ES2260235T3

ES2260235T3 - Modificacion del antigeno "core" de la hepatitis b.

Info

Publication number: ES2260235T3
Application number: ES01943625T
Authority: ES
Inventors: Mark Page; Jing-Li Li; Paul Biomedical Research and Study Centre PUMPENS; Galina Biomedical Research & Study Ctr. Borisova
Original assignee: UCB Pharma Ltd
Current assignee: UCB Pharma Ltd
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2021-06-22
Also published as: WO2001098333A3; CA2413546C; DE60117978D1; PT1294893E; WO2001098333A2; DE60117978T2; US20040054139A1; EP1294893B1; DK1294893T3; ATE320493T1; CA2413546A1; AU6616301A; JP2004500868A; AU2001266163B2; EP1294893A2

Abstract

Una composición para vacuna que comprende una proteína que contiene el antígeno core de la hepati tis B (HBcAg) en el que una o más de las cuatro repeti ciones de arginina está ausente y está presente un resi duo de cisteína C-terminal, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Description

Modificación del antígeno "core" de la hepatitis B.

La invención se refiere a formas modificadas del antígeno "core" del virus de la hepatitis B (VHB) y a vacunas profilácticas y terapéuticas que contienen el antígeno modificado.

Antecedentes de la invención

El VHB continua siendo un problema sanitario importante en el mundo desarrollado y en el mundo en desarrollo. La infección con el virus puede tener como resultado una enfermedad aguda o crónica que en una proporción de casos puede conducir a un carcinoma hepatocelular y a la muerte. El virus tiene un doble revestimiento y su ADN está protegido dentro de una estructura proteica denominada antígeno core (HBcAg). El core está rodeado por la proteína de la envoltura conocida como antígeno de superficie o S (HBsAg).

El HBcAg es un antígeno inusual que puede ser utilizado como vehículo para la administración de péptidos específicos al sistema inmune. El antígeno ha sido utilizado para presentar epítopos a células T cooperadoras, a células B y a linfocitos citotóxicos (CTL) procedentes de una variedad de patógenos víricos y bacterianos, incluyendo epítopos del antígeno de superficie del VHB, de proteínas de la envoltura de la hepatitis A y de antígenos del virus de la hepatitis C. Para una revisión ver Ulrich y col. (1998) Advances in Virus Research 50:141-182.

El HBcAg es un vehículo excelente para la presentación de epítopos debido a la estructura molecular de la proteína, que se autoensambla para formar partículas. Cada partícula es producida a partir de 180 ó 240 copias de un polipéptido monomérico. El polipéptido tiene 183 ó 185 aminoácidos (aa) dependiendo del subtipo de VHB. El monómero, cuando alcanza una concentración apropiada dentro de la célula huésped, forma una partícula de 27 nm de diámetro aproximadamente. Estudios estructurales han demostrado que los aminoácidos que están dentro de la región que va desde el residuo 68 hasta el residuo 90 forman una estructura con púas sobre la superficie de la partícula que es conocida como el bucle e1. Dos monómeros unidos por enlaces disulfuro se unen para formar una púa dimérica, estando el aminoácido más expuesto en la posición 80 (en el centro del bucle e1).

EP-A-421635 (The Wellcome Foundation Limited) describe una modificación del gen del antígeno core del VHB para permitir la inserción de epítopos foráneos en el bucle e1 sin alterar el potencial de la proteína para formar partículas. La inserción en este lugar permite una exposición máxima del epítopo insertado en el extremo de cada púa creada por dímeros de la proteína. Como hay aproximadamente 180 (ó 240) copias de cada monómero por partícula, cada partícula es capaz de presentar 180 (ó 240) copias del epítopo de interés.

Por tanto, el HBcAg puede ser empleado con el fin de generar partículas híbridas para ser utilizadas como vacunas profilácticas y terapéuticas contra enfermedades infecciosas. Sin embargo, trabajos iniciales han identificado un perfil elevado de impurezas de ácido nucleico debido a la naturaleza inherente de la proteína core para unirse a ácidos nucleicos. Se sabe que la unión a ácidos nucleicos está asociada con cuatro repeticiones de arginina encontradas en el extremo C de la proteína. Se ha demostrado que la eliminación de estas repeticiones utilizando herramientas genéticas es factible y tiene como resultado la producción de partículas que no encapsidan ácido nucleico. Sin embargo, la eliminación de esta región parece reducir la estabilidad inherente de la estructura de las partículas.

Resumen de la invención

Con el fin de mantener la estabilidad de las partículas, a la vez que se soluciona el problema de la impureza de ácidos nucleicos, los inventores han ideado una estrategia alternativa y nueva. La estrategia implica la generación de un clon en el cual se ha eliminado una o más de las repeticiones de arginina del HBcAg pero en el que se conserva la cisteína C-terminal. La eliminación de las repeticiones de arginina reduce la unión del ácido nucleico, mientras que la conservación de la cisteína C-terminal permite la formación de un enlace disulfuro que en la estructura nativa es importante para la formación de una partícula estable. La(s) repetición(es) eliminada(s) puede(n) ser sustituida(s) por secuencias que codifiquen epítopos para T cooperadoras, B o CTL de patógenos bacterianos o víricos, parásitos, alergenos o antígenos asociados con el cáncer. Esto se hace posible por la inserción de un lugar de clonaje adecuado en el lugar de la región eliminada.

Por tanto, la invención proporciona una proteína que comprende HBcAg en la que una o más de las cuatro repeticiones de arginina está ausente y un residuo de cisteína C-terminal está presente. Puede estar presente un epítopo procedente de una proteína distinta de HBcAg en lugar de la(s) repetición(es) de arginina ausente(s). La proteína puede ser incorporada a una composición farmacéutica para vacunación profiláctica o terapéutica contra, por ejemplo, el VHB.

La proteína de la invención puede contener un segundo epítopo procedente de una proteína distinta de HBcAg, y el segundo epítopo puede estar el en bucle e1 de HBcAg. Mediante la colocación de un epítopo para T cooperadoras en el extremo C y de un epítopo para células B en el bucle e1, es posible incrementar la repuesta al epítopo para células B mediante la cooperación intraestructural de células T. Además, la estrategia puede ser utilizada para duplicar el número de un epítopo particular en cada partícula mediante el clonaje de la misma secuencia en el bucle e1 y en la región C-terminal.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Secuencia de aminoácidos del core de la hepatitis B utilizando el código de una sola letra. Está resaltada la secuencia C-terminal (aa135-185) para detallar la estrategia de deleción. Para enfatizar las 4 repeticiones de arginina (R), éstas están en negrita y subrayadas. Tres o cuatro regiones de repeticiones de arginina están subrayadas desde aa154-178 o aa146-178, respectivamente. La deleción de las regiones subrayadas con la inserción del sitio de restricción de SpeI, genera construcciones codificadas por los plásmidos pTCR_{154} y pTCR_{146}, respectivamente. El pTCR_{154} conserva la repetición de arginina N-terminal y en pTCR_{146} se han eliminado las 4 repeticiones de
arginina.

Figura 2: Secuencia de ADN que codifica HBcAg y posición y orientación de los cebadores oligonucleotídicos utilizados para PCR. Se presenta la posición del sitio de restricción de SpeI para los oligos MGR371, MGR369 y MGR370 (ver la Tabla 1).

Figura 3: Secuencias de ADN y de aminoácidos de los epítopos pre-S2 y S insertados en core. La Figura 3A muestra la secuencia de aa20-55 de la región pre-S2 del subtipo ayw del VHB. La Figura 3B muestra la secuencia de aa110-147 del antígeno S del subtipo adw. La Figura 3C muestra la secuencia de aa110-157 del antígeno S del subtipo adw.

Figura 4: Electroforesis en gel de agarosa de fragmentos de la PCR inversa. Calles 1, 2, 3 y 4 = fragmentos para pTCR_{146}, pTCR_{154}, pTCSR_{146} y pTCSR_{154}, respectivamente. Calle 5 = marcadores de tamaño. Todos los fragmentos tenían 5 kb aproximadamente, según se esperaba.

Figura 5: Análisis por inmunotransferencia de la expresión de la proteína core en lisados de bacterias E. coli transformadas con construcciones plasmídicas de sustitución 3'. Todas la muestras expresan una proteína reactiva con anticuerpos anti-core de diferentes pesos moleculares relativos dependiendo de la presencia o de la ausencia de secuencias de sustitución y del tamaño de la sustitución. Orden de las muestras:

Calle 1 = E. coli HB101 pTCR_{146}

Calle 2 = E. coli HB101 pTCR_{146}/S110-157

Calle 3 = E. coli HB101 pTCR_{146}/S2-2

Calle 4 = E. coli HB101 pTCR_{154}

Calle 5 = E. coli HB101 pTCR_{154}/S110-147

Calle 6 = E. coli HB101 pTCR_{154}/S110-157

Calle 7 = E. coli HB101 pTCR_{154}/S2-2

Calle 8 = E. coli HB101 pTCSR_{146}

Calle 9 = E. coli HB101 pTCSR_{146}/S110-157

Calle 10 = E. coli HB101 pTCSR_{146}/S2-2

Figura 6: Análisis por inmunotransferencia de la expresión de la secuencia S en lisados de bacterias transformadas con las construcciones plasmídicas de sustitución 3'. Las construcciones que incorporan las secuencias S (Calles 2, 4, 5 y 7) son reactivas con anticuerpos anti-S. Orden de las muestras:

Calle 1 = E. coli HB101 pTCR_{146}

Calle 2 = E. coli HB101 pTCR_{146}/S110-157

Calle 3 = E. coli HB101 pTCR_{154}

Calle 4 = E. coli HB101 pTCR_{154}/S110-147

Calle 5 = E. coli HB101 pTCR_{154}/S110-157

Calle 6 = E. coli HB101 pTCSR_{146}

Calle 7 = E. coli HB101 pTCSR_{146}/S110-157

Calle 8 = Marcador pretinción (Novex).

Figura 7: Análisis por inmunotransferencia de la expresión de la secuencia pre-S2 en lisados de bacterias transformadas con las construcciones plasmídicas de sustitución 3'. Las construcciones que incorporan las secuencias pre-S2 (Calles 2, 4 y 6) son reactivas con anticuerpos hacia pre-S2. Orden de las muestras:

Calle 1 = E. coli HB101 pTCR_{146}

Calle 2 = E. coli HB101 pTCR_{146}/S2-2

Calle 3 = E. coli HB101 pTCR_{154}

Calle 4 = E. coli HB101 pTCR_{154}/S2-2

Calle 5 = E. coli HB101 pTCSR_{146}

Calle 6 = E. coli HB101 pTCSR_{146}/S2-2

Calle 7 = Marcador pretinción (Novex).

Figura 8: Muestra las respuestas anti-HBc medias en ratones inmunizados con varias construcciones descritas en los Ejemplos. Los títulos fueron calculados como los logaritmos negativos de la dilución sérica de la CE50 (concentración eficaz, 50%) sobre la base de curvas dosis-respuesta sigmoideas.

Descripción detallada de la invención Las modificaciones de la secuencia de HBcAg

Según se mencionó anteriormente, HBcAg es una proteína de 183 ó 185 aminoácidos dependiendo del subtipo de VHB. Los dos aminoácidos extra en la forma de 185 de la proteína están situados entre la primera y la segunda repetición de arginina. La secuencia de una forma de la proteína con 185 aminoácidos con una presecuencia está mostrada en la Figura 1. En la Figura 1, la secuencia de la proteína HBcAg madura se extiende desde el residuo de Met en posición 25 hasta el residuo de Cys en el extremo C, siendo la presecuencia la secuencia desde el residuo 1 al 24. Las cuatro repeticiones de arginina están situadas en las posiciones siguientes:

	Posición en la secuencia de 183	Posición en la secuencia de 185
	aa madura	aa madura (ver la Figura 1)
Primera repetición	150-152	150-152
Segunda repetición	157-159	159-161
Tercera repetición	164-167	166-169
Cuarta repetición	172-175	174-177

Una o más de las repeticiones de arginina está eliminada en la proteína de la invención. Por tanto, es posible eliminar una, dos, tres o las cuatro repeticiones y eliminar la primera repetición, la segunda repetición, la tercera repetición y/o la cuarta repetición. Puede eliminarse cualquier combinación de las cuatro repeticiones. La primera repetición es responsable principalmente de la unión a ARN y la segunda, la tercera y la cuarta repetición son responsable principalmente de la unión a ADN, y en una realización preferida se conserva la primera repetición y se eliminan desde la segunda a la cuarta repetición con el fin de reducir específicamente la unión a ADN.

Una secuencia que se extiende entre los residuos 145 y 182 de HBcAg está generalmente ausente en las proteínas de la invención y, preferiblemente, está ausente una secuencia que se extiende entre los residuos 150 y 177. La secuencia eliminada puede comprender toda la secuencia desde el residuo 145 al residuo 182 (o desde el residuo 150 al residuo 177) o puede comprender solamente una parte de la secuencia entre esos residuos. Igualmente, la secuencia eliminada puede extenderse a cada lado de esos residuos. Según se utilizan en la presente, expresiones tales como "está ausente una secuencia que se extiende entre los residuos x e y", significan que la secuencia que está ausente puede incluir los residuos x e y. La eliminación de la secuencia corriente arriba del residuo 145 puede interferir con la capacidad de la proteína para formar partículas y por tanto no se recomienda de manera general. En las formas de HBcAg de 185 aa la secuencia eliminada puede finalizar en el residuo 184, y en las formas de 183 aa puede finalizar en el residuo 182.

El residuo de cisteína C-terminal de la proteína de la invención es típicamente el residuo natural del extremo C de HBcAg y está precedido típicamente por la secuencia inmediatamente corriente arriba del residuo en HBcAg. La secuencia de HBcAg precedente puede comprender de 1 a 7 residuos, esto es 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 residuos. Por tanto, el extremo C de la proteína de la invención puede tener la secuencia Gln Cys, Ser Gln Cys, Glu Ser Gln Cys, Arg Glu Ser Gln Cys, Ser Arg Glu Ser Gln Cys, Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys o Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys. Sin embargo, el residuo de Cys puede no ser el procedente de HBcAg; en este caso, puede construirse una proteína de acuerdo con la invención truncando la secuencia de HBcAg y sustituyendo la secuencia truncada por otra secuencia que incluya un residuo de Cys y opcionalmente un epítopo de una proteína distinta de HBcAg. El residuo de Cys está situado típicamente en el extremo C-terminal de la proteína de la invención, pero puede estar a varios residuos de aminoácidos del extremo C. Por ejemplo, puede estar de 1 a 20, de 1 a 10 o de 1 a 5 residuos del extremo C. En cualquier caso, el residuo de Cys debe ser capaz de formar un enlace disulfuro.

La proteína de la invención comprende típicamente los elementos siguientes ligados en dirección N-terminal a C-terminal:

(i) una parte N-terminal de HBcAg que media la formación de partículas, por ejemplo los residuos 1 a 144 (ó 1 a 146 ó 1 a 154), y

(ii) una parte C-terminal de HBcAg que comprende la cisteína C-terminal;

en la cual al menos una parte de la secuencia de HBcAg entre dicha parte N-terminal y dicha parte C-terminal que contiene una o más de las repeticiones de arginina, está ausente.

Cuando la proteína contiene también un epítopo de una proteína distinta de HBcAg en lugar de la(s) repetición(es) de arginina ausente(s), la proteína contiene típicamente los elementos siguientes ligados en dirección N- a C-terminal:

(i) una parte N-terminal de HBcAg que media la formación de partículas, por ejemplo los residuos 1 a 144 (ó 1 a 146 ó 1 a 154),

(ii) un epítopo de una proteína distinta de HBcAg, y

(iii) una parte C-terminal de HBcAg que contiene la cisteína C-terminal;

en la que al menos una parte de la secuencia de HBcAg entre dicha parte N-terminal y dicha parte C-terminal que contiene una o más de las repeticiones de arginina, está ausente y está sustituida por dicho epítopo.

Cuando la proteína comprende un epítopo de una proteína distinta de HBcAg en el bucle e1, la proteína contiene típicamente los elementos siguientes ligados en dirección N- a C-terminal:

(i) una parte N-terminal de la secuencia de HBcAg que comprende por ejemplo los residuos 1 a 67 (ó 1 a 74 ó 1 a 79),

(ii) un epítopo de una proteína distinta de HBcAg,

(iii) una segunda parte de la secuencia de HBcAg que comprende por ejemplo los residuos 91 a 144 (ó 91 a 146, 91 a 154, 86 a 144, 86 a 146, 86 a 154, 80 a 144, 80 a 146 u 80 a 154), y

(iv) una tercera parte de la secuencia de HBcAg que comprende la cisteína C-terminal;

en la que al menos una parte de la secuencia de HBcAg entre el residuo 145 (ó 147 ó 155) y la cisteína C-terminal que contiene una o más de las repeticiones de arginina, está ausente.

Cuando la proteína de la invención comprende un primer epítopo de una proteína distinta de HBcAg en lugar de la(s) repetición(es) de arginina ausente(s) y un segundo epítopo de una proteína distinta de HBcAg en el bucle e1, la proteína contiene típicamente los elementos siguientes ligados en dirección N- a C-terminal:

(i) una parte N-terminal de la secuencia de HBcAg que comprende por ejemplo los residuos 1 a 67 (ó 1 a 74 ó 1 a 78),

(ii) un epítopo de una proteína distinta de HBcAg,

(iii) una segunda parte de la secuencia de HBcAg que comprende por ejemplo los residuos 91 a 144 (ó 91 a 146, 91 a 154, 86 a 144, 86 a 146, 86 a 154, 80 a 144, 80 a 146 u 80 a 154),

(iv) un epítopo adicional de una proteína distinta de HBcAg, y

(v) una tercera parte de la secuencia de HBcAg que comprende la cisteína C-terminal;

Como será obvio a partir de lo anterior, los inventores contemplan específicamente la modificación de la secuencia de HBcAg de varias formas, incluyendo la deleción de una o más de las repeticiones de arginina, la inserción de un epítopo heterólogo en lugar de la(s) repetición(es) eliminada(s) y la inserción de un segundo epítopo heterólogo en el bucle e1. Sin embargo, es posible una modificación adicional de la secuencia de HBcAg. Tal modificación adicional puede ser por medio de una sustitución, inserción, deleción o extensión. El tamaño de una inserción, deleción o extensión puede ser, por ejemplo, de a 1 a 200 aa, de 1 a 100 aa o de 1 a 50 aa, de 1 a 20 aa o de 1 a 6 aa en la secuencia de HBcAg. Las sustituciones pueden implicar varios aminoácidos hasta, por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 20 ó 50 aminoácidos de la longitud de la secuencia de HBcAg. La proteína modificada conserva generalmente la capacidad para formar partículas. Las sustituciones serán generalmente conservadoras y pueden ser realizadas, por ejemplo, según la Tabla siguiente, en la cual los aminoácidos en el mismo bloque de la segunda columna y preferiblemente en la misma línea de la tercera columna pueden ser sustituidos entre sí.

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Alifáticos	No polares	G A P
		I L V
	Polares no cargados	C S T M
		N Q
	Polares cargados	D E
		K R
Aromáticos	H F W Y

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Cada parte de la secuencia de HBcAg en la proteína de la invención tiene preferiblemente al menos un 70% de identidad de secuencias con la secuencia correspondiente de una proteína HBcAg natural, tal como la proteína que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 2. Más preferiblemente, la identidad es al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%. Los métodos para medir la identidad de secuencias de proteínas (y de secuencias de ácido nucleico) son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT (Devereux y col. (1984) Nucleic Acids Research 12, p. 387-395). De manera similar, pueden utilizarse los algoritmos PILEUP y BLAST para alinear secuencias (por ejemplo según está descrito en Altschul, S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300 y Altschul, S.F. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10).

La proteína de la invención puede autoensamblarse para formar partículas que pueden asemejarse estrechamente a las partículas formadas por la HBcAg nativa. Las partículas pueden tener de 20 a 40 nm de diámetro, pero son preferiblemente de 27 nm de diámetro aproximadamente (que es el tamaño de las partículas de la HBcAg nativa). Contienen cantidades no detectables o reducidas de ácido nucleico (ADN y ARN) en comparación con las partículas de la HBcAg nativa. Pueden contener de 160 a 260 monómeros de la proteína de la invención, pero preferiblemente contienen 180 monómeros aproximadamente o 240 monómeros aproximadamente (que es el número de monómeros en las partículas de la HBcAg nativa).

La determinación de la naturaleza particulada de una proteína de acuerdo con la invención puede ser llevada a cabo mediante cromatografía de exclusión de tamaños y/o microscopía electrónica. La determinación del contenido de ADN de las partículas puede realizarse mediante electroforesis en gel de agarosa o mediante espectrofotometría. Puede utilizarse un método adaptado de Birnbaum y Nasal (1990, J. Virology 64:3319-3330). La proteína puede ser digerida con Proteinasa K y el ácido nucleico extraído utilizando un kit comercial para la recuperación del ADN (por ejemplo, Qiagen, QIAquick™ PCR Purification Kit). El ADN purificado puede ser visualizado utilizando una tinción de ADN de alta sensibilidad (por ejemplo Novex, SYBER Green I™) en un gel de agarosa al 1,5%, después de la electroforesis. El producto de ADN obtenido después de la extracción puede ser cuantificado utilizando la proporción de densidad óptica (DO) a 260 nm:280 nm según Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning - A laboratory manual, segunda edición, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press), utilizando por ejemplo un Ultraspec 2000™ de Pharmacia Biotech.

Los epítopos

Como regla general, los epítopos insertados en la proteína de la invención no deben impedir el plegamiento de la HBcAg ni su autoensamblaje para formar partículas. Además, para una inmunogenicidad mejorada, los epítopos para células B deben estar dispuestos en la superficie de la partícula. Los epítopos para células T no necesitan estar dispuestos en la superficie de la partícula para una presentación óptima.

Existen tres regiones preferidas para la inserción de los epítopos, a saber el extremo C en lugar de la(s) repeti-
ción(es) de arginina eliminada(s), el bucle e1 y el extremo N. Estas tres regiones toleran todas bien la inserción de secuencias foráneas. Cuando un epítopo es colocado en el bucle e1 de HBcAg, puede ser insertado en la secuencia de los residuos de aminoácidos 68 a 90, 69 a 90, 71 a 90, 75 a 85 ó 78 a 83. Lo más preferido es insertar el epítopo entre los residuos 79 y 80 u 80 y 81. Los residuos de HBcAg procedentes del bucle e1 pueden ser eliminados en las proteínas de la invención, de tal manera que el epítopo insertado puede sustituir a toda o a parte de la secuencia del bucle.

Un epítopo heterólogo presente en una proteína de la invención puede ser un epítopo para células B o un epítopo para células T. En el caso de que un epítopo sea un epítopo para células T, puede ser un epítopo para células T cooperadoras (Th) (un epítopo para Th1 o Th2) o un epítopo para linfocitos citotóxicos (CTL).

La proteína de la invención puede contener más de un epítopo heterólogo, por ejemplo hasta 2, 3, 5 u 8 epítopos heterólogos, y en este caso cada epítopo puede estar presente en el mismo sitio o en sitios diferentes en la proteína HBcAg. En una realización preferida de la invención, uno de los epítopos es un epítopo para células T cooperadoras y otro es un epítopo para células B o para CTL. La presencia del epítopo para células T cooperadoras incrementa la respuesta inmune frente al epítopo para células B o para CTL. Cuando hay dos o más epítopos heterólogos en la proteína de la invención, pueden proceder del mismo organismo o de la misma proteína. En efecto, los epítopos pueden ser iguales; esto permite duplicar o multiplicar por más veces el número de epítopos presentados en las partículas.

El tamaño de la secuencia que contiene un epítopo insertada en la proteína de la invención puede variar entre límites amplios, pero será generalmente de 6 a 120 aa, por ejemplo de 6 a 80 aa o de 6 a 40 aa. El epítopo puede ser conformacional o lineal.

La elección del epítopo depende de la enfermedad contra la cual se desea vacunar. Típicamente, el epítopo procede un patógeno tal como un virus, una bacteria o un protozoo, pero puede ser también de un antígeno asociado con el cáncer o de un alergeno. Ejemplos de patógenos cuyos epítopos pueden ser insertados incluyen el virus de la hepatitis A (VHA), el VHB, el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la gripe, el virus de la glosopeda, poliovirus, el virus del herpes simple, el virus de la rabia, el virus de la leucemia felina, el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1), el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 2 (VIH-2), el virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS), el rinovirus humano, el virus del dengue, el virus de la fiebre amarilla, el virus del papiloma humano, Plasmodium falciparum (una causa de malaria) y bacterias tales como Mycobacteria, Bordetella, Salmonella, Escherichia, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia y Brucella.

Específicamente, la bacteria puede ser Mycobacterium tuberculosis - la causa de la tuberculosis; Bordetella pertussis o Bordetella parapertussis - causa la tosferina; Salmonella typhimurium - la causa de la salmonelosis en varias especies animales; Salmonella typhi - la causa de la fiebre tifoidea humana; Salmonella enteritidis - una causa de envenenamiento alimentario en humanos; Salmonella choleraesuis - una causa de salmonelosis en cerdos; Salmonella dublin - una causa de una enfermedad sistémica y de diarrea en el ganado, especialmente en las terneras recién nacidas; Escherichia coli - una causa de envenenamiento alimentario en humanos; Haemophilus influenzae - una causa de meningitis; Neisseria gonorrhoeae - una causa de gonorrea; Yersinia enterocolitica - la causa de un espectro de enfermedades en humanos que varían desde gastroenteritis hasta enfermedad septicémica fatal; Brucella abortus - una causa de abortos y de infertilidad en el ganado y una condición conocida como brucelosis en humanos o Clostridium difficile - una causa de colitis pseudomembranosa.

Ejemplos de antígenos cuyos epítopos pueden ser insertados son los antígenos pre-S1, pre-S2 y S del VHB; los antígenos de superficie del VHA; los antígenos de superficie, la proteína core y la proteína NS3 del VHC; los antígenos gp120, gp160, gag, pol, Nef, Tat y Ref del VIH; los antígenos de la malaria tales como las proteínas del circumesporozoito; los antígenos de la gripe HA, NP y NA; los antígenos de virus herpes gp340 del VEB, gp85 del VEB, gB del VHS, gD del VHS, gH del VHS y la proteína temprana del VHS; los antígenos E4, E6 y E7 del virus del papiloma humano; los antígenos del cáncer, antígeno carcinoembrionario (ACE), P53, ras y myc; el antígeno pertactina de Bordetella pertussis y el alergeno de los ácaros del polvo doméstico.

La invención es particularmente adecuada para una vacunación profiláctica o terapéutica contra el VHB, ya que la proteína transportadora HBcAg procede el VHB y son particularmente preferidos los epítopos de las regiones pre-S1, pre-S2 y S del VHB. Un inserto de pre-S1, pre-S2 o S tiene típicamente al menos 6 aminoácidos de longitud, por ejemplo de 6 a 120 aa, de 8 a 80 aa o de 10 a 40 aa. El inserto puede incluir, por ejemplo, los residuos en las posiciones de pre-S1 1-9, 10-19, 20-29, 30-39, 40-49, 50-59, 60-69, 70-79, 80-89, 90-99, 100-109 ó 110-119 o los residuos en las posiciones de pre-S2 120-129, 130-139, 140-149, 150-159, 160-169 ó 170-174. Los fragmentos particularmente preferidos son aquellos que corresponden a los residuos 20-47 de pre-S1 y a los residuos 139-174 de pre-S2. Los residuos 21-28 de pre-S1 corresponden a un epítopo para células T humanas. Son también preferidos los fragmentos correspondientes a los residuos 110-147 y 110-157 de S (contando el primer residuo de la secuencia de S como
residuo 1).

Producción de las proteínas de la invención

Las proteínas de la invención son producidas generalmente mediante la tecnología del ADN recombinante. La invención incluye una molécula de ácido nucleico (por ejemplo ADN o ARN) que codifica una proteína de la invención, tal como un vector de expresión.

La molécula de ácido nucleico puede codificar una proteína en la cual se ha eliminado una o más de las repeticiones de arginina y se ha sustituido por un sitio de un enzima de restricción exclusivo para la molécula de ácido nucleico, tal como un sitio de XbaI. La molécula de ácido nucleico puede contener también un único sitio de un enzima de restricción en la secuencia que codifica el bucle e1 y/o en el extremo N. Los sitios de enzimas de restricción únicos permiten que las secuencias que codifican los epítopos sean insertadas en la molécula de ácido nucleico, por ejemplo en lugar de la(s) repetición(es) de arginina eliminada(s) o en el bucle e1.

Una proteína de la invención puede ser producida cultivando una célula huésped que contenga una molécula de ácido nucleico que codifique la proteína bajo condiciones en las cuales se expresa la proteína, y recuperando la proteína. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias tales como E. coli, levaduras, líneas celulares de mamífero y otras líneas celulares eucarióticas, por ejemplo células de insecto Sf9.

Los vectores que constituyen las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden ser, por ejemplo, vectores plasmídicos o víricos. Pueden contener un origen de replicación, un promotor para la expresión de la secuencia que codifica la proteína, un regulador del promotor tal como un intensificador, una señal de parada de la transcripción, una señal de inicio de la traducción y/o una señal de parada de la traducción. Los vectores pueden contener también uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia a neomicina para un vector de mamífero. Los vectores pueden ser utilizados in vitro, por ejemplo para la producción de ARN, o pueden ser utilizados para transformar o transfectar una célula huésped.

Los promotores, intensificadores y otras señales de regulación de la expresión pueden ser seleccionados para que sean compatibles con la célula huésped para la que se ha designado el vector de expresión. Por ejemplo, pueden utilizarse promotores procarióticos, en particular aquéllos tales como el promotor de trc adecuado para ser utilizado en cepas de E. coli (tal como E. coli HB101). Puede utilizarse un promotor cuya actividad sea inducida en respuesta a un cambio en el entorno circundante, tal como condiciones anaerobias. Preferiblemente, puede utilizarse un promotor de htrA o nirB. Estos promotores pueden ser utilizados en particular para expresar la proteína en una bacteria atenuada, por ejemplo para utilización como una vacuna. Cuando la expresión de la proteína de la invención se lleva a cabo en células de mamífero in vitro, pueden utilizarse promotores de mamífero. Pueden utilizarse también promotores específicos de un tejido, por ejemplo promotores específicos de hepatocitos. Pueden utilizarse también promotores víricos, por ejemplo el promotor de la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (RTL VLMM), el promotor de la RTL del virus del sarcoma de Rous (VSR), el promotor de SV40, el promotor de IE de citomegalovirus (CMV) humano, promotores del virus del herpes simple y promotores de adenovirus. Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la técnica.

Una proteína de acuerdo con la invención puede ser purificada utilizando técnicas convencionales para la purificación de proteínas. La proteína puede ser proporcionada, por ejemplo, en forma purificada, pura o aislada. Para utilización en una vacuna, la proteína debe ser proporcionada generalmente con un nivel elevado de pureza, por ejemplo con un nivel en el que constituya más de un 80%, más de un 90%, más de un 95% o más de un 98% de la proteína en la preparación. Sin embargo, puede ser deseable mezclar la proteína con otras proteínas en la formulación final de la vacuna, por ejemplo con otras proteínas que comprendan la secuencia de pre-S1, pre-S2 o S del VHB. La proteína está preferiblemente sustancialmente libre de ácido nucleico (ADN o ARN).

Vacunas

La utilización principal de las proteínas de la invención es como vacunas terapéuticas o profilácticas. La invención incluye una composición de vacuna que comprende una proteína de la invención o una partícula de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

El principio que está detrás de la vacunación profiláctica es inducir una respuesta inmune en un huésped con el fin de generar una memoria inmunológica en el huésped. Esto significa que, cuando el huésped es expuesto al patógeno virulento, produce una respuesta inmune eficaz (protectora), esto es una respuesta inmune que inactiva y/o destruye el patógeno. La invención podría constituir la base de una vacuna profiláctica frente a un rango de enfermedades tales como VHB, VHA, VHC, gripe, glosopeda, polio, herpes, rabia, SIDA, fiebre del dengue, fiebre amarilla, malaria, tuberculosis, tosferina, salmonelosis, fiebre tifoidea, envenenamiento alimentario, diarrea, meningitis y gonorrea. Los epítopos de la proteína de la invención son elegidos con el fin de que sean apropiados para la enfermedad frente a la cual se desea que la vacuna proporcione protección.

El principio que está detrás de la vacunación terapéutica es estimular el sistema inmune del huésped para aliviar o erradicar una enfermedad o condición. Hay varias enfermedades y condiciones que pueden ser susceptibles a una vacunación terapéutica, tales como enfermedades víricas crónicas incluyendo VHB crónica y VHC crónica, cáncer y alergias tales como asma, atopia, eczema, rinitis y alergias alimentarias.

Las enfermedades víricas crónicas se producen cuando el sistema inmune de un huésped infectado no elimina el virus, permitiendo que el virus persista en el huésped durante un largo periodo de tiempo. La invención puede ser utilizada para inducir el sistema inmune del individuo infectado crónicamente con el fin de que elimine el virus. Por ejemplo, se cree que los pacientes con hepatitis crónica tienen una respuesta inadecuada de células T, y que la estimulación de una respuesta apropiada de células T puede eliminar el virus. Por tanto, con el fin de tratar la hepatitis vírica utilizando la invención, pueden insertarse en la proteína de la invención epítopos para células T, tales como epítopos para células T procedentes de las regiones pre-S1 y pre-S2 del VHB.

De manera similar, en el caso del cáncer, se cree que una intensificación de la respuesta de células T hacia los antígenos tumorales puede ayudar al sistema inmune a destruir el tumor. Se cree que las enfermedades alérgicas está causadas, al menos en parte, por una respuesta desequilibrada de células T en la cual una respuesta de Th2 inflamatorias domina sobre una respuesta de Th1 antagónicas, y que las alergias pueden ser tratadas por tanto incrementando la respuesta de Th1. Esto puede conseguirse, de acuerdo con la invención, mediante la utilización de una proteína que estimule una respuesta de Th1.

Puede administrarse a un paciente más de una proteína de acuerdo con la invención. Además, puede utilizarse una proteína de acuerdo con la invención en combinación con una o más de otras composiciones. Por ejemplo, en el tratamiento de la VHB crónica puede utilizarse una proteína de acuerdo con la invención en combinación con interferón gamma, Lamivudina™, u otro agente inmunoterapéutico tal como Hepacare™ (anteriormente conocido como Hepagene™). La proteína de acuerdo con la invención y la otra composición pueden ser administradas simultáneamente o secuencialmente.

Los vehículos y diluyentes adecuados para ser incluidos en las composiciones farmacéuticas de la invención son soluciones salinas isotónicas, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato. La composición incluirá normalmente un adyuvante tal como hidróxido de aluminio. La composición puede ser formulada para administración parenteral, intramuscular, intravenosa, intranasal, subcutánea o transdérmica. La composición comprende la proteína, partículas o ácido nucleico en una cantidad profilácticamente o terapéuticamente eficaz. Típicamente, la proteína o las partículas son administradas a una dosis de 0,01 a 30 \mug/kg de peso corporal, preferiblemente de 0,1 a 10 \mug/kg, más preferiblemente de 0,1 a 1 \mug/kg de peso corporal. El ácido nucleico de la invención puede ser administrado directamente como una construcción de ácido nucleico desnudo utilizando técnicas conocidas en el oficio, o mediante la utilización de vectores conocidos en la técnica. La cantidad de ácido nucleico administrada está típicamente en el rango de 1 \mug a 10 mg, preferiblemente de 100 \mug a 1 mg. La vacuna puede ser administrada en una programación de una sola dosis o en una programación de múltiples dosis. Las vías de administración y las dosis dadas anteriormente tienen la intención de ser únicamente una guía, y la vía y la dosis pueden ser finalmente según el criterio del médico.

Sección Experimental

Experimento 1

1. Materiales y Métodos

Se generaron nuevas construcciones plasmídicas mediante PCR inversa de tal manera que se eliminaron tres o cuatro regiones de repeticiones de arginina C-terminales y se introdujo un sitio de restricción de SpeI para permitir la inserción de secuencias de sustitución que codificaran epítopos para células B y T (Fig. 1).

Los moldes plasmídicos para la PCR inversa fueron ptrc/core y ptrc/core-S1 que codifican respectivamente la proteína core de la hepatitis B no híbrida y la proteína core de la hepatitis B híbrida que contenía los aminoácidos 20-47 de la secuencia de pre-S1 de la proteína de superficie del virus de la hepatitis B insertada entre los aminoácidos 79 y 80 del bucle e1 inmunodominante. Se utilizaron tres cebadores oligonucleotídicos (Tabla 1 y Fig. 2) para la reacción de PCR. Estos cebadores introducen un sitio de restricción único de SpeI en los fragmentos de la PCR. Los cebadores fueron también diseñados para generar nuevos fragmentos que estuvieran truncados en los residuos 146 ó 154 pero que mantuvieran 7 residuos del extremo C incluyendo la cisteína terminal en posición 185 que se cree que es importante para mantener la estabilidad de las partículas mediante la formación de enlaces disulfuro (Fig. 1).

1.1 Construcción de plásmidos truncados parentales

Utilizando los cebadores MGR371/370 o MGR369/370 (Tabla 1 y Figura 2), se generan fragmentos de PCR inversa a partir de los moldes plasmídicos de ptrc/core o ptrc/core-S1. Este procedimiento elimina 69 nucleótidos (que codifican 23 aminoácidos (aa155-177)) y 93 nucleótidos (que codifican 31 aminoácidos (aa146-177)), respectivamente. Los tamaños de los fragmentos de la PCR fueron confirmados mediante análisis en geles de agarosa y posteriormente fueron digeridos con la endonucleasa de restricción SpeI seguido por purificación en geles de agarosa y autoligadura para generar los plásmidos pTCR_{146}, pTCR_{154} y pTCSR_{146} y pTCSR_{154}. Los plásmidos pTCR derivan del molde ptrc/core y los plásmidos pTCSR derivan de los moldes ptrc/core-S1. La numeración 146 y 154 indica el número de los aminoácidos en el punto de truncamiento. Los cuatro plásmidos truncados parentales fueron utilizados para transformar células de E. coli HB101 y las colonias positivas fueron analizadas mediante PCR de diagnóstico utilizando los cebadores oligonucleotídicos MGR61/MGR168. La expresión de la proteína core fue confirmada mediante inmunotransferencia de lisados de células bacterianas utilizando un anticuerpo anti-core de ratón.

1.2 Subclonaje de las secuencias de sustitución en los plásmidos parentales truncados

Tres secuencias han sido subclonadas en el extremo 3' de los plásmidos parentales truncados descritos en la Sección 1.1. Estas incluyen las secuencias que codifican los aminoácidos 110-147 y 110-157 de la proteína de superficie pequeña de la hepatitis B, y los aa20-55 de la región S2 de la proteína de superficie mediana de la hepatitis B
(Figura 3).

Para la inserción de la secuencia 110-157 (más 2 aminoácidos resultantes del sitio de restricción de NheI), se utilizaron los cebadores oligonucleotídicos MGR245-247 (Tabla 1B) para generar un fragmento de PCR de 147 nucleótidos utilizando como molde pMBdSRE/17 (Figura 3). Este plásmido codifica la proteína de superficie pequeña de la hepatitis B (subtipo adw) para la expresión en células de mamífero utilizando el promotor de metalotionina de ratón.

Para la inserción de la secuencia 110-147 (más 2 aminoácidos del sitio de NheI), se utilizaron los cebadores oligonucleotídicos MGR247/264 (Tabla 1B) para generar un fragmento de PCR de 120 nucleótidos utilizando como molde pMBdSRE/17 (Figura 3).

Para la inserción de la secuencia 20-55 (más 2 residuos del sitio de NheI) de pre-S2, se utilizaron los cebadores oligonucleotídicos MGR243/249 (Tabla 1B) para generar un fragmento de PCR de 114 nucleótidos utilizando como molde pMByS2R/8 (Figura 3). Este plásmido codifica la proteína de superficie mediana de la hepatitis B (subtipo ayw) bajo el control del promotor de la metalotionina para la expresión en células de mamífero.

Los fragmentos de la PCR fueron digeridos con la endonucleasa de restricción NheI y purificados en geles de agarosa. Los fragmentos purificados fueron ligados posteriormente con los plásmidos parentales tratados con fosfatasa, digeridos con SpeI (Sección 1.1). Posteriormente, células de E. coli HB101 fueron transformadas con los plásmidos resultantes y las colonias positivas se analizaron mediante PCR de diagnóstico utilizando los cebadores oligonucleotídicos MGR61/168, inmunotransferencia con anticuerpos específicos para el inserto y secuenciación de ADN parcial de los insertos.

2. Resultados 2.1 Confirmación de la generación de fragmentos mediante PCR inversa

Los fragmentos de la PCR inversa para pTCR_{146}, pTCR_{154}, pTCSR_{146} y pTCSR_{154} fueron analizados mediante separación en geles de agarosa al 1% (Figura 4). Se encontró que los fragmentos de la PCR eran del tamaño apropiado (5,2 kb aproximadamente) y se confirmó que eran correctos mediante PCR de diagnóstico (no mostrado). El análisis de inmunotransferencia mostró que las construcciones parentales y las que contenían las secuencias insertadas expresaban la proteína core que era reactiva con un anticuerpo anti-core (Figura 5). Además, la confirmación de la expresión de la proteína por las secuencias insertadas se demostró mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpos anti-S (Figura 6) y anti-pre-S2 (Figura 7).

TABLA 1 Cebadores oligonucleotídicos utilizados para la PCR inversa y para la PCR de diagnóstico

Tabla 1A
Oligos	Secuencia 5'-3'	ptrc/core
MGR61	CTGCACTCAGGCAAGCCATT	230 pb-249 pb
MGR62	GCCGAGGCAGGTCCCCTAGA	530 pb-549 pb
MGR168	GAAAATCTTCTCGGATCCGC	del vector (pKK233.2)
MGR282	AGAGATCTCCATGGATTCAG	-10 pb-10 pb
MGR280	GTGGCTTTGGGGCCATGGACA	60 pb-79 pb
MGR369	AGGACTAGTGCCTCGGCCCCGTCGTCT	520 pb-546 pb
MGR370	AGAACTAGTCAATCTAGGGAATCTCAA	598 pb-624 pb
MGR371	TCTTCTAACACTAGTAGTTTCCGG	502 pb-525 pb
Las letras en negrita indican sitios de SpeI

Tabla 1B
Oligos	Secuencia 5'-3'	gen y localización
MGR245	CAGCTAGCGCAATTTCCATCCGTA	HBsAg 147aa
MGR247	GTTTGTGCTAGCATTCCAGGAACA	HBsAg 110aa
MGR264	CCATAGGTTGCTAGCGAAAGCCCA	HBsAg 157aa
MGR243	TTGCTAGCGTTCAGCGCAGGGTCC	pre-S2 20aa
MGR249	GTGAGAGCTAGCTATTTCCCTGCT	pre-S2 55aa

Experimento 2

Resumen

Se construyeron derivados del antígeno core de la hepatitis B (HBc) de longitud completa y truncados C-terminalmente, que llevaban inserciones largas de aminoácidos foráneos en la posición 144. Se utilizaron fragmentos de 50-100 aminoácidos de longitud de pre-S1, pre-S2 del VHB y de gag del VIH-1 como tales inserciones, y los genes recombinantes apropiados fueron expresados en células de E. coli. Los derivados de HBc y HBc\Delta quiméricos apropiados fueron purificados y examinados antigénicamente e inmunogénicamente. El análisis de la subclase de la respuesta inmune anti-HBc inducida en ratones mostró que la proporción de Ig de los anticuerpos IgG1, IgG2a e IgG2b fue restaurada desde el patrón IgG1>IgG2a\geqIgG2b, que es típico para los derivados de HBc\Delta truncados C-terminalmente, al patrón IgG2a\geqIgG2b\geqIgG1, que es típico de los derivados de HBc de longitud completa, después de la inmunización con derivados de HBc\Delta truncados C-terminalmente que llevaban adiciones largas C-terminales de 50-100 aminoácidos de longitud.

Materiales y Métodos Cepas Bacterianas

Se utilizaron las cepas de E. coli RR1 (F, hsdS20 (r^{-}_{b}, m^{-}_{b}), recA^{+}, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20 (Sm^{r}), xyl-5, mtl-1, supE44, \lambda^{-}) y K802 (hsdR, gal, met, supE, mcrA, mcrB) para la selección y expresión de genes quiméricos, respectivamente.

Animales

Se utilizaron ratones BALB/C (H-2^{d}) hembra de 7-10 semanas de edad aproximadamente, 20 g de peso. Para la obtención de anticuerpos policlonales se utilizaron conejos hembra blancos de la cepa New Zealand.

Construcción de los Derivados de HBc

Vectores basados en los plásmidos pHBc3 y pHBc16-15. El vector pHBc3 fue construido colocando el gen de HBc bajo el control de la repetición en támden de promotores trp de E. coli. El vector pHBc16-15 fue construido mediante la inserción de un adaptador oligonucleotídico que llevaba sitios de restricción de ClaI/EcoRV en la posición 144 del gen de HBc.

Construcción de derivados quiméricos de HBc. La estructura de los derivados de HBc y HBc\Delta está mostrada en la Tabla 2. Los genes recombinantes fueron construidos mediante la inserción de los fragmentos apropiados de pre-S1, pre-S2 del VHB y de gag del VIH-1 en el sitio de ClaI del vector pHBc16-15, con o sin la unión en marco a la parte C-terminal del gen de HBc.

Purificación de los Derivados Quiméricos de HBc

Células de E. coli fueron cultivadas durante una noche en un agitador rotatorio a 37ºC en matraces de 750 ml que contenían 300 ml de medio mínimo M9 suplementado con un 1% de casaminoácidos (Difco Laboratories, Sparks, EE.UU.) y un 0,2% de glucosa. Normalmente se alcanzaba una densidad óptica DO_{540} de 2-5. Generalmente, las células eran aglutinadas y lisadas mediante una incubación de 30 minutos sobre hielo en tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 5 mM, 50 \mug/ml de PMSF, 2 mg/ml de lisozima, y posteriormente ultrasonicadas 3 veces durante 15 segundos a 22 kHz. Los lisados fueron ajustados posteriormente a MgCl_{2} 10 mM y 20 \mug/ml de ADNasa. Después de una centrifugación a baja velocidad, las proteínas fueron precipitadas del sobrenadante con sulfato de amonio a una saturación del 33% durante 1-2 horas a 4ºC. Las pellas fueron resuspendidas en un tampón PBS estándar que contenía un 0,1% de Triton X-100™, y 5 ml de las soluciones fueron cargadas en una columna de Sepharose CL4B™ (2,5 x 85 cm) y eluidas con tampón PBS sin Triton X-100. La presencia de polipéptidos de HBc en las fracciones fue analizada mediante PAGE. Las fracciones positivas fueron agrupadas y concentradas mediante precipitación con sulfato de amonio a una saturación del 33% durante 20 horas a 4ºC. Las pellas fueron resuspendidas en PBS, o en tampón Tris-solución salina, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, a una concentración final de 5-20 mg/ml aproximadamente, dializadas durante una noche frente a 2000 volúmenes del mismo tampón y almacenadas a -70ºC o a -20ºC en glicerol 50%.

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida y Transferencia Western

Para el análisis mediante PAGE, las bacterias fueron aglutinadas, suspendidas en tampón de muestra para electroforesis en gel de SDS conteniendo un 2% de SDS y un 2% de 2-mercaptoetanol y lisadas mediante calentamiento a 100ºC durante 5 minutos. Las proteínas fueron separadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de Laemmli en un aparato para planchas de geles (150 x 150 x 0,75 mm) con un gradiente de un 12-18% de gel para correr y un 4% de gel de acumulación. La Transferencia Western se llevó a cabo en general según está descrito por Towbin y col. (1979) en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354. Las láminas de nitrocelulosa (0,2 \mu, Millipore, Bedford, EE.UU.) fueron incubadas con anticuerpos anti-HBc y con anticuerpo anti-pre-S1 en diluciones de 1:100 a 1:1000 durante una noche y posteriormente con un conjugado de peroxidasa con anti-IgG de ratón (1:1000) durante 1-2 horas a temperatura ambiente. La reacción fue revelada con 3,3'-diaminobencidina. En paralelo, los geles fueron teñidos con plata según Ohsawa y Ebata (1983) Anal. Biochem. 135:409-415.

Inmunizaciones

Se inmunizaron ratones (5 por grupo) el día 0 intraperitonealmente con 0,02 mg de partículas quiméricas en adyuvante completo de Freund (CFA, Difco) seguido por dos inmunizaciones de refuerzo en adyuvante incompleto de Freund (IFA, Difco) administradas los días 10 (0,01 mg intraperitonealmente) y 24 (0,01 mg intraperitonealmente y 0,01 mg subcutáneamente). Los sueros obtenidos el día 32 fueron analizados mediante ELISA para determinar la reactividad con partículas de HBc.

ELISA

Para el ELISA, placas de microvaloración de 96 pocillos fueron revestidas con partículas de HBc recombinante mediante secado al aire en una campana de extracción química durante una noche. Los pocillos fueron bloqueados con BSA al 0,5% en PBS durante 1 hora, incubados con diluciones seriadas de los diferentes anticuerpos durante 1 hora a 37ºC y procesados con los segundos anticuerpos apropiados conjugados a peroxidasa de rábano picante (Sigma) según los protocolos de los fabricantes. Las placas fueron lavadas 5 veces entre las incubaciones con Tween-20™ al 0,05% en PBS, y 5 veces con agua destilada para eliminar el Tween-20. Se midieron las absorbancias ópticas a 492 nm en un lector automático Immunoscan MS™. Los títulos fueron calculados como los logaritmos negativos de la dilución sérica de la CE50 (concentración eficaz, 50%) sobre la base de curvas dosis-respuesta sigmoideas. Se utilizó el programa de ordenador GraphPad Prism® versión 3.02 para los cálculos del título medio.

Resultados

Inmunogenicidad de las Proteínas Recombinantes. Para medir la inmunogenicidad de las secuencias de HBc transportadoras y de las secuencias de pre-S1, pre-S2 y gag insertadas, los sueros de ratones individuales fueron analizados repetidamente mediante ELISA directo utilizando HBcAg recombinante y péptidos sintéticos de pre-S1, pre-S2 y p24 del VIH-1 sobre un soporte sólido. La inmunización con partículas quiméricas inducía niveles elevados de anti-HBc y niveles relativamente bajos de anticuerpos anti-inserción (no mostrado).

Inducción de Diferentes Subclases de Inmunoglobulina por las Partículas Quiméricas HBc\Delta-pre-S1(20-47). Con el fin de hacer una media de los datos de inmunización obtenidos y con el fin de hacerlos más informativos para el análisis comparativo de las subclases de las inmunoglobulinas inducidas, calculamos los títulos medios para cada grupo de animales inmunizados como los logaritmos negativos de la dilución sérica de la CE50 (concentración eficaz, 50%) sobre la base de curvas dosis-respuesta sigmoideas (GraphPad Prism® versión 3.02). Estos datos sobre la respuesta anti-HBc de los animales inmunizados, que permite una comparación directa de los títulos medios, están presentados en la Fig. 8.

Los datos presentados en la Fig. 8 muestran que la HBcAg de tipo salvaje induce una respuesta anti-HBc con la distribución de las subclases de inmunoglobulina IgG2a\geqIgG2b>IgG1, mientras que la respuesta inmune a la estructura T31 de HBc\Delta truncada C-terminalmente presenta el patrón de distribución de subclases IgG1>IgG2b\geqIgG2a. El derivado 10-62 de HBc de longitud completa, que lleva una inserción larga de 50 aa de pre-S1, muestra una distribución de subclases análoga a la del vector HBc de longitud completa. Además, la sustitución del extremo C de la molécula de HBc por una inserción foránea larga (50 aminoácidos de la secuencia de pre-S1) en el derivado de HBc 10-140, hace que la distribución de subclases de los anticuerpos HBc sea bastante similar a la inducida por la estructura de HBc de longitud completa (Fig. 8). El derivado 48-2 de HBc\Delta con una inserción larga de 100 aa de gag del VIH-1, ocupa una posición intermedia en este sentido entre la HBcAg de tipo salvaje y las estructuras T31 de HBc\Delta truncadas C-terminalmente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2 Estructura de los derivados de HBc con inserciones C-terminales. Los aminoácidos que aparecen en las uniones de la secuencia de HBc y las secuencias de inserción están mostrados en minúscula

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1

<110> MEDEVA EUROPE LTD

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<120> MODIFICACIÓN DEL ANTÍGENO CORE DE LA HEPATITIS B

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<130> P78451A

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 639

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<212> ADN

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<213> Virus de la hepatitis B

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(639)

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<400> 1

2

3

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<210> 2

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la hepatitis B

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<400> 2

4

5

Claims

1. Una composición para vacuna que comprende una proteína que contiene el antígeno core de la hepatitis B (HBcAg) en el que una o más de las cuatro repeticiones de arginina está ausente y está presente un residuo de cisteína C-terminal, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que un primer epítopo de una proteína distinta de HBcAg está presente en lugar de la(s) repetición(es) de arginina ausente(s).

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que está presente la primera repetición de arginina y están ausentes de la segunda a la cuarta repetición de arginina.

4. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que está ausente una secuencia que se extiende entre los residuos 145 y 182 de HBcAg.

5. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que está ausente una secuencia que se extiende entre los residuos 150 y 177 de HBcAg.

6. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un segundo epítopo de una proteína distinta de HBcAg, estando el segundo epítopo en el bucle e1.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el segundo epítopo es un epítopo para células B.

8. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en la que el primer epítopo es un epítopo para células T.

9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el primer epítopo es un epítopo para células T cooperadoras y el segundo epítopo es un epítopo para células B.

10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende dicho primer y dicho segundo epítopo, en la que los epítopos son iguales.

11. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en la que el primer y/o el segundo epítopo procede del virus de la hepatitis B (VHB).

12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el primer y/o el segundo epítopo procede de la región pre-S1, pre-S2 o S del VHB.

13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los elementos siguientes ligados en dirección N-terminal a C-terminal:

(i): una parte N-terminal de HBcAg que media la formación de partículas, y

(ii): una parte C-terminal de HBcAg que comprende la cisteína C-terminal;

en la que al menos una parte de la secuencia de HBcAg entre dicha parte N-terminal y dicha parte C-terminal que contiene una o más de las repeticiones de arginina, está ausente.

14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los elementos siguientes ligados en dirección N- a C-terminal:

(i): una parte N-terminal de HBcAg que media la formación de partículas,

(ii): un epítopo procedente de una proteína distinta de HBcAg, y

(iii): una parte C-terminal de HBcAg que comprende la cisteína C-terminal;

en la que al menos una parte de la secuencia de HBcAg entre dicha parte N-terminal y dicha parte C-terminal que contiene una o más de las repeticiones de arginina, está ausente y ha sido sustituida por dicho epítopo.

15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los elementos siguientes ligados en dirección N- a C-terminal:

(i): una parte N-terminal de la secuencia de HBcAg que comprende los residuos 1 a 67,

(ii): un epítopo procedente de una proteína distinta de HBcAg,

(iii): una segunda parte de la secuencia de HBcAg que comprende los residuos 91 a 144, y

(iv): una tercera parte de la secuencia de HBcAg que comprende la cisteína C-terminal;

en la que al menos una parte de la secuencia de HBcAg entre el residuo 145 y la cisteína C-terminal que contiene una o más de las repeticiones de arginina, está ausente.

16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los elementos siguientes ligados en dirección N- a C-terminal:

(ii): un epítopo procedente de una proteína distinta de HBcAg,

(iii): una segunda parte de la secuencia de HBcAg que comprende los residuos 91 a 144,

(iv): un epítopo adicional procedente de una proteína distinta de HBcAg, y

(v): una tercera parte de la secuencia de HBcAg que comprende la cisteína C-terminal;

17. Una composición para vacuna que comprende una partícula que contiene múltiples copias de una proteína como la definida en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

18. Una proteína como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o una partícula como la definida en la reivindicación 17, para utilización en un método de vacunación profiláctica o terapéutica del organismo humano o animal.

19. Una proteína o una partícula de acuerdo con la reivindicación 18 para utilización en un método de vacunación profiláctica o terapéutica del organismo humano o animal contra el VHB.

20. Utilización de una proteína como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o de una partícula como la definida en la reivindicación 17, para la fabricación de un medicamento para vacunación profiláctica o terapéutica del organismo humano o animal contra el VHB.