CN101608176A

CN101608176A - 姚虻纤维蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和应用

Info

Publication number: CN101608176A
Application number: CNA200910094685XA
Authority: CN
Inventors: 赖仞; 马冬莹
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2009-12-23
Also published as: EP2450440A4; EP2450440A1; WO2011000263A1; CN103282091A; US20120183525A1

Abstract

本发明涉及一种姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin及其基因和应用，属于生物医学技术领域。本发明的姚虻蛋白酶tabfiblysin是从姚虻唾液腺中分离得到的一种活性蛋白质，分子量27145.5道尔顿，其全序列由255个氨基酸组成；姚虻蛋白酶tabfiblysin基因由871个核苷酸组成。本发明的姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin具有显著的水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集的作用，能作为制备治疗血栓性疾病药物的应用。

Description

姚虻纤维蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和应用

技术领域：

本发明提供一种姚虻纤维蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

血栓性疾病是一类严重影响人类健康的疾病，尤其是心脑血管血栓栓塞性疾病，已成为我国人口死亡的首要原因。及时给予抗栓药物，可大大提高病人的存活率，减轻脏器损害的程度和范围。抗栓药物主要包括溶栓药、抗凝药和抗血小板药。现有的抗凝药和抗血小板药存在着出血、血小板减少及停药后反弹等副作用。因此，人们正在积极寻找着各种生物来源的高效、特异、低毒的新型抗栓药物。

虻科昆虫俗称牛虻(horsefly)，隶属于节肢动物门双翅目短角亚目虻科，是重要的医学和兽医学昆虫。其成虫是一种中药材，俗称虻虫，具有活血化瘀，破积痛经的功效。其药用历史悠久，能为开发现代新药提供靶标和启示。与此同时，传统中药药物成分的复杂性及其炮制方法的局限性造成药物活性成分不能更好的发挥作用，因而从这些传统药物中寻找特定的活性单体化合物是中药现代化的重要内容之一。

经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。

发明内容：

本发明的目的旨在现有技术的基础上，提供一种姚虻纤维蛋白原水解酶及其基因和应用本发明的技术方案为：

姚虻蛋白酶tabfiblysin是我们首次从姚虻唾液腺中分离得到的一种活性蛋白质，分子量27145.5道尔顿。其全序列一级结构为：

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姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin基因的克隆包括：姚虻唾液腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选编码基因。基因测序结果表明编码唾液腺蛋白酶tabfiblysin基因由870个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

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本发明的姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin具有显著的水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集的作用，能作为制备治疗血栓性疾病药物的被应用。

附图说明：

图1为本发明的分子筛分离图。图中箭头所示为活性峰。

图2为本发明姚虻的水解纤维蛋白原作用结果图。

图3为本发明抑制血小板聚集作用的结果图。

具体实施方式：

实施例一：姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin基因的克隆：

一、姚虻唾液腺总RNA提取：

A.活体解剖姚虻，挑取唾液腺立即放入液氮中，迅速取一定量(0.5-2mg)唾液腺组织，加入已预冷的Trizol提取缓冲液(美国Invitrogen公司产品)，置于冰上匀浆15分钟。

B.加入Trizol 1/5体积的氯仿，剧烈混匀约15秒，室温放置5分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，取上清。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为姚虻唾液腺总RNA。

二、姚虻唾液腺mRNA的纯化：

姚虻唾液腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的

mRNAIsolation Systems试剂盒。

A.取姚虻唾液腺总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC300μl，至磁力架吸附30秒，最后加100μl 0.5×SSC悬浮，称之为B液。

C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加100μl DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入150μl DEPC水重悬，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，即为纯化的姚虻唾液腺mRNA。

D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

三、姚虻唾液腺cDNA文库构建：采用CLONTECH公司Creator^TM SMART^TM cDNALibrary Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

1.在无菌PCR管加入1μl姚虻唾液腺mRNA、1μl SMART IV引物、1μlCDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。

2.混匀并短暂离心，72℃保温2分钟。

3.将离心管在冰上孵育2分钟。

4.在离心管中加入以下试剂2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mMDTT、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript逆转录酶。

5.混合离心管中试剂并短暂离心，在42℃保温1小时。

6.将离心管置于冰上中止第一链的合成。

7.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链

1、95℃预热PCR仪。

2、将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。

3、在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，20秒钟；22个循环：95℃，5秒钟，68℃，6分钟。

4、循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

C.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

1.挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD₆₀₀值达到0.35时，收获细菌培养物。冰浴10min，于4℃以5000rpm离心10min，以回收细胞。

2.每ml初始培养液加600ul预冷的0.1mol/LCaCl₂-MgCl₂溶液重悬。

3.于4℃以5000rpm离心10min，以回收细胞。

4.每ml初始培养液加60ul预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬细胞沉淀，分装后备用。

D.酶切、连接以及连接产物的转化：

1.在微量离心管中加入1μl Takara pMD19-T载体、4μl无指盘臭蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。

2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。

3.16℃反应2小时。

4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟。

5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6.加入37℃温浴过的LB培养基900μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。

7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。

8.每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×10⁶个单独克隆。

四、姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin基因序列测定和结果：

根据分离纯化所得姚虻蛋白酶tabfiblysin的内肽氨基酸序列和双翅目昆虫密码子的偏嗜性，我们设计了一条简并引物NT3-F21，与构建姚虻唾液腺cDNA文库时所使用的接头引物CDSIII配对，正反向引物序列为：

NT3-F21：5’-Tac tcc gg(g/c)gac aa(a/g)ct(g/a)cc(c/g)cgc-3’；

CDSIII-primer：5’-att cta gag gcc gag gcg gcc atg-3’

以NT3-F21和3’PCR为引物，在我们已经构建好的姚虻唾液腺cDNA文库中筛选插入了编码tabfiblysin的cDNA序列的克隆。

根据测得的成熟蛋白的核苷酸序列设计反向引物和所构建的cDNA文库克隆的5’端保守序列为正向引物，正反向引物序列分别为：

5’primer：5’-aag cag tgg tat caa cgc aga gt-3’

NT3-R21：5’-(c/g)gg(t/c)ag(c/t)tt gtc(g/c)cc gga gta-3’

以我们所构建的姚虻唾液腺cDNA为模板，进行PCR。所获阳性单克隆核苷酸序列测定。测序结果表明编码tabfiblysin的cDNA序列由871个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

atgacttccataccggtgtccagctttttacttgcggccttagtactacaatacgcc

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实施例二：制备姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin：

一、姚虻唾液腺的解剖，匀浆与处理

姚虻解剖的方法如下：用小剪刀将虫体沿背中线剪开，放入4℃含0.15M NaClpH7.2的0.01M磷酸盐缓冲液中浸泡，挑取唾液腺，放入含上述缓冲液的烧杯中存于-20℃，解剖完毕后10000rpm离心10min，上清继续存放于-20℃，沉淀用玻璃匀浆器在冰上充分匀浆后10000rpm/min离心10min，合并两次离心上清，冻干并取部分样品水溶后用Sephadex G-25脱盐，冻干。

二、分离纯化的每一个步骤都用水解纤维蛋白原检测方法进行活性跟踪。

第一步，Sephadex G-75凝胶过滤：姚虻唾液腺匀浆液冻干粉溶解于0.05MTris-HCl+0.1M NaCl，pH7.2的缓冲液，上样于Sephadex-75(Pharmacia产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，用同样缓冲液洗脱，收集活性成分。

第二步，FPLC Resource S离子交换层析：Sephadex G-75凝胶过滤得到的活性成分峰，冻干溶解于水，于0.05M Tris-HCl pH 8.3缓冲液透析12hr；上样于Resource S柱，用一个0-0.5M NaCl的线性梯度进行洗脱，纯化得到纤维蛋白原水解酶。该步操作在AKTA Purifier FPLC系统中进行。

实施例三：姚虻唾液腺蛋白酶的药理实验：

一、纤维蛋白原水解活性检测

取10μL浓度为2mg/mL的纤维蛋白原(溶于含有150mM NaCl的50mMTris-HCl，pH7.4缓冲液)与样品于37℃保温24hr后，进行12％SDS-PAGE还原电泳分析。

二、血小板聚集抑制实验

富血浆小板聚集(PRP)抑制实验：健康人血小板用血浆稀释至2.5×10⁸个/mL。取富血浆血小板300μL，加入适量样品保温5min后，添加ADP诱导聚集，记录5min血小板聚集情况。

聚集抑制率(I)的计算：

I＝B/A×100％

A＝激动剂所能达到的最大聚集(本文为透光率，％)；

B＝样品作用后加入激动剂所能达到的最大聚集。

三、出血活性检测

将样品溶解到生理盐水中，对小白鼠进行皮下注射，24小时后，剥离小鼠皮肤，观察内皮出血斑的大小。以生理盐水做对照。

姚虻唾液腺蛋白酶的药理实验表明：姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin具有显著的水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集的作用。姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin能作为制备治疗血栓性疾病药物的被应用。

姚虻纤维蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和应用.ST25SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院昆明动物研究所

<120>姚虻纤维蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和应用

<130>1

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>872

<212>DNA

<213>Tabacus yao Macquart

<400>1

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<210>2

<211>255

<212>PRT

<213>Tabacus yao Macquart

<400>2

Met Thr Ser Ile Pro Val Ser Ser Phe Leu Leu Ala Ala Leu Val Leu

1 5 10 15

Gln Tyr Ala Thr Ser Asp Ala Val Asn Tyr Cys Arg Leu Pro Cys Arg

20 25 30

Gly Asp Asn Tyr His Val Gly Cys Gly Glu Pro Ala Tyr Ala Gln Glu

35 40 45

Cys Gly Gln Ser Pro Arg Thr Arg Glu Leu Leu Lys Glu His Arg Asn

50 55 60

姚虻纤维蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和应用.ST25

Glu Ile Leu Ser Lys Ile Asn Asp Val Arg Asp His Val Ala Lys Gly

65 70 75 80

Ser Trp Gly Leu Pro Val Ala Ala Arg Met Lys Val Val Val Trp Asp

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

Lys Glu Leu Ala Leu Ala Ile Ser Asp Arg Val Thr Ala Val Gly Cys

180 185 190

Gly Leu Thr Thr Trp Gln Asp Gly Ala Lys Ala Arg Ala Leu Leu Thr

195 200 205

Cys Asn Phe Ser Ser Gln Asn Thr Arg Gly Arg Pro Val Tyr Lys Ile

210 215 220

Gly Asn Ser Pro Gly Glu Lys Cys Ile Glu Lys Asp Glu Thr Tyr Lys

225 230 235 240

Asn Leu Cys Pro Ala Thr Glu Pro Ile Asp Pro Asn Lys Ser Asn

245 250 255

Claims

1、姚虻蛋白酶tabfiblysin，其特征在于姚虻蛋白酶tabfiblysin是从姚虻唾液腺中分离得到的一种活性蛋白质，分子量27145.5道尔顿，其全序列一级结构为：

MTSIPVSSFLLAALVLQYATSDAVNYCRLPCRGDNYHVGCGEPAYAQECGQSPRTRELLKEHRNEILSK

INDVRDHVAKGSWGLPVAARMKVVVWDAELAGLAKRHTKGCVGETHACRNTERFWLPGQLNFKYSGDKL

PRIKELIDDAVKKGHLQKHNITREIIGNYRENGPNGDVKELALAISDRVTAVGCGLTTWQDGAKARALL

TCNFSSQNTRGRPVYKIGNSPGEKCIEKDETYKNLCPATEPIDPNKSN

2、姚虻蛋白酶tabfiblysin基因，其特征在于该基因由871个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

atgacttccataccggtgtccagctttttacttgcggccttagtactacaatacgccact

agcgacgcagttaactactgtagattgccttgtcgaggggataattaccatgtgggctgt

ggtgagccagcgtatgcccaggaatgtgggcaaagtccaagaactcgcgagttattgaag

gagcatagaaatgagattttgtcgaagatcaacgatgtgcgagaccatgtggccaaggga

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atgtatataaataaaattgaagtgtctgtctgtaatataaaacaactgtcacttattgag

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3、姚虻蛋白酶tabfiblysin的应用，其特征在于姚虻蛋白酶tabfiblysin能水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集，且无出血活性，能作为制备治疗血栓性疾病药物的应用。