ES2237643T3

ES2237643T3 - Fotoproteina con bioluminiscencia mejorada.

Info

Publication number: ES2237643T3
Application number: ES02023452T
Authority: ES
Inventors: Maria Foti; Stefan Lohmer
Original assignee: AXXAM Srl
Current assignee: AXXAM Srl
Priority date: 2002-10-21
Filing date: 2002-10-21
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2022-10-21
Also published as: CN1705680A; HRP20050354A2; CA2503145A1; MXPA05004148A; AU2003287962B2; AU2003287962A1; NO20051921L; DE60203123D1; JP2006517784A; WO2004035620A1; EP1413584B1; US7601805B2; CN1317299C; ATE290016T1; JP4459058B2; US20070065818A1; DK1413584T3; EP1413584A1; ZA200503197B; DE60203123T2

Abstract

Una fotoproteína quimérica que se puede obtener por sustitución de una región de la proteína Obelina comprendida entre el primer y segundo emplazamiento de enlace con el calcio con una región correspondiente de la fotoproteína Clitina.

Description

Fotoproteína con bioluminiscencia mejorada.

La presente invención proporciona una fotoproteína quimérica con actividad luminiscente mejorada, el uso de la misma como indicador del calcio en sistemas de gen indicador y en los ensayos basados en células para la detección y medida del calcio intracelular.

Antecedentes de la invención

La bioluminiscencia es la capacidad de los organismos vivos para emitir luz visible mediante una variedad de sistemas de reacción quimioluminiscente. Las reacciones de bioluminiscencia requieren tres componentes principales: una luciferina, una luciferasa y oxígeno molecular. Sin embargo, se pueden requerir también otros componentes en algunas reacciones, que incluyen cationes (Ca^{++}, y Mg^{++}) y cofactores (ATP, NAD(P)H). Las luciferasas son enzimas que catalizan la oxidación de un sustrato, la luciferina, y producen un intermedio inestable. La luz se emite cuando el intermedio inestable decae a su estado fundamental generando oxiluciferina. Existen muchos tipos de luciferina no relacionados entre sí, aunque muchas especies de al menos siete filum usan la misma luciferina, conocida como coelenterazina, que contiene un anillo formado por tres aminoácidos (2 tirosinas, y una fenilalanina). En algunos animales (por ejemplo, las medusas) el sistema luciferina/luciferasa se puede extraer en forma de una "fotoproteína" estable que emite luz debido al enlace de calcio. Las fotoproteínas difieren de las luciferasas en que son complejos intermedios oxigenados estabilizados de luciferasa y luciferina. Las fotoproteínas están presentes en muchos celentéreos marinos y permiten a estos organismos emitir luz para una variedad de objetivos que incluyen la cría, alimentación y defensa (1). Mientras que las bacterias emiten luz de manera continua, en muchos otros organismos la luminiscencia se produce en forma de destellos, usualmente de 0,1-1 s de duración. Esto requiere un encendido/apagado rápido de la reacción enzimática y la presencia de reactivos secuestrados de manera apropiada y dispuestos a una movilización rápida. En los celentéreos, el destelleo está causado por la entrada de calcio. Los emplazamientos de enlace de calcio de las fotoproteínas son análogos de la calmodulina. En presencia de calcio, las fotoproteínas emiten luz visible mediante una reacción intramolecular. Existen muchos organismos luminiscentes, pero sólo siete fotoproteínas, denominadas Talasicolina (2,3), Aequorina (4-6), Mitrocomina (sin. Halistaurina) (7,8), Clitina (sin. Con Fialidina) (8,9) Obelina (2,6,10,11), Mnemiopsina (12,13), y Berovina (12,13), se ha aislado de esta manera. Todas estas proteínas son complejos de una apofotoproteína, una imidazopirazina cromófora (coelenterazina), y oxígeno. Sus estructuras están muy conservadas, especialmente en la región que contiene los emplazamientos de enlace de tres calcios (estructuras EF-hand). Estas estructuras EF-hand son características de la familia de proteínas de enlace con el calcio. Las fotoproteínas emiten luz debido a la reacción cuando el calcio se enlaza fuertemente en el hueco EF-hand. La reacción es un suceso de cambio único y da como resultado la liberación de CO_{2} y la emisión de luz en la región del azul (\lambda_{máx} = 470 nm). El término "fotoproteína" identifica el polipéptido enlazado con la luciferina, que es capaz de la luminiscencia, mientras que "apofotoproteína" se usa para indicar la proteína sin luciferina.

Las fotoproteínas más estudiadas son Aequorina, aislada de Aequorea victoria (14) y Obelina, aislada de Obelia longissima (15). Después de enlazar el Ca^{++} la Aequorina experimenta un cambio conformacional que la convierte en una oxigenasa (luciferasa), que cataliza a continuación la oxidación de la coelenterazina mediante el oxígeno molecular enlazado. La proteína de fluorescencia azul está compuesta de coelenteramida, que es un producto de oxidación de la coelenterazina, no enlazado covalentemente a la apofotoproteína. La fotoproteína se puede regenerar a partir de la apofotoproteína mediante incubación con coelenterazina, oxígeno molecular, EDTA y 2-mercaptoetanol o ditiotreitol. Debido a que la coelenterazina es el sustrato luminiscente común usado por las fotoproteínas Aequorina, Mitrocomina, Clitina y Obelina, la reacción de emisión de luz es aproximadamente igual en estas cuatro fotoproteínas (16). La reciente adquisición de la estructura primaria y de los datos cristalográficos de Aequorina y Obelina han proporcionado información adicional sobre su función. La Obelina nativa procedente del hidroide Obelia longissima es una proteína de cadena única de 195 residuos de aminoácidos (aa) con un peso molecular aproximado de 20 kDa que contiene el grupo cromofórico no ligado de forma covalente de la coelenterazina. El análisis de las estructuras primarias de Clitina muestra que contiene 189 aa y pertenece a la familia de las fotoproteínas. Las fotoproteínas de enlace con el Ca^{++} de los hidrozoarios, sin embargo, difieren de otras proteínas de enlace con el Ca^{++} tales como calmodulina y troponina C por un contenido relativamente alto de residuos de cisteína, histidina, triptófano, prolina y tirosina.

Las fotoproteínas se usan de manera amplia en la tecnología del gen indicador para monitorizar los sucesos celulares asociados con la transducción de la señal y la expresión del gen.

El estudio de los sucesos celulares y su regulación requiere procedimientos analíticos sensibles, no invasivos. La fotoproteínas y la bioluminiscencia en general son sistemas indicadores excelentes puesto que virtualmente no tienen fondo, en contraste con los sistemas de fluorescencia.

Se han expresado fotoproteínas en células de mamíferos para monitorizar los cambios de calcio en respuesta a diferentes estímulos. La concentración de calcio intracelular se puede medir añadiendo cofactor de coelenterazina a las células de mamíferos que expresan la fotoproteína, y detectando la emisión de fotones, que es indicativa de la concentración de calcio intracelular.

Descripción de la invención

Se ha encontrado en la actualidad que mediante la quimerización de la proteína Obelina (Apobelina) mediante el reemplazo de una región de la misma comprendida entre los dos primeros emplazamientos de enlace del calcio, con una región correspondiente de la fotoproteína Clitina, se obtiene una nueva fotoproteína con bioluminiscencia mejorada.

Tal como se usa en el presente documento, la Obelina se puede referir a cualquiera de las fotoproteínas aisladas de diferentes especies de Obelia, que incluyen Obelia longissima y Obelia geniculata (17). En la SEC ID Nº 1 y 2 respectivamente se relacionan el nucleótido y las secuencias de aminoácidos de referencia de la Obelina. Los aminoácidos y las secuencias de nucleótidos de referencia de Clitina se han depositado en el GenBank, números de acceso Q08121 y L13247, respectivamente.

Una "región o fragmento correspondiente", tal como se usa en el presente documento, significa cualquier secuencia de aminoácidos, en el interior de la fotoproteína Clitina, que se ajustan a las secuencias de Obelina en los alineamientos de secuencia respectivos, la mencionada región o fragmento se expande de manera preferible entre los residuos 42-122, de manera más preferible entre los residuos 50-95, en referencia a la secuencia de Obelina.

De acuerdo con una forma de realización preferida de la invención, la proteína quimérica se obtiene reemplazando los residuos 50 a 94 de la secuencia de aminoácidos de Obelina con un fragmento de la secuencia de Clitina que se extiende del residuo 53 al 97. La fotoproteína así obtenida, que se ha denominado Photina^{TM} tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 3.

Las proteínas quiméricas de la invención se pueden modificar de manera adicional mediante delección, adición o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos, siempre que el perfil de actividad de la fotoproteína, en términos de emisión de luz y sensibilidad al calcio, se mantenga o incremente. Particularmente preferidas son las sustituciones en las posiciones 55, 66, 67, 73, 74, 75, 78, 83, 84, 87, 89 y 94, según se refiere a la secuencia de obelina.

Tal como se muestra en los estudios in vitro, la Photina^{TM} produce una intensa bioluminiscencia en respuesta a la estimulación del calcio, que es generalmente mayor que la observada con las fotoproteínas naturales.

Para la preparación de las fotoproteínas quiméricas, se prepara un constructo de ADN recombinante que soporte las porciones de las secuencias codificantes de fotoproteínas usando ingeniería genética convencional, el producto quimérico resultante se inserta en un vector, se expresa en un huésped adecuado y a continuación se aisla y purifica. Por ejemplo, se pueden amplificar los ADNc codificados de Obelina y Clitina, respectivamente mediante PCR o construidos in vitro con oligonucleótidos sintéticos, y se pueden recombinar los productos haciendo uso de los emplazamientos de restricción adecuados, que se producen de manera natural o se introducen de forma artificial en los oligonucleótidos usados para la amplificación o para la construcción in vitro. El vector de expresión puede contener, de manera adicional al constructo recombinante, un promotor, un emplazamiento de enlace al ribosoma, un codón de iniciación, un codón de parada o un emplazamiento de consenso para los mejoradores de la transcripción. El vector puede comprender también un marcador de selección para el aislamiento de células huésped que contienen el constructo de ADN. Los vectores adecuados son, por ejemplo, plásmidos de levaduras o de bacterias, bacteriófagos, virus, retrovirus o ADN. Los vectores que transportan el constructo recombinante se pueden introducir en el huésped por medio de técnicas convencionales. Las células huésped pueden ser procariotas o eucariotas, tales como bacterias, levaduras o células de mamíferos. Los huéspedes preferidos para la expresión/producción de la fotoproteína son las células de mamíferos, que incluyen células de origen epitelial o linfoblástico tales como Hek-293, CHO-K1, HepG2, y HL-60. Estas células pueden expresar la apofotoproteína en el citoplasma (18), en la mitocondria, mediante adición de una secuencia diana de mitocondria a la fotoproteína, o en cualquier otro compartimento celular (19-21). De manera alternativa, se pueden emplear células no mamíferas, tales como bacterias y hongos. Una vez se ha seleccionado el tipo de célula huésped, se pueden introducir los constructos genéticos mediante precipitación de fosfato de calcio, electroporación u otras técnicas convencionales. Después de la transfección, las células se hacen crecer en un medio adecuado y se seleccionan para actividades apropiadas. La fotoproteína de la invención se puede aislar y purificar con procedimientos convencionales, tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, y electroforesis.

Se pueden introducir mutaciones puntuales en el producto quimérico por medio de la extensión con superposición por PCR.

Para producir la Photina^{TM}, se reemplazó el fragmento NdeI/MunI del gen de la Obelina con un fragmento de 135 nucleótidos correspondientes a la secuencia codificante de Clitina comprendiendo desde el nucleótido 156 al 291.

En un aspecto adicional, la invención se dirige a una molécula de ácido nucleico que codifica las proteínas quiméricas descritas en el presente documento. Las secuencias codificantes de ADN se pueden modificar en virtud de la degeneración del código genético, cambiando por ejemplo el uso del codón para mejorar la expresión en los sistemas heterólogos.

En una forma de realización preferida de la invención, se selecciona la secuencia de ADN codificante para la proteína Photina^{TM} entre las SEC ID No. 4 y 5.

En el ensayo en el que el producto quimérico era funcional, se realizaron experimentos de transcripción y traducción in vitro, en el sistema de traducción de una célula libre de germen de trigo en presencia de coelenterazina. En estos experimentos, se registró la formación de fotoproteína activa ensayando la luminiscencia de la mezcla de traducción, después de la adición de iones de calcio. Para correlacionar la luminiscencia medida con la cantidad de proteína producida, se llevó a cabo una reacción de traducción en presencia de ^{35}S-Metionina. Se determinó la cantidad de polipéptido nuevamente sintetizado mediante la medida de incorporación de ^{35}S-Metionina en la fracción insoluble en ácido tricloroacético. Los resultados de estos experimentos demuestran la sensibilidad y efectividad de la Photina^{TM} en la generación de bioluminiscencia en respuesta a la estimulación de los iones de calcio.

En una forma de realización adicional de la invención, las proteínas quiméricas aquí proporcionadas se usan como indicadores del calcio, especialmente para la medida de la concentración del calcio intracelular. En un ensayo típico, se añade un cofactor tal como coelenterazina a las células de mamíferos que expresan la fotoproteína y se registra la emisión de luz mediante procedimientos conocidos en la técnica, usando por ejemplo un luminómetro comercialmente disponible.

Se pueden usar las células que expresan tanto la fotoproteína como un receptor implicado en la movilización del calcio intracelular para el ensayo de moléculas candidatas por sus efectos sobre la modulación del receptor. Se puede usar la fotoproteína quimérica de la invención en una variedad de células basándose en ensayos funcionales basados en células que utilizan la medida del calcio intracelular para evaluar la actividad de las proteínas, de manera particular los receptores acoplados a la proteína-G (GPCR) y el plasma de los canales iónicos de la membrana. Aunque se puede detectar el fuerte y rápido incremento en la concentración de calcio intracelular que sigue a la estimulación del canal iónico y los GPCR mediante diversos indicadores tales como colorantes fluorescentes sensibles al calcio, se prefiere el uso de fotoproteínas bioluminiscentes (22) porque su fondo está virtualmente ausente, en contraste con los colorantes fluorescentes, más aún, la medida del calcio con fotoproteínas, además de producir señales rápidas, genera una relación señal a ruido alta con un intervalo amplio de sensibilidad de la detección (22, 23). Los ensayos funcionales basados en células comprenden usualmente añadir un agonista apropiado a un cultivo de células que expresen los GPCR o los canales de iones y la fotoproteína, y determinar a continuación cualquier variación de la concentración del calcio, por ejemplo, un aumento del calcio inducido bien por un influjo rápido a partir de los emplazamientos extracelulares o la liberación de los almacenes intracelulares (18), mediante medidas de la actividad de la fotoproteína.

El uso de células que expresan tanto la Photina^{TM} como un receptor implicado en la modulación de la concentración del calcio intracelular proporciona un sistema válido para la selección de compuestos por sus efectos sobre la liberación del calcio intracelular. Se pueden diseñar también ensayos de selección de alto rendimiento usando una fotoproteína de acuerdo con la invención como sistema indicador. La sensibilidad del sistema así como su relación señal a ruido alta permiten el uso de pequeños volúmenes de ensayo.

En otra forma de realización adicional, se conjuga una fotoproteína de acuerdo con la invención en una molécula de interés analítico, diagnóstico o terapéutico, y el producto de la conjugación se usa en un inmunoensayo competitivo en fase sólida para determinar la cantidad de molécula en las muestras biológicas. Por ejemplo, se puede conjugar químicamente la fotoproteína a una proteína hormonal y usar en un inmunoensayo en fase sólida con anticuerpos específicos de hormona para determinar los niveles salivales de la hormona (24). En otra forma de realización más, se produce un producto de fusión entre una fotoproteína de acuerdo con la invención y un polipéptido diferente, tal como una hormona, un péptido antigénico, una inmunoglobulina de cadena ligera o pesada, avidina, estreptavidina o proteína A, con técnicas conocidas de ingeniería genética, tal como se describe en el Documento US6087476, y se usa en procedimientos de inmunodiagnóstico o diagnóstico por imagen.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención con mayor detalle.

Descripción de los dibujos

Fig. 1 Bioluminiscencia inducida con calcio de fotoproteínas nuevamente sintetizadas. Las fotoproteínas se tradujeron en un sistema de células libres de germen de trigo en presencia de coelenterazina. Todas las alícuotas de la mezcla de traducción se incubaron durante 2 h en oscuridad a 30ºC. La reacción se cargó con CaCl_{2} 50 mM y se registró la luminiscencia durante 10 segundos.

Fig. 2 Traducción del ADN de la fotoproteínas en presencia de coelenterazina, con luminiscencia medida diluyendo la mezcla de reacción. AQ: Aequorina, PH: Photina^{TM}, OB: Obelina.

Fig. 3 Dosis de ATP dependiente de la emisión de luz debida a la estimulación del receptor endógeno de ATP expresada por la célula CHO-K1 transfectada con ADN de Photina^{TM}. Se llevaron a cabo la transfección celular, el cosechado y la expresión de la Photina^{TM} tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las células se trataron con dos concentraciones diferentes de ATP. (B) Las células CHO-K1 transfectadas con ADN de Obelina se usaron como control positivo. La luminiscencia se expresa en RLU (unidades relativas de luz).

Fig. 4 Curva de actividad dependiente de la dosis de Photina^{TM} en células CHO-K1 transfectadas con el receptor A de la Endotelina y Photina^{TM}. El receptor se activó mediante inyección de endotelina a una concentración de 100 y 500 nM.

Fig. 5 Curva dependiente de la dosis obtenida de células que expresan la fotoproteína Photina^{TM} del receptor 1 vaniloide de rata (VR1). Se usó el agonista específico, capsaicina a una concentración de 10 a 50 \muM.

Ejemplos 1. Transcripción/traducción in vitro del ADN de la fotoproteína

Se llevó a cabo la traducción de las fotoproteínas en el sistema de células libres del germen de trigo (kit TNT, Promega), siguiendo las instrucciones generales del fabricante. Se usaron aproximadamente 2 \mug de ADN por cada mezcla de reacción de transcripción/traducción in vitro. El volumen de traducción (50 \mul) incluyó 25 \mul de extracto de germen de trigo, 2 \mul del tampón de reacción, una mezcla de aminoácidos excepto para Metionina, Rnasina y Coelenterazina (40 \muM) y Polimerasa T7. La mezcla contenía también ^{35}S-Metionina (actividad específica 1000 Ci/mmol). Se usó ^{35}S-Metionina para determinar la cantidad de fotoproteína sintetizada in vitro. Con este objetivo, e precipitaron 5 \mul de TCA de la mezcla de traducción de cada muestra en hielo durante 30 min, se filtraron, se lavaron con TCA frío al 5%, metanol se secaron y se colocaron en viales de conteo.

En la Tabla I se muestran las cantidades de Photina^{TM} y Obelina producidas en el sistema de células libres.

TABLA I Inclusión de la marca radioactiva en los productos de traducción de las fotoproteínas

ADN añadido	Obelina (1 \mug)	Photina^{TM} (1\mug)	Aequorina (1 \mug)
^{35}S contado tras
90 min de	8169	8290	13049
traducción (cpm)

2. Ensayo de fotoproteína

Se mezclaron directamente 5 y 10 \mul de la mezcla de traducción con 95-90 \mul de la solución PBS en una placa con 96 pocillos que se montó en el Luminometer (Berthold). Para desencadenar la emisión de luz de la fotoproteína, se inyectaron 50 \mul de solución (CaCl_{2} mM) en los pocillos y se registró la luminiscencia durante 10 segundos.

En la Fig. 1 se muestran los resultados de la traducción in vitro del ADN de Photina^{TM}, Obelina y Aequorina. En la Fig. 2 se muestran las medidas de luminiscencia obtenidas diluyendo la fotoproteína en las reacciones de traducción in vitro. En la Tabla II se muestra la comparación de los dato de luminiscencia con los conteos de TCA obtenidos durante la traducción con diferentes cantidades de ADN de Photina^{TM} y Obelina (la luminiscencia medida es proporcional a la cantidad de fotoproteína nuevamente sintetizada).

TABLA II Contenido de fotoproteína radiomarcada y su luminiscencia en la mezcla de traducción

1

3. Ejemplos de ensayos funcionales basados en células

3.1 Se han obtenido clones que expresan la Photina^{TM} mediante transfección de células CHO-K1 (Materiales y Procedimientos). Dos días después de la transfección, las células se tripsinizaron y diluyeron 10 ó 100 veces. Una vez que las células se hicieron crecer hasta que se aislaron bien las colonias, las colonias se transfirieron a placas nuevas y se seleccionaron en función de su respuesta funcional (señal luminiscente) a diferentes concentraciones de ATP, que se sabe que estimula el receptor endógeno CHO y aumentar la concentración de Ca^{++} en el citoplasma. Al final de cada experimento, se lisaron las células mediante perfusión de una solución que contenía Triton X-100 y CaCl_{2}. Se reconstituyó la fotoproteína activa incubando las células con 10 \mul de coelenterazina diluida en PBS que contenía calcio 2 mM, en oscuridad a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5% durante 3 h. Para la medida de la emisión de luz, se lisaron las células en presencia de calcio y se registró la luminiscencia emitida. Se integró el número de fotones emitidos durante los primeros 10 segundos mediante el luminómetro y se visualizó sobre la pantalla. Las células transfectadas con un plásmido vacío o sin transfectar (no se muestran los datos) no aumentan a emisión de fotones. Para detectar los cambios en las concentraciones de calcio, se inyectó ATP 10, 50 y 100 \muM y se determinaron las cinéticas de respuesta del calcio. En la Fig. 3 (A) se muestra la curva obtenida. En la Fig. 3 (B) se usó una línea celular que expresaba la fotoproteína Obelina.

3.2 Se estableció una línea celular CHO que expresaba el receptor de la endotelina A y la Photina^{TM}. Tras la estimulación con un agonista, este receptor induce un aumento en la concentración de calcio intracelular que se mide mediante la luminiscencia de la Photina^{TM}. Se cultivaron las células en forma de monocapa en medio DMEM/F12 que contiene Suero Bovino Fetal al 10% (FBS) en una placa con 96 pocillos. El día del experimento, se eliminó el medio de cultivo y las células se incubaron con Coelenterazina 10 \muM en PBS durante al menos 3 h. El péptido endotelina se diluyó en PBS a una concentración de 100 y 500 nM. Se inyectaron aproximadamente 50 \mul de endotelina en cada pocillo y se midió la respuesta. La luz emitida se registró inmediatamente durante un período de 30 segundos. En la Figura 4 se relaciona la respuesta dependiente de la dosis de endotelina.

3.3 Las líneas celulares de CHO que expresan tanto ApoPhotina^{TM} como el receptor de capsaicina de rata VR1 -un canal de iones permeable al calcio- se hicieron crecer hasta un 80-95% de confluencia en frascos para el cultivo de tejidos, y se recolectaron con tripsinización. Las células se distribuyeron en 10.000 células/pocillo en placas blancas de 96 pocillos con medio de cultivo, y se incubaron durante toda la noche a 37ºC en un incubador humidificado con CO_{2} al 5%. Para los experimentos de luminiscencia las células se cargaron con coelenterazina 10 \muM durante 3 h a 37ºC y CO_{2} al 5%. Se estimuló la respuesta de calcio por adición de capsaicina 10 y 50 \muM a cada pocillo. Se siguió la cinética de los destelleos de luminiscencia mediante un Labsystem Luminoskan Ascent, que inyecta reactivos y registra la emisión de luz procedente de cada pocillo. La adición de capsaicina originó una señal luminiscente rápida y discontinua durante 30 segundos, produciéndose un máximo en aproximadamente 10 segundos (Figura 5).

Materiales y procedimientos Reactivos

Los enzimas de restricción se adquirieron de New England Biolabs y se usaron de acuerdo con las instrucciones del suministrador. La Rnasina y el kit TNT para la transcripción y traducción in vitro fueron de Promega (Madison, WI). La polimerasa Pfu Turbo, los reactivos para PCR, y las células competentes de las cepas de E. coli XL-1Blue y BL21, fueron de Stratagene (La Jolla, CA). Los oligonucleótidos se adquirieron de Primm (Milán). La coelenterazina fue de Prolume Ltd. (Pisttsburg, PA). Todos los demás productos químicos fueron de fuentes estándar y eran de calidad reactivo o superior.

Ensamblaje PCR para síntesis de la etapa única de las secuencias de ADN de la Obelina

Se requieren cuatro etapas para el ensamblaje PCR: oligosíntesis, ensamblaje del gen, amplificación del gen y clonación. Hemos sintetizado 30 oligos, de 40 nt de longitud, que codifican de manera colectiva ambas cadenas de la secuencia del gen de Obelina. La superposición de los oligos complementarios es de 20 nt. Volúmenes iguales tomados de cada una de las 30 soluciones oligo se combinaron hasta una concentración final de aproximadamente 250 \muM de oligos mezclados, anteriormente a una dilución de 250 veces en 20 \mul de una mezcla de Geneamp XL PCR (Perkin Elmer). El procedimiento de amplificación se ha llevado a cabo en tres etapas. La primera etapa se llevó a cabo con oligos combinados como sigue: 40ºC durante 2 min, a continuación adición de la polimerasa, 72ºC durante 10 s, a continuación 40 ciclos (94ºC durante 15 s, 40ºC durante 30 s, y 72ºC durante 10 s). La mezcla de reacción se diluyó tres veces con mezcla de PCR fresco y polimerasa. La segunda etapa fue: 25 ciclos (94ºC durante 15 s, 40ºC durante 30 s y 72ºC durante 45 s). La mezcla de reacción se diluyó de nuevo tres veces en mezcla completa de PCR. Las condiciones para la tercera etapa fueron: 20 ciclos (94ºC durante 15 s, 40ºC durante 30 s y 72ºC durante 70 s). Los productos de la reacción se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y el fragmento específico se clonó en el vector pcrBlunt para las siguientes etapas de clonación. Se ha denominado al plásmido pcr-OB. La fidelidad de las reacciones PCR se confirmó mediante secuenciamiento dideoxi.

Construcción de la proteína quimérica

Se han diseñado cuatro acoplamientos de oligos de la secuencia del gen de Clitina. Se ha escogido la región entre EF-hand I y EF-hand II para la quimerización del gen. Los oligonucleótidos cebadores fueron los siguientes:

2

Los oligos fusionados se han clonado en los emplazamientos únicos NdeI/MunI en el vector pcr-OB. El plásmido que contiene el producto del gen quimérico se denomina pcr-Photina^{TM}. El ADN de Photina^{TM} se ha subclonado de manera adicional en el vector pcADN3 que contiene el promotor T7.

Cambio de uso en el codón según PCR

Se empleó la técnica de extensión por solapamiento PCR para producir el mutante de Obelina. Se diseñaron seis acoplamientos de cebadores con diez mutaciones puntuales diferentes para producir diez cambios de uso diferentes en el codón. Para amplificar los fragmentos de ADN mediante solapamiento por extensión, las reacciones PCR se llevaron a cabo con 2,5 unidades de polimerasa Pfu, 50 ng de ADN molde, 250 \muM de cada DNTP, y 50 pmol de cada cebador en un volumen total de 100 \mul. Los parámetros de ciclación empleados fueron 94ºC durante 1 min, 45ºC durante 1 min, y 72ºC durante 1 min 30 s durante los primeros 10 ciclos, seguido por 20 ciclos con temperatura de apareamiento de 50ºC. Las mutaciones específicas del emplazamiento se confirmaron mediante el secuenciamiento del ADN llevado a cabo en Primm (Milán). Todos los procedimientos moleculares se realizaron usando protocolos normalizados.

Cultivo de células CHO

Todas las células se cultivaron bajo condiciones de humedad normalizadas a 37ºC y CO_{2} al 5%. Las células CHO se mantuvieron en DMEM/F12 + FBS al 10% + Pen/Strep + 0,5 mg/ml de G418 + piruvato 1,6 mM + NaHCO_{3} al 0,2%, todos los reactivos eran de Life Technologies. Se llevó a cabo la transfección del ADN cuando se hicieron crecer estas células hasta una confluencia del 70% al 80% en las placas.

Bibliografía

1. Kendall, J. M., and Badminton, M. N. (1998). Aequorea victoria bioluminescence moves into an exciting new era. Trends Biotechnology - 16(5):216-24.

2. Campbell, A. K., Hallet, R. A., Daw, M. E., RyaIl, R. C., Hart and Herring P. J. (1981). Application of the photoprotein obelin to the measurament of free Ca^{++} in cells. In Bioluminescence and Chemiluminescence, basic Chemistry and Analytical applications (Editado por M. A. deLuca and W. D. McElroy), pp. 601-607. Academy Press, Nueva York.

3. Herring, P.J. (1979) Some features of the bioluminescence of the radiolarian Thalassicola sp. Mar. Biol. 53, 213-216.

4. Shimomura, O., Johnson F. H., and Saiga, Y (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the Iuminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 59,223-239.

5. Shimomura, O., Johnson F. H., and Saiga, y (1963) Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62, 1-8.

6. Morin, J. G. and Hastings J. W. (1971) Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol. 77, 305-311.

7. Shimomura, O., Johnson, F. R. and Saiga, Y. (1963) Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan Halistaura. J. Cell. Physiol. 62, 9-15.

8. Shimomura, O., y Shimomura, A. (1985) Halistaurin, phialidin and modified forms of aequorin as Ca^{++} indicator in biologicaI systems. Biochem. J. 228, 745-749.

9. Levine, L. D:, and Ward, W.W. (1982) Isolation and characterization of a photoprotein "phialidin" and a spectrally unique green-fluorescent protein from the bioluminescent jelIyfish Phialidium gregarium. Comp. Biochem. Physiol. 72B, 77-85.

10. Morín, J. G. and Hastings (1971) Energy transfer in a bioluminescent system. J. Cell. Physiol. 77) 313-318.

11. Campbell, A. K. (1974) Extraction, partial purification and properties of obelin the calcium-activated protein from the hydroid Obelia geniculata. Biochem. J. 143, 411-418.

12. Ward, W. W. and Selinger (1974) Extraction and purification of calcium-activated photoprotein from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Bern ovata. Biochemistry 13, 1491-1499.

13. Ward, W.W. y Seliger H.H. (1974) Properties of mnemiopsin, and Berlin, calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroë ovata. Biochemistry 13, 1500-1510.

14. Johnson, F .H. y Shimomura, O. (1978) Introduction to the bioluminescence of medusae, with special reference to the photoprotein aequorin. Methods Enzymol. 57, 2 71-291.

15. Illarionov BA, Bondar VS, Illarionova VA, Vysotski ES. Sequence of the cDNA encoding the Ca^{++} -activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima. Gene. 1995 14; 153(2):273-4

16. Blinks, J.R., Weir, W.G.) Hess, (P. y Prendergast, F.G. (1982). Measurement of Ca^{++} concentrations In living cells. Prog. Biophys. Mol. Biol. 40, 1-114.

17. Markova SV, Vysotski ES, Blinks JR, Burakova LP, Wang BC, Lee J., (2002) Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning, expression, and comparison of some properties with those of other Ca2+-regulated photoproteins. Biochernistry. 2002 Feb 19;41(7):2227-36.

18. Button D, Brownstein M. (1993) Aequorin-expressing mammalian cell lines used to report Ca^{++} mobilization. Cell Calcium. Oct; 14(9):663-71.

19. Mattheakis, L., y Ohler, L.D. (2002) Seeing the light: Calcium imaging in cells for drug discovery. Drug Discovery Today S, 15-19.

20. Stables J, Green A, Marshall F, Fniser N, Knight E, Sautel M, Milligan G, Lee M, Rees S. (1997). A bioluminescent assay for agonist activity at potentialIy any G-protein-coupled receptor. (1997) Anal Biochem 1; 252(1): 115-26.

21. Brini M, Pinton P, Pozzan T, Rizzuto R. (1999). Targeted recombinant aequorins: tools for monitoring Ca^{++} in the various compartments of a living cell. Microsc. Res. Tech. 46,380-389.

22. Creton R, Kreiling JA, Jaffe LF. (1999) Calcium imaging with chemiluminescence. Microsc. Res. Tech. 46,390-397.

23. Shimomura, O. y col. (1993) Light-emitting properties of recombinant semi-synthetic Aequorins and recombinant fluorescin-conjugated Aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium 14, 373-378.

24. Mirasoli, M. y col. (2002) Bioluminescence immunoassay for cortisol using recombinant aequorin as a label. Analytical Biochemistry 306, 204-211.

<110> Axxam

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<120> Fotoproteína con actividad bioluminiscente aumentada

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<130> 1191 EUR

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<160> 9

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 662

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<212> ADN

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<213> Obelia longissima

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<400> 1

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3

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<210> 2

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<211> 195

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<212> PRT

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<213> Obelia longissima

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<400> 2

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4

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<210> 3

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<211> 195

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<212> PRT

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<213> proteína quimérica

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<400> 3

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5

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<210> 4

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<211> 600

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<212> ADN

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<213> gen quimérico

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<400> 4

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6

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<210> 5

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<211> 607

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<212> ADN

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<213> gen quimérico

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<400> 5

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7

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<210> 6

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<211> 70

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido cebador

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<400> 6

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tatgcgccaa acttggagca acaccagaac agaccaaacg tcaccaggat gctgtcgaag

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60

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctttcttcaa

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70

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<210> 7

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<211> 71

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido cebador

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<400> 7

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tttttgaaga aagcttcgac agcatcctgg tgacgtttgg tctgttctgg tgttgctcca

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60

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agtttggcgc a

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71

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<210> 8

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<211> 62

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<212> ADN

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<213> oligonucleótido cebador

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<400> 8

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aaagattggt atggattatg gtaaagaagt cgaattccca gcttttgttg atggatggaa

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60

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ag

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62

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<210> 9

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<211> 63

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<212> ADN

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<213> oligonuclótido cebador

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<400> 9

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aattctttcc atccatcaac aaaagctggg aattcgactt ctttaccata atccatacca

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60

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atc

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63

Claims

1. Una fotoproteína quimérica que se puede obtener por sustitución de una región de la proteína Obelina comprendida entre el primer y segundo emplazamiento de enlace con el calcio con una región correspondiente de la fotoproteína Clitina.

2. Una fotoproteína quimérica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la mencionada región está entre el residuo 42 y el 122 de la secuencia de la proteína Obelina.

3. Una fotoproteína quimérica de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la mencionada región se extiende desde el residuo 50 al 95 de la secuencia de la proteína Obelina.

4. Una fotoproteína de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en la que los residuos 50 a 94 de la proteína Obelina están reemplazados con un fragmento de la secuencia de Clitina que se extiende desde el residuo 53 al 97.

5. Una fotoproteína quimérica de acuerdo con la reivindicación 4, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 3.

6. Una fotoproteína quimérica de acuerdo con las reivindicaciones 4-5, que comprende de manera adicional una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 55, 66, 67, 73, 74, 75, 78, 83, 84, 87, 89 y 94 de la secuencia de Obelina.

7. Un producto de fusión entre una fotoproteína de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 y un polipéptido diferente.

8. Un producto de conjugación entre una fotoproteína de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 y una molécula de interés analítico, diagnóstico o terapéutico.

9. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la proteína de la reivindicación 3, que tiene una secuencia seleccionada entre SEC. ID Nº 4 y SEC ID Nº 5.

10. El uso de una fotoproteína quimérica de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, en combinación con un sustrato de luciferina, para la detección de iones de calcio.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el mencionado sustrato de luciferina es coelenterazina.

12. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 10-11, para la determinación cuantitativa de iones de calcio.

13. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 10-11, para la determinación de la concentración del calcio intracelular.

14. Una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.

15. El huésped celular de la reivindicación 14, que se selecciona entre células de bacterias, levaduras hongos, plantas, insectos y animales.

16. Un procedimiento para producir una fotoproteína, que comprende hacer crecer la célula huésped recombinante de la reivindicación 14 en condiciones adecuadas para la expresión de la fotoproteína, y la recuperación de la proteína expresada.

17. Un procedimiento para la selección de moléculas biológicamente activas, que comprende la exposición de un huésped celular según la reivindicación 14 a una cantidad definida de las mencionadas moléculas, y detectar cualquier variación de la concentración del calcio intracelular.

18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el huésped celular se transfecta con una proteína-G heteróloga acoplada con el receptor o el canal iónico.

19. El uso de un producto de conjugación entre una fotoproteína de cuerdo con las reivindicaciones 1-6 y una molécula de interés analítico, diagnóstico o terapéutico en un inmunoensayo competitivo en fase sólida para determinar la cantidad de la mencionada molécula en muestras biológicas.

20. Un sistema de transferencia de resonancia de energía de bioluminiscencia (BRET), que comprende una proteína fluorescente y la fotoproteína de la reivindicación 5.