ES2227611T3

ES2227611T3 - Uso de heparinas para disminuir repuestas inflamatorias.

Info

Publication number: ES2227611T3
Application number: ES96936052T
Authority: ES
Inventors: D. Clark Bennett; Elizabeth Cauchon; Dominique Fink; Brigette Grouix; Ariane Hsia; Pamela Danagher; Joseph Zimmerman
Original assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Current assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2016-09-27
Also published as: WO1997011684A1; AU7379196A; US7264799B2; EP0852491A4; PT852491E; EP1552846A3; CA2233343A1; EP0852491B1; US20050191288A1; JP3713276B2; DE69633127T2; ATE273020T1; DK0852491T3; US20060140928A1; US20010006635A1; EP1552846A2; JPH11512721A; AU703394B2; EP0852491A1; DE69633127D1

Abstract

LAS ENZIMAS HEPARINASAS PUEDEN UTILIZARSE COMO TRATAMIENTO MEDICO PARA REDUCIR LAS RESPUESTAS INFLAMATORIAS LOCALIZADAS. EL TRATAMIENTO CON HEPARINASA DEL ENDOTELIO ACTIVADO INHIBE EL MOVIMIENTO, LA ADHESION Y LA EXTRAVASACION DE LEUCITOS. LA MAYOR PARTE DE LA HEPARINA Y DEL SULFATO DE HEPARANO SOBRE LAS SUPERFICIES CELULARES DEL ENDOTELIO Y EN MEMBRANAS BASALES SE DEGRADA POR LA EXPOSICION A LA HEPARINASA. ADEMAS, LAS QUIMOCINAS INMOVILIZADAS, QUE ESTAN UNIDAS A LA HEPARINA/SULFATO DE HEPARANO SOBRE EL ENDOTELIO ACTIVADO, SON SOLUBILIZADAS POR LA DIGESTION CON HEPARINASA. LA HEPARINASA PUEDE INFUSIONARSE HACIA EL SISTEMA VASCULAR PARA INHIBIR LA ACUMULACION DE LEUCOCITOS EN UN TEJIDO INFLAMADO Y DISMINUIR LAS LESIONES PROVOCADAS POR INFLAMACIONES LOCALIZADAS. PUEDE LOGRARSE LA ADMINISTRACION DIRIGIDA DE HEPARINASA AL ENDOTELIO ACTIVADO MEDIANTE LA ADMINISTRACION LOCALIZADA Y/O EL USO DE HEPARINASA FORMADA MEDIANTE INGENIERIA GENETICA QUE CONTIENE DOMINIOS DE UNION A LIGANDOS DEL ENDOTELIO.

Description

Uso de heparinasas para disminuir respuestas inflamatorias.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de un enzima heparinasa en la preparación de un medicamento para administración intravascular para disminuir las respuestas inflamatorias de una lesión por isquemia/reperfusión en un tejido de un paciente.

Antecedentes de la invención

Una respuesta inflamatoria es una respuesta local a una lesión celular que está marcada por dilatación de capilares, infiltración de leucocitos, enrojecimiento, calor y dolor y sirve como mecanismo para iniciar la eliminación de agentes nocivos y del tejido dañado.

Una respuesta inflamatoria generalizada dentro de un tejido se produce por el reclutamiento de leucocitos en el tejido. La destrucción de bacterias, materiales extraños y/o células dañadas se produce por medio de fagocitosis y/o desgranulación extracelular (secreción de enzimas de degradación, proteínas antimicrobianas y mieloperoxidasa, que forma superóxidos a partir de H_{2}O_{2} secretado). Aunque la mayoría de las respuestas inflamatorias localizadas son beneficiosas, pueden producirse respuestas inflamatorias perjudiciales. La mayoría de las respuestas inflamatorias perjudiciales también implican la acumulación de leucocitos dentro de un tejido. Esta acumulación ocasiona la destrucción de células y tejidos viables. Además de dañar a los tejidos, estas respuestas son perjudiciales o debilitantes para el individuo que las padece. Los ejemplos de respuestas inflamatorias perjudiciales pueden incluir los siguientes: lesión por isquemia/reperfusión después de infarto de miocardio, choque, apoplejía, trasplante de órganos, cirugía de bypass cardiopulmonar, rechazo de aloinjertos, artritis reumatoide, asma inducida por antígenos, rinitis alérgica y glomerulonefritis (véase la revisión en Harlan, et al., Immunol. Rev., 114:5-12, 1990; Carlos y Harlan, Blood 84:2068-2101, 1994).

El reclutamiento de leucocitos implica una cascada de sucesos celulares, que comienzan con la activación del endotelio vascular por el tejido lesionado o infectado adyacente al endotelio. La activación del endotelio tiene como resultado una mayor adhesión de los leucocitos a las células endoteliales y una migración transendotelial (extravasación) por los leucocitos unidos al interior del tejido lesionado. La activación endotelial se manifiesta por una estimulación a corto plazo, rápida y/o a largo plazo de las células endoteliales.

Ciertos activadores tales como trombina, leucotrienos quimioatrayentes, B_{4}, C_{4} y D_{4} (LTB_{4}, LTC_{4} y LTD_{4}) y la histamina provocan una activación rápida y transitoria (<30 minutos) de las células endoteliales, independiente de la síntesis de proteínas, y pueden aumentar los niveles en la superficie de las células endoteliales de quimioatrayentes tales como el factor activador de plaquetas (PAF; un glicerofosfolípido) y LTB_{4} (mostrado para histamina), y moléculas de adhesión; ICAM-1 (mostrada para trombina) y P-selectina (Zimmerman, et al., J. Cell Biol., 110:529-540, 1990; Sugama, et al., J. Cell Biol. 119:935-944, 1992; McIntyre, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 83:2204-2208, 1986, Lorant, et al., J. Cell Biol., 115:223-234, 1991). Las consecuencias de la rápida activación de las células endoteliales aumenta la adhesión de los leucocitos al endotelio (Hoover et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 81:2191-2194, 1984; Zimmerman, et al., J. Cell Biol., 110:529-540, 1990; Hanahan, et al. Ann. Rev. Biochem., 55:483-509, 1986). Sin embargo, no se ha demostrado que el aumento de los niveles de LTB_{4} en la superficie aumente directamente la migración transendotelial de neutrófilos (Hughes, et al., Prost. Leuk. Essent. F. A., 45:113-119, 1992) y, en ciertas situaciones, no se necesita PAF para la adhesión de leucocitos al endotelio activado (Kuijpers, et al., J. Cell Biol., 117:565-574, 1992).

La activación de células endoteliales a largo plazo (horas de duración) dependiente de la síntesis de proteínas se produce por citoquinas, tales como IL-1b y TNF-a, y por lipopolisacáridos (LPS) y tiene como resultado el mantenimiento de mayores niveles de moléculas de adhesión en la superficie: E-selectina, P-selectina, ICAM-1 y VCAM-1 (revisado por Carlos y Harlan, Blood, 84:2068-2101, 1994). La IL-1b y el TNF-a también aumentan la síntesis de PAF por las células endoteliales (Kuijpers, et al., J. Cell Biol., 117:565-574, 1992). Además, se ha demostrado que la activación de células endoteliales por IL-1b, TNF-a, LPS e histamina aumenta la síntesis y secreción de la quimioquina IL-8 (Strieter, et al., Science, 243:1467-1469, 1989; Jeannin, et al., Blood, 84:2229-2233, 1994).

Se ha demostrado que las quimioquinas IL-8 y MCP-1 se producen por las células endoteliales para que estén presentes en la superficie de dichas células (Huber, et al., Science, 254:99-102, 1991, Springer, Nature, 346:425-434, 1990). Se ha demostrado que la quimioquina MIP-1b está presente en el endotelio de ganglios linfáticos in vivo (Taub, et al., Science, 260:355-359, 1993; Tanaka, et al., Nature, 361:79-82, 1993). Las quimioquinas RANTES, MIP-a, MIP-b, MCP-1 e IL-8 son, todas ellas, proteínas de unión a heparina que, después de secretarse, se unen a la superficie celular y a proteoglicanos de la matriz extracelular que poseen restos de heparina y de heparán sulfato (revisado por Miller, et al., Crit. Rev. Immunol., 12:17-46, 1992).

La heparina y el heparán sulfato son restos de glicosaminoglicanos similares encontrados entremezclados en la mismas cadenas de carbohidrato no ramificadas. Se unen covalentemente a los esqueletos proteicos de proteoglicanos. A pesar de lo que implican estos dos nombres, la heparina está más sulfatada que el heparán sulfato. Los proteoglicanos están presentes en las superficies celulares y en matrices extracelulares (por ejemplo, en la membrana basal del endotelio). Debido a la dificultad para distinguir las zonas de heparina y de heparán sulfato en la misma cadena de carbohidrato, existen pocos datos sobre la preferencia de unión de las quimioquinas a los restos de heparina o de heparán sulfato. Hay alguna indicación de que las quimioquinas IL-8 y GRO se unen con mayor afinidad al heparán sulfato que a la heparina, y de que PFA y NAP-2 se unen con mayor afinidad a restos de heparina (Witt, y Lander, Curr. Biol., 4:394-400, 1994). En general, las quimioquinas se denominan proteínas de unión a heparina. Se ha demostrado que las regiones C-terminales de las quimioquinas IL-8, PF4, MCP-1 y NAP-2 forman una hélice-a, y que se unen a heparina/heparán sulfato (Webb, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 90:7158-7162, 1993; Zucker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 86:7571-7574, 1989; Matsushima, et al., en Interleukins, Molec. Biol. Immunol., ed. Kistimoto, Karger, Basilea, 236-265, 1992). Probablemente, ésta sea una estructura común para todas las quimioquinas.

Todas las moléculas mencionadas anteriormente, que se expresan por células endoteliales activadas (PAF, LTB_{4}, selectinas, CAM y quimioquinas) están presentes en la superficie de las células endoteliales y se localizan en el endotelio vascular adyacente a los sitios de tejido lesionado. Los leucocitos transportados por la sangre que interaccionan con estas moléculas también se localizarán en su unión en zona del tejido lesionado. El resultado de la activación a largo plazo del endotelio es una mayor adhesión y extravasación de leucocitos y una acumulación localizada significativa de leucocitos en el tejido adyacente, que no puede producirse durante la activación a corto plazo (Ebisawa, et al., J. Immunol., 149:4021-4028, 1992; Huber, y Weiss, J. Clin. Invest., 83:1122-1129, 1989; Oppenheimer-Marks, et al., J. Immunol., 145:140-148, 1990).

Se cree que la adhesión de leucocitos al endotelio es un proceso de dos etapas (revisado por Carlos, y Harlan, Blood, 84:2068-2101, 1994). Inicialmente, los leucocitos ruedan a lo largo de la superficie de los vasos sanguíneos. El aumento del rodamiento inicialmente está mediado en el endotelio vascular (en los primeros 30 minutos) por interacciones entre estructuras Sialyl Lewisx sobre la superficie de los leucocitos y P-selectina y E-selectina, que están aumentadas en las células endoteliales activadas (Ley, et al., Blood, 85:3727-3735, 1995). El aumento del rodamiento también está mediado (después de 40 minutos) por interacciones entre la L-selectina presente en las membranas celulares de leucocitos y en moléculas parecidas a la heparina presentes en el endotelio vascular, que son inducibles por citoquinas (Karin et al., Science 261:480-483, 1993), o entre la L-selectina presente en linfocitos y las adresinas vasculares GlyCAM-1, CD34 y MAdCAM-1 en vénulas de endotelio alto (HEV) de tejido linfoide. La segunda etapa, la adhesión firme de los leucocitos a las células endoteliales, se basa en interacciones entre integrinas de leucocitos (por ejemplo LFA-1, Mac-1, VLA-4) y moléculas de adhesión de las células endoteliales (CAM, por ejemplo ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, MAdCAM-1). Los leucocitos se aplanan sobre la superficie endotelial y retiran la L-selectina, simultáneamente con la firme adhesión (Kishimoto, et al., Science, 245:1238-1242, 1989; Jutila, et al., J. Immunol., 143:3318-3324, 1989; Smith, et al., Clin. Invest., 87:609-618, 1991).

Los niveles de selectina y CAM aumentan en la superficie del endotelio en respuesta a muchas citoquinas y quimioatrayentes. Estos aumentos dependen de la síntesis y/o secreción de moléculas de selectina y CAM adicionales sobre la superficie celular. Por el contrario, se ha demostrado que la activación de los leucocitos para una adhesión firme tiene lugar en segundos (Bargatze, et al., J. Exp. Med., 178:367-373, 1993), por medio de un aumento de la secreción de integrinas y, lo que es más importante, por medio de la inducción de cambios conformacionales en las integrinas de la superficie celular (activación de integrinas), que permite la unión fuerte de las integrinas a CAM (revisado en Zimmerman, Immunol. Today, 13:93-99, 1992).

El PAF y la E-selectina pueden activar integrinas para la adhesión de células endoteliales (Lorant et al., J. Biol. Chem. 115:223-234, 1991; Lo, J. Exp. Med., 173:1493-1500, 1991). Se ha demostrado que para la unión de células T CD8+ a moléculas VCAM-1 inmovilizadas se requiere la presencia de MIP-1b, inmovilizado por unión a CD44 (que posee restos heparina/heparán sulfato), o un conjugado de heparina-BSA. Se demostró que esta unión estaba bloqueada por un anticuerpo contra VLA-4, lo que indica que MIP-1b activa VLA-4 sobre la superficie de las células T (Tanaka, et al., Nature, 361:79-82, 1993). Se ha demostrado que se produce un aumento en el nivel de la integrina CD18 (parte de Mac-1) en la superficie de neutrófilos cuando los neutrófilos entran en contacto con el endotelio que se ha estimulado con IL-1b. Un anticuerpo contra IL-8 inhibía la regulación positiva de CD18 y también inhibía la adhesión de los neutrófilos (Huber, Science, 254:99-102, 1991). Por lo tanto, las quimioquinas pueden actuar como activadores directos de la adhesión de leucocitos. Por el contrario, Luscinaskas et al. (J. Immunol., 149:2163-2171, 1992) han demostrado que el pretratamiento de neutrófilos con IL-8 inhibe la unión de los neutrófilos, y que la adición de IL-8 exógeno separaba los neutrófilos que se adherían a las células endoteliales activadas. Rot (Immunol. Today, 13:291-294, 1992) ha reconciliado estos resultados contradictorios proponiendo que la IL-8 unida a la superficie de las células endoteliales promueve la adhesión, mientras que la IL-8 soluble puede inhibirla.

Las diferentes quimioquinas activan diferentes leucocitos. La IL-8 activa neutrófilos, eosinófilos y células T. RANTES activa monocitos, eosinófilos y células T. MCP-1 activa monocitos. MIP-1a activa células T CD4+, monocitos y células B, mientras que MIP-1b activa monocitos y células T CD8+ (revisado en Lasky, Current Biol., 3:366-378, 1993). Se está considerando que las diferentes combinaciones de selectinas, integrinas, CAM y quimioquinas seleccionan la adhesión y migración de los subtipos de leucocitos observados en los diferentes tejidos inflamados (Butcher, Cell, 67:1033-1039, 1991).

La importancia de las interacciones de integrinas, CD11/CD18 (Mac-1) e ICAM en la adhesión y extravasación de leucocitos se ha demostrado en numerosos sistemas usando anticuerpos contra estas moléculas. Los anticuerpos interfieren con la función de las moléculas de adhesión y bloquean o reducen el reclutamiento de leucocitos. El síndrome de deficiencia de adhesión leucocitaria (LAD) de tipo I produce una ausencia parcial o total de la integrina CD18 en los leucocitos de los pacientes afectados. El reclutamiento de neutrófilos en los sitios de inflamación es insignificante. Sin embargo, el reclutamiento de monocitos y eosinófilos es normal, lo que indica que un conjunto alternativo de moléculas de adhesión pueden funcionar para reclutar estas células, quizás VLA-4 y VCAM-1 (Harlan, Clin. Immunol. Immunopath., 67:S16-S24, 1993). Los neutrófilos no expresan VLA-4 (Winn y Harlan, J. Clin. Invest., 92:1168-1174, 1993). Como se ha mencionado anteriormente, las quimioquinas son importantes para la activación y para el aumento de los niveles en superficie de integrinas VLA-1 y CD18 en leucocitos. Se ha demostrado que la IL-8 inmovilizada sobre un filtro de policarbonato es adecuada para dirigir la migración de neutrófilos a través del filtro (Rot, Immunol. Today, 13:291-294). Huber, et al. (Science, 254:99-102, 1991) han demostrado que se necesita un gradiente transendotelial de IL-8 unida, producido por monocapas de células endoteliales estimuladas por IL-1b, para la extravasación de neutrófilos. Estos neutrófilos se pre-activaron con IL-8 y se unieron a las células endoteliales, pero no migraron hasta que estuvo presente el gradiente de IL-8. Este gradiente se extendió desde la superficie luminal de las células endoteliales a través de la membrana basal subyacente a la monocapa de células endoteliales. El lavado de la IL-8 unida de la membrana basal subyacente a las células endoteliales activadas previno la migración a través de la monocapa. Además, un anticuerpo contra la IL-8 inhibió el 70-80% de la migración de los neutrófilos. Kuijpers et al. (J. Cell Biol., 117:565-572, 1992) usaron un anticuerpo anti-IL-8 para producir una reducción del 60% en la migración de neutrófilos a través de endotelio activado por IL-1b y TNF-a, y la adición de un antagonista del receptor de PAF produjo una reducción del 85-90% en la migración. Estos resultados están en contraste con los experimentos que demostraron que los neutrófilos pretratados con IL-8 tenían inhibida su capacidad para migrar a través de una monocapa de células endoteliales activadas (Luscinaskas et al., J. Immunol., 149:2163-1271, 1992). De esta manera, es probable que las quimioquinas no sólo activen los leucocitos para la adhesión, sino que en la extravasación de leucocitos es importante un gradiente de quimioquinas unidas. La presencia de quimioquina soluble puede interferir con la adhesión y la migración a lo largo de un gradiente de quimioquinas unidas. Como se analiza a continuación, los aumentos de concentración localizados in vivo en quimioquinas solubles se minimizarían por el flujo sanguíneo.

Una vez que los leucocitos activados han empezado a acumularse en el interior de un tejido lesionado, pueden aumentar la acumulación de más leucocitos por síntesis y secreción de citoquinas, quimioquinas y LTB_{4}. Se ha demostrado que los LPS aumentan directamente la expresión de IL-1b de monocitos (Porat, et al., FASEB J., 6:2482-2489, 1992). La IL-8, la IL-1b y el TNF-a se producen por neutrófilos activados con GM-CSF, otra citoquina producida por macrófagos activados, endotelio y células T (McCain, et al., Am. J. Respir. Cell Molec. Biol., 8:28-34, 1993; Lindemann, et al., J. Immunol. 140:837-839, 1988; Lindemann, et al., J. Clin. Invest., 83:1308-1312, 1989). Se ha demostrado que la IL-1b y el TNF-a estimulan los monocitos, aumentando de esta manera la expresión de las quimioquinas, IL-8 y MIP-1a (Lukacs, et al., Blood, 82:3668-3674, 1993). Se ha demostrado que los neutrófilos activados y los monocitos son una fuente principal de producción de LTB_{4} (Samuelsson, et al., Science, 237:1171-1176, 1987; Brach, et al., Eur. J. Immunol, 22:2705-2711, 1992). Como se ha analizado anteriormente, el LTB_{4} no está implicado directamente en el reclutamiento adicional de leucocitos, pero como los neutrófilos estimulados con LTB_{4} producen IL-8, los neutrófilos estimulados con LTB_{4} pueden promover el reclutamiento adicional de neutrófilos, indirectamente, por medio de la formación de un gradiente de IL-8 (McCain, et al., Am. J. Respir. Cell Molec Biol., 10:651-657, 1994). El reclutamiento continuado de leucocitos por estos activadores derivados de leucocitos requeriría el uso del endotelio vascular como intermedio. Las células endoteliales y las membranas basales se unirían y presentarían quimioquinas derivadas de neutrófilos, formando un gradiente, o las citoquinas derivadas de leucocitos activarían el endotelio, lo que también originaría la creación de un gradiente de quimioquinas.

El flujo sanguíneo del sistema vascular prevendría el aumento de concentración localizado de factores de activación solubles (citoquinas, quimioquinas y quimioatrayentes), producido por una respuesta inflamatoria localiza en el tejido. Si una inflamación local está produciendo altas concentraciones en sangre de activadores, podría tener lugar una activación sistémica de leucocitos (Finn, et al., J. Thorac. J. Surg., 105:234-241, 1993). Los leucocitos activados después podrían unirse transitoriamente al endotelio inactivado y/o desgranulado, produciendo sepsis (Sawyer, et al., Rev. Infect. Dis., 11:S1532-1544, 1989). En las situaciones en las que algunos de los leucocitos transportados por la sangre se activan por una inflamación localizada (no todos los leucocitos activados se extravasan), los leucocitos activados producirían y secretarían citoquinas, quimioquinas y LTB_{4} adicionales a la sangre. Este aumento de la concentración de activador podría regular positivamente las células inactivadas y amplificar la respuesta sistémica.

Aunque se ha proporcionado el mecanismo de las respuestas inflamatorias con algún detalle, sigue existiendo la necesidad de medios eficaces para reducir o prevenir las respuestas inflamatorias localizadas que surgen de una lesión de isquemia/reperfusión en el tejido de un paciente.

Sumario de la invención

Esta invención se refiere al descubrimiento de que pueden usarse enzimas que degradan heparinasa, por separado o en combinación, para reducir la respuesta inflamatoria localizada. De esta manera, la presente invención proporciona el uso de un enzima heparinasa en la preparación de un medicamento para administración intravascular para disminuir respuestas inflamatorias localizadas debidas a una lesión por isquemia/reperfusión en el tejido de un paciente.

Las heparinasas útiles en esta invención pueden proceder de diversas fuentes: heparinasas I, II y III de la bacteria Gram negativa Flavobacterium heparinum, heparinasa de cepas de Bacteroides, heparinasa de Flavobacterium Hp206, heparinasa de especies de Cytophagia, y heparinasas de células de mamífero. Estos enzimas, en solitario o en combinación, se denominan en este documento heparinasa o enzima heparinasa. La heparinasa puede sobreexpresarse a partir de una secuencia de nucleótidos recombinante en Flavobacterium heparinum o Escherichia coli. La heparinasa puede ser heparinasa III. La lesión por isquemia/reperfusión puede ser infarto de miocardio, apoplejía, trasplante de órganos, choque o cirugía de bypass cardiopulmonar.

Por medio de la administración de heparinasa se degradan restos de heparina y heparán sulfato sobre la superficie de células endoteliales y de las membranas basales. La eliminación de restos de heparina y de heparán sulfato de proteoglicanos regulados positivamente en células endoteliales activadas previene la interacción de la L-selectina, encontrada en leucocitos, con los proteoglicanos. Al reducirse las interacciones L-selectina-proteoglicano puede inhibirse el rodamiento de los leucocitos sobre el endotelio activado.

Además, cuando se retiran restos de heparina y de heparán sulfato de la superficie de células endoteliales activadas y de su membrana basal, se liberan quimioquinas, que están unidas a la heparina y al heparán sulfato, de las superficies celulares y de la membrana basal. La pérdida de quimioquinas unidas disminuye la concentración localizada de quimioquinas y altera el gradiente de quimioquinas producido por el endotelio activado, inhibiendo de esta manera la activación por quimioquinas de los leucocitos rodantes, que es necesaria para una adhesión firme, e impidiendo la extravasación de leucocitos a lo largo del gradiente de quimioquinas. Mediante esta invención, la disminución del rodamiento de los leucocitos, la activación y la extravasación pueden inhibir las respuestas inflamatorias en tejidos localizadas interfiriendo con los mecanismos fundamentales de reclutamiento de leucocitos.

El enzima heparinasa puede dirigirse a tipos celulares, tejidos u órganos específicos por el método de administración seleccionado, que suministra altas concentraciones localizadas de los enzimas o limita físicamente la dispersión de los enzimas. Adicionalmente, de acuerdo con esta invención, la heparinasa puede dirigirse por fusión de los enzimas a dominios de unión de anticuerpos; factores de crecimiento o moléculas de adhesión. Las proteínas de fusión se producen por construcción y expresión de fusiones génicas en organismos recombinantes. Como ejemplos, los dominios de unión pueden reconocer moléculas de la superficie celular en el endotelio activado (por ejemplo, ICAM-1, VCAM-1, P-selectina y E-selectina), o en subtipos de células endoteliales (por ejemplo, GlyCAM-1). Los enzimas de fusión dirigidos pueden aumentar el número y especificidad de indicaciones, mientras se reducen las cantidades de enzima necesarias en relación con la eficacia y los posibles efectos secundarios resultantes de los tratamientos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico del recuento de 35S-heparina/heparán sulfato liberado de la superficie de células endoteliales por 1,0 IU/ml de heparinasa III, que se separaron de acuerdo con el tamaño en una columna de exclusión molecular. Los rombos indican el recuento liberado por una digestión de 5 minutos, los cuadrados indican el recuento liberado por una digestión de 30 minutos y los triángulos indican el recuento liberado por una digestión de 60 minutos. De las fracciones derivadas de la digestión de la heparinasa III se ha restado el recuento de fondo de la fraccionación de las digestiones simuladas.

Las figuras 2A y 2B son gráficos del porcentaje de heparina/heparán sulfato presente en la línea de células endoteliales humana no activada (2A) y activada por IL-1b (2B) en los tiempos indicados después del tratamiento con 0,1 IU/ml de heparinasa I, II o III durante 1 hora. Se usó la unión de 125I-bFGF a la heparina de la superficie celular para determinar la cantidad de heparina/heparán sulfato presente. Los resultados para las células tratadas con heparinasa I, II o III se indican por rombos, cuadrados o triángulos, respectivamente. Las líneas verticales indican el error típico de las medias.

Las figuras 3A y 3B son gráficos del porcentaje de heparina/heparán sulfato presente en la línea de células endoteliales humana no activada (3A) y activada por IL-1b (3B) en los tiempos indicados después del tratamiento con 1,0 IU/ml de heparinasa I. Se usó la unión de 125I-bFGF a la heparina de la superficie celular para determinar la cantidad de heparina/heparán sulfato presente. Los resultados para células tratadas durante 1, 3 o 5 horas se indican mediante rombos, cuadrados o triángulos, respectivamente. Las líneas verticales indican el error típico de las medias.

Las figuras 4A y 4B son gráficos del porcentaje de heparina/heparán sulfato presente en la línea de células endoteliales humana no activada (4A) y activada por IL-1b (4B) en los tiempos indicados después del tratamiento con 1,0 IU/ml de heparinasa III. Se usó la unión de 125I-bFGF a heparina de la superficie celular para determinar la cantidad de heparina/heparán sulfato presente. Los resultados para las células tratadas durante 1, 3 o 5 horas se indican mediante rombos, cuadrados o triángulos, respectivamente. Las líneas verticales indican el error típico de las medias.

La figura 5 contiene gráficos que representan los niveles de IL-8 liberada de capas de células endoteliales humanas activadas por IL-1b por tratamiento con 1,0 IU/ml de heparinasas; I (5A), II (5B), I+III (barras que contienen líneas diagonales; 5B), y III (5C). Las barras representan el porcentaje de diferencia en la concentración de IL-8 encontrada en los sobrenadantes de capas endoteliales activadas tratadas con heparinasas, frente a los sobrenadantes no tratados de capas endoteliales activadas (que sólo contienen la IL-8 secretada). Los errores típicos para estas diferencias de porcentajes se indican por líneas verticales. Las líneas superpuestas en las barras indican la concentración de IL-8 en los sobrenadantes de capas de células tratadas con heparinasa. Los errores típicos de estas medidas también se indican por líneas verticales (no siempre visibles).

La figura 6 es un gráfico del nivel de adhesión de neutrófilos a células endoteliales, que estaban inactivadas, activadas por IL-1b, o tratadas con 0,1 IU/ml de heparinasas I, II o III después de activación por IL-1b. El nivel de adhesión se expresa como el porcentaje de neutrófilos añadidos, que se están adhiriendo.

Las figuras 7A, 7B y 7C son gráficos del porcentaje de inhibición de la extravasación de neutrófilos a través de capas de células endoteliales activadas por IL-1b, que se trataron con heparinasas I, II o III, respectivamente. Las barras que contienen líneas diagonales representan los resultados de tratamientos de una hora con 1,0 IU/ml de heparinasa. Las barras blancas representan los resultados de tratamientos de una hora con 0,1 IU/ml de heparinasa. Las barras negras representan los resultados de tratamientos de 15 minutos con 0,1 IU/ml de heparinasa I o III, y la barra que contiene líneas verticales representa los resultados de tratamientos de 15 minutos con 1,0 IU/ml de heparinasa II. Las desviaciones típicas para los porcentajes de inhibición se indican por líneas verticales. Los pequeños asteriscos indican resultados de tratamientos de una hora que fueron significativamente diferentes de los resultados de los tratamientos de 15 minutos con la misma heparinasa (P<0,05). Los asteriscos grandes indican los resultados de los tratamientos de una hora con 1,0 IU/ml de heparinasa que fueron significativamente diferentes de los resultados de los tratamientos de una hora con 0,1 IU/ml de la misma heparinasa. Los números entre paréntesis debajo de las barras indican el número de experimentos incluidos en cada conjunto de datos.

La figura 8 es un gráfico que muestra la actividad de heparinasa humana (b-tromboglobulina) sobre la ECM (matriz extracelular) a pH 5,8 y 7. Las barras sólidas representan el porcentaje de diferencia de ^{35}SO_{4} liberado a partir de ECM tratada con 1 \mug de heparinasa humana frente al liberado de ECM sin tratar. Las barras que contienen líneas diagonales representan la diferencia en porcentaje de ^{35}SO_{4} liberado a partir de ECM tratada con 5 \mug de heparinasa humana frente al liberado de ECM sin tratar. La desviación típica de las medias se indica mediante líneas verticales.

La figura 9 es un gráfico que representa el cambio en el nivel de extravasación de neutrófilos sobre la activación de capas de HUVEC con IL-1b, y después del tratamiento de capas de HUVEC activadas con heparinasa humana (hhep). La desviación típica de las medias se indica por líneas verticales.

La figura 10 es un gráfico de concentraciones de heparinasa III en plasma de rata durante un periodo de infusión de cinco horas. Los puntos de tiempo en el protocolo se indican por las flechas, con descripciones encima de las flechas. Las líneas verticales indican el error típico de las medias.

La figura 11 es un gráfico del nivel de rodamiento de leucocitos en la microvasculatura de la rata después de tres horas de isquemia, durante la reperfusión. Los círculos indican los niveles en ratas sin tratamiento previo, los cuadrados indican los niveles en ratas con tratamiento simulado que experimentaron isquemia y los triángulos indican los niveles en ratas tratadas con heparinasa que experimentaron isquemia. Las líneas verticales indican el error típico de las medias.

La figura 12 es un gráfico del nivel de adhesión de leucocitos en la microvasculatura de la rata después de 3 horas de isquemia, durante la reperfusión. Los círculos indican los niveles en ratas sin tratamiento previo, los cuadrados indican los niveles en ratas con tratamiento simulado que experimentaron isquemia, y los triángulos indican los niveles en ratas tratadas con heparinasa que experimentaron isquemia. Las líneas verticales indican el error típico de las medias.

La figura 13 es un gráfico del nivel de extravasación de leucocitos en la microvasculatura de la rata después de 3 horas de isquemia, durante la reperfusión. Los círculos indican los niveles en ratas tratadas con heparinasa que experimentaron isquemia. Las líneas verticales indican el error típico de las medias.

La figura 14 es un gráfico del nivel de extravasación de leucocitos en la microvasculatura de la rata después de 2 horas de isquemia, durante la reperfusión. Las barras blancas son la diferencia en porcentaje en los niveles en ratas con tratamiento simulado frente a los niveles en ratas sin tratamiento previo. Las barras que contienen líneas diagonales son la diferencia en porcentaje en los niveles en ratas tratadas con heparinasa frente a los niveles en ratas sin tratamiento previo. Las líneas verticales indican el error típico de las medias.

La figura 15 es un gráfico del nivel de perfusión en vénulas postcapilares de ratas después de 3 horas de isquemia, durante la reperfusión. Los círculos indican los niveles en ratas sin tratamiento previo, los cuadrados indican los niveles en ratas con tratamiento simulado que experimentaron isquemia y los triángulos indican los niveles en ratas tratadas con heparinasa que padecieron isquemia. Las líneas verticales indican el error típico de las medias.

La figura 16 es un gráfico del producto de ritmo cardíaco-presión sanguínea para conejos durante la isquemia y reperfusión con o sin tratamiento con heparinasa. Los círculos y cuadrados blancos son datos para ratas pretratadas con solución salina y ratas tratadas por reperfusión, respectivamente. Las pirámides blancas y los círculos negros son datos para conejos pretratados con heparinasa y tratados por reperfusión, respectivamente (niveles en plasma diana para heparinasa III 25 \mug/ml). Los cuadrados, pirámides y rombos negros son datos para conejos tratados por reperfusión con heparinasa con niveles diana en plasma de heparinasa III de 5, 1,25 y 0,25 \mug/ml, respectivamente. BASE indica los niveles iniciales. 30I indica el nivel a los 30 minutos de isquemia, 30R, 60R, 120R y 180R indica los niveles a los 30, 60, 120 y 180 minutos de reperfusión. Las líneas verticales indican la desviación típica de las medias.

La figura 17 es un gráfico del porcentaje del tamaño de infarto frente a la zona de riesgo después de isquemia y reperfusión en corazones de conejos, que se sometieron a diferentes tratamientos con heparinasa. Los círculos negros indican los niveles medios para cada grupo de tratamiento. Las formas blancas indican los niveles para conejos individuales. CPT y CRT indican conejos pretratados con solución salina y tratados por reperfusión, respectivamente. DPT y DRT indican conejos pretratados con heparinasa y tratados por reperfusión, respectivamente. Los números debajo de DPT y DRT indican el nivel diana de heparinasa III en el plasma (en \mug/ml). Las líneas verticales indican la desviación típica de las medias.

La figura 18 es un gráfico de la concentración de heparinasa III que se infundió a los conejos tratados con heparinasa (en IU/ml). DPT y DRT indican conejos pretratados con heparinasa y tratados por reperfusión, respectivamente. Los números debajo de DPT y DRT indican el nivel diana de heparinasa III en el plasma (en \mug/ml). Con indica conejos de control en los que se ha infundido solución salina. Las líneas verticales indican la desviación típica de las medias.

La figura 19 es un gráfico de las concentraciones de heparinasa III medidas en el plasma de conejo durante el pretratamiento y reperfusión. Los círculos indican las concentraciones reales medidas en conejos pretratados con heparinasa en los que se pretendían conseguir concentraciones diana en plasma de 25 \mug/ml de heparinasa III. Los cuadrados, pirámides, triángulos y rombos indican las concentraciones reales medidas en conejos tratados por reperfusión con heparinasa en los que se pretendían conseguir concentraciones diana en plasma de 25, 5, 1,25 y 0,25 \mug/ml de heparinasa III, respectivamente. BASE indica concentraciones iniciales. 30P y 60P indican concentraciones a los 30 y 60 minutos de pretratamiento. 15R, 30R, 60R, 120R y 180R indican concentraciones a los 15, 30, 60, 120 y 180 minutos de reperfusión, respectivamente. Las líneas verticales indican la desviación típica de las medias.

Descripción detallada de la invención

Las interacciones entre leucocitos y endotelio son críticas para el progreso de respuestas inflamatorias localizadas. Estas interacciones críticas incluyen contactos funcionales entre quimioquinas unidas al endotelio y receptores de quimioquinas de leucocitos, y entre la L-selectina de leucocitos y proteoglicanos de heparina/heparán sulfato en el endotelio. Esta invención se basa en el descubrimiento y se refiere al uso del enzima heparinasa y la proteína de fusión de heparinasa para disminuir las interacciones leucocito-quimioquina y leucocito-proteoglicano de células endoteliales y, por lo tanto, inhibir la inflamación localizada.

La heparina y el heparán sulfato son restos de glicosaminoglicano de proteoglicanos localizados en la superficie de muchos tipos de células diferentes y también encontrados en las matrices extracelulares producidas por muchas células. Las células endoteliales producen matrices extracelulares, principalmente en su lado abluminal, denominadas membrana basal. Las células endoteliales activadas por ciertas citoquinas o por otros estimuladores de respuesta inflamatoria, aumentan sus niveles en superficie de proteoglicanos de heparina y heparán sulfato (excluyendo las vénulas de alto endotelio), que actúan como moléculas de adhesión inflamatoria, e interaccionan con L-selectina en los leucocitos rodantes. Esta interacción aumenta los contactos de leucocitos con el endotelio (aumento del rodamiento de leucocitos), que son necesarios para etapas posteriores del reclutamiento de leucocitos. El endotelio activado también aumenta su síntesis y secreción de quimioquinas. La secreción de quimioquinas a su vez aumenta la concentración localizada de las mismas quimioquinas, porque las quimioquinas se unen a los restos de heparina y heparán sulfato de proteoglicanos en las superficies de las células endoteliales y en las membranas basales. Este gradiente de concentración localizada es necesario para la activación de leucocitos para la adhesión firme y la extravasación y tiene como resultado el reclutamiento de leucocitos en sitios inflamatorios.

Se han descubierto enzimas heparinasas en microorganismos incluyendo Flavobacterium heparinum (Lohse y Linhardt, J. Biol. Chem. 267:2437-24355, 1992), cepas de Bacteroides (Saylers, et al., Appl. Environ. Microbiol, 33:319-322, 1977; Nakamura, et al., J. Clin. Microbiol. 26:1070-1071, 1988), Flavobacterium Hp206 (Yoshida, et al., 10º Annual Symposium of Glycoconjugates, Jerusalen 1989) y especies de Cytophagia (Bohn, et al., Drug Res. 41(I), Nr. 4:456-460, 1991). También se han descrito heparinasas procedentes de células de mamíferos (Fuks, et al., Patente de Estados Unidos número 5.362.641, 1994; Hoogewerf et al., J. Biol. Chem. 270:3268-3277, 1995). Las heparinasas de Flavobacterium heparinum, heparinasa I (EC 4.2.2.7), y heparinasa II degradan la heparina, mientras que la heparinasa II también degrada el heparán sulfato, así como la heparinasa III (EC 4.2.2.8). Los productos de la digestión completa por estos enzimas principalmente son disacáridos, aunque pueden persistir pequeñas cantidades de tetrasacáridos y oligosacáridos. Estos enzimas pueden usarse para retirar glicosaminoglicanos, heparina y heparán sulfato de la superficie celular y de la membrana basal.

La eliminación de heparina y heparán sulfato de las células endoteliales interfiere con las interacciones de la L-selectina con el endotelio, evitando el aumento del rodamiento de los leucocitos. La eliminación de glicosaminoglicanos de las células endoteliales y de las membranas basales también retira las quimioquinas unidas a glicosaminoglicanos, que son críticas para el reclutamiento de los leucocitos. La pérdida de quimioquinas unidas a células endoteliales disminuye la activación de integrinas de leucocitos e inhibe la adhesión firme por los leucocitos. También inhibe la extravasación de leucocitos, porque los leucocitos requieren la presencia de un gradiente unido de quimioquina para la transmigración. Se cree, sin que esta creencia suponga una limitación, que la concentración de quimioatrayentes no unidos se reduce de la capa de endotelio por el flujo sanguíneo, evitando la formación de un gradiente quimioatrayentes solubles significativo.

Generalmente, después de una hora de tratamiento con heparinasa, el 50% de la heparina y el heparán sulfato de la superficie celular digerida y membrana basal digeridas se reemplaza en 2 a 4 horas, y se reemplazan completamente en 12 a 16 horas. Los tiempos de tratamiento mayores (3 y 5 horas) aumentan en gran medida el tiempo necesario para reemplazar la misma cantidad de heparina/heparán sulfato. Las respuestas inflamatorias se disminuirían significativamente por una velocidad lenta de reemplazo de la heparina/heparán sulfato de la superficie celular. La administración apropiada de heparinasa podría aumentar la duración de la respuesta inflamatoria disminuida.

preparación de heparinasa

Las heparinasas individuales o una combinación de las mismas, que pueden usarse en esta invención, pueden prepararse a partir de diversas fuentes. La heparinasa puede prepararse por aislamiento a partir de células bacterianas o de mamífero, ya sean células que producen el enzima de manera natural o que se han modificado por ingeniería genética para producir el enzima como se describe por métodos conocidos. Además, pueden aislarse heparinasas de mamífero de células humanas de acuerdo con los procedimientos de purificación descritos por Fuks, et al. (documento U.S. 5.362.641, 1994).

Aislamiento de heparinasas de Flavobacterium heparinum

Los enzimas heparinasas pueden purificarse a partir de cultivos de Flavobacterium heparinum de la siguiente manera. Se cultiva F. heparinum en fermentadores de 15 l controlados por ordenador, en una variación de medio nutriente definido descrito por Galliher et al., Appl. Environ. Microbiol 41(2): 360-365, 1981. Para las fermentaciones diseñadas para producir heparin liasas, se incluye heparina semi-purificada (Celsus Laboratories) en el medio a una concentración de 1,0 g/l como inductor de la síntesis de heparinasa. Las células se recogen por centrifugación y los enzimas deseados se liberan del espacio periplásmico por una variación del procedimiento de choque osmótico descrito por la Patente de Estados Unidos Nº 5.169.772 de Zimmermann, et al. (1992).

Las proteínas del osmolato bruto se adsorben en una resina de intercambio catiónico (CBX, J.T. Baker) a una conductividad entre uno y siete mhos. Las proteínas no unidas del extracto se desechan y la resina se introduce en una columna cromatográfica (50 cm de diámetro interno x 100 cm). Las proteínas unidas eluyen a un caudal lineal de 3,75 cm\cdotmin-1 con gradientes de etapas de fosfato 0,01 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,1 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,25 M y fosfato 0,01 M/cloruro sódico 1,0 M, todos a pH 7,0 \pm 0,1. La heparinasa II eluye en la fracción de NaCl 0,1 M, mientras que las heparinasas I y III eluyen en la fracción de 0,25 M. Como alternativa, la etapa de cloruro sódico 0,1 M se elimina y las tres heparinasas co-eluyen con el cloruro sódico 0,25 M. Las fracciones de heparinasa se cargan directamente en una columna que contiene cellufine sulfato (5,0 cm de diámetro interno x 30 cm, Amicon) y se eluyen con un caudal lineal de 2,50 cm\cdotmin-1 con gradientes por etapas de fosfato 0,01 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,2 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,4 M y fosfato 0,01 M/cloruro sódico 1,0 M, todos a pH 7,0 \pm 0,1. Las heparinasas II y III eluyen en la fracción de cloruro sódico 0,2 M, mientras que la heparinasa I eluye en la fracción 0,4 M. La fracción de cloruro sódico 0,2 M de la columna de cellufine sulfato se diluye con fosfato sódico 0,01 M para dar una conductancia menor que 5 mhos. La solución se purifica adicionalmente cargando el material en una columna de hidroxilapatita (2,6 cm de diámetro interno x 20 cm) y eluyendo la proteína unida a un caudal lineal de 1,0 cm\cdotmin-1 con gradientes por etapas de fosfato 0,01 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,35 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,45 M, fosfato 0,01 M/cloruro sódico 0,65 M y fosfato 0,01 M/cloruro sódico 1,0 M, todos a pH 7,0 \pm 0,1. La heparinasa II eluye como un solo pico de proteína en la fracción de cloruro sódico 0,45 M, mientras que la heparinasa III eluye en un solo pico de proteína en la fracción de cloruro sódico 0,65 M. La heparinasa I se purifica adicionalmente cargando el material de la columna de cellufine sulfato, diluido a una conductividad menor que 5 mhos, en una columna de hidroxilapatita (2,6 cm de diámetro interno x 20 cm) y eluyendo la proteína unida a un caudal lineal de 1,0 cm\cdotmin-1 con un gradiente lineal de fosfato (de 0,01 a 0,25 M) y cloruro sódico (de 0,0 a 0,5 M). La heparinasa I eluye en un sólo pico de proteína aproximadamente a la mitad del gradiente.

Los enzimas heparinasas obtenidos por este método tienen una pureza mayor del 98,5% según se estima por análisis de HPLC de fase inversa (BioCad, POROS II). Los resultados de purificación para los enzimas heparinasas se muestran en la tabla A.

TABLA A Purificación de enzimas heparinasas a partir de fermentaciones de Flavobacterium heparinum

muestra	actividad (IU)	actividad específica (IU/mg)	rendimiento (%)
Fermentación
Degradación de heparina	94.500		100
Degradación de heparán sulfato
	75.400	ND	100
Osmolato
Degradación de heparina	52.100		55
Degradación de heparán sulfato
	42.000	ND	56
Intercambio catiónico
Degradación de heparina	22.600		24
Degradación de heparán sulfato	27.540	ND	37
Cellufine sulfato
Degradación de heparina	19.200		20
Degradación de heparán sulfato
	9.328	30,8	12
Hidroxilapatita
Heparinasa 1	16.300	115,3	17
Heparinasa 2	2.049	28,4	3
Heparinasa 3	5.150	44,5	7

Aislamiento de enzimas recombinantes

También pueden aislarse enzimas de degradación de glicosaminoglicanos a partir de sistemas de expresión recombinantes tales como el sistema de expresión de heparinasa I descrito por Sasisekharan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:8660-8664, 1993; y los sistemas de expresión de heparinasa II y III descritos en el documento WO 95/34635. En estos sistemas de expresión, los genes de F. heparinum se aislan y clonan en plásmidos cadena abajo de un promotor inducible. Los plásmidos se introducen en E. coli y la expresión del enzima deseado se dirige por un método de inducción adecuado tal como un cambio de temperatura o la adición de IPTG al medio.

Los enzimas pueden recuperarse en una forma purificada por una modificación de los métodos descritos en este documento. La ruptura celular se consigue mediante homogeneización, sonicación o tratamiento enzimático para romper la pared celular y liberar los componentes citoplásmicos. Si la síntesis enzimática da como resultado una agregación, el agregado después puede disolverse por un agente de desnaturalización, guanidina HCl de 3 a 6 M o urea de 4 a 8 M, y la proteína puede replegarse retirando el agente desnaturalizante por diálisis o dilución. El enzima replegado puede purificarse adicionalmente usando los métodos de cromatografía líquida descritos anteriormente.

Construcción de proteínas de fusión

Pueden crearse proteínas de fusión que incorporan el enzima heparinasa fusionado a proteínas con propiedades de unión específicas por medio de técnicas de biología molecular recombinante. Eligiendo una proteína de unión apropiada, la actividad heparinasa puede dirigirse a sitios específicos, in vivo. Se ha demostrado que ICAM-1 se expresa preferentemente en la superficie de células endoteliales activadas (Dustin, et al., J. Immunol., 137:245-254, 1986). Como ejemplos de proteínas de fusión, un anticuerpo, fragmento Fab o región variable, específico para ICAM-1, VCAM-1 o P-selectina, cuando se fusiona con el enzima heparinasa o una parte activa del mismo, localiza la actividad heparinasa cerca de las superficies luminal y abluminal del endotelio activado. En esta área se retiran restos de heparina y heparán sulfato provocando la ruptura del gradiente de quimioquinas producido por el endotelio. Como otros ejemplos, la fusión de enzima heparinasa, o una parte activa del mismo, al dominio I de LFA-1 o Mac-1 (ambos se unen a ICAM-1) dirige el endotelio activado para la eliminación de heparina y heparán sulfato, inhibiendo el rodamiento de leucocito y la formación del gradiente de quimioquinas. Ciertos receptores para citoquinas tales como IL-1b, están regulados positivamente en el endotelio activado y proporcionan otra diana para la unión de proteínas de fusión. También puede conseguirse por fusión de IL-1b, o el dominio de unión al receptor de IL-1b a la heparinasa de dirección. Las proteínas de fusión pueden reducir las respuestas inflamatorias a menores concentraciones en sangre de la necesaria para conseguir reducciones comparables usando heparina no fusionada. Además, otras células del sistema vascular se verán menos afectadas por esta actividad enzimática de la proteína de fusión, reduciendo los posibles efectos secundarios de los tratamientos.

Las proteínas de fusión de heparinasa creadas por ingeniería genética retienen la unión y las propiedades catalíticas de la heparinasa y de la proteína a la que se fusionan. Se han purificado tres heparinasas hasta la homogeneidad a partir de Flavobacterium heparinum, y se han producido de una forma recombinante en Escherichia coli. Pueden producirse proteínas de fusión que constan de enzima heparinasa combinado con dominios de unión de anticuerpos o moléculas de adhesión con una fusión genética en un hospedador recombinante, reteniendo al mismo tiempo las funcionalidades de unión y la actividad enzimática de las distintas proteínas. Estas moléculas también pueden purificarse hasta la homogeneidad por procedimientos usados normalmente para la purificación de las partes individuales de la proteína de fusión (por ejemplo, cromatografía de afinidad, y protocolos de purificación de heparinasa). A diferencia de la heparinasa natural purificada a partir de Flavobacterium heparinum, el enzima recombinante puede no contener restos de carbohidrato o de piroglutamato amino-terminales. Todas las heparinasas recombinantes pueden contener deleciones, aminoácidos adicionales y/o alterados, que modifican la actividad enzimática del enzima natural o el funcionamiento de los dominios de unión. La heparinasa y la heparinasa de fusión pueden estabilizarse para uso in vivo, complejándolas con polietilenglicol, agentes de entrecruzamiento y por microencapsulación.

Por ejemplo, el gen para la heparinasa I se aisló a partir de F. heparinum como se describe en Sasisekharan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:3660-3664, 1993, y se insertó un sitio de restricción EcoR I en posición 5' con respecto al codón que codifica el resto glutamina-21 por reacción en cadena de la polimerasa. Se preparó un fragmento que contenía el gen de heparinasa I por digestión con endonucleasas de restricción EcoR I y BamH1, y se unió al plásmido pMALc2 (Biolaboratorios New England) escindido con EcoR I/BamH I. El plásmido resultante contenía un gen híbrido que codificaba una proteína de 82.000 - 85.000 Dalton que incorporaba la proteína de unión a maltosa (MalB) fusionada en posición 5' con respecto al gen de heparinasa I. Este plásmido se insertó en células de Escherichia coli HB101 usando el método mediado por cloruro cálcico descrito por Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110-211. Estas células presentaron actividad heparinasa bajo el control del promotor tac, permitiendo la síntesis de la proteína de fusión por la adición de una concentración 0,1 mM del agente inductor IPTG al medio de cultivo.

Las células HB101 (pMALc2-HEP1Q21) se cultivaron hasta una densidad celular de 1,0 g/l de peso seco de células en 500 ml de medio M9 que contenía IPTG 0,1 mM a 37ºC, y se concentraron por centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos. El sedimento celular se suspendió en 10 ml de Tris 0,025 M a pH, 7,7 y las células se rompieron por sonicación usando un Heat Systems modelo XL2020, durante 4,5 minutos, a un nivel de potencia de 3, en ciclos de 30 segundos de activación y 30 segundos de desactivación. Los desechos celulares se retiraron por centrifugación, a 10.000 g durante 10 minutos, y el sobrenadante se aplicó a una columna de resina de afinidad de amilosa (1,0 diámetro interno x 2 cm, New England Biolabs). La proteína unida se eluyó con un gradiente por etapas de Tris 0,025 M que contenía maltosa 0,01 M a pH 7,5. La proteína de fusión se eluyó en un pico de proteína que mostró una actividad específica de heparinasa de 23,77 IU/mg.

La proteína de fusión de unión heparinasa-maltosa también puede purificarse por técnicas de separación de proteínas convencionales basadas en las propiedades de la heparinasa. Se fraccionaron sonicados celulares por precipitación con sulfato amónico. Las proteínas no específicas se retiraron con una etapa de precipitación en sulfato amónico 1,7 M y el sobrenadante precipitó elevando la concentración de sulfato amónico a 3,2 M. El material precipitado contenía la proteína de fusión y se resuspendió en fosfato sódico 0,025 M, pH 6,5. El material se aplicó a una columna de intercambio catiónico débil (1,6 diámetro interno x 10 cm, CBX, J.T. Baker) y se eluyó con gradientes por etapas secuenciales de cloruro sódico 0,0 M, cloruro sódico 0,01 M, cloruro sódico 0,25 M y cloruro sódico 1,0 M, todos en fosfato sódico 0,025 M. La proteína de fusión eluía en la fracción de elución de cloruro sódico 0,25 M y mostraba una actividad específica de heparinasa de 29,95 IU/ml. Estos dos procedimientos de purificación demuestran que pueden obtenerse proteínas de fusión de heparinasa funcionales uniendo genéticamente una proteína con propiedades de unión deseadas al extremo N-terminal de heparinasa, reteniendo la proteína de fusión resultante tanto la funcionalidad de la heparinasa como la funcionalidad de la proteína con la que se fusiona.

Como otro ejemplo de una proteína de fusión, un fragmento de restricción BamH I/Sal I de pGBH3, que contiene el gen de heparinasa III de Flavobacterium heparinum, se insertó en pMALc2 para formar un gen para la fusión de una proteína de unión a maltosa con la heparinasa III. Se produjeron extractos de la cepa de E. coli DH5a que contenían el plásmido del gen de fusión como se ha descrito en el último ejemplo, y estos extractos contenían 18,7 IU/ml/O.D. de actividad heparinasa III. El extracto también se combinó con resina de afinidad de amilosa y la resina después se separó del extracto por centrifugación. La resina se lavó una vez con solución de Tris 0,025 M (pH 7,5) y las proteínas unidas a la resina se resuspendieron en tampón de muestra SDS-PAGE y se separaron de acuerdo con su tamaño en un gel de SDS-poliacrilamida al 7,5%. El análisis de transferencia de Western del gel con anticuerpo específico anti-heparinasa III identificó una proteína de 116.000 Da, que corresponde al tamaño esperado de la proteína de fusión. Este análisis indica que la proteína de fusión tiene un dominio de unión a maltosa funcional. Este ejemplo demuestra que la proteína heparinasa III también puede fusionarse a un dominio de unión para producir un enzima de fusión bifuncional.

Protección de proteínas in vivo

Los métodos para aumentar la vida media in vivo son conocidos y se usan rutinariamente, especialmente en el caso de los enzimas. Un ejemplo de un método adecuado es la unión de restos de polietilenglicol a la proteína, que inhibe la captación por el sistema reticuloendotelial. La preparación y caracterización de tales proteínas no inmunogénicas se describe en Lu, et al. (Pept. Res. 6(3), 140-146, 1993), Delgado, et al. (Critical Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9(3-4), 249-304, 1992) y Davis et al. (Patente de Estados Unidos Número 4.179.337, 1979), cuyas enseñanzas se incorporan en este documento. Otro ejemplo de un método adecuado es el uso de agentes de entrecruzamiento bifuncionales para estabilizar el enzima contra la degradación proteolítica. El glutaraldehído es un tipo de agente de entrecruzamiento bifuncional. El documento PCT WO95/00171 de Novo Nordisk A/S contiene un listado de otros agentes de entrecruzamiento bifuncionales útiles, y enseña el uso de los mismos, que se incorpora en este documento.

Preparación de composiciones farmacéuticas

El enzima heparinasa se administra localmente. La administración local proporciona un mejor control. La heparinasa se mezcla con un vehículo farmacéutico o veterinario apropiado, y después se administra en una cantidad eficaz para producir el efecto deseado en las células tratadas usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, para aplicación local, el uso de perfusión, inyección o un catéter.

Pueden conseguirse dosificaciones de dirección y de concentración eficaz mediante la preparación de enzimas dirigidos como se ha descrito anteriormente, o mediante el uso de vehículos de dirección, tales como un catéter o inyección localizada, para conseguir una liberación controlada del enzima con especificidad de sitio.

Administración de enzimas a través de matrices de liberación controlada o inyección

El enzima heparinasa puede formularse en un vehículo para administración por inyección, por ejemplo, en solución salina o un tampón acuoso, usando la metodología convencional, o puede encapsularse en una matriz polimérica. La encapsulación de heparinasa en formulaciones de liberación controlada es bien conocida; los materiales incluyen, pero sin limitación, liposomas, lipoesferas, matrices poliméricas biodegradables y vesículas. Estos encapsulantes típicamente son micropartículas que tienen un diámetro de 60 nm a 100 micrómetros, pero preferiblemente menor que diez micrómetros, y más preferiblemente un diámetro de un micrómetro o menos.

Los proteosomas se preparan a partir de proteínas de la membrana externa de bacterias meningocócicas y Lowell, et al., Science, 240:800 (1988) ha informado que se unen a proteínas que contienen anclajes hidrófobos. Las proteínas de los proteosomas son muy hidrófobas, reflejando su papel como proteínas transmembrana y porinas. Cuando se aislan, sus interacciones proteína-proteína hidrófobas hacen que formen vesículas multimoleculares naturales membranosas de 60 a 1000 nm o fragmentos de vesículas de membrana, dependiendo de la concentración del detergente usado en su aislamiento. La heparinasa también puede encapsularse dentro de un proteoliposoma como se describe por Miller et al., J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992) y como se ha descrito anteriormente en relación con los proteosomas. Como alternativa, la heparinasa se puede encapsular en vesículas lipídicas tales como vesículas de lípidos NovasomeTM (Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH). Se describe otro vehículo en el documento WO 91/07760 de Nova Pharmaceuticals, cuyas enseñanzas se incorporan en este documento, que hace referencia a una lipoesfera que tienen un núcleo sólido y una capa de envuelta externa formada por fosfolípidos.

El vehículo también puede ser un sistema de liberación retardada polimérico. Los polímeros sintéticos biodegradables son particularmente útiles para realizar la liberación controlada de la heparinasa. La microencapsulación se ha aplicado a la inyección de productos farmacéuticos microencapsulados para proporcionar una liberación controlada. Numerosos factores contribuyen a la selección de un polímero particular para la microencapsulación. La reproducibilidad de la síntesis del polímero y el proceso de microencapsulación, el coste de los materiales y del proceso de microencapsulación, el perfil toxicológico, las necesidades de una cinética de liberación variable y la compatibilidad fisicoquímica del polímero y los antígenos son, todos ellos, factores que deben considerarse. Son ejemplos de polímeros útiles policarbonatos, poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres y políamidas, particularmente las que son biodegradables.

Una elección frecuente de un vehículo para productos farmacéuticos es poli(d,l-lactida-co-glicolida) (PLGA). Es un poliéster biodegradable que tiene una larga historia de uso médico en suturas erosionables, placas de huesos y otras prótesis temporales, en las que no ha presentado ninguna toxicidad. Se ha formulado una amplia diversidad de productos farmacéuticos incluyendo péptidos y antígenos en microcápsulas de PLGA. El proceso de microencapsulación con PLGA usa una separación de fases de una emulsión de agua en aceite. La heparinasa se prepara como una solución acuosa y la PLGA se disuelve en disolventes orgánicos adecuados tales como cloruro de metileno y acetato de etilo. Estas dos soluciones inmiscibles se co-emulsionan mediante agitación a alta velocidad. Después se añade un no disolvente para el polímero, causando la precipitación del polímero alrededor de las gotas acuosas para formar microcápsulas embrionarias. Las microcápsulas se recogen y se estabilizan con uno de una colección de agentes (alcohol polivinílico (PVA), gelatina, alginatos, polivinilpirrolidona (PVP), metil celulosa) y el disolvente se retira por secado al vacío o extracción con disolvente. Otros medios para la encapsulación incluyen secado por pulverización, co-precipitación y extracción con disolvente.

Medios para la administración

El enzima heparinasa puede administrarse por inyección, infusión o perfusión. Típicamente, la inyección se realiza usando una jeringa un catéter. Puede usarse una jeringa o un catéter para aplicar la heparinasa de manera local a zonas de vasos sanguíneos, tejidos u órganos. Los pacientes a los que se les han diagnosticado inflamaciones localizadas pueden tratarse por medio de la introducción de heparinasa en su sistema vascular de esta manera. La heparinasa también puede administrarse antes o simultáneamente con una cirugía, para reducir las respuestas inflamatorias resultantes. Además, antes de una cirugía de trasplante, el donante de órganos puede someterse a perfusión con una preparación de heparinasa para reducir la inflamación tras la reperfusión después del trasplante.

Ejemplos Ejemplo 1 Tratamiento de células endoteliales con heparinasa para liberar heparina/heparán sulfato

La heparinasa altera la superficie celular y la membrana basal escindiendo los restos de heparina y de heparán sulfato de la superficie celular y de los proteoglicanos de la matriz extracelular. La retirada de estos glicosaminoglicanos reducirá las interacciones leucocito-endotelio (rodamiento de leucocitos) disminuyendo la unión de la L-selectina presente en los leucocitos a los proteoglicanos del endotelio. Además, la retirada de heparina y de heparán sulfato disminuirá la unión de quimioquinas al endotelio, lo cual reducirá la activación, la adherencia y la extravasación de leucocitos. La producción de células endoteliales de córnea bovina con proteoglicanos de heparina/heparán sulfato y la posterior digestión de estos proteoglicanos radiomarcados con heparinasa III de Flavobacterium proporciona una evaluación cualitativa del efecto del enzima sobre la superficie celular. La digestión de los proteoglicanos de la superficie celular con heparinasa III liberará tanto los restos heparina como los de heparán sulfato, porque estos restos están intercalados en las mismas cadenas de carbohidrato no ramificadas. Por el tratamiento con heparinasa III se solubilizaron cantidades significativas de ^{35}S-heparina/heparán sulfato.

Se produjeron capas de células endoteliales que contenían ^{35}S-sulfato sembrando placas de 24 pocillos con células endoteliales de córnea bovina primarias. Estas células se dejaron crecer hasta 1 día antes de la confluencia en DMEM con un 10% de suero de ternero fetal y un 5% de suero de ternero. Un día antes de la confluencia, las células se diluyeron 10 veces en medio de Fisher suplementado con un 10% de suero de ternera fetal, un 5% de suero de ternera, un 4% de dextrano y 25 mCi/ml de Na_{2}35SO_{4}, y se cultivaron durante 3 días con la adición de 0,5 ng/ml por día de bFGF. La incorporación de un marcador por células cercanas a la confluencia localiza el marcador en y sobre las células y minimiza el marcador de ^{35}S incorporado en la membrana basal.

Las capas de células endoteliales que contenían ^{35}S-sulfato se trataron con 600 \mul de solución salina tamponada con fosfato o heparinasa III, en solución salina tamponada con fosfato, a una concentración de 1,0 IU/ml, en pocillos por duplicado. Las digestiones se dejaron transcurrir durante 5, 30 o 60 minutos a 37ºC. Después del tiempo de digestión indicado, se retiraron 400 \mul de solución de digestión de cada pocillo y se fraccionaron en una columna de exclusión molecular Bio-sil SEC 125-5 controlada por un sistema Beckman Gold HPLC, equipado con un tomador de muestras automático. El caudal fue de 1 ml/minuto y se recogieron fracciones de 1 ml. La cantidad de 35S-sulfato presente en cada fracción se determinó midiendo una alícuota de cada fracción en un contador de centelleo de líquidos Packard 1600 TR. Las soluciones de control marcadas no tratadas se fraccionaron y se midieron de la misma manera, y la cantidad de material radiactivo en cada fracción (fondo) se restó de la cantidad presente en las fracciones de las muestras digeridas con heparinasa. La cantidad de heparina/heparán sulfato marcado con ^{35}S en la superficie celular en cada fracción liberada por tratamiento con heparinasa III se muestra en la figura 1.

Ejemplo 2 Determinación del grado de eliminación y de la velocidad de reemplazo de restos de heparina/heparán sulfato en células endoteliales y en membranas basales tratadas con heparinasa

El factor de crecimiento factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) es una proteína de unión a heparina bien caracterizada que, como se sabe, se une a los restos de heparina de proteoglicanos presentes en la superficie celular y en la matriz extracelular (Maccarana, et al., J. Biol. Chem., 268:23898-23905, 1993). La unión de bFGF marcado con ^{125}I a los proteoglicanos de la superficie celular y de la membrana basal se usó para conocer la cantidad de heparina/heparán sulfato retirada de capas de células endoteliales no activadas y activadas por IL-1b y sus membranas basales por las heparinasas I, II o III. La digestión de la superficie celular y la membrana basal con heparinasa retirará tanto los restos de heparina como los de heparán sulfato, porque estos restos están intercalados en las mismas cadenas de carbohidrato no ramificadas. La unión de bFGF marcado con ^{125}I también se usó en este experimento para determinar la velocidad a la que los restos de heparina/heparán sulfato se reemplazaron en la superficie celular y en la membrana basal de endotelio tratado con heparinasas I, II o III.

La mayor parte de la heparina/heparán sulfato puede retirarse usando heparinasa (del 70 al 90%; figuras 2, 3 y 4). Esto demuestra que en el endotelio pueden desaparecer casi completamente los restos de heparina/heparán sulfato usando heparinasa. Con un tratamiento con heparinasa de 1 hora, la velocidad de reemplazo de la heparina/heparán sulfato generalmente tiene una naturaleza bifásica. El reemplazo del 40 al 50% de la heparina/heparán sulfato digerido se produce en unas pocas horas. El reemplazo adicional de la heparina/heparán sulfato agotado se produce a una velocidad más lenta durante el resto del experimento, produciéndose el reemplazo completo a las 12 a 16 horas. Los tratamientos de 3 y 5 horas con heparinasas redujeron las velocidades de reemplazo de heparina/heparán sulfato en la superficie celular (figuras 3 y 4). Esto fue lo más evidente para el endotelio no activado. En cuanto a los resultados experimentales representados en las figuras 3 y 4 para el endotelio activado por IL-1, los tres tiempos de tratamiento (1, 3 y 5 horas) dieron menores velocidades de reemplazo que las observadas en los resultados experimentales representados en la figura 2.

Estos datos indican que el tratamiento con heparinasa tiene como resultado una inhibición significativa de la unión de L-selectina y la formación de un gradiente de quimioquinas inmovilizado, y esto tendría como resultado una inhibición significativa de las respuestas inflamatorias localizadas. Además, un periodo de tratamiento de 3 a 5 horas puede prolongar en gran medida el periodo de respuesta inflamatoria reducida disminuyendo la velocidad de reemplazo de heparina/heparán sulfato.

Se cultivó una línea de células endoteliales humanas hasta la confluencia en placas de 48 pocillos en 0,25 ml/pocillo de medio RPMI, que contenía un 1% de penicilina/estreptomicina y un 20% de suero fetal. Las células en la mitad de los pocillos se activaron durante 4 horas con 10 \mul de 50 ng/ml de IL-1b. Después de la activación, todos los pocillos se lavaron tres veces con HBSS y se trataron con medio de incubación (medio RPMI, Tris HCl 25 mM pH 8, HEPES 25 mM pH 7,4 y BSA al 0,1%) o 0,1 IU/ml de heparinasa I, II o III diluida en medio de incubación a 37ºC, en CO_{2} al 5%, durante 60 minutos para los resultados experimentales representados en la figura 2 o, para los resultados representados en las figuras 3 y 4, 1,0 IU/ml de heparinasa I o III diluida en medio de incubación a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 60 minutos con ninguna, 3 o 5 reemplazos de los enzimas cada hora. Después de los tratamientos enzimáticos, los pocillos se lavaron 3 veces con HBSS y se incubaron con medio RPMI que contenía un 1% de penicilina/estreptomicina y un 20% de suero fetal \pm IL-1b, a 37ºC en CO_{2} al 5%, durante los tiempos indicados en la figura 2. Los pocillos se lavaron de nuevo tres veces con HBSS y se añadieron 0,1 ml de medio de incubación a cada pocillo, y las placas se enfriaron en hielo durante 5 minutos. A todos los pocillos se les añadieron 20 \mul de 125 ng/ml de ^{125}I-bFGF, y 20 \mul de bFGF sin marcar a una concentración de 20 \mug/ml. A algunos de los pocillos de control también se les añadieron 15 \mul de heparina a una concentración de 10 mg/ml, para determinar la unión no específica de fondo. Las placas se incubaron en hielo durante 40 minutos y se lavaron 2 veces con HBSS frío. Se añadieron 0,25 ml de LAB (HEPES 25 mM pH 7,4 y NaCl 2 M) a cada pocillo para solubilizar el bFGF y después se recogió en tubos. Esta etapa se repitió y los contenidos de los tubos se contaron en un contador gamma. La cantidad de unión de fondo no específica se restó de cada muestra de control no tratada y tratada. Los recuentos de muestras se dividieron por los recuentos de control para terminar el porcentaje de unión que se produjo. Los resultados \pm los errores típicos (SE) se muestran en las figuras 2, 3 y 4.

Ejemplo 3 Tratamiento de capas de células endoteliales activadas y membranas basales con heparinasa para liberar quimioquina IL-8 unida a heparina/heparán sulfato

La eliminación del gradiente de quimioquinas unidas formado por el endotelio activado adyacente al tejido inflamado inhibirá la acumulación de neutrófilos dentro de este tejido, y disminuirá la respuesta inflamatoria. La quimioquina IL-8 se produce por el endotelio activado por IL-1b y otras citoquinas y quimioatrayentes, que se secretan por tejidos inflamados. Si la IL-8 unida al endotelio puede solubilizarse por tratamiento con heparinasa, se retiraría de la zona de inflamación por el flujo sanguíneo y se inhibiría la respuesta inflamatoria localizada. La eliminación y solubilización in vitro de 0,5 a 3 veces más IL-8 inmovilizada endógena (frente a la IL-8 secretada) del endotelio activado por las heparinasas I, II o III o por las heparinasas I y III demuestra que el gradiente de quimioquina unida puede destruirse por tratamiento con heparinasa.

Se usó un ml de una solución de 3 mg/ml de colágeno humano para recubrir los pocillos de una placa de 12 pocillos. Toda la solución de colágeno restante se retiró por aspiración. Se tripsinizaron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC; usadas en los pasos 1 a 8) de una placa confluente de 10 ml y se diluyeron 1 a 7 en medio RPMI que contenía un 20% de suero fetal, un 1% de penicilina/estreptomicina, 100 \mug/ml de heparina, 10 \mug/ml de factor de crecimiento epidérmico y 200 \mug/ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales. Se añadió 1 ml de células diluidas a cada pocillo de las placas de 12 pocillos recubiertas con colágeno. Las células se dejaron crecer hasta la confluencia a 37ºC en CO_{2} al 5%. El medio de cultivo se cambio un día sí y otro no durante el periodo de crecimiento. El día antes del ensayo de quimioquinas el medio se cambió por 1 ml de medio RPMI sin heparina.

Para activar la capa de endotelio, se añadieron 50 ng/ml de IL-1b recombinante humana, diluida en medio RPMI (menos suero fetal, factor de crecimiento epidérmico, suplemento de crecimiento de células endoteliales y heparina) y un 2% de BSA a pocillos que no eran de control hasta una concentración final de 2 ng/ml. Las placas de múltiples pocillos se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 4 horas. Se retiró el medio de todos los pocillos y los pocillos se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Se añadieron 0,5 ml de medio RPMI (menos suero fetal, factor de crecimiento epidérmico, suplemento de crecimiento de células endoteliales y heparina) y un 2% de BSA a los pocillos durante los tiempos indicados en la figura 3. Después de los tiempos indicados, los pocillos se vaciaron y se lavaron una vez con 1 ml de HBSS. Se añadieron 0,5 ml de HBSS con o sin 1 IU/ml de heparinasa I, II o III; o heparinasas I y III a los pocillos. Las placas se incubaron a 37ºC en un bloque térmico durante 15 minutos con agitación ocasional. Después de 15 minutos, los sobrenadantes se recogieron y se ensayaron para IL-8. Se usó un sistema de ensayo de inmunoadsorbente ligado a enzima (ELISA) de Perseptive Diagnostics para determinar las concentraciones de IL-8 en los sobrenadantes. Se siguió el protocolo recomendado por el fabricante. Se usaron 90 \mul de sobrenadante y 10 \mul de cloruro sódico 5 M en cada pocillo de la placa de ELISA. Cada etapa de lavado utilizó tres repeticiones de 150 \mul de solución de lavado por pocillo, con 2-3 minutos de agitación entre cada repetición. El porcentaje de diferencia en la concentración de IL-8 de los sobrenadantes entre endotelio inducido por IL-1b tratado con heparinasa I, II o III frente a endotelio no tratado inducido por IL-1b se muestran en la figura 5. Además, en la figura 5 se muestran las concentraciones de IL-8 en los sobrenadantes de endotelio tratado con heparinasa I, II o III inducido por IL-1b.

Ejemplo 4 Tratamiento de capas de células endoteliales con heparinasa para inhibir la adhesión de neutrófilos

Para concentrar neutrófilos en un sitio de inflamación, las moléculas de la superficie de las células endoteliales activan la unión fuerte de neutrófilos rodantes a las paredes de vénulas postcapilares. Se han identificado quimioquinas unidas a heparina/heparán sulfato como importantes moléculas señal para la activación de neutrófilos para su unión fuerte en los microcapilares. El sistema de ensayo de adhesión de neutrófilos in vitro descrito a continuación se usa habitualmente para analizar las condiciones que afectan a la adhesión de los neutrófilos a las células endoteliales. El tratamiento de las capas de células endoteliales humanas activadas usado en este ensayo con heparinasa I, II o III tuvo como resultado reducciones significativas en el nivel de adhesión de neutrófilos al endotelio. Estos resultados demuestran que el tratamiento de la vasculatura con heparinasa inhibiría la acumulación localizada de neutrófilos en los microcapilares e inhibiría las respuestas inflamatorias.

Aislamiento de neutrófilos humanos

Se extrajeron 25 ml de sangre venosa de un donante sano en 1/10 volúmenes de citrato sódico 0,1 M, pH 7,4 y se diluyó con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía cloruro cálcico y cloruro magnésico (D-PBS). Se depositaron alícuotas de 10 ml de sangre diluida sobre 10 ml de Ficoll-Paque en tubos de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 400 x g durante 30 minutos a 20ºC y se dejaron parar sin frenar. Las capas superiores se retiraron y los sedimentos se resuspendieron en 3 volúmenes de una solución de NH_{4}Cl 155 mM, KHCO_{3} 10 mM y EDTA 0,1 mM, pH 7,4 a 4ºC, para lisar los eritrocitos. Los tubos se invirtieron después de unos pocos minutos y el contenido se volvió negro después de 7 a 8 minutos. Después de 10 minutos, los tubos se centrifugaron de nuevo a 400 x g durante 5 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se aspiraron y los sedimentos se resuspendieron en la solución de NH_{4}Cl que contenía un 0,5% de albúmina humana. Las suspensiones se agruparon y el volumen se llevó a 50 ml. La suspensión celular se incubó en hielo durante 15 minutos y se centrifugó a 400 x g durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se retiró y si el sedimento aún era rojo, se lavó de nuevo con solución de NH_{4}Cl que contenía un 0,5% de albúmina humana. Finalmente, las células se resuspendieron en D-PBS con 5 mg/ml de albúmina humana y se refrigeraron hasta que se necesitaron. Se diluyó una alícuota de 10 \mul de suspensión con 10 \mul de azul trípano y las células se contaron en un hemocitómetro para determinar el número de células viables por volumen de suspensión.

Marcaje de neutrófilos

Se preparó una suspensión de 10 x 10^{6} neutrófilos en 2 ml de PBS (sin Ca, sin Mg) con 5 mg/ml de albúmina humana. Se añadió BCECF-AM (Molecular Probes) a la suspensión para conseguir una concentración final de 46 \muM. Los neutrófilos se incubaron en un baño de agua a una temperatura establecida de 37ºC durante 30 minutos, después de lo cual se centrifugaron y se aclararon dos veces con PBS (sin Ca, sin Mg) con 5 mg/ml de albúmina humana. Finalmente, se resuspendieron en 10 ml de RPMI + 20% de suero bovino fetal a 37ºC.

Tratamiento de células endoteliales con heparinasas

Se tripsinizaron células HUVEC en el número de paso 3 y se contaron. Las células se pusieron en una placa en RPMI + 20% de suero bovino fetal + 95 \mug/ml de heparina + ECGS + EGF a 5 x 10^{4} células por pocillo en placas de 96 pocillos. Se cultivaron a 37ºC, con CO_{2} al 5% durante 18 horas. En este momento, el medio de cultivo se reemplazó por RPMI + 20% de suero bovino fetal (2 ng/ml de IL-1b durante 4 horas). Las células después se aclararon con HBSS y se trataron con heparinasa I, II o III a 0,1 IU/ml en HBSS durante 1 hora a 37ºC con CO_{2} al 5%.

Ensayo de adhesión de neutrófilos

Después del periodo de tratamiento, se aclararon células HUVEC una vez con HBSS. Se añadieron 200 \mul de la suspensión de neutrófilos (que corresponde a 200.000 neutrófilos) a cada pocillo de células HUVEC tratadas o de control. La placa se puso a 37ºC, con CO_{2} al 5% durante 30 minutos. El periodo de adhesión se detuvo por centrifugación de la placa de arriba a abajo a 250 x g durante 5 minutos. Se añadieron 200 \mul de PBS (sin Ca, sin Mg) + 5 mg/ml de albúmina humana a cada pocillo y la placa se leyó con un lector de placas de fluorescencia Fluorolite 1000 a un voltaje de 2,5 V. El filtro de emisión era a 535 nm \pm 35 y el filtro de excitación a 485 \pm 22.

Análisis de los datos

Se generó una curva patrón poniendo cantidades conocidas de neutrófilos teñidos con BCECF-AM, resuspendidos en PBS (sin Ca, sin Mg) + 5 mg/ml de albúmina humana en pocillos de otra placa de 96 pocillos que contenía capas HUVEC confluyentes. Las unidades de fluorescencia se representaron frente a la cantidad de neutrófilos y se calculó la pendiente. La curva patrón se usó para determinar el número de neutrófilos unidos en los pocillos de control y tratados con heparinasa. En la figura 6 se muestran las diferencias en porcentaje entre las capas de HUVEC activadas con IL-1b y las capas de HUVEC comparables tratadas con heparinasas I, II y III.

Ejemplo 5 Tratamiento de capas de células endoteliales y membranas basales con heparinasa para inhibir la extravasación de neutrófilos

Los leucocitos de la sangre se acumulan en tejidos inflamados por transmigración a través del endotelio adyacente (extravasación). La capa de células endoteliales se activa por el tejido inflamado (mediante citoquinas y quimioatrayentes) y el endotelio afectado dirige y localiza la acumulación de leucocitos en el tejido inflamado. Para activar los leucocitos para la extravasación y para dirigir la migración de los leucocitos al interior del tejido inflamado, el endotelio activado forma un gradiente de quimioquinas inmovilizado sobre su superficie celular y en su membrana basal. El sistema de ensayo de transmigración de neutrófilos in vitro descrito a continuación se usa habitualmente para analizar las condiciones que afectan a la extravasación de neutrófilos. El tratamiento de las capas de células endoteliales humanas activadas usadas en este sistema con heparinasa I, II o III dio como resultado reducciones significativas en el nivel de migración de neutrófilos a través del endotelio. Estos resultados demuestran que el tratamiento con heparinasa de la vasculatura inhibiría la acumulación de neutrófilos localizada y las respuestas inflamatorias.

Ensayo de extravasación de neutrófilos

Se aislaron neutrófilos como se ha descrito en el ejemplo 4. Se disolvió fibronectina humana a 0,4 mg/ml en medio RPMI sin suero. Se recubrieron insertos de filtro (6,25 mm) con un tamaño de poros de 3 \mum u 8 \mum con 4 \mug/cm^{2}de fibronectina humana durante una hora a temperatura ambiente y se aclararon con agua destilada. Los pocillos de una placa de 24 pocillos se llenaron con 0,3 ml de medio RPMI con 20% de suero bovino fetal, 95 \mug/ml de heparina, 200 \mug/ml de ECGS y 10 ng/ml de EGF. Los insertos de filtro recubiertos se asentaron en los pocillos y sobre los insertos de filtro recubiertos se cultivaron 8 x 10^{4} células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC; usadas en los pasos 1 a 7) en 0,3 ml de medio RPMI completo. Las células se dejaron crecer durante 48 a 65 horas, a 37ºC en CO_{2} al 5%. El medio de cultivo de los insertos de filtro y los pocillos se cambió una vez durante el periodo de crecimiento por medio RPMI que carecía de heparina. Después del periodo de crecimiento, el medio de cultivo debajo de todos los insertos, excepto los insertos de control negativo, se retiró y se reemplazó por medio de cultivo fresco que carecía de heparina y factores de crecimiento, pero que contenía 2 ng/ml de IL-1b recombinante humana. El medio de cultivo debajo de los insertos de control negativos se reemplazó por medio de cultivo fresco. Las placas de múltiples pocillos se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 4 horas. El medio se retiró de los insertos y los pocillos y las células se aclararon una vez con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Los filtros y los pocillos se llenaron con 0,3 ml de una solución de HBSS; y los insertos tratados recibieron HBSS que contenía heparinasa I, II o III en lugar de HBSS. Este tratamiento se realizó durante los tiempos indicados en la figura 1, a 37ºC en CO_{2} al 5%. La solución se retiró y las células se aclararon una vez con HBSS. Se añadieron 0,3 ml de medio de cultivo fresco sin heparina y factores de crecimiento a los pocillos y se añadieron 1,5 x 10^{6} neutrófilos humanos preparados recientemente en 0,3 ml de medio de cultivo sin heparina ni factores de crecimiento a todos los insertos. Las placas se incubaron a 37ºC en CO_{2} a 5% durante los tiempos indicados en la figura 3. Después de este tiempo, los insertos se retiraron y los fondos se aclararon una vez con 0,3 ml de D-PBS. Se retiró el contenido del pocillo y el pocillo se lavó con 0,3 ml de D-PBS. Los aclarados se añadieron al contenido del pocillo y los contenidos reunidos se llevaron a un volumen de 1 ml. Estas muestras se congelaron durante un periodo de hasta 16 horas antes del ensayo de la actividad mieloperoxi-
dasa.

Ensayo de mieloperoxidasa

Se produjeron patrones que contenían entre 1 x 10^{5} y 1 x 10^{6} neutrófilos en un volumen de 1 ml diluyendo una alícuota de la suspensión de neutrófilos en D-PBS. Se añadieron 4 ml de fosfato potásico 50 mM a pH 6,7 que contenía un 0,5% de bromuro de hexadeciltrimetilamonio y un 0,5% de tritón a cada patrón y muestra descongelada. Se añadieron 0,1 ml de cada muestra o patrón a una cubeta de plástico. Se añadieron 2,9 ml de tampón fosfato 50 mM, a pH 6,0, que contenía 0,167 mg/ml de clorhidrato de o-dianisidina y peróxido de hidrógeno al 0,0005% a las cubetas. Se controló el cambio de absorbancia a 460 nm cada 30 segundos durante 3 minutos usando un espectrofotó-
metro.

Las proporciones de cambios obtenidas en relación con los patrones se usaron para producir una curva de la velocidad de aumento de la absorbancia frente al número de neutrófilos. Esta curva se usó para cuantificar el número de neutrófilos en cada muestra, que habían migrado a través de una capa endotelial tratada o no tratada. El número de neutrófilos migratorios se dividió por 1,5 x 10^{6} para determinar el porcentaje de migración de neutrófilos.

Análisis de datos

La eficacia del tratamiento con heparinasa en este ensayo dependía de la medida en la que las células HUVEC estaban cubriendo la superficie de filtro. La medida de cobertura se basó en un análisis de exclusión de colorante realizado después de un experimento de extravasación y varió un poco de un filtro a otro en un solo experimento. Generalmente, si el filtro estaba cubierto densamente con una capa de HUVEC fuertemente empaquetadas, el porcentaje de extravasación de neutrófilos era bajo (<10%) y las diferencias entre pocillos tratados y no tratados no fueron estadísticamente significativas (gran variabilidad de un pocillo a otro). Si grandes zonas del filtro no quedaban cubiertas con una capa de HUVEC (una estimación del 30-40% del filtro), grandes cantidades de neutrófilos (del 40 al 60%) migrarían a través del filtro, pero un tratamiento de 1 hora con heparinasa no sería tan eficaz para inhibir la migración. Esta migración no es comparable con la extravasación, que puede definirse funcionalmente como neutrófilos que se aprietan entre células endoteliales vecinas. Si del 75 al 90% del filtro estaba cubierto con HUVEC, generalmente se extravasaban del 15 al 30% de neutrófilos, y se descubrió que el tratamiento de 1 hora con heparinasas era el más eficaz en estas
condiciones.

Usando el ensayo t de Student se analizaron los experimentos para determinar si se había observado un efecto significativo para los tratamientos de una hora con heparinasa (P<0,05). Los datos de estos experimentos se combinaron y se representan en la figura 7. Los datos para los tratamientos de 15 minutos con heparinasa mostrados en la figura 7 proceden de los mismos experimentos que los tratamientos de 1 hora. Se usó el ensayo Student-Newman-Keuls para determinar el significado de las diferencias (P<0,05) entre diferentes tratamientos con el mismo enzima. Las diferencias significativas están indicadas por asteriscos (*) en la figura 7.

Ejemplo 6 Tratamiento de capas de células endoteliales y membranas basales con heparinasa humana (b-tromboglobulina) para inhibir la extravasación de neutrófilos

Las preparaciones comerciales de b-tromboglobulina son una mezcla de las quimioquinas CTAP-III y NAP-2. A un pH no fisiológico (pH 5,8-6), estas quimioquinas tienen actividad heparinasa, mientras que a pH 7, se unen a heparina y actúan como citoquinas quimiotácticas para leucocitos. Se analizó la actividad heparinasa de preparaciones comerciales de b-tromboglobulinas a pH 5,8 y pH 7, por digestión de ECM radiactivo marcado con 35SO_{4}. Estas preparaciones mostraron actividad heparinasa humana significativa sólo a pH 5,8. Después se usaron en el sistema de ensayo de extravasación in vitro descrito en el ejemplo 5, para determinar si la actividad de heparinasa humana podría prevenir la extravasación de neutrófilos a través de una capa de células endoteliales. El tratamiento de capas de células endoteliales humanas activadas con heparinasa humana (b-tromboglobulina) dio como resultado una reducción significativa de la extravasación de neutrófilos. Estos resultados demuestran que el tratamiento con heparinasa de la vasculatura con heparinasa humana inhibiría la acumulación de neutrófilos localizada y las respuestas
inflamatorias.

Actividad de b-tromboglobulina en matrices marcadas

Se ensayó la actividad heparinasa de b-tromboglobulina comercial a pH 5,8 y a pH 7 mediante la liberación de heparina/heparán sulfato marcado con 35SO_{4} a partir de ECM. Se fraccionaron células endoteliales de córnea bovina en los pasos 1 a 8 1:10 en una placa confluente y se sembraron en placas de 4 pocillos en DMEM de bajo contenido en glucosa con un 10% de suero bovino fetal, un 5% de suero de ternero y un 4% de dextrano añadido. Las placas recibieron 1 ng/ml de bFGF 3 veces por semana antes de alcanzar la confluencia. Justo antes de alcanzar la confluencia, se añadió Na_{2}35SO_{4} en H_{2}O diluido a 1 mCi/ml con DMEM de bajo contenido en glucosa a las células a una concentración final de 25 \muCi/ml, en medio de Fisher con un 10% de suero bovino fetal, un 5% de suero de ternera y un 4% de dextrano. De 3 a 4 días después, se volvió a administrar el marcador. Las placas se dejaron en reposo de 12 a 14 días después de la confluencia. Para recoger la matriz, el medio se retiró y se reemplazó por una solución de Tritón al 0,5%, NH_{4}OH 0,02 M en PBS (sin Ca, sin Mg). Esta solución se retiró y la matriz se lavó 3 veces con PBS (sin Ca, sin Mg). Las placas se almacenaron a 4ºC y se cubrieron con PBS. Estas matrices se usaron en un
año.

Se usó b-tromboglobulina de Wellmark (producto Nº 41705) o Calbiochem (producto Nº 605165) para la digestión de ECM marcada. Se disolvieron 100 \mug de enzima en 1 ml de agua (Wellmark) o PBS (Calbiochem). Se realizó una dilución adicional en PBS a pH 5,8 o 7. Las matrices se cubrieron con 250 \mul de PBS solo o PBS con 1 o 5 \mug de \beta-tromboglobulina. Las matrices se incubaron en una incubadora de CO_{2} durante 3 horas. Se tomaron alícuotas de 100 \mul de cada pocillo y se contaron. La cantidad de radiactividad liberada de cada matriz tratada con enzima se comparó con una matriz sin tratar, y los resultados se muestran en la figura 8.

Migración de neutrófilos a través de HUVEC tratadas con \beta-tromboglobulina

Se cultivaron HUVEC en insertos de filtro y se activaron como se ha descrito en el ejemplo 5. Se aplicaron cinco \mug de \beta-tromboglobulina en PBS a pH 5,8 o PBS solo a la capa de HUVEC durante una hora. Se añadieron neutrófilos por encima de los filtros y se cuantificó el número de neutrófilos en extravasación como se describe en el ejemplo 5. En la figura 9 se muestra el efecto de los tratamientos con heparinasa humana sobre la extravasación de neutró-
filos.

Ejemplo 7 El Tratamiento de ratas con heparinasa inhibe las interacciones leucocito-célula endotelial después de la isquemia/reperfusión

Este ejemplo ilustra el efecto de la heparinasa III sobre el comportamiento de leucocitos in vivo. Se analizaron tres mecanismos clave de la acumulación de leucocitos en tejidos inflamados: rodamiento, adherencia y extravasación de leucocitos en la microvasculatura de músculo esquelético de rata después de isquemia. Se descubrió que pretratando la vasculatura con heparinasa III antes de la isquemia, y manteniendo constante la concentración en plasma de heparinasa III durante la reperfusión se reducía significativamente el rodamiento, la adherencia y la extravasación de leucocitos. Este ejemplo demuestra que el tratamiento con heparinasa de la vasculatura inhibiría la acumulación de neutrófilos en microcapilares y en los tejidos circundantes. El tratamiento con heparinasa in vivo daría como resultado la disminución de las respuestas inflamatorias. Como también demuestra este ejemplo, el tratamiento con heparinasa aumentó significativamente la perfusión microvascular en músculo reperfundido después de la isquemia. Además de la disminución de la acumulación de neutrófilos, el aumento de la perfusión microvascular afectaría positivamente a la recuperación del tejido muscular y posiblemente afectaría a las consecuencias de los sucesos de isquemia/reperfusión (es decir, inflamatorios).

Comentarios generales

Para establecer un nivel en plasma de aproximadamente 1 IU/ml, realizamos estudios piloto para ensayar el efecto de la infusión de Heparinasa durante el periodo de tiempo de 5 horas necesario para nuestros estudios in vivo. Una publicación anterior sobre el comportamiento de los leucocitos después de 3 horas de isquemia (Forbes et al., 1996, Microvascular Research 51:275-287) contiene datos sobre ratas sin tratamiento previo y con tratamiento simulado. Como los métodos y los tiempos fueron los mismos para este estudio previo y el presente estudio de 3 horas de isquemia, el efecto del tratamiento con heparinasa se comparará con los resultados sin tratamiento previo y con tratamiento simulado obtenidos a partir de los resultados publicados anteriormente. Para el protocolo de isquemia de 2 horas, se analizaron ratas adicionales sin tratamiento previo y con tratamiento simulado.

Para investigar directamente el efecto de la heparinasa in vivo, aplicamos videomicroscopía intravital al músculo extensor digitorum longus en la pata trasera de la rata. Este análisis se realizó durante un periodo de 105 o 90 minutos de reperfusión, al que siguieron 2 o 3 horas, respectivamente, sin isquemia. Dichos periodos de isquemia/reperfusión (I-R) dieron como resultado una respuesta inflamatoria en el músculo esquelético suficiente para provocar el aumento de las interacciones leucocito-célula endotelial.

Métodos

Se anestesiaron ratas Wistar macho que pesaban de 225 a 250 g por inhalación de halotano (al 1% - 1,5%) y se canularon la arteria carótida y la vena yugular para controlar la presión sanguínea y permitir la infusión de fluidos, respectivamente. El músculo extensor digitorum longus (EDL) en la pata trasera de la rata se preparó para microscopía intravital. En resumen, con la rata anestesiada tendida sobre la plataforma del microscopio, el músculo EDL se expuso por reflexión de la piel superyacente y separación de los músculos tibial anterior y gastrocnemius. Se ató una sutura alrededor del tendón distal del músculo permitiendo la reflexión del músculo en un baño salino colocado sobre la plataforma del microscopio. Se mantuvieron las temperaturas normales del músculo y del cuerpo (es decir, el músculo a 32ºC y el cuerpo a 37ºC) mediante lámparas térmicas. El músculo se cubrió con un cubreobjetos de vidrio y todo el tejido expuesto se cubrió con vendaje Sharan para evitar la deshidratación. Después de la preparación del músculo EDL para videomicroscopía intravital, y un periodo de recuperación de 30 minutos para permitir al flujo sanguíneo microvascular volver a la normalidad después de la hiperemia inducida por los métodos preparatorios, se eligieron 1-2 campos de visión que contenían cada uno dos o más vénulas capilares. Estos campos de visión se usaron durante todo el experimento de manera que pudieran medirse los cambios temporales en el comportamiento del flujo de leucocitos. Se realizaron registros de un minuto de estos campos de visión usando pocos aumentos para proporcionar información con respecto al flujo de RBC en el interior de capilares individuales. Después de los registros de pocos aumentos, se registraron vistas de las vénulas postcapilares durante 1 minuto con más aumento. Los registros en vídeo de dichas vistas permiten el análisis "independiente" de los parámetros microcirculatorios. De esta manera, se midieron los valores de control de la densidad de capilares sometidos a perfusión y el comportamiento del flujo de leucocitos (número de adherencias, rodamientos y extravasaciones por unidad de
área).

Los niveles en plasma de heparinasa III se miden usado un ELISA de heparinasa III. El ELISA de heparinasa III es un ensayo cuantitativo de sándwich de dos anticuerpos. Se aplican anticuerpos de conejo anti-heparinasa III purificados por afinidad como recubrimientos en una placa de microtitulación. Los pocillos se lavan e incuban durante 2 horas a 37ºC con tampón de bloqueo (TBS, BSA al 1% + Tween 20 al 1%). Después de 3 lavados, se añaden patrones y muestras a los pocillos y la heparinasa III presente se une con el anticuerpo inmovilizado. Después se retira por lavado cualquier sustancia no unida y se añaden a los pocillos anticuerpos de conejo anti-heparinasa III marcados con biotina. Los anticuerpos en exceso se retiran por lavado. Se añade estreptavidina conjugada con peroxidasa y se une a cualquier complejo de biotina presente en el pocillo. Después de retirar por lavado la estreptavidina sin reaccionar, se añade una solución de sustrato que contiene peróxido de hidrógeno y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina en DMF acuosa a los pocillos, de acuerdo con el procedimiento descrito para el kit TMB Peroxidase EIA Substrate (Biorad, CA), y el color se revela en proporción con la cantidad de heparinasa III en la muestra. Una solución de H_{2}SO_{4} 1 N detiene la reacción y la absorbancia se mide a 450 nm.

Protocolo específico

Una serie de ratas se sometió a infusión con heparinasa III a través del catéter venoso a una velocidad de 3 ml/h durante 5 horas para mantener un nivel de heparinasa de 1,0 IU/ml en la sangre. Por medio de estos estudios piloto se determinó que 0,33 IU/g de peso corporal/h eran adecuados para este fin.

Se registró el flujo sanguíneo microvascular y el comportamiento de los leucocitos cada 15 minutos durante un total de 90 a 105 minutos de reperfusión. Se tomaron muestras de sangre antes de la administración de heparinasa y durante la reperfusión para asegurar que se conseguían concentraciones correctas de heparinasa en plasma.

Análisis estadístico

En todos los casos, las medias se expresan con su error típico estimado. Las comparaciones se realizaron usando un análisis de varianza (ANOVA) seguido, cuando fue apropiado, de ensayos de Scheffé como análisis ad hoc. Se asumió que el resultado era significativo a p>0,05.

Resultados

Se consiguió una concentración en plasma de aproximadamente 1 IU/ml (ajustado para la actividad) durante la infusión, y a pesar de una tendencia hacia el aumento de los niveles en plasma durante las últimas 2 horas de infusión, la concentración en plasma se mantuvo constante (figura 10). La infusión prolongada de heparinasa III parecía no tener efectos secundarios negativos al menos en términos de la presión sanguínea o ritmo respiratorio.

Inmediatamente después de 3 horas de isquemia, el número de leucocitos rodantes (Lr) aumentó significativamente en ratas sometidas a I-R simulada (14,77 \pm 1,33), en comparación con ratas sin tratamiento previo (sin I-R) (5,66 \pm 0,11). El número medio de leucocitos rodantes permaneció constante a estos niveles durante la reperfusión tanto en las ratas sometidas al tratamiento simulado como en las ratas sin tratamiento previo para la duración del periodo de reperfusión de 90 minutos (figura 3). A pesar de las 3 horas de isquemia, no se midió ningún cambio en el rodamiento de leucocitos dentro de vénulas postcapilares de ratas tratadas con heparinasa III. De hecho, el número medio de leucocitos rodantes después del tratamiento con heparinasa (2,81 \pm 0,64) tendía a ser menor que en ratas sin tratamiento previo durante el periodo de observación de 90 minutos (figura 11).

El número de leucocitos adheridos a la pared de vénulas postcapilares (Ls) aumentó progresivamente en ratas sometidas a I-R simulada, alcanzando un nivel constante (11,96 \pm 0,01) en los 45 minutos posteriores a la liberación del torniquete (3 horas de isquemia). Sin embargo, el número de leucocitos adheridos en ratas tratadas con heparinasa III no mostró ningún cambio después de la isquemia, y no fue significativamente diferente de las ratas sin tratamiento previo (figura 12).

Como sería de esperar basándose en los bajos números de leucocitos adherentes después del tratamiento con heparinasa III, el número de leucocitos extravasado (Le) no cambió durante la reperfusión después de 3 horas de isquemia (figura 13). Los Le de ratas con tratamiento simulado y sin tratamiento previo no están disponibles para el protocolo de isquemia de 3 horas. Para un protocolo de isquemia de 2 horas, los Le para las ratas tratadas con heparinasa III fueron más que para ratas sin tratamiento previo, pero significativamente menos que los Le en los animales con tratamiento simulado. Estos datos se representan en la figura 14, como la diferencia en porcentaje en los Le para las ratas tratadas con heparinasa y con tratamiento simulado frente a ratas sin tratamiento previo.

Después de la liberación del torniquete después de 3 horas de isquemia, tuvo lugar una disminución significativa de la perfusión microvascular (CDper) tanto en ratas con tratamiento simulado como en ratas tratadas con heparinasa III, en comparación con la perfusión medida en ratas sin tratamiento previo. Sin embargo, a diferencia de la perfusión en ratas con tratamiento simulado, la perfusión microvascular en los músculos tratados con heparinasa III volvió a la normalidad a los 30 minutos de la liberación del torniquete (figura 15).

Ejemplo 8 Efectos cardioprotectores de heparinasa III en una preparación de conejo de lesión por isquemia/reperfusión Introducción

La isquemia produce un grado significativo de lesión al nivel de los miocitos y células endoteliales dentro del lecho vascular coronario; esto puede conducir a la extravasación del plasma y de otros componentes sanguíneos y celulares al espacio intersticial. Los leucocitos polimorfonucleares pueden migrar a través de la capa de células endoteliales; esta migración de neutrófilos a través de la barrera de tejido conectivo depende de las acciones de los enzimas proteolíticos derivados de neutrófilos incluso en presencia de antiproteasas plasmáticas. La restauración del flujo sanguíneo permite un acceso rápido de las células inflamatorias al miocardio en peligro. La adhesión de neutrófilos a células endoteliales está estimulada por la endotoxina IL-1b (activa el endotelio vascular para producir moléculas de adherencia para leucocitos) o por el factor de necrosis tumoral. Varios estudios han explorado la posibilidad de usar diversas intervenciones farmacológicas incluyendo anticuerpos monoclonales para prevenir la adhesión de neutrófilos a células vasculares o miocárdicas particularmente durante la fase de reperfusión. Se ha demostrado que la interferencia con las interacciones neutrófilo-célula (rodamiento, adhesión y extravasación de neutrófilos) reduce significativamente el grado de lesión celular después de una isquemia-reperfusión. Esto sugiere que las células inflamatorias juegan un papel importante en la patofisiología de la lesión celular inducida por isquemia; las células inflamatorias también pueden jugar un papel en la extensión de la lesión de los miocitos más allá de lo que ocurre durante el ataque isquémico (es decir, lesión por reperfusión). Como el tratamiento con heparinasa es eficaz para inhibir las interacciones neutrófilo-endotelio (véanse los ejemplos anteriores), se investigó la prevención de la lesión por reperfusión en miocardio de conejo por tratamiento con heparinasa en los experimentos descritos en este ejemplo. Se descubrió que la heparinasa III atenuaba el grado de la necrosis de tejidos cuando se administraba a una dosis diana de 25 \mug/ml antes del comienzo de la oclusión coronaria o en el comienzo de la reperfusión. Dosificaciones menores de heparinasa III no proporcionaron cardioprotección en esta preparación animal de lesión por isquemia-reperfusión; sin embargo, a una dosis diana de 5 \mug/ml hubo una tendencia hacia la reducción del tamaño del infarto. Se obtuvo protección sin cambios significativos en la hemodinámica cardíaca o en la distribución del flujo sanguíneo
transmural.

Cuando una respuesta inflamatoria es el resultado de un episodio isquémico como en los ejemplos no limitantes de ataque cardíaco y apoplejía, este ejemplo demuestra que el tratamiento con heparinasa antes o en el momento del suceso inflamatorio puede reducir la lesión de los tejidos. Además, este ejemplo indica que la lesión tisular resultante de la acumulación de leucocitos durante cualquier suceso inflamatorio puede reducirse por tratamiento o pretratamiento con heparinasa.

Métodos

Para estos estudios se usaron conejos New Zealand White macho (2,2-3,0 kg de peso corporal). Los conejos se cuidaron de acuerdo con la Guide to the Care and Use of Experimental Animals (vol. 1 y 2) del Canadian Council on Animal Care. Se premedicaron con maleato de acepromazina intramuscular (5 mg/kg; Austin Laboratories) y se anestesiaron con pentobarbital sódico (25 mg/kg; i.v.; MTC Pharmaceuticals). Se administró más anestésico cada hora. La tráquea se canuló y los conejos se ventilaron mecánicamente con aire ambiente. La vena yugular derecha se canuló para la administración de fármacos (heparinasa III o vehículo); la vena yugular izquierda se canuló para permitir la extracción de sangre para determinar los niveles de heparinasa en plasma. Se puso una cánula (PE-90) en la arteria carótida izquierda para la extracción de sangre arterial de referencia durante la inyección de microesferas radiomarcadas.

El corazón se expuso mediante una toracotomía izquierda y se ató un lazo (seda 4-0) alrededor de la primera rama anterolateral de la arteria coronaria circunfleja izquierda a medio camino entre el canal atrioventricular y el vértice. La sutura de seda se pasó a través de la longitud de un tubo Tygon para proporcionar un lazo para la oclusión coronaria. La presión de la cámara ventricular izquierda se obtuvo con un catéter lleno de fluido colocado a través del vértice. Se dejó que la hemodinámica cardíaca se estabilizara durante 20 minutos.

Se indujo isquemia de miocardio regional tirando de la sutura a través del tubo de plástico y sujetándola con un hemostato de mosquito. La isquemia se verificó visualmente por la aparición de cianosis epicárdica regional y elevación del segmento ST en el electrocardiograma (derivación II). En corazones que desarrollan fibrilación ventricular, se restauró el ritmo sinusal normal mediante un masaje suave del LV (no se usó cardioversión eléctrica en estos experimentos); los corazones que no pudieron cardiovertirse después de dos intentos se excluyeron del análisis de datos. A lo largo de los experimentos se registraron el electrocardiograma de derivación II y la presión LV con un registrador fisiográfico de 4 canales Gould (TA240) EasyGraph (Interfax Inc., Montreal, Quebec).

Protocolo experimental

Se asignaron conejos a siete grupos de tratamiento diferentes; a los conejos del grupo 1 se les dio solución salina (i.v.) durante 60 minutos antes del comienzo de la isquemia; a los conejos del grupo 2 se les dio solución salina (i.v.) al comienzo de la reperfusión coronaria; a los conejos del grupo 3 se les dio heparinasa III (nivel diana de 25 \mug/ml, i.v.) durante 60 minutos antes del comienzo de la isquemia; a los conejos del grupo 4 se les dio heparinasa III (nivel diana de 25 \mug/ml, i.v.) al comienzo de la reperfusión coronaria; a los conejos de los grupos 5, 6 y 7 se les administraron niveles diana de 0,25, 1,25 o 5,0 (g/ml de heparinasa III, respectivamente, al comienzo de la reperfusión coronaria. Se infundió fármaco o solución salina por vía intravenosa (4,0 ml/h) durante 60 minutos antes del comienzo de la isquemia de miocardio en dos grupos de tratamiento (grupos 1 y 3) y después de manera continua durante 2 horas usando una bomba de infusión Harvard (Ealing Scientific, Montreal, Canadá). En los demás grupos experimentales, la infusión de vehículo o fármaco se inició en el momento de la reperfusión y se continuó durante 3 horas durante la reperfusión. Los conejos se asignaron a un grupo particular rotando el tratamiento con fármaco en experimentos sucesivos a través de los siete protocolos de tratamiento. Todos los conejos se sometieron a 45 minutos de oclusión coronaria regional seguida de 180 minutos de reperfusión.

Determinaciones de heparinasa III en plasma

Se obtuvieron muestras de sangre de la vena yugular derecha al comienzo de la medición, 30 y 60 minutos después de la infusión del vehículo o de fármaco en los conejos del grupo 1 y 3; y también se obtuvo sangre a los 15, 30, 60, 120 y 180 minutos de reperfusión coronaria. En los demás grupos experimentales se obtuvieron al inicio y a los 15, 30, 60, 120 y 180 minutos de reperfusión coronaria. Las muestras de sangre se centrifugaron durante 15 minutos a 1500 rpm a 4ºC; el plasma se congeló y se almacenó a -20ºC para análisis posterior. Los niveles de heparinasa III en plasma se determinaron como se ha descrito en el ejemplo 7.

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Flujo sanguíneo transmural

Se midió el flujo sanguíneo en lechos vasculares isquémicos y no isquémicos usando microesferas radiomarcadas (\pm 15 \mum; NEN, Boston, MA) usando la técnica de extracción de referencia. Para cada medida del flujo sanguíneo, se inyectaron 0,4-0,6 x 10^{6} microesferas marcadas con 113Sn, 46Sc o 85Sr (agitadas mecánicamente con un mezclador vorticial inmediatamente antes de su uso) a la aurícula izquierda en condiciones hemodinámicas estacionarias seguido de dos lavados abundantes con 3 ml de solución salina templada (la inyección de microesferas en la aurícula izquierda asegura la mezcla adecuada en la cámara LV y evita los artefactos de flujo que se producen con las inyecciones directas de microesferas en la circulación coronaria). Se recogieron muestras de sangre arterial de referencia de la arteria carótida empezando 10 segundos antes de la inyección de las microesferas y continuando durante 2 minutos posteriormente a una velocidad de 2,6 ml/minuto. La distribución del flujo sanguíneo miocárdico se evaluó a: 1- al principio, 2- 30 minutos después del comienzo de la reperfusión coronaria y 3- a los 180 minutos de la reperfusión coronaria. Se mide la radiactividad del tejido y de la sangre de referencia usando un analizador multicanal de altura de pulsos (Cobra II, Canberra Packard) con corrección para el solapamiento de los espectros de
isótopos.

Análisis del tamaño del infarto

Al final del protocolo experimental, los corazones se detuvieron en diástole mediante inyección intravenosa de 10 ml de cloruro potásico saturado, se extirparon rápidamente, se aclararon con solución salina y se canularon a través de la aorta en un aparato de perfusión Langendorff. Los corazones se perfundieron ex vivo a través de la aorta a 75 mm Hg con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio a 37ºC durante 20 minutos. Posteriormente se volvió a atar la sutura arterial y se inyectó Monastral Blue de manera retrógrada a través de la cánula aórtica para permitir la delineación de la zona anatómica de riesgo. Después, los corazones se retiraron del aparto de perfusión, se quitaron las aurículas y el ventrículo derecho y el ventrículo izquierdo se pesó y se fijó por inmersión en formalina al 10%
tamponada.

Estudios Post-mortem

El principal criterio de valoración de este estudio fue el efecto del tratamiento con el fármaco sobre el tamaño del infarto (normalizado con respecto a la zona de riesgo anatómica), evaluado usando tinción con tetrazolio. Los corazones se seccionaron en cortes de 2 mm y se trazaron el perfil de los cortes LV y las zonas negativas a tetrazolio (es decir, infartadas) en láminas transparentes de acetato. La zona anatómica de riesgo se delineó por la ausencia de colorante azul de Monastral y se trazó sobre láminas transparentes de acetato. Los infartos se normalizaron con respecto al tamaño de la zona de riesgo anatómica para cada corazón. Se determinó el área transversal de LV, el área de riesgo y el área de infarto a partir de trazos ampliados (1,5X) por planimetría computerizada (Sigma Scan; Jandel Scientific Inc., Calif.) usando un Summagraphics Summasketch Plus Bitpad conectado a un ordenador IBM PS/2. El volumen de riesgo, el volumen de infarto y el volumen de LV para cada corte se calculó como la suma del área obtenida por planimetría computerizada y el espesor de cada corte de ventrículo. Los valores de los cortes secuenciales se sumaron para proporcionar el volumen total del LV, zona de riesgo y zona de infarto.

Análisis de datos

Se examinaron las diferencias en los datos hemodinámicas antes y después de la oclusión coronaria usando ANOVA de una vía. Se usó el producto de ritmo cardíaco-presión sanguínea como índice para la demanda metabólica cardíaca. Se compararon el volumen de infarto, el volumen de riesgo, el tamaño del infarto y el volumen de LV mediante un ANOVA de una vía. Cuando se detectaron diferencias generales en el grupo, se usó un ensayo de comparación múltiple de Dunnett para comparación con los controles. Todas las comparaciones estadísticas se realizaron con programas de sistemas de análisis estadísticos (SAS Institute, Cary, NC) para el ordenador personal. Un nivel de probabilidad (p) de menos de 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Para establecer el tamaño de muestra para este estudio, se calcularon los valores "n/grupo" para proporcionar una potencia de 0,90 para detectar una reducción mínima del 15 por ciento (desviación típica esperada del 8%) del tamaño del
infarto.

Resultados

En los estudios de la presente invención se utilizaron ciento treinta conejos; cinco conejos murieron debido a insuficiencia respiratoria (n = 1), error quirúrgico (n = 1) o fibrilación ventricular no convertible (n = 3). Se incluyeron treinta y seis conejos en los estudios de dosis-respuesta y otros 28 se asignaron a las evaluaciones biomédicas (se incluyeron hemodinámica cardíaca y niveles de heparinasa III en plasma en el análisis estadístico global). Por consiguiente, se incluyeron sesenta y un conejos en los análisis de datos del tamaño del infarto.

Las variables hemodinámicas cardíacas se resumen en la tabla 1. El ritmo cardíaco, las presiones sistólica y diastólica del ventrículo izquierdo y el producto de ritmo cardíaco-presión sanguínea (indicador de la demanda de oxígeno del miocardio) antes del comienzo de la oclusión coronaria fueron comparables para todos los grupos de tratamiento. El producto ritmo cardíaco-presión sanguínea (figura 16) parecía ser mayor a los 60 minutos de reperfusión en conejos tratados con heparinasa III (nivel diana de 25 \mug/ml) en el momento de la reperfusión (grupo 4); sin embargo, la hemodinámica cardíaca fue similar para todos los animales al final del estudio.

En la tabla 3 se resumen los datos de peso del ventrículo izquierdo, volumen de infarto y de riesgo, tamaño del infarto y área anatómica de riesgo como un porcentaje del volumen de LV. El tamaño del infarto (figura 17), normalizado con respecto al tamaño de la zona de riesgo, fue del 42,3 \pm 4,8 (media \pm 1 SD) y del 40,0 \pm 5,3 por ciento (p = NS) en los controles con/sin pre-tratamiento con vehículo, respectivamente. El pretratamiento con heparinasa III y la heparinasa III administrada en el momento de la reperfusión al nivel diana de 25 \mug/ml dieron como resultado una reducción significativa (p = 0,01 frente a los controles tratados con vehículo) en la necrosis de miocitos de 26,1 \pm 5,2 y de 24,7 \pm 5,1 por ciento, respectivamente; no hubo diferencias detectables entre los grupos tratados antes de la isquemia o en el momento de la reperfusión coronaria. El tratamiento con heparinasa III a niveles diana de 0,25, 1,25 o 5,0 \mug/ml no limitó el tamaño del infarto; fueron del 42,8 \pm 6,5, 39,1 \pm 5,4 y 37,9 \pm 4,6 por ciento, respectivamente. Hubo una ligera tendencia hacia infartos más pequeños en el grupo de tratamiento con 5,0 \mug/ml con un valor de p de 0,066.

En la figura 18 se muestran los niveles inyectables de heparinasa III que se administraron a los grupos de tratamiento respectivos. Se investigó la dosis diana de heparinasa III inicial (es decir, la dosis terapéutica) de 25 \mug/ml seguido de las diluciones del fármaco respectivas de 1:5, 1:20 y 1:100; las diluciones se realizaron con solución salina. En la figura 19 se muestra el transcurso a lo largo del tiempo de las concentraciones reales de heparinasa III en plasma; el pre-tratamiento con heparinasa III y el tratamiento en el momento de la reperfusión proporcionaron concentraciones similares del fármaco en plasma en los grupos 3 y 4. Las concentraciones de heparinasa III en plasma fueron considerablemente menores después de 3 horas de reperfusión coronaria en conejos que inicialmente se habían pre-tratado (sólo con fármaco administrado durante las 3 primeras horas del protocolo experimental); lo que es más importante, el fármaco estaba presente en el momento de la reperfusión coronaria. Esto puede responder de los resultados similares obtenidos en los grupos 3 y 4 con respecto al tamaño del infarto.

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TABLA 1 Resumen de la hemodinámica cardíaca

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1

2

Los valores son medias \pm 1 SD. HR = ritmo cardíaco; LVPsis = presión sistólica en la cámara ventricular izquierda; LVPdias = presión diastólica en la cámara ventricular izquierda; RPP = producto ritmo cardíaco-presión sanguínea.

TABLA 2 Flujo sanguíneo miocárdico en lechos de perfusión isquémicos y no isquémicos

3

Los valores son medidas \pm 1 SD. 1p (0,05 frente al grupo 6). BASE = medida de flujo inicial (es decir, antes de la isquemia); RP = reperfusión coronaria. Los datos se expresan en ml/min/g de peso húmedo.

TABLA 3 Medidas del tamaño del infarto

4

Los valores son medidas \pm 1 SD. ^{1}p (0,05 frente a los controles). Htwt = peso ventricular; AN = área de necrosis; AR = área de riesgo; ANAR = área de necrosis normalizada con respeto al área anatómica de riesgo; ARLV = zona de riesgo normalizada con respeto al área de LV total.

Estos datos indican la utilidad de las composiciones que contienen heparinasa para disminuir las respuestas inflamatorias localizadas.

Claims

1. El uso de un enzima heparinasa en la preparación de un medicamento para administración intravascular para reducir las respuestas inflamatorias localizadas debidas a una lesión por isquemia/reperfusión en el tejido de un paciente.

2. El uso de la reivindicación 1, donde dicho enzima heparinasa se sobreexpresa a partir de una secuencia de nucleótidos recombinante, en Flavobacterium heparinum o Escherichia coli.

3. El uso de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, donde dicho enzima heparinasa es heparinasa III.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la lesión por isquemia/reperfusión es infarto de miocardio, apoplejía, trasplante de órganos, choque o cirugía de bypass cardiopulmonar.