ES2263286T3 - Nucleotidos y proteinas antitrombina de la mosca de los cuernos. - Google Patents
Nucleotidos y proteinas antitrombina de la mosca de los cuernos.Info
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Abstract
Proteína purificada sustancialmente que tiene actividad antitrombina, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: (a) una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; (b) una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, y (c) un fragmento de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, en la que dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de dicha secuencia.
Description
Nucleótidos y proteínas antitrombina de la
mosca de los cuernos.
La invención se refiere a vacunas veterinarias
para la prevención de la infestación hematofágica de ganado y el
tratamiento médico de la trombosis.
Se ha estimado que las pérdidas en la producción
de animales de cría en los Estados Unidos debidas a infestaciones
por ectoparásitos superan los 2,26 mil millones de \textdollar
(Byford et al. (1992) J. Anim. Sci.
70:597-602). De las cinco a seis especies de plaga
de artrópodos principales implicadas, la mosca de los cuernos
Haematobia irritans linneus es la más importante y extendida.
Su impacto económico anual sobre la producción de ganado en los
EE.UU. se ha estimado en 730,3 millones de \textdollar. En Canadá,
el control de este ectoparásito en la producción de ganado se ha
estimado que reduce las pérdidas en 71-107 millones
de \textdollar cada año utilizando el valor del dólar de 1977
(Haufe y Weintraub (1985) Can. Entomol.
117:901-907). Por tanto, en Norte América, el
impacto económico anual sobre la producción de ganado mediante esta
mosca hematófaga se aproxima a mil millones de \textdollar.
Las manifestaciones fisiológicas de la
infestación por la mosca de los cuernos incluyen un aumento en las
frecuencias cardiacas, frecuencias respiratorias y temperaturas
rectales. Adicionalmente, aumentan significativamente el consumo de
agua y la producción de orina así como la secreción de nitrógeno en
la orina. También aumentan significativamente las concentraciones de
cortisol en sangre. También se han notificado disminución del
aumento de peso, aumento de la actividad y disminución del
pastoreo. (Schwinghammer et al. (1986) J. Econ. Entomol.
79:1010-1014).
La fase adulta de ambos sexos de H.
irritans son ectoparásitos estrictos que se alimentan con sangre
intermitentemente durante las 24 horas del día. A diferencia de
otras plagas de dípteros que se alimentan con sangre de manera
transitoria (mosca negra, mosquitos, tábanos, moscas de los
establos), los adultos alados de H. irritans permanecen en
los huéspedes bovinos y, cuando necesitan alimento, insertan de
forma recurrente las partes de su boca en la piel para alimentarse.
Harris et al. (1974) Antineoplásico. Entomol. Soc. Am.
67:891-894, indicaron que en condiciones
experimentales, las moscas de los cuernos hembra invierten un
promedio de 163 minutos/día a la alimentación; los machos
promediaron 96 minutos al día. Cada hembra ingirió un promedio de
17,1 mg de sangre al día mientras que los machos ingirieron 12,1
mg/individuo debido a la diferencia en los tiempos de alimentación
(Harris y Frazer (1970) Antineoplásico. Entomol. Soc. Am.
63:1475-1476).
La bibliografía científica que describe la
fisiología de las glándulas salivales de H. irritans,
particularmente con referencia a la alimentación con sangre, es
escasa. Hori et al. (1981) Appl. Ent. Zool.
16:16-23 han comparado varias categorías de enzimas
digestivas en el intestino y las glándulas salivales de H.
irritans con Stomoxys calcitrans (Linnaeus), la
mosca de los establos. Se detectó actividad aminopeptidasa débil en
la saliva de H. irritans, lo que sugiere que las proteasas y
glucosidasas en el intestino son responsables en exclusiva de la
digestión de la sangre.
La mosca de los cuernos Haematobia irritans
linnaeus es una subespecie con H. i. exigua de Meijere,
la mosca de los búfalos que aparece en Australia y en otras partes
del hemisferio sur. Kerlin y Hughes (1992) Med. Vet. Entomol.
6:121-126, han comparado enzimas en la saliva de
cuatro artrópodos parásitos, H. irritans exigua,
Boophilus microplus (Canestrini), Aedes aegypti
(Linnaeus) y Lucilia cuprina (Wiedemann) y observaron
diferencias en los perfiles de enzimas de la saliva entre las
cuatro especies que reflejan aparentemente sus estrategias de
alimentación diferentes. Estas diferencias fueron principalmente en
el tipo y niveles de actividades glucosidasa y proteasa. La saliva
de H. irritans exigua, recogida mediante estimulación de
serotonina y luego evaluada mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida, produjo 7-8
bandas mediante tinción con plata. La actividad apirasa en la
saliva y los extractos de glándulas salivales (EGS) de esta especie
fue ligeramente detectable, lo que sugiere que esta subespecie no
evita la agregación plaquetaria bovina de la misma manera que otros
artrópodos que se alimentan con sangre (Ribeiro (1987)
Antineoplásico. Rev. Entomol. 32:463-478).
Además, la investigación de la respuesta
inmunitaria del ganado expuesto a H. irritans exigua mostró
la producción de altos niveles de anticuerpos circulantes frente a
algunos pero no todos los antígenos de la mosca de los búfalos; no
obstante, las moscas que se alimentaron de ganado expuesto
previamente no mostraron una mortalidad superior que las alimentadas
con ganado no expuesto. (Kerlin y Allingham (1992) Vet. Parasitol.
43:115-129).
En la última década, ha avanzado la elucidación
de las estrategias bioquímicas adoptadas por los artrópodos que se
alimentan con sangre. Aunque se conoce la presencia de
anticoagulantes en la saliva de los artrópodos hematofágicos desde
hace al menos ocho décadas, sólo recientemente se han purificado
algunos de los componentes activos y se han definido sus
estructuras moleculares. Ha resultado evidente que los factores de
la coagulación tales como los factores Xa y trombina (factor II),
que aparecen en un nexo de la cascada de coagulación, se seleccionan
frecuentemente como diana.
Los estudios de la saliva de varias especies de
moscas negras han sugerido que las dianas enzimáticas específicas
pueden asociarse con la selección de huésped (Abebe et al.
(1994)). Por ejemplo, los datos de especies zoofágicas que
prefieren ganado indican que la trombina es una importante molécula
diana cuya inactivación puede evitar también la agregación
plaquetaria irreversible además de impedir la cascada de
coagulación. Véase Hudson (1964) Can. J. Zool.
42:113-120 para Stomoxys calcitrans; y Parker
y Mant (1979) Thrombos. Haemostas (Stuttg.)
42:743-751, sobre la saliva de G. morsitans
(Westwood).
Debido al impacto adverso de la infestación
ectoparásita descrita anteriormente en el ganado, existe una
necesidad terapéutica y económica para prevenir tal
infestación.
También existe la necesidad de un tratamiento
para enfermedades tromboembólicas. Las enfermedades tromboembólicas
se encuentran entre las enfermedades circulatorias más importantes.
Un trombo es un coágulo sanguíneo que bloquea parcial o
completamente en flujo sanguíneo a través de un vaso sanguíneo. Un
émbolo es un trombo que se ha formado en cualquier parte del
cuerpo, se ha separado y desplazado hasta el sitio en el que se
produce el bloqueo. El bloqueo en el cerebro da como resultado un
accidente cerebrovascular, es decir, un infarto cerebral, una zona
localizada de células muertas. Un émbolo en un pulmón puede producir
embolia pulmonar, una de las principales enfermedades pulmonares en
pacientes postrados en cama. Las personas ancianas y postradas en
cama también son particularmente propensas a tromboflebitis, que es
el bloqueo de la circulación en una pierna producido por un émbolo.
Un émbolo o trombo que se aloja en uno de los vasos sanguíneos que
abastecen al corazón produce necrosis de parte del tejido cardiaco,
un infarto de miocardio, denominado comúnmente ataque al
corazón.
El acontecimiento que inicia muchos infartos de
miocardio es la hemorragia en placas ateroscleróticas. Tal
hemorragia a menudo da como resultado la formación de un trombo (o
coágulo sanguíneo) en la arteria coronaria que riega la zona
infartada. Este trombo se compone de una combinación de fibrina y
plaquetas sanguíneas. La formación de un coágulo de
fibrina-plaquetas tiene graves ramificaciones
clínicas. El grado y la duración de la oclusión producida por el
coágulo de fibrina-plaquetas determinan la masa de
la zona del infarto y la extensión de la lesión.
La formación de coágulos de
fibrina-plaquetas en otras partes del sistema
circulatorio puede evitarse parcialmente a través del uso de
anticoagulantes, tales como heparina. Desafortunadamente, no se ha
encontrado que la heparina sea eficaz de manera universal en
prevenir una nueva oclusión en las víctimas de infarto de miocardio
en las que el grado de oclusión del vaso sanguíneo es superior o
igual al 70%, particularmente en aquellos pacientes con grave
estenosis coronaria residual. Entre los agentes más prometedores, se
encuentran la hirudina y sus análogos, que se unen e inactivan la
trombina. La hirudina tiene una ventaja teórica sobre la heparina
como agente antitrombótico. La trombina unida a los trombos o
plaquetas está protegida relativamente de la inhibición por
heparina mientras que la hirudina, al menos in vitro, es aún
eficaz. Otros agentes en investigación prometedores incluyen
antagonistas del receptor de fibrinógeno, que bloquean la agregación
plaquetaria y la liberación de gránulos densos mediante un mecanismo
diferente al de la aspirina, e inhibidores de la producción de
tromboxano.
Por tanto, existe la necesidad de agentes
antitrombina adicionales que muestren baja toxicidad, poca o ninguna
antigenicidad y un tiempo de aclaramiento muy corto de la
circulación.
Se proporcionan proteínas aisladas con actividad
antitrombina y secuencias de nucleótidos que codifican para las
proteínas. La proteína denominada trombostasina se aísla de las
glándulas salivales de Haematobia irritans, la mosca de los
cuernos que se alimenta con sangre. Las proteínas y los nucleótidos
proporcionados son particularmente útiles como vacunas veterinarias
en la prevención de la alimentación con sangre en ganado por la
mosca de los cuernos que lo infesta.
Las proteínas de la invención son también útiles
en el tratamiento de la trombosis.
También se proporcionan los métodos de
administración de las proteínas y secuencias de nucleótidos de la
invención.
La invención proporciona una proteína purificada
sustancialmente que tiene actividad antitrombina, en la que dicha
proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
- a.
- una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- b.
- una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, y
- c.
- un fragmento de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, en la que dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de dicha secuencia.
La invención también proporciona:
- \bullet
- una secuencia de nucleótidos aislada que codifica para una proteína que tiene actividad antitrombina, seleccionada de:
- a.
- una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- b.
- una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6;
- c.
- una secuencia de nucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- d.
- una secuencia de nucleótidos que es idéntica en un 40% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6;
- e.
- una secuencia de nucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15 residuos contiguos la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; y
- f.
- una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6 en condiciones rigurosas.
- \bullet
- un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención
- \bullet
- una célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención
- \bullet
- una preparación de anticuerpos que se une selectivamente a una proteína que tiene actividad antitrombina, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
- a.
- una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- b.
- una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- c.
- una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- d.
- una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; y
- e.
- un fragmento de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, en el que dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de dicha secuen- cia.
- \bullet
- una composición farmacológica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la invención y un excipiente aceptable farmacéuticamente.
- \bullet
- una vacuna veterinaria que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína o de la secuencia de nucleótidos de la invención.
- \bullet
- una proteína o una secuencia de nucleótidos de la invención para el uso en un método de tratamiento del cuerpo animal o humano.
- \bullet
- uso de una proteína o una secuencia de nucleótido de la invención en la fabricación de una vacuna para tratar o prevenir la hematofagia en animales de cría.
- \bullet
- uso de una proteína de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar la trombosis en un mamífero.
- \bullet
- un método para producir una proteína que tiene actividad antitrombina, comprendiendo dicho método:
- a.
- cultivar una célula procariota o eucariota que se transforma con una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de la invención en condiciones en las que se produce dicha proteína; y
- b.
- aislar dicha proteína.
La figura 1 muestra la comparación del peso
molecular de proteínas en moscas recogidas en colonias frente a
recogidas en el campo mediante movilidad relativa en
SDS-PAGE.
La figura 2 muestra el ensayo del tiempo de
recalcificación para probar la actividad anticoagulante en saliva
de H. irritans.
La figura 3 muestra el efecto de la saliva de
H. irritans sobre la coagulación de plasma deficiente en
factor II.
La figura 4 muestra la inhibición de la
hidrólisis de trombina de S238 por saliva de H. irritans.
La figura 5 muestra purificación mediante HPLC
de trombostasina salival activa.
La figura 6 muestra el perfil de
SDS-PAGE de la proteína de anticoagulación salival
purificada mediante HPLC, trombostasina.
Se proporcionan métodos y composiciones para
prevenir la hematofagia (alimentación con sangre) en el ganado, y
el tratamiento de la trombosis en un mamífero. Las composiciones
comprenden proteína procedente de las glándulas salivales de la
mosca de los cuernos hematófaga Haematobia irritans que, tal
como se describe en Yeates et al. (1999) Annu. Rev. Entemol.
44:397-428, pertenece al suborden Cyclorrhapha del
orden Diptera. Se proporcionan adicionalmente secuencias de
nucleótidos que codifican para la proteína antitrombina. La proteína
se ha designado como trombostasina. La función principal de la
proteína es prevenir la coagulación inhibiendo la actividad de la
trombina (factor II).
Por "hematofagia" se pretende que sea la
alimentación con la sangre de un organismo por otro organismo. Por
"infestación hematofágica" se pretende que sea una relación de
huésped-parásito que comprende la alimentación con
la sangre del huésped por el parásito. Por "trombosis" se
pretende que sea la formación, desarrollo o presencia de un trombo.
Por "actividad antitrombina" se pretende que sea una actividad
biológica que reduce o elimina la acción procoagulante de la
trombina; y/o inhibe la trombosis.
Se reconoce que hay métodos disponibles en la
técnica para obtener la secuencia codificante completa para la
proteína antitrombina de la invención. Tales métodos se describen,
por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
Nueva York).
Se proporcionan preparaciones sustancialmente
purificadas de trombostasina. Tales preparaciones sustancialmente
purificadas incluyen proteínas sustancialmente libres de cualquier
compuesto asociado normalmente con la proteína en su estado
natural. Tales proteínas pueden evaluarse para determinar su pureza
mediante SDS-PAGE, cromatografía, electroforesis u
otros métodos. Véase, M. P. Deutscher (ed.), Guide to Protein
Purification, Academic Press, Inc. (1990).
Los términos "sustancialmente puro" o
"sustancialmente purificado" no pretenden excluir mezclas
artificiales o sintéticas de la proteína con otros compuestos. Se
reconoce que las proteínas antitrombina de la presente invención
incluyen aquellas proteínas homólogas a, y que tienen esencialmente
las mismas propiedades biológicas que, la proteína antitrombina
descrita en el presente documento, y particularmente la proteína
descrita en el presente documento en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 o
SEQ ID NO: 7. Esta definición pretende englobar las variaciones
alélicas naturales en los genes. También se reconoce que las
proteínas "sustancialmente puras" de la presente invención tal
como se describen en el presente documento pueden ser de otra
especie de origen, incluyendo pero sin limitarse a otras especies
del suborden Cyclorrhapha.
La invención también proporciona fragmentos de
la proteína antitrombina y/o secuencias de nucleótidos descritas en
SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 6 y 7. Los fragmentos de la proteína pueden
oscilar en tamaño desde al menos 10, 20, 30 o más aminoácidos. Tales
fragmentos pueden conservar la actividad biológica o comprender
regiones activas de la proteína.
Los fragmentos de polinucleótido pueden también
oscilar en tamaño desde al menos 15, 20, 30 o más nucleótidos
contiguos. Las secuencias encuentran uso como marcadores moleculares
o en un proceso de hibridación.
Tales fragmentos pueden prepararse fácilmente
mediante métodos químicos incluyendo métodos automatizados
disponibles comercialmente o mediante métodos de ADN recombinante
conocidos por el experto ordinario en la técnica, y descritos a
continuación. Se reconoce que las funciones biológicas de
antihemostasia, incluyendo las relacionadas con la actividad
anticoagulante antitrombina y/o la modulación de la respuesta
inmunitaria pueden llevarse a cabo mediante los fragmentos
descritos.
La invención engloba adicionalmente las
secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas de la
invención. La secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante
clonada mediante PCR de H. irritans se proporciona en SEQ ID
NO: 1; sin embargo, se reconoce que los genes clonados de la
presente invención pueden ser de otra especie de origen, incluyendo
pero sin limitarse a otras especies del suborden Cyclorrhapha.
Los ADN que se hibridan con la secuencia de
nucleótidos del gen de la antitrombina procedente de la mosca de
los cuernos son sólo un aspecto de esta invención. Las condiciones,
que permitirán que se hibriden otros ADN con el ADN descrito en el
presente documento, pueden determinarse según técnicas conocidas.
Por ejemplo, la hibridación de tales secuencias puede llevarse a
cabo en condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o
incluso condiciones rigurosas (por ejemplo, condiciones
representadas por una rigurosidad de lavado de formamida al
35-40% con solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% y 1x
SSPE a 37ºC; condiciones representadas por una rigurosidad de
lavado de formamida al 40-45% con solución de
Denhardt 5x, SDS al 0,5% y 1x SSPE a 42ºC; y condiciones
representadas por una rigurosidad de lavado de formamida al 50% con
solución de Denhardt 5x, SS al 0,5% y 1x SSPE a 42ºC,
respectivamente, para ADN que codifica para los genes descritos en
el presente documento en un ensayo de hibridación habitual. Véase J.
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(2ª ed.) (Cold Spring Harbor Laboratory).
En general, las secuencias que codifican para la
proteína antitrombina y se hibridan con la secuencias de
nucleótidos descrita en el presente documento pueden ser homólogas
en al menos el 40%, homólogas en aproximadamente del 60% al 70%, e
incluso homólogas en aproximadamente del 80%, 85%, 90% o más con las
secuencias descritas. Tales secuencias son sustancialmente
homólogas a las secuencias de nucleótidos descritas en el presente
documento y englobadas por la invención. Además, las secuencias de
aminoácidos de las proteínas antitrombina aisladas mediante
hibridación con los ADN descritos en el presente documento son
también un aspecto de esta invención. La degeneración del código
genético, que permite que diferentes secuencias de ácido nucleico
codifiquen para la misma proteína o péptido, se conoce bien en la
bibliografía. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número
4.757.006.
Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos
de ADNc u oligonucleótidos, y pueden marcarse con un grupo
detectable tal como se conoce en la técnica. Pueden utilizarse pares
de sondas que servirán como cebadores de PCR para el gen de la
antitrombina o una proteína del mismo según el procedimiento
descrito en las patentes de los EE.UU. números 4.683.202 y
4.683.195.
Los polipéptidos de la invención pueden
someterse a una o más modificaciones postraduccionales tales como
sulfatación, COOH-amidación, acilación o alteración
química de la cadena polipeptídica.
Se reconoce que las secuencias de nucleótidos y
péptidos de la invención pueden alterarse de varias maneras
incluyendo sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de
aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones se conocen
generalmente en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la
secuencia de aminoácidos de péptidos y proteínas pueden prepararse
mediante mutaciones en el ADN. En la técnica, se conocen bien
métodos para la mutagénesis y las alteraciones de las secuencias de
nucleótidos. Véase, por ejemplo, Kunkel, T. (1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 82:488-492; Kunkel et al.
(1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente de
los EE.UU. número 4.873.192; Walker y Gaastra (eds.) Techniques in
Molecular Biology, MacMillan Publishing Company, NY (1983) y la
bibliografía citada en ellos. Por tanto, las secuencias de
nucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias que se
producen de manera natural como mutantes. Asimismo, los péptidos y
proteínas de la invención engloban tanto formas que se producen de
manera natural como modificadas de los mismos. Tales variantes
continuarán teniendo la actividad deseada. Se reconoce que las
mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica para la variante
no situarán la secuencia fuera del marco de lectura y
preferiblemente no producirán secuencias perjudiciales para la
expresión del producto génico. Véase, la solicitud de patente EP,
publicación nº 75.444.
Las proteínas de la invención incluyen las
formas que se producen de manera natural así como variantes de las
mismas. Estas variantes serán sustancialmente homólogas y
funcionalmente equivalentes a la proteína nativa. Tal como se
utiliza en el presente documento, dos proteínas (o una región de las
proteínas) son "sustancialmente homólogas" cuando las
secuencias de aminoácidos son normalmente idénticas en al menos
aproximadamente el 40%, más normalmente en al menos aproximadamente
el 60%-70%, y lo más normalmente en al menos aproximadamente el
80%, 85%, 90% o más. Una secuencia de aminoácidos sustancialmente
homóloga, según la presente invención, estará codificada por una
secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la secuencia de ácido
nucleico, o parte de la misma, de la secuencia de nucleótidos
mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o por lo demás
descrita en el presente documento en condiciones rigurosas tal como
se explica con más detalle a continuación.
Por tanto, una variante de una proteína nativa
es "sustancialmente homóloga" a la proteína nativa cuando al
menos aproximadamente el 40%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 60%-70%, y lo más preferiblemente al menos
aproximadamente el 80%, 85%, 90% o más de su secuencia de
aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la
proteína nativa. Una variante puede diferir en tan sólo 1, 2, 3 ó 4
aminoácidos. Un polipéptido variante puede diferir en la secuencia
de aminoácidos en una o más sustituciones, deleciones, inserciones,
inversiones, fusiones y truncamientos o una combinación de
éstos.
Por "funcionalmente equivalente" se
pretende que sea que la secuencia de la variante defina una cadena
que produce una proteína que tiene sustancialmente la misma
actividad biológica que la proteína nativa de interés. Tales
variantes funcionalmente equivalentes que comprenden variaciones de
secuencia sustanciales también están englobadas por la invención.
Por tanto, una variante funcionalmente equivalente de la proteína
nativa tendrá una actividad biológica suficiente para ser
terapéuticamente útil. Por terapéuticamente útil se pretende que sea
eficaz en conseguir un objetivo terapéutico tal como se trata a
continuación.
Están disponibles métodos en la técnica para
determinar la equivalencia funcional. La actividad biológica puede
medirse utilizando ensayos diseñados específicamente para medir la
actividad de la proteína nativa, incluyendo los ensayos descritos
en la presente invención. Adicionalmente, pueden probarse
anticuerpos producidos frente a la proteína nativa activa
biológicamente para determinar su capacidad para unirse a la
variante funcionalmente equivalente, en la que la unión eficaz es
indicativa de una proteína que tiene una conformación similar a la
de la proteína nativa.
Los polipéptidos variante pueden ser totalmente
funcionales o carecer de función en una o más actividades. Por
tanto, en el presente caso, las variaciones pueden afectar la
función, por ejemplo, de uno o más de los módulos, dominios o
subregiones funcionales de las proteínas y polipéptidos de la
invención.
Las variantes totalmente funcionales contienen
sólo una variación conservativa o una variación en residuos no
críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales pueden
contener también una sustitución de aminoácidos similares, que no
da como resultado cambio o un cambio insignificante en la función.
Alternativamente, tales sustituciones pueden afectar positiva o
negativamente a la función en cierto grado.
Las variantes no funcionales contienen
normalmente una o más sustituciones, deleciones, inserciones,
inversiones o truncamiento de aminoácidos no conservativos o una
sustitución, inserción, inversión o deleción en un residuo crítico
o una región crítica. Tal como se indica, las variantes pueden
producirse de manera natural o pueden prepararse mediante medios
recombinantes o síntesis química para proporcionar características
útiles y novedosas para el polipéptido.
Los aminoácidos que son esenciales para la
función pueden identificarse mediante métodos conocidos en la
técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis con
barrido de alanina (Cunningham et al. Science
244:1081-1085 (1989)). Este último procedimiento
introduce mutaciones únicas de alanina en cada residuo en la
molécula. Las moléculas mutantes resultantes se prueban entonces
para determinar la actividad biológica. También pueden determinarse
los sitios que son críticos mediante análisis estructural tal como
cristalización, resonancia magnética nuclear o marcaje de
fotoafinidad (Smith et al., J. Mol. Biol.
244:899-904 (1992); de Vos et al. Science
255:306-312 (1992)).
La invención engloba además polinucleótidos
variante, y fragmentos de los mismos, que difieren de la secuencias
de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6,
o por lo demás descrita en el presente documento, debido a
degeneración del código genético y por tanto, codifican para la
misma proteína codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada
en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, o por lo demás descrita
en el presente documento.
La invención también proporciona moléculas de
ácido nucleico que codifican para los polipéptidos variante
descritos en el presente documento. Tales polinucleótidos pueden
producirse de manera natural, tales como variantes alélicas (mismo
locus), homólogos (diferente locus) y ortólogos (diferente
organismo), o pueden construirse mediante métodos de ADN
recombinante o mediante síntesis química. Tales variantes que no se
producen de manera natural puede prepararse mediante técnicas de
mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células u
organismos. En consecuencia, tal como se trató anteriormente, las
variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e
inserciones de nucleótidos.
La variación puede producirse en cualquiera o
ambas de las regiones codificante y no codificante. Las variaciones
pueden producir tanto sustituciones de aminoácidos conservativas
como no conservativas.
Los ortólogos, homólogos y variantes alélicas
puede identificarse utilizando métodos bien conocidos en la
técnica. Estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que
codifica para una proteína que es homóloga al menos normalmente en
aproximadamente el 40%, más normalmente en al menos aproximadamente
el 60%-70%, y lo más normalmente en al menos aproximadamente el
80%, 85%, 90% o más a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ
ID NO:1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, o por lo demás descrita en el
presente documento, o un fragmento de esta secuencia. Tales
moléculas de ácido nucleico pueden identificarse rápidamente al
poder hibridarse en condiciones rigurosas, con la secuencia de
nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6,
o por lo demás descrita en el presente documento, o un fragmento de
la secuencia. Se entiende que la hibridación rigurosa no indica
homología sustancial cuando se debe a homología general, tal como
secuencias de poli A, o secuencias comunes a todas o la mayoría de
proteínas en un organismo o clase de proteínas.
Para determinar la homología en porcentaje de
dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de nucleótidos,
las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por
ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una proteína
o ácido nucleico para la alineación óptima con la otra proteína o
ácido nucleico). Se comparan entonces los residuos de aminoácidos o
nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de
nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en una secuencia
está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la
posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las
moléculas son homólogas en esa posición. Tal como se utiliza en el
presente documento, la "homología" de aminoácido o ácido
nucleico es equivalente a la "identidad" de aminoácido o ácido
nucleico. La homología en porcentaje entre las dos secuencias es
una función del número de posiciones idénticas compartidas por las
secuencias (es decir, la homología en porcentaje es igual al número
de posiciones idénticas / número total de posiciones 100 veces).
La invención también engloba proteínas o
polipéptidos que tienen un grado inferior de identidad pero que
tienen suficiente similitud de modo que realizan una o más de las
mismas funciones realizadas por las proteínas antitrombina
descritas en el presente documento. La similitud se determina
mediante la sustitución de aminoácidos conservados. Tales
sustituciones son aquellas que sustituyen el aminoácido dado en un
polipéptido por otro aminoácido de características similares. Es
probable que las sustituciones conservativas sean fenotípicamente
silenciosas. Una guía acerca de qué cambios de aminoácidos es
probable que sean fenotípicamente silenciosos se encuentra en Bowie
et al. Science 247:1306-1310 (1990).
Tanto la identidad como la similitud pueden
calcularse rápidamente (Computational Molecular Biology, Lesk,
A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing:
Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press,
Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1,
Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey,
1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,
Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and
Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Los
métodos de programa informático preferidos para determinar la
identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se
limitan a, paquete de programas CGC (Devereux, J. (1984) Nuc. Acids
Res. 12(1):387), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul, S.F.
(1990) J. Molec. Biol. 215:403); utilizando los parámetros por
defecto disponibles dentro del programa. Por similitud, identidad u
homología de secuencia sustancial, se pretenden secuencias que
tienen una similitud de al menos aproximadamente el 60%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 95% o más.
Las secuencias de ADN también pueden
sintetizarse químicamente o modificarse mediante mutagénesis
dirigida al sitio para reflejar la preferencia de codones de la
célula huésped y aumentar la eficacia de expresión.
Las proteínas de la invención pueden modificarse
mediante ingeniería según la presente invención, mediante métodos
químicos o técnicas de biología molecular. Los métodos de biología
molecular son los más convenientes dado que las proteínas pueden
modificarse mediante ingeniería manipulando las secuencias de ADN
que las codifican. Puede utilizarse ADN genómico, ADNc, ADN
sintético y cualquier combinación de los mismos, para este fin. Las
secuencias de ADN genómico, o secuencias de ADNc que codifican para
las proteínas pueden aislarse basándose en la secuencia de
aminoácidos de las proteínas o ciertas propiedades de las proteínas.
Se conocen muchos métodos de aislamiento de secuencias en la
técnica de la biología molecular. Véase particularmente, Sambrook
et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York).
Para producir un polipéptido antitrombina
mediante tecnología de ADN recombinante, se prepara un gen que
codifica para un polipéptido de la invención. La secuencia
codificante de ADN normalmente no contiene intrones. La secuencia
de ADN se aísla y purifica, el gen se inserta en un vector de
expresión que puede conducir la expresión y la producción del
producto recombinante. La secuencia de ADN puede ser una secuencia
de ADNc, o alternativamente una secuencia de ADN sintético. Un gen
sintético se prepara normalmente sintetizando químicamente
oligonucleótidos que, en total, corresponden al gen deseado. Los
oligonucleótidos sintetizados se ensamblan entonces para obtener el
gen.
Si se desea, la secuencia del gen puede
modificarse mediante mutagénesis dirigida al sitio para introducir
uno o más cambios codificantes. Normalmente, se construye un gen con
sitios de restricción en cada extremo para facilitar su posterior
manipulación.
La secuencia de ADN puede construirse para
comprender un péptido líder. El péptido líder puede dirigir la
secreción de polipéptido desde las células en las que el polipéptido
va a expresarse. La secuencia que codifica para el péptido líder se
fusiona normalmente al extremo 5' de la secuencia de ADN que
codifica para el polipéptido. Se conocen secuencias líder en la
técnica e incluyen el péptido líder OmpA, el péptido líder de la
proteína G del virus de la estomatitis vesicular (proteína G de
VEV). El líder OmpA es útil cuando la expresión es en un huésped
bacteriano, tal como E. coli mientras que la proteína VEVG es
útil cuando la expresión es en células de insecto.
La secuencia de ADN puede construirse para
comprender un sitio escindible para liberar el polipéptido de la
invención. Puede utilizarse una secuencia de ADN que codifica para
una secuencia de polipéptido portador fusionada a través de un
enlace escindible al extremo N-terminal de un
polipéptido de la invención. El enlace escindible puede ser uno
escindible mediante bromuro de cianógeno.
Para la expresión de los polipéptidos, se
construye un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN
que codifica para el polipéptido, que puede expresar el polipéptido
en un huésped adecuado. Se proporcionan otros elementos de control
transcripcional y traduccional apropiados, incluyendo un promotor
para la secuencia de ADN, un sitio de terminación de la
transcripción y codones de inicio y terminación de la traducción. La
secuencia de ADN se proporciona en el marco correcto de modo que se
permita que la expresión del polipéptido se produzca en un huésped
compatible con el vector.
El vector de expresión normalmente comprende un
origen de replicación y, si se desea, un gen marcador seleccionable
tal como resistencia a antibióticos. El vector de expresión puede
ser un plásmido, un virus, particularmente un baculovirus, y
similares.
Una vez que se han aislado las secuencias de
nucleótidos que codifican para las proteínas antitrombina de la
invención, pueden manipularse y utilizarse para expresar la proteína
en una variedad de huéspedes incluyendo otros organismos, incluyendo
microorganismos.
Una vez que se identifica y conoce la secuencia
de nucleótidos, los expertos en la técnica pueden producir grandes
cantidades de la proteína para uso terapéutico. En consecuencia, la
proteína recombinante y los métodos para producir la proteína
recombinante están englobados por la presente invención. De esta
manera, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
antitrombina puede utilizarse en vectores para la expresión en
varios tipos de células huésped, incluyendo tanto procariotas como
eucariotas, para producir grandes cantidades de la proteína, o
análogos activos, o fragmentos de los mismos, y otros constructos
que tienen actividad antitrombina.
Generalmente, los métodos para la expresión de
ADN recombinante se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo,
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory. Adicionalmente, las células huésped y los vectores de
expresión, tales como la expresión en baculovirus descrita en las
patentes de los EE.UU. números 4.745.051 y 4.879.236. En general,
un vector de expresión de baculovirus comprende un genoma de
baculovirus que contiene el gen que va a expresarse insertado en el
gen de poliedro en una posición que oscila desde la señal de inicio
de la transcripción del poliedro hasta el sitio de inicio ATG y bajo
el control transcripcional de un promotor de poliedro de
baculovirus.
Está disponible una amplia variedad de vectores
procariotas y microbianos adecuados. Asimismo, están disponibles en
la técnica los promotores y otros agentes reguladores utilizados en
la expresión de proteínas foráneas. Los promotores utilizados
comúnmente en vectores de expresión microbianos recombinantes se
conocen en la técnica e incluyen los sistemas de promotor de
beta-lictamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang et
al. (1978) Nature 275:615 y Goeddel et al. (1979) Nature
281:544); sistema de promotor de triptófano A (Goeddel et al.
(1980) Nucleic Acids Res. 8:4057 y la publicación de solicitud de
la EPO número 36.776); y el promotor Tac (DeBoer et al.
(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 80:21). Aunque estos se
utilizan comúnmente, están disponibles otros promotores
microbianos. Se han publicado detalles referentes a las secuencias
de nucleótidos de muchos, permitiendo que un trabajador experto las
ligue operativamente a ADN que codifica para la proteína en vectores
de plásmido o virales. Véase, por ejemplo, Siedenlist et al.
(1980) Cell 20:269.
Las células huésped eucariotas tales como de
levaduras pueden transformarse con vectores que codifican para
proteínas adecuados. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU.
número 4.745.057. Saccharomyces cerevisiae es el utilizado
más comúnmente entre los microorganismos huésped eucariotas
inferiores, aunque están disponibles comúnmente varias otras cepas.
Los vectores de levaduras pueden contener un origen de replicación
desde el plásmido de levaduras de 2 micras o una secuencia de
replicación autónoma (SRA), un promotor, ADN que codifica para la
proteína deseada, secuencias para poliadenilación y terminación de
la transcripción y un gen de selección. Un plásmido a modo de
ejemplo es YRp7, (Stinchcomb et al. (1979) Nature 282:9;
Kingsman et al. (1979) Gene 7:141; Tschemper et al.
(1980) Gene 10:157). Este plásmido contiene el gen trp1, que
proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de
levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por
ejemplo, ATCC nº 44076 o PEP4-1 (Jones (1977)
Genetics 85:12). La presencia de la lesión de trp1 en el genoma de
la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno
eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en
ausencia de triptófano.
Las secuencias de promotor adecuadas para su uso
en vectores de levaduras incluyen los promotores para
metalotioneína, alcohol deshidrogenasa, adenilato ciclasa,
3-fosfoglicerato cinasa ((Hitzeman et al.
(1980) J. Biol. Chem. 255:2073) y otras enzimas glucolíticas (Hess
et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; y Holland et
al. (1978) Biochemistry 17:4900) tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato
isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa.
Vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en
levaduras se describen además en R. Hitzeman et al. Publ. de
la EPO nº 73.657.
La invención proporciona preparaciones de
anticuerpos que se unen selectivamente a las proteínas de la
invención, o cualquier variante o fragmento de las mismas tal como
se describió. Un anticuerpo se considera que se une selectivamente,
incluso si se une también a otras proteínas que no sean
sustancialmente homólogas a la proteína antitrombina. Estas otras
proteínas comparten homología con un fragmento o dominio de la
proteína antitrombina dando lugar a anticuerpos que se unen a ambas
proteínas en virtud de la secuencia homóloga. En este aspecto, se
reconoce que la unión de anticuerpos a la proteína antitrombina es
aún selectiva.
Las preparaciones engloban anticuerpos
monoclonales o policlonales, anticuerpos intactos o fragmentos de
los mismos (por ejemplo, Fab), preparaciones purificadas tales como
preparaciones purificadas por afinidad, o preparaciones menos puras
tales como líquido ascítico, sueros y similares. Los métodos para
producir anticuerpos se conocen bien en la técnica e incluyen pero
no se limitan a los descritos en Harlow y Lane (1988) Antibodies, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). La
invención también realiza preparaciones de anticuerpos que
neutralizan las funciones biológicas de las proteínas
proporcionadas, variantes o fragmentos de las mismas. Tales
funciones incluyen pero no se limitan a actividad antitrombina. La
invención también proporciona combinaciones que pueden modular la
respuesta inmunitaria. Por modular la respuesta inmunitaria se
pretende que sea un cambio determinable en el sistema inmunitario
de un organismo huésped efectuado al administrar las composiciones
de la invención descritas en el presente documento a ese huésped. Se
proporcionan ejemplos de trabajo de tal modulación de la respuesta
inmunitaria, así como métodos para preparar y evaluar la
selectividad de las preparaciones de anticuerpos en la sección
experimental de esta solicitud, y se incorporan como referencia al
presente documento.
Las composiciones de la presente invención
encuentran uso terapéutico como vacunas veterinarias en el
tratamiento de la hematofagia en un mamífero. Los métodos
comprenden administrar al mamífero una vacuna veterinaria que
comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones
de la invención. En este aspecto, una cantidad terapéuticamente
eficaz se pretende que sea esa cantidad que logra una reducción,
mejoría, eliminación o prevención determinable de la infestación
hematofágica en el mamífero al que se administró la vacuna de la
presente invención. Aunque las vacunas de la invención pueden
utilizarse con cualquier mamífero, de particular interés son los
animales de cría, más particularmente, caballos, ganado y similares.
Las composiciones son útiles para la vacunación frente a la mosca
hematofágica del suborden Cyclorrhapha, más particularmente de la
especie Haematobia irritans, incluso más particularmente de
la subespecie irritans o exigua. Sin embargo, la
vacunación de la invención frente a cualquier organismo hematofágico
en la que tal vacunación que utiliza las composiciones y métodos de
la presente invención es terapéuticamente eficaz.
Para aplicaciones veterinarias, las
composiciones de la invención pueden formularse en cualquier
preparación farmacéutica aceptable tal como se describe a
continuación o cualquier otra preparación aceptable para uso
veterinario. En una realización de la invención, las vacunas
comprenden cantidades terapéuticamente eficaces de las proteínas de
la invención, o cualquier variante o fragmento de las mismas tal
como se describen en el presente documento.
En una realización preferida, las vacunas
comprenden las composiciones de nucleótidos de la invención tal
como se describen en el presente documento. Tal como se describe por
Cox et al. (1993) J. Virol. 67:5664-5667;
Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:11478-11482; y Lewis et al. (1997) Vaccine
15:861-864; y revisado por Robinson (1997) Vaccine
15:785-787; y Tighe et al. (1988) Immunol.
Today 19:89-97, pueden construirse y producirse
fácilmente vacunas de ácido nucleico. En general, las secuencias de
ADN diana que codifican para la proteína que va a utilizarse como
inmunógeno se clonan en vectores de expresión eucariotas. El
plásmido construido se hace crecer en bacterias y se purifica. El
ADN de plásmido purificado se inyecta directamente al animal
generalmente mediante inyección intramuscular, pero también mediante
inyección transdérmica; en la que su expresión por las células en
el huésped inoculado produce la proteína diana, produciendo así una
respuesta inmunitaria. Véase, por ejemplo, Cox et al. (1993)
J. Virol. 67:5664-5667. Pueden utilizarse niveles
de nanogramos de proteína expresada por el ADN para estimular una
respuesta inmunitaria y proteger frente a agentes infecciosos
obtenidos mediante las inoculaciones en la piel, músculo e
intravenosas de ADN. Véase, por ejemplo, Fynan et al. (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482; Cox et
al. (1993) J. Virol. 67:5664-5667. Tales
plásmidos introducidos mediante inyección intramuscular o
intradérmica estimulan una respuesta protectora que elimina la
enfermedad clínica tras la exposición.
Las composiciones de la presente invención
pueden formularse en preparaciones farmacéuticas para su uso
terapéutico como agentes antitrombina. Tales composiciones
encuentran uso en el tratamiento de la trombosis venosa, oclusión
por derivación vascular y coagulación intravascular diseminada
incluida por trombina.
Las composiciones de la invención pueden
utilizarse solas o en combinación con otros agentes terapéuticos y
antitrombina incluyendo agentes veterinarios tales como vacunas. Se
conocen en la técnica otros agentes.
Las composiciones antitrombina pueden formularse
según métodos conocidos para preparar composiciones
farmacéuticamente útiles, tales como mediante mezclado con un
vehículo excipiente farmacéuticamente aceptable. Vehículos adecuados
y su formulación se describen, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences 19ª ed., Osol, A. (ed.), Mack Easton PA
(1980). Con el fin de formar una composición farmacéuticamente
aceptable adecuada para la administración eficaz, tales
composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína
antitrombina, ya sea sola o con una cantidad adecuada de vehículo
excipiente.
Pueden emplearse métodos farmacéuticos
adicionales para controlar la duración de la acción. Pueden
obtenerse preparaciones de liberación controlada mediante el uso de
polímeros para complejar o absorber las composiciones. La
administración controlada puede ejercerse seleccionando
macromoléculas apropiadas (por ejemplo, poliésteres,
poliaminoácidos, polivinilpirrolidona,
etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa,
carboximetilcelulosa o sulfato de protamina). La velocidad de
liberación del fármaco puede controlarse también alterando la
concentración de tales macromoléculas.
Otro método posible para controlar la duración
de la acción comprende incorporar los agentes terapéuticos en
partículas de una sustancia polimérica tal como poliésteres,
poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros de
etileno-acetato de vinilo. Alternativamente, es
posible atrapar los agentes terapéuticos en microcápsulas
preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o
mediante polimerización interfacial, por ejemplo, mediante el uso
de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina o microcápsulas
de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en un
sistema de administración de fármaco coloidal, por ejemplo,
liposomas, albúmina, microesferas, microemulsiones, nanopartículas,
nanocápsulas, o en macroemulsiones. Tales enseñanzas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).
En realizaciones más específicas, puede
convertirse un polipéptido de la invención en una sal
farmacéuticamente aceptable. Puede convertirse en una sal de
adición de ácido con un ácido orgánico o inorgánico. Los ácidos
adecuados incluyen ácido acético, succínico y clorhídrico.
Alternativamente, el péptido puede convertirse en una sal de ácido
carboxílico tal como la sal de amonio o la sal de metal alcalino,
tal como la sal de sodio o potasio.
Puede utilizarse un polipéptido o sal
farmacéuticamente aceptable del mismo en una composición
farmacéutica, junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente
aceptable para los mismos. Tal formulación es normalmente para la
administración intravenosa (en cuyo caso el vehículo es generalmente
solución salina estéril o agua de pureza aceptable). Por tanto,
puede utilizarse un polipéptido para la terapia y la profilaxis de
la trombosis y tromboembolias en un ser humano u otro mamífero,
incluyendo la profilaxis de trombosis posoperatoria, para la
terapia de choque aguda (por ejemplo, para choque séptico o
politraumático), para la terapia de coagulopatías por consumo, en
hemodiálisis, hemoseparaciones y en circulación sanguínea
extracorporal. En una realización de la invención, el polipéptido o
la sal del mismo puede coadministrarse con un activador del
plasminógeno, tal como un activador del plasminógeno tisular.
La dosificación depende especialmente de la
forma específica de administración y del fin de la terapia o
profilaxis. El tamaño de las dosis individuales y el régimen de
administración pueden determinarse de la mejor manera por medio de
un criterio individual del caso particular de enfermedad; los
métodos para determinar los factores sanguíneos relevantes
requeridos para este fin son familiares para la persona experta en
la técnica. Normalmente, en el caso de una inyección de la cantidad
terapéuticamente eficaz de los compuestos según la invención es en
el intervalo de dosificación de desde aproximadamente desde 0,005 o
0,01 hasta aproximadamente 0,05 p 0,1 mg/kg de peso corporal,
preferiblemente desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente
0,05 mg/kg de peso corporal.
La administración se efectúa mediante inyección
intravenosa, intramuscular o subcutánea. En consecuencia, las
composiciones farmacéuticas para la administración parenteral en
forma de dosis única contienen por dosis, dependiendo del modo de
administración, desde aproximadamente 0,4 hasta aproximadamente 7,5
mg del compuesto según la invención. Además del principio activo,
estas composiciones farmacéuticas también contienen normalmente un
tampón, por ejemplo, un tampón fosfato, que se pretende que mantenga
el valor de pH entre aproximadamente 3,5 y 7, y también cloruro de
sodio, manitol o sorbitol para ajustar la isotonicidad. Las
preparaciones pueden liofilizarse o disolverse. Puede incluirse un
conservante activo de manera antibacteriana, por ejemplo, desde el
0,2 hasta el 0,5% de éster metílico o éster etílico del ácido
4-hidroxibenzoico.
Una composición para la aplicación tópica puede
estar en la forma de una solución acuosa, loción o gel, una
solución o suspensión aceitosa o que contiene grasa o, especialmente
una pomada emulsionada. Se obtiene una composición en la forma de
una solución acuosa, por ejemplo, disolviendo los principios activos
según la invención, o una sal terapéuticamente aceptable de los
mismos, en una solución tampón acuosa de desde, por ejemplo, pH 4
hasta pH 6,5 y, si se desea, añadiendo un principio activo
adicional, por ejemplo, un agente antiinflamatorio, y/o un
aglutinante polimérico, por ejemplo polivinilpirrolidona, y/o un
conservante. La concentración de principios activos es desde
aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1,5 mg, preferiblemente
desde 0,25 hasta 1,0 mg, en 10 ml de una solución o 10 g de un
gel.
Se obtiene una forma aceitosa de administración
para aplicación tópica, por ejemplo, suspendiendo el principio
activo según la invención, o una sal terapéuticamente aceptable del
mismo, en un aceite, opcionalmente con la adición de agentes de
hinchamiento, tales como estearato de magnesio, y/o surfactantes
(tensioactivos) que tienen un valor de HLB ("equilibrio
hidrófilo-lipófilo") inferior a 10, tales como
monómeros de ácido graso de alcoholes polihidroxilados, por
ejemplo, monoestearato de glicerina, monolaurato de sorbitano,
monoestearato de sorbitano o monooleato de sorbitano. Se obtiene
una pomada que contiene grasa, por ejemplo, suspendiendo el
principio activo según la invención, o una sal del mismo, en una
base grasa extendible, opcionalmente con la adición de un
tensioactivo que tiene un valor de HLB inferior a 10. Se obtiene una
pomada emulsionada triturando una solución acuosa del principio
activo según la invención, o una sal del mismo, en una base grasa
extendible, suave con la adición de un tensioactivo que tiene un
valor de HLB inferior a 10. Todas estas formas para la aplicación
tópica también pueden contener conservantes. La concentración de
principio activo es desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente
1,5 mg, preferiblemente desde 0,25 hasta 1,0 mg, en aproximadamente
10 g de base.
Además de las composiciones descritas
anteriormente y composiciones farmacéuticas análogas a las mismas
que se destinan al uso medicinal directo en el cuerpo de un ser
humano o un mamífero, la presente invención se refiere también a
composiciones y preparaciones farmacéuticas para su uso medicinal
fuera del organismo vivo de seres humanos o mamíferos. Tales
composiciones y preparaciones se utilizan especialmente como
aditivos anticoagulantes para la sangre que se está sometiendo a
circulación o tratamiento fuera del organismo (por ejemplo,
hemoseparación). Tales preparaciones, tales como soluciones madre o
alternativamente preparaciones en forma de dosis única, son
similares en composición a las preparaciones para inyección
descritas anteriormente; sin embargo; la cantidad de concentración
del principio activo se basa ventajosamente en el volumen de sangre
que va a tratarse o, más precisamente, en su contenido en trombina.
Dependiendo del fin específico, la dosis adecuada es desde
aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 1,0 mg del principio
activo/litro de sangre, aunque el límite superior todavía puede
superarse sin riesgo ya que el agente es inocuo incluso en
cantidades relativamente elevadas.
Se enviaron crisálidas desde el U.S.D.A.
Livestock Insects Research Laboratory en Kerrville, Texas, de manera
bisemanal y se almacenaron a 4ºC hasta que se necesitaron. Se
sacaron y se colocaron en jaulas de acero inoxidable (18'' \times
18'' \times 18'') a temperatura ambiente (21 - 22ºC) con 16 : 8
horas (L : O) para promover la aparición de adultos. Se colocó una
almohadilla de algodón absorbente en la parte superior de cada jaula
y se usó como una mecha para suministrar sangre fresca a los
adultos de manera diaria.
Se usaron para algunos ensayos adultos cogidos
naturales tomados de la manada lechera de la Universidad de Arizona
y de las terneras y manada lechera de la universidad de Auburn. Se
transportaron al laboratorio en el plazo de una hora desde la
recogida y se mantuvieron tal como anteriormente, antes de la
experimentación.
Ambos sexos de H. irritans se alimentan
con sangre de manera estricta y sus glándulas salivales son
similares en morfología y localización en el cuerpo de las moscas
de los establos (Stomoxys calcitrans) y moscas tsetsé
(Glossina spp.). Se usó el siguiente protocolo para la
disección de las glándulas: (a) se "fulminó" la mosca con
CO_{2} humidificado, se hizo pasar brevemente a través de un baño
de etanol (ETOH) al 70%, y entonces se enjuagó con agua desionizada;
(b) se colocó en un portaobjetos de vidrio limpio en un gota de
solución salina 0,15 M helada y se extirparon las patas, alas y
cabeza. Se abrió sagitalmente el tórax usando una cuchilla de
navaja o un bisturí; (c) se transfirió entonces la mosca a una gota
nueva de solución salina helada en un vidrio de reloj o una placa
pequeña llena de parafina. Entonces usando agujas de disección
diminutas, se despegaron las dos mitades del tórax; (d) usando
pinzas, se tiró hacia afuera de la cutícula abdominal, exponiendo
los órganos internos. Entonces se sacaron las glándulas salivales
del tejido del intestino. Se sujetó el extremo anterior del
intestino (el cardias) y entonces se retiró un conjunto de glándulas
salivales - intestino empujándolo a través de la constricción
torácica abdominal: (e) Entonces se sacaron las glándulas del
intestino, se enjuagaron una vez en solución salina fría y se
transfirieron a un tubo Eppendorf para mantenerse en hielo para la
recogida, y entonces se congelaron a -70ºC.
Se prepararon extractos de glándulas salivales
(EGS) tal como se describió en Cupp et al. (1993) J. Insect
Physiol. 39 : 817-821, o mediante sonicación. Por el
primer método, se homogeneizaron las glándulas en un mezcla 1 : 1 de
solución de NaCl 0,15 M y se añadió Triton X-100 al
0,1% a la muestra descongelada, que se congeló entonces de nuevo. Se
prepararon extractos descongelando las muestras solubilizadas,
agitándolas con vortex durante 30 segundos y centrifugándolas
después a 14.000 x g durante 30 segundos a 4ºC. Por este último
método, se obtuvo la perturbación sónica de las glándulas usando el
ciclo del 70% y una potencia de salida del 70% de un sonicador
Sonifier 450 (Branson Ultrasonics, Danbury, CT) durante 2 minutos.
Se descongelaron los tubos Eppendorf con glándulas y se perturbó el
contenido cogiendo la punta de cada tubo hacia la base de la sonda
sónica inmersa en un baño de hielo para dispersar el calor. Se
transfirieron los extractos de glándulas salivales a un tubo nuevo
tras la eliminación de fragmentos de células mediante centrifugación
a \sim 12.000 x g durante 5 minutos a 4ºC. Se determinó la
cantidad de proteína por glándula individual usando un kit de ensayo
de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). La medición inicial de
proteína soluble obtenida a partir de glándulas salivales de H.
irritans sonicadas fue de 0,54 \pm 0,09 \mug/par de
glándulas para las hembras y de 0,63 \pm 0,02 \mug/par de
glándulas para los machos.
Para determinar la actividad antihemostática
atribuible específicamente a la secreción salival, se combinaron
dos métodos que se han usado previamente para la mosca de los
búfalos (Kerlin y Hughes (1992) Med. Vet. Entomol. 6 :
121-126) y mosquitos (Hurlbut (1996) Am. J. Trop.
Med. Hyg. 15:989-993) para recoger saliva a partir
de esos insectos. Se privó de comida a moscas adultas, mantenidas a
temperatura ambiente, durante 24 horas para garantizar que las
secreciones se retuvieron en las glándulas salivales y que se
digirió todo el contenido de intestino. Es necesaria esta última
precaución ya que las moscas muscoides a menudo regurgitan durante
la alimentación. Se anestesiaron entonces las moscas con CO_{2}
humidificado y se extirparon sus alas con unas tijeras de
microdissección. Entonces se pegaron las moscas sin alas a
bastoncillos aplicadores de tal manera que sus partes de la boca
pudieron situarse dentro de un tubo capilar que contenía aceite
mineral. Justo antes de esta etapa, se inyectó a cada mosca 1 \mul
de serotonina 80 mM. Se insertó entonces la probóscide de la mosca
en el aceite que, debido a su diferencia de viscosidad con la
saliva, sirvió como un medio colector para las secreciones inducidas
por serotonina. Normalmente, la salivación empezó en
30-60 segundos y pudo observarse fácilmente la
saliva como una gotita acuosa transparente cuando se expulsó hacia
el aceite.
A menos que se indique lo contrario, se
resolvieron las proteínas en geles de poliacrilamida/SDS al 15%
(SDS-PAGE) mediante el método de Laemmeli (1970)
Nature 227:680-685, y se visualizó mediante tinción
con plata (Bassam et al. (1991) Annal. Biochem.
196:80-83). Se barrieron los geles teñidos mediante
análisis de densitometría de migración de bandas e intensidad de
tinción (Personal Densitometer S.I., ImageQuaNT para Windows NT,
Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
La figura 1 representa la comparación del peso
molecular de proteínas en saliva de moscas recogidas en colonia
(carril C) frente a recogidas en el campo (carril B) por movilidad
relativa en SDS-PAGE. Los pesos moleculares
habituales en el intervalo de 10 - 220 kDa se muestran en los
carriles A y D. Se observa un perfil muy similar excepto por la
presencia de una banda ligera a \approx 36 KDa en las moscas
recogidas en el campo. Sin embargo, la concentración de proteínas en
la saliva de las 30 moscas recogidas en el campo (B), tal como se
determinó mediante la intensidad relativa de la tinción de las
bandas, supera la de las correspondientes bandas en la saliva de
las 84 moscas de colonia 84 (C). Esta diferencia se observó
rutinariamente en geles teñidos con plata e indica que poblaciones
de campo de H. irritans producen mayores concentraciones de
proteínas salivales de lo que lo hacen las moscas de esta cepa
colonizada.
Se probó la actividad apirasa en EGS usando un
ensayo habitual (véase Cupp et al. (1993) j. Insect
Physiol.39:817-821). Esta enzima degrada
rápidamente adenosina trifosfato (ATP) y adenosina difosfato (ADP)
para dar el monofasto, eliminando de ese modo una señal química
crucial que normalmente promueve la agregación plaquetaria. Se
prepararon extractos a partir de moscas machos y hembras cogidas
naturales que se mantuvieron en agua durante 48 h antes de la
disección. La actividad en esta enzima en EGS fue ligeramente
detectable en H. irritans (2,59 \pm 0,21 miliunidades/par
de equivalentes de glándulas salivales). Esta carencia de actividad
apirasa se confirmó también por la incapacidad de la saliva de
H. irritans para afectar la agregación de plaquetas inducida
por ADP en plasma rico en plaquetas bovino (observaciones no
publicadas). Por tanto, se eliminó la actividad apirasa tal como un
mecanismo de hematofagia por H. irritans.
Se evaluó el potencial de la saliva de H.
irritans para inducir eritema, utilizando inyecciones
intradérmicas de EGS o por alimentación directa de moscas machos y
hembras en el lomo afeitado de un conejo blanco de Nueva Zelanda.
Como un control, también se inyectó EGS de Simulium vittatum
que producen un eritema persistente en un plazo de 15 min. desde la
administración intradérmica (Cupp et al. (1994) Am. J.Trop.
Med. Hyg. 50:235-240). Una cepa colonizada de S.
vittatum sirvió como fuente de material de glándulas salivales
(Bernardo et al. (1986) Ann. Entomol. Soc. Am.
79:610-621). No se produjo eritema ni por la saliva
de los machos ni de las hembras de H. irritans, ya fuera
inyectada como un EGS o administrada mediante una picadura. EGS de
Simulium vittatum produjo un eritema visible en un plazo de
15 minutos. Por tanto, se eliminó la actividad de eritema como un
mecanismo de hematofagia por
H. irritans.
H. irritans.
Se llevaron a cabo estudios para detectar la
presencia de actividad vasodilatadora en EGS de H. irritans o
saliva utilizando mediciones de tensión de bandas de estomago de
rata (ensayo para las prostaglandinas) y bandas aórticas de conejo,
con o sin endotelio intacto (véase Ribeiro et al. (1992) Exp.
Parasitol. 74:112-16; Ribeiro et al. (1994)
J. Med. Entomol. 31:747-753). Para detectar la
actividad histamina o bradicinina en EGS de H. irritans, el
ensayo siguió el procedimiento de Webster y Prado (1970) que utiliza
la contracción in vitro de íleon de cobaya como un ensayo
directo de la actividad cinina. Se obtuvieron respuestas normales a
las sustancias de prueba (prostaglandina E_{2} para bandas de
estomago de rata y norepinefrina o acetilcolina para bandas
aórticas de conejo), mientras que los EGS de H. irritans no
mostraron actividad vasodilatadora. Inicialmente, las recogidas de
saliva inducida mostró actividad en el ensayo de la banda de
estomago de rata pero esto se perdió cuando se incluyó maleato de
metilsergida (Pertz y Eich (1992) Navnyn Schmiedebergs Arch.
Pharmacol. 345:394-401). Esta sustancia es un
inhibidor conocido de la serotonina, el compuesto utilizado para
provocar la salivación por la mosca. La presencia de actividad en
saliva inducida por serotonina, pero no en EGS, indicó que la
actividad serotonina en aquellas muestras se derivó a partir del
compuesto inyectado utilizado para provocar la salivación. La
extracción de EGS de H. irritans para aumentar la detección
de actividad prostaglandina confirmó los resultados negativos del
estudio vasodilatador anterior. No se detectó actividad salival en
el ensayo de íleon de cobaya para bradicinina o histamina. Por
tanto, las actividades vasodilatadores probadas se eliminaron como
mecanismos de hematofagia por H. irritans. La incapacidad de
EGS de la mosca de los cuernos para provocar la vasodilatación
cuando se inyecta por vía intradérmica en la piel afeitada de
conejos de Nueva Zelanda, in vivo, se confirmó utilizando la
obtención de imágenes de perfusión por láser doppler.
Se seleccionó el ensayo de tiempo de
recalcificación para examinar la actividad anticoagulante, ya que
este ensayo general puede detectar inhibidores que atacan a
cualquiera de las tres ramas principales de la cascada de
coagulación; la ruta extrínseca, la ruta intrínseca y la ruta común
final. Se prepararon extractos de glándulas salivales tanto a
partir de H. irritans macho y hembra como a partir de S.
vittatum hembra. Se utilizaron EGS de la ultima especie tal
como un control positivo porque el mismo ensayo de tiempo de
recalcificación se ha utilizado anteriormente para detectar la
actividad anticoagulante en esa especie (Abebe et al. (1994)
J. Med. Entomol. 31:908-911). Los extractos de
glándulas salivales de H. irritans hembra fueron tan potentes
como aquellos de S. vittatum en retrasar el tiempo de
recalcificación de plasma normal tal como se muestra en la figura 2.
También los EGS de macho retrasaron el tiempo de recalcificación
(datos no mostrados). Tiene lugar una inhibición comparable a pesar
del hecho de que el contenido de proteínas medido fue un 50%
inferior en los extractos de H. irritans. Por tanto, esta
actividad anticoagulante fue la única actividad antihemostática
detectada para la mosca de los cuernos, H. irritans.
El ensayo de tiempo de recalcificación puede
detectar inhibición de cualquiera de las etapas en la cascada de
reacciones que conduce finalmente a la coagulación de la sangre
(coagulación), y por tanto es una prueba general útil para examinar
la presencia de un inhibidor desconocido. Debido a que la
coagulación de la sangre es el resultado de una serie de
reacciones, la saliva de la mosca de los cuernos podría retrasar la
coagulación inhibiendo una etapa específica en la cascada de
coagulación de la sangre o, alternativamente, retrasar la velocidad
normal de hemostasia disolviendo un coagulo después que se forme
(actividad fibrinolítica).
Para fines analíticos, las reacciones de
coagulación se agrupan normalmente en tres sub-rutas
que se monitorizan mediante diferentes ensayos de coagulación; es
decir, la ruta intrínseca (prueba del tiempo de tromboplastina
parcial activada = TTPA), la ruta extrínseca (prueba del tiempo de
protrombina = TTP) y la ruta común final (tiempo de trombina = TT).
Los ensayos del tiempo de recalcificación, TTP, TT y TTPA se conocen
bien por los expertos ordinarios en la técnica. Por ejemplo, véase
Biggs et al. ((1962) Human Blood Coagulation And Its
Disorders, 3ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford) para
los ensayos del tiempo de recalcificación, y Turgeon M.L. ((1993)
Clinical Hematology, Theory and Procedures, 2ª ed., Little, Brown y
Company, Boston) para los ensayos de TTPA, TTP y TT. TTPA II es una
modificación del ensayo de TTPA I y es más sensible.
Utilizando estas pruebas, se determinaron varias
propiedades de la actividad de anticoagulación de la mosca de los
cuernos tal como se muestran en la tabla 1: 1) saliva o extractos de
glándulas salivales de mosca de los cuernos produjeron un retraso
en la coagulación de todas las pruebas, indicando que al menos esta
presente un inhibidor que funciona en la ruta común final, es decir
después de la formación de trombina a partir de protrombina. 2) La
saliva de moscas de tipo natural contiene más actividad de inhibidor
que la saliva recogida a partir del mismo número de moscas de
colonia. 3) La actividad de inhibidor en moscas de colonia
mantenidas durante 48 horas después de aparecer, es mayor que 24
horas tras la aparición.
\vskip1.000000\baselineskip
| Fuente | nº de moscas | Tipo de ensayo | % de control* |
| EGS-colonia | 1 | Recalcificación | 106 |
| EGS-colonia | 2 | Recalcificación | 128 |
| Saliva-colonia (24 h) | 4 | Recalcificación | 143 |
| Saliva-colonia (48 h) | 4 | Recalcificación | 175 |
| Saliva-tipo natural | 1 | Recalcificación | 127 |
| Saliva-tipo natural | 2 | Recalcificación | 161 |
| EGS-colonia | 1 | TTPA-I | 113 |
| EGS-colonia | 2 | TTPA-I | 149 |
| Saliva -colonia | 1 | TTPA-I | 112 |
| EGS-colonia | 1 | TTPA-II | 144 |
| Saliva-tipo natural | 1 | TTPA-II | 210 |
| EGS-colonia | 1 | TTP | 120 |
| EGS-colonia | 2 | TTP | 140 |
| Saliva-tipo natural | 1 | TTP | 156 |
| EGS-colonia | 1 | TT | ND |
| EGS-colonia | 2 | TT | 109 |
| Saliva -tipo natural | 1 | TT | 158 |
| ND no determinado | |||
| *cada valor es la media de 4 ensayos. |
La inhibición de la coagulación en el ensayo de
TT por saliva de mosca de los cuernos indica que se selecciona como
diana una reacción que tiene lugar después de la formación de
trombina. Tienen lugar dos reacciones después de ese punto - 1) la
formación de monómeros de fibrina mediante la acción de la trombina
(factor II) sobre el fibrinógeno y 2) la reticulación de los
monómeros de fibrina mediante la acción del factor XIII. La trombina
está implicada también en la activación del factor XIII. Por tanto,
la trombina (factor II) fue una diana probable de la saliva de la
mosca de los cuernos. Para probar esta posibilidad, se determinaron
los tiempos de coagulación de plasma que se ha reducido en factor
II utilizando anticuerpos específicos (Sigmal Chemical, St. Louis,
MO). La adición de cantidades crecientes de plasma normal (que
contiene factor II), disminuyó el tiempo para la coagulación tal
como se midió mediante el ensayo de TTP (figura 3, - saliva). Cuando
se añadió saliva de la mosca de los cuernos (equivalente a 2
moscas) con las cantidades crecientes de plasma normal (figura 3, +
saliva), el retraso en porcentaje en el tiempo de coagulación
aumentó con cantidades crecientes de factor II (presente en el
plasma normal). Esta pauta indicó que la saliva contenía un
inhibidor específico del factor II.
La acción coagulante de la trombina puede
medirse utilizando un sustrato sintético (S238, American Diagnostica
Inc., Greenwich, CT) que produce un cromóforo tras la hidrólisis
por la trombina. Se midieron las velocidades de hidrólisis de S238
por trombina bovina sola (250 pM; figura 4, - saliva) y en presencia
de saliva de la mosca de los cuernos (equivalente a 2 moscas) a
concentraciones crecientes de sustrato en el intervalo de 2,5 - 100
\muM. Estos datos confirmaron la observación de que la saliva de
la mosca de los cuernos contiene un inhibidor de la trombina e
indica que puede ser un inhibidor competitivo, ya que su efecto
disminuye cuando el sustrato es ilimitado (100 \muM). Varios
modelos pueden explicar tal comportamiento bioquímico (Segel (1976)
Biochemical Calculations, John Wiley &
Sons, Nueva York). Para análisis, se genera un diagrama de Dixon determinando la velocidad (v) de la hidrólisis del sustrato por trombina en presencia de diferentes concentraciones fijas de sustrato, y representando l/v frente a la concentración del inhibidor. Esto proporciona los medios para identificar el tipo de inhibición y para determinar la constante de inhibición, Ki.
Sons, Nueva York). Para análisis, se genera un diagrama de Dixon determinando la velocidad (v) de la hidrólisis del sustrato por trombina en presencia de diferentes concentraciones fijas de sustrato, y representando l/v frente a la concentración del inhibidor. Esto proporciona los medios para identificar el tipo de inhibición y para determinar la constante de inhibición, Ki.
Caracterización de las propiedades físicas del
(de los) componente(s) de anticoagulación en glándulas
salivales de la mosca de los cuernos para crear un plan de
purificación
Los tiempos de coagulación TTPA en tabla 2
indican que la actividad en EGS disminuye después de asentar a
temperatura ambiente durante 60 minutos o cuando se somete a 100ºC
durante 5 minutos. La actividad precipita con etanol, y es
razonablemente estable para su tratamiento con acetonitrilo / TFA y
liofilización. Estas características físicas coinciden con un
inhibidor proteico que puede purificarse con procedimientos de HPLC
habituales utilizando elución en gradiente de acetonitrilo /
TFA.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tratamiento | Tiempo de coagulación TTPA (segundos) |
| Control | 52,3 |
| EGS-tiempo O | 62,6 |
| EGS-temperatura ambiente \times 60 min | 56,8 |
| EGS-100ºC \times 5 min | 55,2 |
| EGS-precipitado en etanol | 59,8 |
| EGS-sobrenadante de etanol | 50,1 |
| EGS-liofilizado | 57,0 |
| EGS-acetonitrilo al 50% / TFA al 0,1% | 57,8 |
Para el desarrollo de método analítico, se
reunió saliva de desde 100 hasta 150 moscas para cada serie de
HPLC. Para la separación preparativa, se utilizó saliva de más de
500 moscas para cada serie. Antes de la inyección en la columna, se
diluyó siempre la saliva reunida con el disolvente inicial de los
disolventes \ring{A} de gradiente emparejado. Se utilizó una
columna de de macroesferas, C18, 4,6 \times 250 nm, 300 \ring{A}
(AllTech) para todas las preparaciones de HPLC. Se monitorizó la
elución de proteína mediante absorción UV a 220 nM, que detecta
enlaces peptídicos. Se recogieron los componentes eluídos de la
columna en intervalos de 0,5 o de 1 minuto. Se transfirió una
alícuota para los ensayos de la actividad de cada fracción a un
segundo tubo que contenía albúmina de suero bovino (BSA) antes de
la liofilización de todas las muestras para eliminar los disolventes
orgánicos. Se reconstituyeron las fracciones secas con BSA
(utilizado para aumentar la solubilización de la proteína
purificada) con tampón Tris (tris 5 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 37ºC).
Se definió la actividad inhibidora en las fracciones mediante el
retraso en la formación de coágulos utilizando en ensayo de
recalcificación descrito anteriormente.
La figura 5 representa los tres procedimientos
en columna de HPLC de fase inversa utilizados para obtener una
preparación altamente pura de la actividad de anticoagulación. Las
líneas negras son cromatogramas de HPLC, mientras que las barras
grises indican tiempos de coagulación del ensayo de recalcificación.
El panel A muestra la separación por HPLC de saliva de H.
irritans utilizando elución en gradiente (acetonitrilo,
2-propanol, y TFA). El panel B muestra la separación
por HPLC de la fracción con la actividad de anticoagulación máxima
en "A" utilizando elución en gradiente (acetonitrilo y TFA). El
panel C muestra la separación por HPLC de la fracción con la
actividad de anticoagulación máxima en "B" utilizando elución
en gradiente (acetonitrilo y HCl). Los datos de coagulación de la
primera serie de fraccionamiento (A) indican que la saliva de la
mosca de los cuernos contiene sólo un inhibidor de la coagulación
que eluye a aproximadamente 45 minutos en las condiciones
utilizadas. Para la separación por HPLC secundaria, se combinaron
las fracciones del pico diana y se inyectaron directamente en la
columna después que se hubiera equilibrado la columna con el
disolvente inicial. Se conservó la actividad anticoagulante después
de 3 series de HPLC consecutivas, secándose a vacío y se almacenaron
durante 4 días a 4ºC.
La figura 6 muestra SDS-PAGE de
proteína anticoagulante salival de la mosca de los cuernos después
de la separación por HPLC de 3 etapas. El carril 1 contenía
marcador de concentración de proteínas; el carril 2, marcador
habitual de peso molecular de proteínas, el carril 3, la fracción
de HPLC con mayor actividad anticoagulante (figura
5-C) y el carril 4, la fracción de HPLC con menor
actividad anticoagulante (figura 5-C). Este perfil
indicó una única proteína de alta pureza con una movilidad relativa
de \sim 16,5 KDa.
Se descongeló ARN de glándulas salivales total
(almacenado en varias alícuotas a -70ºC durante un período de \sim
3
años), se reunió y se aisló el ARNm utilizando reactivos de poly(A) Quick® (Strategene, LaJolla, CA). Se construyó una biblioteca de ADNc utilizando un vector ZAP express^{TM} y un kit de Stratagene. Análisis preliminares de los números de insertos indicaron que se obtuvo un número relativamente pequeño de insertos primarios (\sim 3 \times 10^{4}). Aproximadamente se reservó un 1/5 de la biblioteca primaria y el restó se utilizó para una tanda de amplificaciones para dar un título de 5,1 \times 10^{6} unidades formadoras de placas (UFP) por ml.
años), se reunió y se aisló el ARNm utilizando reactivos de poly(A) Quick® (Strategene, LaJolla, CA). Se construyó una biblioteca de ADNc utilizando un vector ZAP express^{TM} y un kit de Stratagene. Análisis preliminares de los números de insertos indicaron que se obtuvo un número relativamente pequeño de insertos primarios (\sim 3 \times 10^{4}). Aproximadamente se reservó un 1/5 de la biblioteca primaria y el restó se utilizó para una tanda de amplificaciones para dar un título de 5,1 \times 10^{6} unidades formadoras de placas (UFP) por ml.
Se envió una cantidad estimada de 110 pmoles de
trombostasina pura por HPLC al Laboratorio de Microquímica de
Harvard para obtener una masa molecular precisa mediante
espectroscopia de masas y la identificación de 30 residuos de la
secuencia amino-terminal (N-). Aunque el análisis
mediante SDS-PAGE indicó sistemáticamente una masa
de \sim 16,5 KDa (véase, por ejemplo, la figura 6), la
espectroscopia de masas de la muestra pura por HPLC detectó una
"familia" aparente de 4 proteínas con una masa promedio de 9,3
\pm 0,06 KDa. Se obtuvo una secuencia N-terminal
a partir de la proteína de \sim 9 KDa (SEQ ID NO: 3), indicando
que se obtuvieron las masas variables a partir de proteínas en gran
medida idénticas que pueden tener pares iónicos variables o que
difieren en tan sólo 1-2 aminoácidos. También
sugirió la secuencia procedente del extremo
N-terminal que la proteína es altamente ácida. Una
segunda muestra de trombostasina, que se purificó mediante HPLC y
se envió para análisis, dio una masa similar. Se volvieron a
analizar los restos no utilizados de esta segunda muestra mediante
SDS/PAGE. De nuevo la proteína corrió tal como una masa de \sim
16,5. La búsqueda de bibliografía científica reveló otro informe de
proteína altamente ácida que produce una masa molecular anómalamente
alta cuando se analiza mediante PAGE (Takano et al. (1988)
Biochemistry 27:1964-1972). Con el fin de confirmar
la masa molecular, se sometió a SDS/PAGE una tercera serie de
trombostasina con actividad confirmada en un ensayo de
recalcificación. La banda única de proteína de \sim 16,5 KDa se
transfirió a una membrana de PVDF. La inmunotransferencia se tiñó
con ponceau S para revelar la banda de trombostasina transferida. Se
cortaron esta banda y una región de control de área similar y se
enviaron al laboratorio de Harvard para el análisis de la secuencia.
La secuen-
cia N-terminal de este análisis (SAGPI) confirmó la identidad de los 5 primeros aminoácidos del extremo N-terminal.
cia N-terminal de este análisis (SAGPI) confirmó la identidad de los 5 primeros aminoácidos del extremo N-terminal.
La secuencia N-terminal obtenida
a partir de los 30 primeros residuos de trombostasina tal como se
expone en SEQ ID NO: 3 se utilizó para construir cebadores de
nucleótidos degenerados por el laboratorio de ADN de
Scout-Ritchey Research Center (SRRC) en la
universidad de Auburn. Para ADN molde, se utilizó una alícuota de
ADNc de glándulas salivales de Haematobia irritans que se
había extraído y congelado a -20ºC tras una síntesis de ADNc de
primera hebra para la construcción de la biblioteca descrita
anteriormente. Una reacción de PCR que utiliza este molde, el
cebador directo degenerado diseñado a partir de la secuencia
N-terminal de trombostasina y un cebador inverso de
oligo dT, dio un producto de aproximadamente 350 pares de bases. Se
utilizó una alícuota de 1 \mul del producto de PCR en una
reacción de ligamiento con el vector PCR 2.1 (Invitrogen
Corporation, San Diego, CA) a 14ºC durante la noche. Entonces se
transformaron células OneShot^{TM} (Invitrogen Corporation) con
el producto de ligamiento y se transfirieron a placas de
LB-agar que contenían ampicilina. Tras el
crecimiento durante la noche, fueron visibles colonias azules y
blancas representando células que contenían plásmido sin un inserto
(azul) y plásmidos con un inserto que perturbaban el gen de la
beta-galactosidasa (colonias blancas). Se
recogieron 10 colonias blancas y 2 colonias azules para la
amplificación en cultivo líquido en crecimiento durante la noche a
\sim 30ºC. Se conservaron alícuotas de cada cultivo mediante
almacenamiento en glicerol a -70ºC. Se estimó el tamaño del plásmido
visualmente mediante tinción con bromuro de etidio y comparación con
respecto a los marcadores de peso molecular. Se prepararon
minipreparaciones de ADN y se secuenciaron por el laboratorio de ADN
de SRRC utilizando cebadores basados en secuencias en el vector del
plásmido que flanquea el sitio de inserción de clonación
múltiple.
El análisis de la secuencia de aminoácidos
deducida de la proteína, expuesta en SEQ ID NO: 2, codificada por
el ADNc clonado mediante PCR expuesto en SEQ ID NO: 1, confirmó la
identidad de la trombostasina; es decir el ADNc codifica para una
proteína de \sim 9 KDa e incluye todos los aminoácidos revelados
por la secuenciación N-terminal, incluso aunque
sólo una parte de esa información se utilizara en la síntesis de
cebadores degenerados que permitan la amplificación por la PCR. El
veintiún por ciento de la supuesta proteína está compuesto por
residuos de ácido aspártico y glutámico. Esta información también
confirmó que el ADNc que codifica para la trombostasina activa está
contenido en la biblioteca de ADNc de H. irritans. Una
búsqueda de bases de datos de proteínas en GenBank no reveló
secuencias similares.
Se utilizó el fragmento de ADNc de trombostasina
clonado por PCR descrito anteriormente para producir una sonda
marcada con digoxigenina para examinar la biblioteca de ADNc de
H. irritans en condiciones muy rigurosas. Se sintetizó un
cebador marcado con digoxigenina mediante PCR utilizando el
fragmento de trombostasina clonado como molde y el sistema
Genius^{TM} (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) en una razón
de 1 : 5 de digoxigenina-11-dUTP
con respecto a dTTP. Se purificó el ADN marcado con digoxigenina
mediante electroforesis en gel de azarosa. Se estimó el rendimiento
de la sonda marcada mediante titulación y comparación visual con
respecto a ADN control marcado con DIG suministrado en el kit
Genius.
Se tranfectaron células XL1-blue
con 50.000 unidades formadoras de placas (ufp) a partir de la
biblioteca amplificada y se cultivaron en placa sobre una placa NZY
de 150 mm. Tras la incubación durante la noche, se enfrió la placa
durante 2 h a + 4ºC antes de que se prepararan las hibridaciones en
placa por duplicado con membranas de nylon y se trataron con sonda
con el fragmento de ADN marcado con digoxigenina, En resumen, se
desnaturalizó el ADN "hibridado" durante 5 min a TA, se secó
durante 5 min., se neutralizó 5 min. y se reticulizó en un
Stratalinker 1800 (Stratagene, LaJolla, CA) en un ciclo de
reticulación automática; la prehibridación y la hibridación fueron
en 5\times SSC, el 0,1% de N-lauroilsarcosina, el
0,02% de SDS, el 2% de reactivo de bloqueo y el 50% de formamida en
65ºC; se lavaron las membranas 4 veces antes de la visualización de
la trombostasina-DIG hibridada mediante incubación
con anti-digoxigenina conjugada a fosfatasa alcalina
seguida de sustrato que produce un producto coloreado azul. Se
subclonaron varias recogidas de placas de la primera selección para
confirmar clones positivos en una selección secundaria. Se extrajo
fago de las recogidas de placas en tampón SM y se amplificó
mediante crecimiento en células XL1-Blue MRF sobre
placas NZY tal como se describió anteriormente. Se aisló ADN en
minipreparaciones de colonias bacterianas hechas crecer durante la
noche. Se probaron clones positivos mediante amplificación por PCR
con cebadores internos inversos y directos específicos de
trombostasina que se sintetizaron basados en la secuencia del
fragmento de PCR clonado. Se probaron además los clones positivos
mediante un ensayo de placas adicional y mostraron ser puros
mediante hibridación de todas las colonias con la sonda
marcada/DIG.
Se obtuvieron fagémidos que contenían insertos
clonados por escisión automática utilizando el sistema
ExAssist/XLOLR y el protocolo de Stratagene. Se hicieron crecer
colonias sobre placas de LB-kanamicina y se
prepararon bloques de glicerol para su almacenamiento a -70ºC. Se
recogieron colonias similares para amplificación mediante
crecimiento durante la noche. Se extrajo ADN en minipreparaciones y
se analizaron mediante secuenciación de ciclo automático (SRRC) en
la dirección directa utilizando cebadores T3 y
trombostasina-F1 y en la dirección inversa
utilizando cebadores T7 y trombostasina-R1, y con
cebadores directos e inversos para secuencias internas a los
extremos terminales. Se obtuvieron y se secuenciaron varios clones
de ADNc. Las secuencias de nucleótidos para un ADNc parcial
designado como TB8 están expuestas en SEQ ID NO: 4, y la secuencia
de aminoácidos codificada por ellas está expuesta en SEQ ID NO: 5.
Se observa que los residuos de aminoácidos 88 -168 expuestos en SEQ
ID NO: 5 codificados por los nucleótidos 263 - 505 expuestos en SEQ
ID NO: 4 corresponden a la trombostasina activa.
Se utilizó el Wisconsin Package^{TM} del
Genetics Computer Group (GCG, Madison WI) para analizar las
secuencias de ácido nucleico y de la supuesta proteína de ADNc de
trombostasina.
Para obtener la secuencia de ADNc de longitud
completa, se empleó un procedimiento 5' RACE (amplificación rápida
de extremos de ADNc), utilizando ARNm de glándulas salivales y
cebadores internos que tienen una secuencia consenso en 3'
correspondiente a los clones de ADNc descritos anteriormente. Se
compilaron secuencias solapantes para determinar una secuencia de
ADNc de longitud completa compuesta. El clon TB8 de ADNc descrito
anteriormente se utilizó para construir un ADNc de longitud
completa que codifica para trombostasina, adaptando el clon para
contener los nucleótidos del extremo 5' determinados a partir del
procedimiento 5' RACE. Las secuencias de nucleótidos para el ADNc
de longitud completa están expuestas en SEQ ID NO: 6 y las
secuencias de aminoácidos codificadas por ellas están expuestas en
SEQ ID NO: 7. Se observa que los residuos de aminoácidos 95 -175
expuestos en SEQ ID NO: 7 codificados por los nucleótidos 283 - 525
expuestos en SEQ ID NO: 6 corresponden a la trombostasina
activa.
Se digirieron el ADN de plásmido de
trombostasina y el vector de transferencia pBacPAK8 (CLONTECH, Palo
Alto, CA) con 2 enzimas de restricción que cortan en los sitios de
clonación múltiple del plásmido pero no las secuencias internas de
trombostasina. La trombostasina escindida y pBacPAK8 linealizado se
purificaron mediante electroforesis en gel de TAE. Se escindieron
las bandas digeridas y se extrajo el ADN con el kit de preparación
de bandas "Sephaglas" (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Se
estableció una reacción de ligamiento (vector:inserto) 1:2 para que
discurriera durante la noche a 15ºC. Se transformaron células
OneShot^{TM} con el plásmido BacPAK8 que contiene el inserto de
trombostasina descrito para el fragmento de PCR. Las células
transformadas se hicieron crecer durante la noche en placas de
LB-ampicilina. Se seleccionaron varias colonias para
el líquido, se hicieron crecer durante la noche a 37ºC. Se
prepararon reservas en glicerol y se congelaron a -70ºC y se
prepararon preparaciones rápidas de plásmido para la evaluación del
tamaño mediante visualización en gel de agarosa. Se preparó ADN de
la minipreparación mediante purificación en columna (Qiagen Corp.,
Santa Clarita, CA) para la secuenciación del ADN utilizando el
cebador Bac 2 (CLONTECH).
Se generó un baculovirus recombinante que
contenía el inserto de trombostasina mediante cotransfección de
células Sf9 con ADN viral BacPAK6 digerido con BSu36I y Tb8/3 de
plásmido de trombostasina / BacPAK8 utilizando Lipofectin^{TM}
(Life Technologies, Grand Island, NY) como reactivo de transfección
y medio libre de suero High Five^{TM} (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Los controles incluyeron virus de tipo natural (control positivo) y
ADN de plásmido sólo (control negativo). Las células se incubaron
con medio de transfección durante 5 h a temperatura ambiente antes
de añadir medio TNM-FH que contenía un 10% de suero
bovino fetal (TNM-FH/FBS) y se incubaron además a
27ºC durante 72 h. Se recogió el sobrenadante del cultivo celular
que contenía el virus y se almacenó a 4ºC. Se realizó un ensayo de
placas para aislar los clones de virus-trombostasina
puros a partir del sobrenadante celular. Se infectaron placas de
treinta y cinco mm que contenían 1,5 X 10^{6} células Sf9 cada
una por duplicado con 100 \mul de sobrenadante o una dilución de
hasta 10^{-3} en un volumen de 100 \mul de medio
TNM-FH/FBS. Tras asentar durante 1 h a temperatura
ambiente, se eliminó el medio de infección y se recubrieron las
células con 3,5 ml cada una de medio de Grace (Life Technologies,
Grand Island, NY) que contenía un 10% de FBS, gentamicina 50
\mug/ml y un 1% de agarosa. Se incubaron las células en una caja
de almacenamiento de plástico con toallitas de papel húmedas a 27ºC.
Tras 5 días, se añadió un segundo recubrimiento que también incluía
colorante rojo neutro 0,16 mg/ml y XgaI 250 \mug/ml. Tras formar
el recubrimiento de agarosa un gel, se invirtieron las placas y se
incubaron durante 48 h a temperatura ambiente. Se recogieron placas
transparentes, positivas y el virus eluyó mediante incubación
durante la noche en medio TNM-FH. Se infectaron
células Sf9 con el virus eluido y se incubaron durante 4 días a 27ºC
para generar el virus de pase 1.
Se recogieron las células en solución salina
tamponada con fosfato (10 mM, pH 7,4) y se extrajo el ADN utilizando
el kit de microextracción de ADN y el protocolo II de Stratagene en
el manual de instrucciones. El ADN extraído se utilizó como molde
para PCR con un par de cebadores directo e inverso de trombostasina
y el par de cebadores Bac 1 /
Bac 2 (CLONTECH). La amplificación con ambos pares de cebadores garantizó que se produjera el acontecimiento de transformación correcto. Se realizó un segundo ensayo de placas para garantizar la pureza de los clones, y para determinar el título del virus.
Bac 2 (CLONTECH). La amplificación con ambos pares de cebadores garantizó que se produjera el acontecimiento de transformación correcto. Se realizó un segundo ensayo de placas para garantizar la pureza de los clones, y para determinar el título del virus.
Se infectaron células Sf9 con virus
(multiplicidad de infección = 2) y se incubaron a 27ºC hasta que se
recogieron los medios a las 12, 24, 48, 72 y 96 h. Se concentró el
virus y se retiró de los medios mediante centrifugación en
concentradores Centriplus^{TM} 100 (Amicon, Beverly, MA) a 3.000 x
g durante 2 h a temperatura ambiente. Se estimó la proteína total en
la fracción < 100 KDa mediante el ensayo de Lowry modificado
(Sigma Chemical, St. Louis, MO).
Se probaron la actividad anticoagulante y/o
antitrombina de r-trombostasina utilizando el ensayo
del sustrato cromogénico S238 tal como se describió
anteriormente.
Se concentraron los componentes de gran peso
molecular (\geq 10 KDa) en el sobrenadante de cultivo células
libre de virus mediante centrifugación a 3.000 x g durante 4 h en
concentradores Centriplus^{TM} 10. Se utiliza RP/HPLC que utiliza
una columna de macroesferas C18 y elución con un gradiente de
acetonitrilo para el aislamiento de r-trombostasina
a partir de otros componentes del medio tal como se describió
anteriormente.
Propiedades inmunogénicas de trombostasina en un
modelo de animales de laboratorio (conejos) como la primera etapa
hacia la producción de una vacuna de ácido nucleico (ADN) frente a
la mosca de los cuernos que se alimenta con sangre.
Las proteínas antihemostáticas en la saliva de
los insectos que se alimentan con sangre no son altamente
inmunogénicas (véase Cupp y Cupp (1997) J. Med. Entomol.
34:87-94). Esta observación experimental coincide
con el concepto intuitivo de que la generación de una respuesta
inmunitaria, especialmente la producción de anticuerpos
neutralizantes, podría prevenir o disminuir la alimentación con
sangre y la producción de progenie y buen estado físico. Por tanto,
es importante desarrollar métodos para provocar una respuesta
inmunitaria robusta ante tales moléculas. Además, la inmunización
eficaz de ganado en el campo también requiere una vacuna práctica
que necesita un mínimo de manejo y almacenamiento. En los últimos
años, la inmunización con ácidos nucleicos ha demostrado generar
fuertes respuestas inmunitarias frente a proteínas codificadas que
pueden dirigirse a compartimentos inmunitarios específicos mediante
la localización y/o cantidad de ácido nucleico administrado. Tales
vacunas, compuestas por plásmidos con el ADN de interés insertado,
pueden producirse a bajo coste y mediante técnicas relativamente
sencillas de cultivo bacteriano: son estables al almacenamiento a
temperatura ambiente y evitan así muchos de los problemas de las
vacunas basadas en proteínas. Por tanto, inicialmente, la
inmunización de los conejos se prueba con ácido nucleico de
trombostasina.
Se construye un plásmido de vacuna que contiene
el promotor CMV y resistencia a kanamicina para la selección. Se
utilizan los procedimientos de digestión por restricción y nuevo
ligamiento del vector de transferencia de baculovirus según se
describieron anteriormente para producir el plásmido de vacuna que
contiene la trombostasina (TS-Vac).
Se obtiene suero, que sirve como control de
preinmunización, de muestras de sangre tomadas de cada conejo a
través de la gran vena de la oreja. Se inyecta a nueve conejos por
vía intradérmica uno de tres plásmidos TS-Vac en
PBS (500 \mug de plásmido sin inserto = control; 200 \mug, o 500
\mug de TS-Vac = plásmidos de prueba). Se toma
una muestra de sangre después de aproximadamente 4 semanas y se
probaron para determinar la respuesta humoral (la presencia de
título de anticuerpos específicos) y celular (respuesta
blastogénica) frente a trombostasina. Se monitorizaron estos
parámetros de manera semanal posteriormente hasta 20 semanas tras
la inyección. Todos los ensayos inmunológicos utilizados son
habituales y se han utilizado en trabajo publicado previamente
sobre la respuesta inmunitaria a los factores de la saliva de
insectos que se alimentan con sangre (Cross et al. (1993) J.
Med. Entomol. 30:725-734; Cross et al. (1993)
J. Med. Entomol. 30:928-935).
Se determina el título de anticuerpos mediante
un ensayo ELISA directo (Cross et al. (1993) J. Med. Entomol.
30:725-734; Cross et al. (1993) J. Med.
Entomol. 30:928-935). Brevemente, se recubren placas
de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos con
r-trombostasina, o proteína no específica, luego se
bloquean con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% en PBS. Se
incuban los pocillos con sueros preinmunitarios o sueros de prueba,
luego se lavan con PBS-Tween antes de la adición de
IgG anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina
(Sigma Immunochemicals,
St. Louis, MO) o IgM anti-conejo (Southern Biotechnology Assoc. Inc., Birmingham, AL). Tras la reacción del sustrato con fosfato de p-nitrofenilo (pNPP), se lee la intensidad del color a 405 nm utilizando un lector de placas de microtitulación Spectramax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se calcula el titulo de anticuerpos y se compara entre tratamientos para determinar la cantidad óptima de inmunógeno para la generación de anticuerpos.
St. Louis, MO) o IgM anti-conejo (Southern Biotechnology Assoc. Inc., Birmingham, AL). Tras la reacción del sustrato con fosfato de p-nitrofenilo (pNPP), se lee la intensidad del color a 405 nm utilizando un lector de placas de microtitulación Spectramax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se calcula el titulo de anticuerpos y se compara entre tratamientos para determinar la cantidad óptima de inmunógeno para la generación de anticuerpos.
Se evalúan los anticuerpos para determinar la
especificidad por trombostasina mediante inmunotransferencia
puntual (Cross et al. (1993) J. Med. Entomol.
30:725-734) utilizando
r-trombostasina. Se siembra en puntos
r-trombostasina, o control de albúmina de suero
bovino (BSA) en pocillos de placas de microtitulación de fondo de
nitrocelulosa de 96 pocillos (Millipore, Marlborough, MA). Se
utiliza leche desnatada (3%) en PBS como una solución de bloqueo. Se
añaden los sueros de prueba y se incuban durante 1 h antes del
lavado y la reacción del sustrato. La especificidad de la reacción
se determina mediante inspección visual.
Se prueba la respuesta celular a la
trombostasina utilizando células mononucleares de sangre periféricas
(PBM) aisladas mediante centrifugación con
Ficoll-Paque de sangre recogida en EDTA como
anticoagulante (Ramachandra & Wickel (1992) J. Med. Entomol.
29:818-826). Se determina la viabilidad de las
células aisladas en una alícuota utilizando diacetato de
fluoresceína (FDA; Sigma, St. Louis, MO) que marca brillantemente
las células sanas. Se añaden PBM a 5 x 10^{5} células/pocillo de
una placa de microtitulación antes de la adición de
r-trombostasina, saliva de mosca de los cuernos o
proteína no específica. Se añade el mitógeno ConA y se continúa la
incubación durante 72 h. S determina la respuesta celular a la
proteína de prueba utilizando el ensayo de colorimetría de MTT
(Denizot y Land (1986) J. Immunol. Methods.
89(2):271-277) que se lee en el Spectromax a
570 nm. Se determina la respuesta blastogénica a trombostasina
mediante el aumento sobre el control. Puede monitorizarse la
comparación de la respuesta en presencia de la saliva completa para
los factores inmunomoduladores en la saliva.
Se le ocurrirán otras modificaciones y
realizaciones de la invención a un experto en la técnica a la que
pertenece esta invención, teniendo el beneficio de las enseñanzas
presentadas en el presente documento. Por tanto, ha de entenderse
que la invención no debe limitarse a las realizaciones específicas
descritas. Aunque se emplean términos específicos, se utilizan en
sentido genérico y descriptivo únicamente y no con fines de
limitación, y esas modificaciones y realizaciones se pretende que
estén incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
<110> Cupp, Eddie Wayne
\hskip1cmCupp, Mary Smith
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUCLEÓTIDOS Y PROTEÍNAS ANTITROMBINA
DE LA MOSCA DE LOS CUERNOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 5721-10
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haematobia irritans
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS (secuencia codificante)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) … (243)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haematobia irritans
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haematobia irritans
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 611
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haematobia irritans
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) … (505)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haematobia irritans
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 631
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haematobia irritans
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) … (525)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haematobia irritans
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Proteína purificada sustancialmente que tiene
actividad antitrombina, en la que dicha proteína comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada de:
- (a)
- una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- (b)
- una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, y
- (c)
- un fragmento de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, en la que dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de dicha secuencia.
2. Proteína según la reivindicación 1, parte
(b), que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en
al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:
2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7.
3. Proteína según la reivindicación 2, que
comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos
un 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en la secuencia SEQ ID
NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7.
4. Proteína según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína se aísla de las
glándulas salivales de una especie de Haematobia.
5. Proteína según la reivindicación 4, en la que
dicha especie es H. irritans.
6. Proteína según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína se produce mediante
métodos recombinantes.
7. Proteína según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína puede modular la
respuesta inmunitaria.
8. Secuencia de nucleótidos aislada que codifica
para una proteína que tiene actividad antitrombina, seleccionada
de:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6;
- (c)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- (d)
- una secuencia de nucleótidos que es idéntica en un 40% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6;
- (e)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15 residuos contiguos la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; y
- (f)
- una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6 en condiciones rigurosas.
9. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 8, parte (c) o (d), que comprende:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; o
- (b)
- una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6.
10. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 9, que comprende:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; o
- (b)
- una secuencia de nucleótidos que es idéntica en un 90% a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6.
11. Vector que comprende la secuencia de
nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
12. Célula huésped que comprende la secuencia de
nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
13. Preparación de anticuerpos que se une
selectivamente a una proteína que tiene actividad antitrombina, en
la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada de:
- (a)
- una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 40% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- (b)
- una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- (c)
- una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7;
- (d)
- una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7; y
- (e)
- un fragmento de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7, en el que dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de dicha secuencia.
14. Composición farmacológica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 y un excipiente aceptable
farmacéuticamente.
15. Vacuna veterinaria que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína según una de las
reivindicaciones 1 a 3 o de la secuencia de nucleótidos según una de
las reivindicaciones 8 a 10.
16. Proteína según una de las reivindicaciones 1
a 3 o una secuencia de nucleótidos según una de las reivindicaciones
8 a 10 para el uso en un método de tratamiento del cuerpo animal o
humano.
17. Uso de una proteína según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 o una secuencia de nucleótido según una
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en la fabricación de una
vacuna para tratar o prevenir la hematofagia en animales de
cría.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que
dichos animales de cría son ganado.
19. Uso de la proteína según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 en la fabricación de un medicamento para
tratar la trombosis en un mamífero.
20. Uso según la reivindicación 19, en el que
dicha proteína se produce mediante métodos recombinantes.
21. Método para producir una proteína que tiene
actividad antitrombina, comprendiendo dicho método:
- (a)
- cultivar una célula procariota o eucariota que se transforma con una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en condiciones en las que se produce dicha proteína; y
- (b)
- aislar dicha proteína.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9722798P | 1998-08-20 | 1998-08-20 | |
| US97227P | 1998-08-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2263286T3 true ES2263286T3 (es) | 2006-12-01 |
Family
ID=22262263
Family Applications (1)
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