ES2258628T3

ES2258628T3 - Vacunas vectoras a base de leporipox.

Info

Publication number: ES2258628T3
Application number: ES02732485T
Authority: ES
Inventors: Norman Spibey
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 2001-03-08
Filing date: 2002-03-07
Publication date: 2006-09-01
Anticipated expiration: 2022-03-07
Also published as: NZ527940A; PT1370668E; WO2002072852A2; MXPA03007862A; US6942864B2; CN1258596C; EP1370668B1; NO20033912D0; ZA200306607B; ATE318321T1; CA2439872C; NO20033912L; CN1527883A; NO331305B1; JP4037273B2; DK1370668T3; DE60209345D1; CA2439872A1; DE60209345T2; BR0207761A

Abstract

Uso de un virus leporipox vivo recombinante que contiene ADN exógeno, que está operablemente unido a al menos un elemento de control de la expresión y que se incorpora a una región no esencial del genoma del virus, en la fabricación de una vacuna vectora para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades infecciosas en especies no lepóridas.

Description

Vacunas vectoras a base de leporipox.

La presente invención se relaciona con el uso de una vacuna vectora de virus leporipox en especies hospedadoras no susceptibles y con virus leporipox vivos recombinantes.

Se han descrito vacunas vectoras basadas en virus ortopox y avipox y su potencial como vectores víricos recombinantes en vacunación. La Patente EE.UU. 5759841 describe un virus vaccinia recombinante que contiene ADN de morbilivirus codificante de al menos una glicoproteína y un promotor para la expresión del ADN en una región no esencial del genoma del virus de la vaccinia. El virus de la vaccinia recombinante puede ser usado en vacunas para inducir una respuesta inmune a morbilivirus en perros. El virus vector de la vaccinia recombinante, sin embargo, es permisivo en un gran número de diferentes especies, incluidos los humanos, por lo que el virus vector de la vaccinia descrito tiene el riesgo potencial de causar una infección desbocada en el huésped vacunado o de transmisión de huéspedes vacunados a no vacunados.

WO 9527780 describe un virus avipox recombinante, que, en virtud de su restringido espectro de hospedadores, tiene virulencia atenuada en un huésped no aviar. Los virus avipox recombinantes contienen ADN exógeno en una región no esencial del genoma vírico, mediante lo cual el ADN exógeno codifica para al menos un antígeno del virus del Moquillo Canino ("CDV") o del antígeno M o N del virus del sarampión ("MV"). Estos virus pueden ser usados para inducir una respuesta antigénica o inmunológica en cánidos y otros carnívoros, así como en humanos. Los virus vectores avipox recombinantes se restringen a su hospedador natural y la vacunación de especies no aviares con dichos virus vectores da lugar a la expresión del antígeno exógeno sin replicación productiva del virus. Sin embargo, el nivel de expresión del antígeno exógeno sigue siendo baja después de la vacunación con el vector vírico avipox. Por ello, se necesitan mejores niveles de expresión del antígeno exógeno. Más aún, la inmunización con vector vírico avipox no siempre proporciona suficientes anticuerpos neutralizantes contra el antígeno exógeno. La vacunación de gatos con una vacuna vectora FeLV basada en la viruela de canarios no dio lugar a la producción de anticuerpos neutralizantes anti-FeLV (J. Tartaglia y col., 1993, J. Virol. 67, pp. 2370-2375). Los gatitos recién nacidos son especialmente susceptibles a la infección por FeLV. Como no tienen un sistema inmune maduro en las primeras semanas después del nacimiento, los gatitos recién nacidos tienen que confiar en los anticuerpos maternos para la protección contra la infección por FeLV. Si la vacunación no proporcionó a la madre anticuerpos neutralizantes, los gatitos no estarán protegidos frente al FeLV y sucumbirán a la infección.

Sorprendentemente, se ha visto que un virus leporipox vivo recombinante que contiene un ADN exógeno codificante de al menos un antígeno podría ser usado para inducir una respuesta antigénica o inmunogénica en un hospedador que normalmente no es susceptible a la infección productiva de virus leporipox, es decir, que el virus leporipox no es capaz de replicarse en dicho hospedador tras la replicación. La infección productiva de virus leporipox se restringe sólo a especies de lepóridos. En consecuencia, la infección de especies no lepóridas con un virus leporipox no dará lugar a replicación del virus leporipox. Fue, por lo tanto, sorprendente descubrir que un virus leporipox vivo recombinante era capaz de infectar a un hospedador no susceptible y de expresar dicho antígeno en ausencia de replicación productiva del virus recombinante en dicho hospedador, como evidencia el hecho de que la eliminación del vector vírico a cualquier otro animal de contacto no se produjera. Más sorprendentemente, la infección de un hospedador no lepórido con dicho vector vírico leporipox dio lugar a elevados niveles de expresión del antígeno codificado por el ADN exógeno incluso aunque no se observara replicación productiva del virus en dicho hospedador. El crecimiento del vector vírico in vitro sí se produce en algunas líneas celulares de mamíferos. Más aún, debido a la ausencia de replicación productiva del vector vírico leporipox en dicho hospedador no susceptible, el virus leporipox será no patógeno en la especie no lepórida, lo que hace que estos vectores víricos sean incluso más adecuados para vacunación.

La vacunación con un virus del mixoma recombinante que contiene ADN exógeno ha sido descrita en FR-A-2736358. Se usó el virus del mixoma recombinante para vacunar conejos contra la mixomatosis y enfermedades infecciosas causadas por otros patógenos de conejos. En ningún lado sugiere FR-A-2736358 el uso de un virus del mixoma vivo recombinante como vector vírico para inducir una respuesta antigénica o inmunogénica en especies no susceptibles, más en particular en especies no lepóridas.

De aquí que la presente invención se relacione con el uso de un virus leporipox vivo recombinante que contiene ADN exógeno, que se une operablemente a al menos un elemento del control de la expresión y que se incorpora a una región no esencial del genoma del virus, en la fabricación de una vacuna vectora para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades infecciosas en especies no lepóridas. Preferiblemente, se usa un virus del mixoma vivo recombinante que contiene ADN exógeno, que está operablemente unido a al menos un elemento del control de la expresión y que se incorpora a una región no esencial del genoma vírico, en la fabricación de una vacuna vectora para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades infecciosas en especies no lepóridas. Más específicamente, la invención se relaciona con el uso de dicho virus leporipox vivo recombinante en la fabricación de una vacuna vectora para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades infecciosas en especies aviares, felinas, caninas, porcinas, ovinas, bovinas, equinas y humana. Preferiblemente, el virus leporipox vivo recombinante según la invención es usado para fabricar una vacuna vectora para el tratamiento de enfermedades infecciosas en especies caninas y felinas.

La invención proporciona además un virus leporipox vivo recombinante que contiene ADN exógeno operablemente unido a al menos un elemento de control de la expresión, cuyo ADN exógeno codifica para al menos un antígeno de un patógeno que produce una enfermedad infecciosa en no lepóridos. Más específicamente, el ADN exógeno codifica preferiblemente para al menos un antígeno de un patógeno que causa una enfermedad infecciosa en especies humana, bovinas, aviares, felinas, caninas, porcinas, equinas u ovinas. Preferiblemente, el ADN exógeno codifica para un antígeno de un patógeno felino o canino. Según la invención, el patógeno puede ser de origen vírico, bacteriano o parasitario, dependiendo de la enfermedad contra la cual se ha de vacunar al sujeto. Si el patógeno tiene un genoma de ARN, el antígeno de interés puede ser codificado por ADNc correspondiente al gen. El ADN exógeno puede codificar para dos o más antígenos, que pueden derivar del mismo patógeno o de diferentes patógenos.

El ADN exógeno adecuado para uso en un virus leporipox recombinante codifica preferiblemente para glicoproteínas víricas, proteínas de la envuelta vírica, proteínas de la matriz vírica, proteínas de la membrana externa bacteriana, enterotoxinas bacterianas, fimbrias bacterianas o proteínas parasitarias. El ADN exógeno codifica más específicamente para la proteína de la envuelta (Stewart y col. (1986), J. Virol. 58, pp. 825-834) o la proteína de la matriz (Donahue y col., 1988, J. Virol. 62, pp. 722-731) del virus de la Leucemia Felina (FeLV), para la proteína de la membrana externa mayor de clamidias de gatos u ovejas (Nº de Acceso GenBank CPFPNMOMP y CHTMOMPX, respectivamente), para la proteína VP2 del virus de la panleucopenia felina (FPV) (Carlson, J. y col., 1985, J. Virol. 55, pp. 574-582), para la proteína de la cápside del calicivirus felino (M.J. Carter y col., 1992, J. Arch. Virol. 122, pp. 223-235), para las proteínas Gag, Pol, Rev, Tat o Vif del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) (R.I. Talbot y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, pp. 5743-5747; T.R. Philips y col., 1990, J. Virol. 64, pp. 4605-4613; K.M. Lockridge y col., 1999, J. Virol. 261, pp. 25-30), para la proteína de la membrana, de la nucleocápside o de la espícula del virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) (R.J. de Groot y col., 1987, J. Gen. Virol. 68, pp. 2639-2646; H. Vennema y col., 1991, Virology 181, pp. 327-335), para la proteína Env, HA, de fusión o de la nucleocápside del virus del moquillo canino (M. Sidhu y col., 1993, Virology 193, pp. 66-72; U. Gassen y col., 2000, J. Virol. 74, pp. 10737-10744), para la proteína VP2 del parvovirus canino (Reed P. y col., 1988, J. Virol. 62, pp. 266-276), para la glicoproteína G del virus de la rabia (T.J. Wiktor y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, pp. 7194-7198) y para la proteína de la espícula del coronavirus canino (B. Horsburgh y col., 2000, J. Gen. Virol. 73, pp. 2849-2862). Además de genes codificantes de proteínas inmunogénicas de patógenos no lepóridos, el ADN exógeno puede también incluir genes codificantes de citokinas, tales como, por ejemplo, INF\gamma (Nº Acc. GenBank D30619), IL-1\beta (Nº Acc. GenBank M92060), IL-2/15 (Nª Acc. GenBank AF054601, IL-4, IL-5 (Nª Acc. GenBank AF025436), IL-6, IL-12 (Nº Acc. GenBank U83184 y U83185), IL-16 (Nº Acc. GenBank AF003701) o IL-18 (Nº Acc. GenBank ABO46211), o citokinas quimiotácticas, tales como las \alpha-quimiokinas IL-8 (Nº Acc. GenBank XM003501), GRO\alpha, GRO\beta, NAP-2, PF-4, IP10, CTAP-III, \beta-TG y las \beta-quimioquinas MCP-1 (Nº Acc. GenBank NM002982), MIP-1\alpha, MIP-1\beta, RANTES (Nº Acc. GenBank XM012656), MCP-2 (Nº Acc. GenBank AJ251190), MCP-3 (Nº Acc. GenBank NM 006273) y MCP-4 (Nº Acc. GenBank AJ251191). Preferiblemente, los genes codificantes de citokinas adecuadas según la invención derivan de la misma especie a la que se ha de administrar la vacuna.

El ADN exógeno está operablemente unido a al menos un elemento de control de la expresión, que controlará y regulará la expresión de dicho ADN exógeno. En una realización preferida, cada gen presente en el ADN exógeno está controlado por un elemento de control de la expresión separado y distinto. Los elementos de control de la expresión son conocidos en la técnica e incluyen promotores. Son promotores adecuados para la expresión de ADN exógeno según la invención promotores víricos o sintéticos, que son capaces de modular la expresión en el citoplasma. Los promotores útiles en la presente invención son promotores de poxvirus, preferiblemente un promotor de vaccinia (véase DE-A-19627193; Mackett y col., "DNA Cloning Volume III", ed. D.M. Glover, 1985, IRL Press Ltd.). Los promotores preferidos según la invención son promotores sintéticos, más preferiblemente promotores sintéticos precoces o precoces/tardíos. Se describen promotores precoces/tardíos del virus de la vaccinia sintéticos en Chakrabati y col., BioTechniques 23, Vol. 6, pp. 1094-1097, 1997. Los promotores pueden ser sintetizados usando técnicas estándar en este campo, tal como se describe, por ejemplo, en Chakrabati y col., 1997, antes citado.

Como virus leporipox adecuados que pueden ser usados según la invención, se incluyen, aunque sin limitación, virus del mixoma o virus del Fibroma de Shope. Como cepas de virus del mixoma adecuadas, se incluyen la cepa Lausanne (de ATCC), SG33 (Mainil, M.D. y col., 2000, J. Comp. Pathol. 122, pp. 115-122), Borghi y Boerlage (Fenner & Fantini, "Biological Control of Vertebrate Pests", CABI Publishing 1999, ISBN 0 85199 323 0 y sus referencias). Como cepas adecuadas del Virus del Fibroma de Shope, se incluyen la cepa Original A (Nº Cat. ATCC VR-112) y la cepa Kasza (Nº Cat. ATCC VR-364). Preferiblemente, el virus leporipox vivo recombinante según la invención deriva de un virus del mixoma. Debido a su restricción de hospedador a las especies de lepóridos, el virus leporipox no es virulento en un hospedador no lepórido. Se prefiere, sin embargo, usar un virus leporipox atenuado para generar los virus vivos recombinantes de la invención. Para los fines de la invención, un virus leporipox atenuado se define como un virus leporipox capaz de replicación productiva en su hospedador lepórido diana sin producir enfermedad. La atenuación de las cepas de virus Leporipox puede ser llevada a cabo por pases seriados de la cepa o por deleción de uno o más genes virulentos que no son esenciales para la replicación vírica. Se presentan la secuencia completa de ADN del genoma del virus leporipox, su organización genómica y la localización de todos los marcos abiertos de lectura ("ORF") en Cameron y col., Virology 264, pp. 298-318 (1999). Se presentan la secuencia completa de ADN del genoma del virus del Fibroma de Shope, su organización genómica y la localización de todos los marcos abiertos de lectura (ORF) en Willer y col., Virology 264, pp. 319-343 (1999).

El ADN exógeno según la invención es preferiblemente insertado en una región génica no esencial del genoma vírico del leporipox. Más preferiblemente, el ADN es insertado en una región génica no esencial que está implicada en la virulencia del virus leporipox. Son regiones génicas no esenciales adecuadas del genoma del virus del mixoma o del genoma del virus del Fibroma de Shope el gen TK codificante de la timidina kinasa, el ORF M11L, los ORF SERP-1, -2 y -3 y el ORF MGF (Cameron y col., 1999, antes citado; Willer y col., 1999, antes citado). En una realización preferida de la invención, se suprimen uno o más de los genes víricos no esenciales, seguido de inserción del ADN exógeno y del promotor. La deleción de al menos parte del ORF MGF es especialmente preferida, ya que este ORF codifica para un factor de virulencia y no es esencial para el crecimiento in vitro o in vivo (Graham y col., Virology 191, pp. 112-124, 1992). La deleción del ORF MGF da lugar a una menor virulencia del virus leporipox.

El virus leporipox vivo recombinante según la presente invención puede ser producido usando la técnica de recombinación in vivo que conlleva la inserción por recombinación específica de sitio de ADN exógeno en el genoma del virus leporipox. Se puede hacer esto usando un método similar a los métodos descritos para la producción de virus de la vaccinia recombinantes y de virus de la viruela aviar recombinantes (véase USP 4.603.112, USP 5.093.258; Guo, P.X., J. Virol. 63: 4189-4198 (1990); Mackett y col., "Construction and Characterization of Vaccinia Virus Recombinants Expressing Exogenous Genes", en "DNA Cloning Volume III", ed. D.M. Glover, 1985, IRL Press Ltd.). En general, el virus leporipox vivo recombinante según la presente invención puede ser producido usando recombinación específica de sitio entre un genoma de leporipox parental y un vector de ADN portador del ADN exógeno bajo el control de al menos un elemento de control de la expresión. Los vectores de ADN adecuados para uso en recombinación específica de sitio pueden derivar de cualquier plásmido que contenga un sitio de clonación múltiple. El vector de ADN contiene el ADN exógeno unido a al menos un elemento de control de la expresión y localizado entre secuencias de ADN vírico homólogas a una región del genoma de leporipox en la que se ha de incorporar el ADN exógeno. Las secuencias de ADN vírico flanqueantes del ADN exógeno son preferiblemente seleccionadas entre una región que no es esencial para la replicación del virus leporipox. El ADN vector para la recombinación con el genoma de leporipox puede contener adicionalmente un gen que codifique para un marcador de selección bajo el control de un promotor de poxvirus. El gen adicional y el promotor se localizan también entre las secuencias de ADN vírico derivadas del genoma de leporipox. El vector de ADN es transfectado en células huésped infectadas con un virus leporipox parental. Son células huésped adecuadas células eucarióticas que sean permisivas para el virus leporipox y que sean transfectables por el ADN vector. Son ejemplos de células huésped las células de riñón de conejo LLC-RK1 y RK13, las células de pulmón de conejo R9ab, las células de piel de conejo SF 1 Ep, DRS y RAB-9, las células de córnea de conejo SIRC, las células de carcinoma de conejo Oc4T/cc, las células de piel/carcinoma de conejo CTPS y las células VERO, todas ellas disponibles en ATCC.

Son virus leporipox parentales adecuados para generar los virus leporipox vivos recombinantes de la presente invención cepas del virus del mixoma tales como la cepa Lausanne (de ATCC), SG33 (Mainil, M.D. y col., 2000, J. Comp. Pathol. 122, pp. 115-122), Borghi y Boerlage (Fenner & Fantini, "Biological Control of Vertebrate Pests", CABI Publishing 1999, ISBN 0 85199 323 0 y sus referencias) y cepas del Virus del Fibroma de Shope, incluyendo la cepa Original A (Nº Cat. ATCC VR-112) y la cepa Kasza (Nº Cat. ATCC VR-364). Preferiblemente, se usan cepas del virus del mixoma para producir el virus de lepóridos vivo recombinante según la invención. Preferiblemente, el virus leporipox parental es un virus atenuado, es decir, un virus leporipox que es capaz de replicarse productivamente en su hospedador lepórido diana sin causar enfermedad. La atenuación de cepas de virus leporipox puede ser llevada a cabo por pases seriados de la cepa o por deleción de uno o más genes virulentos que no son esenciales para la replicación vírica (para la secuencia genómica completa y la localización de genes, véase Cameron y col., 1999, antes citado, y Willer y col., 1999, antes citado).

Se deja que el virus se replique en la célula huésped, durante lo cual se produce la recombinación entre las secuencias de ADN del leporipox sobre el vector de ADN y el ADN correspondiente sobre el genoma del leporipox parental. La recombinación da lugar a la inserción del ADN exógeno unido al/a los elemento(s) de control de la expresión en el genoma del leporipox. Los virus leporipox recombinantes son seleccionados y purificados usando métodos de selección y rastreo estándar bien conocidos en la técnica, incluyendo la detección del ADN exógeno integrado por hibridación con sondas homólogas al ADN exógeno, detección de la expresión del marcador de selección cointegrado con el ADN exógeno y detección de la ausencia del producto de expresión del gen leporipox suprimido al que se ha incorporado el ADN exógeno. La inserción del ADN exógeno en el genoma vírico de leporipox recombinante puede ser confirmada por análisis de reacción en cadena de polimerasa.

El vector vírico leporipox recombinante según la invención es especialmente adecuado para uso como agente inmunizante en no lepóridos, ya que se puede alcanzar niveles de expresión del antígeno in vivo que son suficientes para la inmunización del hospedador. Debido a su restringido espectro de hospedadores, el virus es atenuado en un hospedador no lepórido, por lo que no hay riesgo de enfermedad causada por el virus leporipox. La restricción de hospedadores evitará además que los virus leporipox según la invención se propaguen entre hospedadores, que no son objeto de la vacunación. Así, en otra realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, más preferiblemente una vacuna que consiste en un soporte farmacéutico aceptable y un virus leporipox vivo recombinante que contiene ADN exógeno operablemente unido a al menos un elemento de control de la expresión e incorporado a una región no esencial del genoma del virus, cuyo ADN exógeno codifica para al menos un antígeno de un patógeno que produce una enfermedad infecciosa en no lepóridos. La vacuna según la invención consiste preferiblemente en un soporte farmacéutico aceptable y un virus del mixoma vivo recombinante según la presente invención que expresa al menos una proteína inmunogénica de un patógeno no lepórido. Un virus leporipox recombinante según la invención que expresa dos o más proteínas inmunogénicas es específicamente adecuado para la fabricación de una vacuna multivalente.

Se pueden preparar composiciones vacunales según la invención siguiendo procedimientos estándar. El virus leporipox recombinante puede ser cultivado en un cultivo celular para el que el virus es permisivo, tal como células de riñón de conejo LLC-RK1 y RK13, células de pulmón de conejo R9ab, células de piel de conejo SF 1 Ep, DRS y RAB-9, células de córnea de conejo SIRC, células de carcinoma de conejo Oc4T/cc, células de piel/carcinoma de conejo CTPS y células Vero, todas disponibles de ATCC. Los virus así cultivados pueden ser recogidos recogiendo los fluidos y/o las células del cultivo de células de tejidos. Eventualmente, durante la recogida, el rendimiento de los virus puede ser promovido por técnicas que mejoran la liberación de las partículas infecciosas del substrato de cultivo, v.g., sonicación y congelación-descongelación. La vacuna viva puede ser preparada en forma de suspensión o puede ser liofilizada.

Son soportes farmacéuticos aceptables que son adecuados para uso en una vacuna según la invención agua estéril, suero salino, tampones acuosos tales como PBS y similares. Además, la vacuna según la invención puede contener otros aditivos, tales como adyuvantes, estabilizadores, antioxidantes y otros.

Son estabilizadores adecuados, por ejemplo, carbohidratos, incluyendo sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano y glucosa; proteínas y productos de degradación de las mismas, incluyendo, aunque sin limitación, albúmina y caseína; agentes que contienen proteínas, tales como suero bovino o leche desnatada, y tampones, incluyendo, aunque sin limitación, fosfatos de metales alcalinos. En composiciones vacunales liofilizadas, es preferible añadir uno o más estabilizadores.

Como adyuvantes adecuados, se incluyen, aunque sin limitación, hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, anfígeno, tocofenoles, monofosfenil lípido A, dipéptido de muramilo, emulsiones oleosas, glucanos, carbómeros, copolímeros de bloques, citokinas y saponinas, tales como Quil A. La cantidad de adyuvante añadido depende de la naturaleza del propio adyuvante. Las citokinas tales como el INF\gamma, la IL-12 y la IL-18 son muy adecuadas para uso en una vacuna según la invención.

Preferiblemente, los virus leporipox recombinantes según la invención son administrados en especies no lepóridas por vías de administración parenterales, incluyendo, aunque sin limitación, las vías intramuscular, intradérmica o subcutánea. Alternativamente, la vacuna puede ser administrada por vías de administración no parenterales, tales como administración oral, por pulverización, intraocular, intranasal o in ovo.

En general, el virus leporipox recombinante según la invención es administrado en una cantidad efectiva para inducir niveles de expresión adecuados de la proteína exógena. La dosis dependerá generalmente de la vía de administración, del tiempo de administración, así como de la edad, de la salud y de la dieta del animal que se ha de vacunar. El virus leporipox recombinante puede ser administrado en una cantidad de entre 10^{2} y 10^{11} pfu/dosis por sujeto, preferiblemente de entre 10^{4} y 10^{9} pfu/dosis y más preferiblemente de 10^{6} a 10^{7} pfu/dosis por sujeto (pfu es "unidades formadoras de placa").

Las vacunas según la invención pueden ser también administradas simultánea o concomitantemente con otras vacunas vivas o inactivadas. Estas vacunas adicionales pueden ser administradas no parenteral o parenteralmente. Preferiblemente, las vacunas adicionales son recomendadas para administración parenteral.

Los siguientes experimentos son ilustrativos de la invención y no limitan la invención a las realizaciones particulares descritas.

Leyenda de las figuras

Figura 1: representación esquemática de la construcción de plásmidos intermediarios pV_{L} y PV_{EL}. RHD representa ADNc de virus hemorrágico de conejo. ab(5') y cd(3') representan las regiones flanqueantes de MGF del virus del mixoma. Promotor representa promotor tardío o precoz/tardío sintético, respectivamente. "mcs" representa la secuencia nucleotídica que tiene múltiples sitios de clonación para la introducción de ADN exógeno.

Figura 2: los diversos plásmidos de ADN recombinante basados en pV_{L} y pV_{EL} construidos. P representa la región del promotor tardío (pV_{L}) o precoz/tardío (pV_{EL}) sintético; ab(5') y cd(3') representan las regiones flanqueantes de MGF del virus del mixoma. RHDV Vp60 representa el gen codificante de la proteína RHDV VP60. FeLV gp85 representa el gen env del virus de la Leucemia Felina. FCV Vp60 representa el gen codificante de la proteína de la cápside del calicivirus felino. FPL Vp2 representa el gen vp2 del virus de la panleucopenia felina. CPV VP2 representa el gen vp2 del parvovirus canino. GFP representa el gen codificante de la proteína fluorescente verde. Todos los plásmidos contienen Amp_{r} como marcador de selección (no mostrado).

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de plásmidos de ADN intermediarios pV_{L} y pV_{EL}

El plásmido de partida para el procedimiento era el plásmido comercializado pCITE 2-b (Novagen Inc.), que contiene un ADNc de virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (Meyers G. y col., 1991, Virology 184, pp. 664-676) insertado en los sitios SalI y HincII del vector. Se hace referencia al plásmido como pCITE/RHD.

La primera etapa era la introducción de las secuencias flanqueantes de MGF. Se usaron cebadores de PCR myx a y myx b para amplificar la secuencia flanqueante 5'.

myx a:	5' TTCTCGGAAGTCATAGACGGTATT 3'	(sec. id. Nº 1)
mix b:	5' CATGCCAATGGCACATAAGAGAGTTGCGACTAGGTC 3'	(sec. id. Nº 2)

Se usó una muestra de 2 \mul de MR24 cultivado en cultivo de tejidos (10^{6} pfu ml^{-1}) como plantilla para la reacción de PCR, que fue llevada a cabo usando Perlas PCR (Pharmacia) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se clonó el fragmento de la PCR usando métodos estándar de laboratorio como un fragmento NcoI/romo en pCITE/RHD. Se preparó primeramente el pCITE/RHD por digestión con KpnI, "haciéndolo romo" a continuación con ADN polimerasa T4 y luego digestión con NcoI. Se llamó al plásmido resultante pCITE/RHDab.

Se llevó a cabo una segunda reacción de PCR sobre una preparación idéntica de plantilla usando los cebadores

myx c:	5' CGGCTCGAGCTAATTACCATTAAGTAACCCGTTTTACA 3'	(sec. id. Nº 3)
	\hskip1,4cm XhoI
myx d:	5' GCTCTAGATATATCGTGTACGTAGTTCCCAAAAC 3'	(sec. id. Nº 4)
	\hskip1,1cm XbaI

para preparar la secuencia flanqueante 3'. Se clonó el fragmento de la PCR como un fragmento XhoI/XbaI en pCITE/RHDab cortado con XhoI/XbaI. Se llamó al plásmido resultante pCITE/RHDabdc.

Se produjeron entonces promotores de poxvirus sintéticos por hibridación de los siguientes oligonucleótidos:

Vp3:	5' CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGATCTTAAATGCC 3'	(sec. id. Nº 5)
Vp4:	5' CATGGGCATTTAAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTA 3'	(sec. id. Nº 6)

Estos dos oligonucleótidos complementarios se hibridan entre sí para dar extremos cohesivos compatibles con sitios de restricción KpnI y NcoI. Igualmente, los siguientes dos oligonucleótidos se hibridan también entre sí para dar un fragmento compatible con KpnI/NcoI.

Vp5:	5' CAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAC 3'	(sec. id. Nº 7)
Vp6:	5' CATGGTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTGGTAC 3'	(sec. id. Nº 8)

Vp5 y Vp6 constituyen juntos un promotor precoz/tardío, mientras que Vp3 y Vp4 producen un promotor tardío (Chakrabarti y col., Biotecniques 23, pp. 1094-1097, 1997). Se clonó entonces uno u otro de los pares de oligonucleótidos hibridados en pCITE/RHDabcd cortado con KpnI/NcoI para producir pVP/RHD (promotor tardío) o pEL/RHD (promotor precoz/tardío). Como el gen de la cápside RHD no está en marco con la primera metionina en ninguna de las dos construcciones (pVP/RHD y pEL/RHD), fue necesario volver a clonar el gen de la cápside RHD (Vp60) y eliminar la secuencia intermedia para obtener expresión. Se cortaron los plásmidos pVP/RHD y pEL/RHD con NcoI y EcoRI para eliminar la secuencia codificante Vp60 y la secuencia no codificante 5' al ATG de iniciación. Se substituyó entonces el gen Vp60 por un fragmento generado por PCR producido usando los siguientes oligonucleótidos:

	5' GCTCCATGGAGGGCAAAGCCCGTG 3'	(sec. id. Nº 9)
	\hskip1,3cm NcoI
	5' TTGCTCAGGACACCGGCACCTGC 3'	(sec. id. Nº 10)

La plantilla para la reacción PCR era pCITE/RHD. El fragmento generado por PCR fue digerido con NcoI y EcoRI y clonado en los pVP/RHD y pEL/RHD preparados. Los plásmidos resultantes fueron denominados pVP/Vp60 y pEL/Vp60. Para permitir la introducción de genes flanqueados por otros sitios de restricción, se introdujo un sitio de clonación múltiple secuencia abajo del sitio NcoI único en pVP/Vp60 y pEL/Vp60. Los siguientes oligonucleótidos:

mcs A:	5' CATGGATCGATGTCGACGGATCCACTAGTGAATTCACGCGTC 3'	(sec. id. Nº 11)
mcs B:	5' TCGAGACGCGTGAATTCACTAGTGGATCCGTCGACATCGATC 3'	(sec. id. Nº 12)

se hibridan para dar extremos sobresalientes compatibles con sitios de endonucleasas de restricción NcoI y XhoI. La substitución del fragmento NcoI/XhoI, que lleva toda la secuencia asociada RHD, con los oligonucleótidos hibridados da lugar a los dos plásmidos siguientes: pV_{L} y pV_{EL} (véase la figura 1).

Se usaron los plásmidos pV_{L} y pV_{EL} para construir diversos plásmidos de ADN recombinante que contenían los siguientes genes, proteína de la cápside de la enfermedad hemorrágica del conejo VP60 (Meyers y col., 1991, antes citado), proteína fluorescente verde (Clonetech Laboratories Inc., Palo Alto, California, EE.UU.), glicoproteína de la envuelta de la leucemia felina gp85 (Stewart y col., 1986, J. Virol. 58, pp. 825-834), proteínas de la matriz de la leucemia felina (gag) (Donahue y col., 1988, J. Virol. 62, pp. 722-731), proteína de la cápside del calicivirus felino (Nº de Acceso GenBank Z11536 y NC 001481), proteína de la cápside del virus de la penleucopenia felina VP2 (Carlson J. y col., 1985, J. Virol. 55, pp. 574-582) y proteína de la cápside del parvovirus canino VP2 (Reep P. y col., 1988, J. Virol. 62, pp. 266-276). La Tabla 1 muestra los diversos plásmidos de ADN que fueron construidos para producir los virus del mixoma recombinantes según la invención. Se construyó cada plásmido recombinante del mismo modo, en el sentido de que el gen diana fue cortado de un plásmido existente o amplificado por PCR de tal forma que los sitios de enzimas de restricción en los extremos del gen fueran compatibles con sitios en los mcs de pV_{L} o pV_{EL}.

Preparación del plásmido de ADN pV_{L}GFP

Se compró un plásmido que contenía gen GFP a Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, EE.UU., y se digirió con NcoI y EcoRI para cortar el gen GFP del plásmido. Se insertó el gen en pVL, dando lugar a pV_{L}GFP.

Preparación del plásmido de ADN pV_{EL}FeLV_{env}

Se amplificó el gen de la envuelta por PCR a partir de pFGA5 (Stewart y col., 1986, antes citado) usando los oligonucleótidos:

	5' CAC ATC GAT TGA TGG AAA GTC CAA CGC 3'	(sec. id. Nº 13)
	\hskip1,5cm ClaI
	5' TGG AAT TCA TGG TCG GTC CGG ATC GTA 3'	(sec. id. Nº 14)
	\hskip1,1cm EcoRI

Se digirió el fragmento de PCR con ClaI y EcoRI y se insertó en pV_{EL}, dando lugar a pV_{EL}FeLV_{env}.

Preparación del plásmido de ADN pV_{EL}FPL

Se obtuvo el gen de la cápside FPL por amplificación por PCR a partir del ADN de la forma replicativa ("rf") por PCR usando los siguientes cebadores:

	5' CACATCGATTGATGAGTGATGGAGCAG 3'	(sec. id. Nº 15)
	5' CGGGAATTCTAGGTGCTAGTTGATATG 3'	(sec. id. Nº 16)

Se preparó el ADN rf a partir de células de riñón felino (CRFK) infectadas con una cepa vacunal de FPL por métodos estándar (Reed, P. y col., 1988, J. Virol. 62, pp. 266-276).

Preparación del plásmido de ADN pV_{EL}FCV

Se infectaron células de riñón felino (CRFK) con la cepa de FCV F9 a una multiplicidad de 0,1 pfu por célula. Después de treinta y seis horas, se recogieron las células y se preparó el ARN total usando isotiocianato de guanidina (reactivo TRIzol, Gibco BRL). Se llevó a cabo la síntesis de ADNc de la primera hebra usando cebadores oligodt (SuperScript Choice, Gibco BRL). La secuencia nucleotídica completa y la organización de la cepa F9 de FCV han sido descritas (Número de Acceso GenBank M86379). Se sintetizaron oligonucleótidos para cebar la síntesis de ADN de la segunda hebra y para amplificar a continuación por PCR el gen de la cápside. Se usaron los siguientes oligonucleótidos para producir el gen de la proteína de la cápside Vp60 de FCV (cepa F9):

	5' GGATCGATGCGCGGATGACGGGTCAATC 3'	(sec. id. Nº 17)
	\hskip1,1cm ClaI
	5' GGGGACTAGTATTCATAACTTAGTCATGGG 3'	(sec. id. Nº 18)
	\hskip1,7cm SpeI

Se insertó el gen de la cápside Vp60 en el mcs de pV_{L} y pV_{EL}, dando lugar a pV_{L}FCV y pV_{EL}FCV, respectivamente.

Preparación del plásmido de ADN pV_{EL}CPV

Se amplificó por PCR el gen codificante de la proteína de la cápside VP2 a partir de la cepa vacunal de CPV de Nobivac Parvo®, se digirió con NcoI y EcoRI y se insertó en pV_{EL}.

Ejemplo 2 Preparación de virus del mixoma recombinante

Se seleccionó una cepa no patogénica del virus del mixoma (denominada MR24), que había sido atenuada por pases prolongados en células de riñón de conejo (RK13). Se vio que este virus del mixoma atenuado (MR24) era no patogénico (0% de mortalidad) en conejos cuando se administraba a conejos por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular. MR24 es una cepa vacunal de la mixomatosis candidata para uso en conejos. Todas las titulaciones y amplificaciones víricas fueron realizadas en células de riñón de conejo (RK-13).

Se produjeron virus del mixoma recombinantes siguiendo los métodos descritos para construir virus de la vaccinia recombinantes (Mackett y col., 1985, antes citado). Para hacerlo, se infectaron células de riñón de conejo (RK13) con virus del mixoma MR24 a una multiplicidad de 0,1 pfu por célula. Después de dos horas, las células fueron entonces transfectadas con ADN plasmídico usando el reactivo de transfección lipofectamina (Gibco BRL). La selección de virus recombinantes se basaba en dilución limitante e identificación por inmunofluorescencia.

Setenta y dos horas después de la transfección, se congelaron-descongelaron los cultivos celulares infectados/trans-
fectados tres veces para liberar el virus. Esta mezcla primaria de virus de tipo salvaje y recombinante fue diluida 50 veces con medio de cultivo de tejidos y se usaron luego 10 microlitros de la mezcla de virus para infectar cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos previamente sembrada con células RK13. Se incubó entonces la placa de 96 pocillos durante 72 horas para permitir que procedieran la infección y la propagación del virus. Después de este tiempo, se trató la placa con tres ciclos de congelación y descongelación manteniendo el estado individual de cada pocillo de la placa. Ésta se convirtió en la placa maestra de la primera tanda. A continuación, se plaquearon 5 microlitros del medio que contenía virus de cada pocillo sobre una placa de 96 pocillos por duplicado sembrada con células RK13. Después de 48 horas, se fijó la placa duplicada con metanol helado y se rastreó la placa en cuanto a la expresión de la proteína recombinante por inmunofluorescencia.

Por ejemplo, las células infectadas y transfectadas con pV_{EL}FeLV_{env} fueron rastreadas en cuanto a la producción de proteína de la envuelta del FeLV como sigue; se diluyó fluido ascítico de anticuerpo monoclonal 3-17 de ratón (European Veterinary Laboratory, Woerden, Países Bajos) 1.000 veces y se añadió luego a cada pocillo de la placa de 96 pocillos fijada. Se incubó la placa a 37ºC durante una hora. Se lavó a continuación la placa 5 veces con PBS y se incubó después con IgG anti-ratón de conejo marcada con FITC (Sigma Chemical Co.) y se continuó entonces la incubación durante otra hora. Finalmente, se lavó la placa 5 veces con PBS y se examinó bajo un microscopio de fluorescencia. Se identificaron y anotaron los pocillos que contenían focos fluorescentes de infección. Se diluyeron entonces los pocillos correspondientes de la placa maestra de la primera tanda sobre más placas de 96 pocillos sembradas con RK-13, que a su vez se convirtieron en las placas maestras de la segunda tanda. Se continuó con el proceso de enriquecimiento gradual hasta que los virus recombinantes constituyeron un 20-50% del virus total. Se rastreó la expresión de la proteína recombinante de los otros virus del mixoma recombinantes de un modo similar.

TABLA 1 Plásmidos de ADN y los correspondientes virus del mixoma recombinantes

Plásmido	Virus recombinante	Número de cepa
pV_{L}/GFP	Myxo/GFP	No asignado
pV_{L}/VP60	Myxo/RHD	No asignado
pV_{EL}/FeLV_{env}	Myxo/FeLV_{env}	MS0011
pV_{EL}/FCV	Myxo/FCV	MS0013
pV_{L}/FCV	Myxo/FCV	MS0014
pV_{EL}/FPL	Myxo/FPL	MS0015
pV_{EL}/CPV	Myxo/CPV	MS0016

Se consiguió la purificación final de los recombinantes tomando focos individuales de infección de los cultivos recubiertos de agar.

Ejemplo 3 Myxo/RHD en pollos

Para determinar si las especies no lepóridas infectadas con los virus del mixoma recombinantes provocarían una respuesta de anticuerpos, se inmunizaron pollos con myxo/RHD por vía subcutánea o intramuscular. Las aves recibieron 10^{5} pfu de virus el día 0 y el día 14 del protocolo de inmunización. Se tomaron muestras de sangre los días 0, 14 y 28 y se analizaron en cuanto a anticuerpos para RHDV; en la tabla 2 se muestran los resultados. Todas las aves permanecieron clínicamente normales a lo largo del experimento.

TABLA 2 Resultados de la inoculación de pollos con myxo/RHD. Los niveles de anticuerpos son expresados como la recíproca de la dilución de suero que inhibe la aglutinación de las células rojas de la sangre del conejo en 4 unidades de antígeno RHDV purificado

Vía de	Número	Título de inhibición de la hemaglutinación
inoculación	de animal
		Día 0	Día 14	Día 28
	166	0	80	40
	168	0	40	20
	170	0	640-1.280	640-1.280
Intramuscular	172	0	40	40
	174	0	320	320
	176	0	40	160
	178	0	320	640
	180	0	40	40
	182	0	320	320
	184	0	40	20
	186	0	10	10
Subcutánea	189	0	320-640	320
	191	0	40	40
	193	0	20	20
	195	0	640	640
	197	0	320	320
	290	0	0	0
	292	0	0	0
Controles	294	0	0	0
	296	0	0	0
	298	0	0	0

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Ejemplo 4 Myxo FCV en gatos

Se montó un experimento para establecer la eficacia de un virus recombinante del mixoma/cápside del calicivirus felino (myxo/FCV) para inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes y proteger a los gatos de la inoculación con calicivirus felino virulento. Se inmunizó a un grupo de 4 gatos (Grupo 1) subcutáneamente con 5 x 10^{6} unidades formadoras de foco ("ffu") de myxo/FCV. Se repitió la inmunización a las 3 semanas de la primera inmunización. Se albergaron cuatro animales control no vacunados (Grupo 2) con los animales de ensayo. Cuatro semanas después de la segunda inmunización, todos los gatos fueron inoculados intranasalmente con 10^{5,3} DICT_{50} de una cepa virulenta de calicivirus felino. Se introdujo el virus de la inoculación gota a gota, a 0,5 ml en cada orificio nasal.

TABLA 3 Protocolo de los procedimientos

Puntos temporales	Grupos de animales	Procedimiento
Día -1	1 y 2	Torunda O/F, nasal.
		Sangría
Día 0	1	Vacunación
Día 21	1	Sangría y 2ª vacunación
Día 49	1 y 2	Sangría e inoculación
Días 50-62	1 y 2	Monitorización clínica
		Torunda O/F, nasal
Día 63	1 y 2	Monitorización clínica
		Sangría Torunda O/F, nasal

Se tomaron muestras con torunda al inicio del experimento para asegurarse de que ninguno de los animales tenía presencia de calicivirus felino en la orofaringe. Se tomaron muestras de sangre de forma similar para asegurarse de que ninguno de los animales tenía anticuerpos anti-FCV antes del comienzo del experimento. Se tomaron muestras con torunda después de la inoculación para examinar la excreción de virus.

Se usaron muestras de sangre tomadas durante el experimento en los ensayos de neutralización del virus. Estos ensayos determinan los niveles de anticuerpos circulantes en el gato. Es bien sabido que los anticuerpos neutralizantes séricos están presentes en animales convalecientes y que los anticuerpos neutralizantes preexistentes obtenidos como resultado de la vacunación ayudan a dotar de protección frente a la enfermedad (Hohdatsu y col., 1999, J. Vet. Med. Sci. 61, 299-301).

TABLA 4 Resultados de la inoculación (título de neutralización del suero) de gatos con myxo/FCV (MS0013). Las cifras muestran la dilución máxima de suero a la que se obtiene la neutralización del virus. Las muestras de sangre tomadas antes de la vacunación (presangría) no muestran anticuerpos para FCV. El suero diluido 1-4 veces mostrará una inhibición inespecífica del crecimiento vírico in vitro

Suero	Presangría	POST-1ª	POST-2ª	Post-	Puntuación
		VAC	VAC	inoculación	clínica*
Nº gato	Grupo
358-054		<1:4	1:102	1:2.580	10.321	1
376-561	Vacunados	<1:4	1:50	1:1.024	>16.384	13
383-882	(Grupo 1)	<1:4	1:215	1:3.444	13.777	0
073-609		<1:4	1:161	1:1.569	16.384	4

295-099		<1:4	<1:4	<1:5	1.337	49
375-369	Controles	<1:4	<1:4	<1:4	4.096	18
078-001	(Grupo 2)	<1:4	<1:4	<1:4	2.435	47
268-054		<1:4	<1:4	<1:4	697	22
* \begin{minipage}[t]{158mm} El esquema de puntuación clínica utilizado es el establecido en la Farmacopea Europea para la producción de una vacuna de Calicivirus Felino (Tercera Edición, Junio de 1996, ISBN 92-871-2991-6); éste establece que la vacuna cumple con la prueba si la puntuación clínica es significativamente inferior a la de los controles. En este estudio, el grupo vacunado tiene una puntuación clínica media de 4,5, en comparación con 34 para los controles. \end{minipage}

Comparando los resultados obtenidos tras la vacunación con myxo-FCV (Tabla 4) con los de las vacunas convencionales (Tabla 5), está claro que, después de la primera vacunación, los animales del Grupo 1 tienen una respuesta de anticuerpos comparable a los animales a los que se dan dos dosis de muchas vacunas comerciales, lo que indica que estos gatos estarían protegidos de la enfermedad. Después de la segunda vacunación, los títulos de anticuerpos están muy por encima de los obtenidos por las preparaciones de vacunas comerciales (Hohdatsu y col., 1999, J. Vet. Med. Sci. 61, 299-301; DeSilver y col., 1997, Proc. 1^{st} Int. Symp. Calicivirus ESVV 131-143).

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TABLA 5 Títulos de anticuerpos neutralizantes de sueros inmunes de vacunas FCV comerciales contra cepas de FCV*

	Suero inmune
Aislado	Vacuna A	Vacuna B	Vacuna C	Vacuna D
de FCV
	#20^{a)}	#C3	#C1	#C4	#C2	#C5	#C6	#A7
F4	20^{b)}	80	10	5	5	5	160	20
F9	160	160	640	40	10	10	160	320
255	10	20	20	5	<5	<5	640	>640
91-1	<5	<5	<5	<5	<5	<5	5	<5
a) Número del suero
b) Título de neutralización
* Tomado de Hohdatsu y col. (1998)

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Los vectores de virus herpes felinos que expresan antígenos FCV inducen también títulos muy bajos de anticuerpos séricos neutralizantes (en la región 2,5 y 3,0) antes de la inoculación, como describen Yokoyama y col. (1998).

Referencias

Hohdatsu T, Sato K, Takma T y Koyama H. Neutralizing feature of a commercially available feline calicivirus (FCV) vaccine immune sera against FCV field isolates. J. Vet. Med. Sci. 1999, 61: 299-301.

Yokoyama N, Fujita K, Damiani y col. Further development of a recombinant feline herpesvirus type 1 vector expressing feline calicivirus immunogenic antigen. J. of Vet. Med. Sci. 1998, 60: 717-723.

Reed LJ y Meunch H. A simple method of estimating fifty per cent end points. Am. J. of Hygiene 1938, 27: 493-497.

Ejemplo 5 Experimentos de neutralización con Myxo/FCV en cerdos y bóvidos

Se estudió la aplicabilidad del virus del mixoma como vector de expresión eucariótica para la inducción de una respuesta inmune protectora en hospedadores no naturales, es decir, bóvidos y cerdos, por la vía de inyección intradérmica e intramuscular.

Se usó un vector de virus del mixoma que contenía el fragmento del gen del calicivirus felino codificante de la forma madura del antígeno de la cápside tanto en terneros como en cerdos. Se incluyeron en este estudio dos grupos consistentes en cuatro terneros de 12 semanas de edad y cuatro cerdos de 6 semanas de edad.

Se recogieron muestras de sangre (10 ml/animal) una semana antes del comienzo del estudio para estudiar si los animales eran seronegativos para el calicivirus felino. A continuación, los animales fueron inyectados intradérmica e intramuscularmente con 1 ml de PBS que contenía 1 x 10^{8} FFU del virus del mixoma recombinante/vía de inyección/animal. Los animales fueron albergados como un grupo por especie. Después de cuatro semanas, se recogieron muestras de sangre (10 ml/animal) y se volvió a inyectar a los animales intradérmica e intramuscularmente con la misma dosis de virus del mixoma, es decir, 1 ml de 1 x 10^{8} FFU del virus del mixoma recombinante/vía de inyección/animal. A las dos semanas de la primera inyección, se recogieron muestras de sangre (10 ml/animal) y se destruyeron los animales según las directrices para las pruebas GMO in vivo. Se estudiaron las muestras de sangre recogidas en cuanto a la presencia de anticuerpos dirigidos contra el Calicivirus por medio de un ensayo de neutralización de virus in vitro.

TABLA 6 Diseño experimental y marco temporal: los grupos consisten en cuatro cerdos o cuatro terneros

Fecha	Actividad
T = -7 días	Se recogieron muestras pre-suero
T = 0 días	\begin{minipage}[t]{100mm} Inyección intradérmica e intramuscular con 1 ml de PBS que contenía 1 x 10^{8} FFU de virus de mixoma por vía de inyección y por animal \end{minipage}
T = 28 días p.i.	Se recogieron muestras de sangre (10 ml)
T = 28 días p.i.	\begin{minipage}[t]{100mm} Inyección intradérmica e intramuscular con 1 ml de PBS que contenía 1 x 10^{8} FFU de virus de mixoma por vía de inyección y por animal \end{minipage}
T = 42 días p.i.	Se recogieron muestras de sangre
T = 42 días p.i.	Finalización del experimento

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Método para el ensayo de neutralización sérica del FCV

Se valoró la neutralización del suero por el e.c.p. sobre células CrFK. Se mezclaron réplicas de cinco veces de doscientas DICT_{50} de virus con diluciones seriadas (comenzando en 1:4) de sueros en un volumen final de 600 microlitros. Se incubaron entonces las mezclas de virus/suero durante 60 minutos a 37ºC en tubos de dilución de 5 ml estériles. Se añadieron después 100 microlitros de las mezclas de ensayo a placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos sembradas con células CrFK en 100 microlitros de medio de crecimiento. Se continuó incubando durante 5 días. Se calcularon los valores de la DICT_{50} según el método de Reed & Meunch [1].

Reed, L.J. y H. Meunch, 1938. A simple method of estimating fifty percent end points. Am. J. Hyg., 27: 493-497.

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TABLA 7 Resultados de Sns contra FCV en sueros del estudio FMD004

Animal	Presangría	Post-1ª Vac.	Post-2ª Vac.
Bóvido 2403	\leq1:4	1:54	\geq1:724
Bóvido 1948	\leq1:4	1:64	\geq1:1024
Bóvido 1603	\leq1:4	1:13	1:256
Bóvido 1190	\leq1:4	1:54	\geq1:861
Cerdo 122	\leq1:4	\leq1:4	1:304
Cerdo 119	\leq1:4	\leq1:4	1:304
Cerdo 118	\leq1:4	1:10	1:256
Cerdo 117	\leq1:4	\leq1:4	\geq1:861

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Ejemplo 6 Crecimiento de cepas del virus del mixoma en diversos tipos celulares in vitro

Se infectaron células con virus del mixoma recombinantes que expresaban proteína de fluorescencia verde construidos a partir de 2 cepas diferentes de virus del mixoma. Se valoró el crecimiento por un aumento en el número de células fluorescentes a lo largo del tiempo.

Se observó fluorescencia cuando se plaqueó el virus recombinante myxo/GFP sobre diversos tipos celulares en cultivo, tal como se muestra en la tabla 8. Esto indicó que el virus era capaz de entrar y de expresar el gen GFP en células que no eran de conejo. La Tabla 8 muestra que se observaba crecimiento del virus in vitro en algunos tipos celulares y que el patrón difería para las dos construcciones estudiadas.

TABLA 8 Crecimiento de vectores de mixoma en diversos tipos celulares in vitro

Tipo celular	Crecimiento
	MS20-10	MR24
Riñón de conejo (RK-13)	+++++	+++++
Riñón de mono Africano (Vero)	+++++	+++++
Pulmón embrionario bovino (BEL)	+	+
Fibroblastos embrionarios felinos (FeF)	+	-
Fibroblastos embrionarios de pollo (CEF)	+	-
Línea celular tumoral canina A72	-	-

Ejemplo 8 ELISA para respuestas a la vacunación del parvovirus canino

Con objeto de valorar las respuestas inmunes provocadas por la vacunación de perros con un virus del mixoma recombinante que expresaba la proteína de la cápside del parvovirus canino Vp2, se montó un ELISA. Se compararon las respuestas a la vacunación con las encontradas en perros convencionalmente vacunados.

Materiales y métodos Materiales

: TBS (solución salina tamponada con Tris 50 mM)

: Solución salina tamponada con Tris 50 mM, pH 7,5

: 6,35 g de Tris-HCl

: 1,18 g de Base Tris

: 8,77 g de NaCl

: 800 ml de dH_{2}O

: pH ajustado a 7,5 y volumen llevado a 1 L con dH_{2}O

: TBS-Tween

Se preparó TBS como antes y se añadieron luego 0,5 ml de TWEEN 20. Se mezcló bien.

Métodos

1. Se resuspendió anticuerpo monoclonal anti-CPV en tampón Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 9,6, a una concentración de 5-10 microgramos/ml. Se incubó una placa de ELISA durante la noche a 40ºC con 100 microlitros por pocillo de la suspensión de anticuerpo.

2. Después de agitar el exceso de solución de revestimiento de antígeno, se bloqueó el resto de los sitios de unión de cada pocillo incubando con 200 microlitros de BSA al 1% y leche en polvo seca al 2% en TBS a temperatura ambiente durante una hora.

3. Después de agitar la solución de bloqueo, se substituyó con 100 microlitros de sobrenadante de cultivo de tejidos que contenía parvovirus canino a un título de aproximadamente 10^{7} p.f.u. ml^{-1}. Se llevó a cabo la incubación a temperatura ambiente durante 1-2 horas.

4. Se lavaron las placas cuatro veces con TBS-Tween.

5. Se prepararon diluciones seriadas del suero de estudio en TBS. Se añadieron 100 microlitros de éstas a los pocillos de la placa ELISA y se continuó incubando durante 1-2 horas a temperatura ambiente.

6. Se lavó a continuación la placa cuatro veces en TBS-Tween.

7. Se añadió un segundo anticuerpo anti-perro conjugado con fosfatasa alcalina (v.g., ICN Biomedical Research Products, Nº de Cat. 675071) a una dilución indicada por el fabricante. Se incubó a temperatura ambiente durante 1-2 horas.

8. Se lavó la placa cuatro veces en TBS-Tween.

9. Se reveló el ELISA por adición de substrato PNPP (fosfato de p-nitrofenilo, v.g., SIGMA Chemical Company, número de catálogo N2770).

10. Se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro a 420 nm.

En la Tabla 9 se presentan los resultados.

TABLA 9 Resultados de ELISA para las respuestas a CPV

Vacuna	Absorbancia a la dilución indicada
	1º0	20	40	80	160	320	640	1.280
Myxo-Vp2	>2,0	>2,0	1,8	1,56	1,198	0,685	0,45	0,297
Convencional	0,73	0,46	0,29	0,30	0,28	0,30	0,26	0,29
Ninguna	0,31	0,28	0,30	0,26	0,28	0,25	0,27	0,26

Los resultados del ELISA demuestran claramente que una dilución 1:40 del suero de perros convencionalmente vacunados da lugar a un nivel de fondo de absorbancia, es decir, el observado con los sueros de perros no vacunados. Mientras que, con los sueros de perros vacunados con mixoma-CPV(Vp2), se requiere una dilución de 1:1.280 para conseguir el mismo nivel de fondo.

Claims

1. Uso de un virus leporipox vivo recombinante que contiene ADN exógeno, que está operablemente unido a al menos un elemento de control de la expresión y que se incorpora a una región no esencial del genoma del virus, en la fabricación de una vacuna vectora para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades infecciosas en especies no lepóridas.

2. Uso de un virus según la reivindicación 1 en la fabricación de una vacuna vectora para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades infecciosas en félidos o cánidos.

3. Vacuna consistente en un soporte farmacéutico aceptable y un virus leporipox vivo recombinante que contiene ADN exógeno operablemente unido a al menos un elemento de control de la expresión e incorporado a una región no esencial del genoma del virus, cuyo ADN exógeno codifica para al menos un antígeno de un patógeno que produce una enfermedad infecciosa en no lepóridos.

4. Un virus leporipox vivo recombinante que contiene un ADN exógeno operablemente unido a al menos un elemento de control de la expresión e incorporado a una región no esencial del genoma del virus, caracterizado por el hecho de que dicho ADN exógeno codifica para al menos un antígeno de un patógeno no lepórido.

5. Un virus según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que el virus leporipox es un virus del mixoma.

6. Un virus según las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado por el hecho de que el ADN exógeno codifica para el menos un antígeno de un patógeno felino o canino.

7. Un virus según las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado por el hecho de que el ADN exógeno codifica para el menos un antígeno de un virus felino o canino.

8. Un virus según las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado por el hecho de que el ADN exógeno codifica para la proteína de la envuelta del virus de la Leucemia Felina (FeLV), la proteína de la cápside del Calicivirus Felino (FCV), la proteína VP2 del virus de la Panleucopenia Felina (FPL) y/o VP2 del Parvovirus Canino (CPV).

9. Un virus según las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado por el hecho de que el ADN exógeno y el elemento de control de la expresión están insertados en el ORF MGF del genoma del virus.

10. Un virus según las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado por el hecho de que el elemento de control de la expresión operablemente unido al ADN exógeno es un promotor de poxvirus sintético.

11. Un virus según la reivindicación 10, caracterizado por ser el promotor un promotor precoz/tardío.