ES2246534T3 - Planta de soja que produce semillas con niveles reducidos de sacaridos de rafinosa y de acido fitico. - Google Patents
Planta de soja que produce semillas con niveles reducidos de sacaridos de rafinosa y de acido fitico.Info
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Abstract
La invención se refiere a la identidad, la caracterización y la manipulación de una enzima de soja que modifica el contenido de sacárido de rafinosa, de sacarosa, de ácido fítico y el contenido de fosfatos inorgánicos de las semillas seoja, proporcionando así productos de soja interesantes y útiles. La invención se refiere también a líneas de soja que presentan una capacidad reducida para sintetizar el myo - inositol 1 - fosfato en el tejido de las semillas en desarrrollo, respecto de otras líneas de soja. La reducción de la actividad enzimática de la myo - inositol q - fosfato sintasa, generada por uno cualquier de los diferentes medios estudiados da semillas de soja que tienen el fenotipo considerado.
Description
Planta de soja que produce semillas con niveles
reducidos de sacáridos de rafinosa y de ácido fítico.
Esta invención se sitúa en el campo de la
biología molecular y de la genética de las plantas. De forma más
específica esta invención pertenece a la proteína de la soja y a
productos alimenticios que tengan contenidos significativamente
inferiores de rafinosa, estachiosa y ácido fítico y contenidos
significativamente mayores de sacarosa y de fosfato inorgánico como
una función del uso de líneas de soja que tengan una capacidad
disminuida, hereditaria, para la producción de
1-fosfato de myo-inositol en sus
semillas.
Los sacáridos de la rafinosa son un grupo de
oligosacáridos de sacarosa que contienen
D-galactosa que se encuentran ampliamente
distribuidos en las plantas. Los sacáridos de la rafinosa se
caracterizan por tener la fórmula general
O-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow6)_{n}-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow2)-\beta-D-fructofuranósido
en donde cuando n = 1 hasta n = 4 son conocidos respectivamente
como rafinosa, estachiosa, verbascosa, y ajugosa. En las semillas
de soja, la rafinosa y la estachiosa son los sacáridos de la
rafinosa que se encuentran presentes en mayor cantidad. En
contraste, la verbascosa y la ajugosa son los componentes
minoritarios y generalmente no son detectados por los métodos
analíticos estándar.
Los exámenes botánicos extensivos de la
existencia de sacáridos de la rafinosa han sido descritos en la
literatura científica [P. M. Dey, en Biochemistry of Storage
Carbohydrates in Green Plants, Academia Press, Londres, (1985)
págs. 53-129]. Se piensa que los sacáridos de la
rafinosa son los segundos, después de la sacarosa entre los
carbohidratos no estructurales con respecto a su abundancia en el
reino de las plantas. De hecho, los sacáridos de la rafinosa pueden
ser omnipresentes, al menos entre las plantas superiores. Los
sacáridos de la rafinosa se acumulan en cantidades significativas
en la parte comestible de muchas especies de cultivos
económicamente significativos. Ejemplos de los mismos incluyen la
soja (Glycine max L. Merrill), remolacha de azúcar (Beta
vulgaris), algodón (Gossypium hirsutum L.), canola
(Brassica sp.) y todos los cultivos de la principales
leguminosas comestibles incluyendo judías (Phaseolus sp.),
garbanzos (Cicer arietinum), caupí (Vigna
unguiculata), judías mung (Vigna radiata), guisantes
(Pisum sativum), lentejas (Lens culinaris) y
altramuces (Lupinus sp.).
Aunque son abundantes en muchas especies, los
sacáridos de la rafinosa son un obstáculo para la utilización
eficiente de algunas especies de cultivos económicamente
importantes. Los sacáridos de la rafinosa no son digeridos de forma
directa por los animales, debido principalmente a que la
á-galactosidasa no está presente en la mucosa del intestino
[Gitzelmann y Auricchio (1965) Pediatrics 36:
231-236; Rutloff y col. (1967) Nahrung. 11:
39-46]. Sin embargo, la microflora en el intestino
delgado es capaz de fermentar fácilmente los sacáridos de la
rafinosa que dan lugar a una acidificación del intestino y a la
producción de dióxido de carbono, metano e hidrógeno [Murphy y col.
(1971) J. Agr. Food Chem. 20:813-817;
Cristofaro y col., en Sugars in Nutrition, (1974) Capítulo
20, 313-335; Reddy y col. (1980) J. Food Science
45: 1161-1164]. La flatulencia resultante puede
limitar de forma severa el uso de las plantas leguminosas en dietas
para animales, incluyendo los humanos. Es desafortunado que la
presencia de sacáridos de la rafinosa restrinja el uso de habas de
soja en dietas para animales, incluyendo los humanos, siendo estas
especies, por otra parte, una excelente fuente de proteínas y de
fibra.
La soja está bien adaptada a la maquinaria y a
las instalaciones para la cosecha, al almacenamiento y al procesado
que está ampliamente disponible en muchas partes del mundo. Sólo en
los Estados Unidos, se produjeron aproximadamente 28 millones de
toneladas métricas de harina en 1988 [Oil Crops Situation and
Outlook Report, Apr. 1989, U.S. Dept. of Agriculture, Economic
Research Service]. De forma típica, se eliminan las vainas y a
continuación se extrae el aceite con hexano en uno o varios sistemas
de extracción. Las escamas desengrasas residuales pueden ser
utilizadas a continuación para una variedad de productos de
proteína de soja comerciales [Soy Protein Products,
Characteristics, Nutricional Aspects and Utilization (1987) Soy
Protein Council]. El primero entre estos en volumen de uso es la
harina de soja, la principal fuente de proteína en las dietas
utilizadas para la alimentación animal, especialmente aquellas para
animales monogástricos tales como las aves de corral y los
cerdos.
Aunque la soja es una fuente excelente de
proteínas vegetales, hay ineficiencias asociadas con su uso que
parecen ser debidas a la presencia de sacáridos de la rafinosa. En
comparación con el maíz, el otro ingrediente principal en dietas
animales, la utilización de energía total para la harina de soja es
baja [Potter y Potchanakorn, en: Proceedings World Soybean
Conference III, (1984) 218-224]. Por ejemplo,
aunque la harina de soja contiene aproximadamente un 6% más de
energía total que el maíz amarillo de campo, tiene aproximadamente
entre el 40 y el 50% menos de energía metabolizable cuando alimenta
a los pollos. Esta ineficiencia de utilización de la energía total
no parece ser debida a problemas en la digestión de la fracción de
proteína de la harina, sino más bien es debida a la mala digestión
de la parte de carbohidratos de la harina. Se ha descrito que la
eliminación de sacáridos de la rafinosa de la harina de soja por
extracción con etanol dan lugar a un gran incremento en la energía
metabolizable para los pollos tomateros [C. N. Coon, y col., en:
Proceedings Soybean Utilization Alternatives, University of
Minnesota, (1988) 203-211]. La eliminación de los
sacáridos de la rafinosa estuvo asociada con la utilización
incrementada de las fracciones celulósica y hemicelulósica de la
harina de soja.
A partir de la harina de soja se producen una
variedad de productos de proteína vegetal procesados. Esta variedad
va desde los mínimamente procesados, artículos desengrasados tales
como la harina de soja, sémolas, y harinas hasta los artículos
altamente procesados tales como concentrados de proteína de soja y
aislados de proteína de soja. En otros productos de proteína de
soja no se extrae el aceite, harina de soja con toda la grasa, por
ejemplo. Además de estos productos procesados, hay también un
número de productos especializados basados en los procedimientos
orientales tradicionales, que utilizan la soja entera como material
de partida. Ejemplos de estos incluyen la leche de soja, la salsa de
soja, el tofu, el natto, el miso, el tempeh y la yuba.
Ejemplos del uso de los productos de proteína de
soja en alimentos para humanos incluyen los concentrados de
proteína de soja, los aislados de proteína de soja, la proteína de
soja texturada, la leche de soja y fórmulas infantiles. Las
instalaciones y los métodos para producir concentrados de proteína
y aislados de soja se encuentran disponibles en todo el mundo. Por
ejemplo, en la solicitud WO 97/37547, se describe un método para
fabricar un producto de proteína de soja enriquecido con isoflavona.
Uno de los problemas a los que se enfrentan los productores de
concentrados y aislados de proteína de soja es el desafío que
representa llevar a cabo la purificación selectiva de proteína de
los sacáridos de la rafinosa. Se incurre en un equipo considerable,
así como costes de operación como resultado de la eliminación de
grandes cantidades de sacáridos de la rafinosa que se encuentran
presentes en las sojas.
Los problemas y los costes asociados con los
sacáridos de la rafinosa pueden ser reducidos o eliminados a través
de la disponibilidad de genes que confieren una reducción del
contenido de sacárido de la rafinosa de las semillas de soja. Dichos
genes pueden ser utilizados para desarrollar variedades de soja que
tienen un contenido de sacárido de la rafinosa reducido de forma
inherente. Las variedades de soja con un contenido de sacárido de la
rafinosa reducido de forma inherente mejorarían la calidad
nutricional de los productos de proteína de soja derivados y
reducirían los costes de procesamiento asociados con la eliminación
de los sacáridos de la rafinosa. Las variedades de soja con bajo
contenido en sacárido de la rafinosa serán más valiosas que las
variedades convencionales para dietas animales y humanas y
permitirán a la humanidad utilizar de forma más completa las
cualidades nutricionales deseables de esta legumbre comestible.
El hexafosfato de myo-inositol (también
conocido como "ácido fítico") y los sacáridos de la rafinosa
comparten el myo-inositol como un intermedio común en su
síntesis [M. Ishitani, y col., (1996) The Plant Journal 9:
537-548]. Al igual que los sacáridos de la
rafinosa, el ácido fítico es un componente casi omnipresente de las
semillas de angioesperma [V. Raboy, en: Inositol Metabolism in
Plants (1990) Wiley-Liss, New York, págs.
55-76]. Mientras que el ácido fítico representa de
forma típica entre el 50 y el 70% del fosfato total en semillas
tales como la soja y el maíz, dicho fosfato es sólo escasamente
asequible en los animales mono-gástricos. Además de
ser sólo parcialmente digestible, la presencia de ácido fítico en
las raciones de animales conduce a la excreción de otros nutrientes
limitantes tales como amino ácidos esenciales, calcio y zinc [Z.
Mroz y col., (1994) J. Animal Sci. 72:
126-132; Fox y col., en: Nutricional Toxicology
Vol. 3, Academic Press, San Diego (1989) pág
59-96]. Ya que los alimentos de soja son una parte
principal de muchas raciones de alimento para animales, un alimento
con cantidades menores de ácido fítico junto con cantidades
incrementadas de fosfato asequible conduciría a una mejorada
eficiencia de la comida en raciones conteniendo soja. En efecto, el
tratamiento enzimático de las raciones conteniendo alimentos de
soja para hidrolizar parcialmente los grupos fosfato del ácido
fítico mejora tanto la disponibilidad del fosfato como la
disponibilidad de otros nutrientes limitantes [Mroz y col.,
supra; Pen y col., (1993) Biotechnology 11:
811-814].
Las fuentes de germplasma de soja comercial y
salvaje indican que existe variabilidad genética limitada para los
contenidos de ácido fítico de semillas [Raboy y col., (1984)
Crop Science 24: 431-434]. A la luz de estos
factores, es aparente que se necesitan plantas de soja con unos
niveles hereditarios, sustancialmente reducidos, de sacáridos de la
rafinosa y de ácido fítico en sus semillas.
La presente invención se refiere a una planta de
soja con un fenotipo hereditario de (i) un contenido de ácido
fítico en las semilla de menos de 17 \mumol/g, (ii) un contenido
de rafinosa más estachiosa combinado de menos de 14,5 \mumol/g, y
(iii) un contenido de sacarosa en las semilla de más de 200
\mumol/g, debido el fenotipo a una capacidad disminuida para la
síntesis de 1-fosfato de myo-inositol en las
semillas de la planta. La invención también se refiere a las
semillas derivadas de esta planta.
De forma más específica, esta invención se
refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica a una
sintasa de 1-fosfato de myo-inositol o a su
complemento, y un gen quimérico que comprende este fragmento de
ácido nucleico o un subfragmento de este fragmento de ácido
nucleico, unido de forma operable a secuencias reguladoras
adecuadas, en donde la expresión del gen quimérico da lugar a una
disminución en la expresión de un gen nativo que codifica una
sintasa de 1-fosfato de myo-inositol de
soja.
Otra realización de la presente invención es un
fragmento de ácido nucleico aislado que codifica una sintasa de
1-fosfato de myo-inositol que tiene una
capacidad diminuida para la síntesis del 1-fosfato
de myo-inositol.
Todavía otra realización de la presente invención
es una planta de soja que tiene en su genoma un gen quimérico que
comprende un fragmento de ácido nucleico que codifica una sintasa
del 1-fosfato de myo-inositol o el
complemento del fragmento de ácido nucleico, unido de forma
operable a secuencias reguladoras adecuadas, en donde la expresión
del gen quimérico da lugar a una disminución en la expresión de un
gen nativo que codifica una sintasa del 1-fosfato
de myo-inositol de la soja.
Aún otra realización de la presente invención es
una planta de soja homocigótica para al menos un gen que codifica
una sintasa de 1-fosfato de myo-inositol
mutante que tiene una capacidad disminuida para la síntesis de
1-fosfato de myo-inositol, confiriendo el
gen un fenotipo hereditario de (i) un contenido de ácido fítico de
menos de 17 \mumol/g, (ii) un contenido en semilla de rafinosa
más estachiosa combinadas de menos de 14,5 \mumol/g, y (iii) un
contenido de sacarosa en semilla de más de 200 \mumol/g.
La presente invención también se refiere a las
semillas y los productos de proteína derivados de las semillas de
cualquiera de las plantas descritas anteriormente.
Todavía otra realización de la presente invención
es un método para preparar una planta de soja con un fenotipo
hereditario de (i) un contenido de ácido fítico en semilla de menos
de 17 \mumol/g, (ii) un contenido de rafinosa más estachiosa en
semilla combinadas de menos de 14,5 \mumol/g, y (iii) un
contenido de sacarosa en semilla de más de 200 \mumol/g,
comprendiendo el método (a) el cruce de la línea LR33 de soja o de
cualquier planta de soja que tenga en su genoma un gen quimérico
que comprende un fragmento de ácido nucleico que codifica una
sintasa del 1-fosfato de myo-inositol o el
complemento del fragmento de ácido nucleico, unido de forma
operable a secuencias reguladoras adecuadas, o una planta de soja
homocigótica para al menos un gen que codifica un mutante de la
sintasa del 1-fosfato de myo-inositol que
tenga una capacidad disminuida para la síntesis del
1-fosfato de myo-inositol, con una planta de
soja selecta, y (b) seleccionando plantas de la progenie del cruce
de la etapa (a) que tengan un fenotipo hereditario de (i) un
contenido de ácido fítico en semilla de menos de 17 \mumol/g,
(ii) un contenido de rafinosa más estachiosa combinadas en semilla
de menos de 14,5 \mumol/g, y (iii) un contenido de sacarosa en
semilla de más de
200 \mumol/g.
200 \mumol/g.
La presente invención también realiza un método
para la producción de un producto de proteína de soja que comprende
(a) el cruce de una planta de soja agronómicamente selecta con LR33
o cualquiera de las plantas de soja descritas anteriormente; (b) la
selección de la semilla de las plantas progenie obtenidas de la
etapa (a) para (i) un contenido de ácido fítico en semilla de menos
de 17 \mumol/g, (ii) un contenido de rafinosa más estachiosa
combinadas de menos de 14,5 \mumol/g, y (iii) un contenido de
sacarosa en semilla de más de 200 \mumol/g; y (c) procesado de la
semilla seleccionada en la etapa (b) para obtener el producto de
proteína de soja deseado.
Finalmente, la presente invención realiza un
método de utilización de una planta de soja homocigótica para al
menos un gen que codifica una sintasa de 1-fosfato
de myo-inositol mutante que tiene una capacidad disminuida
para la síntesis de 1-fosfato de
myo-inositol, el gen que confiere un fenotipo hereditario de
(i) un contenido de ácido fítico en semilla de menos de 17
\mumol/g, (ii) un contenido de rafinosa más estachiosa en semilla
de menos de 14,5 \mumol/g, y (iii) un contenido de sacarosa en
semilla de más de 200 \mumol/g para producir líneas de progenie,
comprendiendo el método (a) el cruce de una planta de soja que
comprende una sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol mutante que tiene la capacidad disminuida para
la síntesis de 1-fosfato de myo-inositol con
una referencia de soja que no comprende la mutación, para rendir un
híbrido F1; (b) la autofecundación del híbrido F1 durante al menos
una generación; y (c) la identificación de la progenie del
homocigoto de la etapa (b) para al menos un gen que codifique una
sintasa del 1-fosfato de myo-inositol mutante
que tiene la capacidad disminuida para la síntesis del
1-fosfato de myo-inositol, el gen que
confiere un fenotipo hereditario de (i) un contenido de ácido
fítico en semilla de menos de 17 \mumol/g, (ii) un contenido de
rafinosa más estachiosa combinadas en semilla de menos de 14,5
\mumol/g, y (iii) un contenido de sacarosa en semilla mayor de
200 \mumol/g.
La invención puede ser más totalmente comprendida
a partir de la figura y de los Listados de Secuencias que forman
una parte de esta solicitud. Los Listados de secuencias contienen
los tres códigos de letras para los amino ácidos tal como se han
definido en la 37 C.F.R. 1.822 que se incorpora por referencia la
presente documento.
Figura 1. Metabolismo de la glucosa a ácido
fítico, rafinosa y estachiosa en semillas de soja. Los
co-factores comunes, ATP, ADP, UTP, UDP, pirofosfato
y fosfato inorgánico (Pi) no se muestran. Las enzimas se listan por
abreviación: hexoquinasa (HK); fosfoglucoisomerasa (PGI);
pirofosforilasa de la UDP glucosa (UDPGPP); 4' epimerasa de la UDP
glucosa (UDPG 4'E); sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol (MI 1-PS);
1-fosfatasa de myo-inositol (MI
1-Pase); quinasa del 1-fosfato de
myo-inositol (MI 1-PK); sintasa del
galactinol (GAS); sintasa de la sacarosa (SucS); sintasa de la
rafinosa (RS); y sintasa de la estachiosa (SS).
SEC de ID NO: 1 es la secuencia de los
nucleótidos 5' a 3' de las 1782 bases del cDNA que codifica la
sintasa del 1-fosfato del myo-inositol de
soja de tipo salvaje presente en el clon
p5bmi-1ps.
SEC de ID NO: 2 es la secuencia de 510 amino
ácidos deducida del bloque de lectura abierta en la SEC de ID NO:
1.
SEC de ID NO: 3 es la secuencia de nucelótidos
del prímero (5') "corriente arriba" utilizado en el
aislamiento del cDNA de la sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol a partir de la línea LR33 de la soja.
SEC de ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos
del prímero (3') "corriente abajo" utilizado en el aislamiento
del cDNA de la sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol a partir de la línea LR33 de la soja.
SEC de ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos de
las bases 1533 del cDNA que codifica la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de la LR33 presente
en el clon LR33-10.
SEC de ID NO: 6 es la secuencia de 510
aminoácidos deducida del bloque de lectura abierta en la SEC de ID
NO: 5.
SEC de ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos
del prímero (5') contracorriente utilizado para la amplificación de
la PCR del alelo de tipo salvaje que codifica la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de muestras de DNA
genómico.
SEC de ID NO: 8 es la secuencia de nucleótidos
del prímero (5') contracorriente utilizado para la amplificación de
la PCR del alilo de la LR33 que codifica la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de muestras de DNA
genómico.
Los siguientes materiales biológicos han sido
depositados bajo los términos del Tratado de Budapest en la
American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD 20852, y tienen los siguientes números de acceso:
| Designación | Material | Número de Acceso | Fecha del Depósito |
| LR33 | Semilla | ATCC 97988 | 17 de Abril de 1997 |
| 4E76 | Semilla | ATCC 97971 | 4 de Abril de 1997 |
| P5bmi-1ps | Plásmido | ATCC 97970 | 4 de Abril de 1997 |
En el contexto de esta descripción, deben
utilizarse un número de términos. Tal como se utiliza en el
presente documento, "soja" se refiere a las especies
Glycine max, Glycine soja, o a cualquier especie que sea
sexualmente compatible de forma cruzada con la Glycine max.
Una "línea" es un grupo de plantas de similar familia que
muestran una pequeña o ninguna variación genética entre individuos
para al menos una característica. Dichas líneas pueden ser creadas
por una o más generaciones de auto-polinización y
selección, o propagación vegetativa a partir de un único modelo
incluido por técnicas de cultivo de tejido o células. La
"mutación" hace referencia a un cambio genético detectable o
hereditario (tanto espontáneo como inducido) no causado por
segregación o recombinación genética. "Mutante" hace
referencia a un individuo o linaje de individuos, que poseen una
mutación. Una "población" es cualquier grupo de individuos que
comparten una fuente de genes común. En la presente invención, ésta
incluye las poblaciones M1, M2, M3, M4, F1 y F2. Tal como se utiliza
en la presente invención, una "población M1" es la progenie de
semillas (y de las plantas resultantes) que han sido expuestas a un
agente mutagénico, mientras que la "población M2" es la
progenie de plantas M1 auto-polinizadas, la
"población M3" es la progenie de plantas
auto-polinizadas M2, y "población M4" es la
progenie de plantas auto-polinizadas M3. Tal como se
utiliza en la presente invención, una "población F1" es la
progenie resultante de una polinización cruzada de una línea con
otra línea. El formato utilizado en la presente invención para
representar dicha polinización cruzada es "modelo hembra*modelo
macho". Una "población F2" es la progenie de las plantas F1
auto-polinizadas. Una "línea derivada de F2" o
"línea F2" es una línea resultante de la
auto-polinización de una planta F2 individual. Una
línea derivada de F2 puede ser propagada a través de las
generaciones subsiguientes (F3, F4, F5, etc.) por
auto-polinización repetida y agrupación de semillas
de plantas de dicha línea derivada de F2.
El término "ácido nucleico" hace referencia
a una gran molécula que puede ser de hebra sencilla o doble hebra,
compuesta de monómeros (nucleótidos) que contienen un azúcar, un
fosfato o bien una purina o una pirimidina. Un "fragmento de ácido
nucleico" es una fracción de una molécula de ácido nucleico
dado. Un "subfragmento" hace referencia a una parte contigua
de un fragmento de ácido nucleico que comprende menos de un
fragmento de ácido nucleico entero. "Complementario" hace
referencia al apareamiento específico de bases de purina y de
pirimidina que comprenden ácidos nucleicos: pares de adenina con
pares de timina y de guanina con citosina. De este modo, el
"complemento" de un primer fragmento de ácido nucleico hace
referencia a un segundo fragmento de ácido nucleico cuya secuencia
de nucleótidos es complementaria a la primera secuencia de ácido
nucleico.
En plantas superiores, el ácido
desoxirribonucleico (DNA) es el material genético mientras que el
ácido ribonucleico (RNA) está implicado en la transferencia de la
información en el DNA en las proteínas. Un "genoma" es el
cuerpo entero del material genético contenido en cada célula de un
organismo. El término "secuencia de nucleótidos" hace
referencia a la secuencia de polímeros de DNA o de RNA, que puede
ser de hebra sencilla o doble, conteniendo de forma opcional bases
de nucleótidos alterados o no naturales, sintéticos capaces de
incorporarse en los polímeros de DNA o de RNA. El término
"oligómero" hace referencia a secuencias de nucleótidos
cortas, normalmente de hasta 100 bases de longitud. Tal como se ha
utilizado en el presente documento, el término "homólogo a"
hace referencia a la falta de relación entre la secuencia de
nucleótidos de las dos moléculas de ácido nucleico o entre las
secuencias de amino ácidos de las dos moléculas de proteína. Los
estimados de dicha homología son proporcionados tanto por la
hibridación DNA-DNA o DNA-RNA bajo
condiciones de escasez tal como es bien entendido por los expertos
en el estado de la técnica (Hames y Higgins, Eds. (1985) Nucleic
Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, U.K.); o por la comparación
de la semejanza de la secuencia entre dos ácidos nucleicos o
proteínas, tales como por el método de Needleman y col. (J. Mol.
Biol. (1970) 48: 443-453). Tal como se utiliza en
el presente documento, "sustancialmente similar" hace
referencia a secuencias de nucleótidos que tienen más del 90% de
identidad global en el nivel de nucleótido con la región de
codificación de la secuencia reivindicada, tal como genes y
pseudo-genes correspondientes a las regiones de
codificación. Los fragmentos de ácido nucleico descritos en el
presente documento incluyen moléculas que comprenden posibles
variaciones, tanto preparadas por el hombre como naturales, tales,
pero no limitadas a, (a) aquellas que implican cambios de bases que
no causan un cambio en un aminoácido codificado, o (b) que implican
cambios de base que alteran un amino ácido pero que no afectan las
propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia
de DNA, (c) aquellas derivadas de eliminaciones, reordenamientos,
amplificaciones, mutagénesis al azar o controlada del fragmento de
ácido nucleico, y (d) incluso errores de secuenciación de
nucleótidos ocasionales.
"Gen" hace referencia a un fragmento de
ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo las
secuencias reguladoras precedentes (5'
no-codificantes) y siguientes (3'
no-codificantes) de la región de codificación. Gen
"nativo" hace referencia a un gen aislado con sus propias
secuencias reguladoras tal como se encuentra en la naturaleza.
"Gen quimérico" hace referencia a un gen que comprende
secuencias reguladoras y codificantes heterogéneas que se
encuentran en la naturaleza. Gen "endógeno" hace referencia al
gen nativo que generalmente se encuentra en su localización natural
en el genoma y que no está aislado. Un gen "extraño" hace
referencia a un gen que no se encuentra de forma natural en el
organismo huésped pero que es introducido por transferencia de
genes. "Pseudo-gen" hace referencia a una
secuencia de nucleótidos genómica que no codifica un enzima
funcional.
"Secuencia de codificación" hace referencia
a una secuencia de DNA que codifica para una proteína específica y
excluye las secuencias no codificantes. Puede constituir una
"secuencia de codificación no interrumpida", es decir, faltando
un intrón o puede incluir uno o más intrones unidos por enlaces de
unión apropiados. Un "intron" es una secuencia de nucleótidos
que es transcrita en el transcrito primario pero que es eliminada a
través de la rotura y nueva unión del RNA en la célula para crear el
mRNA maduro que puede ser traducido en una proteína.
"Codón de iniciación" y "codón de
terminación" hace referencia a una unidad de tres nucleótidos
adyacentes en una secuencia de codificación que especifica la
iniciación y la terminación de la cadena, respectivamente, de la
síntesis de proteína (traducción de mRNA). "Bloque de lectura
abierta" hace referencia a la secuencia de codificación no
interrumpida por intrones entre los codones de iniciación y de
terminación que codifica una secuencia de aminoácidos.
"Transcrito de RNA" hace referencia al
producto resultante de la transcripción de una secuencia de DNA
catalizada por la polimerasa de RNA. Cuando el transcrito de RNA es
una copia perfecta de la secuencia de DNA, es referido como el
transcrito primario o puede ser una secuencia de RNA derivada del
procesamiento posttranscripcional del tránscrito primario y es
referido a continuación como el RNA maduro. "RNA mensajero
(mRNA" hace referencia al RNA que está sin intrones y que puede
ser traducido en la proteína por la célula. "cDNA" hace
referencia a un DNA de doble hebra que es derivado del mRNA. RNA
"con sentido" hace referencia a un transcrito que incluye el
mRNA. "RNA antisentido" hace referencia a un transcrito de RNA
que es complementario a todos o parte de un transcrito primario
objetivo o mRNA y que bloque la expresión de un gen objetivo por
interferencia con el procesamiento, transporte y/o traducción de su
transcrito primario o mRNA. La complementariedad de un RNA
antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito del gen
específico, es decir, en la secuencia no codificante 5', la
secuencia no codificante 3', intrones, o la secuencia de
codificación. Además, tal como se utiliza en el presente documento,
el RNA antisentido puede contener regiones de secuencias de
ribozima que incrementan la eficacia del RNA antisentido para
bloquear la expresión del gen. "Ribozima" hace referencia a un
RNA catalítico e incluye las endoribonucleasas específicas de
secuencia.
Tal como se utiliza en el presente documento,
"secuencias reguladoras adecuadas" hace referencia a las
secuencias de nucleótidos en genes nativos o quiméricos que están
localizados corriente arriba (5'), en, y/o corriente abajo (3') a
los fragmentos de ácido nucleico de la invención, que controlan la
expresión de los fragmentos de ácido nucleico de la invención.
"Promotor" hace referencia a una secuencia
de DNA en un gen, normalmente corriente arriba (5') a su secuencia
de codificación, que controla la expresión de la secuencia de
codificación proporcionando el reconocimiento para la polimerasa de
RNA y otros factores requeridos para la transcripción adecuada. En
construcciones de DNA artificiales también pueden utilizarse
promotores para transcribir el RNA antisentido. Los promotores
también pueden contener secuencias de DNA que están implicadas en la
unión de factores de proteína que controlan la efectividad de la
iniciación de la transcripción en respuesta a las condiciones
fisiológicas o de desarrollo. También puede contener elementos
intensificadores. Un "intensificador" en una secuencia de DNA
que puede estimular la actividad promotora. Puede ser un elemento
innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para
intensificar el nivel y/o la especificidad por el tejido de un
promotor. "Promotores constitutivos" hacen referencia a
aquellos que dirigen la expresión del gen en todos los tejidos y en
todos los tiempos. Promotores "específicos del tejido" o
"específicos del desarrollo" tal como son referidos en el
presente documento son aquellos que dirigen la expresión del gen de
forma casi exclusiva en tejidos específicos, tales como hojas o
semillas, a estados de desarrollo específicos en un tejido, tal
como en la embriogénesis temprana o tardía, respectivamente. El
término "expresión", tal como se utiliza en el presente
documento, hace referencia a la transcripción y acumulación estable
del RNA con sentido (mRNA) o del RNA antisentido derivado del
fragmento(s) de ácido nucleico de la invención que, en
conjunto con el aparato de proteína de la célula, da lugar a
niveles alterados de la sintasa de 1-fosfato de
myo-inositol. "Inhibición antisentido" hace
referencia a la producción de transcritos de RNA capaces de
prevenir la expresión de la proteína objetivo. "Sobreexpresión"
hace referencia a la producción de un producto del gen en
organismos transgénicos que superan los niveles de producción en
organismos normales o no-transformados.
"Cosupresión" hace referencia a la expresión de un gen extraño
que tiene homología sustancial a un gen endógeno resultante de la
supresión de la expresión tanto del gen extraño como del endógeno.
"Niveles alterados" hacen referencia a la producción de
producto(s) del gen en organismos transgénicos en cantidades
o proporciones que difieren de los de los organismos normales o
no-transformados. La presente invención también
hace referencia a vectores que incluyen secuencias de nucleótidos
de la presente invención, células huésped que son obtenidas por
ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de
polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.
"Transformación" hace referencia en el presente documento a la
transferencia de un gen extraño en el genoma de un organismo
huésped y su herencia genéticamente estable. "Fértil" hace
referencia a plantas que son capaces de propagarse sexualmente.
"Sacáridos de la rafinosa" hace referencia a
la familia de oligosacáridos con la fórmula general
O-\alpha-D-galactopira-
nosil-(1\rightarrow6)_{n}-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow2)-\beta-D-fructofuranósido en donde n = 1 a 4. En las semillas de soja, el término hace referencia más específicamente a los miembros de la familia que contienen uno (rafinosa) y dos (estachiosa) residuos de galactosa. Aunque son conocidos polímeros de galactosa superiores (por ej., verbascosa y ajugosa), el contenido de estos polímeros superiores en la soja está por debajo de los métodos de detección estándar y por consiguiente no contribuye de forma significativa al contenido total de sacáridos de rafinosa.
nosil-(1\rightarrow6)_{n}-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow2)-\beta-D-fructofuranósido en donde n = 1 a 4. En las semillas de soja, el término hace referencia más específicamente a los miembros de la familia que contienen uno (rafinosa) y dos (estachiosa) residuos de galactosa. Aunque son conocidos polímeros de galactosa superiores (por ej., verbascosa y ajugosa), el contenido de estos polímeros superiores en la soja está por debajo de los métodos de detección estándar y por consiguiente no contribuye de forma significativa al contenido total de sacáridos de rafinosa.
"Plantas" hace referencia a organismos
fotosintéticos, tanto eucaróticos como procarióticos, mientras que
el término "plantas superiores" hace referencia a las plantas
eucarióticas.
Esta invención proporciona una forma mutada de un
gen de soja y métodos para mejorar la composición en carbohidratos
y en ácido fítico de las semillas de soja y productos derivados. La
invención muestra ejemplos de un método para identificar mutaciones
en este gen y para utilizar líneas de soja mutantes derivadas para
reducir el contenido de sacárido de rafinosa y de ácido fítico de
semillas de soja. Esta invención también enseña métodos de utilizar
la tecnología de silenciadores (o inhibidores) de genes y la
secuencia de genes de soja para la sintasa del
1-fosfato del myo-inositol descubierta en la
presente invención para reducir el contenido de sacáridos de la
rafinosa en las semillas de soja.
Las semillas derivadas de las plantas de la
presente invención expresan un contenido en carbohidratos solubles
mejorado en relación con las variedades comerciales. Las mejoras
dan lugar a un contenido total reducido de rafinosa más estachiosa.
El perfil de carbohidratos de estas líneas es dramáticamente
diferente de los perfiles observados en líneas selectas o de
germplasma utilizadas en o producidas por otros programas de
reproducción de soja.
Se enseñan dos métodos separados para producir
los nuevos genes de soja de la presente invención. La primera
aproximación marca el primer intento exitoso para inducir una
mutación que confiere un bajo contenido de rafinosa más estachiosa.
Esta aproximación da lugar al descubrimiento de dos genes
principales, uno de los cuales está descrito en detalle en esta
invención, que puede ser utilizado para desarrollar líneas de soja
que son superiores (en términos de reducción del contenido
combinado de rafinosa y estachiosa) para cualquiera de las líneas
previamente descrita. La segunda aproximación utiliza las secuencias
de genes, que se enseñan en esta invención, aplicadas en métodos
transgénicos de silenciadores específicos de genes para conseguir
resultados similares a los obtenidos mediante mutagénises y
selección al azar.
Los solicitantes inicialmente buscaron introducir
mutaciones al azar en el genoma de sojas de tipo salvaje por
mutagénesis química. La presente invención utilizó NMU
(N-nitroso-N-metilurea)
como el agente mutagénico, aunque también hubieran podido
utilizarse otros agentes conocidos para alterar la estructura y la
secuencia del DNA. Después del tratamiento con NMU, las semillas de
soja fueron sembradas para varias generaciones y seleccionadas
según el fenotipo deseado; la alteración del contenido de sacárido
de la rafinosa fue de importancia principal. La selección inicial
de las poblaciones de soja mutagenizadas reveló dos líneas, la LR33
y la LR28, que aparecieron bajas en sacáridos de la rafinosa (la
LR28 está descrita en la publicación de la patente mundial WO
93/07742). Se demostró que el bajo fenotipo de sacáridos de la
rafinosa de la LR33 era hereditario por análisis de tres
generaciones subsiguientes de la LR33 producida por
auto-fertilización (Tabla 1).
El defecto fisiológico en la línea LR33 que
condujo al único fenotipo mostrado por esta línea fue identificado
y caracterizado mediante la realización de unas series de estudios
genéticos y bioquímicos elegantes (ver Ejemplo 2, infla). El
defecto en la LR33 mostró ser genéticamente y bioquímicamente
diferente de la mutación en la LR28 que condujo al fenotipo de la
estachiosa menor de dicha línea. Además, la mutación en la LR33
demuestra mayor pleitrofía que el defecto en la LR28; la presente
especificación demuestra que el fenotipo de la LR33 incluye no sólo
un contenido de sacáridos de la rafinosa reducidos, sino que
también da lugar a alteraciones en los niveles de ácido fítico, de
fosfato inorgánico y de sacarosa en semillas. Análisis adicionales
confirmaron que la información genética derivada sólo de la LR33
pudo conferir este fenotipo único en la progenie de líneas de soja,
y que el gen mutante o los genes en la LR33 no son simples
modificadores genéticos que intensifican la expresión fenotípica de
los genes derivados de otras líneas de soja mutantes.
Se ha identificado el defecto bioquímico
específico responsable del fenotipo hereditario demostrado por la
LR33 y su progenie. Esto se consiguió por consideración de la
biosíntesis de sacáridos de rafinosa y el control de los niveles de
ácido fítico y de fosfato inorgánico en las semillas de soja. En
base a estos pasos biosintéticos, una serie de estudios bioquímicos
y los subsiguientes análisis genéticos moleculares identificaron
defectos en las semillas de LR33 tales como la alteración en la
actividad de la sintetasa del 1-fosfato de
myo-inositol, que conduce a una capacidad disminuida para la
síntesis del 1-fosfato de myo-inositol.
La biosíntesis de rafinosa y estachiosa ha sido
bastante bien caracterizada [ver P. M. Dey, en Biochemistry of
Storage Carbohydrates in Green Plants (1985)]. El hexafosfato de
myo-inositol o el ácido fítico y los sacáridos de la rafinosa
comparten el myo-inositol como un intermedio común en su
síntesis [M. Ishitami y col., The Plant Journal (1996) 9:
537-548]. Empezando con la glucosa como una fuente
de carbono, en la Figura 1 se muestra el esquema que describe la
síntesis de ácido fítico, de la rafinosa y de la estachiosa en
semillas de soja madura.
Mediante las interconversiones que se muestran en
la Figura 1, tanto la glucosa como la sacarosa pueden ser el
producto de partida para la parte poliol del ácido fítico, todas
las hexosas que constituyen la rafinosa y la estachiosa y la parte
re-ciclada del donador de galactosa a la sintasa de
la rafinosa y a la sintasa de estachiosa, el myo-inositol.
Los productos finales de estas interconversiones que se acumulan en
las semillas de soja de tipo salvaje, madura, son, en orden de
importancia de masa, sacarosa, estachiosa, ácido fítico, y
rafinosa.
La reacción comprometida de biosíntesis de
sacárido de la rafinosa supone la síntesis de galactinol
(O-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow1)-myo-inositol)
a partir de UDPgalactosa y myo-inositol. La enzima que
cataliza esta reacción es la sintasa de galactinol. La síntesis de
rafinosa y de homólogos superiores en la familia de sacárido de la
rafinosa a partir de sacarosa está catalizada por la sintasa de la
rafinosa de las galactosiltransferasas y la sintasa de la
estachiosa.
El control sobre la relación de estos productos
finales puede estar afectado por la alteración de la velocidad de
conversión a muchas de las etapas catalizadas por enzimas en la
Figura 1. Dicho control puede estar afectado por la alteración del
nivel de expresión de la enzima o por la alteración de la actividad
intrínseca de la enzima. La mezcla resultante de los productos
finales que provienen del esquema modificado puede comprender
entonces nuevas proporciones de los productos finales originales
así como de las mezclas de los nuevos productos que incluyen
acumulaciones de algunos de los intermedios normales. La mezcla
exacta y la composición dependerá tanto de la enzima que ha sido
alterada en su actividad y en el grado de dicha alteración.
Las seis enzimas sintasa del
1-fosfato de myo-inositol,
1-fosfatasa de myo-inositol,
UDP-glucosa 4' epimerasa, sintasa del galactinol,
sintasa de la rafinosa, y sintasa de la estachiosa pueden ser
reducidas en actividad para disminuir tanto la síntesis de rafinosa
como de estachiosa sin disminuir el contenido de sacarosa. De estas
seis, las tres únicas enzimas para la síntesis de la rafinosa y de
la estachiosa pueden ser disminuidas en actividad sin disminuir el
contenido de ácido fítico. Sólo la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol parece estar
implicada en la síntesis de los tres productos finales y por
consiguiente puede cambiar la cantidad de los tres productos
finales de forma simultánea si su actividad es disminuida.
La presente invención muestra la capacidad de
reducir de forma simultánea el contenido de sacárido de la rafinosa
y de ácido fítico y de incrementar el contenido de fosfato
inorgánico y de sacarosa en las semillas de soja por reducción de la
actividad de la sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol en las células de semillas de soja. Los
presentes ejemplos describen la generación y el descubrimiento de
una forma mutante de esta enzima en la que una mutación de punto en
la secuencia de nucleótido que codifica esta enzima da lugar a una
sustitución de amino ácidos que, a su vez, disminuye la actividad
enzimática intracelular. Es bien conocido para el experto en la
materia que otras mutaciones en la región codificantes para la
sintasa del 1-fosfato de myo-inositol pueden
dar lugar a una actividad enzimática disminuida dando lugar de este
modo al fenotipo de la semilla presente. Utilizando técnicas bien
conocidas de expresión del gen heterólogo y de mutagénesis in
vitro, y utilizando los diferentes ensayos enzimáticos
descritos en el presente documento, el experto en la materia podría
identificar otras mutaciones en la región codificante de la sintasa
del 1-fosfato de myo-inositol que den lugar
a una actividad enzimática disminuida sin experimentación indebida.
Estos genes de la sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol mutados podrían a continuación ser introducidos
en el genoma de la soja (ver patente U.S. No. 5.501.976) y dar
lugar a nuevas variedades de soja que muestren el fenotipo
presente.
De forma alternativa, pueden ser utilizadas las
técnicas de silenciamiento de genes tales como la tecnología de
inhibición antisentido (patente U.S. No. 5.107.065) y cosupresión
(patente U.S. No. 5.231.020) para reducir la actividad de la sintasa
del 1-fosfato de myo-inositol intracelular
en las células de las semillas de soja. La presente memoria
muestra la secuencia de genes que codifica la enzima de la sintasa
del 1-fosfato de myo-inositol de la soja de
tipo salvaje. El experto en la materia apreciará de forma fácil cómo
hacer y cómo utilizar los genes quiméricos que comprenden toda o
parte de la secuencia de tipo salvaje o secuencias sustancialmente
similares para reducir la actividad de la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol en las semillas de
soja.
De acuerdo con ello, la presente invención se
refiere a la identidad, caracterización y manipulación de un enzima
de soja que da lugar a la alteración del contenido de sacárido de
la rafinosa, de la sacarosa, del ácido fítico y del fosfato
inorgánico de las semillas de soja, conduciendo de este modo a
productos de la soja valiosos y útiles. Tal como se enseña en el
presente documento, la reducción de la actividad enzimática de la
sintasa del 1-fosfato de myo-inositol por
cualquiera de los medios dará lugar a semillas de soja que muestren
el presente fenotipo
La presente invención viene definida, además, en
los siguientes Ejemplos, en los que todas las partes y porcentajes
están en peso y los grados son Celsius, a no ser que se establezca
de otro modo. Debe entenderse que estos Ejemplos, aunque se indiquen
como realizaciones preferidas de la invención, se dan sólo por vía
de ilustración. A partir de la anterior discusión de estos
Ejemplos, un experto en la materia puede encontrar, y sin apartarse
del espíritu y alcance de la misma, puede hacer varios cambios y
modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y
condiciones. Además, la presente invención no está limitada en el
alcance por los materiales biológicos depositados, ya que se
pretende que los materiales depositados proporcionen ilustraciones
de los materiales a partir de los que pueden derivarse muchas
realizaciones. Se pretende que todas dichas modificaciones caigan
dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Las técnicas usuales de la biología molecular
tales como la transformación bacteriana, la electroforesis de
ácidos nucleicos sobre gel de agarosa y la electroforesis de
poliacrilamida de las proteínas son referidas por medio de los
términos comunes que las describen. Detalles de la práctica de
estas técnicas, bien conocidas por los expertos en la materia,
están descritas en detalle en [Sambrook y col., (Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory
Press]. Varias soluciones utilizadas en las manipulaciones
experimentales son referidas por sus nombres comunes tales como
"SSC", "SSPE", "solución de Denhart", etc. La
composición de estas soluciones puede encontrarse por referencia al
Apéndice B de Sambrook y col. [supra]
Se utilizaron los siguientes ensayos para
analizar las semillas de soja tonel fin de determinar el contenido
de sacáridos de la rafinosa. Antes de cada una de las mediciones
analíticas para la determinación del contenido de sacáridos de la
rafinosa, se dejaron las semillas al aire seco durante al menos una
semana a un contenido de humedad de aproximadamente el 8% y a
continuación se almacenaron a aproximadamente entre 40 y 50ºC y una
humedad relativa del 40%. Las determinaciones de los presente
inventores de muchas de dichas muestras secadas al aire indicaron
que el contenido de humedad no varió de forma significativa del 8%
(intervalo entre el 7 y el 10%) cuando se almacenaron en estas
condiciones.
Para cada ensayo individual de sacárido de la
rafinosa, se hicieron crecer de forma típica entre cinco y diez
sojas de una planta dada en un Molino de Muestras Cyclotech 1093
(Tecator, Box 70, S-26301, Hoganas, Suecia) equipado
con una criba de 100 mesh para rendir un polvo de semillas que a
continuación fue analizado. En la mayoría de los casos, se
determinó el contenido de sacáridos de la rafinosa para semillas o
productos derivados conteniendo un porcentaje de humedad "tal
cual" de aproximadamente el 8%. En estos casos, los valores
"tal cual" se convirtieron a una base seca (db) por división de
las determinaciones por 0,92. Para la comparación entre ciertas
líneas o entre ciertos productos de proteína de soja, se situó el
polvo de semilla triturado en un horno de aire forzado a 45ºC hasta
que las muestras alcanzaron un peso constante (0% de humedad) antes
del análisis. Hasta aquí, todas las determinaciones de sacáridos de
la rafinosa descritos en esta memoria son sobre una base seca común
a no ser que se especifique de otro modo.
Tal como se describe a continuación, se
utilizaron tres ensayos ("enzimático", "TLC", y
"HPLC") para determinar el contenido de sacáridos de rafinosa
de las semillas de soja. Los tres fueron realizados sobre polvo de
semillas derivado de los procedimientos de trituración
anteriormente mencionados.
En la preparación para el ensayo
"enzimático", después de la trituración de cada muestra de
semilla, se pesaron aproximadamente 30 mg del polvo resultante en un
tubo con tapón de rosca de 13 x 100 mm y se añadieron 1,6 mL de
cloroformo y 1,4 mL de metanol:agua (4:3, v/v). Se registró el peso
de polvo preciso de cada muestra y se utilizó para ajustar los
siguientes resultados de ensayos para las muestras a las diferencias
de peso de muestra. A continuación se taparon los tubos, se
colocaron en rejillas y se agitaron en un agitador rotatorio
durante 60 min a 1800 rpm a temperatura ambiente. Después de la
extracción, se dejaron los contenidos de los tubos en reposo durante
15 min. Después del reposo, se situó una alícuota de 15 \muL de
la fase de metanol:agua en un pocillo de una placa microvaloradora
de 96 pocillos y se seco a 45ºC durante 20 min. Los pocillos secos
se utilizaron como vasos de reacción para el ensayo
"enzimático" acoplado que utilizó
\alpha-galactosidasa y deshidrogenasa de galactosa
tal como se ha descrito previamente [Schiweck y Bushing, (1969)
Zucker 22: 377-384; Schiweck y Busching,
(1975) Zucker 28: 242-243; Kit de detección
de rafinosa, Boehringer Mannheim GMBH, Número de Catálogo 428 167]
con modificaciones de las condiciones de ensayo. Las modificaciones
del ensayo incluyeron la adición de albúmina de suero de bovino (15
mg/mL) al ensayo y de tampones de
\alpha-galactosidasa, incrementando la temperatura
y el tiempo de la incubación de la
\alpha-galactosidasa desde temperatura ambiente
hasta 45ºC y 30 min, e incrementando el tiempo de la incubación de
la dehidrogenasa de la galactosa desde 20 min hasta 60 min, y
utilizando estachiosa en lugar de rafinosa para el estándar de
\alpha-galactosido. Después de la incubación, se
determinó la absorbancia a 340 nm de las muestras en un lector de
Microplacas BIO-TEK® Modelo EL340. Se determinó la
cantidad de \alpha-galactosidos presentes en las
muestras por comparación de cantidades conocidas del estándar de
estachiosa. Para facilitar el análisis de miles de muestras, los
ensayos enzimáticos se replicaron una vez. Las líneas que
parecieron ser menores en el contenido de sacárido de la rafinosa a
partir del ensayo primario fueron ensayadas de nuevo a continuación
de forma tripliacada, empezando desde la semilla del cultivo, en el
caso de que hubiera suficiente material disponible. Las líneas cuya
composición se confirmó en el ensayo secundario se hicieron crecer
hasta la madurez en condiciones de campo y se ensayaron de nuevo
las semillas de plantas crecidas en el campo. En los casos en que
se requirió más información específica sobre el perfil de los
sacáridos de rafinosa y del galactinol, y se ensayaron de nuevo las
líneas de bajos sacáridos de la rafinosa identificadas mediante
ensayos enzimáticos utilizando el ensayo de HPLC (descrito a
continuación).
Para facilitar la selección rápida del germplasma
bajo de sacárido de la rafinosa, se desarrolló un ensayo por
"TLC", cromatografía de capa fina. Para este ensayo, se
colocaron aproximadamente 60 mg de polvo de semillas triturado en un
tubo de ensayo con rosca en la parte superior de 13 x 100 mm, a los
que se añadieron 1 mL de metanol:agua 4:3 (v/v) y 1 mL de
cloroformo. Los tubos se taparon, se situaron en rejillas y se
mezclaron en un agitador rotatorio durante 60 min a 25 rpm a
temperatura ambiente. Después de la extracción los tubos se
centrifugaron a 2100 rpm durante 5 min. Se tomó una muestra de 4
\muL de la capa de metanol:agua y se colocó en una palca de 20 x
20 cm de TLC con canales, con gel de sílice "Baker" como
preadsorbente, con una capa analítica de 250 mm. Se dejaron secar
las muestras a temperatura ambiente y a continuación se colocó la
placa en un tanque de TLC con una solución de acetato de etilo :
isopropanol : ácido acético al 20% en agua, en una relación 3:4:4
(v/v/v). Se dejó que la solución se empapara por los canales
analíticos durante 10 cm, en cuyo momento la placa se sacó y se
dejó secar al aire en una campana de humos. A continuación se
pulverizó la placa con un reactivo de
anilina-difenilamina para identificar los
carbohidratos en la muestra. Este reactivo se preparó por mezcla de
1 mL de anilina con 100 mL de acetona, 1 gramo de difenilamina, y
10 mL de ácido fosfórico. A continuación se situó la placa en un
horno a 100ºC durante 15 min para secar y se sacó y se dejó enfriar
antes de leer los canales analíticos. Se estimó el contenido de la
rafinosa y de la estachiosa en las muestras de soja por comparación
del modelo de elusión observado en los estándares puros.
Se utilizó un ensayo de cromatografía de
intercambio aniónico de alta resolución/pulsación amperométrica,
referido en la presente invención como ensayo de "HPLC", para
determinar el contenido de sacáridos de la rafinosa individuales
(por ej., estachiosa y rafinosa), galactinol, y para confirmar los
resultados tanto de los ensayos enzimáticos como de los de TLC. Las
condiciones para el triturado y la extracción de las semillas
fueron idénticas a las utilizadas para el ensayo enzimático
"previo". Se separó una alícuota de 750 \muL de la fase
acuosa y se secó a presión reducida a 80ºC. A continuación se
disolvió el material seco en 2 mL de agua y se mezcló de forma
vigorosa durante 30 seg. Se separó una alícuota de 100 \muL y se
diluyó hasta 1 mL con agua. La muestra se mezcló de nuevo de forma
vigorosa y a continuación se centrifugó durante 3 min a 10.000 x g.
después de la centrifugación, se analizó una muestra de 20 \muL en
una columna Dionex^{MR} PA1 utilizando NaOH 150 mM a 1,3 mL/min a
temperatura ambiente. Se utilizó el detector Dionex^{MR} PAD con
E1 = 0,05 v, E2 = 0,60 v y E3 = -0,60 v y un intervalo de salida de
3 mA. El galactinol, la glucosa, la fructosa, la sacarosa, la
rafinosa, la estachiosa y la verbascosa fueron bien separados por
las condiciones cromatográficas. Se determinó el contenido en
carbohidratos de las muestras por comparación con estándares
auténticos.
Los resultados obtenidos a partir de los análisis
de carbohidratos fueron sometidos al análisis de varianza
utilizando el software SuperANOVA (Abacus Conceps, Inc., 1984
Bonita Avenue, Berkeley, CA 94704). Cuando fue adecuado se utilizó
LSD protegido de Fisher como ensayo a posteriori para comparación
de los medios. En otras comparaciones, los medios fueron
considerados estadísticamente significativos si los intervalos
definidos por sus errores estándar (SEM's) no se solaparon. En los
casos en los que se compararon los medios de sacáridos de la
rafinosa al promedio de una línea control, un promedio se consideró
significativamente menor que el control si dicho promedio era al
menos tres desviaciones estándar por debajo del promedio del
control.
Se remojaron aproximadamente 130.000 semillas
(22,7 kg) de LR13 (una línea esencialmente idéntica a la Williams
82) en 150 L de agua del grifo bajo aireación continua durante ocho
horas. La aireación se consiguió por bombeo de aire a través de
"piedras de aire" de un acuario estándar situadas en el fondo
del baso de remojo. Las semillas impregnadas se secaron y se
transfirieron a 98 L de una solución 2,5 mM de
N-nitroso-N-metilurea
(NMU) tamponada a pH 5,5 con un tampón fosfato 0,1 M bajo aireación
continua. Las semillas permanecieron en la solución de NMU durante
tres horas y a continuación se sometieron a series de enjuagues
para eliminar el NMU restante. Para el primer enjuague, las
semillas tratadas fueron transferidas a 45 L de agua del grifo
durante 1 min. Para el segundo enjuague, las semillas se
transfirieron a 45 L de agua del grifo nueva bajo aireación
continua durante una hora. Para el tercer enjuague, las semillas se
transfirieron a 45 L de agua del grifo nueva bajo aireación
continua durante dos horas. Para el cuarto enjuague, las semillas
se transfirieron a 45 L de agua del grifo nueva bajo aireación
continua. Una mitad de las semillas se separaron del cuarto
enjuague después de dos horas (sub-población 1)
mientras que la otra mitad de las semillas se separaron del cuarto
enjuague después de cinco horas (sub-población 2).
Después de la separación del cuarto enjuague, las semillas se
secaron del agua exógena y se esparcieron en hojas de cartón para
secar al sol durante una hora. A continuación las semillas M1
impregnadas fueron plantadas en el campo (Isabela, Puerto Rico, USA)
en filas espaciadas 46 cm de distancia a una densidad de
aproximadamente 14 semillas por pie entre las filas y una
profundidad de 2,5 cm.
Dos reservas de semillas de M2 (de las
sub-poblaciones 1 y 2) fueron cosechadas de forma
masiva a partir de las plantas M1. Aproximadamente 40.000 M2 de
semillas de la sub-población 1 y 52.000 M2 de
semillas de la sub-población 2 fueron plantadas en
Isabela, Puerto Rico, USA. Dentro de cada
sub-población, se cosecharon cinco vainas de cada
uno de los 3.00 M2 de plantas y amontonadas para obtener un global
de la población de semillas M3. Los graneles de M3 se plantaron en
Isabela, Puerto Rico. Cuando estuvieron maduras, se cosecharon las
semillas de plantas de 5000 M3 de forma individual para obtener
líneas 5000 M3:4 de cada sub-población.
Durante el invierno de 1991, se seleccionaron un
total de al menos 8.000 M3:4 líneas para medir el contenido de
sacáridos de la rafinosa utilizando el método enzimático descrito
anteriormente. En la selección inicial, se identificaron dos líneas
con sacáridos de la rafinosa totales disminuidos que demostraron el
carácter hereditario en una segunda generación. Una de estas
líneas, designada LR33, tuvo niveles reducidos tanto de estachiosa
como de rafinosa en comparación con los cultivos de soja selecta
cultivados como controles en el mismo entorno. En comparación con
los valores promedio para el crecimiento para tres cultivos
selectos como controles en el mismo entorno, el contenido en
estachiosa de LR33 fue menor de forma estadísticamente
significativa. El contenido en carbohidratos solubles de las
semillas amontonadas cosechadas de las líneas puras derivadas de
LR33 para tres generaciones se muestra en la Tabla 1.
| Carbohidratos solubles en semillas maduras de líneas de soja derivadas de la línea LR33 pura | ||||
| Línea | Estachiosa | Rafinosa | Galactinol | Sacarosa |
| LR33 | 61 | 18 | 0 | N.D.^{1} |
| IST-83 | 38 | 11 | 0 | 153 |
| 1991 Selecta | 93 | 19 | 0 | N.D.^{1} |
| 2ST-88 | 51 | 13 | 0 | 209 |
| 1992 Selecta | 68 | 12 | 0 | N.D.^{1} |
| 3ST-101 | 25 | 8 | 0 | 126 |
| 1993 Selecta | 76 | 17 | 0 | N.D.^{1} |
| (todos los valores están en \mumoles g^{-1}) | ||||
| ^{1}N.D. No determinado |
Las subsiguientes líneas (1ST-83,
2ST-88 y 3ST-101) fueron todas ellas
derivadas por autopolinización de la LR33, Cada una de estas líneas
tuvo contenidos de estachiosa menores que las de las líneas
control.
En un esfuerzo para reducir de forma adicional el
contenido de sacáridos de la rafinosa totales de las semillas de
soja, se hicieron cruces genéticos entre las líneas LR33 y LR28. La
línea LR28 está descrita en la publicación de la patente mundial WO
93/07742. Brevemente, es también una línea baja de estachiosa más
rafinosa combinadas descubierta en un procedimiento de selección
muy similar al descrito en el Ejemplo 1. El bajo contenido en
estachiosa y rafinosa es consistente entre una generación y la
siguiente. Además, el contenido de galactinol de las semillas
maduras de la línea LR28 y de las líneas derivadas de ella por
cruce con otros modelos, es altamente elevado en relación con las
semillas de soja de tipo salvaje.
Las plantas F1 del cruce de LR33 y LR28 se
hicieron crecer y auto polinizar para producir progenie F2 de
segregación. Las semillas de las líneas derivadas de la LR28, los
cultivos selectos y la población de segregación resultante del cruce
de LR28 y LR33 fueron plantados en el mismo entorno. Las semillas
F2:3 fueron cultivadas a partir de cada planta F2 y seleccionadas
para determinar el contenido de \alpha-galactósido
utilizando el ensayo enzimático descrito anteriormente. Las
selecciones con \alpha-galactósido bajo de la
selección preliminar fueron avanzadas al ensayo de HPLC para
obtener los perfiles de sacáridos de la rafinosa completos. Los
perfiles de carbohidratos de las líneas típicas seleccionadas para
el contenido total de \alpha-galactósido se
muestran en la Tabla 2.
| \begin{minipage}[t]{155mm} Carbohidratos solubles en semillas maduras de líneas de soja derivadas de cruces de la línea LR28 y la LR33 y subsiguientes retro-cruces a cultivos selectos (LR33 y 5ST-1003 (una línea derivada de LR28) están incluidas como ejemplos de modelos de cruce; 2242 como un control de cultivo selecto.)\end{minipage} | ||||
| Línea | Estachiosa | Rafinosa | Galactinol | Sacarosa |
| LR33 | 61 | 18 | 0 | N.D.^{1} |
| 5ST-1441 | 57 | 18 | 0 | N.D.^{1} |
| 5ST-1434 | 6 | 15 | 0 | 216 |
| 5ST-1309 | 0 | 5 | 0 | 287 |
| 2242 | 75 | 18 | 0 | 168 |
| 5ST-1003 | 19 | 4 | 65 | 200 |
| (Todos los valores están en \mumoles g^{-1}) | ||||
| ^{1}N.D. No determinado |
Las líneas 5ST-1441,
5ST-1434, y 5ST-1309 fueron todas
ellas derivadas de los cruces de LR33 por LR28. Mientras que la
línea 5ST-1441 se parece mucho al modelo LR33, de
forma sorprendente las líneas 5ST-1434 y
5ST-1309 son mucho más bajas en resinosa y
estachiosa que sus líneas parentales y no contienen el elevado nivel
de galactinol característico de la línea LR28.
En estudios diseñados para encontrar la causa del
inesperado fenotipo de la rafinosa, la estachiosa y el galactinol
observado en algunas líneas derivadas del cruce de la LR33 por la
LR28, se midieron varias actividades enzimáticas y grupos de
metabolitos en semillas de soja cosechadas justo antes del estado
de maduración fisiológico en semillas de soja cosechadas justo
antes del estado de madurez fisiológico durante el periodo de
rápida biosíntesis de sacáridos de rafinosa. Las semillas fueron
separadas de las vainas que habían sólo empezado a amarillear. Las
semillas de dichas vainas que también empezaban a perder el color
verde o que justo empezaban a amarillear por si solas fueron
seleccionadas para el ensayo de las últimas tres enzimas en la
biosíntesis de los sacáridos de la rafinosa (Ver Figura 1).
Las semillas fueron separadas de la vaina,
pesadas para obtener el peso fresco, a continuación molidas en un
mortero y majadas en diez volúmenes de HEPES-NaOH 50
mM, tampón de pH 7 que también era 5 mM en
2-mercaptoetanol. Las muestras trituradas fueron
centrifugadas a 10.000 x g durante 10 min y el sobrenadante fue
desalado por paso a través de Sephadez G-25 que
había sido equilibrada en el tampón de trituración.
Para el ensayo de la sintasa de galactinol, se
añadieron 10 \muL del extracto desalado a 90 \muL del tampón
HEPES de pH 7 que también fue 20 mM en myo-inositol, 10 mM
en ditiotreitol, 1 mM en MnCl_{2} y 1 mM en UDP-[C^{14}]
galactosa (1,25 \muCi \mumol^{-1}). Se incubó la mezcla del
ensayo durante 10 min a 25ºC y a continuación se finalizó por la
adición de 400 \muL de etanol. Se añadieron a las reacciones
finalizadas 200 \muL de resina de intercambio aniónico Dowex
AG-1x8 (BioRAD) y se agitó la mezcla durante 25 min.
Se separó la resina por centrifugación y se tomó el sobrenadante
para contaje por centelleo. Se tomó la radioactividad no aniónica
como una medición de la síntesis de galactinol.
Para el ensayo de la sintasa de la rafinosa y la
sintasa de la estachiosa, se añadieron 50 \muL del extracto
desalado a 50 \muL del tampón HEPES 25 mM a pH 7 que también fue
10 mM en ditiotreitol, 10 mM en galactinol, y 40 mM en sacarosa para
el ensayo de la sintasa de rafinosa o 40 mM en rafinosa para el
ensayo de la sintasa de la estachiosa. Después de 1 h de incubación
a 25ºC, se pararon las reacciones por la adición de 40 \muL de
etanol y a continuación se colocaron en un baño de agua hirviendo
durante 1 min para precipitar las proteínas. Las mezclas de
reacción se centrifugaron hasta que fueron claras, el sobrenadante
se pasó a través de un filtro de 0,22 micras y a continuación se
redujo a sequedad bajo vacío. El residuo de disolvió de nuevo en
0,5 mL de agua y se separaron 20 \muL en el sistema de HPLC
Dionex tal como se ha descrito anteriormente para la cuantificación
de la rafinosa y la estachiosa. Los resultados de un experimento
realizado utilizando semillas cosechadas de las plantas crecidas en
el campo en Agosto de 1994 se muestran en la Tabla 3.
| \begin{minipage}[t]{155mm} Actividades de la sintasa del galactinol, de la sintasa de la rafinosa, y de la sintasa de la estachiosa en semillas amarilleantes de tres líneas de soja (El control de tipo salvaje es la línea 1923. las actividades de las enzimas están expresadas como \mu moles de producto producido por gramo de peso de semilla fresca por hora bajo las condiciones de ensayo. Los valores son promedio \pm desviación estándar para cinco replicados.)\end{minipage} | |||
| Línea | Sintasa del | Sintasa de la | Sintasa de la |
| Galactinol | Rafinosa | Estachiosa | |
| 1923 | 7,5 \pm 4,1 | 0,10 \pm 0,05 | 0,65 \pm 0,18 |
| Lr28 | 16,5 \pm 5,2 | 0,004 \pm 0,007 | 0,81 \pm 0,24 |
| Lr28Xlr33 | 22,6 \pm 8,8 | 0,006 \pm 0,008 | 0,87 \pm 0,21 |
De los tres enzimas comprometidos para la
síntesis de la rafinosa y la estachiosa, sólo la sintasa de la
rafinosa muestra una clara disminución en la actividad en el
mutante, líneas de bajo contenido en sacáridos de la rafinosa en
comparación con el tipo salvaje. Una mutación que causa una
actividad disminuida de la sintasa de la rafinosa es consistente
con la posición de dicha enzima en el esquema biosintético y la
acumulación de galactinol observado en las líneas que tienen sólo
la LR28 como la fuente del fenotipo de bajo sacárido de la
rafinosa. El galactinol y la sacarosa son los dos sustratos para la
sintasa de la rafinosa y ambos metabolitos se acumulan en las
líneas que contienen LR28 (ver Figura 1 y Tabla 2).
A pesar de los bajos niveles de estachiosa,
rafinosa y galactinol obtenidos cuando las líneas LR33 se cruzaron
con las líneas LR28, la actividad de la sintasa de la rafinosa
reducida conferida por la mutación de la LR28 es la única actividad
alterada. Aunque la actividad disminuida de la sintasa del
galactinol pareció un probable candidato para la lesión en la línea
LR33 debido al contenido de galactinol disminuido conferido por la
mutación cuando en combinación con la LR28, no hay una disminución
en la actividad in vitro medida de dicha enzima.
Aunque no hubo un descenso en la sintasa del
galactinol in vitro en la línea LR33 por cruce de la LR28,
la posibilidad de que la actividad in vivo de la sintasa del
galactinol en semillas maduras de las líneas derivadas de LR33 está
limitada a la disponibilidad de chequear uno de sus sustratos. La
fuente de UDP-galactosa para la sintasa del
galactinol pudo ser disminuida por mutaciones en la 4' epimerasa de
la UDP-glucosa y el suministro de
myo-inositol pudo ser limitado por mutación afectuando tanto
a su sintasa como a la fosfatasa específica que produce la forma de
inositol libre (Figura 1). La fuente de myo-inositol fue
chequeada por ensayo del contenido total de myo-inositol
libre en semillas de tipo salvaje y derivadas de LR33. Se hicieron
crecer tres líneas de soja, un cultivo A2872 de tipo salvaje, y dos
líneas derivadas LR33 x LR28, 5ST-1434 y
5ST-1309, en una habitación de crecimiento bajo días
de 16 h con un régimen de temperaturas día/noche de 30ºC/22ºC. Se
tomaron las semillas de las vainas que habían justo empezado a
amarillear y que se habían ido volviendo amarillas desde un verde
muy ligero. Se hicieron crecer tres semillas de cada línea en 8 mL
de metanol al 80%. Se centrifugó la mezcla a 12.000 x g durante 15
min y se decantó el sobrenadante a un frasco de 50 mL. La extracción
se repitió dos veces y se combinaron los sobrenadantes. Los
sobrenadantes combinados se redujeron a sequedad bajo vacío a 40ºC
y los residuos se disolvieron de nuevo en 1 mL de agua. Los
extractos re-disueltos se desionizaron por el paso a
través de 3 mL de una resina de intercambio iónico de lecho
mezclado (BioRad AG501 x 8) y el flujo eluido, más 4 mL de lavado,
fue reducido de nuevo a sequedad. El residuo se
re-disolvió en 500 \muL de agua y se separó una
alícuota de 70 \muL por HPLC en una columna amino Zorbax (DuPont)
eluido a 1 mL min^{-1} con acetonitrilo al 70%. Se detectaron los
azúcares en la columna eluida por índice refractivo diferencial. La
separación de las mezclas de estándar de sacarosa y
myo-inositol mostró que el inositol emerge último y sólo
parcialmente separado de la sacarosa. Para análisis de los
extractos de semillas, se retuvo el pico de la sacarosa por
re-inyección en un sistema Dionex PAD descrito en
el Ejemplo 1. En el sistema Dionex, el myo-inositol emerge
mucho antes que la sacarosa y pudo se separado limpiamente de la
sacarosa contaminante de la fracción de la columna amino Zorbax.
Por comparación con estándares externos de myo-inositol, la
inyección de 5 \muL de la línea 2872 de tipo salvaje contuvo 3,2
nmoles de myo-inositol mientras que las inyecciones de 5
\muL de 5ST-1434 y 5ST-1309
contuvieron 0,39 y 0,23 nmoles respectivamente.
Se llevó a cabo un segundo experimento para
caracterizar de forma adicional la diferencia en el contenido de
myo-inositol libre de semillas derivadas de LR33 y de tipo
salvaje. Se cosecharon siete semillas únicas de una segunda línea
control (2242) y de la línea 5ST-1434 derivada de
la LR33 de acuerdo con los criterios de madurez descritos
anteriormente. Las semillas se pesaron de forma individual, se
situaron en tubos de microfuga de 1,5 mL, se chafaron con una
espátula, se congelaron en hielo seco y se liofilizaron. Se pesó el
residuo seco y se añadió 1 mL de metanol del 80% que contenía 1
\mumol de trehalosa para actuar como un marcador de retención del
myo-inositol en la columna amino Zorbax y como un estándar
interno. Se calentaron los medios de extracción durante 1 h a 60ºC,
se trituraron de nuevo con una pequeña mano de mortero en el tubo de
microfuga y se centrifugaron para separar el material insoluble. Se
transfirió el sobrenadante a un segundo tubo de microfuga
conteniendo aproximadamente 100 \muL de resina de lecho mezclado,
la mezcla se agitó brevemente y se separaron 20 \muL de la
solución por encima de la resina y se llevaron a sequedad a vacío.
El residuo se disolvió de nuevo en 110 \muL de volumen total y se
inyectaron 55 \muL en una columna amino Zorbax que se eluyó tal
como se ha descrito anteriormente. Se recogió el pico de trehalosa
y se inyectaron de nuevo 20 \muL de la fracción de la columna en
el sistema Dionex. Se cuantificó el pico de myo-inositol por
comparación del estándar interno de trehalosa. La desviación
estándar \pm promedio para el contenido de myo-inositol de
tipo salvaje fue de 2,18 \pm 0,98 \mumoles (g de peso
seco)^{-1} mientras que las semillas de
5ST-1434 contuvieron 0,77 \pm 0,32 \mumoles (g
de peso seco)^{-1}. Ambos experimentos indican que las
semillas que tienen la mutación LR33 contienen menos
myo-inositol durante el periodo de síntesis rápida de
sacáridos de la rafinosa. En ningún experimento la reserva de
myo-inositol total estuvo totalmente ausente. Sin embargo,
dichos experimentos sólo pueden medir la reserva de metabolitos de
semillas totales y el myo-inositol tiene otros destinos que
pueden limitar de forma adicional su uso por la sintasa del
galactinol (Figura 1).
Para comprobar si el descenso observado en el
contenido de myo-inositol libre de las semillas derivadas de
LR33 puede ser o no la causa de contenido disminuido de sacáridos
de la rafinosa en la madurez, se llevaron a cabo estudios de
alimentación de láminas de tejido. Se cosecharon cuatro semillas de
cada una de las líneas 2242 y la línea 5ST-1434
derivada de la línea LR33 de acuerdo con el criterio de madurez
descrito anteriormente. Se separaron los recubrimientos de las
semillas y se enjuagaron los cotiledones en tampón de fosfato
potásico 5 mM a pH 5,5 y a continuación se laminaron en láminas de
aproximadamente 1 mm y de nuevo se enjuagaron con tampón. Las
láminas de tejido se dividieron en dos grupos. Se sumergió un grupo
en el tampón de fosfato potásico y el segundo grupo se sumergió en
el tampón de fosfato potásico conteniendo 50 mM de
myo-inositol. Las láminas de tejido se infiltraron a vacío y
se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Después del
periodo de pre-incubación, se añadieron 5 \muCi de
glucosa-C^{14} a cada grupo y el tejido se
infiltró de nuevo a vacío. Se tomaron diez láminas de tejido de cada
grupo a 2 h y a 8 h después de la adición de glucosa marcada. Se
situaron las láminas de tejido en un tubo de microfuga de 1,5 mL
creosotado para obtener el peso fresco y se hicieron crecer en 300
\muL de metanol del 80%. Los tubos se centrifugaron, se separó el
sobrenadante a un segundo tubo, se repitió la extracción dos veces
más y los sobrenadantes se combinaron. Los sobrenadantes combinados
se redujeron a sequedad a vacío, se disolvieron de nuevo en
acetonitrilo al 50% y se separaron en el sistema de HPLC amino
Zorbax. Las fracciones se recogieron por contaje por centelleo a
intervalos de 15 segundos a través de la región del cromatograma
conteniendo glucosa, sacarosa, rafinosa y galactinol y a intervalos
de 1 min a través de la región conteniendo estachiosa. Las
fracciones radioactivas correspondientes a los picos estándar de
azúcar se agruparon para el análisis. Los resultados se expresan
como porcentaje del radiomarcaje en los cuatro productos azúcares
en la tabla 4.
| \begin{minipage}[t]{155mm} Radiomarcaje en sacarosa, galactinol, rafinosa y estachiosa expresado como porcentaje del marcaje en dichos azúcares combinado para el control y una línea derivada de LR33 con y sin pre-incubación con \mathit{myo}\text{-}inositol\end{minipage} | ||||||||
| Láminas de tejido de tipo salvaje | Láminas de tejido 5st-1434 | |||||||
| 2h | 8h | 2h | 8h | |||||
| 2h | + inos | 8h | + inos | 2h | + inos | 8h | + inos | |
| Sacarosa | 52,4 | 33,4 | 41,0 | 23,8 | 86,8 | 43,5 | 79,8 | 21,8 |
| Galactinol | 13,4 | 24,8 | 8,0 | 11,1 | 3,2 | 27,6 | 1,5 | 9,5 |
| Rafinosa | 19,8 | 20,7 | 17,3 | 17,7 | 4,5 | 15,2 | 3,1 | 13,0 |
| Estachiosa | 14,4 | 21,0 | 33,6 | 47,4 | 5,4 | 13,7 | 15,9 | 55,6 |
Ambas láminas de tejido 5ST-1434
y de tipo salvaje convierten la glucosa-C^{14}
marcada a partir de la suministrada en sacarosa y a continuación en
galactinol, rafinosa, y estachiosa. Sin la adición de
myo-inositol exógeno, la línea conteniendo la mutación LR33
(5ST-1434) convierte muy poca marcada en los
sacáridos de la rafinosa (20,5% después de 8 h) en comparación con
la línea de tipo salvaje (58,9% después de 8 h). Ambos genotipos
responden al myo-inositol exógeno por conversión de más del
marcado suministrado a azúcares de sacáridos de la rafinosa. Con la
adición de myo-inositol los dos genotipos se hicieron
esencialmente iguales en su capacidad para convertir el primer
marcado suministrado en galactinol y a continuación en rafinosa y
estachiosa. La velocidad de conversión se incrementó incluso en la
línea de tipo salvaje en comparación con el control
no-infundido.
Parece que el suministro de myo-inositol a
la sintasa del galactinol es siempre una limitación a la velocidad
a la que pueden sintetizarse la rafinosa y la estachiosa. La
presencia de la mutación LR33 hace dicha limitación mucho mayor.
El modelo de marcaje es sorprendente en el
sentido de que no hay aumento de marcaje en el galactinol tal como
se esperaría si la mutación LR28 en la sintasa de la rafinosa
hubiera sido todavía efectiva en disminuir el flujo a través de
dicha etapa en las líneas mutantes combinadas. Mientras que puede
esperarse que la adición de myo-inositol incremente el flujo
a través de la sintasa del galactinol a galactinol, el marcaje debe
haberse acumulado allí debido a la actividad disminuida en la
sintasa de la rafinosa. La ausencia de dicha acumulación pone en
cuestión tanto la efectividad como la presencia de la mutación del
LR28 en esta línea.
Los resultados anteriores sugieren que la
mutación LR33 reside antes del myo-inositol libre en el
esquema que se muestra en la Figura 1. Para limitar de forma
adicional el posible sitio de la mutación, se midieron otros
metabolitos en dicha parte del esquema.
Ya que las semillas de soja contienen ácido
fítico a niveles de entre 20 y 30 \mumoles g^{-1} en la madurez
y ya que entre el 50 y el 70% del fosfato de semillas total está
contenido en el ácido fítico [Raboy y col. (1984) Crop Science
24:431-434], parece probable que las mutaciones
que lleva a cabo la síntesis del myo-inositol también pueden
afectar los niveles de fosfato inorgánico y de ácido fítico en
semillas. Se ensayaron los niveles de ácido fítico y de fosfato
inorgánico en tres líneas de soja de tipo salvaje por una
modificación del método descrito por Raboy [supra]. Se
hicieron crecer aproximadamente veinte semillas de cada línea en un
molino de impacto pequeño y se pesaron 100 mg del polvo resultante
en un tubo de 15 mL con tapón de rosca. Se añadieron 5 mL de HCl
0,4 N con Na_{2}SO_{4} 0,7 M sobre el polvo y la mezcla se
agitó toda la noche en una plataforma balancín. Se centrifugaron
los tubos a 3900 x g durante 15 min y se separaron 2 mL del
sobrenadante al segundo tubo de vidrio. Se añadieron 2 mL de agua y
1 mL de FeCl_{2} 15 mM y se calentaron los tubos durante 20 min
en un baño de agua hirviendo. Los tubos se centrifugaron tal como se
ha descrito anteriormente para precipitar el complejo hierro:ácido
fítico y se separó el sobrenadante. Los gránulos se suspendieron de
nuevo en 2 mL de HCl 0,2 N y se calentaron durante 10 min en el
baño de agua hirviendo. Se separó de nuevo el precipitado por
centrifugación y se suspendió de nuevo en 2 mL de EDTA 5 mM.
Se tomaron 15 \muL de la suspensión de EDTA se
tomaron para tener las cenizas húmedas para obtener el fosfato de
ácido fítico. A cada tubo conteniendo la alícuota de 15 \muL se
añadieron 10 \muL de una solución de nitrato cálcico al 10%. Se
dejó que el agua se evaporase y se calentó el residuo a la llama
hasta que quedó una blanca ceniza en el tubo. La semilla se
disolvió en 0,3 mL de HCl 0,5 N y se calentó a 90ºC durante un
tiempo comprendido entre 20 y 30 min. Se añadió el reactivo
molibdato ácido (0,7 mL de molibdato amónico al 0,36% y ácido
ascórbico al 1,42% en ácido sulfúrico 0,86N) y se dejó que se
desarrollara el color durante 1 hora antes de hacer la lectura a 820
nm.
Se determinó el fosfato inorgánico por adición de
0,3 mL de HCl 0,5 N y 0,7 mL del reactivo de color del fosfato
tanto a alícuotas de 20 o de 40 \muL del extracto de 5 mL
inicial. Se desarrollaron los estándares de fosfato potásico al
mismo tiempo. Se repitió el experimento tres veces y los resultados
se dan en la tabla 5
| \begin{minipage}[t]{155mm} Fosfato de semillas en fosfato inorgánico y en ácido fítico expresado como \mu moles de fosfato g^{-1} (Los valores son promedios \pm desviación estándar en donde se obtuvieron más de dos replicados o el valor promedio cuando se obtuvieron los dos replicados.)\end{minipage} | ||||
| Línea de | Genotipo | Replicados | Fosfato | Fosfato del |
| Semilla | Inorgánico | Acido Fítico | ||
| 2872 | Tipo salvaje | 7 | 2,7 \pm 3 | 125 \pm 8,4 |
| 1923 | Tipo salvaje | 1 | 2,0 | 126 |
| 1929 | Tipo salvaje | 2 | 1,5 | 155 |
| 5ST-1309 | LR33 | 4 | 76,0 \pm 5,7 | 62,5 \pm 12,4 |
| GxE-117 | LR33 | 7 | 36,7 \pm 6,4 | 55,8 \pm 13,9 |
| GxE-76 | LR33 | 6 | 32,2 \pm 3,5 | 72,8 \pm 14 |
La mutación LR33 también causa una disminución en
el nivel de ácido fítico en semillas (expresado como fosfato en la
fracción de ácido fítico) y aproximadamente dos veces con un
incremento concomitante en el contenido de fosfato inorgánico en
semillas de aproximadamente entre 15 y 25 veces dependiendo del
antecedente genético en el que se contiene la mutación. Basado en
el esquema en la Figura 1, el contenido disminuido de ácido fítico,
junto con el contenido disminuido de myo-inositol libre es
más probable que estén causados por una mutación que disminuya la
actividad de la sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol.
La causa exacta del incremento del contenido de
fosfato inorgánico no es conocida, sin embargo se ha venido
asumiendo que el ácido fítico funciona como una forma de
almacenamiento de fosfato en semillas y otras partes de la planta.
Es posible que cuando la plataforma de almacenamiento preferible
(myo-inositol) no esté disponible, el nuevo fosfato
inorgánico no tenga otro destino más importante y simplemente se
acumula.
Se analizaron varias líneas de soja adicionales
para determinar el fosfato inorgánico de la semilla. Se extrajeron
cien mg de semillas trituradas con 1 mL de agua caliente y se
centrifugaron para eliminar el producto insoluble. Se extrajo el
sobrenadante con 100 \muL de cloruro de metileno para eliminar el
material lípido y el resto del extracto acuoso se llevó a una
concentración del 10% con ácido trifluoroacético. Se centrifugó la
solución para eliminar proteínas y se analizaron 5 \muL del
sobrenadante para determinar el fosfato inorgánico tal como se ha
descrito en el Ejemplo 2. La Tabla 6 da los resultados de estos
ensayos.
| \begin{minipage}[t]{155mm} Contenido del fosfato inorgánico (\mu moles g^{-1}) de semillas de plantas de soja de tipo salvaje, LR28, LR33 y LR28Xlr33\end{minipage} | ||
| Línea | Genotipo | Fosfato inorgánico |
| A2872 | tipo salvaje | 12,7 |
| LR28 | LR28 | 12,7 |
| LOW2 | LR28 | 12,9 |
| 5ST-1190 | LR28 | 14,4 |
| 5ST-1191 | LR28 | 14,0 |
| 5ST-1441 | LR33 | 23,4 |
| 5ST-1309 | LR28xLR33 | 117,6 |
| 5ST-1310 | LR28xLR33 | 113,9 |
| 5ST-1433 | LR28xLR33 | 74,2 |
| 5ST-1434 | LR28xLR33 | 57,1 |
| GxE-117 | LR28xLR33 | 74,3 |
| GxE-305 | LR28xLR33 | 70,7 |
| GxE-76 | LR28xLR33 | 79,1 |
| GxE-77 | LR28xLR33 | 58,4 |
Todas las líneas que contienen sólo la mutación
LR28 tienen niveles de fosfato inorgánico iguales a los controles
de tipo salvaje. La línea 5ST-1441 derivó de la
LR33 (anterior Ejemplo 2) y tiene la reducción moderada en
estachiosa que estuvo originalmente asociada con la mutación. La
5ST-1441 tiene sólo un contenido de fosfato
inorgánico ligeramente incrementado. A pesar del hecho de que
ninguna referencia es elevada en fosfato inorgánico, todas las
líneas derivadas del cruce de LR33 por LR28 tienen los niveles de
fosfato inorgánico altamente elevados.
El fenotipo de fosfato inorgánico intermedio de
la línea 5ST-1441 que sólo contiene la mutación
LR33 fue inesperado. Esto puede indicar que tanto la mutación LR28
como la mutación LR33 deben estar presentes para producir el
fenotipo de ácido fítico bajo/fosfato inorgánico alto. Sin embargo,
si las dos mutaciones están de hecho en los genes estructurales que
codifican las dos actividades que parecen estar disminuidas, éstas
no están relacionadas en el esquema metabólico de la manera que
sugeriría un efecto aditivo en la alteración de la síntesis de
ácido fítico. Si la mutación en la LR33 afecta tanto la producción
de myo-inositol libre como la total, ella sola debe ser la
responsable del fenotipo con ácido fítico bajo y fosfato
inorgánico resultante alto.
Una explicación alternativa puede ser que la
línea 5ST-1441 no es homocigotica para la mutación
LR33 y que el análisis del grueso de las semillas da sólo el
fenotipo promedio para las semillas de tipo salvaje, mutantes
homocigóticas y heterocigóticas. Para comprobar esta posibilidad,
se pesaron trece semillas únicas a partir de la muestra en grueso
de 5ST-1441, se trituraron y se extrajeron con agua
caliente. La proteína no se precipitó y el fosfato inorgánico se
midió como anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla
7.
| \begin{minipage}[t]{155mm} Contenido de fosfato inorgánico aproximado (\mu moles g^{-1}) para trece semillas individuales de la línea 5ST-1441 (Los valores actuales son elevados en comparación con los resultados de la Tabla 6 debido a la presencia de proteína en las muestras)\end{minipage} | ||
| Número de semilla | Fosfato inorgánico | |
| 5ST-1441-a | 21,9 | |
| 5ST-1441-b | 30,4 | |
| 5ST-1441-c | 25,4 | |
| 5ST-1441-d | 81,1 | |
| 5ST-1441-e | 29,7 | |
| 5ST-1441-f | 25,7 | |
| 5ST-1441-g | 25,5 | |
| 5ST-1441-h | 30,8 | |
| 5ST-1441-i | 28,2 | |
| 5ST-1441-j | 123,5 | |
| 5ST-1441-k | 27,9 | |
| 5ST-1441-l | 115,9 | |
| 5ST-1441-m | 27,6 |
Las semillas señaladas con las letras d, j, y l
tienen un contenido en fosfato inorgánico aproximadamente tres
veces superior que las restantes diez semillas analizadas. La
relación se aproxima a la esperada a partir de una población
segregada de semillas en la que el fenotipo mutante de fosfato
inorgánico elevado es recesivo y debido a la acción de un único
gen. Para comprobar esta hipótesis, se inhibieron veinte semillas
obtenidas de la muestra en conjunto de 5ST-1441 en
agua a temperatura ambiente durante 6 h. Se separó el exceso de agua
y se separó por corte una muestra de los cotiledones al final del
eje embriónico. Se pesaron las piezas de tejido, se colocaron en
tubos de microfuga de 1,5 mL y se trituraron en suficiente metanol
del 70% para obtener 10 mg de peso fresco por 100 \muL de volumen
extraído. Se midió el fosfato presente en el sobrenadante después de
la centrifugación tal como se ha descrito anteriormente y los
resultados se muestran en la Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
| \begin{minipage}[t]{155mm} Contenido de fosfato inorgánico de 20 semillas parciales a partir de una población segregada de semillas de la línea 5ST-1441 (Los resultados son expresados como \mu moles por g de peso fresco (\mu moles gfwr^{-1}).)\end{minipage} | ||
| Semilla No. | PO_{4}(\mumoles gfwt^{-1}) | |
| 1 | 4,9 | |
| 2 | 4,3 | |
| 3 | 5,3 | |
| 4 | 40,1 | |
| 5 | 6,1 | |
| 6 | 5,0 | |
| 7 | 37,1 | |
| 8 | 9,9 | |
| 9 | 5,9 | |
| 10 | 3,8 | |
| 11 | 26,9 | |
| 12 | 4,7 | |
| 13 | 5,5 | |
| 14 | 3,9 | |
| 15 | 5,2 | |
| 16 | 17,7 | |
| 17 | 5,9 | |
| 18 | 4,9 | |
| 19 | 2,5 | |
| 20 | 28,9 |
\newpage
Las semillas 4, 7, 11, 16 y 20 fueron plantadas
en macetas en una cámara de crecimiento. Las semillas 7, 11, 16, y
20 sobrevivieron y se hicieron crecer hasta madurez bajo las
condiciones de crecimiento descritas en el Ejemplo 2. Las semillas
en grueso de las plantas madures y dos controles de tipo salvaje
(A2872) se cosecharon después de dejar secar y se hicieron crecer
veinte semillas de cada planta en grueso para análisis de los
carbohidratos solubles y del ácido fítico utilizando los métodos
descritos en los Ejemplos 1 y 2. El contenido total de ácido fítico
se calculó como el (contenido de fosfato de ácido fítico)/6. Los
resultados se muestran en la Tabla 9.
| \begin{minipage}[t]{155mm} Contenido de carbohidratos solubles y de ácido fítico (expresado como \mu moles g^{-1}) para cuatro plantas de una población segregada de semillas que tienen la mutación LR33 y seleccionadas por el fosfato inorgánico elevado en análisis de semillas parcial junto con dos plantas control (Los valores de ácido fítico son el promedio de dos replicados)\end{minipage} | |||||
| Línea | Acido | Estachiosa | Rafinosa | Galactinol | Sacarosa |
| Fítico | |||||
| A2872 | 32,2 | 71 | 19 | 3 | 166 |
| A2872 | 30,8 | 67 | 24 | 0 | 144 |
| LR33-7 | 23,7 | 40 | 16 | 0 | 155 |
| LR33-11 | 8,8 | 4 | 13 | 0 | 212 |
| LR33-16 | 9,5 | 4 | 13 | 2 | 209 |
| LR33-20 | 7,6 | 4 | 11 | 0 | 208 |
Mientras que el fenotipo del carbohidrato soluble
de la planta crecida a partir de la semilla número 7
(LR33-7) es muy similar a la adscrita a la mutación
LR33 tal como se muestra en la Tabla 1, las otras plantas tienen
niveles mucho menores de los sacáridos de la rafinosa y tienen
niveles mucho mayores de sacarosa. Estos niveles de carbohidratos
solubles son muy similares al fenotipo adscrito a algunas plantas en
la combinación mutante LR28xLR33 en la Tabla 2. La explicación más
probable para esta discrepancia es que el grueso de las semillas
analizado para dar los datos de la tabla 1 proviene de plantas
segregadas de la mutación LR33 más que de plantas homocigóticas para
la mutación. Cuando las plantas homocigóticas son seleccionadas
para la mutación, tal como se ha hecho en el caso de las plantas
11, 16 y 20 en este ejemplo, se observa el verdadero fenotipo de la
semilla homocigótica. La hipótesis previa, de que tanto las
mutaciones LR28 como la LR33 necesitaban estar presentes para
producir la combinación de bajos contenidos de rafinosa, estachiosa
y galactinol, fue incorrecta. Mientras que las líneas homocigóticas
para la mutación LR33 no fueron obtenidas a partir de
autofecundación de la línea mutante originalmente identificada,
éstas fueron obtenidas a partir de segregantes provenientes del
cruce de dicha línea con la LR28. Mientras que parte de la progenie
del cruce probablemente contiene ambas mutaciones, el fenotipo de
la mutación LR33 es dominante respecto al que proviene de la
mutación LR28. Este dominio resulta principalmente de la
localización de la mutación LR33 corriente arriba en el flujo de
carbono a partir de la mutación LR28 (ver Figura 1 y Ejemplo
2).
La razón por la que el fenotipo homocigótico LR33
permaneció mal puede ser debido a problemas de germinación con que
se tropieza con la línea mutante original. En las condiciones de
segregación de campo en global la pérdida del 25% (dicha fracción
que habría sido homocigótica para la mutación) de la semilla
plantada a partir de la autofecundación LR33 pudo haber sido
perdida. Las plantas cosechadas a partir de la población global
habrían sido entonces empobrecidas en homocigotos pero el gen
mutante sería retenido en la población en el estado heterocigoto.
Nosotros sospechamos que el cruzamiento a un antecedente genético
más dirigido a permitir a los homocigotos de la LR33 emerger en las
condiciones de cultivo permitiría la recuperación del homocigoto.
Que los cruzamientos iniciales fueran a líneas que soportan otra
mutación en el esquema biosintético de los sacáridos de la rafinosa
fuera incidental al intento original del cruce y no esencial tanto
para el fenotipo superior como para la emergencia del cultivo
mejorado.
De este modo la mutación LR33 es capaz de
producir plantas de soja que produzcan semillas con menos de 5
\mumoles de estachiosa por gramo de semilla, menos de 20
\mumoles de rafinosa por gramo de semilla, más de 200 \mumoles
de sacarosa por gramo de semilla y menos de 10 \mumoles de
fosfato de ácido fítico por gramo de semilla.
Se cruzaron las líneas LR33 y LR28 de bajo
contenido en sacáridos de la rafinosa y se seleccionaron plantas F2
segregantes por los niveles bajos de rafinosa, estachiosa y
galactinol en la semilla de las plantas F2 por el ensayo de HPLC
descrito en el Ejemplo 1. A continuación las líneas seleccionadas
derivadas de este cruce fueron cruzadas con los modelos de cultivo
selecto y la progenie de estos cruces fue seleccionada en la
generación F2 por el mismo procedimiento. Entre estas líneas
conteniendo bajos niveles de sacáridos de rafinosa, se escogieron
varias con antelación en base a las características agronómicas de
la planta vegetativa. Una de dichas líneas, designada 4E76, fue
subsecuentemente cruzada como ensayo a otro cultivo de soja selecto
y las semillas únicas de la planta F1 autofencundada derivada de
dicho cruzamiento fueron analizadas para determinar los
carbohidratos solubles y el contenido en fosfato inorgánico. Las
semillas se clasificaron en dos clases, aquellas con fosfato
inorgánico y niveles de rafinosa más estachiosa de tipo salvaje muy
bajo y una clase más pequeña de semillas con niveles elevados de
fosfato inorgánico y niveles muy bajos de rafinosa más estachiosa.
La relación de estas dos clases fue muy próxima a la relación 3:1
esperada de la mutación LR33 recesiva. No hubo ninguna evidencia de
segregación de LR28 que es la otra mutación que afecta los
sacáridos de la rafinosa que estaban presentes en el cruce
original. La línea 4E76 representa de este modo la mutación LR33 es
un antecedente de cultivo selecto seleccionado. Se hizo crecer la
línea en un total de nueve entornos durante dos años junto con
líneas selectas escogidas para el análisis de carbohidratos. Se
analizó un grupo más limitado de muestras de tres entornos para
determinar el contenido de ácido fítico. Los datos de carbohidratos
se muestran en la Tabla 10 y los datos de ácido fítico en la Tabla
11.
| \begin{minipage}[t]{155mm} Promedio, desviación estándar (SD) y dos desviaciones estándar (2SD) del promedio para el contenido de estachiosa, rafinosa y sacarosa de la línea 4E76 conteniendo LR33 y trece muestras de cultivos selectos (Todos los valores están expresados como \mu moles g^{-1} de peso de semilla)\end{minipage} | |||||||||
| Línea | Estachiosa | Rafinosa | Sacarosa | ||||||
| Promedio | SD | 2SD | Promedio | SD | 2SD | Promedio | SD | 2SD | |
| 4E76 | 2,4 | 0,5 | 1,0 | 6,9 | 0,7 | 1,4 | 249 | 42,9 | 85,8 |
| A2514 | 44,8 | 2,7 | 5,4 | 13,0 | 2,6 | 5,2 | 138 | 9,6 | 19,2 |
| A2396 | 47,8 | 1,1 | 2,2 | 9,6 | 0,9 | 1,8 | 158 | 9,6 | 19,2 |
| A1923 | 50,2 | 2,8 | 5,6 | 8,6 | 0,5 | 1,0 | 148 | 9,4 | 18,8 |
| A2506 | 51,0 | 3,7 | 7,4 | 16,4 | 4,0 | 8,0 | 161 | 28,2 | 56,4 |
| A3322 | 54,2 | 7,3 | 14,6 | 14,0 | 2,7 | 5,4 | 147 | 27,1 | 54,2 |
| A2923 | 56,4 | 2,2 | 4,4 | 13,6 | 1,7 | 3,4 | 125 | 9,2 | 18,4 |
| A2234 | 57,2 | 9,1 | 18,2 | 16,6 | 3,4 | 6,8 | 145 | 21,2 | 42,4 |
| A1923 | 57,5 | 4,5 | 9,0 | 18,5 | 3,4 | 6,8 | 156 | 29,8 | 59,6 |
| A3313 | 61,0 | 9,7 | 19,4 | 14,4 | 3,9 | 7,8 | 172 | 37,9 | 75,8 |
| A1662 | 61,6 | 6,2 | 12,4 | 13,8 | 3,4 | 6,8 | 127 | 21,4 | 42,8 |
| A3935 | 62,8 | 9,2 | 18,4 | 11,6 | 2,1 | 4,2 | 184 | 38,7 | 77,4 |
| A2833 | 63,8 | 8,6 | 17,2 | 15,4 | 2,4 | 4,8 | 150 | 38,7 | 77,4 |
| A3510 | 68,8 | 9,4 | 18,8 | 14,2 | 1,9 | 3,8 | 160 | 33,0 | 66,0 |
| \begin{minipage}[t]{155mm} Promedio, desviación estándar y dos desviaciones estándar del promedio para el contenido de ácido fítico de la línea 4E76 conteniendo LR33 y el cultivo selecto de prueba A2872. (Todos los valores se expresaron como \mu moles g^{-1} de peso de semillas y representan los datos de los tres entornos\end{minipage} | |||
| Línea | Acido fítico | ||
| Promedio | SD | 2SD | |
| 4E76 | 12,3 | 2,4 | 4,8 |
| A2872 | 20,9 | 0,9 | 1,8 |
En comparación con los cultivos de soja selectos
que son típicos de las sojas comerciales, la línea derivada de la
LR33 es entre ocho y nueve veces menor en la masa de los sacáridos
de la rafinosa totales por gramo de peso de semilla. La masa de
ácido fítico también disminuyó en aproximadamente un 40%.
En comparación con los cultivos de soja selecta,
las líneas derivadas de LR33 son menores en la masa tanto de la
rafinosa como de la estachiosa. Mientras que el contenido en
rafinosa es sólo ligeramente menor que los valores observados en las
líneas selectas, el contenido en estachiosa es reducido de forma
importante. Es conocido que el efecto detrimental del contenido de
sacáridos de la rafinosa de la soja en la eficiencia del uso de la
energía cuando la harina de soja alimenta a animales monogástricos
es debido a la pobre digestibilidad del enlace
\alpha-galactosídico. De acuerdo con ello, una
disminución en el contenido combinado de rafinosa más estachiosa es
una medida apropiada de la digestibilidad incrementada. De hecho,
esta medida incluso puede subestimar el efecto del fenotipo
presente cuando la estachiosa contiene dos moles del enlace
\alpha-galactosídico por mol de azúcar
Es conocido que el contenido de sacáridos de la
rafinosa absoluto de sojas maduras varía en respuesta a factores
medioambientales. El efecto de la mutación presente en las líneas
derivadas de la LR33 es de magnitud suficiente para rendir el
contenido combinado de rafinosa más estachiosa de dichas líneas por
debajo de 14,5 \mumoles/g de peso de semilla y debe permanecer
siempre lejos por debajo del de las sojas de tipo salvaje crecidas
en el mismo entorno.
Es también conocido que el contenido de ácido
fítico de las semillas de soja maduras varía como respuesta a
factores medioambientales, debidos principalmente a la variación de
los niveles de fosfato asequible en el suelo. Otra vez, de nuevo, la
mutación presente en las líneas LR33 derivadas mantiene el
contenido de ácido fítico de la semilla total por debajo de 17
\mumoles/g en todos los entornos de crecimiento.
La evidencia a partir del análisis de los
metabolitos en las líneas derivadas de LR33 presentada en el
Ejemplo 2 sugiere en gran manera que la mutación LR33 causa una
disminución en la capacidad de la semilla para producir
myo-inositol.
En plantas así como en otros organismos, el
myo-inositol es producido únicamente por un esquema que
empieza con la conversión del fosfato de la
glucosa-6 a 1-fosfato de
myo-inositol en una reacción catalizada por la sintasa de
1-fosfato de myo-inositol y que acaba con la
hidrólisis del 1-fosfato por una fosfatasa del
fosfato de myo-inositol específica (ver Figura 1; F.A.
Loews, en: Inositol Metabolism in Plants (1990)
Wiley-Liss, New York, págs. 13-19).
Debido a que el ácido fítico tiene como su probable precursor al
1-fosfato de myo-inositol y debido a que el
nivel de ácido fítico está disminuido en la mutación LR33, se
caracterizaron el gen y el producto del gen para la sintasa del
fosfato de myo-inositol tanto en las plantas de tipo salvaje
como de mutante LR33.
Se preparó una biblioteca de cDNA del modo
siguiente. Se separaron embriones de soja (aproximadamente 50 mg de
peso fresco cada uno) de sus receptáculos y se congelaron en
nitrógeno líquido. Se trituraron los embriones congelados hasta un
polvo fino en presencia de nitrógeno líquido y a continuación se
extrajeron por homogenización Polytron y se fraccionaron para
enriquecer el RNA total por el método de Chirgwin y col. ((1979)
Biochemistry 18: 5294-5299).
Se enriqueció la fracción de ácido nucleico por
poli A^{+} RNA pasando el RNA total a través de una columna de
celulosa oligo-dT y fluyendo el poli A^{*} RNA con
sal tal como ha sido descrito por Goodman y col. ((1979) Meth.
Enzymol. 68: 75-90). Se sintetizó el cDNA a
partir de poli A^{+} RNA purificado utilizando un Sistema de
Síntesis de cDNA (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD) y
las instrucciones del fabricante. Se metiló el DNA resultante de
doble hebra por la metilasa de DNA EcoRI (Promega) antes de
insertar en sus terminaciones con polimerasa de DNA T4 (Bethesda
Research Laboratory) y la unión de extremos truncados a los
enlazadores fosforilados Eco RI utilizando la ligasa T4 de DNA
(Pharmacia). Se digirió el DNA de doble hebra con la enzima Eco RI,
se separó de los enlazadores en exceso por paro a través de una
columna de filtración sobre gel (SepharosA CL-4B),
y se ligó al vector lambda ZAP (Stratagene) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se empaquetó el DNA ligado en un
bacteriófago utilizando el extracto de empaquetamiento
Gigapack^{MR} (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La biblioteca de cDNA resultante se amplificó de acuerdo
con las instrucciones de Stratagene y se almacenó a -80ºC.
Siguiendo las instrucciones en el Manual del Kit
de clonación Lambda ZAP (Stratagene), se utilizó la biblioteca del
bacteriófago de cDNA para infectar las células XL1 de E.
coli y se colocaron en seis placas petri de 150 mm de diámetro
las unidades formadoras de aproximadamente 300.000 placas.
Se hicieron aumentos duplicados de las placas en
filtros de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Los
filtros se prehibridaron en 25 mL de tampón de hibridación
consistente en SSPE 6X, solución de Denhart 5X, SDS al 0,5%, sulfato
de dextrano al 5% y 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmón
desnaturalizado (Sigma ChemicalCo.) a 60ºC durante 2 h.
A continuación se hibridaron los filtros
bloqueados a una sonda radiomarcada hecha de un cDNA de
Arabidopsis thaliana que había sido identificado como una
sintasa del 1-fosfato de myo-inositol por
homología con la sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol de levadura [M.A. Johnson, (1994) Plant
Physiol. 105: 1023-1024]. Se obtuvo el clon
Arabidopsis del Arabidopsis Biological Resource Center, DNA
Stock Center, 1060 Carmak Road, Columbus, OH
43210-1002, número de clon 181C18T7113E9T7. Se
eliminó el inserto de cDNA de 1,2 kB del DNA vector por digestión
con Sal I y Not I seguido por purificación del fragmento de DNA
sobre gel de azarosa. Se marcó el fragmento purificado con
[P^{32}]dCTP con un equipo de marcaje de prímero al azar
(Bethesda Research Laboratory). Se dejaron hibridar los filtros
toda la noche bajo las mismas condiciones que las descritas para la
pre-hibridación. Se lavó el exceso de radiomarcado
de los filtros en 0,6 x SSC conteniendo el 0,1% de SDS. A
continuación se aplicaron dos lavados de aproximadamente 10 min cada
uno en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a 60ºC para eliminar el marcaje unido
de forma no específica y se utilizaron los filtros para exponer
película fotográfica en una exposición de toda la noche. Se
observaron aproximadamente 200 señales positivas. Seis se
purificaron por escisión del área alrededor de la señal, colocando
el bacteriófago de nuevo en placas y seleccionando de nuevo como
anteriormente. Se escindieron dos clones a fágmidos y se utilizaron
para infectar la E. coli para obtener clones plásmidos
utilizando los protocolos descritos por el fabricante (Strategene).
De los dos clones, se secuenció el designado como
p5bmi-1-ps utilizando la
metodología y el equipo de Applied Biological Instruments. En la SEC
de ID NO: 1 se muestra la secuencia de nucleótidos del inserto de
cDNA en p5bmi-1-ps y la secuencia
de amino ácidos deducida codificada por dicha secuencia en la SEC
de ID NO: 2.
Se cosecharon semillas de las plantas de LR33
numeradas 11,16 y 20 y descritas en el Ejemplo 3 (ver Tabla 8) a
aproximadamente el 50% a través del periodo de llenado de semillas,
separadas del receptáculo y almacenadas de forma congelada a -80ºC.
Para el aislamiento del mRNA, se trituraron 2 g de semillas
congeladas de la población de semillas en grueso en nitrógeno
líquido en un mortero y mano de mortero.
Se trituró otra vez el polvo congelado en 10 mL
de tampón de extracción de RNA total que consistió en 10 mM de
Tris-HCl, pH 9, 10 mM de EDTA, 0,5% de CTAB (bromuro
de cetiltrimetil amonio), 0,8 M de NaCl, 1% de
2-mercaptoetanol, y 2% de polivinilpirrolidona. Se
trató el agua para todos los reactivos con 0,05% de
dietilpirocarbamato durante 30 min y a continuación en el
autoclave. Se transfirió la pasta del tejido a un tubo de
polipropileno de 15 mL y se centrifugó a 5.500 x g durante 15 min.
Se pasó el sobrenadante a través de Miracloth (Calbiochem) en un
segundo tubo de polipropileno y se añadieron 0,3 volúmenes de
cloroformo. Se separaron las fases por centrifugación a 5.500 x g
durante 10 min y se transfirió la fase superior a otro tubo de
polipropileno al que se añadieron 1,5 volúmenes de
Tris-HCl 10 mM pH 9, 10 mM de EDTA, 0,5% de CTAB y
0,1% de 2-mercaptoetanol. Después de incubación a 30
min a temperatura ambiente se precipitaron los ácidos nucleicos por
centrifugación a 5.500 x g durante 20 min.
Se disolvieron de nuevo los ácidos nucleicos en
0,4 mL de NaCl 1 M conteniendo 0,1% de
2-mercaptoetanol. Después de extracción con un
volumen de fenol:cloroformo 1:1, se precipitaron los ácidos
nucleicos con dos volúmenes de etanol.
Se purificó el mRNA de esta fracción de ácido
nucleico utilizando el kit de purificación de mRNA de Pharmacia. Se
obtuvieron aproximadamente 12 \mug de mRNA. Se utilizaron 13 ng
del mRNA poliadenilado como modelo para la amplificación a partir
de oligo-dT utilizando un kit de
RNA-PCR GeneAmp® (Perkin Elmer CETUR, part no.
N808-0017). Se llevó a cabo la reacción de la
transcriptasa reversa durante 30 min a 42ºC. Para la amplificación
de la PCR, se sustituyó la polimerasa del DNA Vent^{MR} (New
England Biolabs) por la polimerasa del DNA proporcionada por el
fabricante del kit y se añadieron 2 \muL adicionales de sulfato
de magnesio 100 mM a cada 100 \muL de reacción. El prímero 5'
tuvo la secuencia mostrada en la SEC de ID NO: 3 y consiste en las
bases 57 a 77 en la SEC de ID NO: 1 con las bases adicionales
5'-GGGAATTCCATATG-3' añadidas para
codificar un sitio Nde I en el prímero con ocho bases 5'
adicionales para incrementar la actividad de la enzima de
restricción frente la secuencia.
El prímero 3' tuvo la secuencia que se muestra en
la SEC de ID NO: 4 y consiste en el complemento reverso de las
bases 1566 a 1586 en la SEC de ID NO: 1 con las bases adicionales
5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGC-3' añadidas
para proporcionar un sitio Not I en el prímero y diez bases
adicionales para intensificar la digestión de restricción. La
reacción de la PCR se llevó a cabo durante 35 ciclos a una
temperatura de reasociación de 52ºC y un tiempo de extensión de 1,5
min. Se obtuvo un producto de aproximadamente 1550 bases y se
purificó por paso a través de un filtro de microfuga Amicon 50
seguido por extracción con un volumen igual de fenol:cloroformo
1:1, extracción de la capa superior de la separación
fenol:cloroformo con un volumen de cloroformo y precipitación con
etanol. Se digirieron cinco \mug del producto resultante de la
PCR limpia durante toda la noche a 37ºC tanto con Nde I como con
Not I. El digerido de la enzima de restricción fue
des-proteinizado por el procedimiento de extracción
en fenol:cloroformo anteriormente descrito y ligado en 2 \mug
del vector de expresión pET24aT7 (Novogen) que también ha sido
digerida con Nde I y Not I y tratado con fosfatasa alcalina de
intestino de ternero para hidrolizar los fosfatos terminales. Se
utilizó la mezcla ligada para transformar las células de E.
coli DH 10B electrocompetante y se seleccionaron los
transformantes por crecimiento en placas conteniendo 30 mg l^{-1}
de kanamicina. Se tomaron dieciocho colonias de la placa de
transformación y se situaron en 100 \muL de agua estéril. Se
utilizaron cuarenta \muL de la mezcla de células como el modelo
de DNA en una reacción de la PCR llevada a cabo con polimerasa
Taq^{MR} (Perkin Elmer) utilizando los prímeros u las condiciones
de la PCR que fueron utilizadas inicialmente para aislar el inserto
de cDNA. Seis colonias sirvieron como modelo para amplificar un
producto del tamaño correcto. Los restantes 60 \muL de la mezcla
de células a partir de estos clones se hicieron crecer en un
cultivo toda la noche y se hicieron las preparaciones de DNA del
plásmido de cada clon. El plásmido purificado de cada uno de los
seis clones se utilizó para transformar células de E. coli
de DE 3 electrocompetante.
Se situó la sintasa del 1-fosfato
de myo-inositol de soja de tipo salvaje en el vector de
expresión pET24aT7 por amplificación de la PCR de
p5bmi-1-ps utilizando los prímeros
en la SEC de ID NO:3 y la SEC de ID NO: 4, y la amplificación de la
PCR y el protocolo de clonación descrito anteriormente para clonar
la sintasa del 1-fosfato de myo-inositol de
LR33 a partir del mRNA transcrito. En este caso, se agruparon las
preparaciones de plásmido de nueve clones DH 10B que mostraron que
contenían plásmido con el inserto de cDNA y se utilizaron para
transformar células de E. coli DE 3 electrocompetantes.
Se seleccionaron las colonias resistentes a la
kanamicina y se escogieron seis para la inoculación de cultivos
durante toda la noche. Los cultivos durante toda la noche se
hicieron crecer a 30ºC en un medio de LB con 30 mg l^{-1} de
kanamicina, se diluyeron dos veces con medios frescos, se dejaron
crecer de nuevo durante 1 h, y se indujeron por adición de
isopropil-tiogalactósido hasta una concentración
final 1 mM.
Las células se obtuvieron por centrifugación
después de 3 h y se suspendieron de nuevo en 50 \muL de
Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 conteniendo DTT 0,1 mM y
fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM. Se añadió una pequeña
cantidad de bolitas de vidrio de 1 mm y la mezcla se sometió a
sonicación tres veces durante aproximadamente cinco segundos cada
vez con un sonicador de microsonda. Se centrifugó la mezcla y se
determinó la concentración de proteína del sobrenadante. Se separó
un \mug de proteína a partir de la fracción soluble de cada
cultivo clonal por SDS-PAGE. Se seleccionaron para
el ensayo de actividad los cultivos que produjeron una banda de
proteína de adición de aproximadamente 60 kilodaltons en masa.
Para el ensayo, se preparó
[P^{33}]glucosa-6-fosfatasa
por la fosforilación de la glucosa catalizada por la hexoquinasa
utilizando [P^{33}]-\gamma-ATP
como el donador de fosfato. Después de 30 min a temperatura
ambiente, se pasó la mezcla de reacción a través de una columna de
C18 SEP-PAC (MilliPore Corp. Milford, MA) que había
sido lavada en primer lugar con metanol del 80% y después con agua.
Se recogió el pasado a través de la columna junto con unos 0,5 mL
adicionales y se pasó a través de una columna
SEP-PAC SAX que había sido lavada a continuación
con 1 mL de metanol al 80%. Se eluyó la
[P^{33}]-glucosa-6-fosfato
con 2 mL de HCl 0,02N en metanol del 80%. Se añadieron cuarenta
\muL de Tris base 1 M y se eliminó el metanol a vacío. Se
determinó la concentración de la
glucosa-6-fosfato de la solución
restante por su conversión a ácido
6-fosfoglucurónico por la deshidrogenasa de la
glucosa-6-fosfato. Se cuantificó el
NADPH producido en la reacción por absorbancia a 340 nm.
Se incubaron diez \muL de los extractos de las
células a 37ºC durante 30 min en reacciones de 100 \muL que
fueron 2 mM en glucos-6-fosfato
(57,334 dpm P^{33} total), 0,1 mM en NAD, y 15 mM en acetato
amónico. Se calentaron las reacciones a 90ºC para precipitar la
proteína, se centrifugaron hasta que la solución fue clara. Se
aplicaron cuarenta y siete \muL del sobrenadante a una columna
Dionex^{MR} PA-1 que se eluyó a 0,9 ml min^{-1}
con NaOH 0,1 N y acetato sódico 0,1 N. Los estándares de
1-fosfato de myo-inositol se fluyeron entre
8 y 10 min después de la inyección y se tomaron mezclas de reacción
separadas durante un intervalo de tiempo para contaje por
centelleo. Se sumó la radioactividad en las fracciones pico para
obtener la conversión de la
glucosa-6-fosfato a
1-fosfato de myo-inositol y en la Tabla 12
se muestran los resultados para un cultivo DE 3 de E. coli
control conteniendo un vector pET24aT7 vacío y para dos clones
conteniendo el cDNA de la sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol.
| \begin{minipage}[t]{155mm} La actividad específica (\mu moles de 1-fosfato de \mathit{myo}\text{-}inositol produce min^{-1} mg proteína^{-1}) para tres extractos de cultivos de células de E. coli (Clones de soja 1 y 2 contienen la sintasa del 1-fosfato de \mathit{myo}\text{-}inositol mientras que el control contiene un plásmido vacío)\end{minipage} | ||
| Línea | Actividad específica | |
| Control | 0,024 \mumol min^{-1} mg^{-1} | |
| Clon 1 de soja | 0,524 \mumol min^{-1} mg^{-1} | |
| Clon 2 de soja | 0,892 \mumol min^{-1} mg^{-1} |
Tal como se lleva a cabo el ensayo, tanto los
clones conteniendo cDNA utilizaron esencialmente todo el sustrato
disponible y por consiguiente fueron más de 35 más activos que la
línea control. Por consiguiente el gen de la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol es capaz de
producir una enzima funcional en E. coli.
El clon número 1 de la sintasa del
1-fosfato del myo-inositol de la soja de
tipo salvaje (Clon de soja 1) y tres de los clones de la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de LR33 se
hicieron crecer para la expresión de la proteína tal como se ha
descrito anteriormente. Se separaron cinco \mug de proteína del
extracto de células soluble de cada clon por
SDS-PAGE. El clon de LR33 número 10
(LR33-10) produjo una proteína de 60 kilodaltons en
esencialmente la misma abundancia que lo hizo el clon número 1 de
tipo salvaje. Se ensayaron cuatro \mug de proteína de cada uno de
los dos extractos para determinar la actividad de la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol por el método
descrito anteriormente utilizando 100 \muL de reacción que fue 3
\mum en NAD y 90 \mum en
glucosa-6-fosfato. La actividad
específica de la sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol de tipo salvaje fue de 1,5 nmol min^{-1} mg
proteína^{-1} bajo estas condiciones mientras que la actividad
específica de la sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol derivado de LR33 fue de 0,16 nmol min^{-1} mg
proteína^{-1}.
Se determinó la secuencia de nucleótidos del
inserto de cDNA en el clon LR33-10 (conteniendo el
fragmento de ácido nucleico que codifica la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de LR33) utilizando
la cepa de E. coli DH 10 B de dicho clon como la fuente de
plásmido y secuenciando el DNA tal como se ha descrito para el clon
de tipo salvaje. La secuencia de nucleótidos se muestra en la SEC
de ID NO: 5 y la secuencia de amino ácidos deducida obtenida del
bloque de lectura de dicho clon en la SEC de ID NO:6. La SEC de ID
NO:5 difiere por un único cambio de par de bases de G a T en la
hebra de codificación al número de base 1241 de la SEC de ID NO: 1.
Dicho cambio proviene de un cambio de número de amino ácido 396 de
lisina en la secuencia de tipo salvaje (SEC de ID NO: 2) a
aspargina en la secuencia de amino ácidos de LR33 (SEC de ID
NO:6).
Para confirmar que el cambio de base dio lugar a
un cambio en el genoma de LR33 más que a un error generado por la
PCR que puedo haber ocurrido durante la clonación de la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de LR33, se
prepararon dos grupos de prímeros de la PCR. Se utilizaron el
prímero de tipo salvaje (SEC de ID NO: 7) y el prímero de LR33 (SEC
de ID NO: 8) para amplificar el DNA genómico preparado a partir de
semillas secas de cultivo de soja A2872 y del clon número 16 de la
línea LR33 se soja (ver Tabla 8). El prímero de la PCR descrito en
la SEC de ID NO: 4 se utilizó como el prímero de la hebra
antisentido común. A las temperaturas de desnaturalización térmica
de 62ºC o de 64ºC y 35 ciclos de desnaturalización y elongación,
sólo el prímero de tipo salvaje produjo un producto de la PCR
cuando se utilizó el DNA A2872 como un como una plantilla y sólo el
prímero correspondiente a la secuencia de la LR33 produjo un
producto cuando se utilizó el DNA de la LR33 como plantilla.
Para comprobar de forma adicional la
especificidad de los prímeros para la detección de la mutación, se
preparó el DNA a partir de seis plantas únicas crecidas a partir de
semillas de la línea número 7 del clon LR33 segregante descrito en
el Ejemplo 3 (ver Tabla 8). De las seis plantas ensayadas de la
población segregante, dos dieron DNA que actuó como plantilla para
ambos prímeros, tres dieron DNA que actuó como un prímero sólo con
el prímero de tipo salvaje, y uno dio DNA que produjo un producto
sólo con el prímero del LR33. Estos son los resultados esperados de
una población que contiene heterocigotos que contienen un tipo
salvaje y una copia mutante del gen.
A partir de los datos de metabolitos y de la
secuencia de datos, concluimos que los fenotipos de semillas
observados, con azúcares de sacáridos de la rafinosa total muy
bajos, sacarosa muy alta y bajo ácido fítico, son todos debidos a la
mutación del cambio de base descrita por la comparación de las
secuencias de LR33 y de tipo salvaje que se muestran en la SEC de
ID No. 1 y en la SEC de ID NO: 5.
Se construyeron los plásmidos que contienen la
secuencia de cDNA de la sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol de soja orientado con sentido o antisentido bajo
control del promotor del Inhibidor 3 de Kunitz Trypsin (KTi3)
[Jofuku y Goldberg, (1989) Plant Cell I:
1079-1093], el promotor de la proteína de
almacenaje de la semilla de Phaseolus vulgaris 7S (faseolina)
[Sengupta-Gopalan y col., (1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82: 3320-3324; Hoffman y col.,
(1988) Plant Mol. Biol. 11: 717-729] y el
promotor de \beta-conglycinina de soja [Beachy y
col., (1985) EMBO J. 4: 3047-3053]. La
construcción de los vectores que expresan el cDNA de la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol bajo el control de
estos promotores es facilitada por el uso de los siguientes
plásmidos: pML70, pCW108 y pCW109A.
El vector pML70 contiene el promotor KTi3 y la
región no traducida KTi3 3' y se derivó del vector comercialmente
asequible pTZ18R (Pharmacia) a través de los plásmidos intermedios
pML51, pML55, pML64 y pML65. Un fragmento Bst BI/Eco RI de 2,4 kb
del gen KTi3 de soja completo [Jofuku y Goldberg supra], que
contiene todos los 2039 nucleótidos de la región 5' no traducida y
390 bases de la secuencia de codificación del gen KTi3 que codifica
en el sitio Eco RI correspondiente a las bases 755 y 761 de la
secuencia descrita en Jofuku y col., (1989) Plant Cell 1:
427-435, se ligó en los sitios Acc I/Eco RI del
pTZ18R para crear el plásmido pML51. Se cortó el plásmido pML51 con
NcoI, se insertó utilizando Klenow, y se unió de nuevo, para
destruir un sitio Nco I en medio de la región 5' no traducida del
inserto KTi3, dando lugar al plásmido pML55. El plásmido pML55 fue
parcialmente digerido con Xmn I/Eco RI para liberar un fragmento de
0,42 kb, correspondiente a las bases 732 a 755 de la secuencia
citada anteriormente, que se rechazó. Se construyó un fragmento de
unión sintético Xmn I/Eco RI conteniendo un sitio Nco I, preparando
un dímero de los oligonucleótidos sintéticos complementarios,
consistiendo en la secuencia de codificación para un sitio Xmn I
(5'-TCTTCC-3') y un sitio Nco
I.(5'-CCATGGG-3') seguido
directamente por parte de un sitio Eco RI
(5'-GAAGG-3'). Los sitios Xmn I y
Nco I/Eco RI se unieron por una corta secuencia de intervención
(5'-ATAGCCCCCCAA-3'). Este fragmento
de unión sintético estuvo unido en los sitios Xmn I/Eco RI del
fragmento de 4,94 kb para crear el plásmido pML64. La región no
traducida 3' del gen KTi3 fue amplificada a partir de la secuencia
descrita en Jofuku y col, [supra] por protocolos de la PCR
estándar (Perkin Elmer CETUR, kit GeneAmp PCR) utilizando los
prímeros ML51 y ML52. El prímero ML51 contuvo los 20 nucleótidos
correspondientes a las bases 1072 a 1091 de la secuencia
anteriormente citada con la adición de los nucleótidos
correspondientes a los sitios Eco RV
(5'-GATATC-3'), Nco I
(5'-CCATGG-3'), Xba I
(5'-TCTAGA-3'), Sma I
(5'-CCCGGG-3') y Kpn I
(5'-GGTACC-3'). El fragmento de
unión se ligó en el sitio Pst I (directamente 5' a la región del
promotor KTi3) del pML65 para crear el plásmido pML70.
El vector pCW108 contiene el promotor de
faseolina de semilla y la región no traducida 3' y se derivó del
plásmido pUC18 comercialmente disponible
(Gibco-BRL) a través de los plásmidos AS3 y pCW104.
El plásmido AS3 contiene los pares de bases 495 del promotor de
faseolina (proteína de almacenamiento de la semilla 7S) de la
semilla (Phaseolus vulgaris) empezando con
5'-TGGTCTTTTGGT-3' seguido por los
pares de bases 1175 enteros de la región no traducida 3' del mismo
gen [ver descripciones de secuencia en Doyle y col., (1986) J.
Biol. Chem. 261: 9228-9238 y Slightom y col.,
(1983) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80:
1897-1901; la descripción de la secuencia adicional
puede encontrarse en la publicación de la patente mundial WO
911/3993] clonado en el sitio Hind III de pUC18. Los sitios de
clonación adicionales de la región de clonaje múltiple pUC18 (Eco
RI, Sph I, Pst I y Sal I) fueron eliminados por digestión con Eco
RI y Sal I, insertando en las terminaciones con Klenow y uniendo de
nuevo para dar lugar al plásmido pCW104. Se creó un nuevo sitio de
clonación múltiple entre la faseolina 5' de 495 bp y la faseolina 3'
de 1175 bp mediante el inserto de un dímero de oligonucleótidos
sintéticos complementarios que consiste en la secuencia de
codificación para el sitio Nco I
(5'-CCATGG-3') seguido por tres
bases insertadas (5'-TAG-3'), la
secuencia de codificación para un sito Sma I
(5'-CCCGGG-3'), las tres últimas
bases de un sitio KpnI (5'-TAC-3'),
una citosina y una secuencia de codificación para un sitio Xba I
(5'-TCTAGA-3') para crear el
plásmido pCW108. Este plásmido contiene solamente los sitios Nco I,
Sma I, Kpn I y Xba I directamente cerca del promotor de
faseolina.
El vector pCW109A contiene la secuencia del
promotor de \beta-conglicinina de soja y la
región no traducida 3' de faseolina y es una versión modificada del
vector pCW109 que se derivó del plásmido pUC18 comercialmente
asequible (Gibco-BRL). El vector pCW109 se preparó
por inserción en el sitio Hind III del vector de clonación pUC18 una
región no codificante 5' de 555 bp (conteniendo la región del
promotor) del gen de \beta-conglicinina seguido
por la secuencia de clonación múltiple que contiene los sitios de
endonucleasa de restricción para Nco I, Sma I, Kpn I y Xba I, tal
como se ha descrito anteriormente para el pCW108, después 1174 bp
de la región no traducida 3' de la faseolina de la semilla común en
el sitio Hind III (descrito anteriormente).
La región del promotor de la
\beta-conglicina utilizada en un alelo del gen de
\beta-conglicina publicado [Doyle y col., (1986)
J. Biol. Chem. 261: 9228-9238] debido a las
diferencias en 27 posiciones de nucleótidos. Una descripción de la
secuencia adicional de este gen puede encontrarse en la publicación
de la patente mundial WO 91/13993.
Estas tres construcciones de ácido nucleico
constituyen vectores de expresión específicos de semillas con
expresión sobre un amplio periodo de desarrollo incluyendo el
periodo de síntesis del myo-inositol para la conversión
subsiguiente a ácido fítico. La inserción de las secuencias
descritas en la SEC de ID NO: 1 y la SEC de ID NO: 5 en estos
vectores es facilitada por los métodos de la PCR descritos en el
anterior Ejemplo 5. Los prímeros de la PCR que son complementarios
a las regiones seleccionadas de la SEc de ID NO: 1 o la SEC de ID
NO: 5 pueden ser sintetizados con bases adicionales que constituyen
las secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de
restricción seleccionadas entre aquellas que también se rompen en
múltiples secuencias de clonación siguiendo las secuencias del
promotor de pML 70, pCW108 y pCW109. La situación de los sitios de
restricción puede ser seleccionada de modo que dirija la
orientación del fragmento de nucleótido desde la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de soja en la
orientación con sentido para conseguir tanto la
sobre-expresión como la co-supresión
o en la orientación antisentido para conseguir la sub
expresión.
Se utilizaron las siguientes soluciones de
almacenaje y medios para apoyar el crecimiento de los tejidos de
soja in vitro:
| Sulfato MS (100X reserva) | Haluros MS (100X reserva) | ||
| (g/L) | (g/L) | ||
| MgSO_{4} 7H_{2}O | 37,0 | CaCl_{2} 2H_{2}O | 44,0 |
| MnSO_{4} H_{2}O | 1,69 | KI | 0,083 |
| ZnSO_{4} 7H_{2}O | 0,86 | CoCl_{2} 6H_{2}O | 0,00125 |
| CuSO_{4} 5H_{2}O | 0,0025 | KH_{2}PO_{4} | 17,0 |
| H_{3}BO_{3} | 0,63 | ||
| Na_{2}MoO_{4} 2H_{2}O | 0,025 |
| Vitamina B5 | FeEDTA MS (100X reserva) | ||
| (g/L) | (g/L) | ||
| myo-inositol | 10,0 | Na_{2}EDTA | 3,72 |
| ácido nicotínico | 0,10 | FeSO_{4} 7H_{2}O | 2,784 |
| piridoxina HCl | 0,10 |
| Componente (por litro) | SB55 | SBP6 | SN103 | SB71-1 |
| Sulfato MS de reserva | 10 mL | 10 mL | 10 mL | - |
| Haluros MS de reserva | 10 mL | 10 mL | 10 mL | - |
| FeEDTA MS de reserva | 10 mL | 10 mL | 10 mL | - |
| Vitamina B5 de reserva | 1 mL | 1 mL | - | 1 mL |
| 2,4-D de reserva (10 mg/ml) | 1 mL | 0,5 mL | - | - |
| Sacarosa | 60 g | 60 g | - | 3% |
| Maltosa | - | - | 6% | - |
| Asparagina | 0,667 g | 0,667 g | - | - |
| NH_{4}NO | 0,8 g | 0,8 g | - | |
| KNO_{3} | 3,033 g | 3,033 g | - | - |
| MgCl_{2} | - | - | 750 mg | 750 mg |
| Gelrite | - | - | 0,2% | 0,2% |
| pH | 5,7 | 5,7 | 5,7 | 5,7 |
Los cultivos de suspensión embriogénica de soja
se mantuvieron en 35 mL de medios líquidos (SB55 o SBP6) en un
agitador rotatorio, 150 rpm, a 28ºC con luces fluorescentes e
incandescentes mezcladas en un programa de día/noche de 16:8 h. Los
cultivos se subcultivaron cada cuatro semanas por inoculación de
aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mL de medio líquido.
Los cultivos de suspensión embriogénica de soja
pueden ser transformados con vectores de expresión específica de
semillas conteniendo tanto la sintasa del 1-fosfato
de myo-inositol orientada con sentido como antisentido por el
método de bombardeo de disparo de partículas (ver Kline y col.
(1987) (London) 327: 70). Se utilizó un instrumento
DuPont Biolistic^{MR} PDS 1000/HE (retroequipado con helio) para
estas transformaciones.
Se añadieron a 50 mL de una suspensión de
partículas de oro de 1 \mum de 60 mg/mL (en orden): 5 \muL de
DNA (1 \mug/\muL), 20 \muL de espermidina (0,1 M), y 50
\mul de CaCl_{2} (2,5 M). Se agitó la preparación de partículas
durante 3 min, que se hizo girar en una microfuga durante 10 seg y
se separó el sobrenadante. A continuación se lavaron las partículas
recubiertas de DNA una vez en 400 \muL de etanol al 70% y se
suspendieron de nuevo en 40 \muL de etanol anhidro. La suspensión
de partículas/DNA se somete a sonicación tres veces durante 1 seg
cada vez. A continuación se cargaron cinco \muL de las partículas
de oro recubiertas de DNA en cada disco de soporte macro.
Se colocaron aproximadamente
300-400 mg de un cultivo de suspensión de cuatro
semanas en una cápsula de petri de 60 x 15 mm vacía y se eliminó
líquido residual del tejido con una pipeta. Para cada experimento
de transformación, se bombardearon normalmente 5-10
placas de tejido aproximadamente. La presión de ruptura de la
membrana se estableció a 100 psi y se evacuó la cámara a un vacío
de 28 pulgadas de mercurio. Se situó el tejido aproximadamente 3,5
pulgadas fuera de la criba de retención y se bombardearon tres
veces. Después del bombardeo, se situó el tejido en líquido y se
cultivó tal como se ha descrito anteriormente.
Once días después del bombardeo, se intercambió
los medios líquidos con SB55 recién preparado conteniendo 50 mg/mL
de higromicina. A continuación, se prepararon de nuevo los medios
selectivos cada semana. Siete semanas después del bombardeo, se
observó el crecimiento del tejido transformado verse a partir de
las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. Se
separó el tejido verde aislado y se inoculó en frascos individuales
para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos
transformados, propagados de forma clonal. Estas suspensiones pueden
ser mantenidas a continuación como suspensiones de embriones
agrupados en un estado de desarrollo inmaduro a través del
subcultivo o regenerados en plantas enteras por maduración y
germinación de los embriones somáticos individuales.
Las agrupaciones embriogénicas transformadas se
separan del cultivo líquido y se sitúan en un medio de agar sólido
(SB103) que no contiene ni hormonas ni antibióticos. Los embriones
son cultivados durante ocho semanas a 26ºC con una mezcla de luces
fluorescentes e incandescentes en un programa de día/noche de 16:8
h. Durante este periodo, los embriones individuales pueden ser
separados de las agrupaciones y analizados en varias etapas del
desarrollo embrionario. Después de ocho semanas los embriones
somáticos se hacen adecuados para la germinación. Para la
germinación, se separaron los embriones de ocho semanas del medio
maduro y se secaron en placas de petri vacías durante entre 1 y 5
días. A continuación los embriones secados se plantaron en un medio
SB71 I en el que se dejaron germinar bajo las mimas condiciones de
iluminación y germinación descritas anteriormente. Los embriones
germinados pueden ser transferidos a continuación a un suelo
estéril y crecidos hasta madurez para la recogida de las
semillas.
Aunque en el estado embrionario globular en el
cultivo líquido tal como se ha descrito anteriormente, los
embriones de soja somática contienen cantidades muy pequeñas de
triacilglicerol o reservas de las proteínas típicas de la madurez,
embriones de soja cigóticos. En este estado del desarrollo, la
relación de triglicéridos totales respecto a los lípidos polares
totales (fosfolípidos y glicolípidos) es de aproximadamente 1:4, tal
como es típico de los embriones de soja cigótica al estado de
desarrollo a partir del que se inició el cultivo de embriones
somáticos. Igualmente en el estado globular, los mRNAs para las
proteínas de semillas prominentes (subunidad \alpha' de
\beta-conglicina, Inhibidor de Tripsina de
Kunitz 3 y Lectina de semillas de Soja) están esencialmente
ausentes. Con la transferencia a los medios libres de hormonas para
permitir la diferenciación al estado embrionario somático maduro
tal como se ha descrito anteriormente, el triacilglicerol se hace la
clase de lípido más abundante. Del mismo modo, los mRNAs para la
subunidad \alpha' de la \beta-conglicina,
Inhibidor de tripsina de Kunitz 3 y Lectina de Semilla de Soja se
hace muy abundante en mensajes en la población de mRNA total. En
estos aspectos el sistema embrionario de soja somático se comporta
de forma muy similar a los embriones de soja cigóticos maduros in
vivo. Durante el periodo de maduración inicial los principales
carbohidratos solubles presentes en los embriones somáticos son
sacarosa, glucosa y maltosa (el azúcar proporcionado durante la fase
de maduración). A medida que el embrión somático madura y empieza a
volverse amarillo, se forman tanto la rafinosa como la estachiosa.
En este respecto así como en el fenotipo de los embriones
somáticos, éste es muy similar al de los embriones cigóticos tal
como está en las últimas etapas del desarrollo de la semilla. De
este modo la selección de embriones que son transformados con los
vectores de expresión específicos de la semilla que dirigen la
expresión de las secuencias de nucleótidos descritos en la SEC de
ID NO:1 o en la SEC de ID Nº: 5 tanto en la orientación con sentido
como en la antisentido y que producen cantidad reducida de rafinosa
y de estachiosa debe conducir a la regeneración de plantas de soja
maduras, fértiles que tienen semillas con el mismo fenotipo.
(1) GENERAL INFORMATION:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- APPLICANT: HITZ, WILLIAM D
\hskip3.6cmSEBASTIAN, SCOTT ANTHONY
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITLE OF INVENTION: SOYBEAN PLANTS PRODUCING SEEDS WITH
\hskip5.2cmREDUCED LEVELS OF RAFFINOSE
\hskip5.2cmSACCHARIDES AND PHYTIC ACID
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMBER OF SEQUENCES: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CORRESPONDENCE ADDRESS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ADDRESSEE: E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- STREET: 1007 MARKET STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CITY: WILMINGTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- STATE: DELAWARE
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- COUNTRY: UNITED STATES OF AMERICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 19898
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- COMPUTER READABLE FORM:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- MEDIUM TYPE: DISKETTE, 3.50 INCH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTER: IBM PC COMPATIBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OPERATING SYSTEM: MICROSOFT WINDOWS 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: MICROSOFT WORD FOR WINDOWS 95 (7.0)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- CURRENT APPLICATION DATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- APPLICATION NUMBER:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FILING DATE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASSIFICATION:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NAME: MAJARIAN, WILLIAM R.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- REGISTRATION NUMBER: P41,173
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCE/DOCKET NUMBER: BB-1077
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- TELECOMMUNICATION INFORMATION:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELEPHONE: (302)992-4926
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (302)773-0164
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGTH: 1782 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: nucleic acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: double
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HYPOTHETICAL: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENSE: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGINAL SOURCE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISM: Soybean line LR13
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- IMMEDIATE SOURCE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLONE: p5bmi-1-ps
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- FEATURE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NAME/KEY: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCATION: 54..1586
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGTH: 510 amino acids
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: amino acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: protein
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGTH: 35 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: nucleic acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: single
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: DNA (oligonucleotide)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAATTCCA TATGTTCATC GAGAATTTTA AGGTT
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGTH: 39 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: nucleic acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: single
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: DNA (oligonucleotide)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGGAAAAAA GCGGCCGCTC ACTTGTACTC GAGAATCAT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGTH: 1775 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: nucleic acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: double
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HYPOTHETICAL: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENSE: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGINAL SOURCE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISM: Soybean line LR33
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- IMMEDIATE SOURCE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLONE: LR33-10
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- FEATURE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NAME/KEY: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCATION: 1..1533
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- FEATURE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NAME/KEY: POINT MUTATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCATION: 1188
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGTH: 510 amino acids
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: amino acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: single
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: protein
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGTH: 16 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: nucleic acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: single
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: Synthetic ogligonucleotide
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTAGGGGAC AGCAAG
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SEQUENCE CHARACTERISTICS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGTH: 16 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: nucleic acid
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: single
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULE TYPE: Synthetic oligonucleotide
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTAGGGGAC AGCAAT
\hfill16
Claims (6)
1. Una planta de soja homocigótica para al menos
un gen que codifica una sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol mutante, teniendo el gen una mutación en la
secuencia de SEC de ID NO: 1, teniendo la sintasa del
1-fosfato de myo-inositol mutante una
actividad enzimática reducida cuando se compara con una sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de tipo salvaje, el
gen que confiere un fenotipo hereditario de (i) un contenido de
ácido fítico de las semillas de menos de 17 \mumol/g, (ii) un
contenido de rafinosa más estachiosa en la semilla combinado con
menos de 14,5 \mumol/g, y (iii) un contenido de sacarosa en la
semilla de más de 200 \mumol/g, siempre que la planta no sea LR33
(depositada en la ATCC bajo el número de acceso No. 97988).
2. Una planta de soja de acuerdo con la
reivindicación 1 en la que el gen tiene la secuencia de la SEC de ID
NO: 5 o el gen codifica una sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol de la SEC de ID NO: 6.
3. Una planta de soja que tiene el fenotipo de la
planta de soja de la reivindicación 1 que comprende un gen quimérico
seleccionado entre el grupo que consiste en:
(i) un gen quimérico que comprende un fragmento
de ácido nucleico aislado que codifica una sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de la SEC de ID NO:
2 o el complemento del fragmento de ácido nucleico que codifica una
sintasa del 1-fosfato de myo-inositol de la
SEC de ID NO: 2, unida de forma operable a las secuencias
reguladoras adecuadas, en las que la expresión del gen quimérico da
lugar a la actividad enzimática reducida de un gen nativo que
codifica una sintasa del 1-fosfato de
myo-inositol de soja cuando se compara con una soja que no
tenga el gen quimérico; y
(ii) un gen quimérico que comprende un
subfragmento de un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica
una sintasa del 1-fosfato de myo-inositol de
la SEC de ID NO: 2 o el complemento de un subfragmento de un
fragmento de ácido nucleico aislado que codifica una sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de soja de la SEC
de ID NO: 2, en donde la expresión del gen quimérico da lugar a una
actividad enzimática reducida de un gen nativo que codifica una
sintasa del 1-fosfato de myo-inositol de soja
cuando se compara con una soja que no tenga el gen quimérico.
4. Semillas de la planta de soja de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde dichas semillas
contienen (i) un contenido de ácido fítico de la semilla de menos de
17 \mu (ii) un contenido de rafinosa más estachiosa combinado en
la semilla de menos de 14,5 \mumol/g y (iii) un contenido en
sacarosa en la semilla de más de 200 \mumol/g.
5. Un método para producir un producto de
proteína de soja que comprende procesar las semillas de la
reivindicación 4 para obtener el producto de proteína de soja
deseado.
6. Un método para la producción de un producto de
proteína de soja obtenible a partir de semillas de una planta de
soja homocigótica para al menos un gen que codifique una sintasa del
1-fosfato de myo-inositol que tenga una
actividad enzimática reducida cuando se compara con una sintasa del
1-fosfato de myo-inositol de tipo salvaje,
confiriendo el gen un fenotipo hereditario de (i) un contenido de
ácido fítico en la semilla de menos de 17 \mumol/g, (ii) un
contenido de rafinosa más estachiosa combinado en la semilla de
menos de 14,5 \mumol/g, y (iii) un contenido de sacarosa en la
semilla de más de 200 \mumol/g que comprende:
(a) cruzar una planta de soja agronómicamente
selecta con LR33 (depositada en la ATCC bajo el número de acceso No.
97988) o cualquiera de las plantas de soja de la reivindicación 1 o
3,
(b) seleccionar la semilla de las plantas
progenie obtenidas de la etapa (a) para (i) un contenido de ácido
fítico de menos de 17 \mumol/g, (ii) un contenido de rafinosa más
estachiosa combinadas en la semilla de menos de 14,5 \mumol/g, y
(iii) un contenido de sacarosa en la semilla de más de 200
\mumol/g; y
(c) procesar la semilla seleccionada en la etapa
(b) para obtener el producto de proteína de soja deseado.
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