ES2235335T3 - Procedimiento de manipulacion del aroma de productos del tomate y productos del tomate susceptibles de obtencion por este procedimiento. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para manipular el aroma de los productos derivados del tomate comprende las etapas de (a) añadir una enzima con actividad de alcohol deshidrogenasa a una pluralidad de tomates; (b) añadir bien un cofactor de alcohol deshidrogenasa o de un donante de electrones a la pluralidad de tomates; y (c) que incuba la pluralidad de tomate. Compuestos de aromas volátiles como aldehídos C6 son reducidos a alcoholes C6, cambiando de este modo los atributos de los sensores de los productos derivados del tomate. Como alternativa, los alcoholes C6 son oxidados a aldehídos C6 repitiendo las etapas del proceso (a) a (c), pero sustituyendo un donante de electrones por un receptor de electrones.

Description

Procedimiento de manipulación del aroma de productos del tomate y productos del tomate susceptibles de obtención por este procedimiento.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para manipular el aroma de productos del tomate, y a productos preparados mediante el procedimiento.

Antecedentes de la técnica

Los tomates son una importante fuente de alimento. Se consumen crudos o en estado procesado; es común preparar salsas o sopas con ellos.

La popularidad de los tomates puede adjudicarse a su aroma fresco dulce-ácido, que depende de su relación de azúcar a ácido y de una combinación de al menos 400 compuestos aromáticos volátiles que se liberan o generan cuando se corta el fruto del tomate. Por ejemplo, aldehídos y alcoholes de 6 átomos de carbono (C6) contribuyen al aroma fresco verde de los tomates; se generan mediante oxidación lipídica.

Para preparar productos basados en tomate, tradicionalmente se procesan tomates frescos utilizando un procedimiento de ruptura en frío o en caliente, en el que los tomates se trituran y se calientan a temperaturas de aproximadamente 65 y 85ºC respectivamente. Se prepara un producto concentrado de tomate mediante la evaporación del agua de estos tomates triturados y calentados. Sin embargo, muchos compuestos aromáticos volátiles tales como aldehídos C6 y alcoholes C6 se liberan a la atmósfera durante estos procedimientos, dando como resultado una pérdida significativa del aroma verde deseable de los tomates frescos.

Es un procedimiento alternativo para la producción de productos concentrados de tomate utilizar ósmosis inversa para separar sólidos y líquidos. En los sólidos separados, los compuestos aromáticos volátiles tales como aldehídos C6 se retienen en cantidades relativamente altas. Sin embargo, los aldehídos C6 son perjudiciales para la calidad del aroma en altas concentraciones, puesto que el aroma se vuelve demasiado verde y por tanto herboso y químico, en lugar de moderadamente verde y fresco.

Típicamente, el homogeneizado de tomate fresco comprende de 5,0 a 20,0 ppm de aldehídos C6 y de 0,2 a 6,0 ppm de alcoholes C6; la pasta concentrada de tomate preparada utilizando el procedimiento de ruptura en caliente y evaporación comprende de 0 a 0,2 ppm de aldehídos C6 y de 0 a 0,1 ppm de alcoholes C6; la pasta concentrada de tomate preparada utilizando ósmosis inversa comprende de 0,1 a 20 ppm de aldehídos C6 y de 0,1 a 20 ppm de alcoholes C6.

En el documento US 5436022, se escaldan tomates enteros inmaduros en agua caliente para inactivar las enzimas superficiales, se enfrían, se maceran en presencia de base y alcohol añadidos para proporcionar una suspensión que tiene un pH de 4,7-5,1, se acidifican y se someten a un procedimiento de ruptura en caliente tradicional. Durante la etapa de maceración, se liberan enzimas endógenas y se efectúan reacciones enzimáticas. Los productos de tomate resultantes son más dulces, más frutales y menos ácidos que los productos de tomate preparados mediante procedimientos de ruptura en caliente convencionales. Esto es debido a que las actividades de las enzimas responsables del desarrollo del sabor frutal y dulce deseado se utilizan antes de utilizar el procedimiento de ruptura en caliente para inactivarlas.

Un artículo en el Journal of Food Science, vol. 54, nº 6, 1989, pág. 1607-1610, se refiere a la formación de n-hexanol a partir de n-hexanal mediante la acción enzimática en extractos de soja. A un pH de 8-9, se supone que el n-hexanal se reduce mediante alcohol deshidrogenasa endógena para producir n-hexanol (aunque no se muestra ninguna enzima específica). Se indica que la presencia de los cofactores NADH y NADPH es necesaria para que ocurra esta reducción. La conversión de n-hexanal en n-hexanol se dice que es útil para reducir la intensidad de los aromas herboso, fabáceo y verde del n-hexanal.

En relación con los tomates, "Constituents Volatils de la Tomato: Mise en evidence et Formation par Voie Enzimatique du tran-Hexene-2-ol" en Agr. Biol. Chem., 40 (12), 2349-2353, 1976, discute la acción de la alcohol deshidrogenasa aislada sobre el trans-2-hexenal para producir trans-2-hexenol.

Sumario de la invención

Según la presente invención, se proporciona un procedimiento para manipular el perfil aromático de productos del tomate, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:

a)

añadir una enzima con actividad alcohol deshidrogenasa a una pluralidad de trozos de tomate;

b)

añadir un cofactor de alcohol deshidrogenasa, un donante de electrones o un aceptor de electrones a la pluralidad de los trozos de tomate; e

c)

incubar la pluralidad de trozos de tomate.

En la etapa b, para manipular el perfil aromático reduciendo los aldehídos C6 a alcoholes C6, se añade el donante de electrones o la forma reducida del cofactor.

Como alternativa, para manipular el perfil aromático oxidando alcoholes C6 a aldehídos C6, se añade el aceptor de electrones o la forma oxidada del cofactor en la etapa b. Preferiblemente, se añade un donante de electrones o un aceptor de electrones a la pluralidad de trozos de tomate, dependiendo de si se desea reducción u oxidación.

Según la presente invención, se proporciona también un producto de tomate que comprende de 0,025 a 0,5 ppm, preferiblemente de 0,05 a 0,3 ppm, más preferiblemente de 0,075 a 0,15 ppm de aldehídos C6, y de 0,1 a 10 ppm, preferiblemente de 0,5 a 8 ppm, más preferiblemente de 1 a 5 ppm de alcoholes C6.

Estos niveles de aldehídos C6 y alcoholes C6 proporcionan un producto de tomate que tiene un aroma que se percibe como superior al aroma de productos de tomate conocidos; un producto de tomate de la presente invención tiene un aroma que es fresco, no demasiado verde y no sobreprocesado ni desnaturalizado.

Una pluralidad de trozos de tomate es, por ejemplo, tomates cortados, en dados, triturados u homogeneizados. Los trozos de tomate pueden someterse a tratamientos tales como calor, ósmosis inversa o evaporación antes o después de realizar el procedimiento de la presente invención.

Puesto que los productos de tomate son generalmente ácidos, el pH de los trozos de tomate es preferiblemente de 3,5 a 7, más preferiblemente el pH es 5,8.

La enzima con actividad alcohol deshidrogenasa (ADH) puede tener su fuente en células de plantas, animales o microorganismos. Por ejemplo, se extrae de células de tomate, células de levadura y células hepáticas.

El extracto de levadura comprende una enzima con actividad ADH y un donante de electrones; por lo tanto puede añadirse a trozos de tomate durante el procedimiento de la presente invención para proporcionar la enzima y el donante de electrones cuando es necesaria la reducción de aldehídos C6.

Los cofactores de ADH incluyen dinucleótido de adenina nicotinamida NAD; fosfato dinucleótido de adenina nicotinamida NADP y dinucleótido de flavina-adenina FAD. La forma reducida de NAD es NADH, la forma oxidada es NAD^{+}. La forma reducida de NADP es NADPH; la forma oxidada es NADP^{+}. La forma reducida de FAD es FADH, la forma oxidada es FAD^{+}.

Cuando NADH se añade como cofactor a un producto de tomate que comprende aldehídos C6, la enzima que tiene actividad alcohol deshidrogenasa cataliza la siguiente reacción durante la etapa de incubación:

aldehído C6 + NADH + H^{+} \Leftrightarrow alcohol C6 + NAD^{+}

Como resultado, una proporción sustancial de los aldehídos C6 liberados o generados por los trozos de tomate se reduce a alcoholes C6.

Como alternativa, la reacción puede actuar en la dirección opuesta añadiendo NAD^{+} para oxidar alcoholes C6 a aldehídos C6.

Tanto los aldehídos C6 como los alcoholes C6 contribuyen al perfil aromático de los tomates, pero diferentemente. Por tanto, este procedimiento es útil para manipular el aroma de productos de tomate. Por ejemplo, el hexanal se reduce a hexanol y el cis-3-hexenol se oxida a cis-3-hexenal.

La adición de un donante o aceptor de electrones es preferida a la adición del cofactor NAD, puesto que NAD^{+} es endógeno en los trozos de tomate. Por tanto, la adición de un donante de electrones tal como etanol o de un aceptor de electrones tal como acetaldehído conduce a las siguientes reacciones durante la etapa de incubación; estas reacciones son catalizadas por la enzima que tiene actividad ADH:

etanol + NAD^{+} + H^{+} \Leftrightarrow acetaldehído + NADH

aldehído C6 + NADH \Leftrightarrow alcohol C6 + NAD^{+} + H^{+}

siendo la reacción neta:

etanol + aldehído C6 \Leftrightarrow acetaldehído + alcohol C6

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Por tanto, cuando se reducen aldehídos C6 a alcoholes C6, se genera NADH a partir de NAD^{+} utilizando etanol, de modo que no hay necesidad de utilizar NADH exógeno. Cuando se oxidan alcoholes C6 a aldehídos C6, se utiliza acetaldehído para regenerar el NAD^{+}. Esto es ventajoso ya que NADH y NAD^{+} son caros para comparar para adición separada.

En lugar de etanol, pueden utilizarse otros alcoholes orgánicos como donante de electrones. En lugar de acetaldehído, pueden utilizarse otros aldehídos orgánicos como aceptor de electrones.

La etapa de incubación puede dejarse proceder hasta que todos los aldehídos C6 se han reducido a alcoholes C6 o todos los alcoholes C6 se han oxidado a aldehídos C6. Como alternativa, la etapa de incubación puede terminarse prematuramente inactivando la enzima que tiene actividad ADH; esto evita cualquier reducción u oxidación adicional. Por tanto, la terminación de la etapa de incubación regula el grado de reducción u oxidación que ocurre, dictando así las concentraciones relativas de alcoholes C6 y aldehídos C6 en el producto final. La enzima que tiene actividad ADH se inactiva, por ejemplo, calentando los trozos de tomate (por ejemplo durante 10 min a 100ºC) o añadiendo inhibidores tales como pirazol y 4-metilpirazol.

La cantidad añadida de la enzima que tiene actividad alcohol deshidrogenasa puede ser de 0,1 U/ml a 1000 U/ml; preferiblemente de 0,1 a 10 U/ml; más preferiblemente de 0,1 a 0,5 U/ml.

A temperatura ambiente, el tiempo de incubación puede ser de 1 a 60 minutos, y es preferiblemente menor de 30 minutos. En condiciones óptimas, la mayoría de los aldehídos C6 se reducen a alcoholes C6, o la mayoría de los alcoholes C6 se oxidan a aldehídos C6 al cabo de 15 minutos de incubación. A otras temperaturas, los tiempos de incubación preferidos pueden ser diferentes.

La presente invención es más eficaz que el procedimiento dado a conocer en el artículo sobre soja citado anteriormente: según la figura 1 del artículo sobre soja, se reduce menos de un 50% del hexanal en la soja después de 90 minutos; en la presente invención, se reduce más de un 85% después de 15 minutos (véase el ejemplo B3 a continuación).

El artículo sobre soja utiliza sólo enzimas endógenas que tienen actividad alcohol deshidrogenasa (ADH); no se da a conocer la adición de una enzima aislada que tiene actividad ADH.

Aunque la alcohol deshidrogenasa aparece naturalmente en tomates, la capacidad endógena no es suficiente para la catálisis de la reducción de la mayoría de los aldehídos C6 a alcoholes C6, o de la oxidación de la mayoría de los alcoholes C6 a aldehídos C6, incluso en presencia de cofactor añadido.

El artículo sobre soja guarda silencio también sobre las cantidades de cofactor necesarias para conseguir los efectos superiores de reducción y oxidación de la presente invención.

Según la presente invención, cuando se añaden NADH o NAD^{+}, la cantidad utilizada puede ser de 10 \muM a 500 \muM. Cuando se añaden etanol o acetaldehído, la cantidad utilizada puede ser de 1 \muM a 60.000 \muM (concretamente menos de un 0,3% de etanol o acetaldehído en el producto, p/p); preferiblemente se utiliza menos de 40.000 \muM de etanol o acetaldehído, más preferiblemente menos de 20.000 \muM.

Las concentraciones relativas de aldehídos C6 y alcoholes C6 en el producto de tomate resultante están dictadas, en parte, por la cantidad de cofactor o donante/aceptor de electrones añadida. Por tanto, la reducción de los aldehídos C6 o la oxidación de los alcoholes C6 puede controlarse mediante una dosificación predeterminada del cofactor o del donante/aceptor de electrones.

En ausencia de suficiente enzima que tenga actividad alcohol deshidrogenasa y su cofactor o un donante/aceptor de electrones, la relación de aldehído C6 a alcohol C6, en peso, puede ser de 49,5 en un producto homogeneizado de tomate fresco (véase el ejemplo A2 a continuación). En presencia de suficiente enzima que tiene actividad alcohol deshidrogenasa y su cofactor o un donante/aceptor de electrones, la relación de aldehído C6 a alcohol C6, en peso, puede ser de 0,04 (véase el ejemplo A6 a continuación).

Utilizando el procedimiento de esta invención, los compuestos aromáticos volátiles típicos de los tomates frescos pueden generarse en productos de tomate procesados tales como pastas y salsas. Además, los niveles de estos compuestos aromáticos volátiles en los productos de tomate pueden regularse de modo que el aroma no sea demasiado verde o herboso.

Por ejemplo, para productos de tomate concentrados preparados utilizando ósmosis inversa, en los que las concentraciones de aldehído C6 son a menudo indeseablemente altas, la reducción de aldehídos C6 a alcoholes C6 en el producto concentrado mejora sus atributos sensoriales. Como alternativa, los aldehídos C6 pueden reducirse a alcoholes C6 en un homogeneizado de tomate antes de la ósmosis inversa, dando como resultado un producto de tomate concentrado que no tiene una concentración indeseablemente alta de aldehídos C6.

Los productos de tomate concentrado preparados utilizando un procedimiento de ruptura seguido de evaporación tienen a menudo concentraciones indeseablemente bajas de aldehído C6. Esto es debido a la pérdida de los aldehídos C6 durante el procesamiento. La presente invención puede utilizarse para aumentar las concentraciones de aldehído C6 en dichos productos, dando como resultado atributos sensoriales mejorados.

Esto se consigue utilizando el siguiente procedimiento:

i)

homogeneizar tomates en presencia o ausencia de calor;

ii)

reducir los aldehídos C6 en el homogeneizado de tomate a alcoholes C6 añadiendo una enzima con actividad alcohol deshidrogenasa y una forma reducida de un cofactor de alcohol deshidrogenasa o un donante de electrones; e incubar el homogeneizado;

iii)

calentar opcionalmente el homogeneizado;

iv)

evaporar el homogeneizado de tomate para formar un producto concentrado de tomate;

v)

oxidar los alcoholes C6 en el producto de tomate concentrado a aldehídos C6 añadiendo una enzima con actividad alcohol deshidrogenasa y una forma oxidada de un cofactor de alcohol deshidrogenasa o un aceptor de electrones al producto de tomate; e incubar el producto de tomate.

Este procedimiento aumenta los niveles de aldehídos C6 en el producto final al "protegerlos" durante la evaporación como resultado de convertirlos en alcoholes C6, que se conservan mejor que los aldehídos C6 durante la evaporación. Los alcoholes C6 se convierten de nuevo en aldehídos C6 al final del procedimiento.

La etapa final de incubación puede terminarse prematuramente mediante inactivación de la enzima que tiene actividad ADH, para regular el grado de oxidación que ocurre, dictando así las concentraciones relativas de alcoholes y aldehídos C6 en el producto final.

Puesto que tanto los alcoholes C6 como los aldehídos C6 contribuyen al aroma fresco verde de los tomates, la etapa v puede omitirse en conjunto, puesto que los alcoholes C6 formados en la etapa ii y retenidos durante la evaporación pueden ser suficientes para mejorar la percepción fresca de un producto de tomate.

Descripción detallada de la invención

Se describirán ahora ejemplos de los productos y procedimientos de la invención para ilustrar, pero no para limitar, la invención.

Purificación de alcohol deshidrogenasa Extracto bruto

Se lavaron tomates con agua destilada, se cortaron en cuartos y se homogeneizaron en un mezclador (velocidad máxima) durante 30 s en Tris-HCl 1 M, pH 7,4, 20% de glicerol, 1,4-ditiotreitol (DTT) 5 mM, ácido etilendiamino-N,N'-diacético 1 mM (EDTA) (0,8 ml/g de fruta). Se ajustó el pH a 7,4 con NaOH 6 M a temperatura ambiente. Se centrifugó después el homogeneizado a 4ºC, 12200 g durante 40 min. El sobrenadante, después de filtración en un material de filtración rápida tal como gasa, constituyó el extracto bruto.

Precipitación con sulfato de amonio

Se precipitó el extracto bruto en hielo con 35% de saturación de sulfato de amonio y se centrifugó en las mismas condiciones descritas anteriormente. Se llevó después el sobrenadante a 65% de saturación. Después de un procedimiento de centrifugación final, se redisolvió el sedimento en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, 20% de glicerol, DTT 1 mM. Antes de la filtración en gel, esta fracción tuvo que centrifugarse para eliminar la turbidez.

Todos los procedimientos adicionales se realizaron a 4ºC.

Filtración en gel Sephadex G-25™

Se cargó después la fracción en una columna Sephadex G-25™ (5 x 9 cm), obtenible de Pharmacia Biotech, equilibrada y eluída con Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, 20% de glicerol, DTT 1 mM. Se combinaron las fracciones activas y se analizaron la concentración de proteína y la actividad ADH.

Cromatografía de intercambio aniónico

Se aplicó la fracción activa de la filtración en gel a una columna de dietilaminoetil (DEAE)-Sepharose™ (5 x 6,5 cm), obtenible de Pharmacia Biotech, equilibrada con Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, 20% de glicerol, DTT 1 mM. Se eluyó la columna con un gradiente lineal de NaCl 0-0,5 M en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, 20% de glicerol, DTT 1 mM. Se combinaron las fracciones activas y se ensayaron en la solución obtenida el contenido de proteína y la actividad ADH.

Cromatografía de afinidad

Se aplicó finalmente la solución enzimática a una columna Blue Sepharose CL-6B™ (1,8 x 9,5 cm), obtenible de Pharmacia Biotech. El material de cromatografía de afinidad Cibacron Blue F3G-A™ (también de Pharmacia Biotech) se une a varias proteínas, especialmente a enzimas que requieren cofactores que contienen adenilo (incluyendo NAD^{+} y NADP^{+}). Una elución con un cofactor específico de la proteína de interés permite una buena separación. Por tanto, se eluyó la ADH con un gradiente lineal de NAD^{+} 0-0,5 mM en tampón Tris. Las fracciones activas recogidas constituyeron la ADH purificada.

Filtración en gel Sephadex G-25™

Se retiró NAD^{+} de la solución de enzima purificada realizando una filtración en gel en una columna de Sephadex G-25™ (5 x 9,5 cm), equilibrada con tampón Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, 20% de glicerol, DTT 1 mM. Se realizó la elución con el mismo tampón.

Se congelaron después las fracciones que contenían actividad ADH y se almacenaron en porciones de 0,5 ml a 20ºC.

Ensayo de actividad alcohol deshidrogenasa de tomate

Se determinó la actividad ADH midiendo el aumento de absorbancia A_{340 \ nm} debido a la producción de NADH en la reacción. Se calculó la pendiente de la curva A_{340 \ nm}= f (tiempo) en los primeros dos minutos de la reacción (parte lineal de la curva A_{340 \ nm}= f (tiempo). Se define una unidad como la cantidad de enzima que cataliza la formación de NADH 1 \muM por min. (\Sigma_{340}= 6220 M^{-1}cm^{-1} para NADH).

La mezcla de reacción consistía en etanol 50 mM, NAD^{+} 1 mM en tampón de glicina-NaOH 0,5 M, pH 9,6 y 50 a 150 \mul de solución enzimática. Se realizó la reacción en una cubeta de 1 cm de longitud de paso en un volumen final de 1,5 ml a temperatura ambiente, y se inició mediante la adición de la enzima.

Durante la purificación, se controló rutinariamente la actividad en las fracciones recogidas después de la cromatografía mediante el uso de un analizador Cobas-Mira™, que es un aparato automatizado para ensayos y análisis espectrofotométricos, obtenible de Hoffman La Roche; este analizador permitía volúmenes reducidos de enzimas y reactivos. Estas medidas se realizaron a 30ºC en un volumen total de 100 \mul.

Resultados

Se purificó la enzima aproximadamente 94 veces con un rendimiento total de un 39% y una actividad específica de 52,35 u/mg.

Experimentos A a D

En el experimento A, se consideraron los efectos del pH, el cofactor NADH y la ADH de tomate. En el experimento B, se estudiaron los efectos del tiempo de incubación y la ADH de levadura. El experimento C comprobó la influencia de la concentración de cofactor NADH sobre la extensión de la conversión de aldehídos C6 en el tomate. En el experimento D, se intentó una alternativa de la adición de NADH: se añadió etanol a las muestras a varias concentraciones; su oxidación catalizada por ADH se acompañó por la reducción de NAD^{+} a NADH, que se consumió después en la reducción de aldehídos C6.

Todas las muestras comprendían 0,5 ml de un homogeneizado de tomate y 0,5 ml de solución acuosa. Para preparar el homogeneizado, se mezclaron tomates rojos maduros en un mezclador durante 30 s. El homogeneizado obtenido se añadió inmediatamente a la solución acuosa para evitar una pérdida de productos volátiles mediante evaporación. La solución acuosa contenía 100 \mul del tampón utilizado para preparar la solución acuosa, saturado con O_{2} (10% de saturación de oxígeno), para permitir la acción de la lipooxigenasa, esencial para la formación de aldehídos C6. Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 30 min. Se prepararon las muestras en viales que se cerraron herméticamente antes de la incubación. Después de la incubación, se congelaron rápidamente las muestras en hielo seco y se almacenaron a -80ºC para análisis.

Análisis de productos volátiles de las muestras de tomate

Se utilizó un procedimiento que utiliza un Dynamic Headspace Tekmar™ (modelo LSC2000 disponible en Interscience) y un cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama (modelo Carlo Erba 8000, disponible en Interscience) basándose en el trabajo de Buttery^{1} para la cuantificación de los productos volátiles en las muestras. Se utilizó una malla polimérica absorbente porosa (basada en óxido de 2,6-difenil-p-fenileno) para absorber aromas; está disponible una malla adecuada en Interscience con el nombre Tenax™. La malla proporciona una interferencia mínima con el tomate mezclado y evita por lo tanto una gran parte de la degradación de los compuestos aromáticos producidos enzimáticamente por otras enzimas de tomate o durante el aislamiento de productos volátiles.

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(^{1}Buttery, R.G., Teranishi, R y Ling; "Fresh tomato aroma volatiles, a quantitative study", J. Agric. Food Chem. (1987) 35, 540-544).

Utilizando este procedimiento, se extrajeron los diferentes productos volátiles de la muestra mediante una tecnología de purga y trampa con un sistema de atrapamiento Tekmar™ y Tenax™ como material absorbente. Se desorbieron térmicamente después los productos volátiles y se crioenfocaron antes de su análisis con el cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.

Antes del análisis, se descongelaron todas las muestras en 20 min. Se pesaron 20 \mul de muestra de tomate, 80 \mul de agua milli-Q y 100 \mul de patrón interno 2-metilciclohexanona (0,115 mg/l) en un matraz de vidrio en forma de U de 5 ml para análisis.

Para identificar los productos volátiles correspondientes a los diferentes picos, se determinaron los tiempos de retención de los compuestos de interés con sustancias de referencia volátiles. En estos experimentos, los productos volátiles considerados fueron hexanal, Z-3-hexenal, E-2-hexenal y 3-metilbutanal para los aldehídos y hexanol, Z-3-hexenol y 3-metilbutanol para el alcohol.

Se utilizaron los factores de respuesta de las sustancias de referencia y áreas de pico del patrón interno para la cuantificación de los productos volátiles en las muestras de tomate. Los factores de respuesta de estos productos volátiles se determinaron cada día con una solución patrón que contenía sustancia de referencia volátiles.

Las sustancias de referencia y el patrón interno se prepararon a una concentración de 0,1 mg/ml para cada componente, en solución de etanol y agua 35:65 (hervida durante 15 min con purga de He). Se diluyó esta solución madre en agua, obteniéndose una concentración final de aproximadamente 10 ng/200 \mul para cada compuesto.

Las concentraciones volátiles reseñadas a continuación son la media de dos medidas. Los datos resultantes se convirtieron en "\muM en la muestra".

Experimento A (muestras A1 a A6)

El pH de las muestras A-1 y A-3 fue el pH natural del homogeneizado de tomate (aproximadamente 4,2). La solución acuosa no contenía ningún tampón, excepto agua. Se utilizó una solución de NADH 15 mM en agua para la muestra A-3.

En las muestras A-2, A-4, A-5 y A-6, el pH fue 5,8. Los 500 \mul de solución acuosa se prepararon por lo tanto en tampón pirofosfato de Na 0,05 M pH 8,1.

Se preparó una solución de ADH de tomate pura de la siguiente manera: se intercambió el tampón de una fracción de la enzima purificada mediante el uso de una columna de filtración en gel NAP 5™ (de Pharmacia Biotech), se equilibró y se eluyó con tampón pirofosfato de Na 0,05 M, pH 8,1; la fracción obtenida se concentró después obteniéndose 10,5 U/ml de actividad ADH. La solución del cofactor contenía NADH 15 mM preparado en tampón pirofosfato de Na 0,05 M, pH 8,1.

Las condiciones finales en las muestras se enumeran en la siguiente tabla.

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1

Resultados

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2

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Influencia del pH

Sin añadir ADH, no se observó una conversión significativa de aldehídos C6 en alcoholes C6 a pH 4,2, ni en ausencia ni en presencia del cofactor NADH: los aldehídos C6 eran predominantes, con una concentración de
63,0 \muM, mientras que la concentración de alcoholes C6 era de 0,2 \muM. Por el contrario, sin añadir ADH y a pH 5,8, se observó un aumento del nivel de alcohol, tanto en presencia como en ausencia de NADH, desde 1 \muM en la muestra A-2 a 15,6 \muM en la muestra A-4. En presencia de NADH, éste se acopló con una reducción de la concentración de aldehídos C6 desde 49,5 \muM a 27,7 \muM, sugiriendo que la reducción de aldehídos C6 tiene lugar a pH 5,8.

Influencia de NADH y ADH

En ausencia de cofactor añadido, la presencia de ADH en grandes cantidades (2,5 U/ml de muestra), en comparación con la cantidad media de ADH en el tomate (0,5 U/ml de tomate puro), produjo un ligero aumento del nivel de alcoholes C6. Combinar los efectos de la ADH de tomate y el cofactor NADH posibilitó la desaparición de un 96% de los aldehídos C6 (hexanal, Z-3-hexenal y E-2-hexenal) por un lado, y la formación de Z-3-hexenol y hexanol por otro lado. El uso del cofactor NADH y la enzima ADH, juntos a pH 5,8, convierte la mayoría de los aldehídos C6 en alcoholes C6 en el homogeneizado de tomate.

Experimentos B, C, D (muestras B1 a B6, C1 a C4, D1 a D4, I1 a I7)

Se prepararon todas las muestras de estos experimentos en tampón pirofosfato de Na 0,1 M, pH 6,8; el pH final de las muestras fue de 5,8.

Las muestras B-2, B-3, B-4, B-5 y B-6 contenían 20 \mul de una solución de NADH 15 mM (concentración final
0,3 mM) preparada en el tampón citado anteriormente.

Se prepararon las soluciones de ADH de tomate puro para estos experimentos de la manera siguiente: se intercambió el tampón de una fracción de la enzima purificada mediante el uso de una columna de filtración en gel NAP 5™ (disponible en Pharmacia Biotech), se equilibró y se eluyó con tampón pirofosfato de Na 0,1 M, pH 6,8; la fracción obtenida contenía 3,0 U/ml de actividad ADH de tomate.

Se preparó la solución de ADH de levadura en el mismo tampón y contenía 384 U/ml de actividad ADH de levadura. Se determinó la actividad ADH de levadura utilizando el mismo procedimiento que para la actividad ADH de tomate. La mezcla de ensayo contenía tampón pirofosfato de Na 0,1 M, pH 8,8, etanol 0,5 M, NAD^{+} 1 mM y entre 20 y 40 \mul de solución enzimática, en un volumen total de 1,5 ml.

Se prepararon las soluciones de cofactor NADH en el tampón citado anteriormente. Se prepararon las soluciones de etanol en agua. Se enumeran las condiciones finales en las muestras en las siguientes tablas.

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Experimento B

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3

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Experimento C

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4

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Experimento D

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5

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Experimento I

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6

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Resultados

Experimento B

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7

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Influencia del tiempo

Para determinar el tiempo necesario para conseguir la reducción de los aldehídos C6, se redujo la cantidad de enzima añadida a 0,5 U/ml y se varió el tiempo de incubación de las muestras. Se mantuvieron constantes el pH y la concentración de NADH respectivamente a 5,8 y 0,3 mM. La mayor parte de los alcoholes C6 apareció en los primeros 15 minutos de incubación. La concentración de alcoholes C-6 aumentó de 0,6 \muM en la referencia sin enzima y cofactor (muestra B-1) hasta 43,7 \muM después de 15 min de incubación. Entre 15 y 60 min, la concentración de alcoholes C6 aumentó de 43,7 \muM a 45,8 \muM. Los aumentos en la concentración de alcoholes C6 estuvieron acompañados por reducciones en la concentración de aldehídos C6 del mismo orden. Se conservó el balance de masas, puesto que la concentración de volátiles C6 fue aproximadamente la misma en todas las muestras del experimento B.

Los alcoholes C6 representaban un 25% de los volátiles C6 totales en presencia de cofactor, sin ADH de tomate añadida, con un tiempo de incubación de 30 min (muestra A-4). En la muestra B-2, en las mismas condiciones pero incubado durante un periodo 5 veces más largo, sólo se obtuvo un 12% de alcoholes C6.

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Experimento C

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Influencia de la concentración de NADH

Puesto que la reducción completa de los aldehídos C6 puede realizarse con una concentración de ADH de 0,5 U/ml, se varió la cantidad de NADH añadida para modular la extensión de la reacción, con un tiempo de incubación de 30 min. Concentraciones crecientes de cofactor condujeron a niveles crecientes de alcoholes C6 formados: las relaciones de aldehídos C6/alcoholes C6 obtenidas sin NADH añadido, con NADH 25 \muM y con NADH 50 \muM fueron 67, 1,1 y 0,3, respectivamente. En las muestras A-6 y B-4, con NADH 0,3 mM y una adición de ADH, se obtuvieron relaciones entre 0,04-0,06. La relación de aldehídos C6/alcoholes C6 puede regularse en un amplio intervalo mediante la cantidad de NADH añadida.

Experimento D

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Efecto del etanol

En la muestra C-4, que contiene etanol 6 mM, se formaron alcoholes C6 mientras se observaban menores niveles de aldehídos C6. Por tanto, la oxidación de etanol regenera NADH a partir de NAD^{+} en homogeneizado de tomate. El experimento D se dirigió a confirmar esta hipótesis. Concentraciones crecientes de etanol entre 1 y 30 mM dieron como resultado niveles crecientes de alcoholes C6. Las relaciones de aldehído C6/alcohol C6 obtenidas fueron 56, 8, 2,5 y 1, con etanol 0 mM, 1 mM, 6 mM y 30 mM, respectivamente.

Efecto de la concentración de ADH de levadura y de la concentración de etanol

Se muestran en la tabla anterior los resultados de la adición de diferentes niveles de ADH de levadura y etanol a pH 5,8. Las diferentes concentraciones de enzima y etanol no mostraron diferencias observables en su conversión de aldehído C6/alcohol C6. La cantidad de aldehídos C6 se reduce, mientras que la cantidad de alcoholes C6 aumenta. El etanol puede utilizarse para reemplazar a NADH como cofactor.

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Experimento I

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Acción de la ADH de levadura

Se añadieron 20 U/ml de ADH de levadura al homogeneizado de tomate, con NADH 0,3 mM y 30 min de incubación (muestra B-6). El resultado observado fue aproximadamente equivalente al obtenido con 0,5 U/ml de ADH de tomate añadida en las mismas condiciones (muestra B-4): la relación de aldehídos C6/alcoholes C6 se redujo de 67 en la muestra B-1 a 0,04 en la muestra en presencia de ADH de levadura y cofactor. Esto sugiere que la ADH endógena aislada puede reemplazarse por una ADH exógena comercialmente disponible de suministradores de enzimas.

Experimentos E y F

En el experimento E, se repitió el procedimiento del experimento B, muestra B-6, utilizando un exceso de ADH de levadura. En el experimento F, se repitió el procedimiento del experimento B, muestra B-6, pero utilizando un exceso de ADH hepática. Se utilizó una muestra control. La siguiente tabla muestra las cantidades (en ppb) de los aldehídos C6 y alcoholes C6 especificados en la muestra control y en las muestras de los experimentos E y F después de llevar a cabo el procedimiento de la presente invención.

Resultados

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Experimento G (muestras G1 a G5)

Se añadieron niveles diferentes de una mezcla de aldehídos C6 a cinco muestras de una pasta de tomate de 12º Brix, como se detalla en las dos columnas a la izquierda de la tabla siguiente. Esta mezcla consistía en 1200 ppm de Z-3-hexenal, 300 ppm de hexanal y 30 ppm de E-2-hexenal. Se utilizó una muestra de la pasta sola como control.

Para cada muestra, se midieron los atributos aromáticos de "químico" y "seto cortado" mediante un panel sensorial entrenado; los resultados se muestran en la tabla siguiente.

Un atributo químico es una medida del aroma desnaturalizado/químico de un producto de tomate. Un atributo de seto cortado es una medida de la percepción del verdor. Estos atributos se miden cada uno en una escala de 0 a 100, indicando una puntuación de 0 que el aroma en cuestión no se percibía. Una puntuación de 50 indica un nivel muy alto de percepción de un aroma de seto cortado. Una puntuación de 30 indica un nivel muy alto de percepción de un aroma químico.

Resultados

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De los atributos sensoriales, los atributos químico y de seto cortado aumentaron significativamente al aumentar las concentraciones de aldehído, mostrando que los aldehídos son responsables de la impresión verde de los productos de tomate.

Experimento H (muestras H1 a H6)

Se añadieron diferentes niveles de una mezcla de aldehídos C6 y una mezcla de alcoholes C6 a seis muestras de pasta de tomate de 12º Brix, como se detalla en las tres columnas a la izquierda de las tablas siguientes. La mezcla de aldehídos C6 consistía en 1200 ppm de Z-3-hexenal, 300 ppm de hexanal y 30 ppm de E-2-hexenal. La mezcla de alcoholes C6 consistía en 1200 ppm de Z-3-hexenol, 300 pm de hexanol y 30 ppm de E-2-hexenol. La cantidad total de mezcla de aldehídos C6 y mezcla de alcoholes C6 fue de 500 mg por kg de pasta. Se utilizó una muestra de la pasta sola como control.

Para cada muestra, los atributos de aroma de "químico" y "seto cortado" se midieron mediante un panel sensorial entrenado según el experimento G anterior; los resultados se muestran en la siguiente tabla.

Resultados

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Este experimento imita la conversión de aldehídos C6 en alcoholes C6. Las muestras que tenían más alcohol añadido tuvieron puntuaciones similares con respecto a los atributos de seto cortado y químico que el control, mientras que las muestras que tenían más aldehído añadido tuvieron puntuaciones significativamente mayores para estos dos atributos que el control.

Esto muestra que las concentraciones relativas de aldehídos C6 y alcoholes C6 en un producto son importantes para sus atributos sensoriales.

Esto ilustra también que, cuando un producto tiene una concentración de aldehído C6 que se considera demasiado alta porque proporciona la impresión de que es demasiado verde y herboso, la conversión de aldehídos C6 en alcoholes C6 reduce la impresión verde y herbosa y mejora los atributos sensoriales del producto.

Experimento J

Ensayo a escala de banco

Se utilizan ADH de levadura y etanol para la regulación del aldehído C6 y el alcohol C6 en ensayos de procesamiento a escala de banco, en los que se retira el agua mediante ósmosis inversa. Para hacer esto, se lavó la fruta (tomates), se clasificó y se cortó en trozos de aproximadamente 5 x 10 x 10 mm. Se prepararon dos porciones de 70 kg cada una, (1) y (2), siendo la última el control (sin ADH ni etanol añadido). Para cada porción, se ajustó el pH aproximadamente a 5,8 añadiendo una solución de NaOH. Se añadió ADH de tomate a la masa de ensayo (1) en una cantidad de 2 U/g y etanol 60 mM. Se agitó suavemente la mezcla obtenida en una cubeta fría durante 30 minutos. Después de ello, se sometió la masa de tomate a un procedimiento de ruptura en frío, calentando a 65ºC y manteniendo durante 15 minutos. Después de ello, se enfrió la masa de tomate a una temperatura de 35-40ºC, y se filtró a través de un tamiz de 1 mm (refinado). Después de esto, se concentró el producto utilizando ósmosis inversa hasta una concentración de 14º Brix. Se empaquetó el producto en bolsas de 150 g, utilizando vacío y burbujeo de nitrógeno, después de lo cual se congelaron los productos a -18ºC. Después de descongelar, se determinaron las cantidades de aldehídos C6 y alcoholes C6 como en otros ejemplos. El ensayo (2) fue un blanco en el que no se habían añadido ADH ni etanol, por lo demás el procesamiento fue el mismo que para (1) anterior.

Los resultados de las medidas se indica en la tabla siguiente.

Experimento J

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Claims (13)

1. Un procedimiento para manipular el perfil aromático de productos de tomate, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas

a)

añadir una enzima con actividad alcohol deshidrogenasa a una pluralidad de trozos de tomate;

b)

añadir un cofactor de alcohol deshidrogenasa, un donante de electrones o un aceptor de electrones a la pluralidad de los trozos de tomate; e

c)

incubar la pluralidad de trozos de tomate.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, que comprende la etapa de inactivar la enzima con actividad alcohol deshidrogenasa después de la etapa c.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que la enzima con actividad alcohol deshidrogenasa se inactiva utilizando un tratamiento térmico o añadiendo inhibidores.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que después de la etapa c la pluralidad de trozos de tomate comprende de 0,025 a 0,5 ppm de aldehídos C6 y de 0,1 a 10 ppm de alcoholes C6.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cofactor de la alcohol deshidrogenasa está en una forma reducida.

6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el cofactor de la alcohol deshidrogenasa está en una forma oxidada.

7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima con actividad alcohol deshidrogenasa se añade en una cantidad de 0,1 a 1000 unidades por ml de trozos de tomate.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima con actividad alcohol deshidrogenasa tiene como fuente células del grupo constituido por plantas, animales, microorganismos y mezclas de los mismos.

9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cofactor de la alcohol deshidrogenasa se selecciona del grupo constituido por NAD, NADP, FAD y mezclas de los mismos.

10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el aceptor de electrones es un aldehído orgánico.

11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el donante de electrones es un alcohol orgánico.

12. Un producto de tomate obtenible mediante el procedimiento reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

13. Un producto de tomate que comprende de 0,025 a 0,5 ppm de aldehídos C6 y de 0,1 a 10 ppm de alcoholes C6.