ES2279001T3 - Uso de plasminogeno para promover la cicatrizacion de la perforacion de la membrana del timpano. - Google Patents
Uso de plasminogeno para promover la cicatrizacion de la perforacion de la membrana del timpano. Download PDFInfo
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Abstract
El uso de un plasminógeno para preparar una composición farmacéutica tópica para promover la cicatrización de una perforación de membrana timpánica en un mamífero.
Description
Uso de plasminógeno para promover la
cicatrización de la perforación de la membrana del tímpano.
Esta solicitud reivindica la prioridad bajo 35
U.S.C. \NAK119(e) de la Solicitud Provisional de Patente de
EEUU Nº 60/317.643, presentada el 6 de Septiembre de 2001.
Esta invención se refiere a procesos de
cicatrización de heridas. En particular, la invención se refiere a
la promoción de la cicatrización o cierre de heridas o membranas
timpánicas perforadas, así como a la minimización de formación de
cicatrices y eliminación de tejido necrótico.
La cicatrización lenta o inadecuada de heridas
compromete la calidad de vida de gran cantidad de personas. Un tipo
particular de cicatrización de heridas en el que pueden presentarse
problemas es la cicatrización de perforaciones de la membrana
timpánica (tímpano). Aunque la mayoría de las perforaciones
cicatrizarán espontáneamente y se cierran por proliferación de
epitelio queratinizante escamoso que avanza delante de un tejido
conectivo que crece hacia dentro, algunas perforaciones no
cicatrizan, dando frecuentemente como resultado la pérdida de
audición u otras complicaciones. Por qué algunas perforaciones
cicatrizan, mientras que otras permanecen evidentes es aún una
pregunta sin respuesta. Además, en Estados Unidos cada año más de
1,25 millones de personas sufren quemaduras y 6,5 millones tienen
úlceras crónicas en la piel causadas por presión, éstasis venoso o
diabetes melitus.
La cicatrización de heridas es un proceso
dinámico de remodelación de tejidos que incluye la formación de una
matriz rica en fibrina y fibronectina en el campo de la herida, la
infiltración de neutrófilos y macrófagos, la proliferación de
queratinocitos epidérmicos en los bordes de la herida y su migración
a través de la matriz provisional, la formación de tejido granuloso
que contiene vasos nuevos desarrollados y fibroblastos y células
inflamatorias con capacidad para migrar y la contracción de la
herida. Los estudios de cicatrización de heridas de la piel
sugieren que las proteasas juegan papeles importantes en varias
etapas. Está bien documentado el hecho de que la degradación de la
matriz extracelular (ECM) que tiene lugar durante la cicatrización
de la herida y otros procesos de remodelación de la ECM depende de
la acción de una diversidad de enzimas proteolíticas secretadas por
células inflamatorias, así como por elementos celulares del tejido
estromal. Se cree que muchas proteinasas diferentes contribuyen con
la remodelación de la matriz durante la cicatrización de una herida
(Saksela y Rifkin, Annu. Rev. Cell Biol. 4, 93-126
(1988)). Sin embargo, los mecanismos precisos responsables de este
proceso y cómo están regulados se comprenden
pobremente.
pobremente.
El sistema de activación de plasminógeno es un
sistema enzimático versátil, controlado temporalmente en el que el
plasminógeno se activa a la enzima proteolítica plasmina por medio
de cualquiera de los dos activadores fisiológicos de plasminógeno
(PA), activador de plasminógeno de tipo tisular (tPA) y activador de
plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA). La activación de este
sistema se inicia por la liberación de tPA o uPA por parte de
células específicas en respuesta a señales externas y lleva a una
actividad proteolítica extracelular localmente expresada (Vassalli
y col. J. Exp. Med. 159, 1653-1668 (1984); Saksela
& Rifkin, 1988, supra). El sistema PA es también regulado
por inhibidores específicos dirigidos contra PA y plasmina,
incluyendo el inhibidor de PA de tipo 1 (PAI-1), el
inhibidor de PA de tipo 2 (PAI-2), proteasa nexina 1
(PN-1) y \alpha2-antiplasmina
(Saksela & Rifkin, 1988, supra; Ny y col., Thromb Res.
71(1):1-45 (1993)). Todos estos inhibidores,
que pertenecen a la familia de las serpinas, son inhibidores
suicidas que son escindidos por proteasas relacionadas (Wilczynska y
col., J Biol Chem.270(50):29652-5 (1995);
Wilczynska y col., Nat Struct Biol.
4(5):354-7 (1997)). La característica más
importante del sistema PA es la amplificación que se logra por la
conversión de plasminógeno que da como resultado la formación de
plasmina.
Se ha descubierto que los PA están presentes en
los bordes de las heridas, junto con varios tipos de
metaloproteinasas de matriz (MMP), incluyendo colagenasa
intersticial (MMP-1),
estromelisina-1 (MMP-3), y las
formas latentes de gelatinasa A (MMP-2) y
gelatinasa B (MMP-9). La expresión de PA y MMP es
inducida por citoquinas y mediadores inflamatorios, lo que indica
que ambos sistemas enzimáticos pueden actuar conjuntamente. Se sabe
que las MMP se sintetizan como enzimas precursoras latentes que
pueden activarse por proteolisis limitada, pero en gran parte es
desconocido el mecanismo exacto por el cual tiene lugar esta
activación in vivo. Uno de los factores propuestos para estar
involucrado en la activación de algunas subclases de
metaloproteinasas es la plasmina (Lijnen, Thromb Haemost
86(1):324-33 (2001)).
Varios informes han indicado que la expresión o
activación de MMP, inhibidores tisulares de metaloproteinasas
(TIMP), PA e inhibidores de PA están alterados en los procesos de
cicatrización de heridas, y también se ha indicado que la plasmina
juega un papel en la cicatrización de heridas en la piel (Romer y
col., Nat. Med. 2:287-292 (1996)). Más aún, las
Patentes de EEUU Nº 5.925.350 y 6.033.664 de Verheijen describen el
uso de uPA o tPA para mejorar la cicatrización de heridas de
cicatrización lenta o que no cicatrizan. En estos estudios, se notó
que el mecanismo de mejora no estaba asociado con la actividad
fibrinolítica o la eliminación del tejido necrótico. Se han
propuesto también estrategias específicas para mejorar la
cicatrización de la membrana timpánica, usando la aplicación tópica
de altas concentraciones de hialuronan (Laurent y col., Arch
Otolaryngol Head Neck Surg 114:1435-1441 (1988)) o
factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF; Fina y col.,
Laryngoscope 103(7):804-809 (1993)).
Aunque la comprensión de la cicatrización de
heridas y los diversos mecanismos que la regulan está mejorando, y
se han propuesto estrategias de tratamiento promisorias, la
cicatrización lenta o la falta de cicatrización de perforaciones de
membrana timpánica o de otras heridas continúa siendo un problema
médico así como también social. Por lo tanto existe una necesidad en
la técnica de procedimientos nuevos y mejorados para acelerar los
procesos de cicatrización de heridas, tales como la cicatrización de
las perforaciones de membrana timpánica, quemaduras y úlceras de la
piel, eliminando cualquier tejido necrótico y minimizando la
formación de cicatrices. Hay también una necesidad de
procedimientos de selección nuevos para identificar y evaluar
fármacos que puedan usarse en tales procedimientos de tratamiento.
La invención aborda estas y otras necesidades en la técnica.
La presente invención provee un procedimiento
nuevo para mejorar la cicatrización de perforaciones de la membrana
timpánica o minimizar la formación de cicatrices durante la
cicatrización, por medio de la administración de plasminógeno.
Por consiguiente, la invención provee la
reivindicación 1. De preferencia, el sujeto es un ser humano, y el
plasminógeno es plasminógeno humano. La composición puede además
comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable, y puede estar
en la forma de una solución acuosa, un gel, una loción, un bálsamo,
un polvo, una pasta, un vendaje, un apósito para heridas, u otro
vehículo de administración adecuado. El plasminógeno se ha de
administrar por vía tópica. En el caso de administración tópica, la
composición administrada puede comprender desde aproximadamente
0,05 mg hasta aproximadamente 10 mg de plasminógeno, de preferencia
desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5 mg de
plasminógeno. La composición puede promover la cicatrización
acelerando la cicatrización de la perforación, reduciendo el tejido
necrótico y reduciendo la formación de tejido de cicatrización en el
área de la herida. En una forma de realización, se repite la
administración de plasminógeno al menos una vez, de preferencia al
menos una vez cada día.
Las características anteriores y muchas otras
ventajas de la invención se entenderán mejor por referencia a la
siguiente descripción detallada tomada conjuntamente con los dibujos
que la acompañan.
Figura 1A y 1B. Progresión en el tiempo de (A)
reacción inflamatoria en la cavidad del oído medio y (B) contracción
de la perforación, tras la perforación de la membrana timpánica en
ratas de tipo salvaje. Se administraron cincuenta \mul de
solución de plasminógeno (50 \mug (1 mg/ml) - \ding{110} -; ó
0,5 mg (10 mg/ml) - \ding{115} -) o control (PBS, - \ding{116}
-) tras la perforación, y a partir de entonces cada 24 horas.
La presente invención se refiere a la
cicatrización de membranas timpánicas perforadas.
La invención está basada, en parte, en el
descubrimiento de que en ausencia de plasminógeno, el proceso de
cicatrización de heridas no progresa adecuadamente, demostrando que
el plasminógeno juega un rol principal en la cicatrización de
heridas, particularmente en el caso de perforaciones de la membrana
timpánica (ver Ejemplos y Tabla 1). Como se muestra en los
Ejemplos, la cicatrización de perforaciones de la membrana timpánica
fue anormal y se vio drásticamente alterada en los casos de ratones
sin plasminógeno en comparación con controles de tipo salvaje y
otros modelos transgénicos (ver Tabla 1). En ratones sin
plasminógeno, las perforaciones de la membrana timpánica no
cicatrizaron adecuadamente durante el período de la prueba de 144
días durante el que se controló la cicatrización, dando como
resultado una membrana timpánica anormal. Se descubrió también que
los ratones deficientes en plasminógeno revirtieron hacia un proceso
de cicatrización normal tras la inyección de plasminógeno humano
(ver Ejemplos 2 y 5), y las ratas de tipo salvaje mostraron una
mejor cicatrización de la membrana timpánica tras la administración
de plasminógeno (Ejemplo 6). Además, los experimentos mostraron que
uPA, pero no tPA, puede también jugar un papel en la cicatrización
de heridas normales, ya que aparentemente no es necesario uPA para
la eliminación de los depósitos de fibrina (Ejemplos 3 y 4). Sin
embargo, en ningún modelo animal la falta de cicatrización normal
fue más evidente que en los ratones deficientes en plasminógeno, lo
que indica que el plasminógeno juega un papel más esencial y
probablemente diferente que el uPA durante la cicatrización de
heridas. Sin estar ligados a ninguna teoría específica, los
presentes hallazgos avalan que la incapacidad de una cicatrización
adecuada puede ser causada por un defecto en la respuesta
inflamatoria, en la migración de queratinocitos, o en los
acontecimientos de remodelación de la matriz durante el proceso de
cicatrización.
Como demuestran los resultados de la Tabla 1,
uPA, tPA y plasminógeno juegan papeles diferentes en el proceso de
cicatrización de heridas, con el plasminógeno jugando un papel
central. Además, como se muestra en los Ejemplos, la eliminación de
tejido necrótico y fibrina son dependientes de manera crítica de la
presencia o administración de plasminógeno/plasmina más que de tPA o
uPA.
Por consiguiente, podría usarse plasminógeno en
el tratamiento de enfermedades en las que se ve afectada la
cicatrización de heridas, así como en estrategias para acelerar la
cicatrización de la membrana timpánica y de heridas, en el
tratamiento de afecciones o enfermedades que afectan la
cicatrización de tejidos epidérmicos dañados, en procedimientos
para reducir la formación de cicatrices o acumulación o formación de
tejido necrótico, así como en procedimientos para la selección de
fármacos para usar en tales tratamientos. La administración de
plasminógeno puede también minimizar la formación de cicatrices o la
acumulación de tejido necrótico en las membranas timpánicas u otros
tejidos epidérmicos durante la cicatrización de heridas. Por
ejemplo, puede aplicarse plasminógeno conjuntamente con cirugía
plástica para reducir la formación de cicatrices residuales,
depósitos de fibrina o tejido necrótico o prevenir la aparición de
los mismos. También, puede aplicarse plasminógeno en úlceras o
quemaduras para mejorar la cicatrización.
Además, la invención podría usarse para mejorar
la cicatrización de heridas en condiciones de deficiencia local o
sistémica de plasminógeno, o para mejorar la cicatrización de
heridas de cicatrización lenta o que no cicatrizan. Notablemente,
como se muestra en el Ejemplo 5, la restauración del plasminógeno
semanas tras el daño puede disminuir la matriz extracelular
acumulada y reiniciar la cicatrización normal, mostrando de esta
manera que el plasminógeno puede aplicarse para el tratamiento de
heridas crónicas tales como ulceraciones y llagas.
Como alternativa, podría usarse plasmina por sí
misma en el tratamiento de enfermedades en las que está afectada la
cicatrización de heridas, así como en estrategias para acelerar la
cicatrización de la membrana timpánica y de heridas, en el
tratamiento de afecciones o enfermedades que afectan la
cicatrización de tejidos epidérmicos dañados, o en procedimientos
para reducir la formación de cicatrices o acumulación o formación de
tejido necrótico. La administración de plasmina puede también
minimizar la formación de cicatrices o la acumulación de tejido
necrótico en las membranas timpánicas u otros tejidos epidérmicos
durante la cicatrización de heridas. Por ejemplo, puede aplicarse
plasmina conjuntamente con cirugía plástica para reducir la
formación de cicatrices residuales, depósitos de fibrina o tejido
necrótico o prevenir la aparición de los mismos. También puede
aplicarse plasmina en úlceras, llagas o quemaduras para mejorar la
cicatrización.
Las composiciones mencionadas en este documento
pueden administrarse por vía tópica, por inyección o por infusión
intravenosa. De preferencia, aunque no necesariamente, la
administración es local, es decir, próxima a la herida. Cuando se
administra plasminógeno o plasmina por inyección (por ejemplo, por
vía intravenosa, subcutánea o intramuscular), se prepara de manera
ventajosa como una solución del material en un líquido
farmacéuticamente aceptable tal como, por ejemplo solución salina
isotónica. El plasminógeno o plasmina pueden administrarse
localmente para obtener una concentración elevada, por ejemplo, al
menos 200 \mug/ml de plasminógeno o al menos 20 \mug/ml de
plasmina, en el área de la perforación o la herida. Para
administración tópica, la composición de plasminógeno o plasmina
puede, por ejemplo, ser parte de un gel, loción, bálsamo, pasta,
pulverización, polvo, vendaje o apósito de herida. Para acelerar la
cicatrización de una perforación de membrana timpánica, la
composición se administra de preferencia a través del canal auditivo
externo, por ejemplo mediante una pulverización administrada hacia
el área de la perforación, o agregando gota a gota una solución de
plasminógeno o plasmina. Los dispositivos para administrar
composiciones por pulverización son conocidos en la técnica y están
descritos en, por ejemplo la Patente de EEUU Nº 6.027.712. Las
estrategias tales como la administración de plasminógeno/plasmina
por pulverización, así como mediante gel o pasta, o una solución
administrada por vía tópica, pueden usarse también para tratar
heridas en la cavidad oral. Para acelerar la cicatrización de
heridas, el plasminógeno o la plasmina pueden estar presentes en un
apósito para heridas aplicado en la herida, desde el que se
transfiere hacia el área de la herida.
Los términos usados en esta memoria descriptiva
generalmente tienen su significado habitual en la técnica, dentro
del contexto de esta invención y en el contexto específico donde se
usa cada término. Ciertos términos se discuten a continuación, o en
otra parte de la memoria descriptiva, para proveer otra guía al
médico describiendo las composiciones y procedimientos de la
invención y cómo prepararlas y usarlas.
"Membrana timpánica" y "tímpano" se
usan indistintamente en este documento.
Una "perforación en la membrana timpánica"
es una abertura en la membrana timpánica usualmente causada por un
trauma. Existen al menos cuatro categorías generales: daños por
compresión (los más comunes y usualmente el resultado de un golpe
en la oreja); daños por instrumentos (los segundos más comunes,
usualmente inadvertidos, causados frecuentemente por hisopos de
algodón o horquillas para el cabello); daños por quemaduras
(frecuentemente observados en la industria, de metales calientes de
máquinas o de soldaduras); y daños por explosiones (observados
usualmente durante guerras o bombardeos). La infección puede causar
demoras en la cicatrización de la membrana timpánica, y la
perforación persistente es usualmente una manifestación de
tubotimpanitis, una inflamación de la trompa de Eustaquio y de la
cavidad timpánica (oído medio).
Una "herida" es una ruptura o
discontinuidad en la estructura de un órgano o tejido, incluyendo el
epitelio, tejido conectivo y tejido muscular, causada por un agente
externo. Los ejemplos de heridas incluyen, pero no se limitan a,
heridas de la piel, magulladuras, ulceraciones, llagas, rasguños,
desgarros, cortes, pinchazos, heridas soriáticas, perforaciones de
la membrana timpánica y quemaduras. Un tipo particular de heridas
son aquellas que son consecuencia de procedimientos de cirugía
plástica.
"Tópica" y "aplicación tópica" se
refieren a la administración no sistémica, local de un ingrediente
activo. Por ello, aplicación tópica puede referirse a la aplicación
de un ingrediente activo a la superficie externa de una herida.
"Plasminógeno" incluye en este documento al
plasminógeno de mamíferos que se presenta de manera endógena,
plasminógeno alélico, derivados de plasminógeno con función
conservada, fragmentos de plasminógeno funcionalmente activos y
homólogos de plasminógeno de mamíferos. Opcionalmente, una
composición de plasminógeno puede contener más de un tipo, derivado
u homólogo de plasminógeno. De preferencia, el tipo de plasminógeno
para usar en una composición para administrar a un sujeto es
endógeno de la especie del sujeto. Un compuesto de preferencia es el
plasminógeno purificado de una fuente biológica, por ejemplo,
plasminógeno humano producido de manera recombinante, o
plasminógeno humano purificado, que está disponible, por ejemplo en
Blopool AB (Umea, Suecia). Un plasminógeno humano de preferencia
tiene la secuencia de aminoácidos de GenBank Nº de Acceso PLHU
(GI:625234) (SEQ ID Nº 1).
"Plasmina" incluye en este documento a la
plasmina de mamífero que se presenta de manera endógena, plasmina
alélica, derivados de plasmina con función conservada, fragmentos de
plasmina funcionalmente activos y homólogos de plasmina de
mamíferos. Opcionalmente, una composición de plasmina puede contener
más de un tipo, derivado u homólogo de plasmina. De preferencia, el
tipo de plasmina para usar en una composición para administrar a un
sujeto es endógeno de la especie del sujeto. Un compuesto de
preferencia es la plasmina purificada de una fuente biológica, por
ejemplo, plasmina humana producida de manera recombinante, o
plasmina humana purificada.
"Variantes con función conservada" son
proteínas en las que se ha cambiado un resto aminoácido dado sin
alterar la conformación total y función de la proteína, incluyendo,
pero no limitado a, reemplazo de un aminoácido con otro que tiene
propiedades similares (tales como, por ejemplo, acidez, alcalinidad,
hidrofobicidad, y similares). En la técnica se conocen bien los
aminoácidos con propiedades similares. Por ejemplo, arginina,
histidina y lisina son aminoácidos básicos hidrófilos y pueden
intercambiarse. De manera similar, la isoleucina, un aminoácido
hidrófobo, puede reemplazarse con leucina, metionina o valina. Los
aminoácidos diferentes de aquellos indicados como conservados
pueden diferir en una proteína o enzima de manera que el porcentaje
de similitud de proteína o de secuencia de aminoácidos entre dos
proteínas cualesquiera de función similar puede variar y puede ser,
por ejemplo desde 70% hasta 99% como se determina de acuerdo con un
esquema de alineamiento tal como el Procedimiento Cluster, en el
que la similitud está basada en el algoritmo MEGALIGN. Una
"variante de función conservada" incluye también un
polipéptido o enzima que tiene al menos 60% de identidad de
aminoácidos como se determina por los algoritmos BLAST o FASTA, de
preferencia al menos 75%, de más preferencia al menos 85%, de más
preferencia aún al menos 90%, y todavía de más preferencia 95%, y
que tiene las mismas propiedades o funciones o sustancialmente
similares que la proteína o enzima nativa o de origen con la que se
compara.
Un "sujeto" incluye en este documento a
seres humanos y a animales no humanos. Los animales no humanos
incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, animales de laboratorio
tales como ratones, ratas, conejos, cobayas, hámsteres, etc.; los
animales domésticos tales como perros y gatos; y animales de granja
tales como ovejas, cabras, cerdos, caballos y vacas. Un animal no
humano de la presente invención puede ser un animal mamífero o no
mamífero; un vertebrado o un invertebrado.
"Tratamiento" de un sujeto, o "tratar"
en un sujeto una enfermedad o afección significa en este documento
reducir o aliviar los síntomas clínicos de la enfermedad o afección
tales como la cicatrización alterada o lenta de
heridas.
heridas.
"Promover", "mejorar", o
"aumentar" la cicatrización de la membrana timpánica o de las
heridas significa generalmente incrementar la velocidad en la que la
herida o perforación cicatriza o reducir la extensión de la cicatriz
residual o tejido necrótico durante o tras la cicatrización de la
herida o perforación.
Un "control", "valor de control" o
"valor de referencia" en un ensayo es un valor usado para
detectar una alteración en, por ejemplo la cicatrización de una
membrana timpánica perforada o una herida en la piel, o cualquier
otro ensayo descrito en este documento. Por ejemplo, cuando se
estudia la cicatrización de la perforación de la membrana
timpánica, el efecto inhibitorio/estimulador de un agente puede
evaluarse comparando la cicatrización de una herida o perforación
con la de un control. El control o referencia puede ser, por ejemplo
un valor de referencia predeterminado, o puede determinarse
experimentalmente. Por ejemplo, en tal ensayo, un control o
referencia puede ser la cicatrización de una herida o perforación
similar en un animal sin exposición al fármaco o agente activo, o un
animal tratado con el mismo fármaco o agente activo que no tiene
alterada la capacidad de cicatrizar la herida.
Una "cantidad eficaz" o una "cantidad
terapéuticamente eficaz" significa una cantidad que aumenta las
concentraciones local y/o sistémica de plasminógeno, y/o mejora la
cicatrización de heridas. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un
agente activo puede ser una cantidad que da como resultado un nivel
local (en la perforación, herida o área de cicatriz) o un nivel
sistémico de plasminógeno que excede 200 \mug/ml. Como
alternativa, una cantidad eficaz de un agente es una cantidad que
da como resultado una cicatrización más rápida de una perforación o
herida que en ausencia del agente, o una cicatriz o formación de
tejido necrótico reducida comparada con la que se produce en
ausencia del agente. Una cantidad eficaz podría también significar
una cantidad o dosis suficiente para aumentar los niveles local y/o
sistémico de plasminógeno, por ejemplo, a aproximadamente el 10%,
preferiblemente por aproximadamente 50 por ciento, y de más
preferencia por aproximadamente 100 por ciento, del nivel hallado
previo a la administración del agente activo o fármaco. Como
alternativa, una cantidad eficaz de plasminógeno es una cantidad
que corresponde a aproximadamente desde 5 \mug hasta
aproximadamente 50 mg, de preferencia aproximadamente desde 0,05 mg
hasta aproximadamente 10 mg, y de más preferencia aún, desde
aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 5 mg de plasminógeno
por centímetro cuadrado en el área de la herida. Una cantidad
terapéuticamente eficaz puede aliviar o presentar una respuesta
clínicamente significativa en un sujeto, por ejemplo promoviendo la
cicatrización de la perforación de la membrana timpánica o herida,
o reduciendo la formación de cicatriz. Como alternativa, una
cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para mejorar una
afección por cicatrización de heridas o afección por la formación de
cicatrices clínicamente significativa en el huésped.
Como se usa en este documento,
"aproximadamente" significará dentro del 50%, de preferencia
dentro del 20%, de más preferencia dentro del 5%, de un valor o
intervalo dado.
Un valor que es "sustancialmente diferente"
de otro valor puede significar que hay una diferencia
estadísticamente significativa entre los dos valores. Puede usarse
cualquier procedimiento estadístico adecuado conocido en la técnica
para evaluar si las diferencias son significativas o no. Una
diferencia "estadísticamente significativa" significa que se
determinó una significancia en un intervalo de confianza de al menos
90%, de más preferencia en un intervalo de confianza de 95%.
De acuerdo con la presente invención, pueden
usarse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología
y de ADN recombinante, dentro de la experiencia de la técnica. Tales
técnicas se explican ampliamente en la bibliografía. Ver, por
ejemplo, Sambrook y col. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Glover (DNA Cloning: A
Practical Approach, Volúmenes I y II, 1985); Hames y Higgins
(Nucleic Acid Hybridization, 1985); Hames y Higgins (Transcription
And Translation, 1984); Freshney (Animal Cell Culture, 1986); Perbal
(A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984); y Ausubel y col.
(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,
Inc., 1994).
Las abreviaturas usadas en la presente
descripción incluyen las siguientes:
- uPA
- = activador de plasminógeno de tipo uroquinasa;
- PA
- = activador de plasminógeno;
- MMP
- = metaloproteinasa de matriz;
- TIMP
- = inhibidor tisular de metaloproteinasa;
- tPA
- = activador de plasminógeno de tipo tisular;
- Plg
- = plasminógeno;
- ECM
- = matriz extracelular.
De acuerdo con la invención, se mejora la
cicatrización de heridas proveyendo o aumentando los niveles de
plasminógeno.
En una forma de realización de preferencia, se
usa una preparación sustancialmente pura de plasminógeno humano.
Puede adquirirse plasminógeno en forma purificada, o producirse
purificando el componente de seres humanos u otros animales, o por
medio de producción recombinante en células huésped, incluyendo
células huésped procariotas tales como S. cerevisiae o E.
coli, y de más preferencia, células huésped de mamífero tales
como células CHO. El plasminógeno puede ser humano de tipo salvaje,
un homólogo o uno modificado/mutado de mamífero. En particular,
pueden usarse fragmentos del componente que retienen al menos una
parte de la actividad deseada del componente de extensión total.
La invención puede usarse para acelerar la
cicatrización de una membrana timpánica u otra herida en animales,
incluyendo pero no limitado a, vertebrados tales como seres humanos
y animales domésticos, incluyendo perros, gatos y caballos. Además,
puede usarse plasminógeno en esta aplicación clínica para reducir la
formación de tejido de cicatrices y tejido necrótico en el área de
la herida, y para mejorar la eliminación de los desechos
tisulares.
En una forma de realización, la invención se
aplica para potenciar la cicatrización de una membrana timpánica
perforada en un sujeto humano. El sujeto humano o no humano puede o
no sufrir una afección que afecta o hace más lenta la cicatrización
de la perforación de la membrana timpánica.
Dado que la invención no sólo aumenta la tasa de
cicatrización de heridas, sino que también mejora la calidad de las
heridas, es decir, reduce la aparición de cicatrices y la aparición
de tejido necrótico, puede administrarse plasminógeno a cualquier
paciente para reducir la formación de cicatrices. El sujeto puede
ser un ser humano que va a someterse, está siendo sometido, o ha
sido sometido, a cirugía plástica o a la aplicación de un sustituto
de la piel. En tal caso, puede aplicarse o administrarse una
composición que comprende plasminógeno previamente y/o tras la
cirugía.
Además, la administración de plasminógeno puede
reiniciar un patrón de cicatrización de heridas normal, en
situaciones en las que está afectada la cicatrización de heridas.
Sin estar ligados a una teoría en particular, además de la
fibrinolisis, los niveles de plasminógeno elevados pueden llevar a
niveles aumentados de plasmina, que puede iniciar un proceso de
cicatrización de heridas a través de la activación de vías de
citoquinas.
En este documento se describen composiciones de
plasminógeno, que, cuando se administran en una cantidad eficaz,
dan como resultado un nivel aumentado de plasminógeno en el área de
la herida de un sujeto y por lo tanto una mejor cicatrización de
una perforación de membrana timpánica u otra herida.
Por ejemplo, para acelerar la cicatrización de
la membrana timpánica, puede aplicarse una composición que
comprende desde aproximadamente 5 \mug hasta aproximadamente 50
mg, de preferencia desde aproximadamente 0,05 mg hasta
aproximadamente 10 mg, y de más preferencia aún desde
aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 5 mg de plasminógeno,
incluyendo un homólogo o derivado de plasminógeno, al área que rodea
la perforación de la membrana timpánica. Como alternativa, pueden
aplicarse aproximadamente 10-50 \mul de una
solución de plasminógeno de 1 mg/ml, o la cantidad correspondiente
administrada en otra formulación adecuada. Para acelerar la
cicatrización de heridas en general, puede aplicarse una composición
de plasminógeno de manera tal que la cantidad de plasminógeno por
centímetro cuadrado (cm^{2}) del área de la herida comprenda desde
aproximadamente 5 \mug hasta aproximadamente 50 mg, de
preferencia desde aproximadamente 0,05 mg hasta aproximadamente 10
mg, y de más preferencia aún desde aproximadamente 0,5 mg hasta
aproximadamente 5 mg de plasminógeno, incluyendo un homólogo o
derivado de plasminógeno.
Como alternativa, se administra plasminógeno de
tal manera que se alcanza una concentración localmente elevada de
plasminógeno en la perforación de membrana timpánica o área de la
herida del sujeto, por ejemplo, un paciente humano. En una forma de
realización de preferencia, la administración de una cantidad eficaz
del agente activo da como resultado una concentración de
plasminógeno de al menos aproximadamente 200 \mug/ml en la
perforación o en el área de la herida. En otra forma de realización
de preferencia, la administración de una cantidad eficaz del agente
activo da como resultado una concentración de plasminógeno de al
menos aproximadamente 200 \mug/ml en la perforación o área de la
herida. En otra forma más de realización de preferencia, la
concentración de plasminógeno resultante de la administración de
una cantidad eficaz de un agente activo es desde aproximadamente 2
\mug/ml hasta aproximadamente 2 mg/ml, de más preferencia al menos
200 \mug/ml. La concentración de plasminógeno en plasma humano es
de aproximadamente 200 microgramos por ml.
El plasminógeno puede formularse en
composiciones farmacéuticas para administración a sujetos en una
forma biológicamente compatible adecuada para administración in
vivo, por ejemplo, por administración tópica, inyección o
infusión. Por forma biológicamente compatible para administración
in vivo se entiende una forma de la sustancia para ser
administrada en la que cualquier efecto tóxico es compensado por los
efectos terapéuticos. La administración de una cantidad
terapéuticamente activa de las composiciones farmacéuticas de la
presente invención se define como una cantidad eficaz, en
dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para alcanzar
los resultados deseados. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente
activa de una sustancia puede variar según factores tales como el
estado de la enfermedad, la edad, sexo, y peso del individuo. El
régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la
respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, puede administrarse más
de una dosis dividida diariamente o puede reducirse la dosis
proporcionalmente como lo indiquen las exigencias de la situación
terapéutica.
Si se desea, pueden aplicarse también otros
ingredientes activos conjuntamente con el tratamiento con
plasminógeno o plasmina de una perforación o herida. Tales
ingredientes activos incluyen, pero no se limitan a, PA de mamífero
tales como tPA humano o uPA humano, o PA bacterianos tal como
estreptoquinasa.
La sustancia activa puede administrarse de una
manera conveniente tal como por inyección (subcutánea, intravenosa,
etc.), inhalación, pulverización, por aplicación tópica o
transdérmica, o por administración rectal. Dependiendo de la ruta
de administración, la sustancia activa puede estar recubierta en un
material para proteger al compuesto de la acción de enzimas, ácidos
y otras condiciones naturales que pueden inactivarlo. Por lo tanto,
las rutas adecuadas de administración incluyen la administración
tópica, intravenosa, intramuscular, intradérmica, rectal e
intravaginal. Una vía de administración de preferencia es la
administración tópica. En el caso de perforaciones de la membrana
timpánica, puede administrarse el agente activo a través del canal
auditivo externo. Los vasos que soportan la membrana timpánica
terminan en el borde de la membrana. En consecuencia, la sangre y
los componentes de la sangre tales como el oxígeno, nutrientes y
plasminógeno sólo alcanzan la membrana timpánica por difusión.
Las composiciones descritas en este documento
pueden prepararse por medio de procedimientos bien conocidos per
se para la preparación de composiciones farmacéuticamente
aceptables que pueden administrarse a sujetos, de manera tal que se
combina una cantidad eficaz de la sustancia activa en una mezcla con
un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados se
describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack
Publishing Company, Easton, Pa., EEUU 1985). Sobre esta base, las
composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones de las
sustancias o compuestos en asociación con uno o más vehículos o
diluyentes farmacéuticamente aceptables, y están contenidas en
soluciones tamponadas con un pH adecuado e isosmóticas con los
fluidos fisiológicos.
Los ejemplos de vehículos que pueden usarse para
administrar el plasminógeno u otra composición de acuerdo con la
invención incluyen, pero no se limitan a, formas de dosificación
inyectables, infusiones, geles, pastas, bálsamos, ceras, lociones,
cremas para piel, y otros diversos formatos para administración
tópica conocidos en la técnica. Las composiciones pueden también
administrarse localmente en la forma de un polvo o solución
pulverizada en el área de la herida. Como alternativa, la
composición de la invención puede estar presente en apósitos para
heridas, parches, vendajes, gasas, u otros medios aplicados a las
heridas, desde los que se transfieren a la superficie de la herida.
Tales dispositivos también incluyen dispositivos de liberación
lenta, que liberan continuamente plasminógeno u otros componentes
durante un período de tiempo prolongado. Con respecto a la
cicatrización de las membranas timpánicas, la administración de la
composición usando una aplicación por medio de gel, pulverizador o
gota a gota a través del canal auditivo externo, es una forma de
realización de preferencia. Las formas de dosificación inyectables o
infusiones comprenden una solución de plasminógeno o plasmina en un
líquido farmacéuticamente aceptable tal como, por ejemplo, solución
salina isotónica, agua estéril o sistemas de tampones acuosos.
Una vez preparadas las composiciones
farmacéuticas, pueden colocarse en un envase adecuado y etiquetarse
para el tratamiento de una afección indicada. Para la
administración de una composición de la invención, tal etiquetado
debería incluir cantidad, frecuencia y procedimiento de
administración.
\newpage
La administración de plasminógeno puede
repetirse al menos una vez. Por ejemplo, podría administrarse
plasminógeno en intervalos regulares, por ejemplo, al menos
aproximadamente una vez cada dos días, aproximadamente una vez al
día, o aproximadamente dos veces al día, o agregarse en vendajes de
heridas o dispositivos de liberación lenta que se cambian
adecuadamente.
La invención está además descrita por medio de
los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son sólo
ilustrativos de la invención, y no limitan de ninguna manera el
alcance y significado de la invención. De hecho, tras leer esta
memoria descriptiva resultarán evidentes para los expertos en la
técnica muchas modificaciones y variaciones de la invención, y
pueden realizarse sin escapar de su espíritu y alcance.
Este Ejemplo muestra que los ratones deficientes
en plasminógeno tienen una cicatrización más lenta y anormal en
comparación con los hermanos de control de tipo salvaje. Los
estudios a corto plazo entre ratones deficientes en plasminógeno y
ratones control de tipo salvaje mostraron que ya a partir de 6 horas
tras la realización de la perforación, los ratones deficientes en
plasminógeno tuvieron una respuesta inflamatoria mucho mayor
indicando que el plasminógeno funciona tan temprano como la etapa de
inflamación de la cicatrización de la herida.
Se genotiparon ratones macho adultos,
deficientes en el gen de plasminógeno y ratones hermanos de tipo
salvaje (C57BL/6J, 8-12 semanas de edad) por medio
de un ensayo de actividad cromogénico, que determina el nivel de
plasminógeno en el plasma de los ratones (Ny y col., Endocrinology.
140(11):5030-5 (1999)) y se confirmó con
PCR. Se anestesió a los ratones y se les perforó la membrana
timpánica bajo un otomicroscopio con una lanceta de miringotomía. La
perforación ocupó el cuadrante superior posterior de la membrana
timpánica.
Genotipado de los animales con PCR. Se aisló ADN
genómico de las puntas de las colas de los ratones y se genotiparon
por PCR. Las secuencias de los pares de cebadores usados en la
reacción de PCR fueron los siguientes:
| neo: | 5' ATG ATT GAA CAA GAT GGA TTG CAC G 3' | (SEQ ID Nº 2) |
| 5' TTC GTC CAG ATC ATC CTG ATC GAC 3' | (SEQ ID Nº 3) | |
| plg: | 5' TCA GCA GGG CAA TGT CAC GG 3' | (SEQ ID Nº 4) |
| 5' CTC TCT GTC TGC CTT CCA TGG 3' | (SEQ ID Nº 5) |
"Neo" significa neomicina, que es el
marcador de resistencia usado para el desarrollo de los ratones
deficientes en el gen. Se agrega el gen de neo al genoma como un
"proyectil" para inactivar el gen. Por lo tanto una célula
deficiente en el gen carece del gen intacto pero tiene el gen de neo
insertado en su lugar.
Se realizó la PCR mediante el procedimiento
convencional. Brevemente, se llevó a cabo una desnaturalización
inicial a 94ºC durante 3 minutos seguida por 30 ciclos de
desnaturalización a 93ºC durante 30 segundos, hibridación a 55ºC
durante 30 segundos y elongación a 72ºC durante 45 segundos,
finalmente seguida por una elongación durante 5 minutos a 72ºC.
Genotipado de los animales con ensayo
cromogénico. Para ensayar el nivel de plasminógeno en plasma de
ratón, se agregó uroquinasa (ukidan) y se determinó la cantidad de
plasmina formada. Comparando la cantidad de plasmina generada entre
las diferentes muestras de plasma pudo determinarse el genotipo de
un ratón. Brevemente, se recogió sangre de la punta de la cola del
ratón en presencia de ácido cítrico 0,04 M. Se preparó el plasma
centrifugando durante 10 minutos a 3000 rpm y se almacenó a -20ºC
hasta la realización del experimento. Se incubó el plasma de ratón,
diluido 1000 veces, con uroquinasa 65 nM, lisina 10 mM y sustrato
cromogénico S-2251 80 \muM en PBS a 37ºC en una
placa (de 96 pocillos) con un volumen total de 200 \mul/pocillo.
El sustrato S-2251 se colorea cuando es escindido
por una proteinasa. Se prepararon también blancos individuales de
muestra, para compensar los diferentes colores de las muestras de
plasma, y fueron idénticos a la muestra con la excepción de que se
excluyó la uroquinasa. Se midió la absorbancia a 405 nm cada 30
minutos durante 2 horas con un lector de placas de microtitulación.
Se calculó el aumento promedio de absorbancia durante el tiempo para
cada ratón. Pudieron distinguirse los tres diferentes genotipos en
tres diferentes niveles de aumento promedio de absorbancia durante
el tiempo, alto (plg+/+), medio (plg+/-) y bajo (plg-/-).
Evaluación clínica de la cicatrización de la
herida y preparaciones histológicas. Se evaluó la apariencia de la
cicatrización de las heridas bajo un otomicroscopio a los 4, 8, 36,
72 y 144 días tras la perforación, respectivamente. En cada uno de
los tiempos, se decapitaron ratones, se limpiaron sus ampollas
timpánicas retirando el tejido blando, se abrieron y pusieron en
glutaraldehído 2% en tampón cacodilato durante la noche. Se
diseccionaron las membranas timpánicas, incluyendo la parte tensa y
la parte fláccida, se aclararon y fijaron posteriormente en
tetraóxido de osmio. Tras deshidratación en acetona, se incluyeron
las muestras en una resina epoxi. Se seccionaron las membranas
timpánicas incluidas en plástico en cortes paralelos al mango del
martillo a través del cuadrante perforado. Se examinaron las
secciones de 0,5 micrómetros teñidas con azul de toluidina en el
microscopio óptico. También se cortaron secciones ultrafinas, con
espesor de 700 nm, y se contrastaron con acetato de uranilo y
citrato de plomo para el posterior estudio mediante microscopía
electrónica.
La cicatrización de la membrana timpánica se vio
afectada en los ratones deficientes en plasminógeno, como reveló el
examen histológico y morfológico (ver Tabla 2). La Tabla 2 muestra
los resultados de la evaluación mediante el otomicroscopio de la
apariencia de la membrana timpánica, como una función del tiempo
tras la perforación. El número de membranas timpánicas claramente
cerradas se da en relación al número total examinado. El análisis
morfológico reveló que el ratón de tipo salvaje cicatrizó
perfectamente, sin embargo, todas las perforaciones en ratones
deficientes en plasminógeno tuvieron un patrón de cicatrización
totalmente interrumpido en comparación con el tipo salvaje.
La cicatrización de la membrana timpánica está
afectada permanentemente en ratones deficientes en plasminógeno.
La tabla muestra la fracción de membranas
timpánicas claramente cubiertas en cada grupo en cada momento.
Además, se evaluaron los datos de cicatrización
de ratones heterocigotas para el gen de plasminógeno. Estos ratones
tienen 50% de la concentración de plasminógeno en sus fluidos
corporales y se vio que tienen una cicatrización retardada en
comparación con los ratones de tipo salvaje. Esto muestra que el
proceso de cicatrización es dependiente de la dosis y por ello que
la administración de plasminógeno a los ratones de tipo salvaje y a
seres humanos podría acelerar el proceso de cicatrización.
Este Ejemplo demuestra que por medio de la
reconstitución del plasminógeno por administración sistémica en
ratones deficientes en plasminógeno, se convirtió el fenotipo
completamente en el de cicatrización normal de las heridas.
Este experimento se realizó de manera similar al
Ejemplo 1, excepto por la administración de plasminógeno a un grupo
de animales.
Reconstitución del plasminógeno en ratones
deficientes en plasminógeno. Se reconstituyó plasminógeno humano en
ratones deficientes en plasminógeno por medio de repetidas
inyecciones intravenosas de 1,5 mg de plasminógeno en 100 \mul de
solución salina tamponada con fosfato (PBS). La primera dosis se
administró 12 horas previo a la perforación de la membrana
timpánica. De allí en adelante, se administró plasminógeno cada 24
horas a lo largo de toda la duración del experimento.
La reconstitución del plasminógeno en ratones
deficientes en plasminógeno por inyección i.v. restauró la
cicatrización normal de heridas en los ratones deficientes en
plasminógeno. La Tabla 3 muestra los resultados de la evaluación
por medio del otomicroscopio de la apariencia de las membranas
timpánicas tras la cicatrización. El número de membranas timpánicas
cicatrizadas se da en relación con el número total examinado.
La tabla muestra la fracción de membranas
timpánicas cicatrizadas en cada grupo en cada momento.
Por consiguiente, en ratones deficientes en
plasminógeno la cicatrización de la herida en la membrana timpánica
es anormal, mientras que la cicatrización de la membrana timpánica
está restaurada en los ratones deficientes en plasminógeno tras la
administración de plasminógeno. Además, tras 144 días, ninguno de
los ratones deficientes en plasminógeno cicatrizó normalmente la
membrana timpánica, el patrón de cicatrización fue completamente
aberrante ya que la membrana timpánica se volvió gruesa y opaca, con
tejido similar a un adoquinado blanquecino cubriendo la superficie
de la herida. El análisis morfológico reveló que el tejido que llenó
el área de la herida tenía estructura similar a fibrina, lo que
indica que la migración celular se vio dificultada. Desde el Día 16
y a partir de ese momento resultó evidente la necrosis.
Se perforó la membrana timpánica (MT) de ratones
deficientes en tPA (tPA^{-/-}) y de ratones de tipo salvaje en el
día 0, y se siguió el patrón de cicatrización bajo otomicroscopio,
como se describió anteriormente. Los resultados se describen en la
Tabla 4. Los ratones deficientes en tPA retrocruzados 6 veces con
C57B1/6 de origen se cruzaron una vez con DBA1/J originales. Las
camadas heterocigotas se usaron para cría. Los descendientes de
tipo salvaje (tPA+/+) y el homocigoto (tPA-/-) de estas crías se
usaron en los experimentos de cicatrización de heridas.
La tabla muestra la fracción de membranas
timpánicas cicatrizadas en cada grupo en cada momento.
El patrón de cicatrización de la perforación de
MT en ratones tPA^{-/-} fue idéntico al de los ratones control de
tipo salvaje, y la calidad del tejido de MT cicatrizado en los
ratones tPA^{-/-} y en los controles de tipo salvaje tenían
apariencia idéntica, por el hecho de que no se observó tejido
"similar a adoquinado" ni depósitos de fibrina en la
superficie de la herida. En consecuencia, no se observaron
diferencias significativas cuantitativas ni cualitativas en la
cicatrización de membrana timpánica en ratones deficientes en tPA
comparados con los de tipo salvaje, indicando por lo tanto que el
tPA juega un papel menor, si alguno, en la cicatrización de la
membrana timpánica.
Se perforó la membrana timpánica en ratones de
tipo salvaje y en ratones deficientes en uPA (uPA^{-/-}) en el día
0, y se controló el patrón de cicatrización por otomicroscopía como
se describió anteriormente. Los resultados se presentan en la Tabla
5. Los ratones deficientes en uPA retrocruzados 6 veces con C57B1/6
originales se cruzaron una vez con DBA1/J originales. Las camadas
heterocigotas se usaron para cría. Los descendientes de tipo
salvaje (uPA+/+) y homocigota (uPA-/-) de estas crías se usaron en
los experimentos de cicatrización de heridas.
La tabla muestra la fracción de membranas
timpánicas cicatrizadas en cada grupo en cada momento.
Este experimento mostró que la cicatrización de
la perforación de la membrana timpánica en ratones deficientes en
uPA fue demorada de alguna manera en comparación con los controles
de tipo salvaje, y pudo observarse tejido similar al adoquinado,
blanquecino, con depósitos de fibrina en la superficie perforada
tras la cicatrización. Estos datos sugieren que uPA puede jugar un
papel en el proceso de cicatrización de la membrana timpánica o
heridas, afectando potencialmente la depuración de depósitos de
fibrina, aunque en un grado menor que el plasminógeno.
Este ejemplo muestra que un proceso afectado de
cicatrización puede restaurarse mediante la administración de
plasminógeno varias semanas tras la perforación de la membrana
timpánica.
Procedimientos. Se prepararon ratones
deficientes en plasminógeno (plg^{-/-}) como se describió
anteriormente. Se perforaron las membranas timpánicas en el Día 0.
En el Día 36 y a partir de allí durante 7 días, se inyectó un grupo
de ratones plg^{-/-} diariamente con 1,5 mg de plasminógeno humano
en 150 \mul de solución.
Resultados. Pudo detectarse por otomicroscopía
una reducción de la matriz extracelular acumulada anormalmente
debido a la administración de plasminógeno. Específicamente, en el
ratón deficiente en plasminógeno que recibió administraciones
diarias de plasminógeno humano, comenzó una reacción inflamatoria
que dio como resultado una exudación del material acumulado desde
la superficie de la membrana timpánica dentro de los 2 días
posteriores a la primera administración. Durante el período de 7
días de inyecciones, estos ratones mostraron una gran disminución
del espesor de la matriz extracelular anormalmente acumulada
(principalmente constituida por fibrina y tejido necrótico). Tras
este período inicial de 7 días, el patrón de cicatrización de
algunas membranas timpánicas se asemejó a la cicatrización normal.
Estos resultados indican que el plasminógeno es esencial para la
depuración de fibrina y la eliminación del tejido necrótico.
En un experimento similar de restauración de
plasminógeno, ratones deficientes en plasminógeno recibieron
plasminógeno durante los días 0-3, días
4-7 o días 8-11 tras la perforación.
Este experimento mostró que el plasminógeno fue importante durante
todas las etapas de cicatrización de la herida: la etapa
inflamatoria, la etapa de formación de tejidos y la etapa de
remodelación tisular.
Este ejemplo muestra que la cicatrización de
perforaciones de membranas timpánicas es mejorada en ratas de tipo
salvaje por la aplicación local de plasminógeno.
Procedimientos. Se perforaron diez membranas
timpánicas por grupo de estudio de animales. Se aplicaron cincuenta
\mul de PBS (control) o plasminógeno humano en una concentración
de 1 mg/ml o 10 mg/ml directamente en la perforación de la membrana
timpánica. El agregado de plasminógeno o control se repitió cada 24
horas, y se controló la reacción inflamatoria y el patrón de
cicatrización en diferentes momentos. Específicamente, se siguió la
acumulación de fluido inflamatorio en la cavidad del oído medio en
el área del ático, y se hicieron seguimientos de la contracción de
las perforaciones de MT durante las primeras 108 horas tras las
perforaciones.
Resultados. Se siguió el tiempo medio de
cicatrización en cada grupo y se muestra en la Tabla 6 a
continuación. La tabla muestra el período de tiempo promedio para
cicatrizar una perforación de la membrana timpánica para cada
grupo.
Las ratas que recibieron 10 mg/ml de
plasminógeno tuvieron la reacción inflamatoria más fuerte en el área
del ático del oído medio, mientras que las ratas que recibieron 1
mg/ml de plasminógeno exhibieron una reacción inflamatoria casi
similar a la de los controles. La cicatrización de las membranas
timpánicas más rápida se observó en el grupo con 10 mg/ml, aunque
ambos grupos que recibieron plasminógeno mostraron una contracción
mejorada de la perforación durante las primeras 108 horas en
comparación con los controles.
Con el fin de caracterizar la remodelación de
tejidos y los acontecimientos de migración celular anormales en los
ratones deficientes en plasminógeno (plg^{-/-}), se realizaron
inmunotinciones en serie de queratina, fibrina y neutrófilos en
membranas timpánicas cicatrizando/cicatrizadas de ratones de tipo
salvaje y de ratones plg^{-/-} en los días 4, 8, 16, 36, 72 y 144
tras la perforación. El anticuerpo reactivo para neutrófilos fue de
Cedarlane (Canada), el anticuerpo antiqueratina fue de ICN
Pharmaceuticals, Inc., y el anticuerpo reactivo para
fibrinógeno/fibina fue de Nordic Immunology.
Resultados. En el Día 36 y en adelante tras la
perforación, los ratones deficientes en plasminógeno tuvieron una
composición de matriz extracelular anormal en comparación con los
ratones de tipo salvaje. En los ratones deficientes en
plasminógeno, las perforaciones contenían cantidades aumentadas de
fibrina en vez de queratina, mientras que la queratina se
"mantuvo" en el borde de la perforación. Bajo el
otomicroscopio, estos depósitos de fibrina se ven como costras de
tejido "similar al adoquinado", blanquecino. También se
infiltraron grandes cantidades de neutrófilos en el área de la
herida. Además, el tejido necrótico resultó evidente en todos los
ratones deficientes en plasminógeno en el día 16 después de la
perforación y de allí en adelante. Los ratones de tipo salvaje
exhibieron una superficie de herida cicatrizada idéntica a la de los
controles de tipo salvaje normales.
Estos datos sugieren que el plasminógeno, ya sea
directamente o a través de la formación de plasmina, es importante
para prevenir o reducir los depósitos de fibrina, promover la
formación de la capa de queratina, así como para eliminar el tejido
necrótico.
La presente invención no estará limitada en
enfoque por las formas de realización específicas descritas en este
documento. De hecho, los expertos en la técnica encontrarán
evidentes diversas modificaciones de la invención además de las
descritas en este documento en la anterior descripción y en las
figuras que la acompañan. Se prevé que tales modificaciones caigan
dentro del enfoque de las reivindicaciones.
Se entenderá además que los valores son
aproximados, y se proveen para descripción.
<110> NY, Tor
\hskip1cmLI, Jlnan
\hskip1cmHELLSTROM, Sten
\hskip1cmERIKSSON, Per-Olof
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE CICATRIZACIÓN DE
HERIDAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 3810/2J759-WO0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EEUU 60/317.643
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-09-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 810
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> GenBank / 625234
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
15-09-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)...(810)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgattgaac aagatggatt gcacg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipttcgtccaga tcatcctgat cgac
\hfill24
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<210> 4
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskiptcagcagggc aatgtcacgg
\hfill20
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<210> 5
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
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<400> 21
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctctgtct gccttccatg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. El uso de un plasminógeno para preparar una
composición farmacéutica tópica para promover la cicatrización de
una perforación de membrana timpánica en un mamífero.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la composición se selecciona del grupo constituido por una
solución acuosa, un polvo o una pulverización.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el mamífero es un ser humano, y el plasminógeno es
plasminógeno humano.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la composición comprende desde aproximadamente 0,05 mg hasta
aproximadamente 10 mg de plasminógeno.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en
el que la composición comprende desde aproximadamente 0,5 mg hasta
aproximadamente 5 mg de plasminógeno.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la promoción de la cicatrización se selecciona de acelerar
la cicatrización de la perforación, reducir el tejido necrótico, y
reducir la formación de tejido cicatrizal.
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