ES2277675T3 - Metodos para tratar canceres e infecciones patogenicas utilizando celulas de presentacion de antigenos cargadas con arn. - Google Patents

Abstract

Un método para producir una célula de presentación de antígeno (APC) pulsada con ARN, comprendiendo dicho método: introducir en una célula de presentación de antígeno in vitro ARN seleccionado entre: (i) ARN que comprende ARN específico de tumores; y (ii) ARN que comprende ARN específico de patógenos, produciendo de este modo una APC pulsada con ARN.

Description

Métodos para tratar cánceres e infecciones patogénicas usando células de presentación de antígenos cargadas con ARN.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a métodos para tratar o prevenir la formación de tumores o la infección patogénica en un paciente.

Los métodos descritos anteriormente para tratar cánceres incluyen el uso de compuestos quimioterapéuticos, terapia de radiación, y cirugía selectiva. La identificación de varios antígenos tumorales ha conducido al desarrollo de terapias basadas en células. Estos métodos dependen de identificar primero un antígeno tumoral (es decir, un polipéptido que se expresa preferentemente en células tumorales, en relación con células no tumorales). Se han aislado varios antígenos tumorales humanos a partir de pacientes de melanoma, y se han identificado y aislado (Boon y van der Bruggen, J. Exp. Med. (1996) 183: 725-729). Estos antígenos polipeptídicos pueden cargarse en células de presentación de antígenos, y después pueden administrarse a pacientes en un método de inmunoterapia (es decir, como una vacuna). Como alternativa, las células de presentación de antígenos cargadas con polipéptidos pueden usarse para estimular la proliferación de CTL ex vivo. Los CTL estimulados se administran después al paciente en un método de inmunoterapia adoptiva.

Se han descrito diversos métodos para tratar infecciones con patógenos intracelulares tales como virus y bacterias. Por ejemplo, los antibióticos se usan comúnmente para tratar infecciones bacterianas. Las preparaciones de patógenos muertos también pueden servir como vacunas. Además, se han descrito terapias basadas en CTL para tratar dichas infecciones.

Celluzzi et al. (J. Exp. Med. (1996) 183: 283-287) informan de que APC dendríticas pulsadas con antígenos peptídicos presentados en MHC de clase I inducen inmunidad protectora para la estimulación letal con un tumor con el gen antigénico.

El documento WO 95/34638 informa de que la exposición ex vivo de células dendríticas humanas a inmunoglobulinas obtenidas de linfoma como antígenos, seguida de la reinfusión a un paciente de linfoma induce y/o aumenta una respuesta inmune reactiva al tumor.

Sumario de la invención

Actualmente se ha descubierto que la formación de tumores en un paciente puede tratarse o prevenirse administrando al paciente célula(s) de presentación de antígenos que se carga con un antígeno codificado en ARN obtenido de un tumor. Por conveniencia, puede usarse una preparación tumoral enriquecida en ARN en lugar de ARN. La invención evita por tanto la necesidad de purificar ARN o aislar e identificar un antígeno tumoral. Usando métodos similares y ARN obtenido de patógenos, puede tratarse o prevenirse la infección patogénica en un paciente. Las células de presentación de antígenos cargadas con ARN pueden usarse para estimular la proliferación de CTL ex vivo o in vivo. Los CTL expandidos ex vivo pueden administrarse a un paciente en un método de inmunoterapia adoptiva.

Por consiguiente, la invención presenta un método para producir una célula de presentación de antígenos (APC) pulsada con ARN; comprendiendo el método introducir en una APC in vitro un método para producir una célula de presentación de antígenos (APC) pulsada con ARN, comprendiendo dicho método introducir en una célula de presentación de antígenos in vitro, ARN seleccionado entre ARN que comprende ARN específico de tumores y ARN que comprende ARN específico de patógenos, produciendo de este modo, una APC pulsada con ARN. El ARN obtenido de tumores incluye ARN específico de tumores que codifica un epítopo antigénico de superficie celular que induce la proliferación de células T. El ARN obtenido de patógenos incluye ARN específico de patógenos que codifica un epítopo antigénico de patógenos que induce la proliferación de células T. Después de introducir ARN en una APC (es decir, "cargar" la APC con ARN), el ARN se traduce dentro de la APC, y la proteína resultante se procesa mediante las vías de procesado y presentación de MHC de clase I o clase II. La presentación de péptidos codificados por ARN da comienzo a la cadena de sucesos en la que el sistema inmune monta una respuesta a los péptidos
presentados.

Preferiblemente, la APC es una APC profesional tal como una célula dendrítica o un macrófago. Como alternativa, puede usarse cualquier APC. Por ejemplo, pueden usarse células endoteliales y APC generadas artificialmente. El ARN que se carga en la APC puede proporcionarse a la APC en forma de ARN purificado, o como una preparación fraccionada de un tumor o patógeno. El ARN puede incluir ARN poli A^{+}, que puede aislarse usando métodos convencionales (por ejemplo, usando cromatografía poli dT). El ARN citoplasmático y nuclear es útil en la invención. También es útil en la invención el ARN que codifica antígenos o epítopos tumorales o patogénicos definidos, y "minigenes" de ARN (es decir, secuencias de ARN que codifican epítopos definidos). Si se desea, puede usarse ARN específico de tumores o específico de patógenos; dicho ARN puede preparase usando técnicas conocidas en la técnica tales como hibridación sustractiva contra ARN de células no tumorales o contra virus o bacterias relacionadas pero no patogénicas.

El ARN que se carga en la APC puede aislarse a partir de una célula, o puede producirse empleando técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, puede extraerse ARN de células tumorales, transcribirse de forma inversa en ADNc, que puede amplificarse mediante PCR, y después el ADNc se transcribe en ARN para usarlo en la invención. Si se desea, puede clonarse el ADNc en un plásmido antes de que se use como plantilla para la síntesis de ARN. El ARN que se sintetiza in vitro puede, por supuesto, sintetizarse parcial o totalmente con análogos o derivados de ribonucleótidos. Dichos análogos o derivados se conocen bien en la técnica y pueden usarse, por ejemplo, para producir ARN resistentes a nucleasa. El uso de técnicas de amplificación de ARN permite obtener grandes cantidades del antígeno de ARN a partir de una pequeña cantidad de células.

El ARN puede aislarse a partir de un tejido congelado o fijado. Las muestras tumorales se aíslan comúnmente a partir de pacientes de cáncer y después se almacenan, por ejemplo en forma de secciones de tejido incluidas en parafina crioestáticas o fijadas con formalina. Puesto que los pacientes de cáncer a menudo tienen pocas células tumorales, el aislamiento de ARN a partir de tejidos fijados es particularmente ventajoso en la producción de las APC de la invención porque el método puede utilizar una pequeña muestra de tejido. Pueden usarse técnicas de microdisección para separar células tumorales de células normales. El ARN puede aislarse después a partir de las células tumorales y amplificarse in vitro (por ejemplo, mediante PCR o PCR de transcripción inversa (RT-PCR)). El ARN amplificado resultante puede usarse después para producir las APC cargadas con ARN descritas en este documento.

Si se desea, puede introducirse también ARN que codifica un inmunomodulador en la APC cargada con ARN obtenido de tumores u obtenido de patógenos. En esta realización el inmunomodulador codificado por ARN se expresa en la APC y potencia el efecto terapéutico (por ejemplo, en forma de vacunas) de las APC cargadas con ARN. Preferiblemente, el inmunomodulador es una citoquina o un factor coestimulador (por ejemplo, una interleuquina, tal como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, o IL-15, o GM-CSF).

Para introducir ARN en una APC, puede ponerse en contacto la APC con el ARN obtenido de tumores o patógenos en presencia de un lípido catiónico, tal como DOTAP o DOTMA:DOPE 1:1 (p/p) (es decir, LIPOFECTIN). Como alternativa, puede introducirse ARN "desnudo" en las células. También pueden usarse otros métodos de transfección conocidos en la técnica para introducir el ARN en la APC.

En una variación de los métodos anteriores, el ARN que se introduce en la APC puede manipularse de modo que codifique una secuencia señal de tránsito celular además del antígeno tumoral o antígeno patogénico. Puede pensarse que dicho ARN manipulado contiene dos secuencias de ARN que están unidas de forma covalente y que dirigen la expresión de un polipéptido quimérico. Un ARN codifica el antígeno tumoral o patogénico, mientras que la otra secuencia de ARN codifica la secuencia de tránsito celular, formando de este modo un polipéptido quimérico. Los polipéptidos quiméricos que contienen un antígeno unido a una secuencia de tránsito se canalizan en la vía de presentación de antígenos MHC de clase II. A continuación se proporcionan ejemplos de secuencias de tránsito adecuadas.

Puesto que poner en práctica la invención no requiere identificar un antígeno de la célula tumoral o patógeno, el ARN obtenido de esencialmente cualquier tipo de tumor o patógeno es útil. Por ejemplo, la invención es aplicable, pero no se limita a, el desarrollo de productos terapéuticos para tratar melanomas, cánceres de vejiga, cánceres de mama, cánceres pancreáticos, cánceres de próstata, cánceres de colon, y cánceres de ovario. Además, la invención puede tratar o prevenir infecciones con patógenos tales como Salmonella, Shigella, Enterobacter, virus de la inmunodeficiencia humana, Herpes virus, virus de la gripe, virus de la poliomielitis, virus del sarampión, virus de las paperas, o virus de la rubéola.

Las células de presentación de antígenos producidas de acuerdo con la invención pueden usarse para inducir respuestas de CTL in vivo y ex vivo. Por tanto, la invención se refiere a métodos para tratar o prevenir la formación de tumores en un paciente administrando al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de APC cargada con ARN obtenido de tumores. El ARN obtenido de tumores puede obtenerse del paciente, por ejemplo, en forma de una preparación tumoral enriquecida en ARN. Como alternativa, el ARN obtenido de tumores usado en dicho régimen de tratamiento, puede obtenerse de otro paciente aquejado del mismo, o similar, tipo de cáncer. Del mismo modo, puede usarse APC cargada con ARN obtenido de patógenos para tratar o prevenir una infección patogénica en un paciente.

En este documento también se describen métodos para producir un linfocito T citotóxico. Dicho CTL puede producirse poniendo en contacto un linfocito T in vitro con una célula de presentación de antígenos que esté cargada con ARN obtenido de tumores u obtenido de patógenos, y manteniendo el linfocito T en condiciones que conducen a la proliferación de CTL, produciendo de este modo un CTL. El CTL resultante muestra una notable especificidad por el patógeno o las células del tumor de las que se obtiene el ARN cargado. Dicho CTL puede administrarse al paciente en una variación de los métodos de inmunoterapia adoptiva convencionales. Si se desea, puede ensayarse la sensibilización (es decir, activación) del CTL. Con este fin, puede usarse cualquiera de los ensayos conocidos en la técnica, tales como ensayos de citotoxicidad. Por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad puede incluir detectar la destrucción de una(s) célula(s) cargada(s) de ARN (por ejemplo, fibroblastos o células dendríticas producidas como se describe en este documento (es decir, una célula cargada con ARN) que presenta en su superficie un epítopo antigénico tumoral o un epítopo antigénico patogénico codificado por el ARN). Otro método adecuado para detectar sensibilización de CTL es detectando un aumento en la secreción de citoquina, en relación con el nivel de secreción de citoquina (por ejemplo, interferón TNF-\alpha o -\gamma) obtenido antes de poner en contacto el CTL (por ejemplo, en un inmunoensayo in situ, tal como un ensayo ELISPOT).

Una variación de los métodos anteriores en un método para generar una respuesta de CTL específica de tumores (o específica de patógenos). Puesto que la mayoría de los pacientes de cáncer muestran de forma natural una respuesta de CTL específica de tumores no detectable o mala, este método es particularmente útil ya que proporciona un método para producir una respuesta de CTL usando antígenos obtenidos de cualquier paciente. Una vez que se ha generado una respuesta de CTL, pueden usarse métodos convencionales para identificar los antígenos que inducen la respuesta de CTL. Por ejemplo, pueden fraccionarse antígenos en extractos tumorales (por ejemplo, mediante HPLC), y las fracciones pueden someterse a ensayos para determinar que fracción contiene un antígeno que es reconocido por el CTL específico de tumores producido de acuerdo con la invención. Este método sirve por tanto como plataforma para el descubrimiento de antígenos. El método implica:

a) introducir en una célula de presentación de antígenos in vitro, ARN poli A^{+} que incluye al menos el 80% (preferiblemente al menos el 90% o el 100%) de las especies de ARN poli A^{+}, produciendo de este modo una APC cargada con ARN; y

b) poner en contacto linfocitos T con la APC cargada con ARN, produciendo de este modo una respuesta de CTL específica de tumores o específica de patógenos. Si se desea, puede detectarse la inducción de dicha respuesta de CTL detectando la sensibilización del linfocito T puesto en contacto usando los métodos descritos en este documento. Al poner en práctica este método, se usará típicamente ARN obtenido de tumores (u obtenido de patógenos) total, no fraccionado, para producir la APC cargada con ARN, puesto que es seguro que el ARN total contiene una especie de ARN que codifica el antígeno tumoral (o antígeno patogénico).

En este documento también se describen métodos para tratar o prevenir la formación de tumores en un paciente administrando al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de APC cargada con ARN obtenido de tumores. Análogamente, la invención proporciona métodos para tratar una infección patogénica en un paciente administrando al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de APC cargada con ARN obtenido de patógenos. Los linfocitos T que se usan en estos diversos métodos terapéuticos pueden obtenerse del paciente a tratar, o pueden usarse CTL de haplotipo compatible de un donante. Análogamente, el ARN usado en estos métodos puede obtenerse de un paciente a tratar, o puede usarse ARN de un donante.

Por célula de presentación de antígenos "cargada con ARN" o "pulsada con ARN" se entiende una APC (por ejemplo, un macrófago o célula dendrítica) que se incubó o transfectó con ARN, por ejemplo, ARN obtenido de un tumor o un patógeno. Dicho ARN puede cargarse en la APC usando métodos convencionales de transfección de ácidos nucleicos, tales como transfección mediada por lípidos, electroporación, y transfección con fosfato cálcico. Por ejemplo, puede introducirse ARN en una APC incubando la APC con el ARN (o extracto) durante 1 a 24 horas (por ejemplo, 2 horas) a 37ºC, preferiblemente en presencia de un lípido catiónico.

Por ARN "obtenido de tumores" se entiende una muestra de ARN que tiene su origen en una célula tumoral, y que incluye ARN correspondiente a un(os) antígeno(s) tumoral(es). Se incluye ARN que codifica todo o una porción de un antígeno tumoral identificado previamente. Análogamente, ARN "obtenido de patógenos" es una muestra de ARN que tiene su origen en un patógeno (por ejemplo, una bacteria o un virus, incluyendo patógenos intracelulares). Dicho ARN puede "transcribirse in vitro", por ejemplo, transcribirse de forma inversa para producir ADNc que puede amplificarse por PCR y posteriormente transcribirse in vitro, con o sin clonar el ADNc. También se incluye ARN que se proporciona en forma de una preparación fraccionada de una célula tumoral o patógeno. Puesto que puede usarse incluso una preparación de ARN no fraccionado (por ejemplo ARN total o ARN poli A+ total), no es necesario que se identifique un antígeno tumoral o patogénico. En una realización, la preparación se fracciona con respecto a el(los) componente(s) no ARN de la célula para disminuir la concentración de un componente no ARN, tal como proteínas, lípidos, y/o ADN y enriquecer la preparación en ARN. Si se desea, la preparación puede fraccionarse adicionalmente con respecto al ARN (por ejemplo, mediante hibridación sustractiva) de modo que se produce ARN "específico de tumores" o "específico de patógenos".

Por ARN "específico de tumores" se entiende una muestra de ARN que, en relación con ARN obtenido de tumores no fraccionado, tiene un alto contenido de ARN que esta preferentemente presente en una célula tumoral en comparación con una célula no tumoral. Por ejemplo, ARN específico de tumores incluye ARN que está presente en una célula tumoral, pero no está presente en una célula no tumoral. Esta definición también abarca una muestra de ARN que incluye ARN que está presente en células tumorales y no tumorales, pero que está presente a un nivel más alto en células tumorales que en células no tumorales. Esta definición también incluye ARN que codifica un antígeno tumoral identificado previamente y que se produce in vitro, por ejemplo, a partir de un plásmido o mediante PCR. Como alternativa, puede preparase ARN específico de tumores fraccionando una muestra de ARN de modo que el porcentaje de ARN correspondiente al antígeno tumoral aumente, en relación con el ARN obtenido de tumores no fraccionado. Por ejemplo, puede prepararse ARN específico de tumores fraccionando ARN obtenido de tumores usando técnicas de hibridación sustractiva convencionales contra ARN de células no tumorales. Del mismo modo, ARN "específico de patógenos" se refiere a una muestra de ARN que, en relación con ARN obtenido de patógenos no fraccionado, tiene un contenido de ARN más alto que preferentemente presente en el patógeno en comparación con una cepa no patogénica de bacterias o virus.

Por "secuencia de tránsito" se entiende una secuencia de aminoácidos (o un ARN que codifica una secuencia de aminoácidos) que funciona para controlar el tránsito intracelular (por ejemplo, el movimiento directo de orgánulo a orgánulo o a la superficie celular) de un polipéptido al que esta unida.

La invención ofrece varias ventajas. Las vacunaciones realizadas de acuerdo con la invención evitan la necesidad de identificar antígenos de rechazo tumoral o antígenos patogénicos específicos, porque el(los) antígeno(s) correcto(s) se selecciona(n) automáticamente entre el ARN obtenido de tumores o patógenos cuando se usa ARN no fraccionado. Si se desea, puede disminuirse el riesgo de generar una respuesta autoinmune usando ARN específico de tumores. Además, la vacunación con células cargadas con ARN obtenido de tumores no fraccionado es probable que produzca respuestas a varios antígenos tumorales, reduciendo la posibilidad de "mutantes de fuga". Puede usarse inmunoterapia activa para tratar cánceres para los que todavía no se han identificado antígenos tumorales, que son la gran mayoría de cánceres. Además, el ARN a introducir en APC puede obtenerse de muestras de tejido fijadas. Las muestras fijadas de tejidos tumorales se preparan de forma rutinaria en el transcurso del diagnóstico de cáncer; por tanto, el uso de ARN de dichas muestras no requiere someter al paciente a un procedimiento invasivo adicional. Puesto que la mayoría de los pacientes de cáncer tienen cargas tumorales bajas, los métodos descritos en este documento que implican aislamiento y amplificación de ARN de muestras de tejido fijadas son particularmente valiosos. Los métodos descritos en este documento pueden usarse eficazmente incluso si el propio tumor muestra poca inmunogenicidad. Además, las APC descritas en este documento son útiles para reducir el tamaño de tumores preexistentes, incluyendo metástasis incluso después de la retirada del tumor principal. Finalmente, la invención ofrece la ventaja de que las células de presentación de antígenos que se cargan con ARN transcrito in vitro pueden ser vacunas más potentes de lo que son las células de presentación de antígenos que se cargan con antígenos peptídicos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que ilustra la inducción primaria de CTL específicos de OVA con células dendríticas pulsadas con ARN. Las DC se pulsaron con ARN total o ARN poli A^{+} obtenido de E.G7-OVA o células EL4, o ARN de OVA transcrito in vitro en presencia del lípido catiónico DOTAP como se describe en este documento. Las DC pulsadas con el péptido OVA se usaron para comparación. Se incubaron DC y células T sin tratamiento previo durante 5 días a una R/S de 20:1. Se recogieron linfocitos viables, y se determino la actividad de CTL en un ensayo rutinario de liberación de europio. Se usaron como diana células E.G7-OVA y EL4. Este experimento se repitió tres veces con similares resultados.

La Fig. 2 es un gráfico que ilustra que la sensibilización de DC pulsadas con ARN de E.G7-OVA para la estimulación de respuestas de CTL primarias específicas de OVA está mediada por la fracción poli A^{+} del ARN. Se pulsaron DC con ARN total, ARN poli A^{-} o ARN poli A^{+}, y se cultivaron con células T sin tratamiento previo en placas de fondo en forma de U de 96 pocillos durante 5 días. La fracción poli A^{+} del ARN de células E.G7-OVA se trató con un oligonucleótido antisentido específico para el epítopo de CTL que codifica la región del gen OVA, o un oligonucleótido de control seguido de tratamiento mediante ARNasa H para eliminar el ARN hibridado. Se usaron DC pulsadas con péptido OVA como control. Se usaron como diana células E.G7-OVA, EL4 y RMA pulsadas con el péptido OVA.

La Fig. 3 es un histograma que representa la inducción de inmunidad anti-tumoral in vivo en ratones después de una única inmunización con DC pulsadas con ARN. Se pulsaron DC con ARN total o poli A^{+} de células E.G7-OVA o células EL4, o ARN de OVA transcrito in vitro o ARN de OVA antisentido de control. Los ratones se inmunizaron con 2 x 10^{6} DC o 5 x 10^{6} células E.G7-OVA o EL4 irradiadas inyectadas por vía intraperitoneal, seguidas de una estimulación con 2 x 10^{7} células E.G7-OVA vivas. Se examinaron periódicamente los ratones para el crecimiento tumoral, y se sacrificaron cuando el diámetro del tumor alcanzó 3-4 cm. Todos los ratones se sacrificaron a los 35-40 días después de la estimulación.

La Fig. 4 es un histograma que representa la regresión de metástasis espontánea en ratones vacunados con DC pulsadas con ARN poli A^{+} o ARN total en el modelo de melanoma B16-F10.9. Los ratones recibieron mediante inyección en las almohadillas plantares, células F10.9 vivas, y las patas se amputaron cuando el diámetro del tumor alcanzó 5,5-7,5 mm. Las vacunaciones se iniciaron 2 días después de la amputación, y se siguieron con dos vacunaciones más a intervalos semanales. Los ratones se vacunaron por vía intraperitoneal con 2 x 10^{6} DC pulsadas con ARN total, poli A^{-} o poli A^{+}, o células F10.9 irradiadas o células F10.9/Kl, o PBS (como control). Los ratones se sacrificaron en base a la muerte metastásica en los grupos no inmunizados o de control (28-32 días después de la amputación). Se ensayaron las cargas metastásicas pesando los pulmones y contando la cantidad de nódulos metastásicos.

Descripción detallada

Antes de proporcionar ejemplos detallados del funcionamiento de la invención, se describirán de forma general ciertos parámetros de la invención.

Diversos métodos son adecuados para producir el ARN obtenido de tumores o patógenos que puede usarse en la invención. Como ilustran los siguientes ejemplos, no es necesario que se proporcione el ARN a la APC de forma purificada. Preferiblemente, la muestra de ARN (es decir, la preparación tumoral fraccionada o muestra de ARN IVT) el al menos el 50%, más preferiblemente el 75%, 90% o incluso el 99% de ARN (p/vol). Al poner en práctica la invención, se usan células de presentación de antígenos, preferiblemente APC profesionales tales como células dendríticas y macrófagos. Dichas células pueden aislarse de acuerdo con procedimientos descritos anteriormente.

Puede usarse cualquiera de diversos métodos para producir preparaciones tumorales que contienen ARN. Por ejemplo, las preparaciones tumorales pueden producirse sonicando células tumorales en un medio de cultivo de células de mamífero tal como Opti-MEM o un tampón tal como solución salina tamponada con fosfato. Análogamente, puede producirse ARN obtenido de patógenos sonicando bacterias patógenas o células que contienen un virus patógeno. Otros métodos para alterar células también son adecuados, siempre que el método no degrade completamente el ARN obtenido de tumores o de patógenos. Típicamente, la preparación de ARN tiene 10^{6} a 10^{8} células/ml; más preferiblemente 10^{7} células/ml. como alternativas a, o además de la sonicación, el ARN obtenido de tumores o de patógenos puede preparase empleando métodos de purificación de ARN convencionales tales como métodos de isocianato de guanidina y/o métodos de cromatografía oligo dT para aislar ARN poli A^{+}. Puede usarse ARN IVT, sintetizado de acuerdo con métodos convencionales, en lugar de ARN en preparaciones tumorales. Por ejemplo, puede transcribirse de forma inversa ARN de un tumor o patógeno en ADNc, que después se amplifica mediante técnicas de PCR convencionales para proporcionar un suministro esencialmente ilimitado de ADNc correspondiente al antígeno de ARN tumoral o patogénico. Después se usan técnicas de transcripción in vitro y polimerasas bacterianas convencionales para producir el ARN IVT. Como alternativa, el ARN IVT puede sintetizarse a partir de una secuencia de ADN clonada que codifica un antígeno polipeptídico tumoral o patogénico. En la técnica se conocen métodos para identificar dichos antígenos; por ejemplo, se han identificado varios antígenos peptídicos de melanoma. El ARN transcrito in vitro a partir de ADNc que codifica antígenos peptídicos identificados puede servir como ARN específico de tumores o de patógenos en la invención. Como alternativa, puede transcribirse ARN a partir de "minigenes" compuestos por una porción del ADNc del antígeno tumoral que codifica un epítopo. También puede producirse ARN específico de tumores o de patógenos empleando técnicas convencionales para hibridación sustractiva. Por ejemplo, puede usarse una muestra de ARN de células tumorales y células no tumorales en el método de hibridación sustractiva para obtener ARN específico de tumores.

Si se desea, puede prepararse el ARN obtenido de tumores u obtenido de patógenos a partir de tejidos congelados o fijados. Aunque no se requiere, la muestra de tejido puede enriquecerse en ARN específico de tumores. Se han descrito técnicas de microdisección que son adecuadas para separar células tumorales de células no tumorales (Zhuang et al., 1995, Cancer Res. 55: 467-471; Luqmani et al., 1992, Analy. Biochem. 200: 291-195; Luqmani et al., 1994, Analy. Biochem. 222: 102-109; Turbett et al., 1996, BioTech. 20: 846-853). Una vez que las células tumorales se han separado de las células no tumorales, puede aislarse ARN obtenido de tumores a partir de las células tumorales usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede aislarse ARN poli A^{+} obtenido de tumores hibridando el ARN a una fase sólida, tal como oligo(dT) unida a perlas paramagnéticas (véase, por ejemplo, Ranieri et al., 1991, Nucl. Acids. Res. 19: 4010). La primera cadena de ADNc se sintetiza después mediante transcripción inversa, se retira el ARN, y se sintetiza la segunda cadena (por ejemplo, con ADN polimerasa). Después pueden usarse métodos de transcripción in vitro convencionales para sintetizar el ARN. También pueden usarse en la invención otros métodos conocidos en la técnica para amplificar ARN a partir de una pequeña cantidad de células, o incluso una única célula.

Una molécula de ARN que codifica un epítopo antigénico tumoral o patogénico puede, si se desea, manipularse de modo que codifique también una secuencia señal de tránsito celular. Dicha molécula de ARN quimérica puede producirse usando técnicas de biología molecular convencionales. El ARN quimérico que se introduce en una APC codifica un polipéptido quimérico, que contiene un antígeno unido a una secuencia de tránsito que dirige el polipéptido quimérico a la vía de presentación de antígeno MHC de clase II. Por ejemplo, las secuencias de tránsito empleadas en esta realización de la invención pueden dirigir el tránsito del polipéptido al retículo endoplasmático (RE), un lisosoma, o un endosoma, e incluyen péptidos señal (las secuencias amino terminal que dirigen proteínas al RE durante la traducción), péptidos de retención en RE tales como KDEL (SEC ID Nº 1); y péptidos que se dirigen a lisosomas tales como KFERQ (SEC ID Nº 2), QREK (SEC ID Nº 3), y otros pentapéptidos que tienen Q flanqueado en un lado por cuatro restos seleccionados entre K, R, D, E, F, I, V, y L. Un péptido señal preferido que puede usarse en la invención es la señal de separación LAMP-1 (Wu et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 11671.11675; Lin et al., 1996, Cancer Research 56: 21-26). Otro ejemplo de un péptido señal que es útil en la invención es un péptido señal sustancialmente idéntico al de una subunidad de MHC tal como \alpha o \beta de clase II; por ejemplo, el péptido señal de MHC de clase II \alpha está contenido en la secuencia MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA (SEC ID Nº 4). Si se desea, el péptido señal codificado por el ARN de la invención puede incluir solamente una porción (típicamente al menos diez restos de aminoácidos) de la secuencia de 25 restos especificada, siempre que esta porción cause el tránsito del polipéptido al RE.

Los métodos de transfección que son adecuados para introducir el ARN obtenido de tumores o de patógenos en una célula de presentación de antígenos se conocen en la técnica. Por ejemplo, pueden mezclarse 5-50 \mug de ARN en 500 \mul de Opti-MEM con un lípido catiónico a una concentración de 10 a 100 \mug, e incubarse a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Otros lípidos adecuados incluyen LIPOFECTIN^{TM} (1:1 (p/p) DOTMA:DOPE), LIPOFECTAMINE^{TM} (3:1 (p/p) DOSPA:DOPE), DODAC:DOPE (1:1), CHOL:DOPE (1:1), DMEDA, CHOL, DDAB, DMEDA, DODAC, DOPE, DORI, DORIE, DOSPA, DOTAP, y DOTMA. El complejo ARN-lípido resultante se añade después a 1-3 x 106 células, preferiblemente 2 x 10^{6}, células de presentación de antígenos en un volumen total de aproximadamente 2 ml (por ejemplo, en OptiMEM), y se incuba a 37ºC durante 2 a 4 horas. Como alternativa, el ARN puede introducirse en las células de presentación de antígenos empleando técnicas convencionales, tales como electroporación o transfección con fosfato cálcico con 1-5 x 10^{6} células y 5 a 50 \mug de ARN. Típicamente, se usan 5-20 \mug de ARN poli A^{+} o 25-50 \mug de ARN total.

Cuando el ARN se proporciona en forma de una preparación tumoral o patogénica, la preparación típicamente se fracciona o se trata de otra manera para disminuir la concentración de proteínas, lípidos y/o ADN en la preparación, y enriquecer la preparación en ARN. Por ejemplo, pueden usarse métodos de purificación de ARN conocidos en la técnica para purificar al menos parcialmente el ARN de la célula tumoral o patógeno. También es aceptable tratar la preparación de ARN con proteasas o ADNasas libres de ARNasas. Por supuesto, puede sintetizarse el ARN usando análogos o derivados resistentes a nucleasa conocidos en la técnica para convertir al ARN en menos susceptible a ribonucleasas.

Si se desea, puede introducirse ARN que codifica un inmunomodulador, tal como una citoquina o un factor co-estimulador, en las APC cargadas con ARN de la invención. En esta realización de la invención, el ARN que codifica el inmunomodulador puede introducirse en la APC antes de, simultáneamente con, o posteriormente a la introducción del ARN obtenido de tumores o de patógenos. Los métodos descritos en este documento para introducir el ARN obtenido de tumores o de patógenos en la APC también son adecuados para introducir en la APC ARN que codifique un inmunomodulador (por ejemplo, una citoquina o un factor co-estimulador). En la técnica se conocen secuencias que codifican numerosas proteínas y pueden usarse en la invención. Si se desea, puede introducirse ARN que codifica dos o más inmunomoduladores, en la APC. Típicamente, se introducen 5-20 \mug de cada ARN en la APC, como se ha descrito anteriormente para ARN obtenido de tumores y de patógenos.

Las células de presentación de antígenos cargadas con ARN de la invención pueden usarse para estimular la proliferación de CTL in vivo o ex vivo. La capacidad de las células de presentación de antígenos cargadas con ARN para estimular una respuesta de CTL puede medirse o detectarse midiendo o detectando activación de células-T, por ejemplo, en un ensayo de citotoxicidad convencional. En los ejemplos que se proporcionan a continuación, el ensayo de citotoxicidad implica ensayar la capacidad de las células efectoras para lisar células diana. Si se desea, las células diana pueden ser APC cargadas con ARN producidas de acuerdo con la invención (es decir, APC que presentan un epítopo antigénico tumoral o patogénico de superficie celular codificado por ARN que induce la proliferación de células T). Como se describe a continuación, el ensayo de liberación de eropio usado comúnmente puede usarse después para ensayar la sensibilización de CTL. Típicamente, se marcan 5-10 x 10^{6} células con pentaacetato de eropio dietilenetriamina durante 20 minutos a 4ºC. Después de varios lavados, se incuban 10^{4} células dianas marcadas con eropio y diluciones seriadas de células efectoras a una proporción efectora:diana que varía de 50:1 a 6,25:1 en 200 \mul de RPMI 1640 con suero fetal de ternero inactivado por calor al 10% en placas de 96 pocillos. Las placas se centrifugan a 500 x g durante 3 minutos y después se incuban a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 4 horas. Se recoge una alícuota de 50 \mul del sobrenadante, y se mide la liberación de eropio mediante fluorescencia resuelta en el tiempo (Volgmann et al., J. Immunol. Methods 119: 45-51, 1989).

En un método alternativo para detectar sensibilización de CTL, se detecta un aumento en la secreción de citoquina por el CTL, en relación al nivel de secreción de citoquina antes de poner en contacto el CTL con una APC cargada con ARN. Pueden usarse ensayos de hibridación in situ, tales como ensayos ELISPOT para detectar la secreción de citoquinas tales como TNF-\alpha y/o interferón-\gamma.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos de funcionamiento pretenden ilustrar, no limitar, la invención. En primer lugar, se describen los métodos usados en estos ejemplos.

Ratones

Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6 (H-2^{b}) de siete a ocho semanas de edad y retirados de la cría del Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Líneas Celulares

El clon F10.9 del melanoma B16 de origen C57BL/6, es una línea celular de baja expresión de clase I, poco inmunogénica y altamente metastásica. F10.9/K1 es una línea celular poco metastásica y altamente inmunogénica obtenida de transfectar células F10.9 con molécula de clase I, ADNc H-2K^{b}. Las células RMA y RMA-S se obtienen de células T de linfoma RBL-5 inducidas con virus de la leucemia Rauscher, de origen C57BL/6 (H-2^{b}). Otras líneas celulares usadas fueron EL4 (C57BL/6, H-2^{b}, timoma), E.G7-OVA (células EL4 transfectadas con el ADNc de ovoalbúmina de pollo (OVA), A20(célula B de linfoma H-2^{d}) y L929 (fibroblastos H-2^{k}). Las células se mantuvieron en DMEM suplementado con suero fetal de ternero (FCS) al 10%, Hepes 25 mM, L-glutamina 2 mM y piruvato sódico 1 mM. Las células E.G7-OVA se mantuvieron en medio suplementado con 400 \mug/ml de G418 (GIBCO, Grand Island, NY) y las células F10.9/K1 se mantuvieron en medio que contenía 800 \mug/ml de G418.

Células de presentación de antígenos y células T de respuesta

Se trataron esplenocitos obtenidos de hembras C57BL/6 retiradas de la cría sin tratamiento previo, con tampón Tris cloruro de amonio durante 3 minutos a 37ºC para agotar los glóbulos rojos. Se pusieron en capas los esplenocitos (3 ml) a 2 x 10^{7} células/ml sobre una columna de gradiente de metrizamida de 2 ml (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway; calidad analítica, 14,5 g añadidos a 100 ml de PBS, pH 7,0) y se centrifugaron a 600 g durante 10 minutos. La fracción enriquecida en célula dendríticas del interfaz se enriqueció adicionalmente mediante adherencia durante 90 minutos. Las células adherentes (en su mayor parte células dendríticas (DC) y varios macrófagos contaminantes (M_{\diameter}) se recuperaron raspando suavemente, y se sometieron a una segunda vuelta de adherencia a 37ºC durante 90 minutos para agotar los M_{\diameter} contaminantes. Las células no adherentes se reunieron como DC esplénicas y el análisis de FACS mostró aproximadamente el 80% - 85% de DC (mAb 33D1), 1-2% de M_{\diameter} (mAb F4/80), 10% de células T, y < 5% de células B (no se muestran los datos).

El sedimento se resuspendió y se enriqueció en M_{\diameter} mediante dos vueltas de adherencia a 37ºC durante 90 minutos cada una.

Más del 80% de la población adherente se identifico como M_{\diameter} mediante análisis FACS, con 5% de linfocitos y < del 55% de DC.

Las células B se separaron de la población no adherente (células B y T) lavando en placas recubiertas de anti-Ig. La población celular separada, que estaba compuesta por > 80% mediante análisis FACS se uso como células T de respuesta.

Aislamiento de ARN total y poli A^{+} celular

El ARN total se aisló a partir de células de cultivo tisular con crecimiento activo como se ha descrito previamente (Chomczynski y Sacchi, 1987, Analy. Biochem. 162: 156-159). En resumen, se lisaron 10^{7} células en 1 ml de tampón isotiocianato de guanidinio (GT) (isotiocianato de guanidinio 4 M, citrato sódico 25 mM, pH 7,0; sarcosyl al 0,5%, EDTA 20 mM, y 2-mercaptoetanol 0,1 M). Las muestras se agitaron en vórtice, seguido de adición secuencial de 100 \mul de acetato sódico 3 M, 1 ml de fenol saturado en agua y 200 \mul de clorofromo:alcohol isoamílico (49:1). Las suspensiones se agitaron en vórtice y después se colocaron en hielo durante 15 minutos. Los tubos se centrifugaron a 10000 x g, a 4ºC durante 20 minutos, y el sobrenadante se transfirió cuidadosamente a un tubo recién preparado. Se añadió un volumen igual de isopropanol y las muestras se colocaron a -20ºC durante al menos 1 hora. El ARN se sedimento mediante centrifugado como anteriormente. El sedimento se resuspendió en 300 \mul de tampón GT, y después se transfirió a un tubo de microcentrífuga. El ARN se precipitó de nuevo añadiendo un volumen igual de isopropanol y colocando el tubo a -20ºC durante al menos 1 hora. Los tubos se microcentrifugaron a alta velocidad a 4ºC durante 20 minutos. Se decantaron los sobrenadantes, y los sedimentos se lavaron una vez con etanol al 70%. Se dejaron secar los sedimentos a temperatura ambiente y después se resuspendieron en TA (Tris-HCl 10 mM, EDTA1 mM, pH 7,4). El posible ADN contaminante se retiró incubando la muestra de ARN en MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM y 5 U/ml de ADNasa libre de ARNasa (Boehringer-Mannheim) durante 15 minutos a 37ºC. La solución se ajustó a Tris 10 mM, EDTA 10 mM, SDS al 0,5% y 1 mg/ml de pronasa (Boehringer-Mannheim), seguido de incubación a 37ºC durante 30 minutos. Las muestras se extrajeron una vez con fenol-cloroformo y una vez con cloroformo; el ARN se precipitó de nuevo en isopropanol a -20ºC. Después del centrifugado, los sedimentos se lavaron con etanol al 70%, después se secaron ala aire y se resuspendieron en agua estéril. Se cuantificó el ARN total midiendo la densidad óptica (DO) a 260 y 280 nm. Las proporciones de DO 260/280 fueron típicamente 1,65-2,0. El ARN se almacenó a -70ºC.

El ARN poli A^{+} se aisló a partir de ARN total usando un kit de purificación de poli A^{+} OLIGOTEX^{TM} (Qiagen), o directamente a partir de células de cultivo tisular usando el kit de aislamiento de ARN Messenger (Stratagene) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Si se desea, pueden usarse métodos alternativos convencionales para preparar ARN poli A^{+}.

Producción de ARN transcrito in vitro

Se clonó el fragmento EcoRI de 1,9 kb de ADNc de ovoalbúmina de pollo en pUC18 (McReynolods et al., 1978, Nature 273:723) que contenía la región codificante y la región 3' sin traducir, en el sitio EcoRI de pGEM4Z (Promega). Se aislaron clones que contenían el inserto en orientaciones sentido y antisentido, y se fabricaron preparaciones de plásmidos a gran escala usando el kit de preparación de plásmidos Maxi Prep Kits TM (Qiagen). Los plásmidos se linealizaron con BamHI para uso como plantillas para transcripción in vitro. La transcripción se realizó a 37ºC durante 3-4 horas usando el MEGAscript In Vitro Transcription Kit TM (Ambion) de acuerdo con el protocolo del fabricante y ajustando la concentración de GTP a 1,5 mM e incluyendo análogo de recubrimiento m^{7}G (5^{1}) ppp (5^{1}) G (Ambion) 6 mM. También son adecuados otros métodos de transcripción in vitro convencionales. La plantilla de ADN se digirió con ADNasa libre de ARNasa 1, y se recuperó el ARN mediante extracción con fenol:cloroformo y cloroformo, seguida de precipitación con isopropanol. El ARN se precipitó mediante microcentrifugado, y el sedimento se lavó una vez con etanol al 70%. El sedimento se secó al aire y se resuspendió en agua estéril.

Se incubó el ARN durante 30 minutos a 30ºC en Tris-HCl 20 mM, pH 7,0, KCl 50 mM, MnCl_{2} 0,7 mM, EDTA 0,2 mM, 100 \mug/ml de BSA acetilado, glicerol al 10%, ATP 1 mM y 5000 U/ml de poli (A) polimerasa de levadura (United States Biochemical). El ARN recubierto, poliadenilado se recuperó mediante extracción con fenol:cloroformo y cloroformo seguida de precipitación con isopropanol. El ARN se precipitó mediante microcentrifugado, y el sedimento se lavó una vez con etanol al 70%. El sedimento se secó al aire y se resuspendió en agua estéril. El ARN se cuantificó midiendo la DO a 260 y 280 nm, y el ARN se almacenó a -70ºC.

Escisión dirigida por oligodesoxinucleótidos de ARNm de OVA mediante ARNasa H

El procedimiento usado para la escisión específica de sitio con ARNasa H de ARNm de ovoalbúmina se adapto de los descritos anteriormente (Donis-Keller, 1979, Nucl. Acid. Res. 7: 179-192). En resumen, se suspendieron 5-10 \mug de ARNm de células E.G7-OVA en HEPES-KOH 20 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, MgCl_{2} 4 mM, DTT 1 mM, 50 \mug/ml de BSA y 2 \muM del oligodesoxinucleótido 5' -CAG TTT TTC AAA GTT GAT TAT ACT- 3' (SEC ID Nº 5), que hibrida con la secuencia en ARNm de OVA que codifica el epítopo SIINFEKL (SEC ID Nº 6), o del 5' -TCA TAT TAG TTG AAA CTT TTT GAC- 3' (SEC ID Nº 7) (Oligos, Etc.), que sirve como control negativo. Las muestras se calentaron a 50ºC durante 3 minutos seguido de incubación a 37ºC durante 30 minutos. Se añadió ARNasa H (Boehringer-Mannheim) a 10 U/ml, y la digestión se desarrolló durante 30 minutos a 37ºC. El ARN se recuperó mediante extracción con fenol:cloroformo y cloroformo seguida de precipitación con isopropanol. El ARN se precipitó mediante microcentrifugado, y el sedimento se lavó una vez con etanol al 70%. El sedimento se secó después al aire y se resuspendió en agua estéril. La escisión del ARNm de OVA se confirmó mediante transcripción inversa preparada con oligo dT de muestras de ensayo y de control, seguida de PCR con cebadores específicos de OVA que flanquean el sitio de escisión. Se usó PCR con cebadores específicos de actina para el control entre las muestras de ensayo y de control.

Pulsado sobre APC

Se lavaron APC dos veces en medio Opti-MEM (GIBCO, Grand Island, NY). Las células se resuspendieron en medio Opti-MEM al 2-5 x 10^{6} células/ml, y se añadieron a tubos de polipropileno de 15 ml (Falcon). Se usó el lípido catiónico DOTAP (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) para suministrar ARN a las células (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7915-7918). Se mezcló ARN (en 250-500 \mul de medio Opti-MEM) y DOTAP (en 250-500 \mul de medio Opti-MEM) en un tubo de poliestireno de 12 x 75 mm a temperatura ambiente (TA) durante 20 minutos. La proporción de ARN con respecto a DOTAP usada de forma rutinaria fue 1:2, y variaba en ciertos experimentos entre 2:1 Y 1:2. El complejo se añadió a las APC (2-5 x 10^{6} células) en un volumen total de 2 ml y se incubó a 37ºC en un baño de agua con agitación ocasional durante 2 horas. Las células se lavaron y se usaron como estimuladores para la inducción primaria de CTL in vitro.

El péptido sintético que codifica el epítopo de CTL en ovoalbúmina de pollo OVA, aa 257-264 SIINFEKL (H-2K^{b}) (SEC ID Nº 6), se uso para el pulsado de péptidos. El péptido tenía extremos amino y carboxilo sin bloquear (libres) (Research Genetics, Birmingham, AL). Los péptidos se disolvieron en IMDM sin suero y se almacenaron a -20ºC.

Inducción de CTL in vitro

Se cultivaron células T (5 x 10^{6} células/ml) y APC pulsadas con ARN o péptidos (2,5 x 10^{5} células/ml) en IMDM con FCS al 10%, piruvato sódico 1 mM, 100 IU/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, y \beta-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M en placas de fondo en forma de U de 96 pocillos para dar una proporción de R/S de 20:1. Después de 5 días, las células se usaron como efectoras en un ensayo de liberación de eropio de 4 horas convencional.

Ensayo de citotoxicidad

En estos ensayos, se marcaron 5-10 x 10^{6} células diana con pentaacetato de eropio dietielenetriamina durante 20 minutos a 4ºC. Después de varios lavados, se incubaron 10^{4} dianas marcadas con eropio y diluciones seriadas de células efectoras a proporciones de efector:diana de 50:1 a 6,25:1 en 200 \mul de RPMI 1640 con FCS inactivado con calor al 10% en placas de fondo en forma de V de 96 pocillos. Las placas se centrifugaron a 500 g durante 3 minutos y se incubaron a 37ºC y CO_{2} al 5% durante 4 horas. Se recogieron 50 \mul del sobrenadante, se midió la liberación de eropio mediante fluorescencia resuelta en el tiempo (Delta flourometer, Wallace Inc., Gaithersburg, MD). La liberación espontánea fue menor del 25%. Los errores estándar (ES) de las medias de cultivos por triplicado eran menores del 5%.

Inmunoterapia

Modelo E.G7-OVA: se inmunizaron ratones C57BL/6 una vez con APC (2 x 10^{6} células/ratón) o 5 x 10^{6} células E:G7-OVA o EL4 irradiadas, pulsadas con ARN. A los 10-14 días después de la inmunización, los ratones se estimularon con 2 x 10^{7} células E.G7-OVA vivas inyectadas por vía sub-cutánea en la región del flanco. Los ratones se controlaron regularmente para el crecimiento y el tamaño del tumor. Los ratones con tamaños de tumores > 3,5 cm se sacrificaron. Todos los supervivientes se sacrificaron a los 40 días después de la estimulación.

Modelo de melanoma F10.9-B16: Los ratones recibieron mediante inyección en las almohadillas plantares 2 x 10^{5} células F10.9. El protocolo post-quirúrgico era esencialmente como se ha descrito anteriormente (Porgador et al., 1995, Cancer Res. 55: 4941-4949). Las patas de los ratones se amputaron cuando el tumor local el la almohadilla plantar era de 5,5 - 7,5 mm de diámetro. La mortalidad después de la amputación fue menor del 5%. A los dos días después de la amputación, los ratones se inmunizaron por vía intraperitoneal, seguido de vacunaciones semanales dos veces, para un total de tres vacunaciones. Los ratones se sacrificaron en base a la muerte metastásica en los grupos no inmunizados o de control (a los 28-32 días después de la amputación). Las cargas metastásicas se ensayaron pesando los pulmones y contando la cantidad de nódulos metastásicos.

Inducción de una respuesta de CTL primaria in vitro usando células dendríticas transfectadas con ARN de ovoalbúmina de pollo

La capacidad de células dendríticas (DC) esplénicas pulsadas con ARN obtenidas de ratones C57BL/6 (H-2K^{b}) para inducir una respuesta de CTL primaria in vitro se demostró en el sistema tumoral E.G7-OVA. Las células E.G7-OVA se obtuvieron de la línea celular tumoral EL4 (haplotipo H-2K^{b}) mediante transfección con el ADNc de ovoalbúmina de pollo (Moore et al., 1988, Cell 54: 777-785). La ovoalbúmina de pollo codifica un único epítopo dominante (aa 257-264) en ratones C57BL/6 (Rotzschke et al., 1991, Euro. Journal Immunology, 21: 2891-2891).

Las células dendríticas pulsadas con el péptido OVA (aa 257-264) incubadas con células T de ratones sin tratamiento previo inducen una potente respuesta de CTL in vitro (Fig. 1). Este ejemplo demuestra que puede usarse ARN como fuente de antígenos para sensibilizar DC para presentar el antígeno a células T CD8^{+}. Se aislaron DC esplénicas de ratones C57BL/6 y se pulsaron con péptido OVA o se incubaron con ARN sintetizado in vitro (ARN de OVA IVT) de un plásmido que codifica el ADNc de ovoalbúmina de pollo, y se usaron para estimular una respuesta de CTL primaria específica de OVA in vitro. Como se muestra en la Fig. 1, el péptido OVA así como las DC pulsadas con ARN de OVA IVT fueron capaces de inducir una respuesta de CTL primaria específica de OVA (Fig. 1). Las DC pulsadas con ARN fueron estimuladores sistemáticamente más eficaces que las DC pulsadas con péptido. Para ensayar si el ARN aislado a partir de células E.G7-OVA era capaz de sensibilizar DC para estimular una respuesta de CTL, específica de OVA, primaria, se aisló ARN total o ARN poli A^{+} a partir de células E.G7-OVA o células EL4 y se incubó con DC. Como se muestra en la Figura 1, las DC pulsadas con ARN total o ARN poli A^{+} de células E.G7-OVA pero no de células EL4, eran capaces de inducir una fuerte respuesta de CTL específica de OVA. Curiosamente, las DC pulsadas con ARN no fraccionado, total o poli A^{+}, eran inductoras de una respuesta primaria de CTL como las DC pulsadas con el péptido OVA que codifica un epítopo CTL definido. La estimulación de una respuesta de CTL mediante DC pulsadas con ARN de EL4 (total o poli A^{+}) estaba por encima del trasfondo sólo de forma marginal y era estadísticamente no significativa (en comparación con la lisis de dianas EL4 mediante CTL estimulados con péptido OVA o DC pulsadas con ARN de OVA IVT), lo que refleja la inmunodominancia del epítopo OVA y la debilidad relativa de los antígenos codificados por EL4.

Como se ilustra mediante la Fig. 2, el ARN total, así como el poli A^{+}, pero no el poli A^{-}, aislado a partir de células E.G7-OVA es capaz de sensibilizar DC para estimular una respuesta de CTL primaria. Para probar que la sensibilización de DC está mediada en realidad por ARN, se incubó ARN poli A^{+} de células E.G7-OVA con un oligonucleótido antisentido que abarcaba la secuencia que codifica el único epítopo de CTL presente en el gen de ovoalbúmina de pollo o con un oligodesoxinucleótido de control, y después se trató con ARNasa H para retirar cualquier secuencia de ARN con la que hubiera hibridado el oligodesoxinucleótido. Como se muestra en la Fig. 2, la inducción de una respuesta de CTL primaria, específica de OVA se sumprimió cuando el ARN poli A^{+} se incubó con el oligodesoxinucleótido antisentido, pero no con el de control. La Fig. 2 muestra también que las células que expresan el gen de ovoalbúmina completo, células E.G7-OVA, y células RMA-S pulsadas con el péptido OVA de 8 aminoácidos de longitud que codifica el único epítopo de CTL dominante se lisan a un grado similar después de la estimulación con DC pulsadas con ARN de E.G7-OVA total o poli A^{+}. Esto indica, por lo tanto, que la mayoría de epítopos presentados por DC pulsadas con ARN de E.G7-OVA corresponden al único epítopo CTL dominante definido anteriormente codificado en el gen de ovoalbúmina de pollo.

Inducción de inmunidad anti-tumoral mediante DC pulsadas con ARN tumoral

Este ejemplo demuestra que la vacunación de ratones con DC pulsadas con ARN de OVA proporciona protección contra una estimulación con células tumorales E.G7-OVA. Los ratones se inmunizaron una vez con 2 x 10^{6} DC pulsadas con ARN o con 5 x 10^{6} células E.G7-OVA irradiadas. Diez días después, los ratones se estimularon con una dosis tumorigénica de células E.G7-OVA. La aparición y tamaño del tumor se determinaron regularmente. La Fig. 3 muestra el tamaño de los tumores a los 37 días después del implante de los tumores. El tamaño medio del tumor en ratones inmunizados con células EL4 irradiadas era de 25 cm, mientras que tamaño medio del tumor en animales inmunizados con las células EL4 que expresaban OVA (E.G7-OVA) solamente era de 7,03 cm. Esta diferencia es un reflejo de la alta inmunogenicidad del antígeno OVA de pollo expresado en células EL4 y la mala inmunogenicidad de la línea celular tumoral parental, EL4. La vacunación con DC pulsadas con ARN (fracción total o poli A^{+}) obtenido de células E.G7-OVA fue tan eficaz como la vacunación con las células E.G7-OVA altamente inmunogénicas (tamaño medio del tumor 7 cm). La vacunación con DC incubadas con ARN total o poli A^{+} obtenido de células tumorales EL4 tuvo un ligero efecto protector (tamaño medio del tumor: 22 cm y 19,5 cm, respectivamente) que no era estadísticamente significativo, coherente con inmunogenicidad mala a indetectable de los antígenos obtenidos de EL4. Coherente con los datos de inducción primaria de CTL (Fig. 1), la vacunación de ratones con DC pulsadas con ARN de OVA IVT proporcionó la respuesta anti-tumoral más eficaz (tamaño medio del tumor: 3,9 cm), mientras que la vacunación con el ARN de OVA IVT antisentido de control no provocó una respuesta protectora significativa.

La potencia de DC pulsadas con ARN obtenido de tumores se evaluó adicionalmente en el modelo de metástasis de melanoma B16/F10.9 (H-2^{b}). El tumor de melanoma B16/F10.9 es poco inmunogénico, expresa niveles bajos de moléculas MHC de clase I, y es altamente metastásico en sistemas de ensayo de metástasis experimental y espontánea (Porgador et al., 1996, J. Immunology 156: 1772-1780). Porgador et al. han demostrado que, cuando las vacunaciones se realizan después de la retirada del implante tumoral primario, solamente células tumorales irradiadas transducidas con los genes IL-2 y H-2K^{b}, son capaces de tener un impacto significativo en la propagación metastásica de células tumorales B16/F10.9 en el pulmón (Porgador et al., 1995, Cancer Research 55: 4941-4949). Por tanto, el modelo de melanoma B16/F10.9 y el diseño experimental usado por Porgador et al. constituyen un sistema experimental riguroso y clínicamente relevante para evaluar la eficacia de tratamientos adyuvantes para el cáncer metastásico.

Para demostrar que la inmunización con DC pulsadas con ARN tumoral, de acuerdo con la invención, era capaz de causar la regresión de metástasis pulmonar preexistente, se indujeron tumores primarios mediante el implante de células tumorales B16/F10.9 en la almohadilla plantar. Cuando la almohadilla plantar alcanzaba los 5,5-7,5 mm de diámetro, se retiraban los tumores quirúrgicamente. Dos días después, los ratones se inmunizaban con células B16/F10.9 irradiadas, células B16/F10.9 irradiadas transducidas con el gen H-2K^{b} (F10.9K1), o con preparaciones de DC pulsadas con ARN (Fig. 4). Los ratones recibieron un total de tres vacunaciones administradas a intervalos semanales. El peso medio del pulmón de un ratón normal es de 0,18-0,22 g. Los ratones tratados con PBS (un control negativo) fueron abrumados por la metástasis. El peso medio del pulmón de los ratones en este grupo de tratamiento fue de 0,81 g; aproximadamente tres cuartas partes del peso lo aportaba la metástasis, que era demasiada para contarla (> 100 nódulos). Se observó una carga metastásica similar cuando se trataba a los ratones con células B16/F10.9 irradiadas (no se muestran los datos), lo que confirma numerosas observaciones previas de que el tratamiento con células tumorales B16/F10.9 irradiadas en solitario no tiene beneficio terapéutico en este modelo tumoral. Como también se ha mostrado anteriormente, la inmunización con células B16/F10.9 que expresan H-2K^{b} (F10.9K1, como control positivo) tenía un benéfico terapéutico modesto, como se indica mediante una disminución estadísticamente significativa en el peso medio del pulmón de los animales en este grupo de tratamiento. Sin embargo, se observó una respuesta espectacular en animales tratados con DC que se pulsaron con ARN total obtenido de células F10.9 de acuerdo con la invención. El promedio del peso del pulmón fue de 0,37 g. también se observó una respuesta significativa espectacular en ratones tratados con ARN obtenido de células F10.9 de acuerdo con la invención (peso medio del pulmón: 0,42 g). Por el contrario, no se observó disminución estadísticamente significativa en la carga metastásica en ratones tratados con DC que se pulsaron con la fracción de ARN poli A^{-} obtenida de células F10.9 o con ARN total aislado a partir de células tumorales EL4.

La observación de que las células que expresan la proteína OVA (E.G7-OVA) o las células pulsadas con el péptido OVA se lisaban eficazmente mediante CTL, y la sensibilización de DC fraccionadas con ARN poli A^{+}, sugiere fuertemente que la estimulación de CTL mediada por ARN se produce mediante la traducción del ARN de entrada y la generación de los epítopos restringidos de clase I predichos, en este caso un único epítopo dominante codificado en el péptido OVA de pollo. Estos datos muestran que la sensibilización de DC mediada por ARN es más eficaz que pulsar con péptido porque el ARN transfectado puede servir como una fuente continua para la producción de péptidos antigénicos.

Uso Terapéutico

La invención puede usarse para tratar o prevenir la formación de tumores en un paciente (por ejemplo, tumores de melanoma, tumores de vejiga, tumores de cáncer de mama, tumores de cáncer de colon, tumores de cáncer de próstata, y tumores de cáncer de ovario). Análogamente, la invención puede usarse para tratar o prevenir la infección en un paciente con un patógeno tal como una bacteria (por ejemplo, Salmonella, Shigella, o Enterobacter) o un virus (por ejemplo, un virus de inmunodeficiencia humana, un Herpes virus, un virus de la gripe, un virus de la poliomielitis, un virus del sarampión, un virus de las paperas, o un virus de la rubéola).

Para tratar o prevenir la formación de tumores o la infección patogénica en un paciente, no se requiere que la(s) célula(s) que se administra al paciente se obtenga de ese paciente. De este modo, la célula de presentación de antígenos puede obtenerse de un donante compatible, o de un cultivo de células cultivadas in vitro. Los métodos para emparejar haplotipos se conocen en la técnica. Análogamente, no se requiere que el ARN se obtenga del paciente a tratar. Puede usarse ARN de un donante.

Es preferible que el tratamiento comience antes de o en el comienzo de la formación tumoral o la infección, y continúe hasta que el cáncer o la infección mejoren. Sin embargo, como ilustran los ejemplo descritos en este documento, la invención es adecuada para uso incluso después de que se ha formado un tumor, puesto que la invención puede causar la regresión del tumor. Para tratar a un paciente con una célula o vacuna producida de acuerdo con la invención, la dosificación óptima de la vacuna o células depende de factores tales como el peso del mamífero, la gravedad del cáncer o la infección, y la potencia del epítopo de CTL. Generalmente, debe administrarse una dosis de 10^{5} a 10^{8} células de presentación de antígenos cargadas con ARN/kg de peso corporal, preferiblemente 10^{6} a 10^{7} células/kg de peso corporal, en un excipiente farmacéuticamente aceptable al paciente. Las células pueden administrarse usando técnicas de infusión que se usan comúnmente en terapia de cáncer (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Ehg. J. of Med. 319:1676, 1988). El régimen óptimo de dosificación y tratamiento para un paciente particular puede determinarlo fácilmente un especialista en la técnica de medicina controlando los signos de enfermedad en el paciente y ajustando el tratamiento en consecuencia.

Donde se usa la célula de presentación de antígenos para inducir una respuesta de CTL in vitro, los CTL efectores resultantes pueden administrarse posteriormente a un mamífero en un método de terapia basado en CTL (véase, por ejemplo, el documento PCT/US91/06441). Los CTL producidos in vitro con las células de presentación de antígenos de la invención pueden administrarse en un excipiente farmacéuticamente aceptable a un mamífero empleando métodos de infusión convencionales (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., supra). Típicamente, se administran 10^{9} - 10^{10} células en el transcurso de 30 minutos, con el tratamiento repetido según sea necesario. Dicho método de terapia basado en CTL puede combinarse con otros métodos, tales como administración directa de las células de presentación de antígenos de la invención. Los CTL y las células de presentación de antígenos pueden ser autólogos o heterólogos al paciente que se somete a terapia. Si se desea, el tratamiento también puede incluir la administración de mitógenes (por ejemplo, fito-hemaglutinina) o linfoquinas (por ejemplo, IL-2 o IL-4) para potenciar la proliferación de CTL.

<110> DUKE UNIVERSITY

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<120> MÉTODOS PARA TRATAR CÁNCERES E INFECCIONES PATOGÉNICAS USANDO CÉLULAS DE PRESENTACIÓN DE ANTÍGENOS CARGADAS CON ARN

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<130> N. 75527 GCW

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<140> 97922581.0

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<141> 30-04-1997

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<150> PCT/US97/07317

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<151> 30-04-1996

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<160> 7

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido de retención del retículo endoplasmático

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<400> 1

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\sa{Lys Asp Glu Leu}

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<210> 2

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido de dirección a lisosomas

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<400> 2

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\sa{Lys Phe Glu Arg Gln}

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<210> 3

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido de dirección a lisosomas

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<400> 3

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\sa{Gln Arg Glu Lys}

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<210> 4

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido señal de MHC de clase II

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<400> 4

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\sa{Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val}

\sac{Leu Met Ser Ala Gln Ser Trp Ala}

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<210> 5

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda

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<400> 5

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cagtttttca aagttgatta tact

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<210> 6

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Epítopo de CTL

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<400> 6

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\sa{Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu}

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<210> 7

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda

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<400> 7

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tcatattagt tgaaactttt tgac

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Claims (39)

1. Un método para producir una célula de presentación de antígeno (APC) pulsada con ARN, comprendiendo dicho método:

introducir en una célula de presentación de antígeno in vitro ARN seleccionado entre:

(i) ARN que comprende ARN específico de tumores; y

(ii) ARN que comprende ARN específico de patógenos,

produciendo de este modo una APC pulsada con ARN.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha APC es una célula dendrítica, un macrófago o una célula endotelial.

3. El método de la reivindicación 1, donde dicha APC es una APC generada artificialmente.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN comprende ARN específico de tumores que comprende ARN poli A^{+}.

5. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN comprende ARN específico de tumores que comprende ARN citoplasmático.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN corresponde a un antígeno tumoral o antígeno patogénico.

7. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN corresponde a un epítopo.

8. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN es ARN específico de tumores.

9. El método de la reivindicación 1, donde el ARN se introduce en la APC poniendo en contacto la APC con el ARN en presencia de un lípido catiónico.

10. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN comprende ARN específico de tumores que se proporciona en forma de un extracto tumoral que se fracciona con respecto la componente no ARN del extracto tumoral.

11. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN es ARN específico de patógenos.

12. El método de la reivindicación 8, donde el ARN específico de tumores comprende ARN específico de melanoma, ARN específico de tumores de vejiga, ARN específico de cáncer de mama, ARN específico de cáncer de colon, ARN específico de cáncer de próstata o ARN específico de cáncer de ovario.

13. El método de la reivindicación 11, donde dicho ARN específico de patógenos comprende ARN vírico.

14. El método de la reivindicación 13, donde dicho virus se selecciona entre virus de la Hepatitis, virus de inmunodeficiencia humana, virus de la gripe, virus de la poliomielitis, virus del sarampión, herpes virus, virus de las paperas y virus de la rubéola.

15. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN específico de patógenos comprende ARN bacteriano.

16. El método de la reivindicación 15, donde dicha bacteria se selecciona entre Salmonella, Shigella y Enterobacter.

17. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN se aísla a partir de una célula.

18. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN se prepara mediante amplificación por PCR y transcripción in vitro.

19. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN es ARN específico de tumores que comprende ARN nuclear.

20. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN corresponde a un minigen.

21 El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN está compuesto por ARN específico de tumores que codifica un antígeno específico.

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22. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN está compuesto por ARN específico de patógenos que codifica un antígeno patogénico específico.

23. El método de la reivindicación 1, donde dicha APC es una APC profesional.

24. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN se transcribe a partir de ADNc clonado.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 5, 12, 19 y 20, donde dicho ARN se obtiene de un tumor y comprende ARN específico de tumores que codifica un antígeno que induce proliferación de células T e inmunidad tumoral, presentando dicha APC pulsada con ARN en su superficie un epítopo antigénico tumoral codificado por el ARN, donde el epítopo induce proliferación de células T.

26. El método de la reivindicación 1, donde dicho ARN se transcribe a partir de ADNc.

27. El método de la reivindicación 14, donde dicho virus es un virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

28. Una APC pulsada con ARN que puede obtenerse de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-27.

29. La APC pulsada con ARN de la reivindicación 28, donde dicho ARN comprende ARN específico de tumores.

30. La APC pulsada con ARN de la reivindicación 28, donde dicho ARN comprende ARN específico de patógenos.

31. La APC pulsada con ARN de la reivindicación 30, donde dicho patógeno es VIH.

32. La APC pulsada con ARN de la reivindicación 30, donde dicho ARN se aísla, purifica, fracciona, amplifica o transcribe in vitro.

33. La APC pulsada con ARN de la reivindicación 28, donde dicho ARN también codifica una secuencia señal de tránsito celular.

34. La APC pulsada con ARN de la reivindicación 33, donde la secuencia señal de tránsito celular dirige un epítopo antigénico codificado en el ARN al retículo endoplasmático, un lisosoma, o un endosoma dentro de la célula.

35. La APC pulsada con ARN de la reivindicación 33, donde la secuencia señal de tránsito celular es una señal de separación LAMP-1.

36. Una composición farmacéutica que comprende APC pulsadas con ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

37. Uso de APC pulsadas con ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28, 29 y 33 a 35, donde dicho ARN comprende ARN específico de tumores, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir cáncer.

38. El uso de la reivindicación 37, donde el medicamento se usa a una dosificación de 10^{5} a 10^{8} células de presentación de antígenos por kg de peso corporal.

39. El uso de acuerdo con la reivindicación 37 ó 38, donde el tumor es melanoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de colon, o cáncer de ovarios.

40. Uso de APC pulsadas con ARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 y 30 a 35 donde dicho ARN comprende ARN específico de patógenos en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir infección patogénica.