ES2217517T3

ES2217517T3 - Composiciones cosmetica o farmaceutica que comprende un medio de cultivo de microorganismos.

Info

Publication number: ES2217517T3
Application number: ES98400837T
Authority: ES
Inventors: Nathalie Pineau; Richard Martin; Lionel Breton; Lucien Aubert
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1997-05-05
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2018-04-07
Also published as: US6242229B1; DE69822546T2; FR2762782A1; EP0876813B1; EP0876813A1; CA2234833A1; ATE262312T1; CA2234833C; JP2941778B2; DE69822546D1; JPH10298085A; FR2762782B1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION COSMETICA O FARMACEUTICA QUE INCLUYE COMO PRINCIPIO ACTIVO UNA CANTIDAD EFICAZ DE UN MEDIO DE CULTIVO DE AL MENOS UNA BACTERIA FILAMENTOSA NO FOTOSINTETICA, ESTANDO DICHO MEDIO CLARIFICADO Y ESTABILIZADO. SE REFIERE ASIMISMO A LA UTILIZACION DE DICHO MEDIO DE CULTIVO Y AL PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO COSMETICO EN QUE SE EMPLEE LA COMPOSICION.

Description

Composición cosmética o farmacéutica que comprende un medio de cultivo de microorganismos.

La presente invención se refiere a una composición cosmética o farmacéutica que comprende, a título de principio activo, una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, estando clarificado y estabilizado dicho medio. Se refiere igualmente a la utilización de dicho medio de cultivo así como a un procedimiento de tratamiento cosmético que utiliza dicha composición.

Se conoce a partir de la técnica anterior la utilización en cosmética o en farmacia de microorganismos, principalmente en la forma de extractos, para las propiedades que han podido ser reconocidas en los mismos.

Por extracto, se entiende aquí un producto que corresponde a una biomasa de microorganismos que, después del cultivo y una vez separados de su medio de cultivo se someten a diversos tratamientos que pueden ir desde la simple congelación de dicha biomasa hasta purificaciones muy elaboradas de constituyentes de los micro-organismos.

Se pueden citar, por ejemplo, los extractos de levadura utilizados en cosmética, las bacterias utilizadas para la preparación de productos lácteos, los extractos bacterianos utilizados como bactericidas, como cicatrizantes o incluso como inmunoestimulantes.

Más precisamente, se puede citar la utilización en cosmética de fracciones ribosomales, por ejemplo, en la preparación de composiciones destinadas a retrasar el envejecimiento de la piel por estimulación del crecimiento celular y la modulación de la maduración del tejido conjuntivo (EP-A-631773).

En medicina se conocen composiciones destinadas a reforzar las defensas inmunitarias en particular de pacientes que han sufrido graves quemaduras y sensibles de este modo a las infecciones oportunistas provocadas por bacterias, virus, hongos (WO 9111174) o incluso en lo que se refiere a enfermedades de la esfera otorrinolaringológica
(FR 2253499, FR 2360314, FR 2388563, FR 2674755, ZA 8801071) o incluso las alergias (US 4946945).

Estas composiciones utilizan, en general, preparaciones de fracciones ribosomales de micro-organismos.

Existe una clase de bacterias para la cual se han puesto en evidencia numerosas propiedades y que son utilizadas tanto en cosmética como en farmacia. Se trata de la clase de bacterias filamentosas no fotosintéticas tales como las definidas según la clasificación del Bergey's Manual of Sistematic Bacteriology (vol. 3, secciones 22 y 23, 9ª edición, 1989).

Estas bacterias, varías de las cuales ya han sido descritas, tienen generalmente un hábitat acuático y pueden encontrarse principalmente en aguas marinas o en aguas termales. Estas bacterias, o sus extractos se describen en la patente FR-2 283 223 por sus propiedades antiinflamatorias, cicatrizantes, su poder antiacnéico, antiseborréico, su capacidad de favorecer la hidratación cutánea.

Un efecto bacterioestático de la biomasa y del medio de cultivo de Beggiatra se conoce por el documento GB
2 0324 687.

La solicitud EP-A-681831 describe la utilización de estas bacterias o de sus extractos en composiciones cosméticas destinadas a luchar contra el envejecimiento cutáneo. En efecto, estas bacterias o sus extractos han mostrado propiedades en el campo de la renovación epidérmica.

La solicitud EP-A-076 1204 reivindica la utilización de estas bacterias o de sus extractos para su propiedad espesante de las pieles sensibles, propiedad debida, por otro lado, a su propiedad de antagonista de substancia P.

En la solicitud WO-9402158 y en la solicitud EP-A-0765667, las propiedades inmunoestimulantes de estas bacterias o de sus extractos están reivindicadas en cosmética y en farmacia.

En todas estas solicitudes, el agente activo está constituido por la biomasa de bacterias separada de su medio de cultivo y que ha sufrido eventualmente diferentes tratamientos.

La obtención de esta biomasa necesita de las condiciones de crecimientos particulares que la hacen delicada e incrementan el tiempo necesario para la preparación así como el precio de coste de esta materia prima.

De manera sorprendente e inesperada, la Firma Solicitante ha descubierto que el medio de cultivo de las bacterias filamentosas no fotosintéticas, clarificado y estabilizado, aunque considerado como inutilizable al final del cultivo y eliminado, presenta propiedades similares a las de la biomasa. Además, de manera incluso más inesperada el nivel de expresión de estas propiedades por el medio es, sin embargo, comparable al de la biomasa.

Se comprende fácilmente el interés que representa un descubrimiento de este tipo, en particular cuando se sabe que un cultivo en fermentador de 300 litros solamente proporciona la producción de biomasa comprendida entre 270 gramos y 360 gramos en peso seco máximo.

Así pues, la invención tiene por objeto una composición cosmética o farmacéutica que comprende, en un soporte cosmética y/o farmacéuticamente aceptable, una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, siendo clarificado y estabilizado dicho medio.

Por soporte cosmética y/o farmacéuticamente aceptable, se entiende cualquier soporte fisiológicamente aceptable.

Por medio de cultivo clarificado, se entiende un medio de cultivo que ha servido para la amplificación de un micro-organismo, en particular de una bacteria, que después de la amplificación de dicho micro-organismo ha sufrido una manipulación que consiste en la separación física de dicho medio de cultivo y de dicho microorganismo.

Por medio de cultivo estabilizado, se entiende un medio de cultivo que ha sufrido una manipulación destinada para preservarla en el estado en el que se encontraría en un instante dado elegido, habiendo conservado sus propiedades intrínsecas. En particular, tratándose de un medio de cultivo de micro-organismos, esta manipulación está destinada, por ejemplo, a hacer dicho medio estéril, es decir, incapaz de permitir el crecimiento de micro-organismos preservando, por ejemplo, las eventuales propiedades biológicas de las que está dotado.

Entre las bacterias filamentosas no fotosintéticas utilizadas según la invención, son particularmente preferidas las bacterias que pertenecen al orden de las Beggiatoales. Todavía más particularmente, se prefiere las bacterias que pertenecen a los géneros Beggiatoa, Vitreoscilla, Flexithrix o Leucothrix.

Entre las bacterias utilizables, se pueden citar por ejemplo:

Vitreoscilla filiformis (ATCC 15551)

Vitreoscilla beggiatoïdes (ATCC 43181)

Beggiatoa alba (ATCC 33555)

Flexithrix dorotheae (ATCC 23163)

Leucothrix mucor (ATCC 25107)

Sphaerotilus natans (ATCC 13338)

Preferentemente, se utiliza según la invención una cepa de Vitreoscilla filiformis.

Para preparar el medio de cultivo utilizable según la invención, se pueden cultivar dichas bacterias según los métodos conocidos por el técnico en la materia. En este caso, se encontrará en el Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (9ª edición, 1989) todas las informaciones necesarias para el cultivo de estas bacterias.

Se sabe que el cultivo de las bacterias filamentosas no fotosintéticas es relativamente difícil, igual que la obtención de cultivos puros. La mayoría de los autores preconizan la utilización de medios mal definidos, comprendidas maceraciones diversas que utilizan el agua de ciudad. La fuente de carbono recomendada es un acetato.

Preferentemente, el medio de cultivo utilizable en la invención es el medio de cultivo que ha permitido la preparación de una biomasa de bacterias filamentosas no fotosintéticas según el procedimiento descrito por la Firma Solicitante en la solicitud de patente WO-9402158.

En efecto, la Firma Solicitante ha mostrado que es posible adaptar estas bacterias, por contra-selección, a la utilización de un hueso, en lugar de acetato, como fuente de carbono.

Ha mostrado, además, que es posible cultivar estas bacterias sobre un medio de cultivo perfectamente definido. Se puede efectuar en particular un cultivo en el medio siguiente:

Composición	Concentración
Extracto autolítico de levaduras	0,5 a 5 g/l
Peptona	0,5 a 5 g/l
Glucosa anhidra	0,5 a 7 g/l
Micro-elementos de Heller	0,5 a 5 ml/l
CaCl_{2}, 10 H_{2}O	0,01 a 0,20 g/l

Se completa con 1000 ml de agua destilada. Entre las peptonas utilizables, se puede citar por ejemplo la peptona pepaínica de soja.

Este medio particular se distingue de los medios generalmente utilizados por la ausencia de catalasa y de sulfuro, mientras que estos ingredientes eran generalmente considerados como indispensables hasta hoy.

Los micro-elementos de Heller, cuya composición se da a continuación, se han descrito por Heller, Ann Sci. Nat. Biol. Veg. 14: 1-223 (1953).

Se trata de mezclas de diversos elementos minerales que han sido recomendados por Heller, no por el cultivo de las bacterias, sino para la nutrición de los tejidos vegetales cultivados in vitro. Conviene indicar aquí que no se ha investigado para determinar si los micro-elementos de Heller son todos indispensables o útiles en el cultivo de las bacterias filamentosas no fotosintéticas. Se ha encontrado, no obstante, que los micro-elementos de Heller utilizados en conjunto en combinación con los otros constituyentes mencionados en la tabla anterior permiten efectivamente el cultivo de las bacterias consideradas.

La composición de los micro-elementos de Heller, para 1 litro de agua destilada, es la siguiente:

ZnSo_{4}, 7 H_{2}O	1 g
MnSO_{4}, H_{2}O	0,076 g
CuSo_{4}, 5 H_{2}O	0,003 g
Kl	0,010 g
H_{3}BO_{3}	1 g
AlCl_{3}, 6 H_{2}O	0,050 g
NiCl_{2}, 6 H_{2}O	0,030 g

El cultivo puede efectuarse a la temperatura adecuada, que conviene para la especie bacteriana cultivada. Generalmente, esta temperatura está comprendida entre 18ºC y 40ºC según las cepas. El pH del medio de cultivo está comprendido preferentemente entre 5,5 y 8.

Cuando el cultivo bacteriano ha alcanzado un estado terminal, es decir, en general cuando la biomasa es por último de crecimiento exponencial, se separa dicha biomasa del medio de cultivo. Esta separación puede obtenerse por cualquier técnica clásica como por ejemplo la centrifugación, la filtración, la coagulación con un alcohol (etanol, isopropanol, isobutanol) o el secado sobre cilindro con precapa (almidón, diatomeas...) rascada.

Preferentemente, se utiliza el método de la centrifugación.

La estabilización del medio de cultivo puede entonces realizarse por cualquier procedimiento conocido. A título de ejemplo, se citan la filtración esterilizante, el autoclave, la temperatura ultra alta (técnica UHT), la esterilización de alta presión, las radiaciones \gamma o la congelación.

Preferentemente, se utiliza el método de estabilización por tratamiento en autoclave. Ventajosamente, el tratamiento en autoclave es realizado a una temperatura comprendida entre 115ºC y 121ºC y preferentemente durante un tiempo comprendido entre 15 y 40 minutos.

Un ejemplo de preparación del medio de cultivo utilizable según la invención se da, por otro lado, en los ejemplos.

La cantidad de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, clarificada y estabilizada utilizable en la composición de la invención es bien entendido función del efecto buscado. Puede variar, por lo tanto, en una gran medida.

Para dar un orden de magnitud, la composición puede contener una cantidad de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, que representa de 0,0001% a 30% del peso total de la composición y preferentemente en una cantidad que representa de 0,01% a 15% del peso total de la composición.

La composición puede ser ingerida, inyectada o aplicada sobre la piel (sobre cualquier zona cutánea del cuerpo), los cabellos, las uñas o las mucosas (bucal, jugal, gingival, genital, conjuntivo). Según el modo de administración, la composición según la invención puede presentarse bajo todas las formas galénicas normalmente utilizadas.

Para una aplicación tópica sobre la piel, la composición puede tener la forma principalmente de solución acuosa o aceitosa o de dispersión del tipo de loción o suero, de emulsiones de consistencia líquida o semi-líquida del tipo de leche, obtenidas por dispersión de una fase grasa en una fase acuosa (H/E) o a la inversa (E/H), o de suspensiones o emulsiones de consistencia blanda del tipo crema o gel acuoso o anhidros, o incluso de microcápsulas o micropartículas, o de dispersiones vesiculares de tipo iónico y/o no iónico. Estas composiciones están preparadas según los métodos usuales.

Pueden ser utilizadas igualmente para los cabellos en forma de soluciones acuosas, alcohólicas o hidroalcohólicas, o en forma de cremas, de geles, de emulsiones, de espumas o incluso en forma de composiciones para aerosol que comprende igualmente un agente propulsor bajo presión.

Para la inyección, la composición puede presentarse en forma de loción acuosa, aceitosa o en forma de suero. Para los ojos, puede presentarse en forma de gotas y para la ingestión puede presentarse en forma de cápsulas, de gránulos, de jarabes o de comprimidos.

Las cantidades de los diferentes constituyentes de las composiciones según la invención son las utilizadas clásicamente en los campos considerados.

Estas composiciones constituyen principalmente cremas de limpieza, de protección, de tratamiento o de cuidado para la cara, para las manos, para los pies, para los grandes pliegues anatómicos o para el cuerpo (por ejemplo cremas de día, cremas de noche, cremas desmaquillantes, cremas de maquillaje de fondo, cremas anti-solares), maquillajes de fondo fluidos, leches de desmaquillaje, leches corporales de protección o de cuidado, leches anti-solares, lociones, geles o espumas para el cuidado de la piel, como lociones de limpieza, lociones anti-solares, lociones de bronceado artificial, composiciones para el baño, composiciones desodorantes que comprende un agente bactericida, geles o lociones para después del afeitado, cremas depilatorias, composiciones contra las picaduras de insectos, composiciones anti-dolor, composiciones para tratar ciertas enfermedades de la piel como el eczema, la rosácea, la psoriasis, los líquenes, los pruritos severos.

Las composiciones según la invención pueden consistir igualmente en preparaciones sólidas, que constituyen jabones o pastillas de limpieza.

Las composiciones pueden estar también acondicionadas en forma de composición para aerosol que comprende igualmente un agente propulsor bajo presión. La composición según la invención puede ser también una composición para tratamientos capilares, y principalmente un champú, una loción de marcado, una loción tratante, una crema o un gel para el peinado, una composición de tintes (principalmente tintes de oxidación) eventualmente en forma de champús colorantes, de lociones reestructurantes para los cabellos, una composición de permanente (principalmente una composición para el primer tiempo de una permanente), una loción o un gel anticaída, un champú antiparasitario, etc.

La composición puede ser también de uso buco-dental, por ejemplo una pasta dentífrica. En este caso, la composición puede contener adyuvantes y aditivos usuales para las composiciones de uso bucal y principalmente agentes tensioactivos, agentes espesantes, agentes humectantes, agentes de pulido tales como la sílice, diversos ingredientes activos como los fluoruros, en particular el fluoruro de sodio, y eventualmente agentes edulcorantes como el sacarinato de sodio.

Cuando la composición es una emulsión, la proporción de la fase grasa puede ir de 5% a 80% en peso, y preferentemente de 5% a 50% en peso con relación al peso total de la composición. Los aceites, las ceras, los emulsionantes y los coemulsionantes utilizados en la composición en forma de emulsión están elegidos entre los clásicamente utilizados en el campo cosmético. El emulsionante y el coemulsionante están presentes en la composición, en una proporción que va de 0,3% a 30% en peso, y preferentemente de 0,5 a 20% en peso con relación al peso total de la composición. La emulsión puede, además, contener vesículas lipídicas.

Cuando la composición es una solución o un gel aceitoso, la fase grasa puede representar más de 90% en peso total de la composición.

De manera conocida, la composición cosmética puede contener igualmente adyuvantes habituales en el campo cosmético, tales como los gelificantes hidrófilos o lipófilos, los aditivos hidrófilos o lipófilos, los conservantes, los antioxidantes, los disolventes, los perfumes, las cargas, los filtros, los absorbentes de olor, y las materias colorantes. Las cantidades de estos diferentes adyuvantes son las clásicamente utilizadas en el campo cosmético, y por ejemplo de 0,01% a 10% del peso total de la composición. Estos adyuvantes según su naturaleza, pueden introducirse en la fase grasa, en la fase acuosa y/o en las esférulas lipídicas.

Como aceites o ceras utilizables en la invención, se pueden citar los aceites minerales (aceite de vaselina), los aceites vegetales (fracción líquida de manteca de carité, aceite de girasol), los aceites animales (perhidroescaleno), los aceites de síntesis (aceite de Purcellin), los aceites o ceras siliconadas (ciclometicona) y los aceites fluorados (perfluoropoliéteres), las ceras de abejas, de carnauba o parafina. Se pueden añadir a estos aceites alcoholes grasos y ácidos grasos (ácido esteárico).

Como emulsionantes utilizables en la invención, se puede citar por ejemplo el estearato de glicerol, el polisorbato 60 y la mezcla de PEG-6/PEG-32/Glycol Stéarate vendido bajo la denominación de Tefose R 63 por la sociedad Gattefosse.

Como disolventes utilizables en la invención, se pueden citar los alcoholes inferiores, principalmente el etanol y el isopropanol, el propileno glicol.

Como gelificantes hidrófilos utilizables en la invención, se pueden citar los polímeros carboxivinílicos (carbómero), los copolímeros acrílicos tales como los copolímeros de acrilatos/alquilacrilatos, las poliacrilamidas, los polisacáridos, tales como la hidroxipropilcelulosa, las gomas naturales y las arcillas, y, como gelificantes lipófilos, se pueden citar las arcillas modificadas como las bentonas, las sales metálicas de ácidos grasos como los estearatos de aluminio y la sílice hidrófoba, etilcelulosa, polietileno.

La composición puede contener otros activos hidrófilos como las proteínas o los hidrolizados de proteína, los ácidos aminados, los polioles, la urea, la alantoína, los azúcares y los derivados de azúcar, las vitaminas hidrosolubles, los extractos vegetales y los hidroxiácidos.

Como activos lipófilos, se puede utilizar el retinol (vitamina A) y sus derivados, el tocoferol (vitamina E) y sus derivados, los ácidos grasos esenciales, las ceramidas, los aceites esenciales, el ácido salicílico y sus derivados.

Según la invención, la composición puede comprender otros agentes activos destinados principalmente a la prevención y/o el tratamiento de las afecciones cutáneas. Entre estos agentes activos, se puede citar a título de ejemplo:

- los agentes que disminuyen las diferenciación y/o la proliferación y/o la pigmentación cutánea tales como el ácido retinoico y sus isómeros, el retinol y sus ésteres, la vitamina D y sus derivados, los estrógenos tales como el estradiol el ácido cójico o la hidroquinona;

- los antibacterianos tales como el fosfato de clindamicina, al eritromicina o los antibióticos de la clase de las tetraciclinas;

- los antiparasitarios, en particular el metronidazol, el crotamiton o los piretrinoides;

- los antifúngicos, en particular los compuestos que pertenecen a la clase de los imidazoles tales como el econazol, el cetoconazol o el miconazol o sus sales, los compuestos polienos, tales como la anfotericina B, los compuestos de la familia de las alilaminas, tales como la terbinafina, o incluso el octopirox;

- los agentes anti-inflamatorios esteroidienos, tales como la hidrocortisona, el valerato de betametasona o el propionato de clobetasol, o los agentes anti-inflamatorios no-esteroidienos tales como el ibuprofeno y sus sales, el diclofenac y sus sales, el ácido acetilsalicílico, el acetaminofeno o el ácido glicirretínico;

- los agentes anestésicos tales como el clorhidrato de lidocaína y sus derivados;

- los agentes antipruriginosos como la tenaldina, la trimepracina o la ciproheptadina;

- los agentes queratolíticos tales como los ácidos \alpha- y \beta-hidroxicarboxílicos o beta-cetocarboxílicos, sus sales, amidas o ésteres y más particularmente los hidroxiácidos tales como el ácido glicólico, el ácido láctico, el ácido salicílico, el ácido cítrico y de manera general los ácidos de frutas y el ácido n-octanoil-5-salicílico;

- los agentes anti-radicales libres, tales como el a-tocoferol o sus ésteres, las superóxido dismutasas, algunos quelatantes de metales o el ácido ascórbico y sus ésteres;

- los antiseborreicos tales como la progesterona;

- los antipeliculares como el octopirox o la piritiona de zinc;

- los antiacnéicos como el ácido retinoico o el peróxido de benzoilo.

Así, la composición según la invención puede comprender igualmente al menos un agente elegido entre los agentes antibacterianos, antiparasitarios, antifúngicos, antivíricos, anti-inflamatorios, antipruriginosos, anestésicos, queratolíticos, anti-radicales libres, anti-seborréicos, antipeliculares, antiacnéicos y/o los agentes que modulan la diferenciación y/o la proliferación celular y/o la pigmentación cutánea.

Se sabe que el envejecimiento cutáneo, que o bien debido a la edad o a otros factores tales como los factores del medio ambiente, se traduce principalmente por un deterioro de las propiedades mecánicas de la piel, y en particular por una pérdida de elasticidad y de tonicidad con la aparición de arrugas. Se incorpora este fenómeno principalmente a una alteración de los tejidos elásticos y en particular a una disminución del número y del diámetro de las fibras elásticas. El envejecimiento cutáneo se acompaña igualmente de un adelgazamiento del conjunto de los compuestos de la piel como consecuencia un aumento de la fragilidad cutánea. La rarefacción de los fibroblastos así como la alteración de su actividad son consideradas como que juegan un papel muy importante en el proceso de envejecimiento cutáneo. Se sabe igualmente que se producen cambios gaseosos en la superficie de la piel con eliminación de dióxido de carbono y absorción de oxígeno. Este fenómeno, denominado respiración cutánea, disminuye con la edad y esta disminución es considerada como una resultante de la disminución de la actividad epidérmica.

La Firma Solicitante ha encontrado que el medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, clarificado y estabilizado, es capaz de disminuir y/o retardar el envejecimiento cutáneo, cuando se aplica sobre la
piel.

Particularmente, la firma solicitante ha encontrado que el medio de cultivo es capaz de modificar los cambios gaseosos a través de la piel, de estimular la proliferación de los fibroblastos y de mejorar así las propiedades mecánicas de la epidermis.

Así, la invención se refiere igualmente a un procedimiento de tratamiento cosmético destinado a disminuir y/o a retardar el envejecimiento cutáneo, tal que se aplica sobre la piel, sobre el cuero cabelludo y/o sobre las mucosas una composición cosmética tal como se describe anteriormente.

La invención tiene también por objeto una composición farmacéutica destinada a disminuir y/o a retardar el envejecimiento cutáneo que comprende una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como se describe anteriormente.

El sistema inmunitario comprende un conjunto de células especializadas sometidas a múltiples mecanismos de control que aseguran su renovación, su activación y su diferenciación, indispensables a un nivel normal de inmunocompetencia. El papel del sistema inmunitario es discriminar la presencia de la ausencia para eliminar los agentes patógenos y los tumores espontáneos. Cualquier eliminación celular, cualquier desregulación inmunitaria o cualquier déficit funcional es susceptible de favorecer la llegada inesperada de manifestaciones patológicas caracterizadas por la perturbación de los mecanismos de reconocimientos de la presencia frente a la ausencia, y una sensibilidad más grande frente a agresiones microbianas y procesos neoplásicos.

La piel constituye el órgano más importante del organismo y se reconoce como uno de los principales elementos activos del sistema de defensa inmunitario. Tres tipos de células epidérmicas participan en este sistema: los queratinocitos, los melanocitos y las células de Langerhans, que se encuentran sólo al nivel de la piel, juegan un papel primordial en la respuesta inmunitaria y en particular en la presentación antigénica.

La piel sana es capaz de defenderse de las agresiones exteriores gracias a los medios puestos a su disposición. Sin embargo, se somete a la agresión permanente del medio ambiente, de productos químicos y de radiaciones. En particular, las células de Langerhans son el blanco privilegiado de las radiaciones ultravioletas.

Estas agresiones se traducen por un efecto sorprendente de las defensas inmunitarias que producen una baja de resistencias a los agentes patógenos y un aumento de la incidencia de ciertos cánceres.

Para ayudar a la piel a cumplir su función inmunitaria, los productos de estimulación del sistema inmunitario cutáneo son de un gran interés.

Se sabe, por otra parte, que el sistema inmunitario y particularmente el de la piel se debilita en el transcurso del envejecimiento cronobiológico.

Este debilitamiento sobreviene igualmente en el curso del envejecimiento foto-inducido. Un efecto inmunoestimulador puede entonces restablecer las funciones inmunitarias y más particularmente aquellas de la epidermis reforzando las defensas naturales de la piel.

La Firma Solicitante ha encontrado que la aplicación de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, clarificado y estabilizado, permite estimular el sistema inmunitario, más particularmente el sistema inmunitario de la piel.

Particularmente, el medio o la composición está destinado a estimular las defensas inmunitarias en el transcurso del envejecimiento cronobiológico, así como en el transcurso del envejecimiento foto-inducido.

La invención tiene, por lo tanto, igualmente por objeto un procedimiento de tratamiento cosmético destinado a estimular las defensas inmunitarias, tal que se aplica sobre la piel, sobre los cabellos y/o sobre las mucosas una composición cosmética tal como se describe anteriormente. Particularmente este procedimiento de tratamiento cosmético está destinado a estimular las defensas inmunitarias en el transcurso del envejecimiento cronobiológico así como en el transcurso del envejecimiento foto-inducido.

La invención tiene también por objeto una composición farmacéutica destinada a estimular el sistema inmunitario, que comprende una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como se describe anteriormente.

Existen en los mamíferos polipéptidos que pertenecen a la familia de las taquininas, que inducen sobre las fibras musculares lisas contracciones rápidas. Entre los compuestos de esta familia se pueden citar la neuroquinina \beta, neuroquinina \alpha y la substancia P.

La substancia P es un elemento químico polipeptídico (undecapéptido), elaborado y liberado por una terminación nerviosa. La localización de la substancia P es específica de las neuronas, tanto en el sistema nervioso central como en los órganos en la periferia. Así, numerosos órganos o tejidos reciben aferencias de neuronas con substancia P, se trata principalmente de las glándulas salivares, del estómago, del páncreas, del intestino (en este, la distribución de la substancia P está superpuesta a los plexos nerviosos intrínsecos de Meissner y de Auerbach), del sistema cardio-vascular, de la glándula tiroide, de la piel, del iris y de los cuerpos ciliares, de la vejiga y bien evidentemente un sistema nervioso central y periférico.

Debido a la distribución ubicua de la substancia P, son asociados numerosos desórdenes a un exceso de síntesis y/o de liberación de la substancia P.

La substancia P interviene principalmente en la transmisión del dolor y en enfermedades del sistema nervioso central (por ejemplo la ansiedad, las psicosis, las neuropatías, los problemas neurodegenerativos de tipo demencia senil, de Alzheimer, demencia de los afectados por sida, enfermedad de Parkinson, síndrome de Down, síndrome de Korsakoff, esclerosis múltiples, esquizofrenia), en enfermedades respiratorias (tales como por ejemplo las bronco-neumonías) e inflamatorias (tales como por ejemplo la poliartritis reumatoide), en síndromes alérgicos (tales como por ejemplo el asma, las rinitis alérgicas, las faringitis alérgicas, la urticaria, las dermatitis eczematosas), en enfermedades gastrointestinales (tales como por ejemplo las úlceras, las colitis, la enfermedad de Crohn), en desórdenes cutáneos, (tales como por ejemplo la psoriasis, las enfermedades pruriginosas, los herpes, las fotodermatosis, las dermatitis atópicas, las dermatitis de contacto, los líquenes, los prurigos, los pruritos, las picaduras de insectos), en fibrosis y otros problemas de la maduración de los colágenos (tales como por ejemplo la esclerodermia), en problemas cardio-vasculares, en problemas vasoespásticos (tales como por ejemplo las migrañas, la enfermedad de Reynaud), en desórdenes inmunológicos, en problemas del tracto urinario (tales como por ejemplo la incontinencia, la cistitis), en enfermedades reumáticas, en algunas enfermedades dermatológicas (tales como el eczema) y en las afecciones oftalmológicas (tales como por ejemplo las conjuntivitis, las uveitis, los pruritos oculares, los dolores oculares y las irritaciones).

La utilización de antagonista de substancia P es una de las alternativas terapéuticas eficaces en todas las afecciones citadas anteriormente.

Por antagonista de substancia P, se entiende todo compuesto susceptible de inhibir parcialmente, incluso totalmente, el efecto biológico de la substancia P.

Particularmente, para que una substancia sea reconocida como un antagonista de substancia P debe inducir una respuesta farmacológica coherente (que incluye o no su fijación al receptor de la substancia P) principalmente en uno de los ensayos siguientes:

-la substancia antagonista debe disminuir la extravasación del plasma a través de la pared vascular inducida por la capsaicina o por una estimulación nerviosa antidrómica, o bien

-la substancia antagonista debe provocar una inhibición de la contracción de los músculos lisos inducidos por la administración de substancia P.

La Firma Solicitante ha encontrado que el medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, clarificado y estabilizado, responde a las características definidas como que caracterizan un antagonista de substancia P y puede por lo tanto utilizarse como antagonista de substancia P.

Así, la invención se refiere a la utilización de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, estando clarificado y estabilizado dicho medio, como antagonista de substancia P para la preparación de una composición cosmética o de una composición farmacéutica.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de tratamiento cosmético destinado a tratar los desórdenes asociados a un exceso de síntesis y/o de liberación de substancia P, tal como se aplica sobre la piel, sobre el cuero cabelludo y/o sobre las mucosas una composición cosmética tal como se describe anteriormente.

La invención tiene también por objeto una composición farmacéutica destinada a tratar los desórdenes asociados a un exceso de síntesis y/o de liberación de substancia P, que comprende una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, tal como se describe anteriormente.

Además, la invención tiene también por objeto una composición farmacéutica destinada a tratar los desórdenes del sistema nervioso central, los problemas respiratorios, los síndromes alérgicos, la inflamación, el dolor, los desórdenes gastrointestinales, los desórdenes cutáneos, las fibrosis, los problemas de maduración del colágeno los problemas cardio-vasculares, los problemas vasoespásticos, los desórdenes inmunológicos y/o los problemas del tracto urinario, que comprende una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como se describe anteriormente.

En el campo de los desórdenes cutáneos, se conoce que algunas pieles son más sensibles que otras. Se sabe que existen a nivel cutáneo numerosos fenómenos de intolerancia, cuyos síntomas son en particular signos subjetivos, que son esencialmente sensaciones disestésicas. Se entiende por sensaciones disestésicas sensaciones más o menos dolorosas resentidas en una zona cutánea como los picores, hormigueos, comezones o pruritos, quemaduras, irritaciones, incomodidades, tiranteces, etc.

Estos fenómenos pueden ser la consecuencia de acontecimientos múltiples de los cuales los más banales serán calificados de irritación o de inflamación, pero de los que algunos serán debidos a causas fisiológicas, como las pieles sensibles, incluso patológicas como por ejemplo, la alergia.

Sin embargo, los síntomas de las pieles sensibles eran hasta el presente mal caracterizados y el problema de estas pieles estaba, de esta manera, mal definido; nadie conocía exactamente el proceso implicado en la sensibilidad de la piel. Algunos pensaban que una piel sensible era una piel que reaccionaba a los productos cosméticos, otros que se trataba de una piel que reaccionaba a varios factores exteriores, a la fuerza unidos a los productos cosméticos. Se asimilaba igualmente a las pieles sensibles a pieles alérgicas.

Se han puesto a punto ensayos para delimitar las pieles sensibles, por ejemplo ensayos con el ácido láctico y en el DMSO que son conocidos por ser substancias irritantes: ver por ejemplo el artículo de K. Lammintausta y col., Dermatoses, 1988, 36, páginas 45-49; el artículo de T. Agner y J. Serup. Clinical and Experimental Dermatology, 1989, 14, páginas 214-217.

Debido al hecho del desconocimiento de las características de las pieles sensibles, era hasta el presente muy difícil, incluso imposible tratarlas. De hecho, se las trataba indirectamente, por ejemplo limitando en las composiciones cosméticas o dermatológicas el empleo de productos con carácter irritante tales como los tensioactivos, los conservantes o los perfumes así como el empleo de algunos activos cosméticos o dermatológicos.

Después de numerosos ensayos clínicos, la Firma Solicitante ha podido determinar los síntomas unidos a las pieles sensibles.

La Firma Solicitante ha encontrado que las pieles sensibles podían ser divididas en dos grandes formas clínicas, las pieles irritables y/o reactivas, y las pieles intolerantes.

Una piel irritable y/o reactiva es una piel que reacciona por un prurito, es decir, por comezones, o por picores, a diferentes factores tales como el medio ambiente, las emociones, los alimentos, el viento, los frotamientos, la maquinilla de afeitar, el jabón, los tensioactivos, el agua dura con fuerte concentración calcárea, las variaciones de temperatura o la lana. En general, estos signos están asociados a una piel seca con o sin herpes, o a una piel que presenta un eritema.

Una piel intolerante es una piel que reacciona por sensaciones de irritación, de tiranteces, de hormigueos y/o de manchas rojas, a diferentes factores tales como el medio ambiente, las emociones, los alimentos y algunos productos cosméticos. En general, estos signos están asociados a una piel hiperseborréica o acnéica con o sin herpes, y a un eritema.

Estos fenómenos pueden estar generalizados en el conjunto del cuerpo, pero la mayoría del tiempo pueden tener localizaciones bien definidas tales como por ejemplo el cuero cabelludo, la cara, los pliegues cutáneos, etc...

Los cueros cabelludos "sensibles" tienen una semiología clínica más unívoca: las sensaciones de prurito y/o de picores y/o de irritaciones son desencadenadas esencialmente por factores locales tales como frotamientos, jabón, tensioactivos, agua dura con fuerte concentración de cal, champús o lociones. Estas sensaciones son también a veces desencadenadas por factores tales como el medio ambiente, las emociones y/o los alimentos. Un eritema y una hiperseborrea del cuero cabelludo así como un estado pelicular son frecuentemente asociados a los signos precedentes.

Por otro lado, en algunas regiones anatómicas como los grandes pliegues (regiones inguinales, genital, axilares, poplíteas, anal, sub-mamarias, pliegues del codo) y los pies; la piel sensible se traduce por sensaciones pruriginosas y/o sensaciones disestésicas (irritaciones, picores) unidos en particular al sudor, a los frotamientos, a la lana, a los tensioactivos, a algunas preparaciones cosméticas, al agua dura con fuerte concentración en cal y/o a las variaciones de temperatura.

El conjunto de estos fenómenos de intolerancia está siempre unido a un proceso inflamatorio clásico, y más particularmente a una reacción inflamatoria, de tipo neurógeno porque hace intervenir las fibras nerviosas cutáneas.

La Firma Solicitante ha podido mostrar, además, que una piel sensible no era una piel alérgica. En efecto, una piel alérgica es una piel que reacciona a una agente exterior, un alergeno, que desencadena una reacción de alergia. Se trata de un proceso inmunológico que se produce sólo cuando un alergeno está presente y que afecta solamente a sujetos sensibilizados. En cambio, la resultante final de una reacción alérgica se traduce igualmente por una reacción inflamatoria agua asociada generalmente a un edema.

La característica esencial de la piel sensible es según la Firma Solicitante, por el contrario, un mecanismo de respuesta a factores exteriores, que puede concernir a todo individuo, tanto si los individuos denominados de piel sensible reaccionan más rápido que los otros. Este mecanismo no es inmunológico, es aespecífico.

Cualquiera que sea el fenómeno considerado, existe un punto común a todos estos mecanismos que se traduce por una reacción inflamatoria cuya faceta terminal se mide por la liberación por las células mastocitarias de la piel de al menos un mediador de la inflamación tales como la histamina, la serotonina, la heparina, los leucotrienos, las prostaglandinas, las citoquinas, el monóxido de nitrógeno o especies oxigenadas reactivas.

Para determinar si una piel es sensible o no, la Firma Solicitante ha puesto a punto igualmente un ensayo. En efecto, después de haber efectuado un gran número de ensayos con el objetivo de definir una piel sensible, ha encontrado de manera sorprendente que existía un vínculo entre las personas de piel sensible y estas que reaccionaban a una aplicación tópica de capsaicina.

El ensayo con la capsaicina consiste en aplicar sobre aproximadamente 4 cm^{2} de piel 0,05 ml de una crema que comprende 0,075% de capsaicina y de indicar la aparición de signos subjetivos provocados por esta aplicación, tales como picores, quemaduras y comezones. En los sujetos de pieles sensibles, estos signos aparecen entre 3 y 20 minutos después de la aplicación y son seguidos de la aparición de un eritema que debuta en la periferia de la zona de aplica-
ción.

Hasta ahora, la capsaicina era utilizada como medicamento, en particular para tratar los dolores de la zona. La capsaicina provoca un nuevo ensanchamiento de los neuropéptidos, y en particular de las taquininas que provienen de terminaciones nerviosas de la epidermis y de la dermis. La Firma Solicitante ha constatado que el esquema fisiopatológico común a todos los estados de las pieles sensibles estaba unido a una gran aptitud a liberar de las taquininas y más particularmente de la substancia P en la piel. Las manifestaciones disestésicas que son provocadas por su liberación son denominadas "neurógenas".

Hasta hoy ninguna persona había establecido una unión entre la substancia P y la piel sensible. Los signos clínicos de la piel sensible son esencialmente subjetivos: picores, hormigueo, prurito, tiranteces, irritaciones, y los asocian a veces a eritemas. Estos signos son debidos a factores exteriores aespecíficos. Los síntomas aparecen esencialmente localizados en la cara, en el cuello y en el cuero cabelludo, pero pueden aparecer también sobre todo el cuerpo.

Así, la Firma Solicitante ha descubierto que una de las características esenciales de las pieles sensibles está unida a la liberación de la substancia P y por lo tanto que la utilización de antagonistas de substancia P puede permitir obtener un efecto preventivo y/o curativo de las pieles sensibles.

Para tratar las pieles sensibles, la Firma Solicitante ha considerado por lo tanto utilizar antagonistas de substancia P. Ha constatado en efecto de manera sorprendente que la incorporación de un antagonista de substancia P en una composición destinada a un uso tópico permite evitar la irritación y/o las sensaciones disestésicas y/o los pruritos de la piel.

La invención se refiere por lo tanto más particularmente a un procedimiento de tratamiento cosmético destinado a tratar las pieles sensibles, tal que se aplica sobre la piel, sobre el cuero cabelludo y/o sobre las mucosas una composición cosmética tal como se describe anteriormente.

La invención tiene también por objeto una composición farmacéutica destinada a tratar las pieles sensibles que comprenden una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como se describe anteriormente.

La presente invención tiene incluso por objeto la utilización de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, estando clarificado y estabilizado dicho medio, en una composición cosmética o para la preparación de una composición farmacéutica, estando destinado dicho medio o dicha composición para prevenir y/o para luchar contra las irritaciones cutáneas y/o los herpes y/o los eritemas y/o las sensaciones de irritación y/o de disestesia y/o los pruritos de la piel y/o las mucosas.

La invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de tratamiento cosmético destinado a prevenir y/o a luchar contra las irritaciones cutáneas y/o los herpes y/o los eritemas y/o la sensaciones de irritación y/o de disestesia y/o los pruritos de la piel y/o las mucosas, tal que se aplica sobre la piel, sobre el cuero cabelludo y/o sobre las mucosas una composición cosmética tal como se describe anteriormente.

De manera ventajosa según la invención, una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, estando clarificado y estabilizado dicho medio, puede estar asociado a productos con efecto irritante utilizados normalmente en el campo cosmético o farmacéutico, productos que son a veces activos cosméticos o farmacéuticos.

La presencia de un antagonista de substancia P en la forma de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, estando clarificado y estabilizado dicho medio, en una composición cosmética o farmacéutica que comprende un producto que tiene un efecto irritante permite atenuar fuertemente, incluso suprimir este efecto irritante.

Esto permite aumentar, además, la cantidad de activo con relación a la cantidad de activo normalmente utilizada, con vistas a una eficacia mejorada.

Así, la invención se refiere igualmente a la utilización de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, estando clarificado y estabilizado dicho medio, en una composición cosmética o farmacéutica que comprende además al menos un producto con efecto irritante.

La invención se refiere igualmente a una composición cosmética o farmacéutica que comprende en un medio cosmética o farmacéuticamente aceptable una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, estando clarificado y estabilizado dicho medio, y, además, al menos un producto con efecto irritante.

Como productos con efecto irritante se pueden citar, por ejemplo, los tensioactivos (iónicos o no-iónicos), los conservantes, los disolventes orgánicos o los activos como los \alpha-hidroxi-ácidos (ácido cítrico, málico, glicólico, tártrico, mandélico, láctico), los \beta-hidroxi-ácidos (el ácido salicílico y sus derivados), los \alpha-ceto-ácidos, los \beta-ceto-ácidos, los retinoides (retinol, retinal, ácido retinoico), las antralinas (dioxiantranol), los antranoides, los peróxidos (principalmente de benzoilo), el minoxidil, las sales de litio, los antimetabolitos, los queratolíticos, la vitamina D y sus derivados, los tintes o colorantes capilares (parafenilendiamina y sus derivados, los aminofenoles), las soluciones alcohólicas perfumantes (perfumes, aguas de colonia, producto para después del afeitado, desodorantes), los agentes antitranspirantes (algunas sales de aluminio), los activos depilatorios o de permanentes (tioles), los activos depigmentantes (hidroquinona).

El empleo de antagonista de substancia P permite principalmente multiplicar de 2 a 10 veces la cantidad de activo con efecto irritante con relación al estado de la técnica, sin experimentar las incomodidades mencionadas anteriormente. Así, se pueden utilizar los hidroxiácidos hasta un 50% del peso de la composición o los retinoides hasta 5%, disminuyendo notablemente su carácter irritante.

La Firma Solicitante ha encontrado que el medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, aclarada y estabilizada, presenta propiedades anti-inflamatorias, cicatrizantes, anti-acnéica, anti-seborreica, y que favorece la hidratación cutánea.

Así, las composiciones según la invención pueden también servir para mitigar la inflamación, para favorecer la cicatrización, para disminuir el acné y/o la seborrea y/o para favorecer la hidratación cutánea, tal como se aplica sobre la piel, sobre los cabellos y/o sobre las mucosas una composición cosmética tal como se describe anteriormente.

La invención tiene también por objeto una composición farmacéutica destinada a mitigar la inflamación, a favorecer la cicatrización, a disminuir el acné y/o la seborrea y/o a favorecer la hidratación cutánea que comprende una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como se describe anteriormente.

Los procedimientos de tratamiento cosmético de la invención pueden emplearse principalmente aplicando las composiciones higiénicas o cosméticas tales como las definidas anteriormente, según la técnica de utilización habitual de estas composiciones: por ejemplo: aplicación de cremas, de geles, de sueros, de lociones, de leches de desmaquillaje o de composiciones antisolares sobre la piel o sobre los cabellos secos, aplicación de una loción para cabellos sobre cabellos humedecidos, de champús, o incluso aplicación de dentífrico sobre las encías.

Los ejemplos y composiciones siguientes ilustran la invención. En las composiciones, las proporciones indicadas son porcentajes en peso salvo mención contraria.

Ejemplo 1 Preparación de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética clarificado y estabilizado

Se puso en cultivo una cepa de Vistreoscilla filiformis (ATCC 15551) según el procedimiento descrito en la solicitud de patente WO-9402158. El cultivo se efectuó a 26ºC durante al menos 48 horas hasta la obtención de una concentración celular conveniente que corresponde a una densidad óptica a 600 nm superior o igual a 1,5. Se reprodujo la cepa a 2% V/V en medio nuevo cada 48 horas hasta la obtención de un cultivo estable. Un Erlenmeyer de 1 litro que contenía 200 ml de medio nuevo se sembró entonces con 4 ml del cultivo precedente.

El cultivo de Erlenmeyer se efectuó a 26ºC sobre una tabla de cultivo agitada a 100 rpm. El pie de cuba así obtenido sirvió de inóculo en un fermentador de 10 l. El crecimiento se efectuó a 26ºC, pH 7, 100 rpm y pO_{2} \geq 15%.

Después de 48 horas de crecimiento, la biomasa se transfirió a un fermentador de 600 litros útiles, para ser cultivado en las mismas condiciones.

Se utilizó el medio de cultivo siguiente:

\newpage

Composición	Concentración
Extracto autolítico de levadura Biokar (ref. 112002)	2,0 g/l
Peptona papaínica de soja (origen PPS-USP Biokar ref. 1 1601)	2,0 g/l
Micro-elementos de Heller	2,0 ml/l
Glucosa anhidra	2,0 g/l
CaCl_{2}, 10 H_{2}O	0,066 g/l
Agua destilada	100,0 ml

El pH se ajustó a 7,15 por adición de sosa o potasa 1 N antes de esterilización a 121ºC durante 20 minutos.

La composición de los micro-elementos de Heller, para 1 l de agua destilada fue la siguiente:

ZnSO_{4}, 7 H_{2}O	1 g
MnSO_{4}, H_{2}O	0,076 g
CuSO_{4}, 5H_{2}O	0,003 g
Kl	0,010 g
H_{3}BO_{3}	1 g
AlCl_{3}, 6H_{2}O	0,050 g
NiCl_{2}, 6H_{2}O	0,030 g

Se añadieron a este medio de cultivo 0,2 g/l de una antiespuma de tipo polimetilsiloxano (Silibione 97350 RP). La temperatura se reguló entre 26 y 30ºC, situándose el óptimo en 29ºC.

Un ciclo completo de crecimiento se efectuó en 48 h aproximadamente.

La aireación se reguló por un medidor de caudal para tener como mínimo 20% de oxígeno disuelto.

No existía ya prácticamente más glucosa residual al final de crecimiento.

La separación de la biomasa se efectuó por centrifugación.

Se realizó en una centrífuga de tipo industrial refrigerada a 4ºC que permite obtener un poder separativo equivalente a 8000 g, impreso durante 2 minutos.

El medio de cultivo así recolectado pudo a continuación almacenarse por congelación para una utilización diferente.

Antes de la utilización el medio se esterilizó a una temperatura comprendida entre 114ºC y 121ºC durante 15 a 40 minutos.

Ejemplo 2

Se estudió en este ejemplo la capacidad del medio del ejemplo 1 para estimular las defensas inmunitarias.

A) Estudio de la estimulación de los esplenocitos de ratón

Este estudio se realizó según el protocolo descrito por L. E. Averill y N.S. Wolf (1985) Journal of Immunology 134: 3859-3863.

Preparación de los esplenocitos de ratón

Bazos de ratón Balb/C fueron dilacerados en medio RPMI 1640 (SIGMA). La suspensión celular se filtró sobre un filtro de tipo "tinte de célula" de la sociedad Nunc con el fin de eliminar los agregados celulares. La suspensión se centrifugó a continuación a 1000 RPM durante 10 minutos a 4ºC. El culote celular se suspendió en medio

\hbox{RPMI}

completo que contiene L-glutamina con 2 mM, de la penicilina a 100 unidades/ml, estreptomicina a 100 \mug/ml,
2-mercaptoetanol a 5.10^{-5} M y suero de ternero fetal a 10%. La suspensión celular se ajustó a 2.5 x 10^{6} células por ml. Ensayo de proliferación celular

Las células, preparadas como anteriormente, se distribuyeron en placas de cultivo de 96 pozos (FALCON) a razón de 2,5 x 10^{5} células por pozo, en un volumen final de 100 \mul. 20 \mul de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, aclarada y estabilizada del ejemplo 1, se añadieron a las concentraciones finales a estudiar. El volumen de cada pozo se ajustó a 200 \mul por adición de 80 \mul de medio RPMI completo. Las células se cultivaron durante 48 y 72 horas, 18 horas antes del final del cultivo, 1 \muCi de timidina titulada de actividad específica igual a 82 Ci/mmoles (Amersham) se añadió en cada uno de los pozos. Al final del tiempo de cultivo, las células se recuperaron sobre filtro. Después del secado del filtro éste se introdujo en un contador \beta con centelleo líquido con el fin de determinar la radioactividad incorporada al nivel del ADN.

Para comparación de los efectos, el mismo ensayo se efectuó sobre paredes de Vitreoscilla filiformis. Estas paredes se prepararon a partir de la biomasa obtenida después del cultivo separación del medio, por tratamiento a 121ºC durante 15 minutos. Se conoce que estas paredes presentan un efecto inmunoestimulante (WO-9402158).

La medida de la radioactividad incorporada con el ADN permitió determinar el índice de crecimiento de los esplenocitos.

Los resultados se presentan en la tabla siguiente:

1

	A = medio de cultivo del ejemplo 1.
	B = pared de Vitreoscilla filiformis.
	Testigo: Medio de cultivo que no ha contenido bacterias.

[...] (%): Concentración de A o B utilizadas en el ensayo y expresadas en % (volumen/volumen para A y Peso/volumen para B).

Los índices se expresaron en índice de estimulación calculado según la fórmula: valor del ensayo / valor del testi-
go x 100.

Los valores superiores a 20 son considerados como positivos.

El medio del ejemplo 1 indujo el crecimiento de los esplenocitos de ratón. El máximo de proliferación se obtuvo a 48 horas de cultivo para la concentración de 12,5%. Los resultados fueron superiores a aquellos vendidos con las paredes de Vitreoscilla filiformis.

B) Estudio de la producción de inmunoglobulinas

Células tales como las preparadas en el ejemplo 2 se repartieron en placas de cultivo de 6 pozos (FALCON) a razón de 10 x 106 células por pozo (volumen de 2 ml por pozo).

300 \mul de los diferentes pozos a ensayar se añadieron a las concentraciones a estudiar, lo que supuso que fueron 10 veces concentrados. El volumen de cada pozo se ajustó a 3 ml por adición de 0,7 ml de medio RPMI 1640 completo. Las células se cultivaron 3 días luego se tomaron los sobrenadantes de cultivo. La dosificación de las inmunoglobulinas se realizó con la ayuda del "Mab -based mouse Ig isotyping kit" (PHARMINGEN) según el protocolo del proveedor.

Las inmunoglobulinas son proteínas presentes en la sangre que se combinan con los antígenos con el fin de que estos últimos sean reconocidos e identificados como cuerpos extraños por los macrófagos.

Las inmunoglobulinas son subdivididas en diferentes tipos de sub-tipos en función de la estructura de la parte constante de su cadena pesada-. En el ratón, se distinguen 5 clases (Ig, M, G, Aa, D y E). La inmunoglobulina G es la inmunoglobulina más abundante en los fluidos corporales principalmente extravasculares donde combaten microorganismos y toxinas. SE pueden clasificar las inmunoglobulinas G en 4 sub-clases (1, 2, 3 y 4).

La inmunoglobulina A es la inmunoglobulina mayor en las secreciones seromucosas, donde defienden las superficies externas del cuerpo.

La inmunoglobulina M es un agente aglutinante muy eficaz producido muy pronto en la respuesta inmunitaria. Constituye la primera línea de defensa contra las bacteriemias.

Solamente las Ig, G1, G2a, G2b, G3, M y A han sido dosificadas en este ensayo.

Para comparación de los efectos, el mismo ensayo se efectuó sobre paredes de Visteroscilla filiformis. Estas paredes se prepararon a partir de la biomasa obtenida después del cultivo y separación del medio, luego se trataron térmicamente a 121ºC durante 15 minutos.

Un control positivo se realizó con lipopolisacáridos (LPS) de Escherichia coli conocidos por ser buenos inmunoestimuladores.

Los resultados se presentan en la tabla siguiente:

	[...] (%)	IgG1	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgM	IgA
	25	160	159	185	168	129
A	12,5	173	162	188	173	135	175
	6,25	165	152	182	167	131	169
	12,5	142	140	158	135	107	138
B	6,25	178	176	203	171	135	174
	3,13	162	162	172	162	131	164
C	0,1	168	164	189	189	162	179
	1	176	176	207	197	168	186
A: Medio del ejemplo 1;
B: Paredes de Vitreoscilla filiformis;
C: LPS de Escherichia coli (vendidos por la sociedad Sigma) a título de control positivo, utilizados a 10 \mug/ml.

[...] (%): Concentraciones utilizadas en el ensayo y expresadas en % (volumen/volumen para A y Peso/Volumen para B y C).

Los resultados se expresaron en índice de producción calculado según la fórmula:

Valor de ensayo/valor de testigo x 100.

Los valores superiores a 150 fueron considerados como positivos.

El medio clarificado y estabilizado indujo la producción de inmunoglobulinas por las células B.

El medio clarificado y estabilizado aumentó el crecimiento de los esplenocitos y la producción de inmunoglobulinas. No se observó ninguna toxicidad con este medio hasta la dosis de 25%.

Estos resultados demostraron bien el papel inmunomodulador del medio según la invención.

Ejemplo 3

Ejemplos de formulaciones que ilustran la invención. Estas composiciones fueron obtenidas por simple mezcla de los diferentes compuestos.

Composición 1

Composición dérmica en forma de crema

Medio del ejemplo 1	2,0 g
Aceite de vaselina	15,0 g
Aceite de girasol	5,0 g
Ácido esteárico	2,0 g
Alcohol cetílico	3,0 g
Estearato de Polietileno Glicol a 100 OE	5,0 g
Propileno glicol	3,0 g
Conservantes	0,3 g
Agua purificada \hskip2,5cm CSP	100,0 g

Esta crema se aplicó a razón de 3 aplicaciones por día sobre quemaduras o heridas con vistas a acelerar la cicatrización.

Composición 2

Leche para después del sol

Medio del ejemplo 1	1,0 g
Monoestearato de Glicerol auto-emulsionable	3,0 g
Aceite de vaselina	4,0 g
Aceite de gérmenes de trigo	2,0 g
Aceite de Silicona Volátil	5,0 g
Manteca de Carité	3,0 g
Carbómero 940*	0,2 g
Trietanolamina	0,2 g
Goma de xantano	0,1 g
Glicerina	3,0 g
Composición perfumante	0,1 g
Conservantes	0,3 g
Agua purificada \hskip2,5cm CSP	100,0 g

*Carbómero 940 = nombre de comercio que designa un ácido poliacrílico reticulado.

Esta leche se aplicó sobre el conjunto del cuerpo después de la exposición solar.

\newpage

Composición 3

Composición anti-solar

Medio del ejemplo 1	5,0 g
Acido Esteárico	3,0 g
Alcohol Cetílico	1,5 g
Monoestearato de glicerol auto-emulsionable	3,0 g
Aceite de girasol	8,0 g
Poliacrilamida	3,0 g
Octil Metoxisuccinamato	4,0 g
Sal de Trietanolamina del ácido terefalilideno Dicanfor sulfónico (Mexoril SX)	2,6 g
Glicerol	5,0 g
Tocoferol	2,0 g
Conservantes	0,3 g
Pentasodio Etilenodiaminatetrametileno fosfato	0,1 g
Agua purificada \hskip3,5cm CSP	100,0 g

Esta emulsión se utilizó para proteger la piel de los rayos ultravioletas y para mantener y estimular el sistema inmunitario frente al sol.

Claims

1. Composición cosmética o farmacéutica que comprende, en un soporte cosméticamente y/o farmacéuticamente aceptable, una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, habiendo servido dicho medio para la amplificación de dicho micro-organismo y siendo clarificado y estabilizado.

2. Composición según la reivindicación precedente, caracterizada porque dicha bacteria pertenece al orden de los Beggiatoales.

3. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicha bacteria pertenece al género Beggiatoa, Vitreoscilla, Flexithrix o Leucothrix.

4. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicha bacteria está elegida entre cepas de Vitreoscilla filiformis.

5. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el medio representa de 0,0001% a 30% del peso total de la composición.

6. Composición según la reivindicación precedente, caracterizada porque el medio representa de 0,01% a 15% del peso total de la composición.

7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el medio es estabilizado por filtración esterilizante, tratado en autoclave, temperatura ultra alta, esterilización a alta presión,

\hbox{radiación  \gamma }

o congelación.

8. Composición según la reivindicación precedente, caracterizada porque el medio es estabilizado por tratado en autoclave.

9. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el medio comprende un acetato como fuente de carbono.

10. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el medio comprende un hueso como fuente de carbono.

11. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 10, caracterizada porque el medio tiene la siguiente composición:

Composición Concentración Extracto autolítico de levaduras 0,5 a 5 g/l Peptona 0,5 a 5 g/l Glucosa anhidra 0,5 a 7 g/l Micro-elementos de Heller 0,5 a 5 ml/l CaCl_{2}, 10 H_{2}O 0,01 a 0,20 g/l Agua destilada Csp 1 l

12. Composición según la reivindicación precedente, caracterizada porque los micro-elementos de Heller tienen la siguiente composición:

ZnSo_{4}, 7 H_{2}O 1 g MnSO_{4}, H_{2}O 0,076 g CuSo_{4}, 5 H_{2}O 0,003 g Kl 0,010 g

(Continuación)

H_{3}BO_{3} 1 g AlCl_{3}, 6 H_{2}O 0,050 g NiCl_{2}, 6 H_{2}O 0,030 g Agua destilada Csp 1 l

13. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizada porque la peptona es de la peptona papaínica de soja.

14. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la temperatura de cultivo está comprendida entre 18 y 40ºC.

15. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedente, caracterizada porque el pH del medio de cultivo está comprendido entre 5,5 y 8.

16. Composición cosmética o farmacéutica, caracterizada porque comprende en un medio cosméticamente o farmacéuticamente aceptable, una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética, tal como se describe en las reivindicaciones 1 a 15 y al menos un producto con efecto irritante.

17. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, destinada para disminuir y/o retardar el envejecimiento cutáneo.

18. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, destinada a estimular el sistema inmunitario.

19. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, destinada a tratar los desórdenes asociados a un exceso de síntesis y/o de liberación de substancia P.

20. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, destinada a tratar los desórdenes del sistema nervioso central, los problemas respiratorios, los síndromes alérgicos, la inflamación, el dolor, los desórdenes gastro-intestinales, los desórdenes cutáneos, las fibrosis, los problemas de la maduración del colágeno, los problemas cardio-vasculares, los problemas vasoespásticos, los desórdenes inmunológicos y/o los problemas del tracto urinario.

21. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, destinada a tratar las pieles sensibles.

22. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, destinada a mitigar la inflamación, a favorecer la cicatrización, a disminuir el acné y/o la seborrea y/o a favorecer la hidratación cutánea.

23. Procedimiento de tratamiento cosmético destinado a disminuir y/o a retardar el envejecimiento cutáneo, caracterizado por el hecho de que se aplica sobre la piel, sobre el cuero cabelludo y/o sobre las mucosas una composición cosmética tal como se describe en las reivindicaciones 1 a 16.

24. Utilización de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de una composición cosmética destinada a estimular el sistema inmunitario, estando aplicada dicha composición sobre la piel, sobre el cuero cabelludo y/o sobre las mucosas.

25. Utilización de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como se describe en las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de una composición cosmética antagonista de substancia P.

26. Utilización de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de una composición cosmética destinada a tratar los desórdenes asociados a un exceso de síntesis y/o de liberación de substancia P, una composición cosmética tal como se describe en las reivindicaciones 1 a 16, para aplicación sobre la piel, sobre el cuero cabelludo, y/o sobre las mucosas.

27. Utilización de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de una composición cosmética destinada a tratar las pieles sensibles, siendo dicha composición para la aplicación sobre la piel, sobre el cuero cabelludo y/o sobre las mucosas.

28. Utilización de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de una composición cosmética tal como la descrita en las reivindicaciones 1 a 16 destinada a prevenir y/o a luchar contra las irritaciones cutáneas y/o los herpes y/o los eritemas y/o las sensaciones disestésicas y/o las sensaciones de irritación y/o los pruritos de la piel y/o las mucosas, para aplicación sobre la piel, sobre el cuero cabelludo y/o sobre las mucosas.

29. Procedimiento de tratamiento cosmético para favorecer la hidratación cutánea, caracterizado porque se aplica sobre la piel o las mucosas una composición cosmética tal como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 16.

30. Utilización de una cantidad eficaz de medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como la descrita en una de las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de una composición cosmética destinada a mitigar la inflamación, a favorecer la cicatrización, a disminuir el acné y/o la seborrea, siendo dicha composición para la aplicación sobre la piel, sobre los cabellos y/o sobre las mucosas.

31. Medio de cultivo de al menos una bacteria filamentosa no fotosintética tal como la descrita en una de las reivindicaciones 1 a 16, habiendo servido dicho medio de cultivo para la amplificación de dicho micro-organismo y siendo clarificado y estabilizado, para su utilización como antagonista de substancia P.