/die von den CTL-Klonen
5 und 10 erkannt wird/werden, erzeugten wir eine cDNA-Bibliothek,
die sich von 586mel ableitete. Jeder cDNA-Pool bestand aus etwa
100 cDNA-Klonen. Nach Screening von insgesamt 2,5 × 105 cDNA-Klonen identifizierten wir 15 positive
cDNA-Poole, die eine T-Zell-Erkennung durch den CTL-Klon 5 oder
10 verliehen, falls sie in COS-7 zusammen mit HLA-A31-cDNA co-transfiziert
worden waren. Die positiven Klone wurden sodann hinsichtlich einer
Erkennung durch beide CTL-Klone 5 und 10 getestet. Es wurde festgestellt,
dass beide CTL-Klone die gesamten cDNA-Poole erkannten. Einzelne
Kolonien wurden aus jedem positiven Pool isoliert und auf eine T-Zellreaktivität getestet.
Beispielhafte Daten sind in 4 gezeigt.
Der CTL-Klon 5 erkannte COS-7 co-transfiziert mit cDNA Klon 1 oder
2 und HLA-A31, aber nicht COS-7 allein, COS-7 transfiziert mit cDNA
Klon 1 oder 2 oder transfiziert lediglich mit der HLA-A31-cDNA (4).
Eine DNA-Sequenzanalyse zeigte, dass alle 10 cDNA-positiven Klone
aus unterschiedlichen positiven Poolen überlappten, und die DNA- und
die Aminosäuresequenz
dieser Klone ist in 3A gezeigt. Eine
Recherche aller verfügbarer
Datenbanken deckte auf, dass der kodierende Bereich dieses Gens,
wir bezeichneten es Krebsantigen-Gen 3 (CAG-3, Genbankzugangsnummer AF038567),
identisch zu NY-ESO-1 war von dem kürzlich berichtet wurde, dass
es ein Antigen ist, das von einem Serum-Ak erkannt wird, der von
einem Patienten mit Ösophagialkrebs
abgeleitet ist (29). Unser längster
cDNA-Klon enthielt zusätzliche
37 Nukleotide stromaufwärts
von dem früher
beschriebenen 5'-Ende des
nicht translatierten Bereichs. Es wurde festgestellt, dass zwei
andere Proteine in den Datenbanken homologe Sequenzen in einem begrenzten
Bereich enthielten. Das Genprodukt von NY-ESO-1 (wir verwendeten NY-ESO-1
für CAG-3
in dem nachstehenden Text) weist 52% Ähnlichkeit zu dem Tegument-Protein
(UL36) von Herpes simplex-Virus-Typ 1 in dem 64 Aminosäuresegment
und eine 47%ige Ähnlichkeit
zu der Komponente F der Enterobactinsynthetase (Serin-aktivierendes
Enzym) in dem 48 Aminosäurebereich
auf (3B).
-
Beispiel 9
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Von CTL-Klonen erkannte Brustkrebszellen
-
Northern
Blot-Analysen erfolgten unter Verwendung von NY-ESO-1-cDNA als einer
Sonde zum Evaluieren des Expressionsmusters in verschiedenen Geweben.
Es wurde gezeigt, dass Hodengewebe das einzige Positive bei der
Expression von NY-ESO-1 unter den getesteten normalen menschlichen
Geweben ist. Es wurde festgestellt, dass NY-ESO-1 in mehreren Arten
von Krebs, einschließlich
Melanom und Brustkrebs, exprimiert wird (Daten nicht gezeigt). Diese
Ergebnisse waren konsistent mit Daten, die früher beschrieben wurden (29).
Um zu bestimmen, ob die Melanom-reaktiven CTLs auch andere Tumorzellen
erkennen würden,
testeten wir T-Zellreaktivität
gegenüber
HLA-A31-positiven Brust- und Prostatatumorzellen durch den CTL-Klon 5. Wir verwendeten
IFN-γ, um
die T-Zellerkennung in diesen Experimenten zu überwachen, da Prostatatumorzellen
alleine GM-CSF, aber nicht IFN-γ sekretieren.
Wie in der Tabelle 3 gezeigt, war der CTL-Klon 5 fähig, HLA-A31-positive
frische 1295Br- und 1315Br-Brusttumorzellen, aber nicht HLA-A31-negative
frische 14053r- und 1411Br-Brusttumorzellen oder HLA-A31-positive
1295-Fibroblastenzellen, die sich von dem autologen Patienten 1295
ableiteten, zu erkennen. Zusätzlich
erkannte der CTL-Klon 5 die kultivierten HLA-A31-positiven 13153r-Zellen
(Kultur A und B) (Tabelle 3), aber er sprach nicht auf die kultivierten
HLA-A31-negativen kultivierten 1386Br-Brustkrebszellen oder die
kultivierten HLA-A31-positiven 1510-Fibroblasten an. Obwohl der CTL-Klon
5 in gewisser Weise nicht auf die kultivierten HLA-A31-positiven
1315Br-Zellen (Kultur A und B) in Experiment 1 reagierte, zeigten
zusätzliche
Experimente eine T-Zellerkennung der kultivierten HLA- A31-positiven 1315Br-Zellen
(Kultur A und B) (Daten nicht gezeigt). Die Expression von HLA-A31
und NY-ESO-1 in den frischen 1315Br- und 1295Br-Tumorzellen wurde
durch FACS-Analyse und RT-PCR-Analyse bestätigt (Daten nicht gezeigt).
Eine Expression von NY-ESO-1 wurde durch RT-PCR unter Verwendung
der Primer ESO-P2 und ESO-P5 in sowohl frischen 1295- als auch frischen
1315-Brusttumorzellen nachgewiesen. Der CTL-Klon 5 erkannte weder
die HLA-A31
+-1535-Prostatatumorzellen aufgrund
des Fehlens der Expression von NY-ESO-1 noch die HLA-A31-1542-Prostatatumorzellen
(Tabelle 3). Diese Ergebnisse lassen stark vermuten, dass ein antigenes
Peptid von NY-ESO-1 bei ausreichenden Mengen auf der Oberfläche von
Brusttumorzellen exprimiert wird, um durch T-Zellen erkannt zu werden.
Daher kann NY-ESO-1 als ein Immunziel für die Immuntherapie von Patienten
mit Brustkrebs dienen. NY-ESO-1 wird auch in einem hohen Prozentsatz
(etwa 67%) von kleinzelligen Lungenkarzinom exprimiert (Daten nicht
gezeigt). Tabelle 3 Erkennung von Brusttumorzellen durch den
CTL-Klon 5
a | Stimulatoren | IFNγ-Freisetzung
(pg/ml) durch den CTL-Klon 5 |
| Zielzellen | HLA-A31-Expression | Expt.1 | Expt. 2 |
| 586mel | + | 225 | 488 |
| 397mel | – | 7 | 35 |
| 1315Br
(frischer Tumor #1) | + | 171 | 520 |
| 1315Br
(frischer Tumor #2) | + | 106 | 126 |
| 1295Br
(frischer Tumor) | + | 265 | 358 |
| 1295-Fibroblasten | + | 4 | 24 |
| 1405
Br (frischer Tumor) | – | 15 | 28 |
| 1411Br
(frischer Tumor) | – | ND | 74 |
| 1315Br
(kultur A) | + | 23 | 224 |
| 1315Br
(kultur B) | + | 0 | 155 |
| 1398Br | – | 0 | 36 |
| 1510-Fibroblasten | + | 8 | ND |
| 1535
Prostata | + | 24 | ND |
| 1542
Prostata | – | 17 | ND |
- aFN-γ in dem Überstand
wurde nach einer 18-ständigen
Inkubation von 1 × 105 des CTL-Klons 5 gemessen. In den Experimenten
1 und 2 betrug die Cytokinfreisetzung aus Stimulatoren allein < 10 pg/ml.
-
Die
durch den CTL-Klon 5 erkannten Peptidepitope Für ein Screenen auf Epitope
aus dem kodierenden Bereich von der CAG-3-DNA wurde eine HLA-Peptidmotiv-Recherche
durchgeführt.
Diese Ergebnisse sind in der Tabelle 4 und in der Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 4 HLA-Peptidmotiv-Recherchenergebnisse
| Verwenderparameter
und Auswertungsinformation |
| Ausgewähltes Verfahren
zum Begrenzen der Ergebnisanzahl | ausdrückliche
Anzahl |
| Anzahl
von angeforderten Ergebnissen | 30 |
| Ausgewählte Art
an HLA-Molekül | A-3101 |
| Ausgewählte Länge für auszuwertende
Subsequenzen | 10 |
| Ausgewählte Echoart
für Inputsequenz | Y |
| Echoformat | nummerierte
Zeilen |
| Länge der
Peptidsequenz des Verwenderinputs | 180 |
| Anzahl
von berechneten Subsequenzergebnissen | 171 |
| Anzahl
von Topauswertungssubsequenzen, die bei der Auswertungsausabetabelle
angegeben sind | 30 |
Tabelle HLA-Peptidmotiv-Recherchenergebnisse
| Verwenderparameter
und Auswertungsinformation |
| Ausgewähltes Verfahren
zum Begrenzen der Ergebnisanzahlen | ausdrückliche
Anzahl |
| Anzahl
von angeforderten Ergebnissen | 30 |
| Ausgewählte Art
an HLA-Molekül | A-3101 |
| Ausgewählte Länge für auszuwertende
Subsequenzen | 9 |
| Ausgewählte Echoart
für Inputsequenz | Y |
| Echoformat | nummerierte
Zeilen |
| Länge der
Peptidsequenz des Verwenderinputs | 181 |
| Anzahl
von berechneten Subsequenzergebnissen | 173 |
| Anzahl
von Topauswertungssubsequenzen, die bei der Auswertungsausgabetabelle
angegeben sind | 30 |
-
Peptide
wurden auf der Basis des Peptidbindungsmotivs für HLA-A31 (hydrophobe Reste
an Position 2 und positiv geladene Reste an Position 9) (Rammensee
et al., 1995, Immunogenetics 41:178-228) synthetisiert und auf eine
Reaktivität
mit dem CTL-Klon 5 getestet.
-
Diese
Peptide wurden auf HL-A31-pasitive 1510EBV-B-Zellen gepulst und
auf ihre Fähigkeit
zur Stimulation einer Cytokinfreisetzung durch den CTL-Klon 5 getestet.
Wie in Tabelle 6 gezeigt, wurde das 10-mer-Peptid ESO10-53 (ASGPGGGAPR),
ausgehend von der Position 53 des NY-ESO-1-Proteins, durch den CTL-Klon
5 stark erkannt, während
die überlappenden
9-mer-Peptide, ESO9-54 als auch ESO10-127, schwach erkannt wurden, wenn sie
auf 1510EVB-B-Zellen gepulst worden waren. Der CTL-Klon 10 erkannte das
gleiche Peptid wie der CTL-Klon 5 (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise
erkannte der CTL-Klon 2 keine dieser Peptide (Tabelle 6), sogar
obwohl er mit NY-ESO-1 transfizierte 586mel und COS-7 erkannte (siehe nachstehend).
Die Reaktivität
des CTL-Klons 5 war nicht nachweisbar, wenn entweder die ESO9-54-
oder die ESO10-127-Peptide bei Konzentrationen unter 100 nM zum
Sensibilisieren von EBV-Zellen verwendet wurden. Tabelle
6 Screening
von synthetischen Peptiden mit einer Reaktivität hinsichtlich des CTL-Klons
5
a - a 1510-EBV-Zellen
wurden mit einem einzelnen Peptid bei einer Konzentration von 0,1 μg/ml 90 Minuten
inkubiert. Die GM-CSF-Freisetzung wurde nach Co-Inkubation von Peptid-beladenen
1510EBV-Zellen mit dem CTL-Klon
5 gemessen. Die GM-CSF-Freisetzung wurde nach Co-Inkubation von
Peptid-geladenen 1510-EBV-Zellen mit dem CTL-Klon 5 gemessen. 1510EBV
war eine EBV-transformierte B-Zelllinie, die HLA-A31 exprimiert.
-
Beispiel 11
-
Erkennung von modifizierten Peptiden
-
Um
zu untersuchen, ob der CTL-Klon 5 auch Peptide erkannte, die die
Kernaminosäuresequenz
mit der Extension von Aminosäureresten
bei entweder dem N- oder C-Terminus enthielt, stellten wir überlappende 11-mer-,
12-mer-, 13-mer-, 14-mer- und
15-mer-Peptide als auch mehrere Peptide mit Substitutionen an einer der
Positionen 1, 2 oder 10 von ESO10-53 (Tabelle 7 und 3A)
her. Der CTL-Klon 5 war fähig,
11-mer-, 12-mer-, 13-mer-, 14-mer- und 15-mer-Peptide mit Aminosäureextensionen
an dem N-Terminus des ESO-53-Kernpeptids zu erkennen, obwohl es
schien, dass die längeren
Peptide eine signifikant geringere GM-CSF-Sekretion stimulierten
als das ESO10-53-10-mer-Peptid (Tabelle 7). Jedoch hob eine Extension
lediglich eines einzigen Aminosäurerests
bei dem C-Terminus von ESO10-53 seine Fähigkeit zur Stimulation von
T-Zellen auf (Tabelle 7). Der CTL-Klon 5 erkannte das 8-mer-Peptid
nicht.
-
Titrationsexperimente
zeigten, dass die CTL-Reaktivität
bei einer Konzentration des ESO10-53-Peptids von 10 nM nachweisbar
war. Eine GM-CSF-Freisetzung von dem CTL-Klon 5 erhöhte sich
mit den erhöhenden
Peptidkonzentrationen und kein Plateau wurde bei einer Peptidkonzentration
von 10 μM
erreicht (5A). Zusätzlich zum Messen einer Cytokinfreisetzung,
die durch ESO10-53 stimuliert wurde, wurde die Fähigkeit dieses Peptids, Zielzellen
für eine
Lyse durch den CTL-Klon 5 zu sensibilisieren, untersucht. Der CTL-Klon
5 war fähig,
HLA-A31-positive Tumor 586mel-Zellen
zu lysieren, aber nicht die HLA-A31-negativen und NY-ESO-1-positiven
Tumor-397mel-Zellen (5B). Der CTL-Klon 5 lysierte
größer als
60% von entweder 586EBV oder 1510EBV, die mit dem ESO10-53-Peptid
bei einem E:T-Verhältnis
von 40:1 inkubiert worden waren, und etwa 5-10% an Lyse von Zielzellen
wurde bei einem E:T-Verhältnis
von 2,5:1 E:T festgestellt. Der CTL-Klon lysierte entweder 586EBV-
oder 1515EBV-B-Zellen alleine oder gepulst mit einem irrelevanten
Peptid nicht und lysierte die HLA-A31-negativen T2-Zellen, die mit
dem ESO10-53-Peptid gepulst worden waren, nicht (5C).
-
Als
nachstes wurde untersucht, ob eine T-Zellerkennung des 10-mer-Peptids
durch Substituieren von Aminosäuren
an Ankerresten verbessert werden könnte. Eine Reihe von synthetischen
Peptiden mit einer Modifikation an den Resten 1, 2 und 10 wurde
hergestellt und auf eine Erkennung durch den CTL-Klon 5 untersucht,
wenn sie auf 586EBV-B-Zellen gepulst worden waren (Tabelle 7). Die
modifizierten 10-mer-Peptide
mit einer Substitution an der Position 2, die sich von dem Wildtyp
ASGPGGGAPR ableiteten, wurden immer noch durch den CTL-Klon 5 erkannt,
wenn sie auf 586EBV-B-Zellen gepulst worden waren. Die Reaktivität von Peptiden
mit einer Substitution von entweder Ala, Ile, Leu oder Val an der
Position 2 war geringer als die des Wildtyp-Peptids, wohingegen
ein Peptid mit einer Substitution von Thr für Ser an Position 2 zu einer
leicht höheren Reaktivität als die
des Wildtyp-ESO10-53-Peptids
führte.
Im Gegensatz verloren Peptide mit Substitutionen von Arg mit Lys
oder His vollständig
ihre Fähigkeit
zur Stimulation von T-Zellen, was nahe legt, dass das Arg an dem
C-Terminus des ESO10-53-Peptids einen kritischen Ankerrest darstellt.
Peptide mit einer Substitution an der Position 1 wurden schwach
oder gar nicht durch den CTL-Klon 5 erkannt (Tabelle 7). Diese Ergebnisse zeigen
an, dass das ESO-53-Peptid, ASGPGGGAPR, das beste Peptid für eine T-Zellerkennung darstellt.
-
Beispiel 12
-
Antigene Peptide, die sich von einem alternativen
offenen Leserahmen ableiten
-
Zwei
zusätzliche
CTL-Klone, Klone 2 und 14, schienen 586mel- als auch COS-7-Zellen,
die mit NY-ESO-1- und HLA-A31-cDNA transfiziert worden waren, zu
erkennen, aber erkannten das ESO10-53-Peptid nicht (6A-6H).
Der CTL-Klon 5 und TIL1244 wurden für die Spezifizitätskontrollen
verwendet. Zusätzliche
Experimente zeigten, dass der CTL-Klon 2 auf keines der 19 anderen
Peptide mit dem HLA-A31-Bindungsmotiv,
abgeleitet von dem normalen offenen Leserahmen von NY-ESO-1, ansprach
(Tabelle 6). Zum Testen der Hypothese, dass CTLs ein Peptid von
einem Genprodukt erkennen können,
das von einem alternativen offenen Leserahmen desselben Gens translatiert
wird, wurden synthetische Peptide mit HLA-A31-Bindungsmotiv auf
der Basis einer Aminosäuresequenz
hergestellt, die aus dem zweiten offenen Leserahmen (ORF2) (3A) vorhergesagt wurde. Auffallenderweise
erkannte der CTL-Klon 2 ESORF-2-9-19 (AAQERRVPR) als auch die überlappenden
ESORF2-10-18 (LAAQERRVPR)-Peptide, wenn sie auf 1510EBV-B-Zellen
gepulst worden waren. Beispielhafte Daten für den CTL-Klon 2 sind in 7A gezeigt.
Der CTL-Klon 14 erkannte die gleichen Peptide wie der CTL-Klon 2
(Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die CTL-Klone 2
und 14 ein antigenes Peptid erkannten, das sich von dem ORF2 ableitet
(3A). Eine Proteindatenbankrecherche
deckte auf, dass das 58-Aminosäure-Protein
von ORF2 eine 52%ige Ähnlichkeit
zu der A-Kette von Glutamatdehydrogenase in einem 25 Aminosäurebereich
aufweist (34). Peptidtitrationsexperimente zeigten, dass der CTL-Klon
2 fähig
war, 1510EBV, die mit ESORF2-10-18 (LAAQERRVPR) gepulst worden waren,
bei relativ niedrigen Konzentrationen des Peptids zu lysieren, er
aber 1510EBV, die mit ESO-10-53
gepulst worden waren, oder HLA-A31-negative 1102EBV, die mit ESORF2-10-18 gepulst worden
waren, nicht lysierte (7B). Zusätzlich erkannte der CTL-Klon 2 auch überlappende
11-mer-, 12-mer- und 13-mer-Peptide mit Aminosäureextensionen an dem N-Terminus
des ESORF2-10-18-Peptids bei relativ hohen Konzentrationen (Daten
nicht gezeigt).
-
Zusätzliche
Experimente wurden durchgeführt,
um zu bestimmen, ob CTL-Klone das ORF2-Genprodukt des NY-ESO-1 in
anderen Tumortypen erkennen. Wie in
7C gezeigt,
war das Erkennungsmuster des CTL-Klons 2 ähnlich zu dem des CTL-Klons
5 auf Tumorzellen. Der CTL-Klon 2 erkannte HLA-A31-positive frische
1315Br- und 1295Br-Brusttumore als auch 586mel und 1388mel, aber
erkannte nicht HLA-A31-negative frische 1411Br-Brusttumoren, 397mel
oder die HLA-A31-negativen
1295-Fibroblasten. Obwohl 1353mel HLA-A31 exprimiert, sprach weder
der CTL-Klon 2 noch der Klon 5 auf 1353mel an, da 1353mel ein NY-ESO-1-negativer
Tumor ist. Wie früher
gezeigt, erkannte der CTL-Klon 5 das ESO10-53-Peptid ASGPGGGAPR
und der CTL-Klon 2 erkannte das ORF2-10-18-Peptid LAAQERRVPR, das
sich von dem ORF2 ableitete, nach Inkubation mit 1510EBV-B-Zellen (
7C).
Diese Ergebnisse legen stark nahe, dass das ORF2-Genprodukt translatiert,
prozessiert und in Melanoma als auch Brusttumoren präsentiert
wurde. Daher kodiert NY-ESO-1 zwei unterschiedliche Proteine: ein
Protein mit 180 Aminosäuren
(ORF1), das durch die CTL-Klone 5 und 10 erkannt wird, und ein Protein
mit 58 Aminosäuren
(ORF2), das durch die CTL-Klone 2 und 14 erkannt wird. Tabelle
7 Erkennung
der modifizierten Peptide durch den CTL-Klon 5
a - a586EBV- oder
1510EBV-Zellen wurden mit einem einzigen Peptid bei einer Konzentration
von 0,1 μg/ml
90 Minuten inkubiert. Die GM-CSF-Freisetzung wurde nach Co-Inkubation
von Peptid-beladenen EBV-Zellen mit 5 × 104 des
CTL-Klons 5 gemessen. Das Wildtyp-10-mer-ESO10-53-Peptid ist unterstrichen.
Peptide mit Aminosäuresubstitutionen
sind durch Fettdruck und Unterstreichung hervorgehoben. 586EBV und
1510EBV waren HLA-A31-positive EBV-transformierte B-Zelllinien.
-
DISKUSSION
-
NY-ESO-1 ist ein zelluläres Immunziel
-
Fünf Differentiationsantigene,
einschließlich
Tyrosinase, MART-1 gp 100, TRP-1/gp75
und TRP-2, wurden als Melanom-Ags identifiziert, die durch T-Zellen
erkannt werden, die sich von TILs (13-19) ableiten, von denen gezeigt
wurde, dass sie mit einer Antitumorreaktivität in vivo assoziiert sind.
Folglich sind bis jetzt keine TILs in dem Surgery Branch an dem
National Cancer Institute erhältlich,
die MAGE-1, BAGE und GAGE erkennen, die lediglich in Hoden- und
Krebszellen exprimiert werden. Hier zeigen wir, dass NY-ESO-1, ein
weiteres krebsgeteiltes Ag, ein Tumor-Ag ist, das durch HLA-A31-restringierte-T-Zellen
erkannt wird. NY-ESO-1 wurde unabhängig unter Verwendung des autologen
Serums eines Patienten mit Ösophagialkrebs
isoliert (29), was nahe legt, dass das NY-ESO-1-Genprodukt ein Immunziel
für eine
Ak-vermittelte Immunität
war. Ergebnisse in dieser Untersuchung beweisen, dass NY-ESO-1 auch
ein Immunziel ist, das durch T-Zellen erkannt wird. Dies wird weiter
durch einen kürzlichen
Bericht unterstrichen, dass HLA-A2-restringierte CTL NY-ESO-1 erkennen,
die in einem Melanompatienten etabliert wurden (35). Es wurde festgestellt,
dass mehrere Tumorantigene, einschließlich MAGE-1, Tyrosinase, TRP-1,
die durch CTL erkannt werden, mit einem Antikörper auch reaktiv sind (36,
37). Da NY-ESO-1 nicht in normalen humanen Geweben außer den
Hoden exprimiert wird, die keine MHC-Klasse I-Moleküle exprimieren
und als eine immunologisch privilegierte Stelle angesehen werden,
kann dieses Genprodukt ein sicheres Immunziel für die Immuntherapie von Patienten
mit Krebs darstellen.
-
NY-ESO-1 ist ein Brustkrebs-Ag
-
Basierend
auf seinem Genexpressionsmuster gehört NY-ESO-1 zu einem Mitglied
einer expandierenden Familie von Antigenen (Ags), einschließlich MAGE-1,
MAGE-3, BAGE, GAGE
und HOM-MEL-40 (9-12, 30). Jedoch wird NY-ESO-1 hochgradig in einem
signifikanten Anteil von Brust-, Prostata- und Blasenkrebsarten
(29) exprimiert im Vergleich zu MAGE, BAGE und GAGE. Noch interessanter
erkennen CTL-Klone
zwei HLA-A31-positive frische und kultivierte Brustkrebszellen (Tabelle
2 und 7C). Nach unserem Wissen ist dies
die erste Darstellung einer CTL-Erkennung von NY-ESO-1-positiven
Brustkrebszellen. Obwohl berichtet wurde, dass die Expression von
MAGE-1, MAGE-3 und anderen durch RT-PCR in Brusttumoren bei einer
geringen Frequenz (< 5-10%)
nachgewiesen worden war, wurde eine CTL-Erkennung dieser Brusttumore
durch die Ag-spezifischen CTL nicht berichtet. Es war schwierig,
brustreaktive CTLs aus PBL in vitro zu generieren, obwohl MHC-restringierte
T-Zellen, die HER-2/neu-Peptide auf Brustkrebszellen erkannten,
beschrieben worden waren (26-28). Eine Identifizierung von NY-ESO-1-Peptiden,
die auf der Zelloberfläche
von Brustkrebsarten präsentiert
werden, ist für
die Entwicklung von Ag-spezifischen Krebsvakzinen für die Behandlung
von Patienten mit Brustkrebs wichtig. Der hierin beschriebene CTL-Klonansatz
stellt eine Strategie für
die Isolierung von Brustkrebs-Ags dar.
-
Translation von verschiedenen ORFs als
ein Mechanismus für
eine Erzeugung von T-Zellepitopen
-
Zum
Definieren von antigenen Peptiden, fanden wir das 10-mer ASGPGGGAPR,
das sich von dem NY-ESO-1-Protein ableitete, als das beste antigene
Peptid, das durch den CTL-Klon 5 erkannt wurde, obwohl die 9-mer-,
11-mer-, 12-mer-, 13-mer-, 14-mer-
und 15-mer-Peptide auch erkannt wurden. Diese Reaktivität kann auf
das Vorhandensein von zwei Prolinresten in diesen Peptiden zurückzuführen sein.
Prolinreste in der Kernpeptidsequenz können den Peptiden ermöglichen,
sich aus der MHC-Bindungstasche auszuwölben, und folglich können die
verankerten Reste in den längeren
Peptiden immer noch in das HLA-A31-Molekül passen. Eine alternative
Erklärung
besteht darin, dass die längeren
Peptide in kürzere
Peptide durch extrazelluläre oder
Serumproteasen prozessiert werden können (38). Jedoch werden, wenn
die längeren
Peptide auf 586EBV-B-Zellen unter Serum-freien Bedingungen gepulst
werden, sie immer noch durch den CTL-Klon 5 erkannt (Daten nicht
gezeigt). Dieses Experiment schließt jedoch nicht die Möglichkeit
aus, dass diese längeren Peptide
durch extrazelluläre
Proteasen prozessiert wurden. Das modifizierte Peptid, ATGPGGGAPR,
mit einer Substitution von Thr für
Ser, schien leicht die T-Zellerkennung zu verbessern. Es wurde gezeigt,
dass modifizierte Peptide eine Bindungsaffinität zu dem MHC-Klasse I-Molekül verbessern,
was die Immunogenizität
von Peptiden erhöht
(39). Es ist nicht klar, warum der CTL-Klon 5 das nicht verwandte
ESO10-127-Peptid erkannte, aber diese Erkennung war schwach und
konnte lediglich bei einer relativ hohen Peptidkonzentration nachgewiesen
werden.
-
Interessanterweise
erkannten zwei zusätzliche
CTL-Klone COS-7, die mit NY-ESO-1 zusammen mit HLA-A31-cDNA transfiziert
worden waren, aber nicht das ESO10-53-Peptid, das sich von dem ORF1 des NY-ESO-1-Gens
ableitete (6A-6D). Eine
weitere Analyse zeigte, dass der CTL-Klon 2 ein Peptid von dem Genprodukt
erkannte, das aus einem alternativen offenen Leserahmen (ORF2) von
NY-ESO-1 translatiert wurde. Obwohl es mehrere Beispiele dafür gibt,
dass zwei unterschiedliche Peptide aus unterschiedlichen ORFs aus
einer einzigen viralen mRNA translatiert werden (40), wurden sehr
wenige Fälle
bei einer einzigen eukaryotischen mRNA beschrieben. Zwei Beispiele
wurden beschrieben: TRP-1/gp75, das für zwei unterschiedliche Proteine,
gp75, das durch Seren von einem Patienten mit Melanom erkannte wird,
und ein 24-Aminosäure-Genprodukt,
das von CTLs erkannt wird (24, 37), kodiert, und ein 43-kDa-Ag,
das durch CTL erkannt wird, die gegenüber squamösen Zellkarzinomen reaktiv
sind (41). Interessanterweise kodiert das Gen für den Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitor
p16 auch für
zwei Genprodukte, p16 und p19ARF. Jedoch
wird das alternative ORF-Genprodukt p19ARF aus
einem alternativ gespleißten
Transkript translatiert und teilt eine identische Sequenz mit dem
p16-Transkript mit der Ausnahme des ersten Exons (42). Kürzliche
Studien zeigten, dass das Produkt des alternativen Leserahmens p19ARF eine Rolle bei der Zellzyklusregulation
und Tumorsuppression spielt (43). Das hierin berichtete NY-ESO-1-Gen kodiert
zwei unterschiedliche Proteine: ein 180-Aminosäure-Protein, das von ORF1 kodiert
wird, und ein 58-Aminosäure-Protein,
das von ORF2 kodiert wird. Das ORF2-Produkt ist innerhalb von ORF1
lokalisiert. Interessanterweise erkannten die CTL-Klone 5 und 10
antigene Peptide, die sich von ORF1 ableiten, während die CTL-Klone 2 und 14
ein antigenes Peptid von ORF2 erkannten. Beide CTL-Klone 2 und 5
erkannten mehrere HLA-A31+-Melanome als
auch frische Brusttumore (Tabelle 3 und 7C), was
nahe legt, dass die Translation des alternativen ORF2 als ein genereller
Mechanismus in vivo für
ein Generieren von T-Zellepitopen dienen kann.
-
Der
Mechanismus, durch den der alternative ORF translatiert wird, ist
gegenwärtig
nicht bekannt. Jedoch gibt es mehrere mögliche Erklärungen für die Erzeugung von alternativen
Leserahmen. Das „leaky-scanning"-Modell ist eine
mögliche
Erklärung:
Ribosomen übergehen
gelegentlich das erste AUG mit einer schwachen KOZAK-Konsensus-Sequenz
und initiieren eine Translation bei einem AUG stromabwärts (43,
44). In dem Fall von NY-ESO-1 ist das Startcodon für eine Translation
von ORF1 nicht in dem optimalen Kontext. Es gibt vier potentielle
Startcodons, die zum Translatieren des ORF2 verwendet werden könnten. In
unserem früheren
Bericht wurde ein CTL-Epitop aus einem alternativen Leserahmen von
gp75/TRP-1 translatiert (24). Eine Erkennung des Epitops von ORF3
durch CTL wurde durch das Vorhandensein des ersten ATG-Codons, das
für die
Translation des gp75-Proteins verwendet wurde, beeinträchtigt und
vollständig
aufgehoben, wenn das innere ATG, das dem T-Zellepitop (ORF3P) vorausgeht,
zu ATC verändert
wurde, was nahe legt, dass ein ribosomales Scannen ein möglicher
Mechanismus sein kann. In den Untersuchungen des Influenza-Nukleoproteins
wurden CTL-Epitope durch einen ribosomalen Scanmechanismus erzeugt
(44). Jedoch wurde in einer ähnlichen
Untersuchung eine ribosomale Rahmenverschiebung als ein Mechanismus
für die
Erzeugung von T-Zellepitopen vorgeschlagen (45). Andere Mechanismen
wurden für
die Erzeugung von T-Zellepitopen, die sich von unterschiedlichen
Genen ableiten, auch vorgeschlagen. Zum Beispiel wurden mehrere
T-Zellepitope aus Genprodukten identifiziert, die von einem kryptischen
Initiationscodon des 5'-nicht
translatierten Bereichs (46, 47), von einem nicht ATG-definierten
offenen Leserahmen (48) und von Introns eines Transkripts (22, 49, 50)
translatiert wurden. Dass sowohl der alternative offene Leserahmen
von gp75/TRP-1 als auch NY-ESO-1 innerhalb des ersten offenen Leserahmens
lokalisiert sind, ist es von besonderem Interesse, den zugrunde
liegenden Mechanismus zu verstehen.
-
Obwohl
es lediglich wenige Beispiele der Verwendung der alternativen offenen
Leserahmen in Eukaryonten gibt, die in der Literatur beschrieben
sind, glauben wir, dass mehrere Beispiele in der Zukunft berichtet werden,
wenn Tumor-reaktive CTL und Autoantikörper verfügbar sind und verwendet werden,
um Zielproteine oder -peptide zu identifizieren. Daher ist es wichtig,
die biologische Signifikanz der Genprodukte zu verstehen, die aus
alternativen offenen Leserahmen translatiert werden. Eine Möglichkeit
besteht darin, dass diese Genprodukte als antigene Ziele der Ag-prozessierenden
Maschinerie dienen, um die Effektivität und Kapazität der Immunüberwachung
zu erhöhen.
Eine Identifizierung von T-Zellepitopen, die sich von unterschiedlichen
offenen Leserahmen von NY-ESO-1 ableiten, legt nahe, dass die Identität von immunogenen
Peptiden für
Krebsvakzinen nicht lediglich auf Peptide begrenzt ist, die sich
von dem ersten offenen Leserahmen ableiten. Es ist zur Zeit nicht
klar, ob das ORF2-Genprodukt von NY-ESO-1 und das ORF3-Genprodukt
von gp75/TRP-1 biologische Funktionen zusätzlich zu Immunantworten von
T-Zellen aufweisen.
-
Referenzen
-
- 1. Rosenberg, S.A., B.S. Packard, P.M. Aebersold, D. Solomon,
S.L. Topalian, S.T. Toy, P. Simon, M.T. Lotze, J.C. Yang, C.A. Seipp,
et al, 1998. Use of tumor infiltrating lymphocytes and interleukin-2
in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. Preliminary
report. N. Engl. J. Med. 319:1676.
- 2. Rosenberg, S.A., J.Y. Yannelli und J.C. Yang, 1994. Treatment
of Patients with metastatic melanoma using autologous tumor-infiltrating
lymphocytes and interleukin-2. J. Natl. Cancer Inst. 86:1159.
- 3. Boon, T., J.C. Cerottini, B. Van den Eynde, P. van der Bruggen
und A. Van Pel. 1994. Tumor antigens recognized by T lymphocytes.
Annu. Rev. Immunol. 12:337.
- 4. Houghton, A.N. 1994. Commentary: cancer antigens: immune
recognition of self and altered self. J. Exp. Med. 180:1.
- 5. Tsomides, T.J. und H.N. Eisen, 1994. Commentary: T-cell antigens
in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3487.
- 6. Pardoll, D.M. 1994. News and views: a new look for the 1990s.
Nature 369:357.
- 7. Wang, R.F., und S.A. Rosenberg, 1996. Human tumor antigens
recognized by T lymphocytes: implications for cancer therapy. J.
Leukocyte Biol. 60:296.
- 8. Rosenberg, S.A. 1997. Cancer vaccines based on the identification
of genes encoding cancer regression antigens. Immunol. Today 18:175.
- 9. van der Bruggen, P., C. Traversari, Pl. Chomez, C. Lurquin,
E. Deplaen, B. Van den Eynde, A. Knuth und T. Boon, 1991. A gene
encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human
melanoma. Science 254:1643.
- 10. Gaugler, B., B. Van den Eynde, P. van der Bruggen, P. Romero,
J.J. Gaforio, E. De Plaen, B. Lethe, F. Brasseur und T. Boon, 1994.
Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognized on a melanoma
by autologous cytolytic T lymphocytes. J. Exp. Med. 179:921.
- 11. Van Den Eynde, B., O. Peeters, O. De Backer, B. Gaugler,
S. Lucas und T. Boon, 1995. A new family of genes coding for an
antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a human
melanoma. J. Exp. Med. 182:689.
- 12. Boël
P., C. Wildmann, M.L. Sensi, R. Brasseur, J.C. Renauld, P. Coulie,
T. Boon und P. van der Bruggen, 1995. BAGE: a new gene encoding
an antigen recognized on human melanomas by cytolytic T lymphocytes. Immunity
2:167.
- 13. Kawakami, Y., S. Eliyahu, C.H. Delgaldo, P.F. Robbins, L.
Rivoltni, S.L. Topalian, T. Mild und S.A. Rosenberg, 1994. Cloning
of the gene coding for a shared human melanoma antigen recognized
by autologous T cells infiltrating into tumor. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:3515.
- 14. Coulie, P.G., V. Brichard, A. Van Pel. T. Wolfe, J. Schneider,
C. Traversari, S. Mattei, E.D. De Plaen, C. Lurquin, J.P. Szikora,
J.C. Reauld und T. Boon, 1994. A new gene coding for a differentiation
antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on HLA-A2
melanomas. J. Exp. Med. 180:35.
- 15. Kawakami, Y., S. Eliyahu, C.H. Delgado, P.F. Robins, K.
Sakaguchi, E. Appella, J.R. Yannelli, G.J. Adema, T. Miki und S.A.
Rosenberg, 1994. Identification of a human melanoma antigen recognized
by tumor infiltrating lymphocytes associated with in vivo tumor
rejection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6458.
- 16. Brichard, V., A. Van Pel, T. Wölfel, E. De Plaen, B. Lethe,
P. Coulie und T. Boon, 1993. The tyrosinase gene codes for an antigen
recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on HLA-A2 melanomas.
J. Exp. Med. 178:489.
- 17. Robbins, P.F., M. E1-Gamil, Y. Kawakami, E. Stevens, J.
Yannelli und S.A. Rosenberg, 1994. Recognition of tyrosinase by
tumor infiltrating lymphocytes from a patient responding to immunotherapy.
Cancer Res. 54:3124.
- 18. Wang, R.F., P.F. Robbins, Y. Kawakami, X.Q. Kang und S.A.
Rosenberg, 1995. Identification of a gene encoding a melanoma tumor
antigen recognized by HLA-A31-restricted tumor-infiltrating lymphocytes.
J. Exp. Med. 181:799.
- 19. Wang, R.F., E. Appella, Y. Kawakami, X.Q. Kang und S.A.
Rosenberg, 1995. Identification of TRP-2 as a human tumor antigen
recognized by cytotoxic T lymphocytes. J. Exp. Med. 184:2207.
- 20. Wolfel, T., M. Hauer, J. Schneider, M. Serrano, C. Wolfel,
E. Klehmann-Hieb, E. De Plaen, T. Hankeln, K.H. Meyer Zum Buschenfeld
und D. Beach, 1995. A p16INK4a-insensitive CDK4 mutant targeted
by cytolytic T lymphocytes in a human melanoma. Science 269:1281.
- 21. Robbins, P.F., M. E1-Gamil, Y.F. Li, Y. Kawakami, D. Loftus,
E. Appella und S.A. Rosenberg, 1996. A mutated β-catenin gene encodes a melanoma-specific
antigen recognized by tumor infiltrating lymphocytes. J. Exp. Med.
183:1185.
- 22. Coulie, P.G., F. Lehmann, B. Lethe, J. Herman, C. Lurquin,
M. Andrawiss und T. Boon, 1995. A mutated intron sequence codes
for an antigenic peptide recognized by cytolytic T lymphocytes on
a human melanoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7976.
- 23. Mandruzzato, S., F. Brasseur, G. Andry, T. Boon und P. van
der Bruggen, 1997. A CASP-8 mutation recognized by cytolytic T lymphocytes
on a human head and neck carcinoma. J. Exp. Med. 186:785.
- 24. Wang, R.F., M.R. Parkhurst, Y. Kawakami, P.F. Robbins und
S.A. Rosenberg, 1996. Utilization of an alternative open reading
frame of a normal gene in generating a novel human cancer antigen.
J. Exp. Med. 183:1131.
- 25. Bloom, M.D., D. Perry-Lalley, P.F. Robbins, Y. Li, M. E1-Gamil, S.A. Rosenberg
und J.C. Yand, 1997. Identification of tyrosinase-related protein
2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma. J. Exp. Med. 185:453.
- 26. Disis, M.L., J.W. Smith, A.E. Murphy, W. Chef und M.A. Cheever,
1994. In vitro generation of human cytotoxic T-cells specific for
peptides derived from the HER-2/new protooncogene protein. Cancer
Res. 54:1071.
- 27. Fisk. B., B. Chesak, J.S. Pollack, J.T. Wharton und C.G.
Ioannides, 9114. Oligopeptide induction of a cytotoxic T lymphocyte
response to HER-2/Neu proto-oncogene in vitro. Cell Immunol. 157:415.
- 28. Peoples, G.E., I. Yosino, C.C. Douville, J.V.R. Andrews,
P.S. Goedegebuure und T.J. Eberlein, 1994. TCR Vβ3+ and
Vβ6+ CTL recognized tumorassociated antigens
related to HER-2/neu expression in HLA-A2+ ovarian cancers.
J. Immunol. 152:4993.
- 29. Chef Y.-T., M.J. Scanlan, U. Sahin, O. Tureci, A.O. Gure,
S. Tsang, B. Williamson, E. Stockert, M. Pfreundschuh und L.J. Old.
1997. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers
detected by autologous antibody screening. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 94:1914.
- 30. Topalian, S., D. Solomon, F.P. Avis, A.E. Chang, D.L. Freeksen,
W.M. Linehan, M.T. Lotze, C.N. Robertson, C.A. Seipp, P. Simon,
C.G. Simpson und S.A. Rosenberg, 1988. Immunotherapy of patients
with advanced cancer using tumor infiltrating lymphocytes and recombinant
interleukin-2: a pilot study, J. Clin. Oncol. 6:839.
- 31. Wang. R.F., S. Johnston, S. Southwood, A. Sette und S.A.
Rosenberg, 1998.d Recognition of an antigenic peptide derived from
TRP-2 by cytotoxic T lymphocytes in the context of HLA-A31 and -A33.
J. Immunol. 160:890.
- 32. Riddell, S.R. und P.D. Greenberg, 1995. Principles for adoptive
T cell therapy of human viral diseases. Annu. Rev. Immunol. 13:545.
- 33. Rammensee, H.G., T. Friede und S. Stevanoviic, 1995. MHC
ligands and peptide motifs: first listing. Immmunogenetics 41:178.
- 34. Baker, P.J., K.L. Britton, P.C. Engel, G.W. Farrants, K.S.
Lilley, D.W. Rice und T.J. Stiliman, 1992. Subunit assembly and
active site location in the structure of glutamate dehydrogenase.
Proteins 12:75.
- 35. Jager, E., Y.-T. Chef, J.W. Drijfout, J. Karbach, M. Ringhoffer,
D. Jager, M. Arand, H. Wada, Y. Noguchi, E. Stockert, L.J. Old und
A. Knuth, 1998. Simultaneous humoral and cellular immune response
against cancer-testis antigen NY-ESO-1:
definition of human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-A2-binding
peptide eptiopes. J. Exp. Med.187:265.
- 36. Sahin, U., O. Tureci, H. Schmitt, B. Cochlovius, T. Johannes,
R. Schmits, F. Stenner, G. Luo, I. Schobert und M. Pfreundschuh,
1995. Human neoplasms elicit multiple immune responses in the autologous
host. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11810.
- 37. Mattes, J.J., T.M. Thomson, L.J. Old und K.O. Lloyd, 1983.
A pigmentation-associated, differentiation antigen of human melanoma
defined by a precipitating antibody in human serum. Int. J. Cancer
32:717.
- 38. Kozlowski, S., M. Corr, M. Shirai, L.F. Boyd, C.D. Pendleton,
J.A. Berzofsky und D.H. Margulies, 1993. Multiple pathways are involved
in the extracellular processing of MHC class I-restricted peptides.
J. Immunol. 151:4033.
- 39. Parkhurst, M.R., M. Salgaller, S. Southwood, P. Robbins,
A. Sette, S.A. Rosenberg und Y. Kawakami, 1996. Improved induction
of melanoma reactive CTL with peptides from the melanoma antigen
gp100 modified at HLA-A0201
binding residues. J. Immunol. 157:2539.
- 40. Fischer, F., D. Peng, S.T. Hingley, S.R. Weiss und P.S.
Masters, 1997. The internal open reading frame within the nucleocapside
gene of mouse hepatitis virus encodes a structural protein that
is not essential for viral replication. J. Virol. 71:996.
- 41. Quelle, D.E., F. Zindy, R.A. Ashmun und C.J. Sherr, 1995.
Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode
two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest. Cell
83:993.
- 42. Kamijo, T., F. Zindy, M.F. Roussel, D.E. Quelle, J.R. Downing,
R.A. Ashmun, G. Grosveld und C.J. Sheer, 1997. Tumor suppression
at the mouse INK4a locus mediated by the alternative reading frame
product p19ARF. Cell 91:649.
- 43. Kozak, M. 1994. Determinants of translational fidelity and
efficiency in vertebrate mRNAs. Biochimie 76:815.
- 44. Bullock, T.N.J. und L.C. Eisenlohr, 1996. Ribosomal scanning
past the primary initiation codon as a mechanism for expression
of CTL epitopes encoded in alternative reading frames. J. Exp. Med.
184:1319.
- 45. Elliott, T., H. Bodmer und A. Townsend, 1996. Recognition
of out-of-frame major histocompatibility complex class I-restricted
epitopes in vivo. Eur. J. Immunol. 26:1175.
- 46. Uenaka, A., T. Ono, T. Akisawa, H. Wada, T. Yasuda und E.
Nakayama, 1994. Identification of a unique peptide pRL1 on BALB/c
RL male 1 leukemia recognized by cytotoxic T lymphocytes and its
relation to the aki onogene. J. Exp. Med. 180:1599.
- 47. Shastri, N., V. Nguyen und F. Gonzalez, 1995. Major histocompatibility
class I molecules can present cryptic translation products to T
cells. J. Biol. Chem. 270:1088.
- 48. Malarkannan, S., M. Afkarian und N. Shastri, 1995. A rare
cryptic translation product is presented by Kb major
histocompatibility complex class I molecule to alloreactive T cells.
J. Exp. Med. 182:1739.
- 49. Guilloux, Y., L. Lucas, V.G. Brichard, A. Van Pel, C. Viret,
E. De Plaen, F. Brasseur, B. Lethe, F. Jotereau und T. Boon, 1996.
A peptide recognized by human cytolytic T lymphocytes on HLA-A2
melanomas is encoded by an intron sequence of the N-acetylglucosaminyltransferase
V. gene. J. Exp. Med. 183:1173.
- 50. Robbins, P.F., M. El-Gamil, Y.F. Li, E. Fitzgerald, Y. Kawakami
und S.A. Rosenberg, 1997. The intronic region of an incompletely
spliced gp100 gene transcript encodes an epitope recognized by melanoma-reactive tumor-infiltrating
lymphocytes. J. Immunol. 159:303.
-
