ES2241844T3

ES2241844T3 - Procedimiento para producir un reovirus infeccioso.

Info

Publication number: ES2241844T3
Application number: ES01953084T
Authority: ES
Inventors: Matthew C. Coffey; Bradley G. Thompson
Original assignee: Oncolytics Biotech Inc
Current assignee: Oncolytics Biotech Inc
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2021-07-20
Also published as: US20020037576A1; DE60111747D1; CA2415749A1; DK1586634T3; HK1082765A1; WO2002012435A1; AU2001275628B8; US6703232B2; ATE298788T1; DK1309672T3; NZ523510A; US20040126869A1; EP1309672B1; JP4009532B2; US6528305B2; PT1309672E; TWI289158B; MXPA03000846A; EP1586634A1; DE60111747T2

Abstract

Un procedimiento para producir reovirus de mamífero, que comprende las etapas de: a. poner en contacto células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293) con un reovirus de mamífero en condiciones que tengan como resultado la infección reoviral de dichas células HEK 293; b. incubar el cultivo de dichas células infectadas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la replicación viral, y c. recoger el virus producido.

Description

Procedimiento para producir un reovirus infeccioso.

Esta invención se refiere a un procedimiento para producir un reovirus infeccioso de mamíferos que es adecuado para la administración clínica a mamíferos, incluyendo seres humanos.

Referencias

Patente de Estados Unidos Nº 5.023.252.

Berry y col., Biotechnology and Bioengineering, "Production of Reovirus Type-1 and Type-3 from Vero Cells Grown on Solid and Macroporous Microcarriers", Biotechnology and Bioengineering 62: 12-19 (1999).

Bos, J.L., "Ras Oncogenes in Human Cancer: A Review", Canc. Res. 49(17): 4682-4689 (1989).

Chandron y Nibert, "Protease cleavage of reovirus capsid protein mul and mul C is blocked by alkyl sulfate detergents, yielding a new type of infectious subvirion particle", J. of Virology 72(1): 467-75 (1998).

Coffey, M.C., y col., "Reovirus therapy of tumor with actived Ras pathway", Science 282: 1332-1334 (1998).

Davis y col., Microbiology, Lippincott, Philadelphia (1990).

Fields, B.N. y col., Fundamental Virology, 3ª Edición, Lippincott-Raven (1996).

Patente japonesa Nº 63044532A, publicada el 25 de febrero de 1988.

McRae, M.A. y Joklik, W.K., "The nature of the polypeptide encoded by each of the 10 double-stranded RNA segments of reovirus type 3", Virology, 89: 578-593 (1979).

Nibert y col., "Reovirus and their replication", en Fields y col., Fundamental Virology, 3ª Edición, Lippincott-Raven (1996).

Smith, R.E, y col., "Polypeptide components of virions, top component and cores of reovirus type 3", Virology, 39: 791-800 (1969).

Strong, J.E. y P.W. Lee, "The v-erbV oncogene confers enhanced cellular susceptibility to reovirus infection", J. Virol. 70: 612-616 (1996).

Strong, J.E. y col., "Evidence that the Epidermal Growth Factor Receptor on Host Cells Confers Reovirus Infection Efficiency", Virology 197(1): 405-411 (1993).

Strong, J.E. y col., "The molecular basis of viral oncolysis: usurpation of the Ras signaling pathway by reovirus", EMBO J. 17: 3351-3362 (1998).

Taber y col., "The selection of virus-resistant Chinese hamster ovary cells", Cell 8: 529-533 (1976).

Documento WO99/08692A1, publicado el 25 de febrero de 1999.

El reovirus es un virus de ARN de doble cadena con un genoma segmentado. El receptor para el reovirus de mamíferos, el ácido siálico, es una molécula ubicua, por tanto, el reovirus es capaz de unirse a una multitud de células. Sin embargo, la mayoría de las células no son susceptibles a la infección por reovirus y la unión del reovirus a su receptor celular no tiene como resultado la replicación viral o la producción de partículas virales. Esta es probablemente la razón por la que no se conoce la asociación del reovirus con ninguna enfermedad en particular.

Se descubrió recientemente que células transformadas con el oncogén ras se hacen susceptibles a la infección por reovirus, mientras que sus equivalentes sin transformar no lo son (Strong y col., 1998). Por ejemplo, cuando las células NIH-3T3 resistentes a reovirus se transformaban con Ras activado o con Sos, una proteína que activa Ras, se potenciaba la infección por reovirus. De forma similar, fibroblastos de ratón que son resistentes a la infección por reovirus se hacen susceptibles después de la transformación con el gen del receptor de EGF o el oncogén v-erbB, activando ambos la ruta ras (Strong y col., 1993; Strong y col., 1996). De esta manera, el reovirus puede infectar y replicarse selectivamente en células con una ruta Ras activada.

El oncogén ras es responsable de un gran porcentaje de tumores de mamíferos. Las mutaciones que activan el gen ras en sí tiene lugar en aproximadamente el 30% de todos los tumores humanos (Bos, 1989), principalmente en carcinomas pancreáticos (90%), colorrectales esporádicos (50%) y de pulmón (40%), así como en leucemia mieloide (30%). También se asocia con el tumor la activación de factores secuencia arriba o abajo de ras en la ruta de ras. Por ejemplo, la sobreexpresión de HER2/Neu/ErbB2 o del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) es común en cáncer de mama (25-30%) y la sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o del receptor de EGF es frecuente en gliomas y glioblastomas (40-50%). Se sabe que tanto el receptor de EGF como el receptor de PDGF activan ras una vez que se unen a sus respectivos ligandos, y v-erbB codifica un receptor activado constitutivamente al que le falta el dominio extracelular.

Puesto que gran número de tumores humanos se explican por alteraciones genéticas del protooncogén ras o una alta actividad Ras, la terapia con reovirus es una terapia nueva y prometedora para estas dolencias (Coffey y col., 1998). La terapia con reovirus es sumamente selectiva para células tumorales asociadas con Ras y deja a las células normales sin infectar. En consecuencia, se necesita un procedimiento simple y con buena relación coste-beneficio para la producción de reovirus infeccioso adecuado para la administración clínica en seres humanos.

Puesto que el reovirus no supone una seria amenaza para la salud humana, no se ha hecho ningún esfuerzo intenso para producir reovirus de forma eficaz. El reovirus de mamíferos tradicionalmente se cultiva en fibroblastos L-929 de ratón (Nibert y col., 1996). También se ha publicado que crece en células de ovario de hámster chino y células Vero, una línea celular de riñón del mono verde africano (Taber y col., 1976; Davis y col., 1990). Además, se usó el cultivo primario de riñón de cerdo para cultivar un reovirus porcino (Patente japonesa Nº 63044532A, publicada el 25 de febrero de 1988). En un estudio dirigido a la producción en masa del reovirus, Berry y col. realizaron una investigación sobre los procedimientos óptimos de cultivo de células Vero y la posterior infección con reovirus (Berry y col., 1999) Las células Vero se cultivaron en microvehículos Cytodex-1 o Cultispher-G, y se variaron los parámetros de cultivo, tales como la densidad celular, crecimiento del virus en el transcurso del tiempo y la relación de células con respecto a las perlas del microvehículo y se determinó el rendimiento viral. El estudio demostró que el rendimiento del virus variaba mucho con los parámetros de cultivo y se necesitaban condiciones de cultivo complicadas (por ejemplo, número de células por perlas en relación con la multiplicidad de infección) para obtener un rendimiento razonable. Por tanto, existe todavía la necesidad de un procedimiento simple y eficaz para producir reovirus clínicamente
útiles.

La presente invención se dirige a un procedimiento simple y eficaz para producir reovirus mediante el cultivo de reovirus en células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293). El rendimiento en células HEK 293 es inesperadamente alto, particularmente en comparación con trabajos previos usando células L-929 o células Vero. Además, usando la presente invención, se logra un alto rendimiento muy pronto en el curso de la infección, antes de que las partículas del virus se liberen de las células. Por tanto, el virus se puede recoger muy pronto a partir de células intactas, permitiendo purificar el virus en ausencia de los medios de cultivo. Esto hace que el procedimiento de purificación sea relativamente simple.

Por consiguiente, un aspecto de la invención proporciona un procedimiento para producir reovirus de mamíferos, que comprende las etapas de poner en contacto las células HEK 293 con un reovirus de mamíferos en condiciones que den como resultado la infección reoviral de dichas células HEK 293; incubar el cultivo de dichas células infectadas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la replicación viral; y recoger el virus producido.

Puede producirse cualquier reovirus de mamíferos usando este procedimiento. En particular, usando este procedimiento puede producirse reovirus humano para administración clínica en seres humanos. Más en particular, se producen el serotipo 3 del reovirus y la cepa Dearing. También pueden producirse de forma eficaz otros reovirus de mamíferos mediante el procedimiento actualmente reivindicado.

Otro aspecto de la invención es que, puesto que el reovirus se produce rápidamente en las células HEK 293, esta invención proporciona un procedimiento rápido y con buena relación coste-beneficio de producción de reovirus. También, puesto que el título del virus en el cultivo de células HEK 293 es alto antes de que se lisen las células completamente, el virus puede recogerse cuando sigue asociado con la célula, por lo tanto, el procedimiento de purificación del virus puede ser relativamente simple, reduciendo además el coste de producción. Por tanto, esta invención proporciona un procedimiento en el que el virus se recoge antes de que todas las células se lisen. Preferiblemente, el virus se recoge cuando el 20-95% de las células continúan viables, más preferiblemente el 35-90% y más preferiblemente el 50-80%.

Otro aspecto de la invención es que se puede usar un amplio intervalo de multiplicidad de infección para lograr la producción viral. Aunque una multiplicidad de infección del 0,1 es suficiente, se pueden usar multiplicidades más altas para acortar el tiempo de producción, por ejemplo, una multiplicidad de hasta 10. Preferiblemente se usa una multiplicidad de infección de menos de 1, más preferiblemente de o alrededor de 0,5.

Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento para producir reovirus tanto en cultivos celulares adherentes como en suspensión, ya que las células HEK 293 se pueden adaptar al crecimiento en ambas clases de cultivo. También son útiles en la presente invención células HEK 293 que se han adaptado para otros propósitos o condiciones de cultivo o se han trasformado con un ADN exógeno.

La presente invención se dirige a un procedimiento para producir reovirus de mamífero usando células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293). Se encontró que las células HEK 293 son células hospedadoras más eficaces para el reovirus que las células L-929 o las células Vero. Aunque nunca antes se ha publicado que apoyaran la replicación viral, las células HEK 293 producían más reovirus en un tiempo más corto que las células L-929 o las células Vero. En consecuencia, usando HEK 293, los costes de producción pueden reducirse. Además, puesto que el reovirus aún está asociado con las células HEK 293 cuando el título es suficientemente alto, se puede usar un procedimiento relativamente simple para purificar el virus y además reducir el coste de producción.

Antes de describir la invención con más detalle, se definen los términos usados en esta solicitud como sigue, a menos que se indique lo contrario.

Definiciones

Como se usa en este documento, "células HEK 293" se refiere a la línea celular de riñón embrionario humano designada 293 (número de la ATCC CRL-1573) o sus derivados. Por ejemplo, las células 293/SF (número de la ATCC CRL-1573.1) son células HEK 293 que se han adaptado al cultivo en medios sin suero. También se contemplan en esta invención las células HEK 293 adaptadas al crecimiento en otras condiciones de cultivo, o cualquier clase de células HEK 293 o derivados transformadas con un ADN exógeno, siempre que esta transformación no perjudique a la capacidad de las células para sostener una producción eficaz del reovirus como se describe en esta invención.

Como se usa en este documento, "reovirus" se refiere a cualquier virus clasificado en el género reovirus, sea de origen natural, modificado o recombinante. Los reovirus son virus con un genoma de ARN de doble cadena segmentado. Los viriones miden 60-80 nm de diámetro y poseen dos cápsides envoltorio concéntricas, cada una de las cuales es icosaédrica. El genoma consta de un ARN de doble cadena en 10-12 segmentos diferenciados con un tamaño total del genoma de 16-27 kpb. Los segmentos individuales de ARN varían de tamaño. Se han recuperado tres tipos distintos pero relacionados de reovirus a partir de muchas especies. Los tres comparten un antígeno fijador de complemento común.

El reovirus humano consta de tres serotipos: tipo 1 (cepa Lang o T1L), tipo 2 (cepa Jones o T2J) y tipo 3 (cepa Dearing o cepa Abney, T3D). Los tres serotipos se identifican fácilmente en base a ensayos de neutralización y de inhibición de la hemaglutinina (véase, por ejemplo, Fields, B.N. y col., 1996).

El reovirus puede ser de origen natural o modificado. El reovirus es de "origen natural" cuando puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y no ha sido modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio. Por ejemplo, el reovirus puede ser de una "fuente", esto es, de un humano que se ha infectado con el reovirus.

El reovirus puede estar modificado, pero ser aún capaz de infectar líticamente a una célula de mamífero que tiene una ruta ras activa. El reovirus puede pretratarse química o bioquímicamente (por ejemplo, mediante el tratamiento con una proteasa, tal como quimotripsina o tripsina) antes de la administración a las células proliferantes. El pretratamiento con una proteasa elimina la cubierta o cápside externa del virus y puede aumentar la infectividad del virus. El reovirus se puede recubrir con un liposoma o micela (Chandron y Nibert, 1998). Por ejemplo, se puede tratar el virión con quimotripsina en presencia de concentraciones formadoras de micela de detergentes de sulfato de alquilo para generar una nueva partícula infecciosa del subvirión.

El reovirus puede ser un reovirus recombinante (es decir, reagrupado) de dos o más tipos de reovirus con distintos fenotipos patogénicos de modo que contiene diferentes determinantes antigénicos, reduciendo o previniendo, de ese modo, una respuesta inmune de un mamífero previamente expuesto a un subtipo de reovirus. Estos viriones recombinantes pueden generarse mediante la coinfección de células de mamífero con diferentes subtipos de reovirus con el reagrupamiento resultante, y la incorporación de proteínas de la cubierta de diferente subtipo en las cápsides de los viriones resultantes.

Como se usa en este documento, "poner en contacto" una célula con un virus se refiere a colocar el virus en el cultivo de la célula de modo que el virus tenga la oportunidad de contactar con la célula, lo que puede llevar a una infección satisfactoria por el virus.

Como se usa en este documento, "infección viral" se refiere a la entrada de un virus en una célula y la posterior replicación del virus en la célula.

Como se usa en este documento, "multiplicidad de infección" se refiere a la proporción entre el número de virus y el número de células cuando se usa un virus para ponerlo en contacto con las células.

Como se usa en este documento, "lisis celular" se refiere a la desintegración de la membrana celular de una célula y a la posterior liberación de todo o parte del contenido de la célula.

Como se usa en este documento, "lisis completa" se refiere a la lisis de cada célula en un cultivo de múltiples células.

Como se usa en este documento, "condiciones de cultivo" se refiere a las condiciones usadas en un cultivo celular, incluyendo, aunque sin limitación, la temperatura, el tipo de recipiente de cultivo, la humedad, la concentración de CO_{2} o cualquier otro gas usado en los recipientes de cultivo, el tipo del medio de cultivo, la densidad inicial de las células cultivadas, y si las células están infectadas con un virus, la multiplicidad de infección inicial.

Como se usa en este documento, un virus que está "asociado a la célula" se refiere a un virus que está unido o atrapado en parte de una célula en la cual se ha producido el virus. De esta manera, un virus está asociado a la célula antes de que la célula hospedadora se lise. Cuando comienza la lisis celular, un virus puede estar aún unido o atrapado en parte de la célula rota y permanecer asociado a la célula. Sin embargo, cuando el virus es liberado al medio, ya no está nunca más asociado a la célula.

Como se usa en este documento, una célula está "desintegrada" cuando la membrana celular se rompe y al menos algo del contenido celular se libera de la célula. Una célula puede desintegrarse, por ejemplo, por tratamientos de congelación-descongelación, sonicación o con detergentes.

Como se usa en este documento, "recoger" el virus se refiere al acto de recolectar el virus producido a partir de un cultivo celular que se ha infectado previamente con el virus. La recogida del virus puede implicar la rotura de la célula hospedadora si el virus sigue asociado a la célula. De forma alternativa, pero menos preferiblemente, se pueden recoger de los medios las partículas virales que se han liberado en los medios de cultivo.

Como se usa en este documento, el "efecto citopático" viene indicado por las células que comienzan a hincharse y a hacerse granulares en apariencia y por los agrupamientos de células rotas. Las células que muestran un efecto citopático tendrán tinción negativa en un recuento de células viables ya que no captarán el colorante.

Como se usa en este documento, "células adherentes" se refiere a células que, en un cultivo celular, se adhieren al recipiente de cultivo. Ejemplos de células adherentes incluyen células en monocapa que son células que forman una única capa de células sobre la superficie del recipiente de cultivo. "Células en suspensión" o "células suspendidas" se refieren a células que, en un cultivo celular, no se adhieren al recipiente de cultivo. Las células en suspensión pueden crecerse en un "cultivo rotatorio", que es un cultivo en el cual el medio de cultivo está en continua agitación durante el proceso de cultivo.

Como se usa en este documento, "viabilidad de las células" o "porcentaje de células que continúan viables" es el porcentaje de células en una población que no muestran un efecto citopático.

Como se usa en este documento, "tiempo de recogida" se refiere al momento en el que el virus es recolectado y purificado. El virus se recoge preferiblemente cuando el título es suficientemente alto y el virus sigue asociado a la célula. Aunque se puede recoger el virus incluso después de que se produzca la lisis completa de las células, es deseable recoger el virus antes de que sea liberado de las células para simplificar el proceso de purificación. De esta manera, se mide de forma rutinaria la viabilidad de las células como indicación de si el virus sigue asociado a la célula. Generalmente, el virus se recoge cuando al menos el 5% de las células son viables. Preferiblemente, el virus se recoge cuando el 20-95% de las células son viables, más preferiblemente cuando el 35- 90% continúan siendo viables, y más preferiblemente cuando el 50-80% de las células continúan siendo viables.

Procedimientos

Generalmente las células normales no son susceptibles a la infección por reovirus, y las líneas celulares cultivadas varían en gran medida en su capacidad para sostener la producción de reovirus. En un intento de desarrollar una célula hospedadora eficaz para producir reovirus se emplearon diversas células y se probó que las células HEK 293 eran muy eficaces. En un experimento típico (Ejemplo 1), se cultivaron las células HEK 293, Vero y L-929 hasta la confluencia y se infectaron con el reovirus a una multiplicidad de infección (m.d.i.) de 1. El rendimiento del virus se determinó a diferentes tiempos posinfección. Sorprendentemente, las células HEK 293, de las que no se había publicado que sostuvieran el crecimiento de reovirus, produjeron casi 50 veces más reovirus a las 24 horas posinfección que las células L-929, las cuales se usan de forma rutinaria para el cultivo de reovirus de mamíferos. Las células Vero producían aún menos reovirus en este punto, rindiendo 3000 veces menos reovirus que las células HEK 293.

A las 36-48 horas posinfección, el rendimiento de reovirus en las células HEK 293 llegaba a una meseta pero el título era aún un orden de magnitud mayor que el título producido en las células L-929 y dos órdenes de magnitud mayor que el de las células Vero. No fue hasta las 96 horas posinfección cuando las tres líneas celulares produjeron aproximadamente el mismo titulo de reovirus, de 10^{9} a 10^{10} por mililitro.

Estos resultados indican que la célula HEK 293 es un sistema muy eficaz para la producción de reovirus, permitiendo acortar el tiempo de producción, lo que reducirá considerablemente el coste de producción.

Para optimizar más las condiciones de producción de las células HEK 293, se usó el reovirus para infectar las células HEK 293 a diferentes m.d.i. y se determinó el rendimiento (Ejemplo 2). Los resultados sugieren que una m.d.i. más baja es aún más ventajosa. De esta manera, 48 horas después de la infección, las células que se inoculaban a una m.d.i. de 0,5 producían más de 10^{10} virus por ml, que era el rendimiento máximo en estas condiciones de cultivo. Después de este punto, el título descendía aproximadamente dos veces y alcanzaba el rendimiento máximo de nuevo a las 96 horas. Se observó un patrón similar para el cultivo con una m.d.i. de 0,1. Aunque la razón no está clara, es posible que el descenso a las 72 horas esté causado por la degradación proteolítica del virus. Aparentemente, a esto le sigue la replicación para producir el rendimiento más alto a las 96 horas.

En consecuencia, el mejor momento para recoger el reovirus bajo estas condiciones de cultivo es 36-60 horas posinfección. En este periodo de tiempo, el título es alto y el virus aún está asociado con fragmentos y membranas celulares, lo que hace la purificación del virus relativamente simple. A las 96 horas, todas las células se han lisado y el virus se libera al medio junto con los productos de degradación de las células muertas, haciendo la purificación mucho más complicada que cuando el virus está asociado a la célula.

Para una mejor eficacia, el virus debería recogerse cuando el rendimiento es suficientemente alto pero la mayoría de los virus siguen asociados con las células. El tiempo de recogida debe determinarse empíricamente cuando se varían las condiciones de cultivo. Para determinar si el virus está asociado con las células se puede examinar una pequeña alícuota del cultivo, por ejemplo, al microscopio, para determinar el grado de viabilidad celular a diferentes tiempos después de la infección. De forma alternativa, se puede realizar una tinción vital para determinar el porcentaje de células viables. Para simplificar el procedimiento de purificación, típicamente, el virus se recoge antes de que todas las células se hayan lisado. Preferiblemente, el virus se recoge cuando el 20-95% de las células continúan siendo viables. Más preferiblemente, el virus se recoge cuando el 35-90%, y más preferiblemente el 50-80% de las células continúan siendo viables.

Las células HEK 293 son células adherentes y pueden crecerse en frascas de cultivo celular, botellas rotatorias, sistemas de microvehículo o sistemas de fibra hueca, o cualquier otro sistema que sea adecuado para el crecimiento de células adherentes. Las células HEK293 pueden modificarse para general células derivadas. Por ejemplo, la célula 293/SF (número de la ATCC CRL-1573.1) se derivó a partir de las células HEK 293 y se adaptaron a condiciones de cultivo sin suero. Las células 293/SF crecen como una mezcla de células adherentes y en suspensión y pueden crecer en cualquiera de los recipientes descritos anteriormente, así como en botellas giratorias, vasos con agitación (fermentadores), sistemas de fibra hueca, o cualquier otro recipiente de cultivo adecuado para células en suspensión.

Para producir cantidades industriales de reovirus, se cultivaron células 293/SF en matraces giratorios de 15 l y se infectaron con reovirus a una multiplicidad de infección de 0,5 cuando la densidad celular alcanzó 10^{6}/ml. El cultivo se incubó hasta que empezó la lisis celular, como se evidenció por el cambio de color de los medios de cultivo de rojo a naranja debido a la presencia de rojo fenol en los medios, o mediante un recuento de células viables al microscopio. En este punto, se recogió el virus mediante centrifugación. Entonces se purificó el virus como se describe en Materiales y Procedimientos y se usó para la administración clínica o se almacenó para su uso en lo sucesivo. Para el almacenamiento, el virus puede congelarse o liofilizarse de acuerdo con los procedimientos establecidos en la técnica, con o sin agentes estabilizantes.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar esta invención y no puede interpretarse de ninguna forma como una limitación del alcance de la presente invención.

En los ejemplos que siguen, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados. Las abreviaturas que no se definen tienen el significado aceptado generalmente.

IC =: intervalo de confianza

DICT_{50} =: dosis infecciosa de cultivo tisular_{50}

\muM =: micromolar

mM =: milimolar

M =: molar

ml =: mililitro

\mul =: microlitro

mg =: miligramo

\mug =: microgramo

g/l =: gramos por litro

rpm =: revoluciones por minuto

SBF =: suero bovino fetal

DTT =: ditiotreitol

NP-40 =: Nonidet P-40

\quad: (octilfenoxipolietoxietanol)

SDS =: dodecil sulfato sódico

PBS =: Solución salina tamponada con fosfato

\beta-ME =: \beta-mercaptoetanol

MDI o m.d.i =: multiplicidad de infección

UFP =: unidades formadoras de placa

h =: hora

ºC =: grados Celsius.

Procedimiento general Células y virus

Las células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293), las células Vero (de riñón de mono verde africano) y las células de fibroblastos de ratón L-929 se obtuvieron del fabricante BioReliance Corporation (Rockville, Maryland). Las células HEK 293 se cultivaron en un medio de cultivo que contenía suero de caballo inactivado por calor al 10% y el 90% de la siguiente mezcla: medio mínimo esencial de Eagle con L-glutamina 2 mM y solución salina balanceada de Earle ajustada para contener bicarbonato sódico a 1,5 g/l, aminoácidos no esenciales 0,1 mM y piruvato sódico 1,0 mM. Las células de ratón L-929 y las Vero se propagaron en un medio de cultivo que contenía SBF al 10% y el 90% de la siguiente mezcla: medio mínimo esencia de Eagle con L-glutamina 2 mM y solución salina balanceada de Earle ajustada para contener bicarbonato sódico a 1,5 g/l, aminoácidos no esenciales 0,1 mM y piruvato sódico 1,0 mM.

Las células 293/SF se cultivaron en Medio Sin Suero 293 (Life Technologies, Rockville, Maryland) suplementado con L-glutamina 4 mM a 36ºC \pm 2ºC, CO_{2} al 6% \pm 2% y humedad relativa del 80% \pm 5% en matraces giratorios a una velocidad del rotor de 35-40 rpm.

La cepa Dearing de reovirus de serotipo 3 usada en estos estudios se propagó en cultivos en suspensión de células L-929 purificadas de acuerdo con Smith (Smith y col., 1969) con la excepción de que se omitió el \beta-mercaptoenol (\beta-ME) del tampón de extracción. Los reovirus marcados con [^{32}S]-metionina se cultivaron y se purificaron como describieron McRae y Joklik (McRae y Joklik, 1979). La proporción partícula/UFP para purificar el reovirus típicamente fue de 100/1.

Infección de célula en monocapa y cuantificación de virus

Se cultivaron monocapas en confluencia de células HEK 293, Vero y L-929 en placas de 24 pocillos y se infectaron con un reovirus a multiplicidades de infección conocidas. Tras 1 h de incubación a 37ºC, las monocapas se lavaron con medios templados y luego se incubaron en su medio de cultivo. A distintos valores de tiempo posinfección, se añadió una mezcla de NP-40 y deoxicolato sódico directamente en los medios de las monocapas infectadas a concentraciones finales de 1% y 0,5%, respectivamente. Después, se recogieron los lisados y se determinaron los rendimientos de virus por valoración de placa en células L-929 y se expresaron como Log_{10} DICT_{50}/ml.

Infección de células en suspensión y purificación de virus

Las células 293/SF se cultivaron hasta 10^{6}/ml y se infectaron con el reovirus. Se permitió que el cultivo creciera hasta que el color del medio cambiaba de rojo a naranja, o hasta que la viabilidad de las células caía del nivel deseado como se evidenciaba en un recuento de viabilidad celular. El recuento de células viables puede realizarse al microcopio para las células que no muestran efecto citopático, lo cual está indicado porque las células comienzan a hincharse y a volverse granulares en apariencia y por los agrupamientos de células rotas. El recuento de las células viables también puede realizarse mediante un colorante de viabilidad de los usados normalmente en la técnica. Cuando se alcanzó el nivel de viabilidad celular deseado, las células se sedimentaron en una centrífuga y se resuspendieron en Tris 10 mM, pH 7,4 NaCl 250 mM y Triton X-100 al 0,1%.

Después, las células se lisaron por congelación-descongelación y se mantuvieron en hielo durante 20-40 minutos con agitación periódica para mezclar y lisar las células. La suspensión se extrajo con un volumen igual de Freon® previamente enfriado (1,1,2-tricloro-1,1,2-trifluoro-etano) por agitación durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 2500 rpm durante 10 minutos a 4ºC para separar las diferentes fases. La fase acuosa (superior) se retiró y se extrajo de nuevo dos veces como se ha descrito anteriormente. Tras la extracción final, la capa acuosa se transfirió a un tubo nuevo y se añadió Triton X-100 a una concentración final del 0,5%.

El virus se purificó en un gradiente en etapas de cloruro de cesio. El gradiente contenía dos capas de soluciones de CsCl (1,20 g/ml y 1,4 g/ml, respectivamente) preparadas en Tris 10 mM (pH 7,4). La suspensión de virus se cargó sobre el gradiente y se centrifugó en un rotor SW 28.1 a 26.000 rpm durante 2 horas a 4ºC. La banda viral (la más baja de las dos bandas, ya que la banda superior contiene cápsides vacías) se recogió y se dializó contre PBS estéril.

Ejemplo 1 Determinación de la línea celular óptima para la producción de reovirus

Para determinar si había diferencias entre la cantidad de reovirus producidos por las líneas celulares susceptibles como consecuencia de la infección, se ensayaron las cantidades de reovirus producidas por varias líneas celulares diferentes que mostraban susceptibilidad por reovirus. Fueron de particular interés aquellas líneas celulares que habían sido aprobadas por diversas autoridades reguladoras de la producción de un agente biológico. Por consiguiente, las células HEK 293, Vero y L-929 se expusieron a reovirus y se comparó su capacidad para producir reovirus.

La cuantificación de la producción viral se consiguió recogiendo las células infectadas y sus medios de cultivo a diversos valores de tiempo tras la infección. Posteriormente, los lisados producidos se sometieron a análisis de titulación de placas para determinar el rendimiento viral, lo que se expresa en la Tabla 1 a continuación como título \pm IC 95% (Log_{10}DICT_{50}/ml). Los resultados indican que, mientras que todas las células ensayadas eran susceptibles de infección por reovirus, había considerables diferencias en la cantidad de virus producido en cada una de estas líneas celulares.

TABLA 1

1

Los resultados muestran claramente que las cantidades de virus producido eran más altas en las células HEK 293. Además, las células HEK 293 producían más virus más pronto, permitiendo tiempos de producción reducidos para la fabricación del reovirus.

Ejemplo 2 Efecto de la multiplicidad de infección inicial sobre la producción viral final

Para determinar si la multiplicidad de infección inicial determina la producción viral final, se infectaron células HEK 293 con un intervalo de multiplicidad de infección (m.d.i.) inicial entre 1 y 0,1. Los resultados, que se muestran en la tabla 2, indican que hay, de hecho, una relación entre la m.d.i. inicial y la producción viral final. Una m.d.i. inicial de menos de 1 es óptima para la fabricación a gran escala de reovirus.

TABLA 2

2

Además, los resultados demuestran que también hay un tiempo óptimo al cual será importante la recogida de células. Se encontró que la producción viral es mayor después de 24 horas. Esto no es sorprendente ya que antes de 24 horas no habría tiempo suficiente para una síntesis proteica viral adecuada y el ensamblaje del virión maduro. Es más sorprendente la observación de una disminución en la cantidad de virus a las 72 horas seguido por un marcado aumento en el número de partículas infecciosas a las 96 horas. Se supone que este ligero descenso a las 72 horas es debido probablemente a la degradación proteolítica de los virus seguida por una segunda ronda de replicación viral a las 96 horas.

Claims

1. Un procedimiento para producir reovirus de mamífero, que comprende las etapas de:

a. poner en contacto células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293) con un reovirus de mamífero en condiciones que tengan como resultado la infección reoviral de dichas células HEK 293;

b. incubar el cultivo de dichas células infectadas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la replicación viral, y

c. recoger el virus producido.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el reovirus de mamíferos es un reovirus humano.

3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que el reovirus humano es un reovirus de serotipo 3.

4. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que el reovirus de serotipo 3 es la cepa Dearing.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que la multiplicidad de infección en la etapa (a) es 10 o menos.

6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el que la multiplicidad de infección es 5 o menos.

7. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que la multiplicidad de infección es 1 o menos.

8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que la multiplicidad de infección es 0,5.

9. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que la multiplicidad de infección es 0,1.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que el virus se recoge cuando al menos el 5% de las células en el cultivo continúan siendo viables.

11. El procedimiento de la reivindicación 10 en el que el virus se recoge cuando el 20-95% de las células en el cultivo continúan siendo viables.

12. El procedimiento de la reivindicación 11 en el que el virus se recoge cuando el 35-90% de las células en el cultivo continúan siendo viables.

13. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que el virus se recoge cuando el 50-80% de las células en el cultivo continúan siendo viables.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que las células HEK 293 se cultivan como células adherentes.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que las células HEK 293 se cultivan en suspensión.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en el que el virus se recoge separando las células de los medios de cultivo, desintegrando las células para liberar el virus de las células y purificando el virus.

17. El procedimiento de la reivindicación 16 en el que las células se separan de los medios de cultivo mediante centrifugación y se desintegran mediante congelación-descongelación, y el virus es purificado mediante un gradiente de CsCl.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende además la etapa de congelación del virus recogido para su almacenamiento.

19. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que el virus recogido es almacenado a -60ºC o inferior.

20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 que comprende además la etapa de liofilizar el virus recogido para su almacenamiento.

21. Un procedimiento para producir el reovirus infeccioso que comprende las etapas de:

a. cultivar las células HEK 293 en un medio de cultivo que contiene Medio Sin Suero 293 suplementado con L-glutamina 4 mM a 36ºC \pm 2ºC, CO_{2} al 6% \pm 2% y 80% \pm 5% de humedad relativa en frascas giratorias a una velocidad del rotor de 35-40 rpm hasta que las células alcanzan una densidad celular de aproximadamente 10^{6} células/ml;

b. infectar las células con el reovirus de la cepa Dearing a una multiplicidad de infección de 0,5;

c. incubar el cultivo de dichas células infectadas en las mismas condiciones que en la etapa (a) hasta que el porcentaje de células viables caiga al 50-80%;

d. recoger el virus producido mediante centrifugación del cultivo, congelar y descongelar para liberar el virus de las células y purificar el virus mediante un gradiente de CsCl; y

e. almacenar el virus a -60ºC o inferior.

22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el reovirus es de origen natural.

23. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el reovirus no es de origen natural.

24. El procedimiento de la reivindicación 22 ó 23, en el que el reovirus es un reovirus reagrupado a partir de dos o más tipos de reovirus con diferentes fenotipos patogénicos de modo que el reovirus reagrupado contiene diferentes determinantes antigénicos.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que el reovirus reagrupado es de dos o más tipos de reovirus.

26. El procedimiento de la reivindicación 24 ó 25, en el que el reovirus reagrupado resulta del reagrupamiento de reovirus seleccionados entre el grupo compuesto por el reovirus de serotipo 1, reovirus de serotipo 2 y reovirus de serotipo 3.

27. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que el reovirus reagrupado se genera mediante coinfección de células de mamífero con diferentes subtipos de reovirus.