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CN1252098A - 产生具有降低的棉子糖类和植酸水平之种子的大豆植物 - Google Patents

产生具有降低的棉子糖类和植酸水平之种子的大豆植物 Download PDF

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CN1252098A
CN1252098A CN98804008A CN98804008A CN1252098A CN 1252098 A CN1252098 A CN 1252098A CN 98804008 A CN98804008 A CN 98804008A CN 98804008 A CN98804008 A CN 98804008A CN 1252098 A CN1252098 A CN 1252098A
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W·D·希茨
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EI Du Pont de Nemours and Co
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Abstract

本发明涉及一种大豆酶的鉴定,表征和处理,所述酶导致大豆种子的棉子糖类,蔗糖,植酸和无机磷酸盐成分的改变,由此导致有价值和有用的大豆产物。本发明包括的大豆品系与其他大豆品系种子相比降低了发育种子的组织中合成肌醇1磷酸能力。如本文所论述的,通过几个方法中的任何方法降低肌醇1磷酸合酶的酶活性将导致呈现本发明表型的大豆种子。

Description

产生具有降低的棉子糖类和植酸水平之种子的大豆植物
                      发明领域
本发明属于植物分子生物学与遗传学领域。更具体地说，本发明涉及大豆蛋白质产品及食品，所述产品含明显较低含量的棉子糖，水苏糖和植酸以及明显较高含量的蔗糖与无机磷酸盐，这是因为使用了具有可遗传的，降低了在其种子中产生肌醇-1-磷酸能力之大豆品系的作用。
                      发明背景
棉子糖类是一组含D-半乳糖的蔗糖寡糖，它们广泛分布于植物中。棉子糖类的特征在于含通式0-α-D吡喃半乳糖基-(1→6)n-α-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D呋喃果糖苷，其中n＝1到n＝4时分别称为棉子糖，水苏糖，毛蕊糖和筋骨草糖。在大豆种子中，棉子糖和水苏糖是含量最高的棉子糖类。相比而言，毛蕊糖和筋骨草糖是次要成分并且一般用标准分析方法检测不出。
对棉子糖类之存在的广泛植物学调查已在科学文献中有报道[Dey，P.M.《绿色植物中储存的碳水化合物的生物化学》(Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants)，Academic Press，London，(1985)53-129页]。在非结构性碳水化合物中，棉子糖类在植物王国中的丰富含量被认为仅次于蔗糖。事实上，棉子糖类是无处不在的，至少在较高等植物中是这样。棉子糖类在许多有经济意义的作物物种中的可食部分大量积累。实例包括大豆(Glycine max L.Merrill)，甜菜(Beta vulgaris)，棉花(Gossypiumhirsutum L.)，canola(Brassica sp.)和全部主要的可食性豆科作物，包括豆类(Vigna radiata)，鹰嘴豆(Cicer arietinum)，豇豆(Vigna unguiculata)，绿豆(Vigna radiata)，豌豆(Pisumsativum)，小扁豆(Lens culinaris)和白羽扇豆(Lupinus sp.)。
虽然在许多物种中丰富存在，棉子糖类对一些经济上重要的作物物种的有效利用来说是一个障碍。棉子糖类不能被动物直接消化，主要因为α-半乳糖苷酶在小肠粘膜中不存在[Gitzelmann和Auricchio.(1965)《儿科学》(Pediatrics)36：231-236；Rutloff等(1967)Nahrung.11：39-46]。然而，在直肠中的微生物区系易于发酵棉子糖类，从而导致直肠的酸化并产生二氧化碳，甲烷和氢气[Murphy等(1972)《农业食品化学杂志》(J.Agr.Food Chem.)20：813-817；Cristofaro等，《营养学中的糖类》(SugarsinNutrition)(1974)第20章313-335页；Reddy等(1980)《食品科学杂志》《J.Food Science》45：1161-1164]。产生的肠胃胀气可严重限制豆科植物在动物(包括人类)食物中的利用。此外，因为此类物种是蛋白质和纤维的优越来源，令人遗憾的是棉子糖类的存在限制大豆在动物(包括人类)食物中的使用。
大豆很适合机械与设备收获，储存和加工，这些在世界许多地区都是广泛使用的。仅在美国，1998年产量约两千八百万公吨[《油料作物情况和展望报告》(Oil Crops Situation and Outlook Report)，4月1989，美国农业部经济研究服务处]。一般而言，除去豆荚，然后用几个提取系统之一中的己烷提取豆油。然后，剩余的脱脂饼被用于各种经济的大豆蛋白质产品[《大豆蛋白质产品、特征、营养概括和利用》(Soy Protein Products，Characteristics，Nutritional Aspectsand Utilization)(1987)大豆蛋白质理事会]。其中最为大量使用的是大豆食品，它用做动物，特别是那些单胃动物如家禽和猪饲料的食品中蛋白质的来源。
虽然大豆是植物蛋白质的很好的来源，但是其使用中似乎是由于棉子糖的存在而效能差。与玉米(动物食品中的另一主要成分)相比，大豆食物的总能量利用较低[Potter and Potchanakorn：《第三届世界大豆研讨会科研报告集》(Proceedings World Soybean ConferenceIII)，(1984)218-224]。例如，虽然大豆食物比田产黄玉米的总能量高约6％，但是当饲养鸡时，它的可代谢能量不到约40至50％。这种总能量利用效能差似乎不是由于这种食物中蛋白质部分的消化问题，而是由于这种食物中碳水化合物部分的消化不良。已有报道用乙醇提取从大豆中除去棉子糖类导致烘焙食物的可代谢能量大增[Coon，C.N.等：《大豆利用替代品科研报告集》(Proceedings Soybean Utilization Alternatives)，University of Minnesota(1988)203-211]。除去棉子糖类伴随着增加大豆食物的纤维素和半纤维素部分的利用。
从大豆中生产出各种加工的植物蛋白质产品。它们的范围从加工最少的，脱脂的产品如大豆食物，粗粉和精粉到高度加工的产品如大豆蛋白质浓缩物和大豆蛋白质分离物。在其他大豆蛋白质产品中，例如豆油是未提取的全脂精粉。除这些加工的产品外，还有些基于传统东方加工方法的特产产品，它们利用完整的豆作为初始原料。例如包括大豆乳，大豆酱油，豆腐，日本豆豉，日本豆面酱，大豆发酵食品和yuba。
在人类食物中使用大豆蛋白质产品实例包括大豆蛋白质浓缩物，大豆蛋白质分离物，膨化大豆蛋白质，豆乳和婴儿食品。从大豆生产蛋白质浓缩物和分离物的设备和方法世界各地均可得到。大豆蛋白质浓缩物与分离物的生产者所面临的问题之一是选择性纯化蛋白质与棉子糖分开的挑战。除去大豆中存在的大量棉子糖类导致可观的设备和操作成本。
棉子糖类所伴随的问题与成本可通过获得使大豆种子的棉子糖类含量降低的基因而减少和消除。这类基因可用于产生有遗传上降低了棉子糖类含量的大豆变种。有遗传上降低了棉子糖类含量的大豆变种会改善所获得的大豆蛋白质产品的营养质量并降低除去棉子糖类所伴随的加工成本。低棉子糖大豆变种将比常规种类的动物和人类食品更有价值并将使人类更充分利用这种可食性豆科植物中所需要的营养质量。
肌醇六磷酸(亦称“植酸”)和棉子糖类共用肌醇在其合成反应中作为共同中间物[Ishitani，M.等，(1996)《植物杂志》(The PlantJournal)9：537-548]。与棉子糖类相似，植酸是被子植物种子的几乎普遍存在的成分[Raboy，V，：《植物中的肌醇代谢》(InositolMetabolism in Plants)(1990)Wiley-Liss，New York，55-76页]。当植酸一般占种子如大豆和玉米中总磷酸的50-70％时，所述磷酸是唯一不易于单胃动物利用的。除仅部分是可消化的外，在动物配料中存在的植酸导致其他限制性营养如必需氨基酸，钙和锌的分泌[Morz，Z.等，(1994)《动物科学杂志》(J.Animal Sci.)72：126-132；Fos等，《营养毒理学》(Nutritional Toxicology)第三卷，AcademicPress，San Diego(1989)59-96页]。由于大豆食物是许多动物饲料配料的主要部分，所以有降低了植酸含量并增加了可利用磷酸的食物应导致改善含大豆配料中的饲料功效。酶处理含配料的大豆食物以从植酸中部分水解出磷酸基团确能既改善磷酸盐的可用性又改善其他限制性营养成分的可用性[Mroz等见上文；Pen等(1993)《生物技术》(Biotechnology)11：811-814]。
市售与野生大豆种质的调查表明种子植酸的成分的有限遗传变异性是存在的[Raboy等，(1984)《作物科学》(Crop Science)24：431-434]。根据这些因素，显然需要具有可遗传的，显著降低了其种子中棉子糖类和植酸含量的大豆植物。
                      发明综述
本发明涉及有可遗传表型的大豆植物，所述表型是(i)种子植酸含量低于17微摩尔/克，(ii)种子棉子糖加水苏糖含量低于14.5微摩尔/克，和(iii)种子蔗糖含量高于200微摩尔/克，所述表型是由于降低了所述植物的种子中肌醇1-磷酸的合成能力。本发明还涉及从此类植物获得的种子。
更具体而言，本发明涉及分离的编码大豆肌醇1-磷酸合酶的核酸片段或其互补片段，并涉及包含该核酸片段或所述核酸片段的亚片段的嵌合基因，所述片段被有效连接到适当的调节序列，其中所述嵌合基因的表达导致编码大豆肌醇1磷酸合酶的天然基因的表达降低。
本发明的另一个实施方案是分离的编码突变型肌醇1-磷酸合酶的核酸片段，所述酶具有降低的肌醇-1-磷酸合成能力。
本发明的另一个实施方案是一种大豆植物，在其基因组中含一种嵌合基因，所述基因包含编码大豆肌醇1-磷酸合酶的核酸片段或该核酸片段的互补片段，所述片段有效连接到适当的调节序列，其中所述嵌合基因的表达导致编码大豆肌醇1-磷酸合酶的天然基因的表达降低。
还有一个本发明实施方案是一种大豆植物，其就至少一种编码突变型肌醇1-磷酸合酶基因而言纯合的，所述合酶具有降低的合成肌醇1-磷酸的能力，所述基因提供可遗传的表型，包括(i)种子植酸含量低于17微摩尔/克，(ii)种子棉子糖加水苏糖含量低于14.5微摩尔/克，和(iii)种子蔗糖含量高于200微摩尔/克。
本发明还涉及来源于上述任意植物种子的种子和蛋白质产品。
本发明的另一个实施方案还涉及形成具有可遗传表型的大豆植物的方法，所述表型是(i)种子植酸含量低于17微摩尔/克，(ii)种子棉子糖加水苏糖含量低于14.5微摩尔/克，和(iii)种子蔗糖含量高于200微摩尔/克，所述方法包括(a)将一种原种大豆植株与大豆品系LR33或在其基因组中含一嵌合基因的任意大豆植株杂交，所述嵌合基因包含编码大豆肌醇1-磷酸合酶的核酸片段或该核酸片段的互补片段，所述片段被有效连接到适当的调节序列，或用一种原种大豆植株与一种纯合的大豆植物杂交，其中至少一种基因编码一突变型肌醇1-磷酸合酶，所述合酶具有降低的合成肌醇1-磷酸的能力；和(b)筛选步骤(a)杂交中的子代植株，所述植株具有可遗传的表型，包括(i)种子植酸含量低于17微摩尔/克，(ii)种子棉子糖加水苏糖含量低于14.5微摩尔/克，和(iii)种子蔗糖含量高于200微摩尔/克。
本发明还包括产生大豆蛋白质产物的方法，包括(a)进行农艺学优良大豆植物与LR33或如上述的任何大豆植物的杂交；(b)筛选从步骤(a)获得的子代植物的种子，就(i)种子植酸含量低于17微摩尔/克，(ii)种子棉子糖加水苏糖含量低于14.5微摩尔/克，和(iii)种子蔗糖含量高于200微摩尔/克；和(c)处理步骤(b)中筛选的种子以获得所需要的大豆蛋白质产物。
最后，本发明包括使用纯合大豆植物的方法，其至少一种基因编码突变型肌醇1-磷酸合酶，所述合酶具有降低的合成肌醇1-磷酸的能力，所述基因提供可遗传的表型，包括(i)种子植酸含量低于17微摩尔/克，(ii)种子棉子糖加水苏糖含量低于14.5微摩尔/克，和(iii)种子蔗糖含量高于200微摩尔/克，以产生子代品系，所述方法包括(a)将包含具有降低的合成肌醇1-磷酸能力的突变型肌醇1-磷酸合酶的大豆植株与不含突变的任何大豆亲代进行杂交，以产生F1杂交体；(b)所述F1杂交体自交至少一代；和(c)鉴定步骤(b)的子代，其至少一种编码突变肌醇1-磷酸合酶的基因是纯合的，所述合酶有降低了的合肌醇1-磷酸的能力，所述基因提供一种可遗传表型，包括(i)种子植酸含量低于17微摩尔/克，(ii)种子棉子糖加水苏糖含量低于14.5微摩尔/克，和(iii)种子蔗糖含量高于200微摩尔/克。
                       附图简述与序列表
从构成本发明的一部分的附图和序列表可更充分理解本发明。所述序列表含三字符氨基酸编码，如37C.F.R.1.822所定义的，此处引用为参考。
图1.大豆种子中葡萄糖到植酸，棉子糖和水苏糖的代谢。共同的辅助因子ATP，ADP，UTP，UDP，焦磷酸和无机磷酸盐(Pi)没有列出。缩写列出酶：己糖激酶(HK)；葡糖磷酸异构酶(PGI)；UDP葡糖焦磷酸化酶(UDPGPP)；UDP葡糖4’差向异构酶(UDPG4’E)；肌醇1-磷酸合酶(MI 1-PS)；肌醇1-磷酸酶(MI 1-Pase)；肌醇1-磷酸激酶(MI 1-PK)；肌醇半乳糖苷合酶(GAS)；蔗糖合酶(SucS)；棉子糖合酶(RS)；和水苏糖合酶(SS)。
SEQ DI NO：1是1782碱基的cDNA5’到3’的核苷酸序列，其编码存在于克隆p5bmi-1ps中的野生型大豆肌醇1-磷酸合酶。
SEQ ID NO：2是从SEQ ID NO：1可读框推出的510氨基酸序列。SEQ ID NO：3是上游(5’)引物的核苷酸序列，它用于从大豆品系LR33分离肌醇1-磷酸合酶cDNA。SEQ ID NO：4是下游(3’)引物的核苷酸序列，它用于从大豆品系LR33分离肌醇1-磷酸合酶cDNA。SEQ ID NO：5是1533碱基的cDNA核苷酸序列，其编码克隆LR33-10中的LR33肌醇1-磷酸合酶。SEQ ID NO：6是从SEQ ID NO：5可读框推出的510氨基酸序列。SEQ ID NO：7是上游(5’)引物的核苷酸序列，它用于来自基因组DNA样品的编码肌醇1-磷酸合酶野生型等位基因的PCR扩增。SEQ ID NO：8是上游(5’)引物的核苷酸序列，它用于来自基因组DNA样品的编码肌醇1-磷酸合酶之LR33等位基因的PCR扩增。
                      生物寄存
如下生物学物质已按照布达佩斯协议条款被寄存在美国模式培养物保藏所(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，并有如下登记号：
  名称         物质      登记号        寄存日期
LR33           种子    ATCC 97988    1997年4月17日
4E76           种子    ATCC 97971    1997年4月4日
p5bmi-lps      质粒    ATCC 97970    1997年4月4日
                        详述
本公开的内容，使用几个术语。如本文所用“大豆”指物种大豆，野大豆，或与大豆有性杂交相容的任何物种。“品系”是一组类似系谱的植物，其呈现极少或不呈现个体之间的至少一个特征上的遗传变异。此类品系可通过一代或数代自花受粉和筛选而生成，或通过包括组织或细胞培养技术从单一亲本的无性繁殖而生成。“突变”指可检测到的并可遗传的基因改变(自发或诱导)，它不由隔离或遗传重组所引起。“突变体”指的是具有突变的个体或个体谱系。“群体”是共有一个共同基因库的任何一群个体。在本发明中，它包括M1，M2，M3，M4，F1和F2群体。如本文所使用的，“M1群体”是种子(和所产生的植株)的子代，所述子代已接触了诱变剂，而“M2群体”是自花受粉的M1植株的子代，“M3群体”是自花受粉的M2植株的子代，而“M4群体”是自花受粉的M3植株的子代。如本文所使用的“F1群体”是一个品系与另一品系杂交受粉产生的子代。本文所使用的表达式描述这种杂交受粉为“雌性亲本*雄性亲本”。“F2群体”是F1植侏自花受粉的子代。“F2衍生品系”或“F2品系”是各F2植株自花受粉产生的品系。F2衍生品系可通过重复的自花受粉和从所述F2衍生品系的植株积累的种子所产生的后代(F3，F4，F5等)进行繁殖。
术语“核酸”指单链或双链大分子，由包含糖，磷酸和嘌呤或嘧啶的单体(核苷酸)组成。“核酸片段”是一段给定的核酸分子。“亚片段”指包含比完整核酸片段少的连续的核酸片段部分。“互补”指构成核酸的嘌呤与嘧啶碱基的专一性配对：腺嘌呤与胸腺嘧啶配对而鸟嘌呤与胞嘧啶配对。因此，第一核酸片段的“互补片段”指核苷酸序列与第一核酸序列互补的第二核酸片段。
在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与转移DNA中的信息到蛋白质中。“基因组”是一个生物的每个细胞中所含有的遗传物质的整体，它可以是单或双链，任选含有合成的，非天然的或改变的能掺入到DNA或RNA聚合物中的核苷酸碱基。术语“寡聚体”指短的核苷酸序列，通常可达100碱基长度。如本文所使用的，术语“同源的”指两个核酸分子的核苷酸序列之间或两个蛋白质分子的氨基酸序列之间的相关性。这种同源性通过在如本领域专业人员所理解的一定的严谨条件下进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交(Hames和Higgins，编辑(1985)核酸杂交，IRL Press，Oxford，U.K.)；或通过比较两核酸或蛋白质的序列类似性，如通过Needleman等(《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)(1970)48：443-453)的方法而得到估计。如本文使用的术语“基本上类似”指核苷酸序列与权利要求的序列的编码区(如相应于所述编码区的基因和假基因)在核苷酸水平上有高于90％整体一致性。本文所述核酸片段包括含可能变异(人工形成和自然形成)的分子，如但不限于(a)涉及不引起被编码氨基酸变化的碱基改变的分子，或(b)涉及改变氨基酸但不影响所述DNA序列编码的蛋白质功能性质之碱基改变的分子，(c)衍生于核酸片段的缺失，重排，扩增，随机或受控制的诱变的分子，和(d)甚至偶然的核苷酸测序的错误的分子。
“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包括编码区的前(5’非编码区)和后(3’非编码区)调节序列。“天然的”基因指用如在自然界发现的其自身的调节序列分离的基因。“嵌合基因”指包含在自然界未发现的异源调节和编码序列的基因。“内源性”基因指在其基因组的自然位置中正常发现的天然基因并且是未被分离的。“外源”基因指不是在其宿主生物中正常发现的，而是通过基因转移引入的基因。“假基因”指不编码功能性酶的基因组核苷酸序列。
“编码序列”指编码特定蛋白质而不包括非编码序列的DNA序列。它可构成一个“连续的编码序列”，即没有内含子或可包括一个或多个以适当的剪接点为边界的内含子。“内含子”是初级转录物转录的但通过细胞内为产生可被翻译成蛋白质的成熟RNA而进行的RNA切割和重接所移除的序列。
“起始密码”和“终止密码”指在蛋白质合成(mRNA翻译)中特异性起始和链终止编码序列中分别三个邻接核苷酸的单位。“可读框”指由起始和终止密码之间的内含子连接起的编码序列，它编码氨基酸序列。
“RNA转录物”指DNA序列的RNA聚合酶催化的转录产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完整拷贝时，指初级转录物或它可以是初级转录物转录后加工而衍生的RNA序列，并亦指成熟的RNA。“信使RNA(mRNA)”指没有内含子并可被细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指从mRNA衍生的双链DNA。“有义”RNA指包括mRNA的RNA转录物。“反义”RNA指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补的RNA转录物，并且所述转录物通过干扰其初级转录物或mRNA的加工，转录和(或)翻译而阻断靶基因的表达。反义RNA的互补性可存在于任何特定基因转录物部分，即在5’非编码序列，3’非编码序列，内含子或编码序列。此外，如本文所使用的，反义RNA可含核酶序列区域，它增强反义RNA阻断基因表达的功效。“核酶”指催化性RNA并包括序列特异性内切核糖核酸酶。
如本文使用的，“适当的调节序列”指天然或嵌合基因的核苷酸序列，它位于本发明核酸片段的上游(5’)，其中和(或)下游(3’)，它控制本发明核酸片段的表达。
“启动子”指基因中的DNA序列，通常在其编码基因的上游(5’)，它通过提供RNA聚合酶和适当转录所需要的其他因子的识别部位控制编码序列的表达。在人工DNA构建体中，启动子还可用于转录反义RNA。启动子也可含参与结合蛋白质因子的DNA序列，所述因子根据生理和发育条件控制转录起始的效率。它也可包含增强子元件。“增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列。它可以是启动子固有的元件或插入的异源元件以增强启动子的水平和(或)组织特异性。“组成型启动子”指在全部组织和全部时间内指导基因表达的启动子。“组织特异性”或“发育特异性”启动子如本文所指，是几乎专性在特异性组织(如叶片或种子)中，在组织的特定发育阶段(如分别在早期或晚期胚胎发生)中指导基因表达。如本文所使用的，术语“表达”指本发明的核酸片段衍生的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累，这与所述细胞的蛋白质细胞器一起导致肌醇1-磷酸合酶水平的改变。“反义抑制”指产生能阻止靶蛋白质表达的反义RNA转录物。“超表达”指转基因生物中基因产物的生产超过正常或非转化的生物中的生产水平。“共抑制”指与内源基因有基本同源性的外源基因的表达导致所述外源基因与所述内源基因表达均受抑制。“改变的水平”指在转基因生物中基因产物的产生数量或比例与正常或非转化生物不同。本发明还涉及载体，包括本发明的核苷酸序列，用本发明载体遗传工程化的宿主细胞和通过重组技术产生的本发明多肽。本文的“转化”指外源基因转移到宿主生物基因组中并可稳定遗传。“能育的”指能进行有性繁殖的植物。
“棉子糖类”指有通用分子式O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)n-α-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D-呋喃果糖苷(其中n＝1到4)的寡糖族。在大豆种子中，所述术语更特指所述家族成员含一个(棉子糖)和两个(水苏糖)半乳糖残基。虽然已知较高的半乳糖聚合物(例如毛蕊糖和筋骨草糖)，但是大豆中这些较高聚合物的含量低于标准检测方法所检测出的含量，因此显然不归属于总棉子糖含量。
“植物”指光合作用的生物(真核与原核)，而术语“高等植物”指真核植物。
本发明提供大豆基因的突变型和改进大豆种子的碳水化合物与植酸成分的方法以及衍生的产物。本发明论述鉴别这种基因中的突变的方法的实例和使用衍生的突变体大豆品系降低大豆种子中的棉子糖和植酸成分的方法的实例。本发明还论述使用基因沉默技术和本发明中揭示的大豆肌醇1-磷酸合酶基因序列降低大豆种子中棉子糖含量的方法。
从本发明植物中获得的种子表达一种与市售品种有关的改进的可溶性碳水化合物含量，所述改进导致总棉子糖加水苏糖含量的降低。这些品系的碳水化合物资料与用于或产生于其他大豆育种规划中的优良或种质品系中所见的资料明显不同。
论述了两种不同的产生本发明新型大豆基因的方法。第一种方法标志着首次成功尝试诱导突变来实现低棉子糖加水苏糖含量。这种方法导致两个主要的基因的发现，其中之一在本发明中详细描述，它可被用于开发(在降低棉子糖与水苏糖结合含量的意义上)优越于先前报道的任何品系的大豆品系。第二种方法利用在特异性基因沉默法的转基因中使用的本发明所论述的基因序列以达到类似于通过随机诱变和筛选所获得的结果。
申请人最初想通过化学诱变在野生型大豆基因组中引入随机诱变。本发明使用NMU(N-亚硝基-N-甲基脲作为诱变剂，尽管可能使用了其他已知改变DNA结构和序列的试剂。NMU处理之后，播种大豆种子数代并筛选需要的表型；首选重要的是棉子糖含量的改变。初步筛选的诱变的大豆群体显示两种品系，LR33和LR28，它们表现出低棉子糖类(LR28在世界专利申请WO93/07742中公开)。通过自花受粉产生的LR33三代后代的分析(表1)证明了LR33的低棉子糖表型是可遗传的。
通过一系列精细的遗传和生化研究鉴定和表征了导致该品系呈现的独特表型的LR33生理缺陷(见实施例2，后文)。LR33中的缺陷表现出遗传和生化上不同于导致LR28品系低水苏糖表型的LR28中的突变。而且，LR33中的突变证明比LR28中的缺陷有更大的多效性；本说明书证明LR33表型不仅包括降低的棉子糖含量，而且包括导致种子植酸，无机磷酸盐和蔗糖水平的改变。进一步分析证实来自LR33的遗传信息能单独在子代大豆品系上提供这种独特的表型，并且证实所述突变体基因或LR33中的基因不是增强源于其他突变体大豆品系的基因表型表达的简单遗传修饰剂。
具体的生化缺陷与LR33所证实的可遗传表型有关并鉴定了其子代。这通过考虑对大豆种子中的棉子糖类的生物合成以及植酸和无机磷酸盐水平的控制来完成。根据这些已知生物合成途径，一系列的生化研究和随后的分子遗传分析鉴定了LR33种子中的缺陷是由于肌醇1-磷酸合酶活性的改变，导致肌醇1-磷酸合成能力的降低。
棉子糖与水苏糖的生物合成已被十分清楚的表征[见Dey，P.M.《绿色植物中储存的碳水化合物的生物化学》(Biochemistry ofStorage Carbohydrates in Green Plants)(1985)]。肌醇六磷酸或植酸和棉子糖类共有肌醇作为其合成反应中的共同中间物[Ishitani，M等.《植物杂志》(The Plant Journal)(1996)9：537-548]。以葡萄糖开始作为碳源，描述成熟大豆种子中植酸，棉子糖和水苏糖合成的途径在附图1中给出。
根据附图1所示的互变反应，葡萄糖或蔗糖均可作为植酸的多元醇部分的初始物，组成棉子糖和水苏糖的全部己糖初始物和棉子糖合酶与水苏糖合酶半乳糖供体的再循环部分(肌醇)的初始物。这些在成熟，野生型大豆种子中积累的互变反应的终产物是(根据质量的高低次序)蔗糖，水苏糖，植酸和棉子糖。
公认的棉子糖生物合成反应涉及从UDP半乳糖和肌醇合成肌醇半乳糖苷(O-α-D吡喃半乳糖基-(1→1)-肌醇)。催化该反应的酶是肌醇半乳糖苷合酶。来自蔗糖的棉子糖族中的棉子糖与较大的同系物的合成由半乳糖基转移酶，棉子糖合酶和水苏糖合酶催化。
在许多附图1中酶催化步骤中，控制这些终产物的比例受互变速率改变的影响。这种控制可受改变酶表达水平的影响或受改变所述酶的内在活性的影响。然后，来自修饰途径的终产物所产生的混合物可组成新比例的原终产物以及新产物混合物，其中包括一些正常中间产物的累积物。确切的混合物和组合物将取决于已改变了活性的酶和改变的程度。
六种酶，肌醇1-磷酸合酶，肌醇1-磷酸酶，UDP葡糖4’差向异构酶，肌醇半乳糖苷合酶，棉子糖合酶，和水苏糖合酶的活性可被降低以在不降低蔗糖含量的条件下，降低棉子糖或水苏糖的合成。在这六种酶中，棉子糖与水苏糖合成所独有的三种酶活性可被降低，而不降低植酸含量。仅有肌醇1-磷酸合酶似乎参与全部三种终产物的合成，因此如果其活性被降低，可同时改变全部三种终产物的数量。
本发明论述了通过降低大豆种子细胞中的肌醇1-磷酸合酶活性而同时降低大豆种子中棉子糖和植酸含量并增加蔗糖与无机磷酸盐含量的能力。本发明的实施例描述了这种酶的突变型的产生和发现，其中编码该酶的核苷酸序列中的一个点突变导致氨基酸替换，后者又依次降低了细胞内酶的活性。专业人员众所周知肌醇1-磷酸合酶的编码区内的其他突变可导致降低的酶活性并由此产生本发明的种子表型。使用众所周知的异源基因表达和体外诱变技术，并应用本文描述的各种酶检测法，专业人员可鉴定导致降低的酶活性而无不适实验结果的肌醇1-磷酸合酶编码区中的其他突变。然后这些突变的肌醇1-磷酸合酶基因可被引入到大豆基因组(见美国专利号5,501,967)并导致呈现本发明表型的新的大豆变种。
或者，可利用基因沉默技术如反义抑制技术(美国专利号5,107,065)和共抑制(美国专利号5,231,020)降低大豆种子细胞中的细胞内肌醇1-磷酸合酶活性。本说明书论述了编码野生型大豆肌醇1-磷酸合酶的基因序列。专业人员将容易意识到如何制备和如何使用含所述全部或部分野生型序列的嵌合基因或基本上类似的序列以降低大豆种子中的肌醇1-磷酸合酶活性。
因此，本发明涉及鉴定，表征和处理大豆酶，导致大豆种子的棉子糖，蔗糖，植酸和无机磷酸盐含量的改变，由此产生有价值而又有用的大豆产品。如本文所论述的，通过数种方法中的任何方法降低肌醇1-磷酸合酶的酶活性将导致大豆种子呈现本发明的表型。
                        实施例
在如下实施例中，本发明被进一步定义，其中所有份数和百分数是重量，温度是摄氏，除非另有说明。显而易见，这些实施例当指出为本发明优选实施方案时，仅是以解释的方式给出。从上述讨论和实施例中，本领域专业人员可确信能对本发明作出各种改变和修饰以使其适应于各种用途和条件而不偏离其宗旨与范围。而且，本发明范围上不受寄存的生物物质的限制，因为所寄存的生物物质是要提供对物质的解释，从这些物质可衍生出许多实施方案。全部此类修饰均属于所附权利要求的范围。
常用的分子生物学技术如细菌转化，核酸的琼脂糖凝胶电泳和蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳以描述这些方法的通用术语相称。这些技术的实践细节(本领域专业人员所熟知)在[Sambrook等(分子克隆，实验室手册，第二版，(1989)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)]中有详细描述。在实验操作中使用的各种溶液以其通用名相称如“SSC”，“SSPE”，“Denhardt’s溶液”等。这些溶液的组合物可通过参考Sambrook等[上述]的附录B而找到。
                        实施例1
        提供改进的碳水化合物组分的大豆基因的发现棉子糖含量检测
下述检测被用于分析大豆种子的棉子糖含量。在每次分析测试确定棉子糖含量前，使种子空气干燥至少一周直到湿度约为8％，然后在约40到50℃和40％相对湿度中存放。发明者自测试许多这类空气干燥样品表明，当在这些条件下存放时，所述湿度不明显偏离8％(范围从7到10％)。
每次个别的棉子糖测试，一般从一给定的植株取5到10棵大豆在配有100目筛的Cyclotech 1093 Sample Mill(Tecator，Box70 S-26301，Hoganas，Sweden)中研磨生成种子粉末，然后进行分析。在多数情况下，测定含“现有”温度为约8％的种子或所获得产物的棉子糖含量。在这些情况下，“现有”值通过用0.92除测量值被转换成干基重(db)。为进行某些品系之间或大豆蛋白质产品之间的比较，在分析前，将研磨的种子粉末放在45℃的强力通风炉中直到所述样品达到恒定重量(0％湿度)。因此，除非另有说明，在这种条件下所报道的全部棉子糖测量值是通用的干基重。
如下所述，使用三种检测法(“酶法”，“TLC”和“HPLC”)测定了大豆中的棉子糖含量。全部三种方法用前述研磨过程中获得的种子粉末进行。
在准备“酶法”检测过程中，研磨每个种子样品后，将约30毫克得到的粉末称重到13×100毫米螺旋盖的试管中并加入1.6毫升氯仿和1.4毫升甲醇∶水(4∶3，v/v)。记录每个样品的精确粉末重量并用来调整下述检测结果的样品重量之间的差别。然后盖上试管并放在架子中在旋转震荡器上以1800转/分钟在室温下震荡60分钟。提取后，使试管中的内容物沉降15分钟。沉降后，每份15微升的甲醇∶水相被放置在96孔微量滴定板的一个孔中并在45℃干燥20分钟。被干燥的孔用做反应容器以偶联“酶法”检测，该检测如先前的描述使用α半乳糖苷酶和半乳糖脱氢酶[Schiweck and Busching，(1969)Zucker22：377-384；Schiweck和Busching，(1975)Zuker28：242-243；棉子糖检测试剂盒(Raffinose DetectionKit)，Boehringer Mannheim GMBH，目录号(Catalog Number)427 167]并修改了检测条件。对检测的修改包括加入牛血清白蛋白(15毫克/毫升)到所述检测和α半乳糖苷酶缓冲液中，增加α半乳糖苷酶温孵的温度和时间从室温到45℃和30分钟，并增加半乳糖脱氢酶温孵的时间从20分钟到60分钟，并使用水苏糖代替棉子糖作为α-半乳糖苷的标准。温孵之后，在BIO-TEKModel EL340微量平板读数器测定样品在340nm的吸收度。存在于样品中的α半乳糖苷的量通过比较已知数量的水苏糖标准确定。为便利分析数千份样品，酶检测被影印一次，初级检测中呈现棉子糖含量低的品系被随后在一式三份中再次检测(如果足够物质可用的话，从播种开始)。在第二次检测中其组成成分被确定的品系在田间环境中培育到成熟并再次检测田间培育的植株的种子。在需要有关棉子糖和肌醇半乳糖苷资料的更具体信息的情况中，由酶检测法鉴定的低棉子糖品系用HPLC检测(下面描述)进行再测试。
为便于快速筛选棉子糖种质，开发出一种薄层层析“TLC”检测。在该检测中，将约60毫克研磨的种子粉放入13×100毫米螺旋盖测试管中，向其中加入1毫升4∶3(v/v)甲醇∶水和1毫升氯仿。盖上试管放在试管架中，在旋转震荡器上混合60分钟，条件为25转/分钟，室温。提取之后，将试管在2100转/分钟离心5分钟。从甲醇∶水层中取4微升样品并放在20×20厘米“Baker″Silica Gel预吸收/通道化的有250毫米分析层的TLC平板上。使样品在室温干燥，然后将平板放在装有3∶4∶4(v/v/v)的乙酸乙酯∶异丙醇∶20％醋酸(在水中)的溶液的TLC槽中。使所述溶液吸收分析通道10分钟，此时移出平板并在通风橱中空气干燥。然后用苯胺-二苯胺试剂喷淋平板以鉴定所述样品中的碳水化合物。该试剂通过1毫升苯胺与100毫升丙酮，1克二苯胺和10毫升磷酸混合来制备。然后将平板放置在100℃烘箱中15分钟至干燥并取出使其在读取分析通道前冷却。通过与纯品标准所见的洗脱模式比较估计大豆样品中水苏糖与棉子糖的含量。
高效阴离子交换层析/脉冲电流检测法(本文称谓“HPLC”检测法)被用于测定各棉子糖类(例如水苏糖和棉子糖)，肌醇半乳糖苷的含量，并测定酶检测或TLC检测的结果。研磨和提取种子的条件与先前的“酶法”检测所使用的相同。移出750微升一份的水相并在80℃减压下干燥。然后将干燥物质溶解在2毫升水中并剧烈混合30秒钟。移出100微升1份并用水稀释到1毫升。再次充分混合样品，然后10,000Xg离心3分钟。离心后，用150mM NaOH，1.3毫升/分钟，室温下，在DionexTMPA1柱上分析20微升的样品。DionexTMPAD检测仪使用参数为E1＝0.05v，E2＝0.60v和E3＝-0.60v，输出信号范围是3毫安。在层析条件下可很好地分离肌醇半乳糖苷，葡萄糖，果糖，蔗糖，棉子糖，水苏糖和毛蕊糖。所述样品的碳水化合物含量通过比较与可靠的标准比较确定。
从所述碳水化合物所获得的分析结果用软件SuperANOVA(Abacus Concepts，Inc.，1984 Bonita Avenue，Berkeley，CA94704)进行方差分析。在适当的时候，用Fisher’s Protected LSD作为平均值比较的post-hoc测验。在其他比较中，如果其标准差(SEM’s)定义的范围不重叠，则平均值被认为有统计学意义。在棉子糖类的平均值与对照品系的平均值比较的情况中，若所述平均值在对照平均值以下至少三个标准差，则平均值被认为明显低于对照。诱变与突变体的筛选
LR13(与Williams82基本一致的品系)的约130,000个种子(22.7公斤)被渗泡在150升自来水中，连续通风8小时。通风是泵入空气通过放在渗泡容器低部的标准水族箱“气石”而完成。吸收液体的种子被干燥并转移到由0.1M磷酸盐缓冲液在连续通风下，在pH5.5缓冲的98升2.5mM N-亚硝基-甲脲(NMU)溶液。在所述NMU溶液中保持种子3小时，然后通过一系列冲洗并沥出残留的NMU。在第一次沥出时，处理过的种子被转移到45升自来水中1分钟。在第二次沥出时种子被转移到45升新鲜自来水中在连续通风下持续1小时。在第三次沥出时，种子被转移到45升新鲜自来水中在连续通风下2小时。在第四次沥出时，种子被转移到连续通风下的45升新鲜自来水中。两小时后，一半种子从第四次沥出物中移出(亚群1)，而另一半种子从五小时后的第四次沥出物中移出(亚群2)。从第四次沥出物移出后，种子被排出外来水分并撒在纸板上在太阳下晒干一小时。然后将这种吸收了液体的M1种子进行大田种植(Isabela，Puerto Rico，USA)，每行间隔46厘米，行内密度约为每英尺14棵种子，而深度在2.5厘米。
从M1植株大量收获M2种子的两个库(来自亚群1和2)。将亚群1的约40,000个M2种子和来自亚群2的52,000个种子种植在Isabela，Puerto Rico，USA。在每个亚群内，收获3,000个M2植株中每一个的5个豆荚并囤积以获得大量的M3种子群体。将M3大批种植在Isabela，Puerto Rico。成熟时来自5,000M3植株的种子被单独收集以从每个亚群获得5000 M3：4品系。
在1991年冬季，筛选总共至少8,000M3：4品系以用上述的酶法测量棉子糖类的含量。在初筛时，鉴定出含降低的棉子糖类的两个品系，这证明了这两个品系在第二代(自花受粉)是可遗传的。这些品系之一命名为LR33，与同样环境下对照的优良大豆栽培物相比，该品系已经降低了水苏糖与棉子糖的水平。与生长在同样环境的三种优良栽培作物的平均价值相比，LR33的水苏糖含量在统计学意义上明显较低。从三代LR33获得的自花受粉品系收获的大批种子含量的可溶性碳水化合物含量在表1中给出。
                       表1
自花受粉LR33品系衍生的大豆品系成熟种子中的可溶性碳水化合物
品系            水苏糖    棉子糖    肌醇半乳糖苷    蔗糖
LR33              61        18           0          N.D.1
1ST-83            38        11           0          153
1991原种(平均数)  93        19           0          N.D.1
2ST-88            51        13           0          209
1992原种(平均数)  68        12           0          N.D.1
3ST-101           25        8            0          126
1993原种(平均数)  76        17           0          N.D.1
(全部数值是微摩尔/克)
1N.D.未确定结果品系(1ST-83，2ST-88和3ST-101)全部通过LR33的自花受粉获得。三品系中的每个品系均含比对照品系低的水苏糖含量。
                      实施例2
         与LR33低棉子糖表型有关的生理缺陷的鉴定用LR33作为低棉子糖亲本进行遗传杂交
在力图进一步降低大豆种子的总棉子糖含量的过程中，进行了LR33与LR28的遗传杂交。LR28品系在世界专利中请WO93/07742中有描述。简言之，它也是一种低结合棉子糖与水苏糖的品系，是在极类似于实施例1中描述的筛选方法中发现的。低棉子糖与水苏糖含量在上代与下代之间是一致的。此外，LR28品系的成熟种子和与其他亲本杂交衍生的品系的肌醇半乳糖苷含量与野生型大豆种子相比显著提高了。
培养来自LR33与LR28杂交的F1植株并自花受粉以产生分离的F2子代。LR28衍生品系的种子，原种栽培种子和LR28与LR33杂交产生的分离群体的种子被种植在同样的环境中。从每个F2植株收获F2：3种子并用上述酶检测法筛选α-半乳糖苷成分。从初筛得到的低α-半乳糖苷筛选物进一步进行HPLC检测以获得完整的棉子糖类资料。筛选出的低总α-半乳糖苷含量的典型品系的碳水化合物资料在表2中给出。
                      表2从LR28与LR33杂交品系以及随后与原种栽培品系回交获得的成熟种
              子中可溶性碳水化合物(LR33和5ST-1003(LR28衍生品系)被包括在内作为杂交亲本的实
          例；2242作为原种栽培品系对照)品系      水苏糖    棉子糖    肌醇半乳糖苷    蔗糖LR33        61        18          0           N.D.15ST-1441    57        18          0           N.D.15ST-1434    6         15          0           2165ST-1309    0         5           0           2872242        75        18          0           1685ST-1003    19        4           65          200(全部数值以微摩尔/克计)1N.D.未确定5ST-1441，5ST-1434和5ST-1309全部从LR28与LR33杂交获得。意外的是，即使5ST-1441品系十分类似于所述LR33亲本，品系5ST-1434与5ST-1309的棉子糖与水苏糖水远低于亲本品系并且不含LR28品系的升高的肌醇半乳糖苷水平特征。体外检测棉子糖类途径中的酶活性
在为找出衍生于LR28与LR33杂交的某些品系中观察到的意外的棉子糖，水苏糖和肌醇半乳糖苷表型的原因而设计的研究中，在即将进入快速棉子糖类生物合成期的生理成熟期前测量大豆种子中的酶活性和代谢物库。从豆荚移出刚刚开始发黄的种子。选择豆荚也失去绿色或刚刚开始发黄的种子进行棉子糖类合成中的最后三个酶的检测(见附图1)。
从所述豆荚中移出种子，称重，然后在10个体积的50mM HEPES-氢氧化钠，pH7的有5mM 2-巯基乙醇的缓冲液中用研钵和杵研磨。在10，←000xg离心研磨的样品10分钟并通过用研磨缓冲液平衡好的Sephadex G-25使所述上清液脱盐。
检测肌醇半乳糖苷合酶时，加入10微升脱盐提取物到含20mM肌醇，10mM二硫苏糖醇，1mM氯化锰和1mMUDP-[14C]半乳糖(1.25微居里/微摩尔)的90μL、pHT的HEPES缓冲液中。所述检测混合物被温孵在25℃10分钟，然后加入400微升的乙醇终止反应。向终止的反应体系中加入200微升Dowex AG-1X8阴离子交换树脂(BioRAD)并震摇所述混合物25分钟。通过离心除去树脂并取上清液进行闪烁计数。取非阴离子放射性作为肌醇半乳糖苷合成的测量值。
检测棉子糖合酶与水苏糖合酶时，加入50微升脱盐提取物到50微升25mM，pH7的HEPES缓冲液中，其中还含10mM二硫苏糖醇，10mM肌醇半乳糖苷和40mM蔗糖，以检测40mM棉子糖或棉子糖合酶以检测水苏糖合酶。25℃温孵1小时后，加入40微升的乙醇终止反应，然后放在沸水中水浴1分钟以沉淀蛋白质。反应混合物被离心到澄清，使上清液通过0.22微米滤器，然后在真空条件下减压干燥。所得残留物被重新溶解在0.5毫升水中并在Dionex HPLC系统上如前述分离20微升用于棉子糖和水苏糖定量。用1994年8月收获的野生植株种子所做的实验结果在表3中给出。
                        表3三个大豆品系的发黄种子中肌醇半乳糖苷合酶，棉子糖合酶和水苏糖
                     合酶的活性(野生型对照是1923品系。酶活性表示为在检测条件下每克新鲜种子重量每小时产生的产物微摩尔数。数值是平均值±五个平行测定的标准差。)
品系    肌醇丰乳糖苷合酶     棉子糖合酶     水苏糖合酶
1923        7.5±4.1         0.10±0.05     0.65±0.18
LR28        16.5±5.2        0.004±0.007   0.81±0.24
LR28×LR33  22.6±8.8        0.006±0.008   0.87±0.21棉子糖与水苏糖合成的三个关键酶中，与野生型相比，只有棉子糖合酶显示出在突变株(低棉子糖类品系)中有明显降低。引起棉子糖合酶活性降低的突变与所述生物合成途径中该酶的位置以及在只携带LR28作为低棉子糖类表型来源的品系中观察到的肌醇半乳糖苷积累相一致。肌醇半乳糖苷与蔗糖是棉子糖合酶的两个底物，并且两个代谢物均在含LR28品系中积累(见附图1和表2)。
尽管当LR33品系与LR28品系杂交时，所获得的水苏糖，棉子糖与肌醇半乳糖苷的水平低，但是由LR28突变提供的降低的棉子糖合酶活性是唯一被改变的活性。虽然似乎LR33品系中的损伤引起的降低的肌醇半乳糖苷合酶活性应当是与LR28结合时所述突变致使肌醇半乳糖苷含量降低的一个可能候选因素，并没有测量出该酶在体外活性的降低。成熟中的大豆种子游离肌醇含量的检测
虽然没有LR28与LR33杂交中体外肌醇半乳糖苷合酶活性的降低，却检测到了LR33衍生品系的成熟种子中肌醇半乳糖苷合酶体内活性受其底物之一可用性限制的可能性。UDP-葡糖4’差向异构酶中的突变可使UDP-半乳糖给肌醇半乳糖苷合酶的供应减少，而影响其合酶或产生游离肌醇形式(附图1)的特异性磷酸酶的突变可限制肌醇的供应。通过检测野生型和LR33衍生种子的总游离肌醇成分可核查肌醇库。三个大豆品系，野生型栽培品系A2872，和两个LR33×LR28衍生品系(5ST-1434与5ST-1309)在温室中培养16小时，每日/夜温度标准为30℃/20℃。种子是从刚开始发黄的豆荚中取出的，并且豆荚本身正从十分绿色变成黄色。每个品系取三个种子在8毫升80％甲醇中研磨。所述混合物在12,000xg离心15分钟，缓冲液倾入50毫升烧瓶。所述提取重复两次并合并上清液。将合并的上清液在40℃真空中干燥，残留物重新溶解在1毫升水中。重新溶解的提取物通过3毫升混合的层离子交换树脂(BioRad AG501X8)去离子，流出物加4毫升洗涤液被再次减压干燥。残留物被重新溶解在500微升的水中并将70微升1份用70％乙腈以1毫升/分钟流速，通过HPLC在ZorbaxAmino柱(DuPont)上洗脱而分离。用不同的折射率检测柱洗脱物中的糖。蔗糖与肌醇的标准混合物的分离显示肌醇后出现并只有部分与蔗糖分开。在分析所述种子提取物时，蔗糖峰后的1毫升洗脱物被收集用于按实施例1的描述再注入DionexPAD系统。在Dionex系统中，肌醇全部在蔗糖前出现并可与染有Zorbax Amino柱级分的蔗糖完全分开。通过与肌醇的外部标准比较，5微升野生型2872品系的注入物含3.2nmoles的肌醇，而5微升5ST-1434和5ST-1309的注入物分别含0.39和0.23nmoles。
进行第二次实验以表征野生型与LR33衍生种子的游离肌醇含量的差别。取自第二对照品系(2242)和LR33衍生品系5ST-1434的七个单一种子按照上述成熟标准收集。所述种子被分别称重，放置在1.5毫升微离心管中，用刮铲捣碎，在干冰上冷冻并冻干。干燥的残留物被称重并加入1毫升80％甲醇，其中含1微摩尔海藻糖以作为Zorbaxamino柱上的肌醇残留标记和作为一种内部标准。所述提取介质在60℃被加热1小时，再次用小杵在所述离心管中研磨并离心以沉降不溶性物质。上清液被转移到含约100微升混合层树脂的第二只微离心管中，所述混合物被简单震摇并移出20微升所述树脂上面的溶液，并在真空中干燥。残留物被重新溶解在110微升总体积中并取55微升注入Zorbax Amino柱，如上述方法过柱。收集海藻糖峰并取20微升柱级分再次注入Dionex系统。通过与海藻糖内部标准比较进行肌醇峰的定量。野生型肌醇含量的平均值±标准差是2.18±0.98微摩尔/(克干重)，而5ST-1434种子含0.77±0.32微摩尔/克干重。两次实验表明携带LR33突变的种子在快速棉子糖合成期含较低的肌醇。在两个实验中没有总肌醇库全部丢失的现象。然而，此类实验仅能测量总代谢种子库，并且肌醇还有另外的途径，该途径通过肌醇半乳糖苷合酶进一步限制其使用(附图1)。肌醇灌注法在棉子糖类体内标记方面的作用
为确认是否所观察到的LR33衍生种子的游离肌醇含量的降低可能是成熟时棉子糖类降低的原因，进行了组织切片灌注研究。按上述成熟标准从野生型品系2242和LR33衍生品系5ST-1434每种收集四个种子。除去种子外被并在pH5.5的5mM磷酸钾缓冲液中冲洗子叶，然后切成约1毫米厚的切片并再次用所述缓冲液冲洗。所述组织切片被分成两组。一组被渗泡在磷酸钾缓冲液中，而另一组被渗泡在含50mM肌醇的磷酸钾缓冲液中。所述组织切片被真空渗透过滤并在室温温孵30分钟。在预温孵期后，每组加入5微居里14C葡萄糖并将该组织再次真空渗透过滤。每组10个组织切片在加入所述葡萄糖标记后被放置2小时和8小时。所述组织切片被放置在涂焦油的1.5毫升微离心管中以取得鲜重并在300微升80％甲醇中研磨。所述离心管被离心，移出上清液到第二个离心管中，重复所述提取两次并合并上清液。将在真空中干燥合并的上清液重新溶解在50％乙腈中并在Zorbax aminoHPLC系统中分离。在通过含葡萄糖，蔗糖，棉子糖和肌醇半乳糖苷的色谱区时以15秒间隔收集级分和通过含水苏糖区时以1分钟间隔收集级分进行闪烁计数。对应于糖标准峰的放射性级分被分组分析。结果被表示为表4中给出的四个糖产物中的标记百分数。
                       表4蔗糖，肌醇半乳糖苷，棉子糖和水苏糖中的放射性标记被表示为用于对照的结合糖中的标记百分数和在与或未与肌醇预温孵的LR33衍生
                品系中标记百分数
    野生型组织切片     5ST-1434组织切片
         2小时2小时    +肌醇          8小时8小时  +肌醇          2小时2小时    +肌醇           8小时8小时   +肌醇
蔗糖肌醇半乳糖苷棉子糖水苏糖  52.4    33.413.4    24.819.8    20.714.4    21.0   41.0    23.88.0     11.117.3    17.733.6    47.4   86.8   43.53.2    27.64.5    15.25.4    13.7   79.8    21.81.5     9.53.1     13.015.9    55.6
野生型与5ST-1434组织切片均转变标记从14C葡萄糖成为蔗糖，然后成为肌醇半乳糖苷，棉子糖和水苏糖。与野生型相比(8小时后58.9％)，未加入外源肌醇，含LR33突变(5ST-1434)的品系转变很少的标记成为棉子糖类(8小时后，20.5％)。两种基因型通过转变更多的所提供的标记成为棉子糖类而与外源肌醇相关。加入肌醇时，两种基因型在其首先转变提供的标记成为肌醇半乳糖苷，然后转变成棉子糖和水苏糖的能力方面基本相同。与未经渗泡的对照相比，甚至在野生型品系中转变速率得到增加。
显然，给肌醇半乳糖苷合酶提供肌醇对合成棉子糖和水苏糖的速率总是个限制。LR33突变的存在使这种限制作用更大。
这种标记模式是出人意料的，因为如果棉子糖合酶中的LR28突变仍在合并的突变品系中通过减慢流动起作用的话，就不会有如所期望的肌醇半乳糖苷中的标记组合了。虽然加入肌醇可期望通过肌醇半乳糖苷合酶增加向肌醇半乳糖苷的流动，但是所述标记由于棉子糖合酶活性的降低而应该在那里积累。这种积累的缺乏产生的问题是或者LR28突变在该品系中起作用或者在该品系中存在。LR33突变对种子植酸和无机磷酸盐水平的影响
上述结果提示LR33突变存在于附图1给出的途径中游离肌醇之前。为进一步限制可能的突变部位，测量了所述途径的该部位的其他代谢物。
由于大豆种子在成熟时含20到30微摩尔/克的植酸水平并由于50到70％的总种子磷酸盐包含在植酸中[Raboy等(1984)《作物科学》(Crop Science)24：431-434]，看来很可能影响肌醇合成的突变也可影响植酸和无机磷酸盐的水平。通过Raboy[上述]描述的方法的修改方法在干燥种子中对三个野生型大豆品系和三个含LR33突变的品系中的植酸和无机磷酸盐的水平进行了检测。每个品系取约20个种子在一个小型冲击研磨机中研磨并称重100毫克的所得粉末到15毫升旋盖试管中。加入5ml的0.4N HCI和0.7M硫酸钠到所述粉末中并在一个震动平台上震荡混合过夜。所述试管在3900xg离心15分钟。移出2毫升上清液到第二只玻璃试管中。加入2毫升水和1毫升15mM氯化铁，将所述试管在沸水浴中加热20分钟。如上述离心所述试管以沉淀铁∶植酸混合物，弃去上清液。将沉淀物重悬浮于2毫升0.2N HCI中并在沸水浴中加热10分钟。将所述沉淀再次用离心法除去并重悬浮在2毫升5mM EDTA中。
取15微升EDTA悬浮液进行湿灰化以获得植酸磷酸盐。向每只含15微升一份的试管加入10微升10％硝酸钙溶液。使水蒸发并在火焰上加热残留物直到在所述试管中剩下白灰。所述灰份被溶解在0.3毫升的0.5N HCI中并在90℃加热20到30分钟。加入钼酸盐试剂(0.7毫升0.36％钼酸铵和1.42％维生素C在0.86N硫酸中)并显色1小时，然后在820nm读值。
通过加入0.3毫升的0.5N HCI和0.7毫升的磷酸盐显色试剂到20或40微升一份的初始5毫升提取物中测定无机磷酸盐。在同时进行磷酸钾标准物的显色。将所述实验重复三次，其结果在表5中给出。
                        表5在无机磷酸盐和植酸中的种子无机磷酸盐表达为微摩尔/无机磷酸盐/克(在两次平行实验取得多个值或两次平行实验取平均值时，数值用平
                均值±标准差表示)
种子品系  基因型    平行实验    无机磷酸盐    植酸磷酸盐
2872      野生型      7          2.7±3       125±8.4
1923      野生型      1          2.0          126
1929      野生型      2          1.5          155
5ST-1309  LR33        4          76.0±5.7    62.5±12.4
G×E-117  LR33        7          36.7±6.4    55.8±13.9
G×E-76   LR33        6          32.2±3.5    72.8±14
根据所获得突变的遗传背景的不同，LR33突变还引起种子植酸水平(在植酸组分中表示为磷酸盐)约两倍的降低和种子无机磷酸盐含量的约15被到25倍的同时增加。基于附图1的代谢途径，植酸含量的降低以及游离肌醇含量的降低更可能是由于降低的肌醇1-磷酸合酶的活性的突变所引起。
无机磷酸盐含量的增加的确切原因尚属未知，但长期以来认为植酸起在植物的种子和其他部位中的磷酸盐储存形式的作用。可能，当优选的储存平台(肌醇)不可利用时，不断形成的无机磷酸盐没有其他归宿，而只能简单积累。
                      实施例3
            纯合LR33品系的种子表型的鉴定
分析了几个另外的大豆品系的种子无机磷酸盐。将100毫克的研磨种子用1毫升热水提取并离心除去不溶性物质。将上清液用100微升二氯甲烷提取以除去脂类物质，用三氯醋酸将所述水提取物的其余部分制成10％溶液。离心所述溶液以除去蛋白质并按实施例2中的描述取5微升上清液分析无机磷酸盐。表6给出这些检测的实验结果。
                           表6野生型，LR28，LR33和LR28×LR33大豆植株种子的无机磷酸盐含量(μmoleg-1)
品系       基因型    无机磷酸盐
A2872      野生型      12.7
LR28        LR28       12.7
LOW2        LR28       12.9
5ST-1190    LR28       14.4
5ST-1191    LR28       14.0
5ST-1441    LR33       23.4
5ST-1309    LR28×LR33 117.6
5ST-1310    LR28×LR33 113.9
5ST-1433    LR28×LR33 74.2
5ST-1434    LR28×LR33 57.1
G×E-117    LR28×LR33 74.3
G×E-305    LR28×LR33 70.7
G×E-76     LR28×LR33 79.1
G×E-77     LR28×LR33 58.4
全部含LR28突变克隆的品系无机磷酸盐水平与野生型对照相等。品系5ST-1441来自LR33(上述实施例2)并有水苏糖的平缓降低，这种降低原与所述突变相伴随。5ST-1441仅有无机磷酸盐含量的略微增加。尽管事实上两亲本均无高无机磷酸盐水平，但LR33与LR28杂交所得的全部品系的无机磷酸盐水平明显上升。
只含LR33突变的品系5ST-1441的中间产物无机磷酸盐表型是出人意料的。这可能表明产生低植酸/高无机磷酸盐表型一定有LR28和LR33突变的存在。然而，如果所述的两个突变事实上发生在编码似乎被降低的两种活性的结构基因中，则它们就在某种意义上与所述代谢途径无关，这提示了对改变植酸合成的一种附加作用。如果LR33中的突变既影响了游离肌醇又影响了总肌醇的产生，该突变自身就应与低植酸和产生的高无机磷酸盐表型有关。
另一个解释可能是品系5ST-144不是LR33突变的纯合型，而且对大量种子的分析仅给出野生型，纯合突变型与杂合型种子的平均表型。为检查这种可能性，将取自大量5ST-1441种子样品中的13个单一种子称重，研磨并用热水提取。不沉淀蛋白质并如前述测量无机磷酸盐。结果在表7中给出。
                   表7品系5ST-1441的13个种子的大约无机磷酸盐含量(微摩尔/克)(由于样品中蛋白质的存在，与表6的结果比较的实际上升数值)
种子号       机磷酸盐
5ST-1441-a    21.9
5ST-1441-b    30.4
5ST-1441-c    25.4
5ST-1441-d    81.1
5ST-1441-e    29.7
5ST-1441-f    25.7
5ST-1441-g    25.5
5ST-1441-h    30.8
5ST-1441-i    28.2
5ST-1441-j    123.5
5ST-1441-k    27.9
5ST-1441-l    115.9
5ST-1441-m    27.6用字符d，j和l表示的种子比分析的其余10个种子有高出约3倍的无机磷酸盐。其中的比例接近从分离种子群体的期望值，其中高无机磷酸盐的突变表型是隐性的并且应归因于单基因的活动。为检查这个推断，取自5ST-1441大批量样品的20个种子被渗泡在室温的水中共6小时。筛去多余的水并切下远离胚胎茎轴一端的子叶样品。将该组织切片称重，放置在1.5毫升微离心管中并在充足的70％甲醇中研磨以得到每100微升提取体积10毫克鲜重。如上述测量离心后上清液中存在的磷酸盐，结果在表8中给出。
                        表8来自品系5ST-1441种子的分离群体的20个部分种子的无机磷酸盐含量种子号                       PO4(微摩尔/克鲜重)
1                                 4.9
2                                 4.3
3                                 5.3
4                                40.1
5                                 6.1
6                                 5.0
7                                37.1
8                                 9.9
9                                 5.9
10                                3.8
11                               26.9
12                                4.7
13                                5.5
14                                3.9
15                                5.2
16                               17.7
17                                5.9
18                                4.9
19                                2.5
20                               28.9
种子4，7，11，16和20被种植在栽培室的花盆中。种子7，11，16和20存活下来并在实施例2描述的生长条件下栽培成熟。来自所述成熟植株的大批种子和两种野生型对照(A2872)被干燥后收集并每株取20个种子在容器中研磨供使用实施例1和2中描述的方法分析可溶性碳水化合物与植酸。总种子植酸含量如(植酸磷酸盐含量)/6计算。其结果在表9中给出。
                      表9来自携带LR33突变种子的分离群体之四个植株的可溶性碳水化合物含量(表示为微摩尔/克)并选择与两个对照一起进行部分种子中上升
    的无机磷酸盐分析(植酸值是两个复本的平均值。)
品系     植酸    水苏糖    棉子糖  肌醇半乳糖苷  蔗糖
A2872    32.3      71        19         3         166
A2872    30.8      67        24         0         144
LR33-7   23.7      40        16         0         155
LR33-11  8.8       4         13         0         212
LR33-16  9.5       4         13         2         209
LR33-20  7.6       4         11         0         208
尽管7号(LR33-7)种子长出的植株的可溶性碳水化合物表型十分类似于表1中给出的LR33突变所描述的表型，但其他植株有十分低水平的棉子糖类和十分高水平的蔗糖。这些可溶性碳水化合物的水平十分类似于表2中的突变体结合LR28×LR33中的某些植株所描述的表型。对这种差异的最有可能的解释是在表1中给出数据的大批被分析的种子来自LR33突变的植株分离，而非所述突变的纯合植株。在挑选突变是纯合的植株时，如本实施例中植株11，16和20所发生的情况，观察到真正的纯合种子表型。先前有关产生低棉子糖，水苏糖和肌醇半乳糖苷的结合物需要LR28和LR33突变都存在的假设是不正确的。虽然LR33突变型纯合品系不是从自花受粉的原初鉴定的突变品系获得的，但从其与LR28杂交而产生的分离子可获得它们。尽管所述杂交的某些后代可能确实含有两种突变型，但LR33突变的表型对从LR28突变产生的表型是显性的。这种显性主要来源于位于LR28突变形成的碳流的LR33突变上游的位置。(见附图1和实施例2)。
纯合LR33表型仍令人费解的原因可能是由于原初突变品系所遇到的发芽问题。在大片分离的条件下，来自自花受粉LR33的种植种子有25％(该比例已成为突变纯合型)丢失没有被观察到。因此，从大批群体收获的植株的纯合型被排除，而突变型基因被保留在杂合状态的群体中。我们推测遗传背景的异型杂交更易使LR33纯合子在大田条件下出现，从而使得发现纯合子。最初的异型杂交属于携带棉子糖类生物合成途径中的另一突变，这对于所述杂交的原始意图是容易发生的，并且对超表型或增加在大田中的出现都不是必需的。
因此，LR33突变能产生大豆植物，所述大豆植物产生的种子含每克种子低于5微摩尔水苏糖，每克种子低于20微摩尔棉子糖，每克种子高于200微摩尔蔗糖和每克种子低于10微摩尔植酸磷酸盐。
                        实施例4
含LR33突变型大豆品系的可溶性碳水化合物与植酸含量
进行低棉子糖类品系LR33与LR28的杂交并通过实施例1中描述的HPLC检测筛选分离的F2植株，其F2植株种子中有低水平的棉子糖，水苏糖与肌醇半乳糖苷含量。然后将这种杂交中筛选的品系与优良栽培亲本杂交，这些杂交的子代以同样方法在F2代中选择。在这些含低水平棉子糖类品系中，挑选数个有先进蔬菜植物农艺学特征的品系。随后将其中一个品系(命名为4E76)与另一优良大豆栽培植株进行测交，并对从所述测交获得的自花受粉F1植株的单一种子分析其可溶性碳水化合物与无机磷酸盐含量。所述种子分成两类，具有很低的无机磷酸盐和棉子糖加水苏糖野生型含量的那些种子，和有升高的无机磷酸盐水平以及很低的棉子糖加水苏糖水平的较小的一类。这两类的比例十分接近隐性LR33突变所预期的3∶1比例。没有影响棉子糖类的其他突变的LR28分离证据出现在原始的杂交中。因此品系4E76代表在选择的优良栽培品种背景中的LR33突变。这种品系被种植在总共9种环境下两年以上，同时进行优良检查品系的碳水化合物分析。来自3种环境下的一组更多限制的样品被分析其植酸含量。所述碳水化合物的数据在表10中给出，而植酸数据在表11中给出。
                     表10含LR33品系4E76和13个优良栽培品种检测的水苏糖，棉子糖和蔗糖
  含量平均值，标准差(SD)与平均值的双标准差(2SD)
          (全部数值表示为微摩尔/克种子重)
  品系         水苏糖平均值    SD    2SD         棉子糖平均值    SD     2SD         蔗糖平均值   SD      2SD
 4E76A2514A2396A1923A2506A3322A2923A2234A1923A3313A1662A3935A2833A3510  2.4     0.5    1.044.8    2.7    5.447.8    1.1    2.250.2    2.8    5.651.0    3.7    7.454.2    7.3    14.656.4    2.2    4.457.2    9.1    18.257.5    4.5    9.061.0    9.7    19.461.6    6.2    12.462.8    9.2    18.463.8    8.6    17.268.8    9.4    18.8  6.9      0.7    1.413.0     2.6    5.29.6      0.9    1.88.6      0.5    1.016.4     4.0    8.014.0     2.7    5.413.6     1.7    3.416.6     3.4    6.818.5     3.4    6.814.4     3.9    7.813.8     3.4    6.811.6     2.1    4.215.4     2.4    4.814.2     1.9    3.8  249    42.9    85.8138    9.6     19.2158    9.6     19.2148    9.4     18.8161    28.2    56.4147    27.1    54.2125    9.2     18.4145    21.2    42.4156    29.8    59.6172    37.9    75.8127    21.4    42.8184    38.7    77.4150    38.7    77.4160    33.0    66.0
                     表11含LR33品系4E76和优良栽培查对品系A2872的植酸含量的平均值和
               平均值的双标准差(全部数值表示为微摩尔/克种子重量并代表来自三种环境的数据)
品系           植酸
        平均值      SD      2SD
4E76     12.3       2.4     4.8
A2872    20.9       0.9     1.8
与优良大豆栽培品种(典型的上市大豆)比较，所述LR33衍生品系比每克种子重的总棉子糖类质量低8到9倍。植酸质量也降低约40％。
与优良大豆栽培品种比较，LR-33衍生品系棉子糖和水苏糖质量均低。尽管棉子糖含量只略微比优良品系中所见值低，但水苏糖含量则被显著降低了。已知，在用大豆饲料饲养单胃动物时，大豆棉子糖类对能量使用效率的有害作用是由于对α-半乳糖苷键的不良消化能力。因此，结合的棉子糖加水苏糖含量的降低是对增加的消化能力的适当测量方法。事实上，这种测量方法甚至可能低估了直接的表型效应，因为水苏糖每摩尔糖含两摩尔的α-半乳糖苷键。
成熟大豆的绝对水苏糖类含量已知随环境因素而有不同。存在于LR33衍生品系中的突变的作用具有足够的力量使所述品系的结合棉子糖加水苏糖含量低于14.5微摩尔/克种子重，并且应总是保持远低于同样环境中生长的野生型大豆的相应含量。
还知道成熟大豆种子的植酸含量相对于环境因素，主要是由于土壤中可利用的磷酸盐的水平的改变而变化。再次重申，LR33衍生品系中存在的突变在各种生长环境下均保持总种子植酸含量低于17微摩尔/克。
                    实施例5
               LR33突变的分子鉴定
实施例2中存在的LR33衍生品系中代谢物分析的证据提示LR33突变引起种子产生肌醇能力的降低。
在植物以及其他生物中，唯一产生肌醇的途径是从葡糖-6-磷酸转换成肌醇-1-磷酸开始，该反应由肌醇-1-磷酸合酶催化，并终止于特异性肌醇-1磷酸磷酸酶催化的1-磷酸盐水解(见附图1；Loews，F.A.：《植物中的肌醇代谢》(Inositol Metabolism in Plants)(1990)Wiley-Liss，New York，13-19页])。由于植酸有作为其可能前体的肌醇-1-磷酸并且由于植酸水平因LR33突变而降低，所以肌醇磷酸合酶的基因及基因产物在野生型中和LR33突变体植株中被表征。野生型大豆肌醇-1-磷酸合酶的cDNA的克隆
如下制备cDNA库。从豆荚中移出大豆胚胎(每个约50毫克鲜重)并在液氮中冷冻。冷冻的胚在液氮存在下被磨成细粉，然后用Polytron匀浆提取并分级分离以通过Chirgwin等((1979)《生物化学》(Biochemistry)18：5294-5299)的方法富集总RNA。
核酸级分通过使总RNA过oligo-dT纤维素柱而富集polyA+RNA并用如Goodman等((1979)《酶学法》Meth.Enzymol.68：75-90)描述的盐洗脱polyA+RNA。用cDNA合成系统(Bethesda ResearchLaboratory，Gaithersburg，MD)和厂商的说明从纯化的polyA+RNA合成cDNA。所得产物双链DNA通过EcoRI DNA甲基化酶(Promega)甲基化，此前用T4DNA聚合酶(Bethesda Research Laboratory)充填其末端并用T4DNA连接酶(Pharmacia)平头连接到磷酸化的EcoRI多接头。用EcoRI酶消化双链DNA，通过凝胶过滤柱(SepharoseCL-4B)从过剩的接头中分离之，并按照厂商的说明连接到λZAP载体(Stratagene)。用GigapackTM包装提取物(Stratagene)按照厂商的说明将所述连接的DNA包入噬菌体。所得cDNA库按照每一Stratagene的说明进行扩增并储存在-80℃。
遵循λZAP克隆试剂盒手册(Stratagene)，所述cDNA噬菌体库被用于感染大肠杆菌XL1细胞，而总共约300,000噬斑形成单位被铺到六个150毫米直径的培养平板上。
将所述平板的复本吸印物印迹到纤维素滤膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH)。将所述滤膜在含6×SSPE，5×Denhardt’s溶液，0.5％SDS，5％葡聚糖硫酸酯和0.1毫克/毫升变性鲑精DNA(Sigma Chemical Co.)的25毫升杂交缓冲液中于60℃预杂交2小时。
然后将封闭的滤膜与从鼠耳芥的cDNA制备的放射性标记探针杂交，鼠耳芥已被鉴定其肌醇1-磷酸合酶与酵母肌醇-1-磷酸合酶是同源的[Johnson，M.A.(1994)《植物生理学》(Plant Phusiol.)105：1023-1024]。所述鼠耳芥克隆从Arabidopsis BiologicalResource Center，DNA Stock Center，1060 Carmack Road，Columbus，OH43210-1002获得，克隆号为181C18T7113E9T7。通过用SalI和NotI消化载体DNA移出1.2kBcDNA插入片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳纯化所述DNA片段。纯化的片段用[32P]dCTP，随机引物标记试剂盒(Bethesda Research Laboratory)标记。使滤膜在如预杂交所描述的同样条件下杂交过夜。将剩余的放射性标记在含0.1％SDS的0.6×SSC中洗去。然后进行两次洗涤，每次在0.2×SSC，0.1％SDS，60℃下约10分钟以除去非特异性结合标记，并且所述滤膜被用于在感光胶片上曝光过夜。观察到约200个阳性信号。通过剪下所述信号周边区域，重新铺噬菌体平板和如上方法重新筛选纯化出6个克隆。使用厂商描述的方法(Strategene)将两个克隆剪下成噬菌粒并用于感染大肠杆菌以获得质粒克隆。在两个克隆中，一个称为p5bmi-1-ps的用Applied Biological Instruments的方法与设备进行测序。p5bmi-1-ps中的cDNA插入片段的核苷酸序列在SEQ ID NO：1中给出，而其推导的氨基酸序列由SEQ ID NO：2中的序列编码。LR33大豆未成熟种子的肌醇1-磷酸合酶的cDNA的克隆
来自编号为11，16和20的LR33植株的种子以及实施例3中描述的种子在种子灌浆期约50％时被收获，从豆荚中移出并冷冻储存在-80℃，进行mRNA分离时，来自大批种子群体的2克冷冻种子用臼和杵在液氮中被研磨。
将冷冻的粉末再次在10毫升总RNA提取缓冲液中研磨，该缓冲液包含10mM Tris-HCI，pH 9，10mM EDTA，0.5％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，0.8M NaCI，1％2-巯基乙醇，和2％聚乙烯吡咯烷酮。配制全部试剂的水用0.05％焦氨基甲酸二乙酯处理，然后高压30分钟。组织浆液被转移到15毫升聚丙烯试管中并在5,500Xg离心15分钟。上清液通过Miracloth(Calbiochem)进入第二只聚丙烯试管并加入0.3体积的氯仿。在5,500xg离心10分钟分相，将上层相转移到另一只聚丙烯试管，向其中加入1.5体积的10mM Tris-HCI(pH9)，10mM EDTA，0.5％CTAB和0.1％2-巯基乙醇。室温温孵30分钟后通过5,500xg离心20分钟沉淀核酸。
所述核酸被重新溶解在含0.1％2-巯基乙醇的0.4毫升1M NaCl中。用一体积的1∶1酚∶氯仿提取后，用两体积的乙醇沉淀核酸。
用Pharmacia的mRNA沉淀纯化盒从该核酸级分中纯化mRNA。获得约12微克的mRNA。13ng的聚腺苷酸化的mRNA被用做模板以使用GeneAmpRNA-PCR试剂盒(Perkin Elmer Cetus，Part no.N808-0017)从oligo-dT进行扩增。逆转录酶反应在42℃进行30分钟。进行PCR扩增时，用所述试剂盒厂商提供的DNA聚合酶代替VentTMDNA聚合酶(New England Biolabs)并加入另2微升100mM硫酸镁到每个100微升反应物中。5’引物序列在SEQ ID NO：3中给出，其包含SEQ IDNO：1中的第57到77碱基另加碱基5’-GGGAATTCCATATG-3’以编码NdeI位点，在该引物中有八个5’的附加碱基促进限制酶对该序列的活性。
3’引物含SEQ ID NO：4给出的序列并包含SEQ ID NO：1中第1566到1586碱基的反向互补片段，还含有5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGC-3’碱基附加在所述引物中以提供NotI位点，还有另10个碱基以促进限制酶消化反应。所述PCR反应在52℃退火温度和1.5分钟延长时间进行35个循环。获得一个约1550碱基对的产物并通过Amicon50微离心管滤器而纯化，然后用等体积的1∶1酚∶氯仿提取，酚∶氯仿分离相的上层用一个体积的氯仿提取并用乙醇沉淀。将所得5微克纯净PCR产物用NdeI和NotI在37℃消化过夜。将限制酶消化物通过上述酚∶氯仿提取方法除蛋白并连接到2微克用NdeI和NotI消化好并用小牛肠碱性磷酸酶处理以水解其末端磷酸的pET24aT7表达载体(Novogen)中。所述连接混合物被用于转化电感受态(electocompetant)DH 10B大肠杆菌细胞并通过在含30毫克/升卡那霉素的平板上培养筛选转化体。从转化平板挑出18个单菌落并放在100微升的无菌水中。40微升的所述细胞混合物被用做PCR反应的DNA模板，该反应用TaqTM聚合酶(Perkin Elmer)，所述引物和最初在分离所述cDNA插入片段时使用的PCR反应条件下进行。将六个菌落用做扩增正确大小的产物的模板。这些克隆的其余60微升细胞混合物被培养过夜并从每个克隆制备质粒DNA制剂。从六个克隆的每个克隆纯化的质粒用于转化电感受态(electrocompetant)DE3大肠杆菌细胞。野生型与LR33大豆的肌醇-1-磷酸合酶在大肠杆菌中的功能表达
通过用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中的引物进行p5bmi-1-ps的PCR扩增和通过上述有关来自逆转录mRNA的LR33肌醇-1-磷酸合酶克隆化的克隆方法将野生型大豆肌醇-1-磷酸合酶放入所述pET24aT7表达载体中。在这种情况下，显示出含携带所述cDNA插入片段的质粒的9个DH10B克隆来源的质粒制剂被汇集并用于转化电感受态(electrocompetant)DE3大肠杆菌细胞。
筛选卡那霉素抗性菌落并挑选六个用于接种过夜培养物。使过夜培养物在30℃的含30毫克/升卡那霉素的LB培养基中生长，用新鲜培养基稀释两倍，使其在生长1小时，通过加入异丙基硫代半乳糖苷到1mM终浓度进行诱导。
3小时后通过离心收集细胞并再悬浮于含0.1mM DTT和0.2mM苯基甲磺酰氟化物的50微升50mMTris-HCI pH8.0中。加入少量1毫米玻璃珠并用微探针超声发生器将混合物超声处理3次，每次5秒钟。所述混合物被离心并测定上清液中蛋白质浓度。取每个克隆培养物的可溶性级分来源的1微克蛋白质用SDS-PAGE分离。选产生约60千道尔顿质量的额外蛋白质带的培养物进行活性测定。
检测时，使用[32P]-γ-ATP作为磷酸的供体通过己糖激酶催化的葡糖磷酸化来制备[32P]葡糖-6磷酸。室温30分钟后，使所述反应混合物过SEP-PAC C18柱(Millipore Corp.Milford，MA)，该柱首先用80％甲醇然后用水洗涤过。与另外0.5毫升一起收集过柱物并通过SEP-PAC SAX柱，然后用1毫升80％甲醇洗柱。用2毫升0.02N HCl的80％甲醇溶液洗脱[33P]-葡糖-6-磷酸。加入40微升1MTris碱并在真空下除去甲醇。剩余溶液中的葡糖-6-磷酸浓度通过葡糖-6-磷酸脱氢酶将其转换成6-磷酸葡糖醛酸进行测定。在该反应中产生的NADPH通过340nm吸收度定量。
将10微升细胞提取物在100微升反应物中，37℃温孵30分钟，所述反应物是2mM葡糖-6-磷酸(57，334dpm总33P)，0.1mM NAD和15mM醋酸铵。所述反应物被加热到90℃以沉淀蛋白质，离心到澄清。将47微升的上清液与0.1N NaOH和0.1N醋酸钠一起上DionexTMPA-1柱，流速0.9毫升/分钟。灌注后8到10分钟之间洗脱的标准肌醇1-磷酸和分离的反应混合物的1分钟级分在相应时间范围内被取来做闪烁计数。加合峰值级分的放射活性以获得葡糖-6-磷酸到肌醇-1-磷酸的转化率以及一个含空pET24aT7载体的对照大肠杆菌DE3培养物和含大豆肌醇1-磷酸合酶cDNA的两个克隆的结果，它们在表12中给出。
                          表12三个大肠杆菌细胞培养提取物(大豆克隆1和2含大豆肌醇1-磷酸合酶，而对照含空质粒)的比活性(微摩尔肌醇1-磷酸产生/分钟/毫克蛋白质)
品系                       比活性
对照                 0.024微摩尔份钟/毫克
大豆克隆1            0.524微摩尔/分钟/毫克
大豆克隆2            0.892微摩尔/分钟/毫克
在所述检测进行时，含cDNA的两个克隆基本上使用全部可用底物并且因此比对照品系活性高35倍以上。因此，大豆肌醇1-磷酸合酶基因在大肠杆菌中能产生有功能的酶。
培养野生型大豆肌醇1-磷酸合酶克隆1号(大豆克隆1)和三个LR33肌醇1-磷酸合酶克隆用于如上描述的蛋白质表达。通过SDS-PAGE分离来自每个克隆的可溶性细胞提取物的蛋白质5微克。LR33克隆10号(LR33-10)产生可溶的，60千道尔顿蛋白质，基本上与野生型克隆1号产生的蛋白质同样丰富。通过上面描述的方法，使用100微升反应物，其中有3微摩尔NAD和90微摩尔葡糖-6-磷酸，检测来自两种提取物的每个提取物的4微克蛋白质。野生型肌醇1-磷酸合酶的比活性是1.5nmol/分钟/毫克蛋白质，而在这些条件下LR33衍生的肌醇1-磷酸合酶比活性是0.16nmol/分钟/毫克蛋白质。编码LR33肌醇1-磷酸合酶的cDNA核苷酸序列
使用对野生型克隆时所描述的相同质粒源和DNA测序法而得到的克隆的DH10B大肠杆菌菌株测定克隆LR33-10中的cDNA插入片段的核苷酸序列(含编码LR33肌醇1-磷酸合酶的核酸片段)。所述核苷酸序列在SEQ ID NO：5中给出，而推导的氨基酸序列从SEQ ID NO：6中所述克隆的可读框获得。通过编码链上的单碱基对的改变，SEQ IDNO：5的G变成SEQ ID NO：1的1241号碱基的T。这种改变导致第396号氨基酸从野生型序列中的赖氨酸(SEQ ID NO：2)变成LR33氨基酸序列(SEQ ID NO：6)中的天冬酰胺。
为确认这种碱基对的改变产生于LR33基因组中的改变，而不是PCR产生的错误，这种错误在克隆LR33肌醇1-磷酸合酶时可能会发生，制备了两套PCR引物。野生型引物(SEQ ID NO：7)和LR33引物(SEQ ID NO：8)被用于扩增来自大豆栽培品系A2782的干种子和大豆品系LR33第16号克隆(见表8)制备的基因组DNA。在SEQ ID NO：4中描述的PCR引物被用做共同的反义链引物。在退火温度62℃或64℃和35个进行退火和延长的循环条件下，当使用A2872DNA为模板时只有野生型引物产生PCR产物，而当使用LR33DNA为模板时，只有相应于LR33序列的引物产生产物。
为进一步检查测试所述突变的引物的特异性，从实施例3(见表8)中描述的分离的LR33克隆第7号品系的种子长出的六棵单植株制备DNA。在从分离群体检测出的六棵单植株中，两棵提供作为两引物的模板的DNA，三棵提供作为只与野生型引物在一起的引物的DNA，而一棵提供只与LR33引物在一起产生产物的DNA。这些成为从含一个野生型和一个突变型拷贝基因的杂合子的群体所预期的结果。
从代谢物数据和序列数据中，我们总结出所观察到的十分低的总棉子糖类，十分高的蔗糖和低植酸的种子表型全部是由于与SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：5中给出的野生型和LR33序列相比而描述的单碱基变化的突变所致。实施例6转化大豆以达到肌醇-1-磷酸合酶的基因沉默和相伴随的种子表型用于转化大豆以减低肌醇-1-磷酸合酶在发育的大豆种子中的表达之载体的构建
含大豆Kunitz Trypsin Inhibitor3(KTi3)启动子[Jofuku和Goldberg，(1989)《植物细胞》(Plant Cell)1：1079-1093]控制下的反义和有义方向的大豆肌醇1-磷酸合酶cDNA序列，菜豆7S种子储存蛋白质(菜豆蛋白)启动子[Sengupta-Gopalan等，(1985)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)82：3320-3324；Hoffman等，(1988)《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)11：717-729]和大豆β-conglycinin启动子[Beachy等，(1985)《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)4：3047-3053]的质粒被构建。通过使用下述质粒：pML70，pCW108和pCW109A便利构建表达这些启动子控制下的大豆肌醇-1-磷酸合酶cDNA的载体。
pML70载体含KTi3启动子和KTi3 3’非翻译区并且是从市售载体pTZ18R(Pharmacia)通过中间质粒pML51，pML55，pML64和pML65衍生而来。一个2.4kb的完整大豆KTi3基因的BstBI/EcoRI片段[Jofuku和Goldberg前文]被连接到pTZ18R的AccI/EcoRI位点以创建质粒pML51，所述片段含5’非翻译区的全部2039个核苷酸和终止于与Jofuku等(1989)《植物细胞》(Plant Cell)：427-435中描述的序列的755到761碱基对应的EcoRI位点之KTi3编码序列的390碱基。将质粒pML51用NcoI切开，用Klenow充填，并连接(以破坏KTi3插入片段5’非翻译区中部的一个NcoI位点)而产生质粒pML55。将质粒pML55用XmnI/EcoRI部分消化以释放0.42kb片段(对应于上面引述序列的732到755碱基)。含一个NcoI位点的合成XmnI/EcoRI接头通过制备一个互补的合成寡聚核苷酸的二聚体而构建，所述寡聚核苷酸含一个XmnI位点(5’-TCTTCC-3’)和一个NcoI位点(5’-CCATGGG-3’)的编码序列，后面紧接EcoRI位点的一部分(5’-GAAGG-3’)。通过一个短的间隔序列(5’-ATAGCCCCCCAA-3’)将XmnI与NcoI/EcoRI位点连接起来。将这个合成接头连接到4.94kb片段的XmnI/EcoRI位点以创建质粒pML64。KTi3基因的3’非翻译区从Jofuku等[前文]所描述的序列通过标准PCR方法使用引物ML51和ML52扩增。引物ML51含对应于上面引述的序列之1072到1091碱基的20个核苷酸外加在所述引物5’端的对应于EcoRV(5’-GATATC-3’)，NcoI(5’-CCATGG-3’)，XbaI(5’-TCTAGA-3’)，SmaI(5’-CCCGGG-3’)和KpnI(5’-GGTACC-3’)位点的核苷酸。引物ML52含对应于上面引述的序列的1242到1259碱基的确切的核苷酸补体，在所述引物的5’端外加对应于SmaI(5’-CCCGGG-3’)，EcoRI(5’-GAATTC-3’)，BamHI(5’-GGATCC-3’)和SalI(5’-GTCGAC-3’)位点的核苷酸。PCR扩增的KTi3基因的3’端被连接到pML64的NcoI/EcoRI位点以创建质粒pML65。合成的多克隆位点接头通过形成互补合成寡核苷酸二聚体而构建，所述二聚体含PstI(5’-CTGCA-3’)，SalI(5’-GTCGAC-3’)，BamHI(5’-GGATCC-3’)和PstI(5’-CTGCA-3’)位点的编码序列。所述接头被连接到pML65的PstI位点(紧邻KTi3启动子区5’)以创建质粒pML70。
pCW108载体含菜豆的菜豆蛋白启动子和3’非翻译区并且是从市售pUC18质粒(Gibco-BRL)通过质粒AS3和pCW104衍生而来。质粒AS3含495碱基对的菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白(7S种子储存蛋白质)启动子，它开始于5’-TGGTCTTTTGGT-3’，后接被克隆到pUC18的HindIII位点的同一基因之3’非翻译区完整的1175碱基对[见Doyle等(1986)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)261：9228-9238和Slightom等(1983)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：1897-1901中的序列描述；进一步的序列描述可在世界专利申请WO911/3993中找到]。所述pUC18多克隆区的附加克隆位点(EcoRI，SphI，PstI和SalI)通过用EcoRI和SalI消化而移除，用Klenow填平末端并再次连接以产生质粒pML104。在5’菜豆蛋白的495bp与3’菜豆蛋白的1175bp之间的新多克隆位点通过插入一个互补合成的寡核苷酸二聚体而创建，所述二聚体含NcoI位点(5’-CCATGG-3’)编码序列，后接三个充填碱基(5’-TAG-3’)，SmaI位点(5’-CCCGGG-3’)编码序列，最后是KpnI位点(5’-TAC-3’)的三个碱基，一个胞嘧啶和一个XbaI位点(5’-TCTAGA-3’)编码序列以创建质粒pCW108。该质粒含直接与所述菜豆蛋白启动子结合的唯一的NcoI，SmaI，KpnI和XbaI位点。
载体pCW109A含大豆β-conglycinin启动子序列和菜豆蛋白3’非翻译区并且是载体pCW108的一个修饰版本，后者是从市售质粒pUC18(Gibco-BRL)衍生而来。载体pCW109通过向克隆载体pUC18的HindIII位点插入β-conglycinin基因的555bp5’非编码区(含启动子区)后接含限制性内切酶位点NcoI，SmaI，KpnI和XbaI(如上面pCW18中所述)的多克隆序列，然后将共同的菜豆蛋白3’非翻译区的1174bp插入HindIII位点(如上所述)。
由于在27个核苷酸位置的差别，所使用的β-conglycinin启动子是发表的β-conglycinin基因[Doyle等，(1986)《生物化学杂志》J.Biol.Chem.261：9228-9238]的等位基因。这个基因的进一步序列描述可在世界专利发布WO91/13993中找到。
这三个核酸构建体组成含盖广泛的发育期间，包括为随后转变成植酸的肌醇合成期之表达的种子特异性表达载体，在上面实施例5中描述的PCR方法便利将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5中描述的序列插入这些载体。与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的选择区域互补的PCR引物可用附加的碱基合成，所述碱基构成限制性内切核酸酶的识别序列，而所述内切核酸酶识别序列选自那些也在pML70，pCW108和pCW109的启动子序列之后的多克隆序列内进行切割的识别序列。可选定限制位点的位置以便指导来自大豆肌醇1-磷酸合酶的核酸片段的取向进入有义方向以达到超表达或共抑制或进入反义方向以达到次表达。体细胞大豆胚胎培养物的转化与大豆植株的再生
下列储液和培养基用于支持体外大豆组织的生长：储液：
 MS硫酸盐(100×储液)  MS卤化物(100×储液)
 MgSO4 7H2O    37.0MnSO4 H2O     1.69ZnSO4 7H2O    0.86CuSO4 5H2O    0.0025  CaCl2 2H2O   44.0KI              0.083CoCl2 6H2O   0.00125KH2PO4       17.0H3BO3        0.63Na2MoO42H2O 0.025
维生素B5  MS Fe EDTA(100×储液)
肌醇烟酸吡多醇HCl  Na2EDTA       3.72FeSO47H2O    2.784
培养基成分(每升)                SB55    SBP6    SB103   SB71-1MS硫酸盐储液               10mL    10mL    10mL     -MS卤化物储液               10mL    10mL    10mL     -MSFeEDTA储液               10mL    10mL    10mL     -维生素B5储液               1mL     1mL     -        1mL2，4-D储液(10毫克/毫升)    1mL     0.5mL   -        -蔗糖                       60g     60g     -        3％麦芽糖                     -       -       6％      -天冬酰胺                   0.667g  0.667g  -        -硝酸铵                     0.8g    0.8g    -        -硝酸钾                     3.033g  3.033g  -        -氯化镁                     -       -       750mg    750mg脱乙酰吉兰糖胶             -       -       0.2％    0.2％pH                         5.7     5.7     5.7      5.7
大豆胚基因悬液培养物被保持在一旋转震荡器上的35毫升液体培养基中(SB55或SBP6)，150转/分钟，28℃，荧光灯或白炽灯按16：8小时的昼/夜时间表。通过每四周接种约35毫克组织到35毫升液体培养基中进行培养物的次级培养。
大豆胚胎悬浮培养物可用含有义或反义方向的肌醇1-磷酸合酶的种子特异性表达载体通过粒子枪轰击法进行转化(见Kline等(1987)《自然》(Nature)(London)327：70)。DuPont BiolisticTMPDS1000/HE仪器(氦更新法)被用于这些转化。
向50毫升60毫克/毫升的1微摩尔金粒子悬液(依次)加入：5微升DNA(1微克/微升)，20微升亚精胺(0.1M)，和50微升氯化钙(2.5M)。搅拌所述粒子制备液3分钟，在微离心管中旋转10秒钟并移出上清液。然后在400微升70％乙醇中洗涤DNA包被的粒子一次并重悬浮在40微升的无水乙醇中。所述DNA/粒子悬液被超声三次，每次1秒钟。然后将5微升DNA包被的金粒子上载到各大载体圆盘上。
约300-400毫克四周龄的悬浮培养物被放在空的60×15毫米培养皿中并用吸管从组织中移出残留液体。在每个转化实验中，通常轰击约5-10个平板的组织。破坏膜的压力设置在1000psi且小室被抽成28英寸汞柱的真空。所述组织被放在距离遮挡屏约3.5英寸处并被轰击三次。轰击之后，所述组织被放回到液体中并如上述进行培养。
轰击后11天，将所述液体培养基用含50毫克/毫升潮霉素的新鲜SB55替换。此后，每周新换选择性培养基。轰击7周后，观察到绿色转化的组织从未转化的坏死胚发生群体中生长。分离的绿色组织被移出并接种到各烧瓶中以产生新的，克隆化繁殖的，转化胚胎悬浮培养物。因此，将这种新的品系作为独立的转化情况处理。然后通过次级培养可维持这些悬浮物作为在未成熟的发育阶段中簇集的胚胎悬液或通过各体细胞胚胎的成熟和发芽而再生成为完整植株。
转化的胚胎簇被从液体培养物中移出并放在不含激素或抗菌素的固体琼脂糖培养基上(SB103)。将胚胎用混合的荧光灯和白炽灯按16∶8小时昼/夜时间表，在26℃培养8周。在此期间，各胚胎可从所述簇集中被移出并分析胚胎发育的各个阶段。在8周之后，体细胞胚胎变得适合于发芽。将在发芽时8周龄的胚胎从成熟培养基移出并在空培养皿中干燥1到5天。然后将干燥的胚胎种植在SB71-1培养基，在那里他们被容许在同样光照和上述发芽条件进行发芽。然后发芽的胚胎可被转移到无菌土壤中并生长到成熟以便收集种子。
当在如上述的液体培养基中的球形胚胎状态下，体细胞大豆胚胎含十分低含量的成熟的，合子大豆胚的典型三酰甘油或储存蛋白质。在这个发育阶段，总三酰甘油与总极性脂类(磷脂和糖脂)的比例约为1∶4，这是典型的合子大豆胚，它们处于体细胞胚胎培养物开始的那个发育阶段。仍是在球形阶段，主要种子蛋白质(βconglycinin的α-亚单位，Kunitz胰蛋白酶抑制剂3和大豆种子凝集素)的mRNAs是基本不存在的。当转移到无激素培养基以使之分化成如上所述的成熟体细胞胚胎状态时，三酰甘油成为最丰富的脂类。而且，βconglycinin的α亚单位的mRNAs，Kunitz胰蛋白酶抑制剂3和大豆种子凝集素成为总mRNA群体中的十分丰富的信息。在这些方面，体细胞胚胎大豆系统的表现十分类似于在体内成熟的合子大豆胚。在早成熟期，存在于所述体细胞胚中的主要可溶性碳水化合物是蔗糖，葡萄糖和麦芽糖(在所述成熟期期间所提供的糖)。在体细胞胚成熟并开始发黄时，棉子糖和水苏糖均被形成。仍是在这方面，体细胞胚的表型在其进入种子发育的晚期阶段时十分类似于合子胚。因此对用种子特异性表达载体转化的胚的筛选应导致成熟的，丰盛的携带同样表型大豆种子之大豆植株的再生，其中所述载体指导SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：5 l中描述的核苷酸序列按有义或反义方向表达。
               序列表(1)一般资料：
(i)申请人：HITZ，WILLIAM D.
SEBASTIAN，SCOTT ANTHONY
(ii)发明题目：产生具有降低的棉子糖类和植酸水平之种子的大豆植物
(iii)序列号：8
(iv)联系地址：
    (A)地址：E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
    (B)街道：1007 MARKET STREET
   (C)城市：WILMINGTON
   (D)州：DELAWARE
   (E)国家：美国
   (F)邮政编码：19898
(v)计算机可读形式：
   (A)媒体类型：3.5英寸软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容机
   (C)操作系统：微软WINDOWS 95
   (D)软件：微软WORD FOR WINDOWS 95(7.0)
(vi)现申请资料：
   (A)申请号：
   (B)申请日：
   (C)分类：
(viii)代理人/代理公司信息
   (A)名称：MAJARIAN，WILLIANM R.
   (B)注册号：P41，173
   (C)参考/登记号：BB-1077
(ix)电信资料：
   (A)电话：(302)992-4926
   (B)传真：(302)773-0164(2)序列描述：SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：1782个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟结构：无
(iv)反义结构：无
(vi)原始来源：
   (A)有机体：大豆品系LR13
(vii)现有来源：
   (B)克隆：p5bmi-1-ps
(ix)特征：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：54..1586
(xi)序列描述：SEQIDNO：1：CTCTTCTTTA TTCCTTTTGT AATTTCATTC ATTCTTAATC TTTGTGAAAA ATAATGTTCA      60TCGAGAATTT TAAGGTTGAG TGTCCTAATG TGAAGTACAC CGAGACTGAG ATTCAGTCCG     120TGTACAACTA CGAAACCACC GAACTTGTTC ACGAGAACAG GAATGGCACC TATCAGTGGA     180TTGTCAAACC CAAATCTGTC AAATACGAAT TTAAAACCAA CATCCATGTT CCTAAATTAG     240GGGTAATGCT TGTGGGTTGG GGTGGAAACA ACGGCTCAAC CCTCACCGGT GGTGTTATTG     300CTAACCGAGA GGGCATTTCA TGGGCTACAA AGGACAAGAT TCAACAAGCC AATTACTTTG     360GCTCCCTCAC CCAAGCCTCA GCTATCCGAG TTGGGTCCTT CCAGGGAGAG GAAATCTATG     420CCCCATTCAA GAGCCTGCTT CCAATGGTTA ACCCTGACGA CATTGTGTTT GGGGGATGGG     480ATATCAGCAA CATGAACCTG GCTGATGCCA TGGCCAGGGC AAAGGTGTTT GACATCGATT     540TGCAGAAGCA GTTGAGGCCT TACATGGAAT CCATGCTTCC ACTCCCCGGA ATCTATGACC     600CGGATTTCAT TGCTGCCAAC CAAGAGGAGC GTGCCAACAA CGTCATCAAG GGCACAAAGC     660AAGAGCAAGT TCAACAAATC ATCAAAGACA TCAAGGCGTT TAAGGAAGCC ACCAAAGTGG     720ACAAGGTGGT TGTACTGTGG ACTGCCAACA CAGAGAGGTA CAGTAATTTG GTTGTGGGCC     780TTAATGACAC CATGGAGAAT CTCTTGGCTG CTGTGGACAG AAATGAGGCT GAGATTTCTC     840CTTCCACCTT GTATGCCATT GCTTGTGTTA TGGAAAATGT TCCTTTCATT AATGGAAGCC     900CTCAGAACAC TTTTGTACCA GGGCTGATTG ATCTTGCCAT CGCGAGGAAC ACTTTGATTG     960GTGGAGATGA CTTCAAGAGT GGTCAGACCA AAATGAAATC TGTGTTGGTT GATTTCCTTG  1020TGGGGGCTGG TATCAAGCCA ACATCTATAG TCAGTTACAA CCATCTGGGA AACAATGATG  1080GTATGAATCT TTCGGCTCCA CAAACTTTCC GTTCCAAGGA AATCTCCAAG AGCAACGTTG  1140TTGATGATAT GGTCAACAGC AATGCCATCC TCTATGAGCC TGGTGAACAT CCAGACCATG  1200TTGTTGTTAT TAAGTATGTG CCTTACGTAG GGGACAGCAA GAGAGCCATG GATGAGTACA  1260CTTCAGAGAT ATTCATGGGT GGAAAGAGCA CCATTGTTTT GCACAACACA TGCGAGGATT  1320CCCTCTTAGC TGCTCCTATT ATCTTGGACT TGGTCCTTCT TGCTGAGCTC AGCACTAGAA  1380TCGAGTTTAA AGCTGAAAAT GAGGGAAAAT TCCACTCATT CCACCCAGTT GCTACCATCC  1440TCAGCTACCT CACCAAGGCT CCTCTGGTTC CACCGGGTAC ACCAGTGGTG AATGCATTGT  1500CAAAGCAGCG TGCAATGCTG GAAAACATAA TGAGGGCTTG TGTTGGATTG GCCCCAGAGA  1560ATAACATGAT TCTCGAGTAC AAGTGAAGCA TGGGACCGAA GAATAATATA GTTGGGGTAG  1620CCTAGCTGAA TGTTTTATGT TAATAATATG TTTGCTTATA ATTTTGCAAG TGTAATTGAA  1680TGCATCAGCT TCATTAATGC TTTAGAGCGG GGCATATTCT GTTTACTAGG AACATGAATG  1740AATGTAGTAT AATTTTGTGT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA                     1782(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：510氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Phe Ile Glu Asn Phe Lys Val Glu Cys Pro Asn Val Lys Tyr Thr1               5                   10                  15Glu Thr Glu Ile Gln Ser Val Tyr Asn Tyr Glu Thr Thr Glu Leu Val
        20                  25                  30His Glu Asn Arg Asn Gly Thr Tyr Gln Trp Ile Val Lys Pro Lys Ser
    35                  40                  45Val Lys Tyr Glu Phe Lys Thr Asn Ile His Val Pro Lys Leu Gly Val
50                  55                  60Met Leu Val Gly Trp Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr Leu Thr Gly Gly65                  70                  75                  80Val Ile Ala Asn Arg Glu Gly Ile Ser Trp Ala Thr Lys Asp Lys Ile
            85                  90                  95Gln Gln Ala Asn Tyr Phe Gly Ser Leu Thr Gln Ala Ser Ala Ile Arg
        100                 105                 110Val Gly Ser Phe Gln Gly Glu Glu Ile Tyr Ala Pro Phe Lys Ser Leu
    115                 120                 125Leu Pro Met Val Asn Pro Asp Asp Ile Val Phe Gly Gly Trp Asp Ile
130                 135                 140Ser Asn Met Asn Leu Ala Asp Ala Met Ala Arg Ala Lys Val Phe Asp145                 150                 155                 160Ile Asp Leu Gln Lys Gln Leu Arg Pro Tyr Met Glu Ser Met Leu Pro
            165                 170                 175Leu Pro Gly Ile Tyr Asp Pro Asp Phe Ile Ala Ala Asn Gln Glu Glu
        180                 185                 190Arg Ala Asn Asn Val Ile Lys Gly Thr Lys Gln Glu Gln Val Gln Gln
    195                 200                 205Ile Ile Lys Asp Ile Lys Ala Phe Lys Glu Ala Thr Lys Val Asp Lys
210                 215                 220Val Val Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Ser Asn Leu Val225                 230                 235                 240Val Gly Leu Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Ala Ala Val Asp Arg
            245                 250                 255Asn Glu Ala Glu Ile Ser Pro Ser Thr Leu Tyr Ala Ile Ala Cys Val
        260                 265                 270Met Glu Asn Val Pro Phe Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val
    275                 280                 285Pro Gly Leu Ile Asp Leu Ala Ile Ala Arg Asn Thr Leu Ile Gly Gly
290                 295                 300Asp Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Met Lys Ser Val Leu Val Asp305                 310                 315                 320Phe Leu Val Gly Ala Gly Ile Lys Pro Thr Ser Ile Val Ser Tyr Asn
            325                 330                 335His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Met Asn Leu Ser Ala Pro Gln Thr Phe
        340                 345                 350Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ser Asn Val Val Asp Asp Met Val Asn
    355                 360                 365Ser Asn Ala Ile Leu Tyr Glu Pro Gly Glu His Pro Asp His Val Val
370                 375                 380Val Ile Lys Tyr Val Pro Tyr Val Gly Asp Ser Lys Arg Ala Met Asp385                 390                 395                 400Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Phe Met Gly Gly Lys Ser Thr Ile Val Leu
            405                 410                 415His Asn Thr Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Pro Ile Ile Leu Asp
        420                 425                 430Leu Val Leu Leu Ala Glu Leu Ser Thr Arg Ile Glu Phe Lys Ala Glu
    435                 440                 445Asn Glu Gly Lys Phe His Ser Phe His Pro Val Ala Thr Ile Leu Ser
450                 455                 460Tyr Leu Thr Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Asn465                 470                 475                 480Ala Leu Ser Lys Gln Arg Ala Met Leu Glu Asn Ile Met Arg Ala Cys
            485                 490                 495Val Gly Leu Ala Pro Glu Asn Asn Met Ile Leu Glu Tyr Lys
        500                 505                 510(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：35碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(寡核苷酸)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：1GGGAATTCCA TATGTTCATC GAGAATTTTA AGGTT                     35(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：39个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(寡核苷酸)(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AAGGAAAAAA GCGGCCGCTC ACTTGTACTC GAGAATCAT                 39(2)SEQID NO：5的信息：(i)序列特征：(A)长度：1775个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：CDNA(iii)假拟结构：无(iv)反义结构：无(vi)原始来源：
(A)有机体：大豆品系LR33(vii)现有来源：
(B)克隆：LR33-10(ix)特性：
(A)名称/关键词：CDC
(B)位置：1..1533(ix)特性：
(A)名称/关键词：点突变
(B)位置：1188(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：ATGTTCATCG AGAATTTTAA GGTTGAGTGT CCTAATGTGA AGTACACCGA GACTGAGATT    60CAGTCCGTGT ACAACTACGA AACCACCGAA CTTGTTCACG AGAACAGGAA TGGCACCTAT   120CAGTGGATTG TCAAACCCAA ATCTGTCAAA TACGAATTTA AAACCAACAT CCATGTTCCT   180AAATTAGGGG TAATGCTTGT GGGTTGGGGT GGAAACAACG GCTCAACCCT CACCGGTGGT   240GTTATTGCTA ACCGAGAGGG CATTTCATGG GCTACAAAGG ACAAGATTCA ACAAGCCAAT   300TACTTTGGCT CCCTCACCCA AGCCTCAGCT ATCCGAGTTG GGTCCTTCCA GGGAGAGGAA   360ATCTATGCCC CATTCAAGAG CCTGCTTCCA ATGGTTAACC CTGACGACAT TGTGTTTGGG   420GGATGGGATA TCAGCAACAT GAACCTGGCT GATGCCATGG CCAGGGCAAA GGTGTTTGAC   480ATCGATTTGC AGAAGCAGTT GAGGCCTTAC ATGGAATCCA TGCTTCCACT CCCCGGAATC   540TATGACCCGG ATTTCATTGC TGCCAACCAA GAGGAGCGTG CCAACAACGT CATCAAGGGC   600ACAAAGCAAG AGCAAGTTCA ACAAATCATC AAAGACATCA AGGCGTTTAA GGAAGCCACC   660AAAGTGGACA AGGTGGTTGT ACTGTGGACT GCCAACACAG AGAGGTACAG TAATTTGGTT   720GTGGGCCTTA ATGACACCAT GGAGAATCTC TTGGCTGCTG TGGACAGAAA TGAGGCTGAG   780ATTTCTCCTT CCACCTTGTA TGCCATTGCT TGTGTTATGG AAAATGTTCC TTTCATTAAT   840GGAAGCCCTC AGAACACTTT TGTACCAGGG CTGATTGATC TTGCCATCGC GAGGAACACT   900TTGATTGGTG GAGATGACTT CAAGAGTGGT CAGACCAAAA TGAAATCTGT GTTGGTTGAT   960TTCCTTGTGG GGGCTGGTAT CAAGCCAACA TCTATAGTCA GTTACAACCA TCTGGGAAAC  1020AATGATGGTA TGAATCTTTC GGCTCCACAA ACTTTCCGTT CCAAGGAAAT CTCCAAGAGC  1080AACGTTGTTG ATGATATGGT CAACAGCAAT GCCATCCTCT ATGAGCCTGG TGAACATCCA  1140GACCATGTTG TTGTTATTAA GTATGTGCCT TACGTAGGGG ACAGCAATAG AGCCATGGAT  1200GAGTACACTT CAGAGATATT CATGGGTGGA AAGAGCACCA TTGTTTTGCA CAACACATGC  1260GAGGATTCCC TCTTAGCTGC TCCTATTATC TTGGACTTGG TCCTTCTTGC TGAGCTCAGC  1320ACTAGAATCG AGTTTAAAGC TGAAAATGAG GGAAAATTCC ACTCATTCCA CCCAGTTGCT  1380ACCATCCTCA GCTACCTCAC CAAGGCTCCT CTGGTTCCAC CGGGTACACC AGTGGTGAAT  1440GCATTGTCAA AGCAGCGTGC AATGCTGGAA AACATAATGA GGGCTTGTGT TGGATTGGCC  1500CCAGAGAATA ACATGATTCT CGAGTACAAG TGA                               1533(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：510个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Phe Ile Glu Asn Phe Lys Val Glu Cys Pro Asn Val Lys Tyr Thr1               5                   10                  15Glu Thr Glu Ile Gln Ser Val Tyr Asn Tyr Glu Thr Thr Glu Leu Val
        20                  25                  30His Glu Asn Arg Asn Gly Thr Tyr Gln Trp Ile Val Lys Pro Lys Ser
    35                  40                  45Val Lys Tyr Glu Phe Lys Thr Asn Ile His Val Pro Lys Leu Gly Val
50                  55                  60Met Leu Val Gly Trp Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr Leu Thr Gly Gly65                  70                  75                  80Val Ile Ala Asn Arg Glu Gly Ile Ser Trp Ala Thr Lys Asp Lys Ile
            85                  90                  95Gln Gln Ala Asn Tyr Phe Gly Ser Leu Thr Gln Ala Ser Ala Ile Arg
        100                 105                 110Val Gly Ser Phe Gln Gly Glu Glu Ile Tyr Ala Pro Phe Lys Ser Leu
    115                 120                 125Leu Pro Met Val Asn Pro Asp Asp Ile Val Phe Gly Gly Trp Asp Ile
130                 135                 140Ser Asn Met Asn Leu Ala Asp Ala Met Ala Arg Ala Lys Val Phe Asp145                 150                 155                 160Ile Asp Leu Gln Lys Gln Leu Arg Pro Tyr Met Glu Ser Met Leu Pro
            165                 170                 175Leu Pro Gly Ile Tyr Asp Pro Asp Phe Ile Ala Ala Asn Gln Glu Glu
        180                 185                 190Arg Ala Asn Asn Val Ile Lys Gly Thr Lys Gln Glu Gln Val Gln Gln
    195                 200                 205Ile Ile Lys Asp Ile Lys Ala Phe Lys Glu Ala Thr Lys Val Asp Lys
210                 215                 220Val Val Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Ser Asn Leu Val225                 230                 235                 240val Gly Leu Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Ala Ala Val Asp Arg
            245                 250                 255Asn Glu Ala Glu Ile Ser Pro Ser Thr Leu Tyr Ala Ile Ala Cys Val
        260                 265                 270Met Glu Asn Val Pro Phe Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val
    275                 280                 285Pro Gly Leu Ile Asp Leu Ala Ile Ala Arg Asn Thr Leu Ile Gly Gly
290                 295                 300Asp Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Met Lys Ser Val Leu Val Asp305                 310                 315                 320Phe Leu Val Gly Ala Gly Ile Lys Pro Thr Ser Ile Val Ser Tyr Asn
            325                 330                 335His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Met Asn Leu Ser Ala Pro Gln Thr Phe
        340                 345                 350Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ser Asn Val Val Asp Asp Met Val Asn
    355                 360                 365Ser Asn Ala Ile Leu Tyr Glu Pro Gly Glu His Pro Asp His Val Val
370                 375                 380Val Ile Lys Tyr Val Pro Tyr Val Gly Asp Ser Asn Arg Ala Met Asp385                 390                 395                 400Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Phe Met Gly Gly Lys Ser Thr Ile Val Leu
            405                 410                 415His Asn Thr Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Pro Ile Ile Leu Asp
        420                 425                 430Leu Val Leu Leu Ala Glu Leu Ser Thr Arg Ile Glu Phe Lys Ala Glu
    435                 440                 445Asn Glu Gly Lys Phe His Ser Phe His Pro Val Ala Thr Ile Leu Ser
450                 455                 461Tyr Leu Thr Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Asn465                 470                 475                 480Ala Leu Ser Lys Gln Arg Ala Met Leu Glu Asn Ile Met Arg Ala Cys
            485                 490                 495Val Gly Leu Ala Pro Glu Asn Asn Met Ile Leu Glu Tyr Lys
        500                 505                 510(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：16个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：合成的寡核苷酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：CGTAGGGGAC AGCAAG        16(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：16个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：合成的寡核苷酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CGTAGGGGAC AGCAAT        16

Claims (16)

1.编码大豆肌醇-1-磷酸合酶的分离的核酸片段。
2.权利要求1的核酸片段，其中被编码的大豆肌醇-1-磷酸合酶的氨基酸序列基本上类似于SEQ ID NO：2中给出的氨基酸序列。
3.含有权利要求1核酸片段或权利要求1核酸片段的互补片段的嵌合基因，有效连接到适当调节序列上，其中所述嵌合基因的表达导致编码大豆肌醇-1-磷酸合酶的天然基因的表达降低。
4.含有权利要求1之核酸片段的次级片段或权利要求1的核酸片段之次级片段的互补片段的嵌合基因，有效连接到适当调节序列上，其中所述嵌合基因的表达导致编码大豆肌醇-1-磷酸合酶的天然基因的表达降低。
5.编码具有降低的肌醇-1-磷酸合成能力的突变型肌醇-1-磷酸合酶之分离的核酸片段。
6.权利要求5的核酸片段，其中被编码的突变型肌醇-1-磷酸合酶的氨基酸序列基本上类似于SEQ ID NO：5中给出的氨基酸序列。
7.至少一种基因是纯合的大豆植物，所述基因编码有降低了肌醇-1-磷酸合成能力的突变型肌醇1-磷酸合酶，所述基因提供一种可遗传表型：(i)低于17微摩尔/克的种子植酸含量，(ii)低于14.5微摩尔/克的棉子糖加水苏糖结合的种子含量，和(iii)假设所述植物不是LR33，高于200微摩尔/克的种子蔗糖含量。
8.权利要求7的大豆植物的种子。
9.含选自如下之组成的大豆植物：
(i)权利要求3的嵌合基因；
(ii)权利要求4的嵌合基因；和
(iii)权利要求5的核酸片段；
其中所述大豆植物具有可遗传表型，该表型包括：(i)低于17微摩尔/克的种子植酸含量，(ii)低于14.5微摩尔/克的棉子糖加水苏糖结合的种子含量，和(iii)假设所述植物不是LR33，高于200微摩尔/克的种子蔗糖含量。
10.权利要求9的任何大豆植物的种子。
11.使大豆植物具有可遗传表型的方法，所述表型包括(i)低于17微摩尔/克的种子植酸含量，(ii)低于14.5微摩尔/克的棉子糖加水苏糖结合的种子含量，和(iii)高于200微摩尔/克的种子蔗糖含量，所述方法包括：
(a)使LR33或权利要求9大豆植物的任何一种与优良大豆植物杂交；和
(b)筛选步骤(a)的具有可遗传表型的杂交子代植物，所述可遗传表型包括(i)低于17微摩尔/克的种子植酸含量，(ii)低于14.5微摩尔/克的棉子糖加水苏糖结合的种子含量，和(iii)高于200微摩尔/克的种子蔗糖含量。
12.从至少一种编码就突变型肌醇1-磷酸合酶的基因而言是纯合的大豆植物的种子获得的大豆蛋白质产物，所述合酶具有降低的合成肌醇1-磷酸的能力，所述基因提供一种可遗传表型，该包括(i)低于17微摩尔/克的种子植酸含量，(ii)低于14.5微摩尔/克的棉子糖加水苏糖结合的种子含量，和(iii)高于200微摩尔/克的种子蔗糖含量。
13.从加工权利要求8的大豆种子获得的大豆蛋白质产物。
14.从加工权利要求10的大豆种子获得的大豆蛋白质产物。
15.产生从至少一种基因是纯合的大豆植物种子获得的大豆蛋白质产物的方法，所述基因编码一种突变型肌醇1-磷酸合酶，该酶有降低的肌醇-1-磷酸合成能力，所述基因提供一种可遗传表型，该表型包括：(i)低于17微摩尔/克的种子植酸含量，(ii)低于14.5微摩尔/克的棉子糖加水苏糖结合的种子含量，和(iii)高于200微摩尔/克的种子蔗糖含量。所述方法包括：
(a)用农艺学优良的大豆植物与LR33或权利要求9的任何大豆植物杂交；
(b)筛选从步骤(a)获得的子代植物种子，就，(i)低于17微摩尔/克的种子植酸含量，(ii)低于14.5微摩尔/克的棉子糖加水苏糖结合的种子含量，和(iii)高于200微摩尔/克的种子蔗糖含量；和
(c)处理步骤(b)中筛选的种子以获得需要的大豆蛋白质产物。
16.使用至少一种基因是纯合的大豆植物的方法，所述基因编码一种突变型肌醇1-磷酸合酶，该酶有降低的肌醇-1-磷酸合成能力，所述基因提供一种可遗传表型，该表型包括：(i)低于17微摩尔/克的种子植酸含量，(ii)低于14.5微摩尔/克的棉子糖加水苏糖结合的种子含量，和(iii)高于200微摩尔/克的种子蔗糖含量，从而产生子代品系，所述方法包括：
(a)将含具有降低的合成肌醇1-磷酸能力的突变型肌醇1-磷酸合酶的大豆植物与不含该突变的任何大豆亲本杂交以产生F1杂交体；
(b)杂交的F1代自花受粉至少一代；和
(c)鉴定步骤(b)至少一种基因是纯合的子代，所述基因编码一种突变型肌醇1-磷酸合酶，该酶有降低的肌醇-1-磷酸合成能力，所述基因提供一种可遗传表型，该表型包括：(i)低于17微摩尔/克的种子植酸含量，(ii)低于14.5微摩尔/克的棉子糖加水苏糖结合的种子含量，和(iii)高于200微摩尔/克的种子蔗糖含量。
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