ES2227220T3 - 2-arachidonylglycerol (2-ag) - inhibidor de factor de necrosis tumoral alfa y neuroprotector cerebral en traumatismo craneoencefalico cerrado. - Google Patents

Abstract

La utilización de 2-araquidonilglicerol (2-AG) en la fabricación de una composición farmacéutica para la reducción de edemas y déficits neurológicos producidos por traumatismos craneoencefálicos cerrados.

Description

2-araquidonilglicerol (2-AG)-inhibidor de factor de necrosis tumoral \alpha y neuroprotector cerebral en traumatismo craneoencefálico cerrado.

Esta invención se refiere a la utilización del 2-araquidonilglicerol (2-AG) como inhibidor de un factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha) y para la reducción tanto de los edemas como de los déficits neurológicos producidos por traumatismo craneoencefálico cerrado.

Se han identificado y estudiado exhaustivamente dos tipos de cannabinoides endógenos: la araquidoniletanolamida (anandamida) y el 2-araquidonilglicerol (2-AG) (Mechoulam y Ben-shabat, 1999). Aunque estos endocannabinoides, en particular la anandamida, han sido objeto de estudio en varios sistemas, sus funciones fisiológicas todavía no están claras (Mechoulam et al., 1998). Teniendo en cuenta las propiedades anti-inflamatorias tanto de los cannabinoides sintéticos como de aquellos derivados de plantas, por una parte, y la presencia de endocannabinoides y receptores de cannabinoides en órganos asociados con la regulación inmune, por otra, al sistema cannabinoide endógeno se le ha atribuido una probable función anti-inflamatoria. Ciertamente, la anandamida ha demostrado tener efectos anti-inflamatorios (Molina-Holgado et al., 1997) y el 2-AG inhibe la producción de interleuquina-2 mediante la reducción (down-regulation) del factor nuclear de las células T activarlas (Ouyang et al., 1998).

El factor de necrosis tumoral-\alpha (TNF-\alpha) está implicado en la patogénesis de diversos procesos inmunes y es el mediador clave en el choque séptico (Tracey y Cerami 1993). En animales de experimentación esta citoquina es liberada principalmente por células fagocíticas mononucleares en respuesta a la inyección de lipopolisacárido (LPS, una endotoxina derivada de las bacterias Gram negativas). El TNF-\alpha afecta tanto al sistema nervioso central como al periférico. Produce fiebre, malestar, anorexia, descarga simpática y estimulación de las hormonas de la pituitaria. En las neuronas también puede inducir la muerte celular programada. Se ha puesto de manifiesto que el TNF-\alpha circulante y otras citoquinas se transportan al cerebro y afectan a su función. El TNF-\alpha se puede sintetizar en el cerebro in situ, principalmente por las microglías pero también por astrocitos, neuronas y células endoteliales. La actividad del TNF-\alpha puede ser inducida mediante traumatismo craneoencefálico traumático o isquémico (Newton y Decicco, 1999 y ref. citadas) y juega un papel doble en la patofisiología de estas lesiones (Shohami et al. 1999).

Puesto que el TNF-\alpha es un importante mediador inflamatorio, la inhibición de su producción por cualquier constituyente del organismo puede reflejar un papel de tales ligandos endógenos en los procesos anti-inflamatorios de un tejido vivo. Recientemente hemos puesto de manifiesto que el 2-AG inhibe la producción del TNF-\alpha tanto en macrófagos murinos in vitro como en ratones.

Teniendo en cuenta que los cannabinoides han mostrado propiedades antioxidativas (Mechoulam et al., 1998), también hemos investigado la acción del 2-AG sobre la formación de intermediarios reactivos de oxígeno (ROI). Se trata de compuestos de gran toxicidad que se forman en multitud d e reacciones biológicas.

Hemos investigado el efecto de diferentes concentraciones de 2-AG (0,05-50 \mug/ml) sobre la producción del TNF-\alpha y sobre la generación de óxido nítrico por los macrófagos. Se eligió a este tipo de células debido a su versatilidad, ya que participan de forma muy activa en funciones innatas e inmunes. Fagocitan, ingieren y destruyen muchos agentes infecciosos y actúan como células efectoras en respuestas inmunes tanto humorales como celulares. Sin embargo, los macrófagos también pueden causar una gran diversidad de enfermedades inflamatorias.

Los macrófagos peritoneales de ratón (obtenidos de ratones C57BL/6) se incubaron in vitro con varias concentraciones de 2-AG, en combinación bien con LPS, que activa la producción del TNF-\alpha, o con LPS e IFN\gamma, que desencadenan conjuntamente la generación de óxido nítrico. Los ensayos de exclusión de colorantes azul tripano o eritrosina B demostraron que el 2-AG no era tóxico para los macrófagos en el rango estudiado de concentraciones (50 \mug/ml-0.5 \mug/ml). La producción de TNF-\alpha se determinó mediante bioensayo utilizando células BALB/c CL.7 como células diana (Gallily et al., 1997).

La formación de ROI por los macrófagos se determinó mediante un ensayo de reacción quimioluminiscente amplificada por luminol (empleando biolumate LB 85, Belhold, Wildbad, Germany (Avron y Gallily, 1995)).

Para determinar el efecto del 2-AG sobre los niveles de TNF-\alpha en el suero de ratones tratados con LPS, a unos ratones C57BL/6 hembras, de 9-11 semanas de edad y que pesaban 20-23 g., se les inyectó i.p. bien 5 mg/kg de LPS, o una combinación de LPS (5 mg/kg) y 2-AG (10 mg/kg), o de LPS (5 mg/kg), 2-AG (1 mg/kg), 2-linoleoilglicerol (2-LinoG) (10 mg/kg) y 2-palmitoilglicerol (2-PalmG) (5 mg/kg). A los 90 min se extrajo sangre de los ratones y se efectuó el bioensayo de la actividad (título) del TNF-\alpha del suero, según se ha descrito anteriormente.

En la Fig. 1A se muestra una inhibición dosis-respuesta del TNF-\alpha por 2-AG in vitro. Se observó una inhibición del 97% y del 90% con unas concentraciones de 50 y 10 \mug/ml, respectivamente. Incluso con concentraciones de 0,1 \mug/ml de 2-AG, todavía se aprecia un 50% de inhibición de la producción de \mug/ml. Por otro lado, después de añadir unas concentraciones de 2-AG de 50 \mug/ml-0.05 \mug/ml a los cultivos de macrófagos, ni el LPS ni el IFN\gamma detuvieron la generación de óxido nítrico. Ésta se determinó midiendo el nitrito acumulado en los sobrenadantes de los macrófagos tratados, utilizando el reactivo de Griess (datos no mostrados).

Tal y como se determinó mediante quimioluminiscencia, el tratamiento de los macrófagos con 25 \mug/ml de 2-AG detenía la producción de ROI inducida por Zymosan en más de un 85% después de 40 min (Fig. 1B).

También se observó la inhibición de la producción de TNF-\alpha en ratones (Tabla 1).

TABLA 1 Suspensión de la producción del TNF-\alpha in vivo por 2-AG

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \begin{minipage}{140mm}Tres grupos de ratones hembra
C57BL/6 fueron inyectados (i.p.) bien sólo con  LPS (grupo 3), con
2-AG y LPS (grupo 1) o con una mezcla de
2-AG, 2-PalmG, 
2-LinoG y LPS (grupo 2) con las dosis indicadas en
la
Tabla.\end{minipage} \cr}

Se observó un 73% de inhibición del TNF-\alpha cuando el 2-AG (10 mg/kg) se administraba conjuntamente con LPS. La co-administración del LPS con el AG (1 mg/kg), el 2-LinoG (10 mg/kg) y el 2-PalmG (5 mg/kg) inhibió casi totalmente la producción del TNF-\alpha en 4 de los 5 ratones (95%). Anteriormente habíamos mostrado que el 2-LinoG y el 2-PalmG, que van asociados al 2-AG en el organismo, estimulan la actividad de éste aunque se mostraran inactivos en numerosos ensayos in vivo e in vitro (incluyendo la unión a los receptores de cannabinoides) (Ben-Shabat et al., 1998). Esta estimulación, a la que hemos denominado "efecto séquito", también se ha observado aquí. El 2-AG (1 mg/kg) fue más activo en presencia de los compuestos "séquito" que cuando actuaba solo a una dosis mucho más elevada, de 10 mg/kg (Tabla 1).

Se ha demostrado que diversos cannabinoides, tanto sintéticos como derivados de plantas, reducen la producción de citoquinas inflamatorias y óxido nítrico. La anandamida también inhibe la producción de TNF-\alpha (en astrocitos), aunque su efecto sea relativamente moderado (Molina-Holgado et al., 1997). Al contrario de lo que ocurre en los resultados referidos aquí relativos al efecto del 2-AG sobre los macrófagos, la anandamida también bloqueaba la liberación de óxido nítrico por los astrocitos.

Teniendo en cuenta que el traumatismo craneoencefálico está asociado a procesos inflamatorios, decidimos evaluar la posibilidad de que el 2-AG pudiera ser un agente neuroprotector. Hemos observado que la producción del 2-AG en el cerebro se incrementa después de un traumatismo craneoencefálico cerrado. Esta observación posiblemente pueda indicar que la liberación de 2-AG forme parte del mecanismo neuroprotector endógeno del cerebro.

Una de las manifestaciones del traumatismo craneoencefálico es la muerte celular neuronal, que se manifiesta de forma clara por la presencia de un infarto alrededor del lugar donde se produce la lesión. Los ratones fueron tratados con 2-AG (5 mg/kg) o con el vehículo, decapitados a las 24 horas y sus cerebros fueron examinados para determinar los cambios producidos en la dimensión del infarto. La dimensión del infarto se redujo en los ratones tratados con 2-AG, en comparación con aquellos que fueron tratados con el vehículo (5,6 \pm 1,2% frente a 9,9 \pm 1,6%, del volumen total del cerebro respectivamente; p=0,053). No se apreció ningún infarto en ratas intactas (datos no mostrados).

Hemos analizado el efecto del 2-AG en un modelo animal de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) que ha sido desarrollado en nuestro laboratorio (Chen et al. 1996). En este modelo, que emula muchas características clínicas del traumatismo craneoencefálico clínico, la formación de edema y el perjuicio en las funciones motoras se encuentran entre algunos de los efectos típicos de incapacitación que se manifiestan en el traumatismo. En consecuencia, analizamos el efecto del tratamiento con el 2-AG sobre estos dos parámetros después de un CHI.

Los ratones fueron sometidos a CHI bajo anestesia con éter, utilizando nuestro dispositivo weight-drop, y la severidad del traumatismo se analizó según la Calificación de Severidad Neurológica (Neurological Severity Score (NSS)). También se evaluó la función motora y los reflejos de los ratones con traumatismo a las 24 h del CHI. Se adjudicó un punto cada vez que había ausencia de un reflejo analizado o incapacidad para ejecutar alguna tarea. Se empleó un método de puntuación acumulada, de tal manera que el NSS pudiese tener un rango desde 0 (realización de todas las tareas con éxito) hasta 10 (fracaso en todas las tareas). Las series de tareas se han descrito en detalle en publicaciones previas (Chen et al. 1996) y recientemente han sido modificadas para incluir sólo 10 medidas diferentes, tal y como se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2 Severidad neurológica para los ratones con traumatismo craneoencefálico

Tarea	NSS
Presencia de mono- o hemiparesis	1
Incapacidad para andar sobre una viga de 3 cm de ancho	1
Incapacidad para andar sobre una viga de 2 cm de ancho	1
Incapacidad para andar sobre una viga de 1 cm de ancho	1
Incapacidad para mantener el equilibrio sobre una viga de 1 cm de ancho	1
Incapacidad para mantener el equilibrio sobre un palo redondo (0,5 cm de ancho)	1
No salir de un círculo de 30 cm diámetro (en 2 min)	1
Incapacidad para caminar recto	1
Pérdida del comportamiento asustadizo	1
Pérdida del comportamiento de búsqueda	1
Total máximo	10
Se adjudica un punto por cada fallo al realizar una tarea. NSS a 1 h en el rango de 7-10: CHI grave.

Calificación de Severidad Neurológica (Neurological Severity Store (NSS))

Un grupo de análisis funcionales que es la base para la evaluación del estado clínico de los ratones después del CHI. Se adjudica un punto por cada fallo al realizar una tarea. A mayor puntuación, mayor severidad de traumatismo.

1 hora y 24 horas después de la lesión se determinaron las puntuaciones NSS en los animales traumatizados, y las diferencias entre estos valores representan la recuperación. 24 h después de CHI se decapitó a los ratones, se extrajeron sus cerebros y se evaluó el edema mediante la determinación del contenido de agua en el tejido, utilizando para ello la relación entre el peso húmedo (WW) y el peso seco (DW): %H_{2}O=[(WW-DW) x 100]/WW. El tratamiento con el 2-AG se administró 15 min ó 1 h después del CHI, con tres dosis (1, 5 y 10 mg/kg), y los ratones control se inyectaron a los mismos tiempos con el vehículo. El medicamento se inyectó subcutáneamente (s.c.) o por vía intravenosa (i.v.).

Pudimos comprobar que cuando se inyectaba el 2-AG 15 min ó 1 hora después de CHI (en dosis de 1 mg/kg y 5 mg/kg, pero no de 10 mg/kg), se reducía el edema significativamente con respecto a los controles (Figuras 2 y 3). Este efecto fue más pronunciado en el caso de la inyección intravenosa que en el de la subcutánea. También observamos que la administración del 2-AG mejoraba sustancialmente la recuperación clínica (en base a la calificación NSS). De nuevo la administración i.v. condujo a una mejor recuperación que la administración s.c. (Figuras 4 y 5). La administración del 2-AG (1 mg) junto con 2-LinoG (10 mg/kg) y 2-PalmG (5 mg/kg) incrementaba su potencia hasta ser ésta casi el doble que cuando se administraba el 2-AG sólo (1 mg/kg).

El presente informe es el primero que pone de manifiesto el efecto del constituyente endógeno 2-AG del cerebro y del sistema periférico sobre el TNF-\alpha. El 2-AG, que no resulta tóxico para los macrófagos en dosis de hasta 50 \mug/ml, inhibió la formación de TNF-\alpha. También suprime in vivo la producción de TNF-\alpha. Asimismo se apreció una reducción de la producción de ROI por los macrófagos. Pudimos observar adicionalmente que la administración de 2-AG reduce el edema y favorece la recuperación clínica de los ratones sometidos a un traumatismo craneoencefálico cerrado.

La presente invención consiste, por lo tanto, en la utilización de 2-araquidonilglicerol (2-AG) p ara la fabricación de compuestos farmacéuticos con función inhibidora de un factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha) y para la reducción tanto de edema como de déficits neurológicos producidos por traumatismo craneoencefálico cerrado.

Según la presente invención, la nueva composición farmacéutica contiene 2-AG y 2-linoleoilglicerol y/o 2-palmitoilglicerol como componentes activos adicionales.

Las composiciones de la presente invención son particularmente efectivas para aliviar, o incluso prevenir, la neurotoxicidad originada por lesiones severas en el sistema nervioso central (CNS), tales como: lesiones producidas por ataques de apoplejía prolongados, suministro de sangre reducido o limitado, supresión del suministro de glucosa y trauma mecánico. Las presentes composiciones también son efectivas para aliviar otros daños en el CNS, como las convulsiones inducidas por envenenamiento, que se consideran asociadas a receptores de aminoácidos.

Las composiciones de la presente invención también pueden ser efectivas para el tratamiento de determinadas enfermedades degenerativas crónicas que están caracterizadas por una pérdida neuronal gradual y selectiva. A este respecto, las composiciones de la presente invención se contemplan como remedios efectivos terapéuticamente en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Las presentes composiciones son de valor especial en crisis epilépticas de tipo tónico-clónico, daños globales hipóxico-isquémicos, hipoxia, sola o acompañada de una disminución del aporte de sangre (isquemia), o también en casos de paro cardíaco y de oclusión abrupta de las arterias cerebrales (apoplejía).

La composición farmacéutica, de acuerdo con la presente invención, puede contener compuestos activos adicionales y/o un excipiente farmacéutico apropiado, un solvente, diluyentes, un sólido, etc.

Las composiciones sólidas para la administración oral, tales como pastillas, píldoras, cápsulas o similares, se pueden preparar mezclando el ingrediente activo con ingredientes convencionales aprobados en farmacología, como son el almidón de maíz, la lactosa, la sacarosa, el sorbitol, el talco, el ácido esteárico, el estearato de magnesio, el fosfato bicálcico o las gomas, utilizando diluyentes aprobados en farmacología. Las pastillas o píldoras se pueden cubrir o confeccionar de cualquier otra forma con materiales aprobados en farmacología y que se utilizan para conseguir una forma de dosificación que permita una acción prolongada o su liberación continua. Se pueden preparar otras composiciones sólidas en forma de supositorios para su administración rectal. O también en formas líquidas de administración oral o para su inyección subcutánea, transdérmica, intravenosa, intratecal, etc. Las composiciones líquidas incluyen soluciones acuosas, jarabes aromatizados, suspensiones acuosas o aceitosas y emulsiones aromatizadas con aceites comestibles tales como elixires y vehículos farmacéuticos similares. Además, las composiciones de la presente invención se pueden preparar en forma de aerosoles para su administración intranasal o similares.

La dosis activa para humanos generalmente está dentro del rango entre 0,05 mg y 50 mg por kg de peso corporal, con una frecuencia de administración de 1-4 veces al día.

El rango de dosis preferible es de 1,0 mg a 20 mg por kg de peso corporal. Sin embargo, para una persona experta resulta evidente que las dosis deberían ser determinadas por el médico tratante de acuerdo con la enfermedad que deba ser tratada, el método de administración, la edad del paciente, su peso, las contraindicaciones y demás características particulares.

Los resultados de los análisis realizados que sostienen las afirmaciones anteriores se muestran en las figuras adjuntas, en las que:

Figura 1: muestra la inhibición de la producción de TNF-\alpha y de ROI por el 2-AG. Los macrófagos peritoneales obtenidos con tioglicolato fueron aislados de ratones C57BL/6. Después de ser incubadas durante toda la noche, las células fueron tratadas con 2-AG. La Fig. 1A muestra la adición a las células del 2-AG, en una concentración de 0,05-5 \mug/ml, junto con 1 \mug/ml de LPS. Los sobrenadantes fueron recogidos después de 24 h para determinar el TNF-\alpha mediante bioensayo. El título del TNF-\alpha viene expresado en unidades S50, definidas como la recíproca de la dilución que se requiere de la muestra para destruir el 50% de una monocapa de células diana CL.7. En la curva se muestra un experimento representativo de 5 ensayos llevados a cabo por tetraplicado. Las diferencias siempre fueron significativas (p<0,05, test-U de Mann-Whitny). Los valores mostrados en el eje de abscisas fueron obtenidos con LPS (1 \mug/ml) y 2-AG (en \mug/ml, según se indica en la Figura). La Fig. 1B muestra a los macrófagos incubados durante toda la noche en tubos quimioluminiscentes, lavados e incubados con 25 \mug/ml de 2-AG, luminol y zymusan. La quimioluminiscencia se registró durante 65 min.

Figura 2: muestra el efecto del 2-AG sobre la formación de un edema después del CHI. El 2-AG se inyectó s.c. en dosis de 1 ó 5 mg/kg en ratones, 15 min ó 1 h después del CHI. El edema se evaluó a las 24 h como el porcentaje de contenido de agua en el tejido.

Figura 3: muestra el efecto del 2-AG sobre la formación de un edema después del CHI. El 2-AG se inyectó i.v. en dosis de 0/1, 5 ó 10 mg/kg en ratones, 15 min después del CHI. El edema se evaluó a las 24 h como el porcentaje de contenido de agua en el tejido.

Figura 4: muestra el efecto del 2-AG en la recuperación clínica después del CHI. El 2-AG se inyectó en dosis de 1 ó 5 mg/kg en ratones, 15 min ó 1 h después del CHI. El estado clínico se evaluó después de 1 h y a las 24 h utilizando la Calificación de Severidad Neurológica (Neurological Severity Score, (NSS)). La recuperación se expresa como: \DeltaNSS=NSS 1 h-NSS 24 h

Figura 5: muestra el efecto del 2-AG en la recuperación clínica después del CHI. El 2-AG se inyectó i.v. en dosis de 0,1, 5 ó 10 mg/kg en ratones, 15 min después del CHI. La recuperación se evaluó según se describe en la Fig. 4.

A continuación se exponen algunos ejemplos ilustrativos, aunque no limitativos, de la aplicación de la presente invención:

Ejemplo 1 Emulphor

Los agentes activos indicados en la invención se disolvieron en etanol/Emulphor 620 [GAF, USA]. Se añadió agua bidestilada. La proporción de etanol:Emulphor:agua era 1:1:18.

En general, los excipientes de este tipo pueden ser soluciones acuosas que contienen cosolventes aprobados en farmacología, como por ejemplo: etanol, polietilenglicol, propilenglicol, glicerol y similares. Dentro de este contexto, los excipientes de este tipo pueden ser soluciones micelares preparadas con surfactantes fónicos o no-iónicos tanto naturales como sintéticos. Los excipientes también pueden ser combinaciones de estos cosolventes y de soluciones micelares.

Ejemplo 2 Emulsión

En determinados casos pueden resultar ventajosas unas preparaciones farmacéuticas en forma de emulsiones que contengan ciertos ingredientes especiales que se detallan a continuación.

Estas emulsiones se preparan a partir de una fase aceitosa que contiene triglicéridos, lecitina, estabilizadores, antioxidantes, etc. (todos ellos aprobados en farmacología) y en la que se solubiliza el compuesto activo. Opcionalmente se le puede añadir una fase acuosa que contenga glicerol y emulgentes.

Los triglicéridos serán preferiblemente de cadena media o larga, y además se utilizarán: el deoxicolato como estabilizador, el \alpha-tocoferol como antioxidante, y el Pluronic F-68, que es un emulgente no-iónico compuesto por un copolímero del polioxietileno y del polioxipropileno, como emulgente.

Por tanto, un ejemplo general de formulación de una "Emulsión" idónea podría ser: triglicéridos (entre el 1,0% y el 30%, preferiblemente el 10%), lecitina (del 0,10% al 5%, preferiblemente el 1%), antioxidante (el % que se requiera, de acuerdo con el antioxidante específico utilizado), estabilizador (del 0,05% al 5%, preferiblemente el 1%), glicerol (el % que requiera para la isotonicidad), emulgente (del 0,20% al 10%, preferiblemente el 2%), compuesto activo (del 0,05% al 5%) y agua hasta completar el 100% (todos los valores expresados en % peso/peso).

Se pueden añadir agentes conservantes, como los parabenos (0,01-0,1%).

Una formulación típica seria (% en peso/peso): 2-AG (5,0) estabilizado en una fase aceitosa (20,0), fracciones purificadas de fosfolípidos de yema de huevo (1,2), Pluronic F-68 (2,0), glicerol (2,25), \alpha-tocoferol (0,02), ésteres de ácidos metil- o butil-p-hidroxibenzoicos ((0,2) y (0,05), respectivamente) y agua bidestilada (hasta completar 100).

Claims (6)

1. La utilización de 2-araquidonilglicerol (2-AG) en la fabricación de una composición farmacéutica para la reducción de edemas y déficits neurológicos producidos por traumatismos craneoencefálicos cerrados.

2. La utilización indicada en la reivindicación 1, en la que se administren de 0,05 mg a 50 mg de 2-AG por kg de peso corporal y con una frecuencia de 1-4 veces por día.

3. La utilización indicada en la reivindicación 2, en la que el rango de dosis sea de 1,0 mg a 20 mg por kg de peso corporal.

4. La utilización indicada en cualquier reivindicación precedente, en la que la composición contenga adicionalmente 2-linoleoilglicerol y 2-palmitoilglicerol.

5. Una composición farmacéutica que contenga como ingredientes activos 2-AG con 2-linoleoilglicerol (2-LinoG) y/o 2-palmitoilglicerol (2-PalmG).

6. La composición farmacéutica indicada en la reivindicación 5, que contenga un excipiente, solvente o diluyente adecuados.