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ES2262667T3 - Probioticos nuevos para aplicaciones en alimento para animales de compañia. - Google Patents

Probioticos nuevos para aplicaciones en alimento para animales de compañia.

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Publication number
ES2262667T3
ES2262667T3 ES01956446T ES01956446T ES2262667T3 ES 2262667 T3 ES2262667 T3 ES 2262667T3 ES 01956446 T ES01956446 T ES 01956446T ES 01956446 T ES01956446 T ES 01956446T ES 2262667 T3 ES2262667 T3 ES 2262667T3
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ES
Spain
Prior art keywords
dogs
food
strains
cfu
lactobacillus
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES01956446T
Other languages
English (en)
Inventor
Ralf Zink
Roberto Reniero
Florence Rochat
Christoph Cavadini
Thierry Von Der Weid
Eduardo Schiffrin
Jalil Benyacoub
Virginie Rousseau
Pablo Perez
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Societe des Produits Nestle SA
Nestle SA
Original Assignee
Societe des Produits Nestle SA
Nestle SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Societe des Produits Nestle SA, Nestle SA filed Critical Societe des Produits Nestle SA
Application granted granted Critical
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Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Abstract

Cepa probiótica que es Lactobacillus reuteri NCC2581 (NCMC I-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592 (NCMC I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (NCMC I-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (NCMC I-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (NCMC I-2452), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (NCMC I-2453).

Description

Probióticos nuevos para aplicaciones en alimento para animales de compañía.
La presente invención está relacionada con bacterias ácido lácticas y, en particular, con microorganismos de los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium y Streptococcus (Enterococcus) que han sido aislados y seleccionados por su potencial probiótico. Se proporciona un método para la obtención de dichas cepas probióticas. La presente invención también está relacionada con un método de preparación de composiciones de alimento para animales de compañía cuyo propósito es mejorar la salud de estos animales, y con las composiciones que contienen las mismas cepas.
Antecedentes de la invención
El bienestar de los animales de compañía está estrechamente relacionado con su alimentación. Una alimentación adecuada debe conllevar una mascota sana y en forma. La composición del alimento, además de aportar valor nutricional, ejerce una influencia sobre el equilibrio de la microflora intestinal y puede provocar o prevenir trastornos gastrointestinales. Por lo tanto, es crucial conocer el tubo gastrointestinal y los procesos digestivos de los animales sanos para la comprensión de una práctica alimentaria adecuada. Los gatos y los perros son carnívoros y por esta razón presentan un tubo digestivo corto y un tránsito del bolo alimenticio rápido.
De entre los constituyentes de la microflora gastrointestinal de gatos y perros se pueden recuperar los siguientes microorganismos: Bacteroides sp, Clostridium sp., Enterobacteriaceae, Bifidobacteruim sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Staphylococcus sp. Y levaduras.
El número y la composición de esta flora endógena tienden a ser bastante estables a pesar de que la edad y, en menor medida, el alimento pueden modificarlos. Los ácidos gástricos, la bilis, la peristalsis intestinal y la inmunidad local son factores que se consideran importantes en la regulación de la flora bacteriana del intestino delgado de los seres humanos y de otros mamíferos.
Los trastornos gastrointestinales caninos y felinos a menudo están asociados con una proliferación bacteriana y con la producción de enterotoxinas generadas por bacterias patógenas.
La investigación de los últimos años se ha centrado en algunas cepas valiosas de bacterias ácido lácticas y en el uso potencial de las mismas como agentes probióticos. Se considera que los probióticos son preparaciones microbianas viables que promueven la salud de los mamíferos al preservar la microflora intestinal natural. Se piensa que los probióticos se adhieren a la mucosa intestinal, colonizan el tubo intestinal y de esta manera evitan la adhesión de microorganismos perjudiciales a la mucosa. Un prerrequisito para su acción consiste en que deben alcanzar la mucosa intestinal en una forma adecuada y viable y, especialmente, no ser destruidas a causa del bajo pH del estómago. Más concretamente, la fisiología del tubo digestivo de gatos y perros difiere de la de los humanos. Por ejemplo, el pH medio del estómago es aproximadamente de 3,4 en los perros y de 4,2 en los gatos.
La publicación de Hartemink, R. y Rombouts, F.M. ("Comparison of media for the detection of bifidobacteria, lactobacilli and total anaerobes from faecal samples", Journal of Microbiological Methods, 1999, vol. 36, p. 181-192) trata acerca de los medios utilizados para la detección y caracterización de cepas microbianas.
El artículo de Fujisawa, T. Y Mitsuoka, T. ("Homofermentative Lactobacillus species predominantly isolated from canine feces", Journal of Veterinary Medical Science, 1996, vol. 58, no. 6, p. 591-593) revela el aislamiento de cepas de Lactobacillus a partir de heces caninas.
US 5922375 se refiere al aislamiento de una cepa de Bifidobacterium a partir de las heces de un lactante y al suplemento de alimentos con dicha cepa. En este documento el pienso está suplementado con una cepa probiótica aislada a partir de humanos.
WO 9608261 relata la inclusión de microorganismos probióticos y un portador en productos de alimentación animal de manera que los microorganismos alcanzan el intestino grueso donde se desarrollan. Los microorganismos probióticos obtenidos a partir de colecciones de cultivos disponibles comercialmente o de aislados de heces humanas son utilizados para alimentar ratones y cerdos.
WO 99/17788 describe un método para tratar o evitar la candidiasis en un animal mediante la administración de una cepa probiótica. Estas cepas probióticas utilizadas provienen de una diversidad de fuentes que incluyen el yogur, las heces humanas o animales y las abejas melíferas.
Finalmente, a pesar de que US 5968569 revela la inclusión de un microorganismo probiótico en un cereal de alimento para animales de compañía, donde las fuentes comerciales de los microorganismos provienen de productos lácteos o de heces infantiles, ni la misma ni el resto de técnicas disponibles proporcionan información acerca de cepas pensadas específicamente para la salud de animales de compañía.
En consecuencia, es necesario proporcionar cepas bacterianas nuevas que estén especialmente adaptadas para animales de compañía y que hayan sido seleccionadas por sus elevadas propiedades probióticas beneficiosas para la salud animal. También es necesario incorporar estas cepas en una composición de alimento para animales de compañía.
Resumen de la invención
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un microorganismo probiótico nuevo de las bacterias ácido lácticas seleccionado por su capacidad de sobrevivir en el tubo gastrointestinal de un animal de compañía y colonizarlo, y por su capacidad de ejercer una actividad probiótica beneficiosa para la salud de las mascotas.
La cepa probiótica se puede seleccionar a partir de lactobacilos, bifidobacterias o enterococos.
La cepa probiótica puede seleccionarse a partir del grupo formado por: Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum y Bifidobacterium spp., Enterococcus faecium y Enterococcus spp.
En una realización preferida la cepa probiótica es seleccionada a partir del grupo formado por Lactobacillus reuteri (NCC2581; CNCM I-2448), Lactobacillus reuteri (NCC2592; CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus (NCC2583; CNCM I-2449), Lactobacillus reuteri (NCC2603; CNCM I-2451), Lactobacillus reuteri (NCC2613; CNCM I-2452) y Lactobacillus acidophilus (NCC2628; CNCM I-2453).
La cepa bacteriana nueva se puede utilizar en cualquier cantidad desde aproximadamente 1,0E+04 hasta aproximadamente 1,0E+12 ufc/animal y día, preferiblemente desde 1,0E+05 hasta aproximadamente 1,0E+11 ufc/animal y día y más preferiblemente desde 1,0E+07 hasta aproximadamente 1,0E+10 ufc/animal y día.
La cepa bacteriana descrita anteriormente puede utilizarse para preparar una composición cuya aplicación es el tratamiento y/o la prevención de trastornos asociados a la colonización del tubo gastrointestinal de animales de compañía por microorganismos patógenos.
La cepa bacteriana descrita anteriormente puede utilizarse también para preparar una composición cuya aplicación sea la de regular la respuesta inmunitaria de los animales de compañía. El término "regular" la respuesta inmunitaria significa que las bacterias descritas anteriormente poseen la capacidad de estimular ciertas funciones inmunitarias importantes para la salud del animal o bien modular otras funciones inmunitarias que pueden estar potencialmente implicadas en enfermedades inmunitarias como inflamación, alergia, etc. La estimulación o modulación de estas funciones inmunitarias se puede conseguir utilizando diferentes combinaciones de las cepas bacterianas antes descritas.
En un aspecto, la invención proporciona un método de obtención de cepas probióticas para gatos y perros que comprende los siguientes pasos:
a) aislamiento de bacterias ácido lácticas a partir de heces de gato y perro
b) selección de cepas con capacidad de crecer produciendo al menos 1,0E+06 ufc/ml en presencia de hasta un 2,0% de sales biliares y con capacidad de crecer produciendo al menos 1,0E+06 ufc/ml tras dos horas a un pH que oscila entre 3,4 y 4,2.
La invención proporciona también un método para preparar una composición de alimento para gatos o para perros cuya función es mantener o mejorar la salud general del tubo gastrointestinal, la piel, el pelo y el sistema inmunitario de una mascota. El método comprende los siguientes pasos:
a) aislamiento de bacterias ácido lácticas a partir de heces de gato y perro
b) selección de cepas con capacidad de crecer produciendo al menos 1,0E+06 ufc/ml en presencia de hasta un 2,0% de sales biliares y con capacidad de crecer produciendo al menos 1,0E+06 ufc/ml tras dos horas a un pH que oscila entre 3,4 y 4,2
c) incorporación de la cepa(s) seleccionada(s) en una composición de alimento para gatos o para perros.
Se puede llevar a cabo un método para el tratamiento o prevención de trastornos asociados a la colonización del tubo gastrointestinal por microorganismos patógenos. El método comprende el paso de alimentar a un animal de compañía con una composición de alimento para mascotas que contiene por lo menos una cepa aislada de acuerdo con la presente invención.
Se puede llevar a cabo un método para la regulación de la respuesta inmunitaria de los animales de compañía, método que comprende el paso de alimentar a un animal de compañía con una composición de alimento para mascotas que contiene por lo menos una cepa aislada de acuerdo con la presente invención.
Se puede llevar a cabo un método para mejorar o reducir los efectos del envejecimiento en un animal de compañía, método que comprende el paso de alimentar a un animal de compañía con una composición de alimento para mascotas que contiene por lo menos una cepa aislada de acuerdo con la presente invención.
Estos microorganismos seleccionados tienen un impacto beneficioso particular sobre el tubo gastrointestinal de los animales de compañía, sobre su piel o pelo, sobre su sistema inmunitario y sobre los efectos del envejecimiento.
Tienen un impacto beneficioso particular sobre los patógenos intestinales como cepas de Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Shigella dysenteriaea u otras enterobacteriaceas patógenas que colonizan animales de compañía, o parásitos como helmintos (Toxocara spp.), protozoos (Cryptosporidium spp., Giardia spp., Pentatrichomonas hominis, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii,...) o levaduras.
Estos microorganismos, combinados con el alimento, ejercen particularmente sus efectos probióticos beneficiosos sobre la palatabilidad, la digestión y la salud del intestino, la función inmunitaria y las condiciones sanitarias. En el último caso ejercen los efectos beneficiosos al contribuir en la reducción del volumen fecal y una desodorización, por lo menos parcial, de las heces caninas. Por lo tanto, de acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar una composición de alimento para animales de compañía que contiene un microorganismo con una actividad probiótica elevada en animales de compañía y que es capaz de sobrevivir en el tubo gastrointestinal de un animal de compañía que haya ingerido dicho microorganismo, e incluso colonizarlo.
Por consiguiente, la invención está relacionada con un método de preparación de una composición de alimento para animales de compañía dirigida a la salud del tubo gastrointestinal de las mascotas, que contiene por lo menos una cepa probiótica aislada de la manera antes descrita y que está asociada a un vehículo ingerible o a una matriz farmacéutica.
Se puede utilizar una composición de alimento para animales de compañía dirigida a la regulación de la respuesta inmunitaria de las mascotas, que contiene por lo menos una cepa probiótica aislada de la manera antes descrita y que está asociada a un vehículo ingerible o una matriz farmacéutica.
La invención también está relacionada con un método de preparación de una composición de alimento para animales de compañía dirigida a la mejora o reducción de los efectos del envejecimiento en las mascotas, que contiene por lo menos una cepa probiótica aislada de la manera antes descrita y que está asociada a un vehículo ingerible o una matriz farmacéutica.
Finalmente, la invención está relacionada con un método de preparación de una composición de alimento para animales de compañía dirigida a la salud de la piel y el pelo de las mascotas, que contiene por lo menos una cepa probiótica aislada de la manera antes descrita y que está asociada a un vehículo ingerible o una matriz farmacéutica.
En una realización, el vehículo ingerible está formado por una composición de alimento para animales de compañía nutricionalmente equilibrada. Dicha composición contiene preferiblemente una cantidad suficiente de la cepa aislada para que proporcione de manera efectiva el efecto profiláctico antes mencionado cuando se administra la composición en forma de comida completa a una mascota.
Descripción detallada de la invención
En la siguiente descripción la abreviatura ufc ("unidad formadora de colonias") designa el número de células bacterianas reveladas en los recuentos microbiológicos sobre placas de agar.
Además, "NCC" designa Nestlé Culture Collection, colección de cultivos Nestlé, (Nestlé Research Center, Vers-chez-les-Blanc, Laussane, Suiza).
En relación con el primer objeto de la presente invención se analizaron y seleccionaron 20 lactobacilos y 18 bifidobacterias aisladas a partir de heces felinas y caninas según parámetros tecnológicos y fisiológicos.
Se llevó a cabo un primer análisis in vitro en busca de aplicaciones potenciales (véanse los ejemplos 1 y 2): características de crecimiento, tolerancia a la acidez gástrica a diferentes pH y a diferentes concentraciones de las sales biliares presentes en el duodeno esperables en gatos y perros.
Es más, se demostró claramente la buena supervivencia de células liofilizadas a 4 y 20ºC en dos medios crioprotectores diferentes, como indicó un ensayo de conservación acelerado.
Estas cepas se pueden caracterizar por tiempos de generación cortos, recuentos elevados durante la fase estacionaria (más de 1,0E+08 ufc/ml) y estabilidad en altos números tras 8 y 24 h postinoculación, estabilidad frente a la liofilización seguida de unas condiciones de conservación cualesquiera, resistencia a concentraciones biliares fisiológicas del duodeno (2% de bilis) y una baja inhibición cuando se cultivan en presencia de hasta un 4% de bilis. Además, para seleccionar las bacterias representativas de la diversidad investigada se tuvieron en cuenta resultados de análisis de DNA.
Las cepas destinadas a la salud de gatos y perros pueden proliferar hasta por lo menos 1,0E+06 ufc/ml en presencia de hasta un 2,0% de sales biliares. También pueden proliferar hasta por lo menos 1,0E+06 ufc/ml después de 2 h en un pH que oscila entre 3,4 y 4,2.
Las cepas bacterianas de acuerdo con la presente invención pueden seleccionarse a partir del grupo formado por: Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium spp., Enterococcus faecium y Enterococcus spp.
Las siguientes cepas, Lactobacillus reuteri NCC2581, Lactobacillus rhamnosus NCC2583, Lactobacillus reuteri NCC2592, Lactobacillus reuteri NCC2603, Lactobacillus reuteri NCC2613 y Lactobacillus acidophilus NCC2628, fueron depositadas por ejemplo bajo el Tratado de Budapest en la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes, 25 rue du docteur Roux, 75724 París, Francia, el 19 de abril de 2000, bajo las siguientes referencias: CNCM I-2448, CNCM I-2449, CNCM I-2450, CNCM I-2451, CNCM I-2452 y CNCM I-2453, respectivamente. Todas las restricciones respecto a la disponibilidad de estos depósitos serán retiradas con la primera publicación de esta solicitud u otra solicitud que reivindique prioridad frente a esta.
Caracterización bioquímica de las cepas seleccionadas Lactobacillus reuteri CNCM I-2448
-
Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
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Bastoncillos bastante cortos y gruesos
-
Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+) y D(-)
-
Catalasa (-), producción de CO_{2} a partir de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH_{3}
-
Crecimiento con NaCl al 5% y 10%
-
Fermentación de los azúcares: L-arabinosa, galactosa, D-glucosa, lactosa, sacarosa y D-rafinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacillus rhamnosus CNCM I-2449
-
Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
-
Bastoncillos bastante cortos y gruesos
-
Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+)
-
Catalasa (-)
-
Fermentación de todos los azúcares característicos de Lb. rhamnosus.
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacillus reuteri CNCM I-2450
-
Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
-
Bastoncillos bastante cortos y gruesos
-
Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+) y D(-)
-
Catalasa (-), producción de CO_{2} a partir de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH_{3}
-
Crecimiento con NaCl al 5% y 10%
-
Fermentación de los azúcares: L-arabinosa, galactosa, D-glucosa, D-xilosa, lactosa, sacarosa y D-rafinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacillus reuteri CNCM I-2451
-
Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
-
Bastoncillos bastante cortos y gruesos
-
Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+) y D(-)
-
Catalasa (-), producción de CO_{2} a partir de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH_{3}
-
Crecimiento con NaCl al 5 y 10%
-
Fermentación de todos los azúcares característicos de Lb. reuteri.
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacillus reuteri CNCM I-2452
-
Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
-
Bastoncillos bastante cortos y gruesos
-
Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+) y D(-)
-
Catalasa (-), producción de CO_{2} a partir de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH_{3}
-
Crecimiento con NaCl al 5 y 10%
-
Fermentación de los azúcares: L-arabinosa, D-glucosa, lactosa, sacarosa y D-rafinosa.
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Lactobacillus acidophilus CNCM I-2453
-
Microorganismo gram positivo, inmóvil, no formador de esporas
-
Bastoncillos bastante cortos y gruesos
-
Microorganismo microaerofílico con metabolismo heterofermentativo, producción de ácido láctico L(+) y D(-)
-
Catalasa (-)
-
Fermentación de los azúcares: D-glucosa, lactosa, sacarosa y D-rafinosa.
También se analizó la actividad probiótica potencial en animales de compañía de tres lactobacilos aislados a partir de gatos (NCC2581, NCC2592, NCC2583), tres lactobacilos de perros (NCC2603, NCC2613, NCC2628), una bifidobacteria de gatos (NCC2627) y una bifidobacteria de perros (NCC2657) (véanse los ejemplos 3 y 4).
En otra realización la presente invención está relacionada con un método que utiliza cepas bacterianas como se ha descrito anteriormente para la preparación de una composición alimentaria capaz de mejorar o mantener la salud de las mascotas.
Estas cepas se pueden utilizar en su forma viable, en su forma inactivada, como un sobrenadante de un cultivo o fracciones del mismo, por ejemplo, paredes celulares, peptidoglicanos, citoplasma, proteínas purificadas, metabolitos funcionales o moléculas bioactivas.
Son utilizadas preferiblemente en una cantidad de aproximadamente desde 1,0E+04 ufc/g hasta aproximadamente 1,0E+11 ufc/g, preferiblemente desde 1,0E+05 ufc/g hasta aproximadamente 1,0E+10 ufc/g y más preferiblemente desde 1,0E+06 ufc/g hasta aproximadamente 1,0E+09 ufc/g.
En una realización preferida estas cepas se pueden utilizar como complementos alimenticios para mejorar la calidad del alimento para mascotas y pueden incluirse en cantidades que oscilan entre 1,0E+04 ufc/g y 1,0E+11 ufc/g aproximadamente. Cuando se utilizan como complementos alimenticios pueden estar encapsulados o suministrarse en forma de polvos y pueden estar empaquetados junto a una comida principal o separados de ella, sea húmeda o seca. A modo de ejemplo, un polvo que contiene los microorganismos seleccionados se puede empaquetar en bolsitas, en forma de polvo o en un gel o lípido u otro portador adecuado. Estas unidades empaquetadas separadamente se pueden suministrar junto a una comida principal o en envases multiunidad para su uso con una comida principal o una golosina, de acuerdo con las instrucciones de usuario. En otro ejemplo, las cepas probióticas pueden suministrarse en una unidad de empaquetado multicámara junto a un segundo componente ingerible, por ejemplo un alimento troceado húmedo, o con un contenido de humedad medio, o un lote de porciones secas en forma de bolsa flexible del tamaño de una comida. Una primera cámara de la bolsa contiene la cepa probiótica y una segunda cámara separada y sellada contiene el segundo componente ingerible.
Estos microorganismos seleccionados ejercen un impacto beneficioso particular en los animales de compañía en su tubo gastrointestinal, piel o pelo, sistema inmunitario, salud dental u oral, huesos y efectos del envejecimiento.
También mejoran la palatabilidad de la comida, la digestión, la función inmunitaria y las condiciones sanitarias (reducción del volumen fecal y parcial desodorización de las heces caninas) en las mascotas.
La presente invención también está relacionada con un método de preparación de una composición de alimento para animales de compañía destinada a mejorar o mantener la salud de estos animales, que contiene por lo menos una cepa probiótica con los rasgos antes descritos, asociada a un vehículo ingerible o una matriz farmacéutica.
Se puede administrar a la mascota al menos una cepa bacteriana con los rasgos anteriores como suplemento de su dieta normal o como componente de un alimento para mascotas nutricionalmente completo.
La composición del alimento nutricionalmente completo preparada según un método de acuerdo con la invención puede estar en forma de polvo seco o de producto de alimento para mascotas húmedo, refrigerado o de conservación sin refrigerar. Estos alimentos para mascotas pueden producirse mediante métodos conocidos en el campo, siempre y cuando allí donde se desee que haya actividad de microorganismos se tenga cuidado en asegurar su supervivencia. Además de las cepas bacterianas y/o su medio fermentado, estos alimentos para mascotas pueden incluir una fuente, o varias, de almidón, proteína o lípido.
Algunos ejemplos de fuentes de almidón apropiadas son grano y legumbres, como el maíz, el arroz, el trigo, la cebada, la avena, la soja o mezclas de éstos.
Las fuentes proteicas apropiadas pueden seleccionarse de cualquier fuente animal o vegetal adecuada; por ejemplo carne y harina de carne, harina de aves, harinas de pescado, concentrados de proteína de soja, proteínas lácteas, gluten y similares. En el caso de animales de edad avanzada es preferible que la fuente proteica contenga una proteína de alta calidad.
Las fuentes lipídicas apropiadas incluyen carnes y grasas animales y vegetales.
La elección de las fuentes de almidón, proteína o lípidos estará determinada en gran medida por los requisitos nutricionales del animal, por consideraciones de palatabilidad y por el tipo de producto empleado. En el caso de animales de edad avanzada es preferible que el alimento contenga, en proporción, menos grasa que el alimento para mascotas más jóvenes. Además, las fuentes de almidón pueden ser una o varias del grupo formado por arroz, cebada, trigo y maíz.
Además, también se pueden incorporar al alimento para mascotas, en el modo que se desee, otros ingredientes diferentes adicionales como, por ejemplo, azúcar, sales, especias, condimentos, vitaminas, minerales, agentes aromatizantes, grasas y similares.
Un proceso adecuado para preparar alimento seco para mascotas es la extrusión, aunque se puede utilizar la cocción al horno u otros procesos similares. El alimento seco, cuando es sometido a extrusión, normalmente resulta en forma troceada. Si se utiliza un carbohidrato prebiótico éste puede mezclarse con el resto de ingredientes del alimento seco antes de ser procesado. Un proceso adecuado se describe en la Solicitud de patente europea núm. 0850569. Si se utiliza un microorganismo probiótico y se desea que el producto final presente actividad, es mejor que el organismo recubra el alimento seco o bien que se encuentre dentro de él. Se describe un proceso adecuado en la Solicitud de patente europea núm.0862863. En los casos en que no sea necesaria la supervivencia del microorganismo éste puede añadirse a la mezcla de preextrusión.
En el caso de alimentos húmedos, se pueden utilizar los procesos descritos en las patentes estadounidenses
4.781.939 y 53132.137 para producir productos cárnicos simulados. Las revelaciones de estas patentes están incorporadas mediante cita. También se puede utilizar otros procedimientos para generar productos en trozos como, por ejemplo, la cocción en un horno de vapor. Por otro lado, para obtener productos en barra se puede emulsionar un material cárnico apropiado y producir una emulsión de carne a la que se le añade un agente gelificante adecuado y se calienta antes de introducirla en latas u otros recipientes. Del mismo modo que en la obtención de alimento seco, la especie probiótica se puede añadir al preparado de alimento antes de ser cocinado o calentado o en cualquier fase adecuada o conveniente del proceso de producción, siempre y cuando la supervivencia del producto probiótico escogido no sea imprescindible.
La cantidad de prebiótico en el alimento para mascotas es preferiblemente menos de un 20% en peso y, más preferiblemente, menos de un 10% en peso. Por ejemplo, el prebiótico puede constituir desde un 0,1% hasta un 5% en peso del alimento. En aquellos alimentos para mascotas que utilizan achicoria como el prebiótico ésta puede comprender desde un 0,5% hasta un 10% en peso de la mezcla de alimento; más preferiblemente desde un 1% hasta un 5% en peso.
Los alimentos para mascotas pueden contener otros agentes activos como por ejemplo ácidos grasos de cadena larga. Los ácidos grasos de cadena larga adecuados son el ácido alfa-linoléico, el ácido gamma-linoléico, el ácido linoléico, el ácido eicosapentanoico y el ácido docosahexanoico. Los aceites de pescado representan una fuente apropiada de ácidos eicosapentanoicos y de ácido docosahexanoico. El aceite de borraja, el aceite de pepitas de grosella negra y el aceite de onagra son fuentes adecuadas de ácido gamma-linoléico. Los aceites de cártamo, girasol, maíz y soja son fuentes adecuadas de ácido linoléico.
En caso de que sea necesario, los alimentos para animales de compañía se suplementan con minerales y vitaminas para que sean nutricionalmente completos.
Más aún, si se desea, la cepa bacteriana puede estar encapsulada en una matriz glucídica, lipídica o polisacárida. También puede estar recubierta, como se describe en EP 862 863.
Es preferible utilizar la nueva cepa probiótica de manera que el alimento para mascotas contenga preferiblemente de unas 1,0E+04 hasta 1,0E+10 células del microorganismo probiótico por gramo de alimento; más preferiblemente de unas 1,0E+06 hasta 1,0E+08 células de microorganismo probiótico por gramo. El alimento para mascotas puede contener de un 0,005% a un 10% en peso de la mezcla del microorganismo probiótico. Preferiblemente contiene de un 0,2% a un 6% en peso y más preferiblemente de un 1% a un 6% en peso.
La cantidad de alimento que debe consumir el animal de compañía para obtener un efecto beneficioso depende del tipo de mascota, de su tamaño y de su edad. Sin embargo, la cantidad que sería adecuada habitualmente para proporcionar una cantidad diaria de entre unas 1,0E+03 y 1,0E+14 ufc de por lo menos una cepa de bacteria ácido láctica y/o el medio de fermentación equivalente. La administración preferida para perros es aproximadamente de 1,0E+09 a 1,0E+14 ufc/día y para gatos de 1,0E+07 a 1,0E+10 ufc/día.
La composición preparada mediante un método de acuerdo con la invención presenta una actividad probiótica elevada y/o parece ser particularmente efectiva en la mejora y el mantenimiento de una función digestiva saludable en los animales de compañía, y en la mejora y mantenimiento de su tubo gastrointestinal, piel y pelo, sistema inmunitario y salud en general. Esta composición también posee un carácter beneficioso sobre los efectos del envejecimiento en gatos y perros.
El alcance de la presente invención no debe limitarse a las realizaciones aquí descritas. Los ejemplos están precedidos de una breve descripción de las figuras.
Figuras
Figura 1: Proliferación linfocítica de células mononucleares periféricas (PMBC) caninas tras la estimulación con mitógenos o ésteres de forbol. Se estimularon PMBC de perros adultos alimentados durante cuatro semanas con (barritas negras) o sin (barritas blancas) L. acidophilus NCC2628 con diferentes mitógenos a las dosis indicadas en el gráfico (\mug/ml). Los mitógenos son: PHA (fitohemaglutinina), ConA (Concanavalina A) y PWM (mitógeno de filotaca o "pokeweed"). El éster de forbol es PMA/iono (forbol miristato acetato y ionomicina). *=P<0,05, test de Student.
Figura 2: Citocinas producidas por leucocitos caninos estimulados con diferentes cepas de probióticos. Los leucocitos de perros adultos normales fueron estimulados durante 18 h con diferentes cepas de lactobacilos aislados a partir de animales de compañía. Los cultivos control solo contenían medio (control negativo) o un aislado de lactobacilo humano ST11 (control positivo). La identificación de citocinas se llevó a cabo mediante RT-PCR. Su cuantificación se realizó mediante el cribado de los geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio y la determinación del píxel relativo de cada banda utilizando el software NIH Image. Los resultados están expresados en forma de dos experimentos independientes y en unidades arbitrarias. (A) IL-12, (B) IL-10, (C) IFN\gamma, (D) TGF\beta.
Ejemplos Ejemplo 1 Cepas y condiciones de cultivo
Se analizó el uso probiótico potencial de numerosas cepas (de la Colección de Cultivos Nestlé = NCC) en gatos y perros. Concretamente, se evaluó el potencial de crecimiento, la resistencia a la liofilización con el consiguiente almacenamiento y la tolerancia a la acidez gástrica y a diferentes concentraciones de sales biliares del tubo gastrointestinal de gatos y perros en el caso de aquellos 20 lactobacilos y 18 bifidobacterias aislados a partir de heces felinas y caninas que se presentan en la Tabla 1.
TABLA 1 Códigos y características de las bacterias seleccionadas para los ensayos 
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacilos
Código Código Código Origen especie Tipo de NH3 de Ácido Identificado
NCC CNCM animal ingesta arginina láctico con API50CH
2578 - - LB1-1 Gato Mixta - L L. animalis/ruminis
2581 I-2448 LB1-2 Gato Mixta + D/L L. reuteri
2583 I-2449 LK1-1 Gato Mixta - D/L L. rhamnosus
2586 - - LK1-2 Gato Mixta + D/L L. reuteri
2590 - - LH2-1 Gato Seca - D/L L. acidophilus
2592 I-2450 LR1-1 Gato Mixta + D/L L. reuteri
2594 - - LS1-1 Gato Mixta - L L. animalis/ruminis
2597 - - LA2-5 Perro Húmeda - L L. animalis
2600 - - LC2-5 Perro Húmeda - D/L L. fermentum/reuteri
2603 I-2451 LE2-5 Perro Húmeda - L L. reuteri
2606 - - LF2-6 Perro Seca + D/L L. reuteri
2609 - - LH2-6 Perro Seca + D/L L. reuteri
2613 I-2452 LH2-7 Perro Seca + D/L L. reuteri
2616 - - L1-1-1 Perro Mixta + D/L L. reuteri/fermentum
2619 - - L1-1-2 Perro Mixta - D/L L. acidophilus
2621 - - L3-1-2 Perro Mixta - L L. animalis/ruminis
2625 - - L7-1-3 Perro Mixta - L L. animalis/ruminis
2628 I-2453 LA1-5 Perro Mixta - D/L L. acidophilus
2632 - - LA1-6 Perro Mixta + D/L L. reuteri/fermentum
2636 - - LB1-5 Perro Mixta - L L. animalis/ruminis
Bifidobacterias
Código NCC Código Origen especie animal Tipo de ingesta Especie
2623 CO2-5 Gato Seca Bifidobacterium
2627 CG2-5 Gato Seca Bif. adolescentis
2630 CH2-5 Gato Seca Bif. adolescentis
2633 CE3-1 Gato Seca Bif. adolescentis
2635 CC1-5 Gato Mixta Bif. longum/suis
2637 CE4-1 Gato Seca Bif. adolescentis
2640 CB3-5 Gato Seca Bif. adolescentis
2643 CJ2-6 Gato Seca Bif. adolescentis
2647 D5-3-5 Perro Húmeda Bif. adolescentis
2651 D8-3-6 Perro Seca Bif. animalis/lactis
2654 D9-3-7 Perro Seca Bif. animalis/lactis
2657 D6-3-6 Perro Seca Bifidobacterium
2660 D7-3-5 Perro Seca Bifidobacterium
2663 DB3-1 Perro Seca Bifidobacterium
2667 DC3-1 Perro Seca Bifidobacterium
2671 DA1-3 Perro Mixta Bif. animalis/lactis
2674 DA3-1 Perro Seca Bifidobacterium
2677 DD3-1 Perro Seca Bif. adolescentis
Todos los 20 lactobacilos y las 18 bifidobacterias fueron aislados a partir de gatos y perros que siguieron diferentes dietas, tal como muestra la Tabla 1. La identificación inicial se determinó según características morfológicas y fisiológicas. Se utilizaron los sistemas API-50CH y Rapid-ID32A (BioMérieux) para lactobacilos y bifidobacterias, respectivamente. Las cepas puras se congelaron y se depositaron a -80ºC en la Colección de Cultivos Nestlé (NCC).
Todas las bacterias fueron cultivadas en medio líquido para los ensayos. Se conservó una muestra de cada cepa reactivada a -80ºC en 1 ml de medio crioprotector (40% glicerol + 60% LL). Los cultivos se mantuvieron mediante el subcultivo semanal de un inóculo 1% en 10 ml de medio de cultivo y mediante incubación anaeróbica a 37ºC.
Los lactobacilos se cultivaron en MRS durante 18 horas. Las bifidobacterias se cultivaron o bien en MRS + hidrocloruro de L-cisteína 0,05% (p/v) (MRS-C) durante 32 horas o en BHI + hidrocloruro de L-cisteína 0,05% (BHI-C) durante 48 horas empezando con un inóculo 5%.
Todos los cultivos se conservaron a +4ºC entre las diferentes transferencias. En general, la anaerobiosis se obtuvo mediante un sistema anaeróbico de dióxido de carbono-hidrógeno (GasPak, Becton Dickinson, EEUU). Las bifidobacterias se mantuvieron siempre en estas jarras durante el periodo de almacenamiento.
Ejemplo 2 Selección de las cepas bacterianas
Este cribado in vitro se basó en las características de producción para una aplicación industrial de células viables, su habilidad para sobrevivir las condiciones gastrointestinales inhibidoras o perjudiciales y su diversidad genómica. A través de RAPD y ribotipificación se tuvieron en cuenta la diversidad de las cepas y la similitud genómica de aquellas cepas no caracterizadas.
Materiales y métodos \bullet Crecimiento bacteriano
Es preciso identificar las cepas que son capaces de producir un alto número de células rápidamente. Su ciclo de crecimiento bacteriano puede caracterizarse por una fase de latencia corta, un tiempo de generación corto, recuentos máximos altos y una fase estacionaria larga. Por tanto, las cepas fueron comparadas teniendo en cuenta tres variables: la duración de la fase de latencia, su tiempo de generación (en horas) y sus recuentos máximos; es decir, las características más importantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacilos
Se inocularon 200 ml de caldo de cultivo MRS preincubado a 37ºC con un 1% de un subcultivo fresco. Se recogieron muestras post-inoculación de un ml, cada hora, durante ocho horas. SE tomó una muestra final tras 24 h. Se hicieron diez diluciones seriadas en TS de un ml de cada muestra para la enumeración. Los cultivos se sembraron en agar MRS (técnica de vertido en placas), anaeróbicamente, a 37ºC durante 48 horas. Todas las placas con número de colonia entre el 30 y el 350 se registraron como unidades formadoras de colonias (ufc) por ml de cultivo y, por tanto, se tuvieron en cuenta para las enumeraciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Bifidobacterias
En ensayos preliminares, todas las cepas se enumeraron tras 24 h de crecimiento en caldos de cultivo MRS-C y TPYG. Los resultados se expresaron en ufc/ml. Las curvas de crecimiento se establecieron mediante la determinación de la cantidad de células en el caso de siembra sobre MRS-C tras 0, 4, 12, 24, 32 y 48 horas, de acuerdo con el protocolo descrito para lactobacilos. Con el fin de determinar la influencia del medio de subcultivo y de la optimización de la desgasificación del medio de cultivo, este ensayo se llevó a cabo:
\bullet
a partir de un subcultivo en BHI-C, conservado 48 h a 4ºC e inoculado en MRS-C
\bullet
a partir de un subcultivo en BHI-C, conservado 48 h a 4ºC e inoculado en MRS-C bien desgasificado (extracción del oxígeno optimizada por introducción del medio en autoclave dos veces y almacenamiento directo en jarras de anaerobiosis)
\bullet
a partir de un cultivo fresco, en MRS e inoculado en MRS-C bien desgasificado y almacenado bajo condiciones anaeróbicas previamente al experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Medios de ensayo para el crecimiento bacteriano
lactobacilos
Sustrato Composición pH Referencias
MRS MRS sin azúcar (Difco) 35 g/l 6,5 De Man and al. (1960)
Glucosa 20 g/l
Agua destilada 1,000 ml
bifidobacterias
Sustrato Composición pH Referencias
MRS-C MRS sin azúcar (Difco) 35 g/l 6,0 Pacher and Kneifel (1996)
Glucosa 20 g/l
HCl L-cisteína (Fluka) 0,5 g/l
Agua destilada 1,000 ml
Tripticasa (BBL) 50 g/l 7,0
TPYG Peptona (Difco) 5 g/l
(Extracto de Levadura Extracto de levadura 20 g/l
Peptona Tripticasa) (Difco)
Glucosa (Merck) 4 g/l
HCl L-cisteína (Fluka) 1 g/l
Agua destilada 1,000 ml
Los medios sólidos se obtuvieron por adición de agar Difco Bacto (15 g/l). Los medios se introdujeron en autoclave a 121ºC durante 15 min. Los medios líquidos para bifidobacterias se conservaron en condiciones anaeróbicas o se desgasificaron antes de su utilización.
Resistencia al pH gástrico y a la bilis
Los microorganismos, al ser ingeridos, deben sobrevivir en las condiciones del estómago y duodeno para poder ejercer una actividad beneficiosa en el tubo gastrointestinal del animal. El pH gástrico y las sales biliares son los principales componentes reguladores de la flora bacteriana. Por estos motivos es necesario realizar ensayos acerca del grado de resistencia de las cepas a la acidez y la bilis.
La fisiología del tubo digestivo de gatos y perros es diferente de la de los humanos. El pH medio en gatos y perros era de 3,4 y 4,2, respectivamente. Se recomendó para los ensayos el uso de una bilis de animal de compañía reconstituida (Tabla 4). La concentración biliar en el intestino delgado oscila entre 0,5 y 2% cuando se ingiere alimento.
De acuerdo con valores de pH extremos encontrados en gatos y perros, los recuentos de viables tras 10 min a pH 2,6 y tras 2 h a pH 3,4 (cepas aisladas a partir de perros) o pH 4,2 (cepas aisladas a partir de gatos) no deberían estar por debajo de 1,0E+06 ufc/ml.
\bullet Resistencia al pH gástrico
Todos los lactobacilos fueron inoculados al 1% en caldo de cultivo MRS y cultivados anaeróbicamente a 37ºC durante toda la noche. Las bifidobacterias, inoculadas al 5% en BHI-C, se cultivaron 48 horas a 37ºC en condiciones de anaerobiosis. Los cultivos se distribuyeron en tubos de reacción (Eppendorf) de 2 ml y se centrifugaron a 3.500 x g/10 min/20ºC. Las células se lavaron tres veces con solución Ringer. El análisis de la resistencia a las condiciones acídicas del estómago se realizó in vitro en tres jugos gástricos simulados con niveles de pH de 2,6, 3,4 y 4,2 ajustados con HCl (Merck). Se utilizó material de filtración desechable (Nalgene) en todas las esterilizaciones por filtración. La supervivencia de cada suspensión bacteriana fue estudiada mediante la adición de 1 ml en una serie de 5 ml de jugo gástrico simulado (diferentes pH) suplementado con 1,5 ml de una solución de NaCl 0,5%.
Las muestras se incubaron a 37ºC y los organismos viables se enumeraron a:
\bullet
0, 1, 5, 10 minutos con el jugo gástrico de pH 2,6
\bullet
0, 1, 30, 60, 120, 180 minutos cuando el jugo gástrico tenía un pH de 3,4 (para cepas aisladas a partir de perros) o de 4,2 (para cepas aisladas a partir de gatos).
Se diluyeron muestras en tampón fosfato (pH 7,0), se dispusieron en placas sobre agar MRS-C y se enumeraron.
TABLA 3 Jugo gástrico simulado
Nombre del sustrato Composición pH
Jugo gástrico pepsina porcina 0,3% p/v (Sigma) 2,1; 3,4 ó 4,2
NaCl 0,5% p/v
HCl (Merck): para ajustar el pH
\bullet Resistencia a las sales biliares
Se determinó la evolución de los recuentos de viables de lactobacilos cultivados durante 18 horas en presencia de varias concentraciones de bilis animal reconstituida.
Hubo dos recuentos de viables que se consideraron significativamente diferentes cuando la desviación de su log_{10} estaba por encima de 0,25. Cada cepa se definió según dos variables:
\bullet la concentración máxima de sales biliares ensayada cuando no se encontró una diferencia significativa con el control
\bullet la tasa del descenso de viabilidad cuando la concentración biliar en el medio de cultivo aumenta.
Las cepas caracterizadas por una pérdida superior a un log_{10} de sus recuentos de viables cuando la concentración biliar aumenta en pasos de un 1% se consideraron sensibles a la bilis. Se consideró aceptable una reducción superior a un log_{10} entre células cultivadas en presencia de bilis 0 y 2% y a un log_{10} por porcentaje adicional de bilis (superior al 2%). Además, para producir un efecto en el tubo gastrointestinal solo se deben seleccionar aquellas cepas que produzcan más de 1,0E+06 ufc/ml cuando son cultivadas en presencia de hasta un 2% de sales biliares.
Se preparó bilis animal reconstituida a partir de gatos y perros de la manera que se indica en la Tabla 4 y se esterilizó por filtración antes de ser utilizado. En un primer ensayo, los lactobacilos se cultivaron anaeróbicamente durante 24 horas en caldo de cultivo MRS a 37ºC y se transfirieron a caldo MRS fresco con 0, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 2 y 4% de bilis animal reconstituida estéril durante otras 18 horas adicionales. Se hicieron diez diluciones seriadas de las muestras en TS para enumeración. Las diluciones 1,0E-03 y 1,0E-05 se dispusieron en placas de agar MRS mediante un WASP ("Whitley Automatic Spiral Plater"; Don Whitley Scientific Limited, Inglaterra). Una vez secas, las placas se invirtieron e incubaron 48 h a 37ºC en jarras de anaerobiosis.
Floch et al. (1972) definieron que una inhibición es significativa cuando se reducen al menos 2 log del ensayo comparados con el crecimiento en el tubo control. Partiendo de esta definición, todos los lactobacilos sensibles a concentraciones biliares del primer ensayo y dos lactobacilos resistentes a un 4% bilis se analizaron de igual manera en presencia de 0, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 y 4% de bilis. El objetivo del segundo ensayo era la repetibilidad y estableció si el número de bacterias viables descendía fuertemente con el incremento de la concentración biliar.
Por otro lado, resaltó que estas cepas son resistentes a la bilis durante este periodo de 18 h. Las curvas de crecimiento se establecieron en presencia de sales biliares para determinar si la fase de latencia y la tasa de crecimiento se veían afectadas. Se llevaron a cabo ensayos con lactobacilos cultivados en caldo MRS suplementado con un 1% de bilis animal reconstituida, de acuerdo con el protocolo descrito en anteriores mediciones de crecimiento.
Se realizaron subcultivos de bifidobacterias que se cultivaron durante 32 horas a 37ºC anaeróbicamente utilizando caldo MRS-C con 0, 1, 2, 3 y 4% de bilis animal reconstituida. Se aplicó en las diluciones 1,0E-03, 1,0E-04 y 1,0E-05 el mismo método de enumeración empleado en los lactobacilos.
TABLA 4 Bilis animal reconstituida
Compuestos \mumol/ml mg/ml % total
Taurodesoxicolato (Sigma) 14,00 7,00 18,0
Taurocolato (Sigma) 59,00 30,40 74,0
Colato (Fluka) 0,14 0,06 0,2
Tauroquenodesoxicolato (Sigma) 6,90 3,45 8,0
\bullet Supervivencia a la liofilización y posterior almacenamiento de las cepas de lactobacilos
Se evaluó la evolución de la supervivencia. Los recuentos inferiores a 1,0E+05 ufc/ml se consideraron demasiado bajos.
Para cada cepa se inocularon 200 ml de caldo MRS al 3% con un subcultivo fresco. Los cultivos se cultivaron durante 16 h a 37ºC. Se asumió que las condiciones sin aire (contenedores cerrados) eran esencialmente anaeróbicas. Se enumeraron las células viables mediante el método de vertido en placa descrito anteriormente.
Los cultivos se centrifugaron a 3.500 x g/+7ºC/20 minutos (RC3C Sorvall Instrument centrifuge) y se resuspendieron en 10 ml de dos medios crioprotectores diferentes. Cada cepa fue resuspendida en dos crioprotectores diferentes. Las suspensiones bacterianas concentradas se enumeraron (método de vertido en placa) y distribuidas en viales (0,5 ml por ampolla). Las muestras se congelaron a -196ºC en nitrógeno líquido y se secaron al vacío durante 18 horas. Después de la liofilización, se introdujo nitrógeno a través de la válvula de entrada de aire del liofilizador y se sellaron todas las ampollas. Todos los viales se conservaron a +4ºC y +20ºC durante seis meses. EL número de células viables por ampolla (para cada bacteria y cada medio de suspensión) se determinó mensualmente.
Resultados
En el marco de la selección de probióticos potenciales para gatos y perros, los resultados de este cribado in vitro de 20 lactobacilos y 18 bifidobacterias basado en sus potenciales de crecimiento, resistencia a la liofilización y posterior conservación, resistencia al pH y concentraciones biliares gástricas del tubo gastrointestinal de gatos y perros se presentan en la Tabla 5.
Los 20 lactobacilos se clasificaron según los criterios que éstos cumplían en el estudio actual. Cuatro de las cepas mostradas presentaban buenos resultados en cuanto a sus características de crecimiento, resistencia al pH gástrico, resistencia a la bilis y supervivencia durante la conservación tras la liofilización: L. reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM I-2450), L. reuteri NCC2603 (CNCM I-2451), L. reuteri NCC2613 (CNCM I-2452). Se cumplían las siguientes características:
\bullet el tiempo de generación era inferior a una hora cuando se cultivaban en MRS
\bullet la fase de latencia era corta (inferior a dos horas)
\bullet los recuentos bacterianos eran elevados (mayores a 1,0E+08 ufc/ml) durante la fase estacionaria del ciclo de crecimiento y estables a las 8 y 24 horas post-inoculación
\bullet las cepas estaban estables a lo largo de la liofilización y posterior conservación de seis meses a 4 y 20ºC
\bullet las cepas eran resistentes a las concentraciones biliares extremas que con probabilidad se pueden encontrar en el tubo gastrointestinal de gatos y perros (2%)
\bullet no se observó inhibición significativa en presencia de hasta un 4% de bilis en el medio
\bullet se evidenció que las cepas toleraban un pH de 2,6 durante al menos 10 min y podían mantenerse a niveles superiores a 1,0E+08 ufc/ml
\bullet las cepas eran resistentes a un pH gástrico medio durante por lo menos dos horas.
Por todas estas razones, dos lactobacilos aislados a partir de gatos (L. reuteri NCC2581 y L. reuteri NCC2592) y dos aislados a partir de perros (L. reuteri NCC2603 y L. reuteri NCC2613) fueron seleccionadas para el estudio de su actividad probiótica potencial. Se identificó las cepas NCC2581, NCC2592, NCC2603 y NCC2613 como L. reuteri mediante identificación API 50CH. Sin embargo, la ribotipificación mostró que, tanto NCC2581 y NCC2592 como NCC2603 y NCC2613, tenían patrones muy similares lo cual indica la existencia de una relación estrecha probable. La cepa NCC2581 presentaba unas características de crecimiento muy buenas y la NCC2603 presentaba una resistencia a la bilis mejor que la NCC2613.
Los resultados referentes a las ocho bifidobacterias aisladas a partir de heces felinas permitieron hacer una selección en función de sus características de crecimiento, resistencia al pH gástrico y sensibilidad a la bilis. La cepa NCC2623 no presentaba ninguna de las características deseadas y, por tanto, no se recomienda para estudios posteriores. Por otro lado, la cepa NCC2627 cumplía todos los criterios:
\bullet el tiempo de generación era inferior a una hora al ser cultivada en MRS-C
\bullet la fase de latencia era igual de corta que en los lactobacilos
\bullet los recuentos eran elevados y estables durante la fase estacionaria del ciclo de crecimiento
\bullet la cepa era resistente a las concentraciones biliares extremas que con probabilidad se pueden encontrar en el tubo gastrointestinal de gatos y perros (2%)
\bullet no se observó inhibición significativa en presencia de hasta un 4% de bilis en el medio
\bullet se evidenció que las cepas toleraban un pH de 2,6 durante al menos 10 min y podían mantenerse a niveles superiores a 1,0E+06 ufc/ml
\bullet las cepas eran resistentes a un pH gástrico medio durante por lo menos dos horas.
La cepa NCC2627 era mucho más resistente que la NCC2623 y la NCC2635, mientras que estas tres cepas presentaban un patrón muy similar obtenido por ribotipificación lo cual indica una relación estrecha probable (digestión con dos enzimas de restricción: EcoRI y EcoRV).
Las diez bifidobacterias aisladas a partir de perros solamente mostraron dos patrones diferentes al ser caracterizadas por ribotipificación. Por tanto, solo se llevaron a cabo ensayos de resistencia a la bilis con cuatro cepas (dos de cada grupo): NCC2657, NCC2660, NCC2671 y NCC2677. Estas cuatro cepas eran resistentes a la concentración biliar máxima que se puede encontrar in vivo (2% de bilis) y las cepas NCC2660 y NCC2657 no presentaron ningún descenso en el recuento de viables al ser sometidos a un valor máximo de un 4% de bilis. En consecuencia, todas las bifidobacterias aisladas a partir de heces caninas son considerablemente resistentes a concentraciones biliares elevadas.
Según las características de crecimiento, estas diez bacterias se pueden dividir en dos grupos:
\bullet cepas resistentes a la bilis y con características de crecimiento buenas: NCC2657, NCC2651, NCC2663 y NCC2667
\bullet cepas resistentes a la bilis pero con características de crecimiento que deben optimizarse para su producción industrial: NCC2660, NCC2671, NCC2677, NCC2647,NCC2654 y NCC2674.
Los resultados completos acerca de la resistencia al pH gástrico extremo durante la digestión de gatos y perros permitirán una determinación mejor de las cepas a seleccionar para estudios posteriores. Solamente la cepa NCC2651 no cumplió los criterios de selección en cuanto a la resistencia a pH.
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TABLA 5 Resumen
Código NCC Código Criterios de Resistencia a los Resistencia Estabilidad tras
crecimiento jugos gástricos a la bilis liofilización
2578 LB1-1 + + - -
2581 LB1-2 + + + +
2583 LK-1 + + + -
2586 LK1-2 - + - -
2590 LH2-1 + + + -
2592 LR1-1 + + + +
2594 LS1-1 - + - -
2597 LA2-5 - + + +
2600 LC2-5 - - + -
2603 LE2-5 + + + +
2606 LF2-6 - + + -
2609 LH2-6 + + + -
TABLA 5 (continuación)
Código NCC Código Criterios de Resistencia a los Resistencia Estabilidad tras
crecimiento jugos gástricos a la bilis liofilización
2613 LHH2-7 + + + +
2616 L1-1-1 - + + -
2619 L1-1-2 - + + -
2621 L3-1-2 + + - +
2625 L7-1-3 + + - +
2628 LA1-5 + + + -
2632 LA1-6 - + + -
2636 LB1-5 - + + + 
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De acuerdo con los resultados actuales se puede seleccionar una cepa bifidobacteriana aislada a partir de gatos y tres bifidobacterias aisladas a partir de perros; NCC2627, NCC2657, NCC2663 y NCC2667, respectivamente.
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TABLA 6 Medios de dilución
Sustrato Composición pH
Tampón fosfato K2PO4 72 g/l 7,0
KH2PO4 48 g/l
Agua destilada 1,000 ml
Solución Ringer NaCl 9 g/l 7,0
Agua destilada 1.000 ml
TS (Triptón salino) NaCl 8,5 g/l 7,0
Triptón 1 g/l
Agua destilada 1,000 ml 
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Se dispusieron porciones de 9 ml en tubos y se introdujeron en autoclave a 121ºC durante 15 min.
Finalmente, 8 de las 38 cepas fueron seleccionadas para estudios posteriores (véase el Ejemplo 3): tres lactobacilos aislados a partir de gatos (NCC2581, NCC2592, NCC2583), tres lactobacilos a partir de perros (NCC2603, NCC2613, NCC2628), una bifidobacteria a partir de gatos (NCC2627) y una bifidobacteria a partir de perros (NCC2657).
Estas cepas se caracterizan por tiempos de generación cortos, recuentos elevados (superiores a 1,0E+08 ufc/ml) durante la fase estacionaria y estabilidad a altas cantidades a 8 y 24 h post-incubación, estabilidad frente a la liofilización seguida de cualesquiera condiciones de conservación, resistencia a las concentraciones biliares extremas del duodeno (2% bilis) y baja inhibición al ser cultivadas en presencia de hasta un 4% de bilis. Además, se tuvieron en cuenta resultados de análisis de DNA para seleccionar bacterias representativas de la diversidad investigada.
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Ejemplo 3 Eficacia de la colonización en gatos
L. reuteri NCC2581, L. reuteri NCC2592, L. rhamnosus NCC2583 y Bifidobacterium sp. NCC2627 fueron sometidas a ensayo en varios experimentos alimentarios para poder evaluar su capacidad de supervivencia al tránsito por el tubo gastrointestinal felino.
Se sometió a 16 gatos, machos y hembras lo más iguales posibles, a tres días de adaptación con Friskies Grand Menu de buey. El protocolo de alimentación consistió en siete días con "Friskies Grand Menu" y siete días de ensayo con "Friskies Grand Menu" al que se le había añadido una de las cepas antes mencionadas: L. reuteri NCC2581 (dieta A), L. reuteri NCC2592 (dieta B), L. rhamnosus NCC2583 (dieta C) y Bifidobacterium sp. NCC2627 (dieta D). La asignación de dietas fue la siguiente:
Núm. gato 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Periodo 1 A D C B D A A C B A
Periodo 2 B A D A C C D A C B 
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Núm. gato 11 12 13 14 15 16
Periodo 1 B C B D C D
Periodo 2 C D D A B B
Estas cepas se prepararon en una cantidad suficiente y en una forma liofilizada estable para aplicar estas ocho bacterias diferentes según la supervivencia de la cepa en el tubo gastrointestinal de los animales ensayados. Todas las cepas se mezclaron con 4 g de trealosa para así añadir un volumen suficiente de portador para la mezcla de las cepas preparadas con la matriz alimentaria para los animales. Las cepas bacterianas se preparan en tubos de plástico individuales (1,0E+09 ufc/día) y se añaden diariamente en una parte del alimento para garantizar la ingestión del total de las bacterias.
Se obtienen muestras fecales frescas para el análisis de las cifras de la población bacteriana y se comparan con la línea de base (sin bacterias añadidas). Las heces se recogen los días
7 y 8 (línea de base),
14 y 15,
21 y 22 (línea de base).
28 y 29.
Se utiliza una sonda rectal estéril para obtener una muestra fecal de por lo menos 0,1 g. Esta muestra es pesada con precisión y se mezclan 0,1 g con 10 ml de solución fisiológica (Ringer) que contiene un 10% de glicerol. Luego se transfiere esta solución a criotubos de 1 ml y se congela en nitrógeno líquido. Entonces todas las muestras se conservan a -80ºC hasta el análisis.
Se hizo el recuento de las poblaciones endógenas de lactobacilos, Bacteroides, enterobacteriáceas, enterococos, bifidobacterias y Clostridium perfringens. Se detectaron bacterias en medios selectivos o semiselectivos. A partir de las diluciones que estaban en el intervalo entre -2 y -8, Se realizaron cien diluciones seriadas en solución Ringer con un 0,5% de cisteína. Se inocularon e incubaron placas de petri de diversos medios selectivos (véase la siguiente Tabla).
\newpage
Bacterias Medios T (ºC) Tiempo (h) Atmósfera
Enterobacteriaceae Drigalski (Sanofi Diagnostics 37 24 Aeróbica
Pasteur, Francia)
Bifidobacteria Eugon Tomato * 37 48 Anaeróbica
lactobacilos MRS (Difco, MI. USA) 37 48 Anaeróbica
+ antibióticos **
C. perfringens Agar NN *** 37 48 Anaeróbica
Bacteroides Schaedler Neo-Vanco (BioMérieux, 37 48 Anaeróbica
Marcy-l'Etoile, Francia)
*: \; \; Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual, V. Suter, D. Citron y S. Finegold; Third ed.
**: \; Fosfomicina (79,5 mg/l) + Sulfametoxazol (0,93 mg/l) + Trimetoprima (5 mg/l)
***: Agar NN de Lowbury and Lilly, 1995
Resultados: los recuentos bacterianos que se presentan en la Tabla 7 están expresados en log en base 10.
TABLA 7 Recuentos bacterianos fecales en gatos (media \pm Stdev, n=8)
NCC 2581 NCC 2592 NCC 2583 NCC 2627
antes Durante Antes Durante Antes Durante Antes Durante
Lactobacilos 6,38 7,63 6,12 7,62 5,31 7,47 6,69 7,65
\pm 2,25 \pm 1,23 \pm 2,45 \pm 1,58 \pm 2,04 \pm 1,23 \pm 1,44 \pm 1,45
Bifidobacterias 7,17 7,64 7,57 6,31 6,43 6,80 8,04 6,07
\pm 1,82 \pm 0,42 \pm 1,68 \pm 2,26 \pm 2,25 \pm 2,19 \pm 1,03 \pm 2,32
Enterobacteriaceae 4,25 4,27 4,37 4,58 5,09 4,40 4,59 3,64
\pm 1,71 \pm 1,20 \pm 1,35 \pm 1,45 \pm 1,50 \pm 0,63 \pm 1,42 \pm 0,64
Bacteroides 6,05 5,54 5,94 6,15 6,19 5,52 6,00 5,48
\pm 1,38 \pm 0,49 \pm 0,99 \pm 1,43 \pm 0,97 \pm 0,46 \pm 1,11 \pm 0,50
C. perfr. 4,09 3,84 3,61 3,30 4,16 3,34 3,84 3,57
\pm 1,22 \pm 1,00 \pm 0,57 \pm 0,00 \pm 1,64 \pm 0,11 \pm 0,89 \pm 0,56
Durante el tratamiento se observa un incremento de los recuentos fecales de lactobacilos debido a la ingestión de las bacterias probióticas citadas. No se observa ningún incremento drástico en el recuento de Enterobacteriaceae lo cual refleja que no existen daños en el ecosistema intestinal relacionados con el uso de los probióticos seleccionados.
Ejemplo 4 Eficacia de la colonización en perros
L. reuteri NCC2603, L. reuteri NCC2613, L. acidophilus NCC2628 y Bifidobacterium sp. NCC2657 fueron sometidas a ensayo en varios experimentos alimentarios para poder evaluar su capacidad de supervivencia al tránsito por el tubo gastrointestinal del perro.
Se sometió a 10 perros, 5 machos y 5 hembras de 4 a 7 años de edad, a este experimento específico. El protocolo alimentario consistió en 5 días de adaptación con "Friskies Vitality" sin achicoria, 5 días de ensayo con "Friskies Vitality" sin achicoria, 3 días de adaptación y 5 días de ensayo con "Friskies Vitality" sin achicoria más bacterias: L. reuteri NCC2603 (dieta E), L. reuteri NCC2613 (dieta F), L. acidophilus NCC2628 (dieta G) y Bifidobacterium sp. NCC2657 (dieta H). La asignación de dietas fue la siguiente:
\newpage
núm. perro 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
periodo 1 E E E E E F F F F F
periodo 2 G G G G G H H H H H
Las cepas mencionadas se prepararon en una cantidad suficiente y en una forma liofilizada estable para aplicar estas ocho bacterias diferentes según la supervivencia de la cepa en el tubo gastrointestinal de los animales ensayados. Todas las cepas se mezclaron con 4 g de trealosa para así añadir un volumen suficiente de portador para la mezcla de las cepas preparadas con la matriz alimentaria para los animales. Las cepas bacterianas se preparan en tubos de plástico individuales (5,0E+09 ufc/día) y se añaden diariamente en una parte del alimento para garantizar la ingestión del total de las bacterias.
Se obtienen muestras fecales frescas para el análisis de las cifras de la población bacteriana y se comparan con la línea de base (sin bacterias añadidas). Las heces se recogen los días
7 y 8 (línea de base),
14 y 15,
21 y 22 (línea de base).
28 y 29.
Se utiliza una sonda rectal estéril para obtener una muestra fecal de por lo menos 0,1 g. Esta muestra es pesada con precisión y se mezclan 0,1 g con 10 ml de solución fisiológica (Ringer) que contiene un 10% de glicerol. Luego se transfiere esta solución a criotubos de 1 ml y se congela en nitrógeno líquido. Entonces todas las muestras se conservan a -80ºC hasta el análisis. El recuento de todas las bacterias se llevó a cabo en los mismos medios que se describen en el ejemplo 3.
Resultados: Los recuentos bacterianos que se presentan en la Tabla 8 están expresados en log en base 10.
TABLA 8 Recuentos bacterianos fecales en perros (media \pm Stdev, n=8)
NCC 2603 NCC 2613 NCC 2628 NCC 2657
antes Durante Antes Durante Antes Durante Antes Durante
Lactobacilos 5,25 3,92 4,00 3,40 7,93 8,30 6,47 7,00
\pm 1,34 \pm 1,05 \pm 1,56 \pm 0,21 \pm 1,75 \pm 0,99 \pm 1,27 \pm 1,35
Bifidobact. 7,32 4,48 6,09 4,55 7,70 7,20 5,72 6,78
\pm 2,06 \pm 2,64 \pm 2,10 \pm 2,79 \pm 1,88 \pm 1,88 \pm 2,51 \pm 2,39
Enterobact. 4,10 4,62 3,62 4,39 4,58 4,04 4,51 4,85
\pm 0,89 \pm 0,61 \pm 0,72 \pm 0,94 \pm 1,54 \pm 0,76 \pm 1,51 \pm 1,45
Bacteroides 7,82 6,70 6,92 6,69 7,88 7,53 7,92 7,66
\pm 0,53 \pm 1,25 \pm 1,37 \pm 1,19 \pm 1,13 \pm 0,61 \pm 0,63 \pm 0,86
C. perfr. 3,70 3,84 3,50 3,30 3,70 3,30 3,93 3,70
\pm 0,89 \pm 0,87 \pm 0,45 \pm 0,00 \pm 0,62 \pm 0,00 \pm 1,25 \pm 0,89
Durante el tratamiento no se observa ningún cambio importante en los recuentos fecales de lactobacilos debido a la ingestión de las bacterias probióticas seleccionadas excepto en el caso de la cepa de L. acidophilus NCC2628. El efecto inhibidor sobre C. perfringens bajo las condiciones ensayadas no fue significativo ya que los niveles basales de C. perfringens eran muy bajos. No se observa ningún incremento drástico en el recuento de Enterobacteriaceae lo cual refleja que no existe ninguna perturbación del ecosistema intestinal relacionada con el uso de los probióticos seleccionados.
Ejemplo 5 Efecto de los lactobacilos y sus metabolitos sobre la viabilidad de Giardia intestinalis
Se estudió el efecto de sobrenadantes de filtrado de cultivo de cepas de lactobacilos aislados a partir de gatos y perros.
Material y Métodos
Cepas y cultivos bacterianos: los microorganismos pertenecientes al género Lactobacillus formaban parte de la Colección de Cultivos Nestlé. Las bacterias se cultivaron en medio MTYI. Los sobrenadantes que contenían metabolitos de lactobacilos fueron neutralizados a pH 6 y esterilizados por filtración.
Se llevaron a cabo controles en los que se acidificó el medio MTYI con ácido láctico al mismo pH que el de los cultivos bacterianos. Después se ajustó a pH 6 con NaOH 0,1 N. El origen de la cepa estudiada y el pH de los sobrenadantes y controles se muestran en la Tabla 9.
TABLA 9
Cepa Origen pH sobrenadante pH control
L. reuteri NCC2581 Gato 6,63 6,63
L. rhamnosus NCC2583 Gato 6,50 5,97
L. reuteri NCC2592 Gato 6,04 5,98
L. reuteri NCC2603 Perro 6,04 5,99
L. reuteri NCC2613 Perro 6,07 5,95
L. acidophilus NCC2628 Perro 6,01 5,93
Parásitos: La cepa de Giardia intestinalis WB (ATCC 30957) fue comprada a la American Type Culture Collection (Rockville, EEUU). Los trofozoitos se cultivaron en medio de cultivo TYI-S-33 modificado de Keister y contenía por litro: 20 g de producto de la digestión de la caseína (Difco), 10 g de extracto de levadura (BBL), 10 g de dextrosa (Merck), 0,75 g de bilis bovina (Difco), 2 g de NaCl (Merck), 2 g de HCl L-cisteína (Sigma), 0,2 g de sal sódica de ácido ascórbico (Fluka), 0,6 g de K_{2}HPO_{4} (Merck), 22,8 mg de citrato amónico férrico (Sigma), 100 ml de suero bovino adulto (Sigma), 15 ml de penicilina/estreptomicina (Gibco, 1000 IU/ml, 1000 \mug/ml). El pH se ajustó a 6,9 con NaOH 5 N previamente a la esterilización por filtración (tamaño del poro:0,22 \mum).
Los parásitos se cultivaron en frascos de cultivo de poliestireno (LUX, Miles Laboratories, Inc. Naperville IL 60540) en los que había 40 ml de medio de cultivo. Se realizaron subcultivos descartando el sobrenadante carente de parásitos, añadiendo 5 ml de medio de cultivo frío, incubando en un baño de hielo durante 10 min para separar los trofozoitos adheridos e inoculando 0,2 ml de la suspensión resultante en medio fresco. Las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC en la oscuridad.
Ensayos de proliferación: Se mezclaron 200 \mul de suspensiones de trofozoitos (1,4 x 10^{5} parásitos/ml) con 100 \mul de sobrenadantes o controles, y se añadió 1 \muCi de timidina H3. Se incubaron muestras a 37ºC durante 24 h en placas de cultivo de 96 pocillos (Nunc Brand Products). Entonces se recogieron los parásitos y se evaluó la incorporación de timidina.
Resultados
La incorporación de Timidina se muestra en la Tabla 10. La cepa NCC 2628 aislada a partir de un perro produjo una fuerte inhibición de la proliferación de la cepa WB (91%). Otras cepas estudiadas no inhibieron el crecimiento de trofozoitos.
TABLA 10 Efecto de los sobrenadantes de filtrado de cultivo sobre la proliferación de la cepa de Giardia intestinalis
Cepa Proliferación Giardia intestinalis en CPM
L. reuteri NCC 2581 1720
Control 2000
L. rhamnosus NCC 2583 2500
Control 1720
L. reuteri NCC 2592 1800
Control 1970
L. reuteri NCC 2603 2100
Control 1900
L. reuteri NCC 2613 2510
Control 1950
L. acidophilus NCC 2628 150
Control 1610
MTYI 1870
En este experimento se puede demostrar que los metabolitos funcionales producidos durante el crecimiento de L. acidophilus NCC 2628 tienen un fuerte efecto inhibidor sobre el crecimiento de Giardia intestinalis.
Ejemplos del 6 al 8
Efectos inhibidores de cepas de Lactobacillus de acuerdo con la invención sobre bacterias intestinales patógenas
Para identificar cepas con propiedades antagonistas fuertes respecto a patógenos intestinales pequeños se realizaron experimentos de cocultivo siguiendo un sistema modelo de simulación de las condiciones intestinales caninas (pH, composición y concentración biliar, mucina, pancreatina). El jugo de intestino delgado canino simulado contenía bilis canina reconstituida (0,345 g/l tauroquenodesoxicolato, Sigma, Alemania; 3,04 g/l taurocolato, Sigma, Alemania; 0,006 g/l colato, Fluka, Suiza), mucina porcina (1,9 g/l, Sigma, Alemania), pancreatina porcina (2,42 g/l, Sigma, Alemania) y solución electrolítica (5 g/l NaCl, 0,6 g/l KCl, 0,25 g/l CaCl_{2}, todos de Merck, Alemania). El pH del jugo se ajustó a 6,5 \pm 0,5 con NaOH 0,1 N.
Cepas y condiciones de cultivo Patógenos del intestino delgado
Se seleccionaron cuatro cepas potencialmente patógenas: S. typhimurium SL1344, E. coli ETEC O8:H9 y E. coli O149:K88 (aislados caninos patógenos) y un aislado clínico de Sh. dysenteriae (origen humano, amablemente proporcionada por el Centre Hospitalier Universitaire Vaudoise - CHUV Laussane, Suiza). Con la excepción de S. typhimurium SL1344 propagado en caldo Luria Bertani (Difco, EEUU), todas las Enterobacteriaceae se cultivaron en caldo Infusión Cerebro Corazón (Difco, EEUU) a 37ºC en agitación (240 rpm).
Bacterias ácido lácticas
Un amplio espectro de lactobacilos de origen canino y felino que incluye L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453), L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), L. reuteri NCC2581 (CNCM I-2448) y L. reuteri NCC2592 (CNCM I-2450) fueron seleccionadas a partir de la Colección de Cultivos Nestlé (NCC, Nestec, Suiza) y se analizó en el intestino delgado canino su supervivencia, actividad fisiológica y efectos inhibidores sobre los patógenos del intestino delgado arriba mencionados. Los lactobacilos se cultivaron anaeróbicamente (anaerocult, Oxoid, Inglaterra) en caldo de cultivo Man Rogosa Sharp (Difco, EEUU) a 37ºC.
Determinación de recuentos de células viables
Se diluyeron muestras en tampón fosfato estéril (NaH_{2}PO_{4}, pH 7, 0,2 M) y se realizaron diez diluciones seriadas que fueron dispuestas en la superficie de placas de agar: agar MRS (Difco, EEUU) para lactobacilos, agar Salmonella-Shigella (Oxoid, Inglaterra) para S. typhimurium y Sh. dysenteriae y agar Sorbitol Mac Conkey (Oxoi, Inglaterra) para E. coli. Las placas se incubaron anaeróbicamente durante 48 h a 37ºC, en el caso de los lactobacilos, y durante 24 h a 37ºC en el caso de las Enterobacteriaceae. En los experimentos de cocultivo, el crecimiento de Enterobacteriaceae sobre agar MRS se inhibió mediante la adición de polimixina (Oxoid, Inglaterra).
Experimentos de cocultivo de bacterias ácido lácticas (BAL) y patógenos
Se llevaron a cabo experimentos de cocultivo con BAL probióticas potenciales y cepas patógenas a 37ºC en 20 ml (tubos Falcon) de jugo de intestino delgado canino simulado enriquecido con diferentes fuentes de carbono (azúcar, alimento para mascotas) para favorecer la actividad metabólica de los cultivos. Las BAL fueron inoculadas a 10E+08 ufc/ml y los patógenos a 10E+02 ufc/ml, 10E+04 ufc/ml y 10E+06 ufc/ml. Se tomaron muestras en diferentes tiempos hasta las 8 horas y se determinaron recuentos de células viables mediante la disposición de diez diluciones seriadas sobre la superficie de placas con los medios respectivos.
Los experimentos de cocultivo se realizaron bajo diferentes condiciones como el enriquecimiento con dextrosa del jugo de intestino delgado canino simulado (5 g/l) y diferentes concentraciones de alimento seco extruido para mascotas comercialmente disponible (5, 25 ó 100 g/l; Friskies ALPO Complete, EEUU). Estas últimas fueron homogeneizadas (Stomacher Lab Blender) y suspendidas en solución electrolítica. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.
Ejemplo 6
Se llevaron a cabo experimentos de cocultivo con cuatro lactobacilos y las cuatro cepas potencialmente patógenas E. coli ETEC O8:H9, E. coli O149:K88, S. typhimurium SL1344 y Sh. dysenteriae en jugo duodenal canino simulado enriquecido con 5 g/l de dextrosa (Difco). Se inocularon los lactobacilos a 10E+08 ufc/ml y las cepas indicadoras Gram negativas a 10E+02 ufc/ml. Los resultados se recogen en la Tabla 11.
TABLA 11 Cocultivo de BAL y bacterias potencialmente patógenas en jugo de intestino delgado canino simulado enriquecido con dextrosa
Patógeno E. coli ETEC O8:H9 E. coli O149:K 88 S. typhimurium SL1344 Sh. dysenteriae
Probiótico
L. acidophilus NCC +++ +++ +++ +++
2628 (CNCM I-2453)
L. rhamnosus NCC +++ +++ +++ +++
2583 (CNCM I-2449)
L. reuteri NCC2581 Inhibición ++ Inhibición +++
(CNCM I-2448) nula nula
L. reuteri NCC2592 Inhibición ++ Inhibición +
(CNCM I-2450) nula nula
+ \; \; Inhibición del crecimiento
++ \; Inhibición del crecimiento e inactivación parcial
+++ Inhibición del crecimiento inactivación completa
Los cuatro lactobacilos investigados mostraron actividad antimicrobiana, pero solamente L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) y L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) mostraron una actividad elevada frente a todos los patógenos ensayados. Ambas cepas eran capaces tanto de inhibir el crecimiento como de inactivar completamente los patógenos que contenía el sistema de ensayo (no quedaba ninguna célula viable).
Ejemplo 7
Se llevaron a cabo experimentos de cocultivo con los lactobacilos L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) y L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) y S. typhimurium SL1344 en jugo duodenal canino simulado enriquecido con alimento seco extruido para mascotas comercialmente disponible (5, 25 ó 100 g/l; Friskies ALPO Complete, EEUU). Se inocularon los lactobacilos a 10E+08 ufc/ml y las cepas indicadoras Gram negativas a 10E+02 ufc/ml. Los resultados se recogen en la Tabla 12.
TABLA 12 Cocultivo de BAL y bacterias potencialmente patógenas en jugo de intestino delgado canino simulado enriquecido con alimento seco para mascotas
Patógeno Enriquecimiento con alimento para mascotas S. typhimurium SL1344
Probiótico
L. acidophilus NCC2628 5 g/l +++
(CNCM I-2453) 25 g/l +++
100 g/l +++
L. rhamnosus NCC2583 5 g/l No inhibición
(CNCM I-2449) 25 g/l +
100 g/l ++
+ \; \; Inhibición del crecimiento
++ \; Inhibición del crecimiento e inactivación parcial
+++ Inhibición del crecimiento inactivación completa
Los resultados demuestran en especial el alto potencial de L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) para inhibir el crecimiento e incluso inactivar completamente los patógenos del intestino delgado bajo condiciones muy prácticas como son una mezcla de jugo de intestino delgado simulado y alimento para mascotas. La actividad antimicrobiana de L. acidophilus NCC2628 era muy elevada incluso a niveles bajos de enriquecimiento con alimento para mascotas comercial que servía de fuente de azúcares fermentables para el organismo. Por el contrario, la efectividad de L. rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) dependía del nivel de enriquecimiento con alimento para mascotas de manera que se observaba un aumento en la actividad antimicrobiana a medida que aumentaba la cantidad de alimento para mascotas añadido al sistema de ensayo.
Ejemplo 8
Se llevaron a cabo experimentos de cocultivo con L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) y diferentes niveles de inoculación de S. typhimurium SL1433 en jugo duodenal canino simulado enriquecido con dextrosa (5 g/l, Difco). L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) fue inoculado a 10E+08 ufc/ml y S. typhimurium SL1433 a 10E+02 ufc/ml, 10E+04 ufc/ml y 10E+06 ufc/ml. Los resultados se recogen en la Tabla 13.
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TABLA 13 Cocultivo de L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) y diferentes niveles de inoculación de S. typhimurium SL1344
Patógeno Nivel de inoculación del patógeno S. typhimurium SL1344
Probiótico
L. acidophilus 10E+02 ufc/ml +++
NCC2628 (CNCM I-2453) 10E+04 ufc/ml +++
10E+06 ufc/ml +++
+ \; \; Inhibición del crecimiento
++ \; Inhibición del crecimiento e inactivación parcial
+++ Inhibición del crecimiento inactivación completa
La actividad antimicrobiana de L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) era lo suficientemente alta como para inactivar completamente incluso concentraciones iniciales elevadas de S. typhimurium SL1344.
\newpage
Ejemplo 9 Estimulación inmunitaria in vivo en perros
Se analizó el potencial de estimulación inmunitaria de cepas de probióticos aisladas de mascotas en un ensayo clínico con la cepa L. acidophilus NCC2628.
Métodos Proliferación de células mononucleares periféricas (PMBC) caninas tras la estimulación con diferentes mitógenos
Para realizar este experimento se utilizaron 20 perros de 4 a 7 años de edad. El protocolo alimentario consistió en una semana de adaptación con "Friskies Vitality" sin achicoria y 4 semanas de ensayo con "Friskies Vitality" sin achicoria más bacterias de L. acidophilus NCC2628.
La cepa L. acidophilus NCC2628 se preparó en una cantidad suficiente y en una forma liofilizada estable de acuerdo con la supervivencia de la cepa en el tubo gastrointestinal de los animales ensayados. Se mezclaron bacterias con 4 g de trealosa con el fin de añadir un volumen de portador suficiente para mezclar la bacteria preparada con la matriz alimentaria para los animales. Las bacterias se prepararon en tubos de plástico individuales (5,0E+09 ufc/día) y se añadieron diariamente en una parte del alimento para asegurar la ingestión del total de bacterias.
Se tomaron muestras de sangre de los perros después de las cuatro semanas de administración del probiótico. La sangre se fraccionó en una columna Vaccutaniner^{TM} (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Las PMBC fueron recubiertas siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Las células se estimularon con diferentes mitógenos o ésteres de forbol que inducen una fuerte proliferación de células T (concanavalina A (conA), fitohemaglutinina (PHA)), de células B (mitógeno de filotaca o "pokeweed" (PWM)) y de todas las células (Forbol-Miristato-Acetato/Ionomicina (PMA/Iono)). Se incubaron 10^{5} células por pocillo con mitógenos o los ésteres de forbol (las dosis respectivas se indican en la figura 1) en un volumen final de 200 \mul de medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y antibióticos en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos (Nunc).
Las células se mantuvieron en atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada a 37ºC durante 48 h. Las células se marcaron por pulsos con 1 \muCi de timidina H3 (Amersham Pharmacia Biotech, Suiza) durante otras 18 h. Luego se transfirieron las células sobre filtros de nitrocelulosa (Packard) y la timidina H3 unida se midió mediante recuento de centelleos (TopCount; Packard, Suiza). La proliferación celular se calculó como las cuentas por minuto (cpm) medias(\pmSD) a partir de triplicados.
Resultados
Figura 1: tuvo lugar un incremento claro de la proliferación celular en respuesta todos los mitógenos del grupo del perro alimentado con L. acidophilus NCC2628 si se compara con el grupo control. Este incremento fue significativo en los cultivos estimulados con los ésteres de forbol PMA + ionomicina. Estos datos muestran que las células linfoides de perros alimentados con probióticos eran más reactivas tras una activación in vitro y sugieren que el sistema inmunitario de los perros alimentados con probióticos ha sido estimulado.
Ejemplo 10 Modulación in vitro de las funciones inmunitarias por cepas de lactobacilos aisladas de mascotas
Se estableció un cribado in vitro de las diferentes cepas de lactobacilos aisladas de mascotas antes descritas para determinar su potencial de modulación inmunitaria. Con esta finalidad, se midió su capacidad para inducir citocinas proinflamatorias (IL-12, IFN\gamma) y/o citocinas antiinflamatorias (IL-10, TGF-\beta) (Anand A.C., Adaya C.M. 1999, Trop. Gastroenterol.; 20(3):97-106; Spellber B., Edwards J.E.Jr 2001, Clin. Infect. Dis.; 32(1):76-102). Con esto se pretendía seleccionar cepas candidatas potenciales para funciones inmunitarias antipatógenas o anticancerosas fuertes además de funciones antagonistas respecto a patologías intestinales caninas como alergias e inflamación (enfermedades inflamatorias intestinales). Se realizaron cultivos adicionales solo con medio de cultivo (control negativo), con la cepa Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415, Cerbios-Pharma, Suiza) y con un aislado de Lactobacillus humano ST11 (NCC 2461, CNCM I-2116) (control positivo).
Método Perfiles de citocinas inducidos por diferentes cepas probióticas en leucocitos caninos
Se trató sangre de perros adultos normales durante 5 min a temperatura ambiente con tampón de lisis ACK (150 mM de NH_{4}Cl, 1 mM de KHCO_{3} y 0,1 mM de Na_{2}EDTA en H_{2}O, pH = 7,4). Los leucocitos se lavaron dos veces con medio RPMI (sin antibióticos) y se sembraron a 2,10^{6} células/ml en placas de cultivo de 24 pocillos. Se añadió a cada pocillo 1 ml de una suspensión bacteriana (descrita más adelante) que contenía 10^{6} ufc.
Para el tratamiento control, se añadió solamente medio a los leucocitos. Las muestras se incubaron 18 h a 37ºC y CO_{2} al 5%. Posteriormente, los leucocitos se recogieron, se lavaron en PBS y se centrifugaron. El sedimento celular fue lisado con 500 \mul de reactivo Trizol (Gibco BRL). Se extrajo RNA de los lisados celulares mediante el equipo Nucleospin RNA (Macherey-Nagel). Se realizaron RT-PCR para amplificación de citocinas caninas mediante el equipo AB gene (Merck). Las referencias de los cebadores (todos producidos por Microsynth) se indican más adelante. El análisis densitométrico de las bandas de PCR reveladas en los geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio se llevó a cabo utilizando el software NIH Image. Todas las bandas se normalizaron con la banda del producto de PCR correspondiente a \beta-actina respectiva obtenida con cada muestra (control interno), y los resultados están expresados en unidades arbitrarias que reflejan las densidades en píxeles de cada banda del producto de PCR correspondiente a citocina (figura 2).
-
Preparación de las bacterias: las diferentes cepas de lactobacilos se cultivaron en medio MRS durante aproximadamente 8 h hasta alcanzar una densidad idéntica. Las bacterias se diluyeron en medio RPMI sin antibióticos hasta unas concentraciones finales de 10^{6} ufc/ml.
-
Cebadores utilizados para las RT-PCR de citocinas:
Citocinas Referencias
IL-12p40 Büttner M., et al., 1998. Cytokine; 10(4):241-248.
IFN\gamma Büttner M., et al., 1998. Cytokine; 10(4):241-248.
TGF\beta1 Gröne A., et al., 1998. Vet. Immunol. Immunopathol.; 65:11-27.
IL-10 Pinelli E., et al., 1999, Vet. Immunol. Immunopathol.; 69:121-126.
Resultados
Figura 2: Los datos mostrados muestran que los perfiles de citocinas inducidos por lactobacilos dependen del tipo de cepa. Por ejemplo, la cepa NCC2628 indujo altos niveles de IL-10 y TGF\beta, lo cual resalta el potencial de esta cepa en particular para la modulación inmunitaria de trastornos inflamatorios como alergias y enfermedades inflamatorias intestinales. Por el contrario, la cepa NCC2583 indujo elevados niveles de IFN\gamma y IL-12, lo que implica que esta cepa es una buena candidata para la actividad antipatógena o anticancerosa.
Ejemplo 11
En el estudio se utilizan tres tipos de alimento seco para mascotas: "A","B" y "C". El alimento para mascotas "A" es un alimento seco nutricionalmente completo, disponible con el nombre de ALPO (ALPO es una marca registrada de SOCIÉTÉ DES PRODUITS NESTLÉ S.A. de Suiza).
El alimento para mascotas "B" es el mismo alimento seco nutricionalmente completo que "A", pero está suplementado con una mezcla en polvo de microorganismos probióticos seleccionados añadidos de una bolsita. La mezcla comprende cantidades sustancialmente iguales de L. acidophilus NCC2628 y Bifidobacterium sp. NCC2657. Se espolvorea sobre el alimento en cada ración en una dosis de unas 1.0E+08 ufc/día.
El alimento para mascotas "C" es un alimento seco nutricionalmente completo sustancialmente idéntico al alimento "A" pero que contiene un 1,2% en peso de un sobrenadante seco de un cultivo de Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415).
En el estudio se emplearon 30 perros. Primero son prealimentados durante 8 semanas con el alimento "A". Luego se les divide en tres grupos de 10 perros cada uno, se les designa como grupo A, B y C y se les alimenta durante 8 semanas con las dietas que les corresponde por nombre:
Los perros tienen acceso libre a agua y son alimentados una vez al día. La prevalencia de caspa en el pelo se determina mediante un panel de evaluación de 30 miembros al inicio y a las 7 semanas.
Los perros se cepillan antes de ser evaluados por el panel y los miembros del mismo no comparan notas durante la evaluación.
En esta evaluación los perros son presentados a cada uno de los miembros del panel en 20 parejas diferentes. Se pide a los miembros que indiquen en sus hojas de puntuación qué perro de la pareja presentada muestra (1) menos caspa (2) mayor brillo del pelo y (3) menos olor a pelo.
El estado general del pelo de todos los perros es bueno a la vista y al tacto, tal como se espera de perros normales y sanos. Sin embargo, se observa que los perros alimentados con la dieta C presentan bastante menos caspa que aquellos alimentados con la dieta control A. Los alimentados con la dieta B presentan un pelo mucho más brillante y desprenden menos olor a pelo que los alimentados con A. Estas características no parecen diferir estadísticamente de forma significativa si se comparan con los perros en el grupo B.
Ejemplo 12
Una mezcla alimenticia está compuesta de cerca de un 58% en peso de maíz, un 6% en peso de gluten de maíz, un 23% en peso de carne y el resto lo componen harina, sales, vitaminas y minerales.
La mezcla alimenticia se introduce en un precondicionador y se humedece. A esta mezcla se le añade un polvo que contiene una mezcla de las siguientes cepas de Lactobacillus: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) y Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). El polvo se dispersa bastante homogéneamente por toda la mezcla. Esta combinación alimenticia humedecida se introduce en una extrusora-esterilizadora y es gelatinizada. La matriz de gelatina que sale de la extrusora se obliga a pasar por un molde y se extruye. La mezcla extruida se corta en porciones adecuadas para alimentar a los perros, se seca a unos 110ºC durante 20 min y se enfría para formar pellets. Se analiza la actividad bacteriana de las cepas añadidas en las porciones de mezcla extruida y no se detecta ninguna.
Ejemplo 13
En este estudio se utilizan 24 perros, jóvenes y mayores, estos últimos de entre 8 y 12 años. Los perros mayores seleccionados muestran signos externos de inflamación articular habituales de su edad y parecen padecer alguna dificultad de movimiento ocasional. Ciertos movimientos parecen resultarles dolorosos. Estos síntomas se observan con frecuencia en perros mayores y se cree que están relacionados con una enfermedad artrítica.
En el estudio se utilizan tres alimentos secos para mascotas que se designan como A, B y C. El alimento A es un alimento seco nutricionalmente completo (ALPO Beefy Dinner) y es el alimento control.
Todos los 24 miembros de la selección son alimentados durante 8 semanas con el alimento A. Entonces los perros son divididos en tres grupos, A, B y C, cada uno de ellos con 8 perros y con la misma proporción de jóvenes y mayores. Cada grupo es alimentado siguiendo las dietas respectivas durante 8 semanas:
Grupo Alimento para mascotas
A A
B B
C C
El alimento B es un alimento seco nutricionalmente completo sustancialmente idéntico al alimento A, pero contiene un recubrimiento que representa el 2% de su peso y que contiene los microorganismos de Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). La cantidad de alimento administrado diariamente a cada perro se calcula según la masa corporal individual, por tanto la dosis de microorganismos es de 1,0E+09 ufc/día.
La dieta C está formada por las porciones extruidas producidas en el ejemplo 12 anterior. La cantidad de alimento administrado diariamente a cada perro se calcula según la masa corporal individual, por tanto la dosis es de 1,0E+11 ufc/día.
Los perros tienen libre acceso a agua y son alimentados una vez al día. A cada perro se le coloca en el collar un medidor de actividad y se realizan mediciones cada día. La actividad de los perros también es evaluada visualmente por personal experto.
El estado general de todos los perros es bueno a la vista y al tacto, tal como se espera de perros normales y sanos. Sin embargo, se observa que los perros alimentados con las dietas B y C son más activos que sus equivalentes de la dieta A. Las lecturas del medidor apoyan estas observaciones.
Además, los perros mayores de los grupos B y C, después de ser alimentados con las dietas B y C durante el periodo del ensayo, parecen mostrar menos signos externos de inflamación articular local. Los perros también parecen experimentar niveles más bajos de dolor con el movimiento físico y se mueven más libremente que antes. Se puede concluir que las dietas B y C parecen proporcionar alivio respecto a determinados signos de envejecimiento y mejoran la movilidad de las mascotas mayores.
Ejemplo 14 Alimento seco para gatos
Una mezcla alimenticia está compuesta de cerca de un 58% en peso de maíz, un 6% en peso de gluten de maíz, un 23% en peso de harina de pollo y el resto lo componen sales, vitaminas y minerales.
La mezcla alimenticia se introduce en un precondicionador y se humedece. La composición alimenticia humedecida se introduce en una extrusora-esterilizadora y es gelatinizada. La matriz de gelatina que sale de la extrusora se obliga a pasar por un molde y se extruye. La mezcla extruida se corta en porciones adecuadas para alimentar a los perros, se seca a unos 110ºC durante 20 min y se enfría para formar pellets. En este punto se proporciona un polvo liofilizado de una cepa o más de las siguientes especies de Lactobacillus para aplicar a los pellets: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) y Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Así, se proporciona suficiente polvo para que la ingesta alimenticia correspondiente para el gato sea de aproximadamente entre 1,0E+07 y 1,0E+09 ufc/día. Parte del polvo se mezcla en una primera masa de pellets y se embolsa. Una segunda cantidad del polvo es medida y mezclada con un portador lipídico que entonces es rociado sobre una segunda masa de pellets. Los pellets se embolsan una vez el recubrimiento esté suficientemente seco a entre 50 y 60ºC durante algunos minutos.
Ejemplo 15 Alimento en lata para mascotas y suplemento
Se prepara una mezcla alimenticia a partir de un 73% de carcasa de pollo, pulmones porcinos y hígado de ternera (molido), un 16% de harina de maíz, un 2% de colorantes, vitaminas y sales inorgánicas. Esta mezcla es emulsionada a 12ºC y extruida en forma de "pudding" que luego se cuece a una temperatura de 90ºC. Se deja enfriar hasta 30ºC y se corta en pedazos. El 45% de estos pedazos se mezcla con un 55% de una salsa preparada con un 98% de agua, 1% de colorante y un 1% de goma guar. Se llenan latas de hojalata y se esterilizan a 125ºC durante 40 min. Se proporciona un empaquetado adicional en bolsitas como un suplemento probiótico que se debe mezclar con el alimento para mascotas antes de servirlo. Su contenido son cepas de las siguientes especies de Lactobacillus: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) o Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). La cantidad correspondiente para la mascota es de aproximadamente entre 10^{6} y 10^{12} ufc/día, dependiendo de si es un perro o un gato y de factores físicos como la masa corporal. Se suministra como un suplemento adjunto a la lata y con indicaciones alimentarias.

Claims (10)

1. Cepa probiótica que es Lactobacillus reuteri NCC2581 (NCMC I-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592
(NCMC I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (NCMC I-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (NCMC I-2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (NCMC I-2452), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (NCMC I-2453).
2. Un método de obtención de cepas probióticas para gatos y/o perros que comprende los siguientes pasos:
a.
Aislamiento de bacterias ácido lácticas a partir de heces de gatos y perros,
b.
Selección de cepas con la capacidad de crecer produciendo por lo menos 1,0E+06 ufc/ml en presencia de hasta un 2,0% de sales biliares, y con la capacidad de crecer produciendo por lo menos 1,0E+06 ufc/ml tras 2 horas en un intervalo de pH de entre 3,4 y 4,2.
3. Un método de preparación de una composición de alimento para perros o gatos que comprende los siguientes pasos:
a.
Aislamiento de bacterias ácido lácticas a partir de heces de gatos o perros,
b.
Selección de cepas con la capacidad de crecer produciendo por lo menos 1,0E+06 ufc/ml en presencia de hasta un 2,0% de sales biliares, y con la capacidad de crecer produciendo por lo menos 1,0E+06 ufc/ml tras 2 horas en un intervalo de pH de entre 3,4 y 4,2.
c.
Incorporación de la(s) cepa seleccionada en una composición de alimento para perros o gatos.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la cepa es Lactobacillus o Bifidobacterium y donde la cepa está asociada a un vehículo ingerible o una matriz farmacéutica.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la composición está destinada a la salud del tubo gastrointestinal de gatos y/o perros.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la composición está destinada a la salud de la piel y/o el pelo de gatos y/o perros.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la composición está destinada a la mejora o reducción de los efectos del envejecimiento en gatos y/o perros.
8. El método de acuerdo con las reivindicaciones de la 3 a la 7, en el que la cepa se encuentra en la composición en una cantidad de entre 1,0E+04 y 1,0e+11 ufc/g.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 3 a la 8, que también contiene el paso de adición de un prebiótico.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 3 y la 9, en el que la composición está en forma de
a.
Un alimento para mascotas nutricionalmente completo en una forma seca en polvo o húmeda refrigerada o de conservación sin refrigerar, o
b.
En forma de un complemento alimenticio.
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