ES2215986T3 - Composiciones receptoras de glutamato y metodos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PRESENTA NUEVOS ADNS QUE CODIFICAN PROTEINAS QUE TIENEN UNA PROPIEDADES ELECTROFISIOLOGICAS Y FARMACOLOGICAS CARACTERISTICAS DE LOS RECEPTORES DE GLUTAMATOS. LOS RECEPTORES DE GLUTAMATOS QUEDAN EJEMPLIFICADOS POR LAS CLONAS DE CADN REPRESENTATIVAS PARA GLUR1, GLUR2, GLUR3, GLUR4, GLUR5, GLUR6 Y GLUR7, FRAGMENTOS DE LAS MISMAS Y COMBINACIONES FUNCIONALES DE ESTAS PROTEINAS RECEPTORAS DE GLUTAMATOS Y/O FRAGMENTOS. LAS SECUENCIAS DE ADN DE LAS CLONAS DE ADN PARA GLUR1, GLUR2, GLUR3, GLUR4 Y GLUR5 SON ESPECIALMENTE UTILES COMO SONDAS, PERMITIENDO ASI; A AQUELLOS ESPECIALIZADOS EN EL TEMA, IDENTIFICAR, SIN UN EXPERIMENTO INDEBIDO, OTROS MIEMBROS DE LA FAMILIA DE LOS RECEPTORES DEL L-GLUTAMATO.

Description

Composiciones receptoras de glutamato y métodos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una familia de nuevas secuencias de ADN y de proteínas receptoras codificadas que comprenden el sistema neurotransmisor de glutamato. La invención también se refiere a métodos para fabricar los receptores de glutamato y para usar las proteínas receptoras en ensayos diseñados para identificar y caracterizar agonistas y antagonistas de glutamato.

Antecedentes de la invención

El aminoácido L-glutamato es un neurotransmisor de excitación principal en el sistema nervioso de los mamíferos. Los análisis anatómicos, bioquímicos y electrofisiológicos sugieren que los sistemas glutamatérgicos están implicados en un amplio espectro de procesos neuronales, incluyendo la transmisión sináptica rápida de excitación, la regulación de la liberación del neurotransmisor, la potenciación a largo plazo, el aprendizaje y la memoria, la plasticidad sináptica de desarrollo, el daño hipóxico-isquémico y la muerte celular neuronal, los ataques epileptiformes, así como la patogénesis de varios desórdenes neurodegenerativos. Véase de forma general, Monaghan y col., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29, 365-402 (1989). Este extenso repertorio de funciones, especialmente aquellas relacionadas con el aprendizaje, la neurotoxicidad y la neuropatología, han estimulado intentos recientes con el fin de describir y definir los mecanismos a través de los cuales el glutamato ejerce sus efectos.

Actualmente, los esquemas de clasificación del receptor de glutamato están basados en criterios farmacológicos que sirven para definir cinco subtipos o clases de receptor: aquellos activados por el ácido N-metil-D-aspártico (NMDA), el ácido kainico (KA), el ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propiónico (AMPA, antes denominado ácido quiscuálico o receptor QUIS), el ácido 2-amino-4-fosfonobutírico (AP4 o APB), y el ácido 1-amino-ciclopentil-1,3-dicarboxílico (ACPD). Los efectos del glutamato están mediados principalmente por interacciones con receptores ionotrópicos selectivos a cationes (Foster y Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103-164 (1984); Strange, Biochem. J.249,309-318 (1988)). Una excepción es el subtipo receptor ACPD que tiene las propiedades de un receptor metabotrópico. Esta clase de receptores de glutamato altera de la fisiología sináptica vía proteínas de unión GTP y los segundos mensajeros diacilglicerol y 1,4,5-trifosfato de inositol (Gundersen y col., Proc. R. Soc. London Ser. B 221, 127 (1984); Sladeczek, y col., Nature 317, 717 (1985); Nicoletti y col., J. Neurosci. 6, 1905 (1986); Sugiyama y col., Nature 325, 531 (1987)).

Las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas de los receptores de glutamato han sido estudiadas de forma extensa y ahora son bien conocidas. Véase por ejemplo, Foster y Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103 (1984); Cotman y col., Trends Neurosci. 10, 263 (1987); Mayer y Westbrook, Prog. Neurobiol. 28, 197 (1987); Watkins y Olvermann, Trends Neurosci. 10, 265 (1987); y Blair y col., Science 242, 577 (1988). Esto contrasta con sus características y estructura bioquímicas a un nivel molecular, que, hasta las enseñanzas de la presente invención, permanecían desconocidas en su mayor parte. Orlova y col. (Chemical Abstracts 110: 70440g (1989), p. 172), presentaron brevemente un cADN sin caracterizar que se asumió que codificaba un receptor de glutamato del cerebro.

Definiciones

En la presente especificación y reivindicaciones, se hará referencia a frases y términos de la técnica que son definidos expresamente para su uso aquí tal como sigue:

Tal como se usa aquí, receptores de glutamato se refiere a las proteínas receptoras neurotransmisoras que son activadas por el L-glutamato y compuestos relacionados. Estas proteínas receptoras son clasificadas en función de su "farmacología". Actualmente existen cinco clases de receptores: aquellos activados por N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido kainico (KA), ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propiónico (AMPA, antes denominado ácido quiscuálico o receptor QUIS), ácido 2-amino-4-fosfonobutírico (AP4 o APB), y ácido 1-amino-ciclopentil-1,3-dicarboxílico (ACPD).

Tal como se usa aquí, NMDA significa N-metil-D-aspartato, que es un ligando (agonista) del subtipo de receptor de glutamato NMAD.

Tal como se usa aquí, AMPA significa \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propionato, que es un ligando (agonista) del subtipo de receptor de glutamato AMPA. El receptor AMPA se denominaba antes receptor QUIS (quiscualato).

Tal como se usa aquí, QUIS significa ácido quiscuálico o quiscualato, que es un ligando (agonista) del subtipo de receptor definido farmacológicamente antes denominado receptor QUIS (quiscualato). El receptor antes denominado receptor QUIS se denomina ahora receptor AMPA.

Tal como se usa aquí, KA significa ácido kainico o kainato, que es un ligando (agonista) del subtipo de receptor de glutamato kainato.

Tal como se usa aquí, APB significa 2-amino-4-fosfonobutirato, que es un ligando (agonista) del subtipo de receptor de glutamato APB. A veces también se usa el acrónimo AP4 para denominar el subtipo de receptor 2-amino-4-fosfonobutirato.

Tal como se usa aquí, ACPD significa ácido 1-amino-ciclopentil-1,3-dicarbóxilico, que es un ligando (agonista) del subtipo de receptor de glutamato ACPD.

Tal como se usa aquí, cuando se usa como un modificador de la(s) proteína(s) receptor(as) de glutamato de la presente invención, la frase "que tiene propiedades electrofisológicas y farmacológicas características de un receptor de glutamato" significa que la(s) señal(es) neuronal(es) generada(s) por la proteína receptora en respuesta al glutamato o a ligandos similares al glutamato serán comparables a las de los receptores de glutamato conocidos. Véase también, la definición de "funcional" que se da más adelante.

Tal como se usa aquí, homomérico significa receptores comprendidos por solo un tipo de subunidad.

Tal como se usa aquí, heteromérico significa receptores comprendidos por más de un tipo de subunidad.

Tal como se usa aquí, funcional, si se usa como un modificador de proteína(s) receptora(s) de glutamato de la presente invención, significa que la unión de ligando de glutamato (o de similares al glutamato) a la(s) proteína(s) receptora(s) provoca que los "canales iónicos" de la membrana se abran. Esto permite que los iones se muevan a través de la membrana, lo que a su vez despolariza la célula y genera una señal neuronal. Dicho de otra forma, funcional significa que se genera una señal neuronal como consecuencia de la unión del ligando a la(s) proteína(s) receptora(s).

Tal como se usa aquí, GABA significa ácido \gamma-aminobutírico.

Tal como se usa aquí, \gamma-DGG significa \gamma-D-glutamilglicina.

Tal como se usa aquí, GAMS significa \gamma-D-glutamilaminometil-sulfonato.

Tal como se usa aquí, PDA significa ácido 2,3-cis-piperidindicarboxílico.

Tal como se usa aquí, GDEE significa dietiléster de glutamato.

Tal como se usa aquí, TMDs significa dominios transmembrana.

Tal como se usa aquí, APV significa ácido 2-amino-5-fosfo-novalérico.

Tal como se usa aquí, CPP significa 3-(2-carboxipiperacin-4-il)propil-1-fosfato.

Tal como se usa aquí, nAChRs significa receptores de acetilcolina nicotínica neuronal.

Tal como se usa aquí, CNS significa sistema nervioso central.

Tal como se usa aquí, PNS significa sistema nervioso periférico.

Tal como se usa aquí, una subunidad de unión agonista es una subunidad receptora que contiene una posición de unión para un compuesto farmacológico que, después de unirse, activa el receptor.

Tal como se usa aquí, una subunidad de unión no agonista es una subunidad receptora que se une a agonistas.

Tal como se usa aquí, el término antagonista se refiere a una sustancia que interfiere con la función del receptor. Los antagonistas son de dos tipos: competitivos y no competitivos. Un antagonista competitivo (también conocido como un bloqueador competitivo) compite con un agonista por posiciones de unión solapadas. Un antagonista o bloqueador no competitivo desactiva el funcionamiento del receptor uniéndose a una posición sobre el receptor diferente a la posición de unión del agonista.

Tal como se usa aquí, GluR1 se refiere al clon de cADN que codifica una sola proteína de subunidad de receptor de glutamato del mismo nombre que tiene un M_{r} = aprox. 99.769 daltons. GluR1 fue la primera subunidad de receptor de glutamato que codifica cADN para ser aislado; referida previamente como GluR-K1. GluR-K1 ha sido renombrada como gen 1 de subunidad de receptor de glutamato o, más sencillo, GluR1. Otras subunidades de glutamato adicionales o genes relacionados con subunidades adicionales se denominan GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, GluR6, GluR7 y así. El cADN de GluR1 ha sido depositado en la American Type Culture Collection; se le ha proporcionado el código ATCC Nº 68134.

Tal como se usa aquí, GluR2 se refiere al clon de cADN que codifica una sola proteína de subunidad de receptor de glutamato con el mismo nombre que tiene un M_{r} = aprox. 96.400 daltons. El cADN de GluR2 ha sido depositado en la American Type Culture Collection; se le ha proporcionado el código ATCC Nº 68132.

Tal como se usa aquí, GluR3 se refiere al clon de cADN que codifica una sola proteína de subunidad de receptor de glutamato con el mismo nombre que tiene un M_{r} = aprox. 98.000 daltons. El cADN de GluR3 ha sido depositado en la American Type Culture Collection; se le ha proporcionado el código ATCC Nº 68133.

Tal como se usa aquí, GluR4 se refiere al clon de cADN que codifica una sola proteína de subunidad de receptor de glutamato con el mismo nombre que tiene un M_{r} = aprox. 98.500 daltons. El cADN de GluR4 ha sido depositado en la American Type Culture Collection; se le ha proporcionado el código ATCC Nº 68375.

Tal como se usa aquí, GluR5 se refiere al clon de cADN de GluR5 que codifica una sola proteína de subunidad de receptor de glutamato con el mismo nombre que tiene un M_{r} = aprox. 100.000 daltons. El cADN de GluR5 (como GluR5-1) ha sido depositado en la American Type Culture Collection; se le ha proporcionado el código ATCC Nº 68374. (Existen dos variantes de longitud del cADN de GluR5, aquí denominadas GluR5-1 y GluR5-2. La traducción de los cADNs de GluR5 predice un solo marco de lectura abierta largo de 290 aminoácidos. La diferencia entre los ADNs de GluR5-1 y de GluR5-2 estriba en la inserción de 45 nucleótidos (15 aminoácidos) en el ADN de GluR-1 lo cual no interrumpe su marco de lectura. La inserción de 15 aminoácidos en la proteína receptora de GluR5-1 es única entre las proteínas receptoras descritas aquí; de este modo la variante GluR5-2 más corta es la contrapartida de las subunidades GluR1, GluR2, GluR3, GluR4, GluR6 y GluR7.)

Tal como se usa aquí, GluR6 se refiere al clon de cADN que codifica una sola proteína del mismo nombre que tiene un M_{r} = aprox. 100.000.

Tal como se usa aquí, GluR7 se refiere al clon de cADN que codifica una sola proteína del mismo nombre. Los fragmentos codificadores de GluR7 35-T3 y U35 se muestran en la Figura 12.

Tal como se usan aquí, GluR1, GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, GluR6 y GluR7 se usan cada uno de forma intercambiable para denominar genes, clones de cADN y las proteínas receptoras de glutamato que codifican.

El uso de la frase "homología de secuencia sustancial" en la presente especificación y reivindicaciones significa que el ADN, el ARN o las secuencias de aminoácidos que tienen variaciones de secuencia pequeñas y sin consecuencias respecto a las secuencias reales presentadas y reivindicadas aquí, son considerados equivalentes a las secuencias de la presente invención, y como tales están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En relación con esto, "variaciones de secuencia pequeñas y sin consecuencias" significa que las secuencias "homólogas" (es decir, las secuencias que tienen una homología de secuencia sustancial con el ADN, con el ARN, o con las proteínas descritas y reivindicadas aquí) serán funcionalmente equivalentes a las secuencias descritas y reivindicadas en la presente invención. Las secuencias funcionalmente equivalentes funcionarán sustancialmente del mismo modo para producir sustancialmente las mismas composiciones que el ácido nucleico y las composiciones de aminoácidos descritas y reivindicadas aquí.

El uso de la frase "sustancialmente puro" en la presente especificación y reivindicaciones como modificador de ADN, ARN, polipéptidos o proteínas significa que el ADN, el ARN, los polipéptidos o las proteínas así designados han sido separados de su entorno celular in vivo por medios humanos; como resultado de esta separación y purificación, los ADNs, los ARNs, los polipéptidos y las proteínas sustancialmente puros son útiles en formas en las que los ADNs, los ARNs, los polipéptidos o las proteínas no separadas, impuras, no lo son.

Los aminoácidos que comprenden las diversas secuencias de aminoácidos que aparecen aquí pueden ser identificados de acuerdo con las siguientes abreviaturas de tres letras o de una letra:

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Los nucleótidos que comprenden las diversas secuencias de nucleótidos que aparecen aquí tienen sus designaciones de una letra habituales (A, G, T, C o U) usadas de forma rutinaria en la técnica.

Tal como se usan aquí, las palabras "proteína", "péptido", y "polipéptido" son consideradas términos equivalentes y se usan de forma intercambiable.

Tal como se usa aquí, pb significa pares base. Kpb significa kilo pares base, o miles de pares base.

Tal como se usan aquí, todas las temperaturas se dan en grados centígrados a no ser que se indique otra cosa.

Depósitos

Los clones de cADN que codifican subunidades de proteína receptora de glutamato representativas de la presente invención han sido depositadas en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. (ATCC) para proporcionar a aquellos con conocimientos en la técnica el mejor modo de fabricar y usar las sondas necesarias para identificar miembros adicionales de la familia de genes del L-glutamato. Los depósitos se han realizado bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de Depósitos de Microorganismos para Propósitos de Procedimiento de Patente y bajo los términos de los Reglamentos promulgados bajo este Tratado. Las muestras de las secuencias de ADN clonadas están y estarán disponibles para oficinas de propiedad industrial y para otras personas legalmente tituladas para recibirlas bajo los términos del Tratado y los Reglamentos y de otra manera con la conformidad de las leyes y reglamentos de patentes de los Estados Unidos de América y de todas las demás naciones u organizaciones internacionales en las que esta solicitud, o una solicitud que reclama prioridad de esta solicitud, sea presentada o en las que cualquier patente transferida sobre cualquier solicitud tal es transferida.

Los números del Depósito ATCC y las Fechas de Depósito de los clones de cADN representativos depositados son las siguientes:

Clon GluR1 ATCC Nº 68134, 19 de Octubre de 1989

Clon GluR2 ATCC Nº 68132, 19 de Octubre de 1989

Clon GluR3 ATCC Nº 68133, 19 de Octubre de 1989

Además, también se han depositado los siguientes clones de cADN:

Clon GluR4 ATCC Nº 68375, 2 de Agosto de 1990

Clon GluR5 ATCC Nº 68374, 2 de Agosto de 1990

Sumario de la invención

La presente invención describe una familia de nuevas proteínas receptoras de glutamato y secuencias de ADN que las codifican. Los receptores de glutamato de la invención tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de los receptores de glutamato del sistema nervioso central. Los receptores de glutamato de la presente invención sirven de ejemplo para las proteínas tipo canal selectivo de iones catiónicos codificadas por los clones de cADN GluR1, GluR2 y GluR3. Además de ser útiles en la producción de proteínas receptoras de glutamato, estos cADNs también son útiles como sondas, permitiendo de este modo a aquellos con conocimientos en la técnica, sin una excesiva experimentación, identificar y aislar proteínas adicionales en la familia de receptores de glutamato.

Los nuevos receptores de glutamato funcionales de la presente invención pueden ser ensamblados bien a partir de subunidades individuales GluR (homoméricos) o a partir de combinaciones de polipéptidos subunidad (heteroméricos). GluR1, GluR2 y GluR3 son ejemplos de las subunidades preferidas actualmente para formar receptores homoméricos, mientras que las combinaciones de GluR1, GluR2 y GluR3 son ejemplos de subunidades preferidas actualmente para formar receptores heteroméricos.

Además de describir nuevos ADNs y proteínas, la presente invención también comprende métodos para fabricar receptores de glutamato y usarlos para identificar y caracterizar agonistas y antagonistas de la función de receptor de glutamato. La invención también comprende métodos para determinar si la(s) proteína(s) desconocida(s) son funcionales como receptores de glutamato.

Descrión de la invención

La presente invención describe una familia de receptores de glutamato y nuevas secuencias de ADN que codifican estos receptores.

Más específicamente, en un aspecto, la presente invención comprende proteínas funcionales sustancialmente puras, o fragmentos funcionales suyos, o combinaciones funcionales de estas proteínas y/o estos fragmentos, en los que las proteínas o los fragmentos o las combinaciones funcionales tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de un receptor de glutamato.

En otro aspecto, la invención comprende proteínas funcionales sustancialmente puras, o fragmentos funcionales suyos, o combinaciones funcionales de estas proteínas y/o estos fragmentos, en los que las proteínas o los fragmentos funcionales o las combinaciones tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de un subtipo de receptor de glutamato seleccionado del grupo que consiste en N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propiónico (AMPA), kainato (KA) y 2-amino-4-fosfonobutirato (APB).

En otro aspecto, la invención comprende proteínas funcionales sustancialmente puras, o fragmentos funcionales suyos, o combinaciones funcionales de estas proteínas y/o estos fragmentos, en los que las proteínas o los fragmentos funcionales tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de los subtipos de receptor de glutamato KA y/o AMPA.

En otro aspecto más, la invención comprende proteínas sustancialmente puras, o fragmentos suyos, o combinaciones funcionales de las proteínas y/o los fragmentos, en los que las proteínas o los fragmentos o las combinaciones funcionales tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas de un receptor de glutamato y están codificadas por ADN que tiene al menos un 40% de homología con al menos un miembro del grupo que consiste en ADN de GluR1, ADN de GluR2 y ADN de GluR3.

En otro aspecto más, la invención comprende proteínas sustancialmente puras, o fragmentos suyos, o combinaciones funcionales de las proteínas y/o los fragmentos, en los que las proteínas o los fragmentos o las combinaciones tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas de un receptor de glutamato y tienen al menos un 40% de homología de aminoácidos con al menos un miembro del grupo que consiste en GluR1 (Figura 1), GluR2 (Figura 3) y GluR3 (Figura 4).

En otro aspecto, la invención comprende proteínas sustancialmente puras seleccionadas del grupo que consiste en GluR1, GluR2 y GluR3, y combinaciones suyas en las que dichas combinaciones son funcionales como receptor(es) de glutamato.

En otro aspecto, la invención comprende proteínas sustancialmente puras que tienen M_{r}s de aproximadamente 99.769 (GluR1), 94.400 (GluR2) y 98.000 (GluR3), que forman canales iónicos que poseen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de los receptores de glutamato de los subtipos KA y/o AMPA.

En otro aspecto más, la invención comprende proteínas funcionales sustancialmente puras que tienen una homología sustancial con las proteínas funcionales sustancialmente puras de la invención.

La presente invención también incluye proteínas funcionales sustancialmente puras que codifican ADN, o fragmentos funcionales suyos, que tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de los receptores de glutamato.

En otro aspecto, la invención comprende proteínas funcionales sustancialmente puras que codifican ADN o fragmentos funcionales que tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de un subtipo de receptor de glutamato seleccionado del grupo que consiste en N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propiónico (AMPA), kainato (KA) y 2-amino-4-fosfonobutirato (APB).

Más aún, la invención comprende ADN que codifica los receptores de glutamato KA y/o AMPA.

En otro aspecto, la invención comprende ADN sustancialmente puro seleccionado del grupo que consiste en ADN de GluR1, ADN de GluR2 y ADN de GluR3.

Más aún, la invención comprende ADN sustancialmente puro que tiene al menos un 40% de homología con al menos un miembro del grupo que consiste en ADN de GluR1, ADN de GluR2 y ADN de GluR3.

En otro aspecto relacionado, la invención comprende ADN que codifica proteínas que tienen al menos un 40% de homología con al menos un miembro del grupo que consiste en GluR1 (Figura 1), GluR2 (Figura 3) y GluR3.

La invención también comprende ADN sustancialmente puro que codifica proteínas sustancialmente puras que tienen M_{r}s de aproximadamente 99.769 (GluR1), 96.400 (GluR2) y 98.000 (GluR3), que forman canales iónicos que poseen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de un receptor de glutamato de los subtipos KA y/o AMPA.

La invención además comprende ADN sustancialmente puro que es funcionalmente equivalente a cualquiera de los ADN sustancialmente puros de la invención, en el que funcionalmente equivalente significa que el ADN sustancialmente puro codificará las proteínas, o sus fragmentos funcionales, que formarán canal(es) iónico(s) en respuesta a los ligandos de los receptores de glutamato.

En otro aspecto, la invención comprende mARN sustancialmente puro, sentido o antisentido, trascrito a partir de los ADNs de la invención, en el que los ADNs codifican proteínas funcionales sustancialmente puras que tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de un receptor de glutamato.

En otro aspecto, la invención comprende clones de cADN que codifican las secuencias de aminoácido de péptidos funcionales que tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de un receptor de glutamato. Los clones representativos han sido depositados en el American Type Culture Collection para proporcionar a aquellos con conocimientos en la técnica los materiales de partida necesarios (es decir, sondas) para identificar y aislar miembros adicionales de la familia de receptores de glutamato. Los clones de cADN representativos incluyen: GluR1 (ATCC Nº 68.134), GluR2 (ATCC Nº 68.132) y GluR3 (ATCC Nº 68.133).

Tanto los clones de cADN de longitud completa como sus fragmentos pueden ser usados como sondas. Si se usan los fragmentos como sondas, las secuencias de ADN procederán preferiblemente de la porción codificadora carboxilo del ADN, y más preferiblemente incluirán porciones codificadoras de canal iónico de las secuencias de ADN.

En otro aspecto, la invención comprende fragmentos de péptido funcionales, y combinaciones funcionales suyas, codificados por los ADNs de la invención. Dichos fragmentos funcionales de péptido pueden ser producidos por aquellos con conocimientos en la técnica, sin una excesiva experimentación, eliminando algunos o todos los aminoácidos de la secuencia no esenciales para que el péptido funcione como un receptor de glutamato. La determinación de los aminoácidos que son esenciales para la función del receptor de glutamato se hace, por ejemplo, mediante digestión sistemática de los ADNs que codifican los péptidos y/o mediante la introducción de eliminaciones en los ADNs. Los ADNs modificados (por ejemplo, borrados o digeridos) son expresados, por ejemplo, transcribiendo el ADN y a continuación introduciendo el mARN resultante en Xenopus oocytes, en el que se producirá la traducción de los mARNs. El análisis funcional de las proteínas expresadas de este modo en el oocytes se lleva a cabo exponiendo el oocytes a ligandos que son conocidos por unirse a receptores de glutamato y activarlos funcionalmente, y a continuación monitorizar el oocytes para ver si los fragmentos expresados forman canal(es) iónico(s). Si se detecta(n) canal(es) iónico(s), los fragmentos son funcionales como receptores de glutamato.

En aún otro aspecto más, la invención comprende células transformadas con ADNs de la invención.

En aún otro aspecto, la invención comprende el Xenopus oocytes al que se ha introducido el mARN de la invención, por ejemplo, mediante inyección.

Más aún, la invención comprende nuevos receptores de glutamato fabricados mediante la expresión de las secuencias de ADN de la invención, o mediante la traducción de los correspondientes mARNs. Dichos nuevos receptores incluyen los receptores GluR1, GluR2 y GluR3 individuales, fragmentos suyos más combinaciones funcionales de los receptores o de los fragmentos.

Más aún, la invención comprende ADN, ARN y proteínas que son funcionalmente equivalentes a los ADNs, a los ARNs y a las proteínas de la presente invención. Dichos ADNs, ARNs y proteínas funcionalmente equivalentes funcionarán sustancialmente del mismo modo que los ADNs, los ARNs y las proteínas de la invención.

Además de las composiciones de materia de ADN, de ARN y de proteínas, la invención comprende métodos. Un primer método de la invención es un método para identificar ADN que es homólogo al ADN que se sabe que codifica proteína(s) receptora(s) de glutamato. Este método comprende poner en contacto una muestra de ADN "desconocido" o de prueba con una sonda de ADN de receptor de glutamato (por ejemplo, GluR1, GluR2 y GluR3) bajo condiciones de hibridación de baja y/o alta severidad, y a continuación identificar como ADN homólogo de receptor de glutamato a ese ADN "desconocido" o de prueba que se hibrida con el ADN de sonda de glutamato.

Un segundo método de la invención está dirigido a identificar receptores de glutamato funcionales (es decir, receptores de glutamato que forman canales iónicos). Este método comprende poner en contacto proteínas, preferiblemente en un sistema de expresión de oocyte, con al menos un ligando conocido por activar receptores de glutamato, medir la respuesta de canal iónico al ligando(s), e identificar como receptor(es) de glutamato funcional(es) aquellas proteínas que exhiben una respuesta de canal iónico como consecuencia del contacto.

Un tercer método de la invención es un método para determinar si una sustancia es un ligando funcional para la proteína receptora de glutamato. De acuerdo con este método, las proteínas conocidas por funcionar como receptores de glutamato son puestas en contacto con una sustancia "desconocida" o de prueba, se monitoriza la actividad de canal iónico del receptor de glutamato conocido después del contacto con la sustancia "desconocida" o de prueba, y aquellas sustancias que producen una respuesta de canal iónico en el(los) receptor(es) de glutamato conocido(s) son identificadas como ligandos funcionales de proteínas receptoras.

Volviendo ahora a algunos de los ADNs específicos de la invención, el clon de cADN GluR1 fue aislado a partir de una biblioteca de cADN de cerebro anterior de rata mediante monitorización de la expresión de canales iónicos mediados por kainato en Xenopus oocytes. Se usó un injerto del clon GluR1 como sonda para monitorizar bibliotecas de cADN de cerebro (primero bajo condiciones de hibridación de poca severidad y, a continuación, bajo condiciones más severas) con el fin de encontrar clones de cADN que codifican otros miembros de la familia de receptores de glutamato. El uso del cADN de la sonda de GluR1 condujo a la identificación y al aislamiento de los clones GluR2 y GluR3. Se usó una sonda de GluR2 para identificar y aislar los clones GluR4 y GluR5, y el GluR5 fue usado para aislar los clones GluR6 y GluR7.

El clon de cADN GluR1 codifica una subunidad de receptor de glutamato funcional que consiste en un única proteína de aproximadamente M_{r} = 99.769, antes de cualquier modificación post-traducción. Esta proteína forma un canal iónico que posee las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas de los receptores KA y AMPA.

Las proteínas codificadas por los genes GluR1, GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, GluR6 y GluR7 exhiben una considerable identidad de secuencia de aminoácidos intersubunidades. Véase la Tabla 2. Se ha descubierto que estas proteínas forman distintos canales iónicos sensibles a KA/AMPA homoméricos y heteroméricos en el Xenopus oocytes. Por ejemplo, las subunidades de proteínas de receptores de glutamato, GluR1, GluR2, GluR3, GluR4 y GluR5 son suficientes para formar complejos canal iónico-receptor funcionales homoméricos activados por KA, AMPA, QUIS pero no por NMDA y APB. Mientras que las subunidades GluR2 pueden formar complejos homoméricos funcionales, esta subunidad reúne más eficientemente complejos canal iónico-receptor en combinación heteromérica con subunidades GluR1 o GluR3.

La proteína GluR5 forma un canal iónico homomérico en el Xenopus oocytes que reacciona débilmente al glutamato pero no al N-metil-D-aspartato, al kainato, al quiscualato y al 2-amino-4-fosfonobutirato. El hecho de que los oocytes que expresan GluR5 reaccionen al L-glutamato pero no al KA, al quiscualato o al AMPA puede indicar que esta proteína puede participar en la formación de receptores con un perfil farmacológico diferente al de las subunidades KA/AMPA. Esta sugerencia se vecorroborada por los datos de hibridación in situ.

Durante el desarrollo embriónico o postnatal, el gen GluR5 es expresado en subconjuntos de células neuronales en el CNS y en el PNS y el modelo de expresión espacial y temporal del gen GluR5 solapa en gran medida con la subunidad KA/AMPA GluR4. Sin embargo, en cerebros adultos, el gen GluR5 está expresado en un modelo distinto a los de los genes de las subunidades KA/AMPA, lo que es consistente con la sugerencia de que el GluR5 representa un subtipo de receptores de glutamato diferentes de los receptores KA/AMPA.

Sin una mayor elaboración, se cree que una persona con un conocimiento estándar de la técnica puede, usando la descripción precedente, y los siguientes Ejemplos y Descripciones Detalladas de las Figuras, utilizar la presente invención en su máxima extensión. El material descrito en los ejemplos, a no ser que se indique lo contrario, está descrito con propósitos ilustrativos y, por tanto, no debería ser interpretado en modo alguno como limitante de las reivindicaciones anexas.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción de Bibliotecas de cADN de Cerebro

Se purifica poli(A)^{+} ARN mediante el método de guanidina tiocianato-CsCl (Chirgwin y col., Biochem. 18, 5294 (1979)) a partir de varias regiones del cerebro, por ejemplo, de cerebro de mamífero, o a partir de una línea de células adecuadas, por ejemplo, la línea de células NCB-20. El ARN purificado se usa como una plantilla para preparar cADN de doble cadena. Se usa un prímero poli-dT unido a una posición de restricción Xho I como prímero para imprimar la transcriptasa inversa de Molones para la síntesis de la primera cadena usando como precursor 5-metil dCTP en lugar de cCTP. Se añaden RNasa H y polimerasa de ADN I para completar la segunda cadena. El cADN es redondeado en el extremo con polimerasa de ADN T4 lo que aumenta las posibilidades de fabricar un cADN de cadena completa. Se ligan adaptadores Eco RI al extremo redondeado y los extremos son kinaseados. A continuación, el cADN es digerido con la enzima de restricción Xho I. Esta enzima no puede romper ADN semimetilado por lo que sólo rompe la posición de restricción Xho I no metilada que había sido unid al prímero dT en el extremo 3' del mARN. El cADN de doble cadena resultante tiene una posición de restricción Xho I en el extremo 3' del mARN y una posición Eco RI en el extremo 5'. Este cADN es colocado a continuación en un vector apropiado, tal como el vector \lambdaZAP, que es parte del sistema de clonación \lambdaZAP-cADN de Stratagene. Si se usa el vector \lambdaZAP; el cADN se coloca dentro del vector de tal modo que el extremo 5' del mARN está próximo al promotor lacZ. (El vector \lambda ZAP tiene un promotor de polimerasa de ARN T3 en un extremo del injerto de cADN y un promotor de polimerasa de ARN T7 en el otro extremo, lo que hace posible sintetizar ARN tanto sentido como antisentido para experimentos posteriores, incluyendo la expresión en oocytes.

Ejemplo 2 Hibridación de Baja y de Alta Severidad

Las bibliotecas de cADN se hacen preferiblemente con el sistema \lambdaZAP-cADN descrito en el Ejemplo 1. Preferiblemente, se fabrica una sonda de hibridación a partir del ADN obtenido de los clones GluR1, GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, GluR6 o GluR7, o a partir de otro clon adecuado o de otra fuente adecuada. El ADN es marcado por el método de imprimación aleatoria, usando preferiblemente el kit de marcado de ADN Amersham Multiprime. Preferiblemente, se usan condiciones de hibridación de baja severidad, al menos al principio. Una disolución de hibridación adecuada es: (NaCl 1 M, Tris 50 mM [pH 8,0], SDS al 0,5%, pirofosfato de sodio al 0,1%, 100 mg/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado, 0,1% [p/v] de cada uno de los siguientes Ficoll, polivinilpirrolidona y albúmina de suero bovino). Para la monitorización de baja severidad, es preferible una temperatura de 50ºC, y los filtros de la biblioteca son lavados en 2 x SSPE (1 x SSPE es NaCl 180 mM, Na_{2}HPO_{4} 9 mM, NaH_{2}PO_{4} 0,9 mM y AEDT 1 mM, pH 7,4) a temperatura ambiente y expuestos a una película Kodak XAR-5 a -70ºC. Para la monitorización de alta severidad, se ajusta la temperatura a 65ºC y los filtros son lavados a esta temperatura en 0,2 x SSPE que contiene dodecilsulfato de sodio al 0,5%. Los filtros son expuestos a película Kodak XAR-5 con pantallas de intensificación Cronex Quanta II/III a -70ºC durante de 18 a 48 horas.

Bajo estas condiciones de hibridación de baja severidad, aproximadamente uno de cado dos mil clones de cADN de cerebro muestra alguna hibridación a la sonda fabricada a partir del injerto de cADN de GluR1.

Ejemplo 3 Análisis de los Clones Identificados por Hibridación

Se pueden usar al menos dos enfoques para analizar clones que son identificados mediante monitorización de la hibridación de baja severidad. Un enfoque es tomar clones \lambdaZAP positivos y reunirlos en mezclas de aproximadamente 100 clones. Se fabrica mARN in vitro a partir de estos conjuntos de clones \lambdaZAP y el mARN es inyectado en oocytes con el objetivo de evaluar la capacidad del mARN para dirigir la síntesis de receptores de glutamato funcionales. Si se descubre un clon positivo, el clon de cADN \lambdaZAP único es aislado subdividiendo el conjunto hasta que el clon funcional es aislado. (Véase Ejemplo 5, más adelante, para una discusión de cómo fue usado este enfoque para aislar el clon de GluR1). Un segundo enfoque que puede ser usado para evaluar clones positivos es analizar cada injerto de forma individual. Aunque esto puede ser tedioso, el enfoque del "clon individual" tiene la ventaja de que inicialmente no requiere expresión funcional. Si se usa el enfoque del "clon individual", cada clon es purificado en placa y el injerto de cADN es analizado individualmente. Esto se ve favorecido por el hecho de que, al menos en el sistema de cADN \lambdaZAP, el cADN es clonado en una casete flanqueada por el origen bacteriófago f1 de la replicación. El cADN está contenido dentro de un plásmido pBluescript que puede ser rescatado del bacteriófago \lambdaZAP por una infección auxiliar. (Una vez que se ha hecho esto el cADN está en el plásmido pBluescript pequeño, con el que es mucho más fácil trabajar que con el \lambdabacteriófago, más grande). El ARN sentido o antisentido se fabrica a partir de injertos de cADN en el plásmido pBluescript usando bien el promotor T3 (sentido) o el promotor T7 (antisentido).

Preferiblemente, el injerto de cADN también es mapeado con enzimas de restricción. Por ejemplo, los injertos de cADN son cortados con enzimas de restricción cortadoras frecuentes. Los fragmentos resultantes son fraccionados en tamaño en un gel y los fragmentos son transferidos a un filtro para el análisis Southern Blot. Los filtros son hibridazos con una sonda hecha a partir de receptores de glutamato conocidos, por ejemplo, GluR1, GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, GluR6 o GluR7. Los fragmentos de hibridación de cada clon son subclonados en el vector de cadena sencilla M13, (mp18 o mp19), y el fragmento es secuenciado. El secuenciamiento de ADN se lleva a cabo usando el método de terminación de cadena de didesoxinucleótido de Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 74, 5463 (1977), o mediante un secuenciador automático tal como el fabricado por Applied Biosystems. La secuencia es analizada preferiblemente mediante computadora usando software tal como los programas desarrollados por Intelligenetics, Staden y la Universidad de Wisconsin.

El mARN fabricado a partir de clones de longitud completa o casi completa es expresado en el sistema oocyte y las propiedades funcionales de los nuevos receptores son caracterizadas. Si un clon no es funcional cuando es expresado por sí mismo, es evaluado en presencia de mARN fabricado a partir de otros clones candidatos.

Ejemplo 4 Clonación de la Expresión y Ensayo en Xenopus Oocytes

Este ensayo es una adaptación del ensayo de Masu y col., Nature 329, 836 (1987). Se basa en el hecho de que si se inyecta a Xenopus oocytes mARN ajeno, el mARN es traducido en proteínas funcionales.

Las plantillas de ADN, tanto una preparación de cADN \lambdaZAP como un plásmido que contiene el cADN que se va a evaluar, son cortadas por debajo del injerto de cADN con una enzima de restricción. Las digestión post-restricción es digerida con Proteinasa K y, a continuación, extraída con dos extracciones fenol : cloroformo (1:1). La plantilla de ADN es precipitada a continuación con etanol. La plantilla es mezclada tanto con polimerasa de ARN T3, para fabricar la cadena sentido, como con polimerasa de ARN T7, para fabricar la cadena antisentido, más rATP, rCTP, rGTP, rUTP, e inhibidor de RNasa. Simultáneamente, los transcritos de ARN son limitados con un tope 7meGpppG.

A lo largo del procedimiento se llevan guantes y el agua es tratada con dietilpirocarbonato para desactivar RNasas.

Los tránscritos de mARN sintetizados in vitro son inyectados a Xenopus oocytes. Se inyectan 50 nl de una disolución de ARN, 0,2-0,6 mg/ml, en oocytes de etapa v. Los oocytes inyectados son incubados a 16ºC en un medio de Barth durante 2-7 días antes de ser analizados en busca de la presencia de receptores funcionales.

Se realizan registros de voltaje penetrando el oocyte con un microelectrodo rellenado con KCl 3 M y conectado al circuito puente de una unidad abrazadera de un voltaje apropiado. Los estudios de abrazadera de voltaje se llevan a cabo preferiblemente con dos electrodos, un electrodo de voltaje rellenado con KCl 3 M y un electrodo de corriente rellenado con CsCl 0,25 M, CsF 0,25 M y EGTA 50 mM. (Véase el Ejemplo 6, más adelante, para una discusión de los resultados de los registros de los oocytes inyectados con ARN a partir de cADN de GluR1 que codifica un receptor de glutamato KA/AMPA).

Antes de la inyección, los oocytes son preparados tomando ovarios de hembras adultas de Xenopus. El tejido de ovario es tratado con colagenasa, 2 mg/ml, durante 2 horas y, a continuación, el epitelio ovariano y las células foliculares son diseccionadas.

Ejemplo 5 Clonación de la Expresión del Receptor GluR1

Se inyectaron Xenopus oocytes con ARN poli (A)^{+} aislado a partir de cerebro anterior de rata. 2-10 días después, los oocytes fueron ensayados electrofisiológicamente en relación a su capacidad para responder a agonistas selectivos de los subtipos de receptores glutamato. Tanto el glutamato como el quiscualato eliminan despolarizaciones inducidas presentando un modelo bifásico compuesto por una respuesta de canal iónico activa, suave, presumiblemente sujeta a ligando, y una respuesta más duradera, fluctuante, probablemente mediada por un segundo mensajero. Las respuestas suaves provocadas por NMDA y KA con comienzos rápidos. El APB no dio respuesta.

Se construyó una biblioteca de ADN direccional (\lambdaZAPII RTB1; complejidad: 8 x 10^{5} elementos), que consiste en 18 subbibliotecas independientes de 44.000 clones cada una, a partir de este ARN poli (A)^{+} usando el vector de expresión bacteriófago \lambdaZAPII. Se inyectó en ooctytes un conjunto de tránscritos in vitro, compuesto de tránscritos fabricados de forma independiente a partir de todas las 18 subbibliotecas amplificadas. Se observaron pequeñas despolarizaciones (de 1 a 3 mV) en los registros de voltaje de los oocytes tratados con kainato 100 \muM 10 días después de la inyección. No se detectaron respuestas al NMDA o al quiscualato. Tampoco mostraron ninguna respuesta los oocytes no inyectados ni los oocytes a los que se les inyectó agua a los agonistas de receptor de glutamato. Posteriormente, se evaluaron conjuntos de 44.000 (= las subbibliotecas sencillas), 4.000, 400 y 40 clones. En cada una de estas pruebas al menos un conjunto respondió al KA. Se usaron los siguientes criterios a lo largo del procedimiento de monitorización para asegurarse de que las pequeñas respuestas observadas inicialmente no estaban registrando artefactos: (a) las respuestas en un oocyte dado fueron reproducibles, (b) las respuestas fueron rápidas (menos de un segundo tras la aplicación del agonista), (c) las respuestas fueron fácilmente reversibles después de la superfusión del oocyte con la disolución de Ringer de control, (d) el domoato 10 \muM proporcionó una respuesta similar al estimulado con kainato 100 \muM. Los conjuntos que proporcionaron las mayores respuestas en cada etapa fueron seleccionados para una mayor subdivisión. Los clones del conjunto positivo final de 40 clones fueron analizados en lo que se refiere al tamaño de su injerto, y los 12 clones con los mayores injertos (todos > 2 kb) fueron evaluados de forma individual para determinar su capacidad de dirigir la síntesis de un receptor de kainato funcional. Sólo se encontró un clon, que portaba un injerto de 3,0 kb, que diera respuesta al kainato y se le denominó \lambdaZAPII-GluR1.

Ejemplo 6 Caracterización Electrofisiológica y Farmacológica del Clon GluR1

El plásmido pGluR1 fue rescatado posteriormente del bacteriófago \lambdaZAPII-GluR1, y después de la transcripción in vitro el ARN sentido indujo respuestas a kainato cuando se inyectó en los oocytes, pero el ARN antisentido no. Cantidades tan pequeñas como 10 pg de tránscrito sentido de GluR1 bajo condiciones de abrazadera de voltaje
(-70mV de potencial sostenido) produjeron respuestas detectables al KA 100 \muM.

Con el objetivo de descartar la posibilidad de que el GluR1 codifique un factor de transcripción, los oocytes inyectados con tránscritos de pGluR1 in vitro fueron mantenidos en un medio complementado con 50 \mug/ml de actinomicina D para inhibir la transcripción endógena. Estos oocytes exhibieron las mismas respuestas al kainato que aquellos que fueron mantenidos en el medio de control. Por lo tanto, la transcripción inducida por la inyección del genoma de oocyte no parece probable que contribuya a las respuestas observadas.

El L-glutamato provoca respuestas mucho menores de lo que lo hizo el KA, e incluso a una concentración 1 mM provocó sólo un 50% de la despolarización observada con el KA 30 \muM. Esto es coherente con los informes previos acerca de que el glutamato es sólo un agonista débil del subtipo de receptor KA (Monaghan y col., Nature 306, 176 (1983)). Otros agonistas de receptor de glutamato tales como el NMDA, el quiscualato y el L-aspartato no provocaron respuestas cuando fueron aplicados a las concentraciones de 150 \muM, 10 \muM y 100 \muM, respectivamente. Otros agonistas de receptor de neurotransmisor no relacionados tales como la glicina, GABA, la serotonina y la nicotina tampoco provocaron respuestas, incluso cuando fueron probados a concentraciones superiores a 1 mM. La glicina no potenció la respuesta a KA. Se registró las curvas dosis-respuesta para el KA y el domoato y se dedujeron los valores EC_{50} para 39 \muM y para 1,8 \muM, respectivamente. El potencial de inversión medio extrapolado a partir de las respuestas actuales a kainato 10 \muM obtenidas en una serie de potenciales sostenidos entre 0 y -130 mV fue de 10 mV. Las respuestas a KA no redujeron la sensibilidad, ni siquiera después de una superfusión prolongada (de hasta 10 minutos) con elevadas concentraciones (100 \muM) del agonista. Estos descubrimientos también son coherentes con informes anteriores a partir de experimentos con receptores KA expresados a partir de ARN poli (A)^{+} total (Verdoorn y Dingledine, Molecular Pharmacology 34, 298 (1988)). De forma similar, el perfil farmacológico del GluR1 (véase la Tabla 1), como queda revelado por las propiedades de inhibición de diversos antagonistas de receptor de glutamato conocidos, es coherente con informes anteriores acerca de receptores KA en sistemas en los que se usó ARN poli

\hbox{(A) ^{+} }

total como fuente del mensaje del receptor de kainato (Hirono y col., Neurosci. Res. 6, 106 (1988); Lerma y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86, 2083 (1989)). De todos los compuestos evaluados (cada uno a una concentración de 1 mM), el antagonista de receptor de glutamato altamente específico de ácido kinurénico fue claramente el inhibidor más potente de las despolarizaciones provocadas por kainato en oocytes inyectados con ARN de GluR1 sintetizado in vitro. En menor medida, la \gamma-D-glutamilglicina (\gamma-DGG), de la que se ha publicado que bloquea preferentemente receptores KA y NMDA pero no receptores de quiscualato (Davies y Watkins, Brain Res. 206, 172 (1981)), inhibió las respuestas a kainato, tal como hizo el \gamma-D-glutamilaminometil-sulfonato (GAMS), que prefiere los receptores KA y AMPA, según se ha publicado (Fagg, Trends Neurosci. 8, 207 (1985)). De forma similar, el ácido 2,3-cis-piperidincarboxílico (PDA), que es conocido porque bloquea todos los subtipos de receptores de glutamato (Foster y Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103 (1984)), bloqueó la respuesta a GluR1. El dietiléster de glutamato (GDEE), que se cree que inhibe preferentemente receptores de glutamato de tipo AMPA (Foster y Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103 (1984)), no bloqueó la respuesta significativamente, sino que en vez de eso mostró propiedades de agonista débiles. Los antagonistas de receptor de NMDA ácido 2-amino-5-fosfonovalérico (APV) y 3-(2-carboxipiperacin-4-il)propil-1-fosfato (CPP), así como el NMDA por sí mismo, inhibieron ligeramente las respuestas a KA, actuando de este modo como antagonistas débiles. No mostraron ninguna propiedad de agonista.

Consideradas en conjunto, las propiedades electrofisiológicas observadas en oocytes inyectados con tránscrito de GluR1, así como las propiedades farmacológicas observadas, indican que el GluR1 representa un receptor funcional de KA indistinguible del observado en los oocytes inyectados con ARN de poli (A)^{+} total. De este modo, la subunidad de proteína sencilla codificada por GluR1 es suficiente para formar un complejo activo de canal iónico-receptor.

Ejemplo 7 Secuenciamiento y Estructura Primaria del GluR1

El injerto de ADN del plásmido GluR1 fue subclonado en M13mp19 y secuenciado (Fig. 1). Se descubrió un marco de lectura abierta de 2721 pb en una longitud total de 2992 pb. De este modo, la proteína predicha consiste en 889 aminoácidos, con un M_{r} calculado de aproximadamente 99.769. La secuencia de proteína deducida contiene un péptido de señal putativo de 18 aminoácidos en su extremo N, con una posición de ruptura predicha que se ajusta a las reglas empíricas (von Heijne, Nucl. Acids Res. 14, 4683 (1986)). Por lo tanto, se espera que el extremo N de la proteína esté localizado extracelularmente. Existen 6 posibles posiciones de N-glicosilación en el supuesto dominio extracelular. Las comparaciones de secuencia con otros canales iónicos secuenciados mediados por ligandos, los receptores de acetilcolina nicotínicos, los receptores GABA_{A} y los receptores de glicina, revelan poca homología general.

Todas las subunidades de canal iónico mediado por ligando secuenciadas con anterioridad a esta descripción tienen una región extracelular conservada caracterizada por 2 residuos de cisteína espaciados 14 aminoácidos entre sí, con residuos conservados de prolina y de aspartato localizados a 8 y a 10 aminoácidos, respectivamente, por debajo de la posición de la primera de estas dos cisternas (Barnad y col., Trends Neurosci. 10, 502 (1987)). La firma hipotética de los complejos canal-receptor neurotransmisor se conserva mal en la proteína codificada por GluR1. Los residuos de prolina y de aspartato están presentes, pero el primer residuos de cisteína está localizado sólo 7 residuos por encima del residuo de prolina, y el segundo residuo de cisteína no está presente.

Un análisis de gráfico de hidropatía de GluR1 reveló varias regiones que son candidatas para ser dominios de transmembrana (TMDs). La región entre los aminoácidos 455 y 810 era notable debido a que su perfil de hidropatía se parece al observado en los otros canales iónicos mediados por ligandos: tres TMDs putativos colocados muy próximos en el espacio que están separados por aproximadamente 175 residuos de aminoácido a partir de un cuarto TMD putativo que está localizado próximo al extremo C de la proteína. Dentro de esta región, las siguientes cuatro regiones de transmembrana son asignadas en GluR1: TMD I, localizado entre los residuos de aminoácido 463 y 480, TMD II entre los residuos 521 y 539, TMD III entre los residuos 596 y 614, y TMD IV entre los residuos 788 y 808.

Ejemplo 8 Aislamiento y Caracterización de GluR2 y de GluR3

Se aislaron clones de cADN que codifican los genes GluR2 y GluR3 a partir de una biblioteca de cerebro anterior de rata adulta usando un protocolo de monitorización de hibridación de baja severidad (véase el Ejemplo 2) y un fragmento radiomarcado del cADN de GluR1 como sonda. Las Figuras 3 y 4 muestran el nucleótido y la secuencia de aminoácidos derivada de los clones \lambdaRB14 (GluR2) y \lambdaRB312 (GluR3). Los pesos moleculares calculados para las formas maduras, no glicosiladas de GluR2 y de GluR3 son 96.400 daltons (862 aminoácidos) y 98.000 daltons (866 aminoácidos), respectivamente. Existen posiciones potenciales de glicosilación ligada a N en la proteína GluR2 en Asn 235, Asn 349, Asn 385, Asn 392, y Asn 835, y en la proteína GluR3 en Asn 35, Asn 238, Asn 352, Asn 387, y Asn 394. Igual que en el GluR1, el perfil de hidrofobicidad tanto para el GluR2 como para el GluR3 revela cinco regiones fuertemente hidrofóbicas: uno de dichos dominios está localizado en el extremo amino de cada proteína y tiene las características de un péptido señal, mientras que las otras cuatro regiones hidrofóbicas forman probablemente hélices que atraviesan membranas (MSR I-IV) y están localizadas en la mitad terminada en carboxi de cada polipéptido.

La Figura 5 es un alineamiento de las secuencias de aminoácidos deducidas para las proteínas codificadas por los genes GluR1, GluR2 y GluR3 (y GluR4 y GluR5). Como demuestran las secuencias alineadas, existe una identidad significativa entre el GluR1 y los GluR2 (70%) y GluR3 (69%), así como entre el GluR2 y el GluR3 (74%). (Véase también la Tabla 2). La identidad de secuencia es más pronunciada en la mitad terminada en carboxi de cada proteína.

Ejemplo 9 Comparación Electrofisiológica: GluR1, GluR2 y GluR3

La fuerte similitud de secuencia entre las proteínas codificadas por GluR1, GluR2 y GluR3 sugería que, como con el GluR1, las proteínas de GluR2 y de GluR3 podrían funcionar como canales iónicos homoméricos sensibles al kainato en los Xenopus oocytes. Para probar esta hipótesis, los oocytes fueron inyectados con tránscritos de ARN sintetizados in vitro derivados a partir de clones de cADN individuales. La Figura 6A muestra que tanto los oocytes inyectados con GluR2 como los inyectados con GluR3 se despolarizan en respuesta a la aplicación en baño de KA 100 \muM.

Las amplitudes de las respuestas a KA no fueron equivalentes en las tres subunidades de receptor de glutamato: para cantidades iguales de ARN inyectado (2 ng), las respuestas en los oocytes inyectados con ARN GluR3 fueron invariablemente mayores que las respuestas correspondientes al GluR1. Las despolarizaciones provocadas por KA en los oocytes inyectados con GluR2 fueron las más débiles y sólo pudieron ser detectadas en los oocytes inyectados con cantidades mucho mayores de ARN (de 10 a 25 ng).

Los datos de la Figura 6B muestran que, además de al KA, los oocytes inyectados con ARN GluR1 o GluR3 también responden a QUIS (10 \muM), AMPA (50 \muM), glutamato (GLU, 100 \muM). No se obtuvieron respuestas con NMDA (30 \muM más glicina 10 \muM) o con APB (50 \muM). Las respuestas obtenidas con los oocytes inyectados con ARN GluR2 eran demasiado pequeñas para una cuantificación reproducible y, por lo tanto, fueron excluidas del análisis. Para los oocytes inyectados con GluR1 las respuestas a AMPA y QUIS fueron típicamente un 35-40% de la máxima respuesta a KA, mientras que para el GluR3 fueron aproximadamente del 10% de la respuesta a KA. Referido a KA, la respuesta con el GluR1 a ácido domoico (DOM, 10 \muM) es aproximadamente 6 veces mayor que la observada con el GluR3. Considerados en conjunto, estos datos demuestran que los receptores reunidos a partir de subunidades de GluR1 o de GluR3 son farmacológicamente distintos. Además, la observación de que los receptores homoméricos de GluR1 y de GluR3 responden tanto a QUIS como a AMPA, aunque con eficacias reducidas, proporciona una evidencia directa de que el KA, el QUIS y el AMPA pueden unirse al mismo polipéptido receptor de glutamato.

La Figura 6B también muestra que el perfil farmacológico de los oocytes inyectados con ARN de subunidad individual de GluR1 o de GluR3 es significativamente diferente al observado en oocytes inyectados con ARN poli (A)^{+} de hipocampo de cerebro de rata. Este descubrimiento sugiere que las respuestas observadas en los oocytes inyectados con ARN de hipocampo están mediadas por receptores de glutamato heteroméricos reunidos a partir de varias combinaciones de polipéptidos subunidad GluR1, GluR2 y GluR3. Esta propuesta se ve respaldada por el hecho de que los tres genes de subunidad de GluR son transcritos activamente en el hipocampo.

Ejemplo 10 Comparación Farmacológica de GluR1, GluR2 y GluR3

Este ejemplo aborda la cuestión de si los receptores de glutamato reunidos a partir de mezclas de las proteínas codificadas por los genes subunidad GluR1, GluR2 y GluR3 tienen propiedades farmacológicos significativamente diferentes entre sí o de las observadas en receptores de subunidad sencillos.

Una comparación de los datos de la Figura 6B y de la Figura 7B sugiere que, para los agonistas evaluados, hay pocas diferencias sustanciales en la farmacología. Sin embargo, las respuestas a QUIS, AMPA y GLU son, referidas al GluR1, se redujeron significativamente en los oocytes que expresan las combinaciones de subunidades. Excepto para la respuesta a NMDA, los perfiles de agonistas generales para los oocytes inyectados con combinaciones de subunidades de GluR son más similares a los de los oocytes que contienen ARN poli (A)^{+} que a los de los inyectados solamente con ARN de las subunidades GluR1 o GluR3.

Ejemplo 11 Comparación de Corrientes Activadas por KA Registradas a partir de GluR1, GluR2 y GluR3

La Figura 7A compara las corrientes activadas por KA registradas para los oocytes inyectados con mezclas de las subunidades GluR1, GluR2 y GluR3 (columnas punteadas) con las corrientes sumadas medidas para las subunidades individuales (columnas en blanco). El descubrimiento principal es una potenciación significativa de las corrientes provocadas por KA en los oocytes que coexpresan la subunidad GluR1 más la subunidad GluR2 (aproximadamente un incremento de 4 veces la suma de las respuestas de los oocytes inyectados de forma individual), o la subunidad GluR2 más la subunidad GluR3 (aproximadamente un incremento de 2 veces). La inyección de los tres ARNs de subunidad da como resultado una media de un incremento de 2,5 veces en las corrientes provocadas por el KA.

Estos resultados confirman la conclusión de que, en los oocytes, los polipéptidos de subunidad de receptor de glutamato individuales no se comportan de un modo independiente sencillo, sino que interaccionan unos con otros. Es probable que dicha interacción dé como resultado la generación de receptores de glutamato heteroméricos con propiedades que son diferentes de las de los receptores comprendidos en subunidades de receptor de glutamato solitarias.

Ejemplo 12 Relaciones de Corriente-Voltaje para Respuestas Provocadas por KA

Este ejemplo examina las relaciones corriente-voltaje (I/V) de las respuestas provocadas por KA medidas en los oocytes inyectados con subunidades GluR individuales, con combinaciones suyas o con ARN poli (A)^{+} de hipocampo.

Los datos de I/V se muestran en la Figura 8 en la que los oocytes inyectados con ARNs de subunidades de receptor de glutamato individual son mostrados en el panel A, los oocytes inyectados con combinaciones de subunidades son mostrados en los paneles B y C, y con fines comparativos, los oocytes que expresan hipocampos de ARN poli

\hbox{(A) ^{+} }

también son mostrados en el panel A. Las respuestas a KA medidas en los oocytes inyectados con ARN poli (A)^{+} de cerebro muestran una relación I/V aproximadamente lineal con un potencial inverso de aproximadamente -10 mV. Este resultado contrasta fuertemente con las curvas I/V obtenidas para los oocytes inyectados con ARN de subunidad GluR1 o GluR3 individualmente. Las curvas I/V para el GluR1 y para el GluR3 muestran una fuerte rectificación hacia dentro y potenciales inversos próximos a -40 mV. A partir de estos datos, está claro que los receptores sensibles a KA presentes en los oocytes inyectados con ARN de hipocampo son diferentes de los reunidos por oocytes inyectados con ARNs de subunidad GluR1 o GluR3.

En la Figura 8B la curva I/V de la combinación del GluR1 más el GluR2 es claramente diferente de la observada para la subunidad GluR1 por sí sola. Los oocytes inyectados con este par de ARNs muestran una representación I/V casi lineal y tienen un potencial inverso de aproximadamente -10 mV. Esta representación es sorprendentemente similar a la observada con oocytes inyectados con ARN de hipocampo (panel A). Por el contrario, la curva I/V de la combinación del GluR1 más el GluR3 es solo ligeramente diferente de las medidas en oocytes que expresan las subunidades individuales. La Figura 8C muestra alguna rectificación hacia dentro en la curva I/V para la combinación de las subunidades GluR2 y GluR3, así como un potencial inverso algo más negativo (-20 mV) que los gráficos I/V determinados para el GluR1 más el GluR2 o para el ARN de hipocampo (-10 mV). Cuando se combinan los ARNs de las tres subunidades de receptor de glutamato en un único oocyte, la curva I/V resultante se aproxima a la observa para la combinación de GluR1 más GluR2 tanto en potencial inverso como en pendiente; sin embargo, las respuestas con las tres subunidades muestran una pronunciada rectificación hacia dentro no observada con la suma de GluR1 más GluR2.

Ejemplo 13 Distribución de mARN de GluR1, GluR2 y GluR3 en el Sistema Nervioso Central de Mamíferos

La hipótesis de que las proteínas codificadas por los genes GluR1, GluR2 y GluR3 se reúnen para formar receptores de glutamato heteromérico in vivo puede ser rebatida por el hecho de que los genes de subunidad individual son transcritos en diferentes lugares neuroanatómicos. Por lo tanto, la distribución de ARNs de GluR1, GluR2 y GluR3 en el cerebro de rata adulta fue examinada usando sondas de ARN antisentido radiomarcadas e histoquímica de hibridación in situ esencialmente como se ha descrito en Deneris, y col., J. Biol. Chem. 264, 6268 (1989). Los resultados indicaron que los modelos de hibridación obtenidos con las sondas GluR1, GluR2 y GluR3 fueron casi idénticos, observándose la mayor hibridación en las regiones CA1-CA3 del hipocampo y del giro dentado. Los análisis de alta resolución de estas áreas sugieren que la señal de hibridación se origina en la capa de células piramidales de las regiones CA1-CA3 y la capa de células granulares del giro dentado. Se observó una hibridación algo más débil de las tres sondas en el cortex piriforme, en el caudato-putamen, en la amígdala, y en el hipotálamo. Se detectaron niveles bajos en el tálamo, con poca o ninguna señal observada en los tractos fibrilares. Mientras que se observó hibridación diferencial en la habenula media y en el neocortex, los modelos globales de expresión para los genes de las subunidades GluR1, GluR2 y GluR3 mostraron una sustancial concordancia.

Ejemplo 14 Aislamiento de cADNs para GluR4 y GluR5

Usando un fragmento de cADN de GluR2 (nucleótidos 1793 a 2240) como sonda y un protocolo de hibridación de baja severidad, se aislaron varios clones de GluR4 y R5 a partir de una biblioteca de cerebro de rata. El análisis de la secuencia demostró que ninguno de los clones de cADN contenía un marco de lectura abierta completo. El análisis de Northern blot con mARN de otros tejidos de cerebro de rata adulta diferentes indicó que los tránscritos de GluR4 y de GluR5 eran los más abundantes en el cerebelo. Por consiguiente, los clones de cADN de GluR4 y GluR5 parciales fueron usados como sondas bajo condiciones de monitorización de alta severidad para aislar cADNs que codifican marcos de lectura abierta grandes a partir de una biblioteca de cADN de cerebelo de rata.

De los clones de cADN aislados de este modo, dos clones relativos a GluR4 (\lambdaCER112 y \lambdaCER121B) codificaron sólo porciones del gen de GluR4 pero poseían una superposición suficiente para crear un constructo expresable de longitud completa en el vector pBS SK (+) (Stratagene Cloning Systems). La secuencia de nucleótidos de este constructo de GluR4, designado como pK45, fue determinada y la secuencia de aminoácidos deducida se presenta en la
Figura 9.

Entre los 29 cADNs relacionados con el GluR5 aislados a partir de la biblioteca de cerebelo, se identificó tres clones, especificados como \lambdaRB12, \lambdaRB15 y \lambdaRB20, que codificaban un marco de lectura abierta grande idéntico. La secuencia del clon de cADN \lambdaRB20 (GluR5-1) se muestra en la Figura 10. El \lambdaRB15 y el \lambdaRB12 son más cortos que el \lambdaRB20 en el extremo 5'. El cADN de \lambdaRB20 consiste en una región 5' no traducida de 187 pb, en un marco de lectura abierta continuo de 2760 pb, y en una región 3' no traducida de 303 pb. La región 5' no traducida termina con la secuencia AAGATGG que es característica de una posición de inicio de traducción.

También fueron examinados tres clones de cADN adicionales aislados originalmente a partir de una biblioteca de cerebro anterior. Las secuencias de estos cADNs son idénticas a las de \lambdaRB20 en la región de la posición predicha de inicio de la traducción. El análisis de la secuencia reveló que dos variantes del cADN de GluR5 están representadas en las bibliotecas de cerebro anterior y de cerebelo. Esta heterogeneidad deriva de la inserción de 45 nucleótidos descubierta en el \lambdaRB20 y en 17 de los 29 clones de cADN relativos a GluR5 aislados (Figura 10). Esta inserción no interrumpe el marco de lectura abierta. Además, no hay posiciones dadoras o aceptoras de empalme de consenso (Breathnach y Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50, 349-383 (1981)), lo que sugiere que la inserción no surge de un intrón no empalmado y es, más probablemente, el resultado de un suceso de empalme alternativo. Por lo demás, el análisis de la secuencia de nucleótidos indica que las dos variantes de GluR5 son idénticas.

No se descubrió ningún clon de cADN para la variante de empalme más corta que codifica el marco de lectura abierta completo. Por lo tanto, se construyó un clon (\lambdaRB\Delta20) que carece de la inserción de 45 nucleótidos descubierta en el \lambdaRB20 (GluR5-1) pero que, por lo demás, es idéntico a ese clon. El clon de variante de empalme más corta (\lambdaRB\Delta20) es denominado GluR5-2. Tanto el \lambdaRB20 como el \lambdaRB\Delta20 son usados en los experimentos de expresión con Xenopus oocyte (véase el Ejemplo 16) y las proteínas variantes codificadas fueron denominadas GluR5-1 y GluR5-2, respectivamente.

El mARN de GluR4 fue detectado con el análisis de Northern blot del ARN de cerebelo como una especie de 4,5 kb. El menor tamaño del mARN puede representar variantes de empalme. El análisis de Northern blot también indicó que el mARN principal de GluR5 tiene un tamaño de 6 kilobases.

Ejemplo 15 Características Estructurales del cADN y de la Proteína de GluR5

La traducción de la secuencia de nucleótidos del cADN del GluR5-1 predice un único marco de lectura abierta largo de 920 residuos de aminoácido (Figura 10). La secuencia de GluR5 tiene una identidad global de secuencia de aminoácidos con cada una de las subunidades KA/AMPA (Figura 5, y Tabla 2). La inserción de 15 aminoácidos en el GluR5-1 es única entre las proteínas presentadas, siendo por tanto la variante más corta del GluR5-2 la contrapartida de las subunidades KA/AMPA caracterizadas. La Tabla 2 muestra que el GluR5 es por tanto de lejos la subunidad de receptor de glutamato más diferente identificada y la comparación de GluR5 con las subunidades KA/AMPA resalta los elementos más conservados de la secuencia (Figura 5). En otras familias de canales iónicos mediados por ligandos, el receptor de acetilcolina neuronal, el receptor GABA_{A} y las familias de receptor de glicina, el dominio extracelular del extremo N es mayoritariamente conservado mientras que las secuencias terminadas en C divergen entre las regiones paso de membranas (MSR) III y IV. En la familia de genes de subunidad de receptor de glutamato, por el contrario, las regiones N-terminales de la MSR I propuesta (Hollmann, y col., Nature 342, 643 (1989)), sólo tienen un 17% de identidad y son menos similares que las regiones de extremo C de la MSR I que tienen un 45% de identidad. El "lazo Cys-Cys", una firma de los complejos de canal de receptor neurotransmisor mediados por ligandos (Barnard, y col., Trends. Neurosci. 10, 502 (1987)) no se conserva en la familia de subunidades de receptor de glutamato (Figura 5). Se sugiere que la mitad del extremo C de las subunidades de receptor de glutamato está involucrada en la formación de canales y que contiene las hélices de paso de membranas postuladas (MSR I-IV; Figura 5) (Hollmann, y col., Nature 342, 643 (1989)). La MSR III supuesta es la secuencia continua más conservada, con tan sólo un cambio de aminoácido conservativo (Val por Ile) en la proteína de GluR5 (Figura 5). Como se ha mencionado anteriormente, en otras familias de canales mediados por ligandos el segmento entre la MSR III y la IV es divergente en longitud y secuencia. En la familia de subunidades de receptor de glutamato la similitud en este segmento postulado es elevada (48%) y sólo el GluR5 exhibe una variación en la longitud de la secuencia. Los receptores KA/AMPA y la proteína GluR5 son generalmente divergentes en el extremo C de la MSR IV propuesta.

El gráfico de hidrofobicidad para el GluR5 es similar a los de los receptores KA/AMPA, lo que sugiere una estructura secundaria conservada en el canal iónico propuesto que forma la porción de la proteína. Sin embargo, la mitad del extremo N del gráfico de hidrofobicidad de GluR5 no es usual. En esta región, el GluR5, en comparación con las subunidades KA/AMPA, es más hidrófobo y contiene varios segmentos que podrían atravesar la membrana. En base a algoritmos que investigan las hélices asociadas a membranas, se pueden asignar al GluR5 cuatro (Rao y Argos, Biochim. Biophys. Acta 869, 197-214 (1986)) o siete (Eisenberg, y col., J. Mol. Biol. 179, 125-142 (1984)) regiones transmembrana putativas.

Una comparación de las regiones del extremo C de todas las subunidades de receptor de glutamato entre las proteínas de unión a KA de la rana (Gregor, y col., Nature 342, 689 (1989)) y del pollo (Wada, y col., Nature 342, 684 (1989)) demuestra una extensión similar de la conservación de secuencia (de 35 a 40% de identidad de aminoácidos). Una búsqueda FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 2444 (1988)) en las bases de datos GenBank, EMBL y SWISS-PROT con la secuencia del GluR5 no reveló similitudes significativas a otras proteínas.

Ejemplo 16 Propiedades Electrofisiológicas de Oocytes Inyectados con mARN de GluR5 Expuestos a L-Glutamato

Los cARNs de GluR5-1 y GluR5-2 sintetizados in vitro fueron expresados individualmente en Xenopus oocytes. Con cualquier cARN, los agonistas de receptor de glutamato KA (100 \muM), AMPA (50 \muM), quiscualato (10 \muM), APB (100 \muM) y NMDA (100 \muM, aplicado con glicina 10 \muM) no provocaron despolarizaciones de membrana en oocytes inyectados con cARN. Sin embargo, se registraron despolarizaciones de membrana débiles inducidas por L-glutamato (100 \muM) en los oocytes inyectados con cARN de GluR5-1 (despolarización máxima 3,5 mV) y con cARN de GluR5-2 (despolarización máxima 4,5 mV).

No se descubrieron despolarizaciones de membrana significativamente más fuertes en respuesta al L-glutamato en los oocytes coinyectados con cARN de GluR5-1 y de GluR5-2 en comparación con los oocytes inyectados sólo con cARN de GluR5-2. Para cualquier oocyte particular inyectado con cARN de GluR5-1 y de GluR5-2, las despolarizaciones fueron reproducibles, mostraron un comienzo rápido, y fueron invertidos lentamente (en 5 minutos) cuando la superfusión de agonista fue trasladada a superfusión de disolución tampón. Ni los oocytes no inyectados ni los oocytes inyectados con agua mostraron una respuesta a los agonistas de receptor de glutamato evaluados. Se registraron respuestas a L-glutamato en 7 (de 7) oocytes para el GluR5-1 (despolarización de membrana 2,29 \pm 0,26 mV s.e.m) y 29 (de 33) oocytes para el GluR5-2 (2,27 \pm 0,19 mV s.e.m).

Ejemplo 17 Distribución del mARN de GluR4 y de GluR5 en los Sistemas Nerviosos Central y Periférico en Desarrollo

Para el estudio del desarrollo de la expresión del gen GluR4 y del R5, se analizaron secciones de ratones desde el día embrionario 10 (E10) hasta el día posnatal 21 (P21) usando hibridación y histoquímica in situ.

En el CNS completo, se detectó una expresión difusa de los genes de GluR4 y R5 en E10. Estas primeras señales de hibridación se originan en las neuronas postmitóticas. Esto queda mejor demostrado en el mielencéfalo a E12. La capa ependimal está enfrentada al canal neural y contiene neuroblastos divisores. No se detectó ninguna hibridación en estas células. Las células postmitóticas están localizadas en la parte exterior del tubo neural y expresan ambos genes. Más adelante en el desarrollo los tránscritos para el GluR5 y, en menor medida, para el GluR4 fueron particularmente pronunciados en áreas en las que las neuronas se diferencian y se reúnen en núcleos. Estos cambios temporales en el modelo de hibridación se observaron mejor para el GluR5 en los núcleos sensoriales primarios de la médula oblonga y en los núcleos de los pons que se hibridaron más intensamente que las estructuras circundantes. A E14, la expresión de gen de GluR5 fue particularmente intensa en varios núcleos de cerebro discretos, mientras que la expresión de gen de GluR4 fue detectable en todas las partes rostral y caudal del cerebro. Durante el desarrollo postnatal, la distribución espacial de los tránscritos de genes de GluR4 no cambiaron, pero normalmente se detectaron cantidades de mARN menores que las últimas etapas embrionarias. Por el contrario, la expresión de gen de GluR5 pareció hacerse más restringida espacialmente durante el desarrollo y los niveles de tránscrito fueron regulados a la baja. Se hicieron evidentes cambios extremos en el modelo de hibridación de GluR5 temporal en el cortex cerebelar. Hasta el P12, se detectaron altos niveles de tránscrito de GluR5 en la capa de células granulares y de Purkinje. Más adelante, la intensidad de las señales de hibridación en la capa de células granulares fue reducida en relación a la capa de células de Purkinje y comenzando en el P14, sólo una tenue señal de hibridación fue detectada en el capa de células granulares. En general, aquellas regiones del cerebro que exhibieron un etiquetado denso durante el desarrollo embrionario también presentaron niveles de tránscrito detectables en los adultos. En los animales P21 se observaron los mayores niveles de tránscrito de GluR4 en las capas de células del bulbo olfativo, del hipocampo, del cerebelo y de la retina. En la retina, se descubrió una fuerte hibridación en la capa de células de ganglionares y en las células amadrinas de la capa nuclear interior. No se detectó expresión en las células de Muller. Para el GluR5, se descubrieron las mayores señales de hibridación a P21 en el bulbo olfativo, en la amígdala, en el coliculo y en algunos núcleos hipotalámicos.

En el sistema nerviosos periférico (PNS) en desarrollo, los ensayos de hibridación mostraron que los genes de GluR4 y R5 están expresados en grados variables en los ganglios craneales (por ejemplo, ganglio trigeminal, ganglios acústicos), en los ganglios de raíz dorsal y en los ganglios murales de los órganos intestinales. Comparable al CNS, los tránscritos del PNS son detectados a E10 para el GluR4 y a E11 para el GluR5. Durante el desarrollo, las señales de hibridación para el GluR4 aumentan continuamente hasta las primeras etapas postnatales y, a continuación, persisten con una intensidad similar en los adultos. Las señales de hibridación para el GluR5 aumentan hasta E16 y permanecen con una intensidad comparable en las etapas de desarrollo posteriores. En los animales postnatales, los ganglios de raíz dorsal (GluR5) y los ganglios murales de los órganos intestinales (GluR4 y GluR5) presentan mayores niveles de hibridación que el CNS. La autoradiografía de alta resolución en los ganglios de raíz dorsal demuestra la hibridación de la sonda de GluR5 sobre las células neuronales, mientras que las células satélites no están marcadas.

Ejemplo 18 Distribución del mARN de GluR4 y de GluR5 en el Cerebro Adulto de Mamífero (Rata)

La distribución de los tránscritos de mARN de GluR4 y de GluR5 en el CNS adulto fue estudiada mediante hibridación in situ. En la región del cerebro anterior, se detectaron niveles elevados de tránscritos de GluR4 en el Cal y en el giro dentado del hipocampo, en la habenula media y particularmente en el núcleo talámico reticular. El hipocampo mostró solo una expresión débil del gen de GluR5 y no fueron detectados tránscritos en la habenula media. La señal de hibridación de GluR5 fue intensa en el cortex cingular y piriforme, en varios núcleos hipotalámicos, en la amígdala y en el septum lateral. En el cerebelo, los modelos de hibridación para las sondas de GluR4 y R5 estaban solapados pero eran distintos. Ambas sondas fueron detectadas a niveles elevados en la capa de células de Purkinje. En la capa de células granulares la sonda de GluR4 produjo un fuerte marcado, mientras que el marcado con la sonda de GluR5 fue débil.

Ejemplo 19 Aislamiento de GluR6 y de GluR7

Los clones de cADN que codifican los genes de GluR6 y de GluR7 fueron aislados a partir de una biblioteca de cerebro anterior de rata adulta usando un protocolo de monitorización de hibridación de baja severidad (véase el Ejemplo 2) y un fragmento radiomarcado de aproximadamente 1,2 kb (nucleótidos 705-2048) del cADN de GluR5 como sonda. Los clones seleccionados fueron identificados mediante mapeado y secuenciamiento de digestión de restricción. La Figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos derivada del clon de GluR6; la Figura 12 muestra lo mismo para fragmentos 35-T3 (Fig. 12 A) y U35 (Fig. 12 B) a partir del clon de GluR7.

Ejemplo 20 Ensayos relacionados con GluR

Los cADNs, los mARNs, las proteínas de GluR, y fragmentos funcionales suyos, son útiles en varios ensayos diseñados para identificar y caracterizar receptores y ligandos de L-glutamato. Por ejemplo, los cADNs son útiles como sondas para identificar miembros adicionales de la familia de genes de receptor de glutamato. Los mARNs transcritos a partir de los ADNs de la invención son especialmente útiles en ensayos diseñados para identificar y caracterizar tanto receptores como ligandos funcionales. Este uso es especialmente importante para la identificación y diseño de compuestos que pueden afectar la función de receptor de L-glutamato.

En un ensayo para identificar y caracterizar receptores funcionales, el mARN es tránscrito a partir de ADNs de la invención (tanto de longitud completa como de fragmentos suyos producidos por eliminaciones, sustituciones, síntesis, etc.) y, a continuación, fueron traducidos para producir proteínas de GluR. En el modo preferido, los mARNs son introducidos en oocytes, preferiblemente Xenopus oocytes. Las proteínas de receptor de glutamato expresadas son expuestas a continuación a ligandos conocidos por unirse funcionalmente a receptores de glutamato y activarlos. Las características electrofisiológicas de las proteínas de receptor de glutamato son medidas, y se concluye que aquellas que forman canales iónicos funcionales son receptores de glutamato funcionales.

En un ensayo relacionado diseñado para identificar ligandos funcionales de receptores de glutamato, proteínas conocidas por unirse funcionalmente a compuesto(s) que activa(n) receptores de glutamato son puestas en contacto con al menos un compuesto "desconocido" o de prueba en los que se busca determinar su capacidad para inducir a los receptores de glutamato a formar canales iónicos. Las propiedades electrofisiológicas de los receptores de glutamato son medidas después de la exposición a el(los) compuesto(s) de prueba, y se concluye que aquellos que pueden efectuar una respuesta de canal iónico son ligandos funcionales de receptores de glutamato.

Figuras Breve descripción de las figuras

La siguiente es una breve descripción de las figuras.

Las figuras comprenden 10 Figuras, de las cuales:

La Figura 1 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon GluR1.

La Figura 2 (a y b) comprende dos análisis de homología de secuencias. La Figura 2a compara la región extracelular localizada entre los residuos de aminoácido 89 y 106 del GluR1, encontrándose la región "lazo-Cys-Cys" en todos los demás canales iónicos mediados por ligando, lo que muestra homología de secuencia. La Figura 2b compara la región putativa TMD II del GluR1 con regiones TMD II hipotéticas de otros canales iónicos mediados por ligandos, lo que sugiere conservación de la secuencia de proteína.

La Figura 3 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon GluR2.

La Figura 4 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon GluR3.

La Figura 5 es una representación que muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos deducidas para las subunidades GluR1, GluR2, GluR3, GluR4 y GluR5 (GluR5-1) de la familia de genes de receptor de glutamato.

La Figura 6 (A y B) consta de dos gráficos que comparan respuestas de corrientes medidas en Xenopus oocytes que han sido inyectados con ARNs individuales de las subunidades GluR1, GluR2 y GluR3 (Figura 6A) o con ARN poli (A)^{+} de hipocampo de cerebro de rata (Figura 6B).

La Figura 7 (A y B) consta de dos gráficas que comparan respuestas de corriente medidas en Xenopus oocytes que han sido inyectados con combinaciones de ARNs de GluR1, GluR2 y GluR3.

La Figura 8 consta de tres gráficos que ilustran la dependencia de las respuestas de corriente con respecto a KA 100 mM en el potencial de membrana.

La Figura 9 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon GluR4.

La Figura 10 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon de cADN que codifica la subunidad de receptor de glutamato GluR5-1.

La Figura 11 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon GluR6.

La Figura 12 (A y B) es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de los fragmentos 35-T3 y U35 del clon GluR7.

Descripción detallada de las figuras

Figura 1. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon pGluR1. Los nucleótidos son numerados en la dirección del extremo 5' al extremo 3', comenzando con el primer nucleótido del codón del residuo putativo del extremo amino de la proteína madura. Se predice que la ruptura del péptido señal supuesto (von Heijne, Nucl. Acids Res. 14, 4683 (1986)) se produce en la posición 1. A los nucleótidos localizados por encima de la base del extremo 5' predicha se les ha asignado números negativos. Los nucleótidos -1 a -54 codifican un péptido señal putativo (von Heijne, supra), y las bases de la -55 a la -251 representan una región 5' sin traducir. En el extremo 3' del clon se descubrieron 71 nucleótidos de la secuencia sin traducir. La secuencia de aminoácidos deducida para el GluR1 se muestra por encima de la secuencia de nucleótidos, comenzando la numeración con el primer residuo de la proteína madura. Las posibles posiciones de N-glicosilación extracelular están marcadas con un asterisco por encima del residuo de aminoácido. La región marcada con dos flechas (aminoácidos 89-103) mantiene cierto parecido con la signatura de canal iónico mediada por ligandos postulada por algunos investigadores (Grenningloh y col., Nature 330, 25 (1987); Barnard y col., TINS 10, 502 (1987)).

Figura 1, Métodos. El injerto de cADN del clon de bacteriófago \lambdaZAPII-GluR-K1 fue cortado con Eco RI/Xho I, redondeado y subclonado en la posición-I Sma del vector bacteriófago M13mp19 (Messing y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 74, 3642 (1977)), dando lugar a clones con ambas orientaciones del cADN. Se construyeron subclones eliminados solapados para cada orientación de la cadena usando el kit Cyclone^{TM} de USB.

El secuenciamiento de cadena sencilla mediante el método de terminación de cadena de didesoxinucleótidos (Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 74, 5463 (1977)), fue llevado a cabo con todos los 45 subclones, y adicionalmente, 10 prímeros de oligonucleótido fueron sintetizados para facilitar el secuenciamiento entre áreas donde se encontraron compresiones o huecos en las secuencias derivados de los subclones eliminados. Las secuencias completas para ambas cadenas fueron obtenidas de este modo. Se usaron paquetes de software de IntelliGenetics (IntelliGenetics versión 5.0, y PC/Gene^{TM}) para analizar las secuencias.

Figura 2a. Comparación de la región extracelular localizada entre los residuos de aminoácido 89 y 106 del GluR1 con la región "lazo-Cys-Cys" encontrada en todos los demás canales iónicos mediados por ligando, mostrando homología de secuencia. Las secuencias de subunidades naChR \alpha1, \beta1, \gamma, \delta proceden de músculo de ratón (Heinemann y col., en: Molecular Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (ed. Heinemann, S. & Patrick, J.) 45-96 (Plenum Press, Nueva York, 1987)), aquellas de las subunidades naChR \alpha2, \alpha3, \alpha4, \beta2, \beta3 y \beta4 proceden de cerebro de rata (Deneris y col., J. Biol. Chem. 264, 6268 (1989); Duvoisin y col., Neuron 3, 487 (1989)).Las subunidades \alpha y \beta de GABA_{A} proceden de cerebro de ternero (Barnard y col., Trends Neurosci. 10, 502 (1987)). GlyR 48k es la subunidad de M_{r} = 48 kDa del receptor de glicina procedente de cerebro de rata (Grenningloh y col., Nature 328, 215-220 (1987)). Se encuentran residuos de aminoácido enmarcados en posiciones idénticas en el GluR1 así como en al menos una de las otras secuencias de receptor. Se ha introducido arbitrariamente un hueco.

Figura 2b. Comparación de la región putativa TMD II del GluR1 con regiones TMD II hipotéticas de otros canales iónicos mediados por ligandos (Barnard y col., Trends Neurosci. 10, 502 (1987); Deneris y col., J. Biol. Chem. 264, 6268 (1989); Duvoisin y col., Neuron 3, 487 (1989); Grenningloh y col., Nature 328, 215 (1987); Heinemann y col., en: Molecular Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (ed. Heinemann, S. & Patrick, J.) 45-96 (Plenum Press, Nueva York, 1987)) 1987), que sugiere la conservación de la secuencia de proteína.

Figura 3. La secuencia de nucleótidos y la secuencia deducida de aminoácidos del clon de cADN lRB14 que codifica el gen de la subunidad de receptor de glutamato de rata GluR2. Los nucleótidos están numerados en la dirección 5' a 3', que empieza con el primer nucleótido en el codón que corresponde al residuo putativo del extremo amino de la proteína madura. Los nucleótidos que se extienden hacia 5' de la base 1 son designados con números negativos e incluyen la región que codifica el péptido señal putativo y la región 5' sin traducir. Existen 5 posiciones de glicosilación unidas a N potenciales localizadas en Asn-235, Asn-349, Asn-385, Asn-392, y Asn-835. La masa molecular calculada de la forma madura no glicosilada de la proteína de GluR2 es 96.400 daltons. El asterisco indica un codón de terminación de la traducción.

Figura 4. La secuencia de nucleótidos y la secuencia deducida de aminoácidos del clon de cADN IRB312 que codifica el gen de la subunidad de receptor de glutamato de rata GluR3. Los nucleótidos están numerados en la dirección 5' a 3', que empieza con el primer nucleótido en el codón que corresponde al residuo putativo del extremo amino de la proteína madura. Los nucleótidos que se extienden hacia 5' de la base 1 son designados con números negativos e incluyen la región que codifica el péptido señal putativo y la región 5' sin traducir. Existen 5 posiciones de glicosilación unidas a N potenciales localizadas en Asn-35, Asn-238, Asn-352, Asn-387, y Asn-394. La masa molecular calculada de la forma madura no glicosilada de la proteína de GluR3 es 98.000 daltons. El asterisco indica un codón de terminación de la traducción.

Figura 5. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos deducidas para las subunidades de receptor de glutamato de rata. Los residuos idénticos en todas las secuencias comparadas están recuadrados, se introdujeron espacios para maximizar la homología. Los péptidos señal predichos y las cuatro regiones de paso de membrana propuestas (MSR I-IV) están indicados. Dos cabezas de flecha (\blacktriangledown) delimitan una región en el GluR1 de la que se propone (Hollman, y col., Nature 342, 643 (1989)) que corresponde al lazo "cys-cys" descubierto en otras subunidades de canal iónico mediadas por ligandos (Barnard, y col., Trends. Neurosci. 10, 502 (1987)). La línea trazada denota la inserción de 15 residuos de aminoácido encontrados en el GluR5-1, pero no en la proteína de GluR5-2.

Figura 6. Comparación de las respuestas de corriente medidas en Xenopus oocytes que han sido inyectados con ARNs individuales de las subunidades GluR1, GluR2 y GluR3 o con ARN poli (A)^{+} de hipocampo de cerebro de rata. (A) Respuestas de los oocytes a KA 100 mM medidas 3 días después de la inyección de ARN individual de GluR1 (2 ng), GluR2 (10 ng) o GluR3 (2 ng). El injerto muestra ejemplos de trazas de registro de voltaje obtenidas a partir dichos oocytes excepto que la respuesta de GluR2 fue obtenida 5 días después de la inyección de 25 ng de ARN. (B) Respuestas de oocytes a los agonistas indicados medidas 3 días después de la inyección con ARN de GluR1 (2 ng) o de GluR3 (2 ng) o con ARN poli(A)^{+} de hipocampo de cerebro de rata adulta (ap. 50 ng). Todos los valores están normalizados a la respuesta obtenida con KA 100 mM y son presentados como la media \pm S.E.M. con n \geq 3 para todas las medidas. Todos los oocytes fueron cortados en voltaje hasta -70 mV y se llevaron a cabo registros como se describe en Hollmann, y col., Nature 342, 643 (1989).

Figura 7. Comparación de respuestas de corriente medidas en Xenopus oocytes que han sido inyectados con combinaciones de ARNs de GluR1, GluR2 y GluR3. (A) Respuestas de los oocytes a KA 100 mM medidas 3 días después de la inyección de 2 ng de ARN de cada una de las subunidades de GluR indicadas. Las columnas en blanco representan la suma de las respuestas medidas en oocytes que expresan los ARNs individuales de las subunidades de GluR, mientras que las columnas punteadas muestran las amplitudes medidas después de la coexpresión de los ARNs de las subunidades de GluR en oocytes individuales. (B) Respuestas de oocytes a los agonistas indicados medidas 3 días después de la inyección con 2 ng de ARN para cada una de las subunidades de GluR indicadas o con 50 ng de ARN poli(A)^{+} de hipocampo de cerebro de rata. Los valores han sido normalizados a la respuesta obtenida con KA 100 mM y son presentados como la media \pm S.E.M. con n \geq 3 para todas las medidas. Todos los oocytes fueron cortados en voltaje hasta -70 mV y se llevaron a cabo registros como se describe en Hollmann, y col., Nature 341, 643 (1989).

Figura 8. La dependencia de las respuestas de corriente a KA 100 mM con el potencial de membrana. (A) Datos obtenidos a partir de oocytes que han sido inyectados con ARN poli (A)^{+} de hipocampo de cerebro de rata (50 ng, Cuadrado Negro, \sqbullet), con ARN de GluR1 (Cuadrado Blanco, \boxempty ) o de GluR3 (Círculo Blanco, \circ); (B) con ARN de GluR1 más ARN de GluR2 (Cuadrado Negro, \sqbullet) o con ARN de GluR1 más ARN de GluR3 (Cuadrado Blanco, \boxempty); y (C) con ARN de GluR2 más ARN de GluR3 (Cuadrado Negro, \sqbullet) o con los ARNs de las tres subunidades de GluR(Cuadrado Blanco, \boxempty ). Se realizaron registros de los oocytes 3 días después de la inyección de 2 ng de ARN para cada subunidad de GluR. Los voltajes fueron escalonados de 10 en 10 mV entre -150 mV y +50 mV y todos los valores están normalizados respecto a la respuesta medida a -70 mV.

Figura 10. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de un único clon de cADN (\lambdaRB20) que codifica la subunidad de receptor de glutamato de rata GluR5-1. La secuencia de aminoácidos deducida se muestra por encima de la secuencia de nucleótidos. Se predice la ruptura del péptido señal supuesto en la posición de aminoácido 1 (von Heijne, Nucl. Acids. Res. 14, 4683 (1986)). Esta posición de ruptura está después de un residuo de prolina, lo que es atípico. A los aminoácidos que codifican el péptido señal se les asignó números negativos. Los nucleótidos son numerados en la dirección de 5' a 3', comenzando con el primer residuo del codón para el residuo putativo del extremo amino de la proteína madura. Los nucleótidos en el lado 5' del residuo de aminoácido 1 son indicados con números negativos. Los codones de parada que flanquean el marco de lectura abierta (ORF, del inglés "open reading frame") son denotados con "FIN", las señales de poliadenilación están subrayadas. Las posiciones de glicosilación unida a N potenciales están indicadas mediante asteriscos (*). Dos cabezas de flecha (\blacktriangledown) delimitan la inserción de 45 nucleótidos entre los nucleótidos 1113 y 1159 descubierta en el \lambdaRB20, pero no en 12 de los 29 clones de cADN aislados.

TABLAS

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ a = % de la respuesta provocada por kainato 30  \mu M
inmediatamente antes de la aplicación del fármaco.\cr 
\+ \begin{minipage}[t]{150mm} b = % de la respuesta observada
solo con kainato 30  \mu M inmediatamente antes de la aplicación de
la mezcla
fármaco/kainato\end{minipage} \cr}

Los oocytes habían sido inyectados con 1,25 ng de ARN de sentido de GluR1 in vitro 3 días antes del registro. Los oocytes fueron sometidos en voltaje a -70 mV, y los compuestos evaluados (todos a 1 mM, excepto el kainato, que fue 30 \muM) aplicados mediante superfusión rápida, con intervalos de 5 minutos entre fármacos. Los picos de corrientes fueron registrados, y cada número representa la media de 3 registros a partir de 3 oocytes diferentes, \pm SEM. La respuesta de corriente al 100% corresponde a 40-200 nA, dependiendo del oocyte.

3

Sumario de especificación

De la descripción precedente, alguien con conocimientos normales en la técnica puede entender que la presente invención describe segmentos de ADN sustancialmente puros que codifican una familia de proteínas de subunidad de receptor de glutamato. Los receptores de glutamato de la invención son proteínas, o fragmentos funcionales suyos, que tienen las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas características de los receptores de glutamato, incluyendo los subtipos de receptor de glutamato seleccionados del grupo que consiste en N-metil-D-aspartato (NMDA), AMPA o quiscualato, kainato (KA) y 2-amino-4-fosfonobutirato (APB). Los nuevos receptores de glutamato de la presente invención están ejemplificados por proteínas codificadas mediante los clones de cADN GluR1, GluR2 y GluR3, y combinaciones funcionales suyas, así como mediante fragmentos de péptido codificados por ellos. Tanto los genes de receptor de glutamato como las proteínas de receptor de glutamato de la presente invención son útiles para la monitorización de fármacos. Además, los cADNs de GluR1-GluR3 pueden ser usados como sondas, por aquellos con conocimientos en la técnica, sin una excesiva experimentación, para identificar y aislar otros nuevos y únicos receptores de glutamato. Dichos nuevos y únicos receptores de glutamato se encuentran expresamente dentro del alcance de la presente invención.

Sin distanciarse de la esencia ni del alcance de esta invención, una persona con conocimientos ordinarios puede realizar varios cambios y modificaciones en la invención para adaptarla a varios usos y condiciones. Como tales, estos cambios y modificaciones están adecuadamente, equitativamente, y pretenden estar, dentro del intervalo completo de equivalencia de las siguientes reivindicaciones.

Claims (20)

1. Método para la producción de proteínas sustancialmente puras, o de fragmentos suyos, o de combinaciones de dichas proteínas y/o dichos fragmentos, en el que dichas proteínas o fragmentos o combinaciones generan una señal neuronal en respuesta a la unión de ligandos de glutamato o similares a glutamato de al menos un receptor(es) seleccionado del grupo que consiste en GluR1 (Figura 1), GluR2 (Figura 3) y GluR3 (Figura 4) y en el que dichas proteínas o fragmentos o combinaciones son codificadas por ADN que tiene al menos un 40% de homología de secuencia de nucleótidos con al menos un miembro del grupo de dichos receptores de glutamato, que comprende la etapa de producir dichas proteínas o fragmentos.

2. Método para la producción de proteínas sustancialmente puras, o de fragmentos suyos o de combinaciones de dichas proteínas y/o dichos fragmentos, en el que dichas proteínas o fragmentos o combinaciones generan una señal neuronal en respuesta a la unión de ligandos de glutamato o similares a glutamato de al menos un receptor(es) seleccionado del grupo que consiste en GluR1 (Figura 1), GluR2 (Figura 3) y GluR3 (Figura 4) y en el que las proteínas o fragmentos o combinaciones tienen al menos un 40% de homología de aminoácidos con al menos un miembro de dicho grupo de receptores de glutamato, que comprende la etapa de producir dichas proteínas o fragmentos.

3. Método para la producción de proteínas, o de fragmentos suyos, o de combinaciones de dichas proteínas y/o dichos fragmentos de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dichas proteínas o fragmentos o combinaciones de dichas proteínas y/o dichos fragmentos generan una señal neuronal en respuesta a la unión de ligandos de glutamato o similares a glutamato de un subtipo de receptor de glutamato seleccionado del grupo que consiste en los subtipos N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propiónico (AMPA), kainato (KA) y 2-amino-4-fosfonobutirato (APB), que comprende la etapa de producir dichas proteínas o fragmentos.

4. Método para la producción de proteínas, o de fragmentos suyos, o de combinaciones de dichas proteínas y/o dichos fragmentos de la reivindicación 3, en el que dichas proteínas o fragmentos o combinaciones generan una señal neuronal en respuesta a la unión de ligandos de glutamato o similares a glutamato de un receptor de glutamato de los subtipos KA y/o AMPA, que comprende la etapa de producir dichas proteínas o fragmentos.

5. Método para la producción de proteína sustancialmente pura seleccionada del grupo de proteínas que consiste en GluR1 (Figura 1), GluR2 (Figura 3) y GluR3 (Figura 4) y combinaciones suyas, en el que dichas combinaciones son funcionales como receptor(es) de glutamato, que comprende la etapa de producir dichas proteínas o fragmentos.

6. Método para la producción de las proteínas de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dichas proteínas son seleccionadas del grupo que consiste en GluR1 (M_{r} aprox. 99.769), GluR2 (M_{r} aprox. 96.400) y GluR3 (M_{r} aprox. 98.000), que comprende la etapa de producir dichas proteínas o fragmentos.

7. Método para la producción de ADN sustancialmente puro que codifica proteínas funcionales, o fragmentos funcionales suyos, que generan una señal neuronal en respuesta a la unión de ligandos de glutamato o similares al glutamato de al menos un receptor(es) de glutamato seleccionado del grupo que consiste en GluR1 (Figura 1), GluR2 (Figura 3) y GluR3 (Figura 4), en el que dicho ADN tiene al menos un 40% de homología de secuencia de nucleótidos con al menos un miembro de dicho grupo de receptores de glutamato, que comprende la etapa de producir dicho ADN o fragmentos.

8. Método para la producción de ADN sustancialmente puro que codifica proteínas funcionales, o fragmentos funcionales suyos, que generan una señal neuronal en respuesta a la unión de ligandos de glutamato o similares al glutamato de al menos un receptor(es) de glutamato seleccionado del grupo que consiste en GluR1 (Figura 1), GluR2 (Figura 3) y GluR3 (Figura 4), en el que dicho ADN codifica una proteína que tiene al menos aproximadamente un 40% de homología de aminoácidos con al menos un miembro de dicho grupo de receptores de glutamato, que comprende la etapa de producir dicho ADN o fragmentos.

9. Método para la producción del ADN de las reivindicaciones 7 u 8, en el que dichas proteínas codificadas o fragmentos generan una señal neuronal en respuesta a la unión de ligando de glutamato o similar al glutamato de un subtipo de receptor de glutamato seleccionado del grupo que consiste en los subtipos N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propiónico (AMPA), kainato (KA) y 2-amino-4-fosfonobutirato (APB), que comprende la etapa de producir dicho ADN o fragmentos.

10. Método para la producción del ADN de la reivindicación 9, en el que dichas proteínas o fragmentos codificados generan una señal neuronal en respuesta a la unión de ligandos de glutamato o similares al glutamato de receptores de glutamato de los subtipos KA y/o AMPA, que comprende la etapa de producir dicho ADN o fragmentos.

11. Método para la producción de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 8 ó 9, en el que dicho ADN es seleccionado del grupo que consiste en ADN de GluR1 (Figura 1), de GluR2 (Figura 3) y de GluR3 (Figura 4), que comprende la etapa de producir dicho ADN o fragmentos.

12. Método para la producción de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 8 ó 9, en el que dicho ADN codifica una proteína de receptor de glutamato seleccionada del grupo que consiste en GluR1 (M_{r} aprox. 99.769), GluR2 (M_{r} aprox. 96.400) y GluR3 (M_{r} aprox. 98.000), que comprende la etapa de producir dicho ADN o fragmentos.

13. Método para la producción del ADN de las reivindicaciones 8 ó 9, en el que dicho ADN es funcionalmente equivalente al ADN seleccionado del grupo que consiste en GluR1, GluR2 y GluR3, que comprende la etapa de producir dicho ADN o fragmentos.

14. Método para la producción de sondas de ADN que comprenden GluR1 (Figura 1), GluR2 (Figura 3) y GluR3 (Figura 4), cADN o fragmentos suyos, en el que dichos fragmentos tienen al menos 20 pares base de longitud y proceden del carboxilo contiguo que codifica los extremos de dichas secuencias de ADN, que comprende la etapa de producir dichas sondas de ADN o fragmentos.

15. Método para la producción de las sondas de ADN de la reivindicación 14, en el que dichas sondas proceden de canales iónicos que codifican porciones de dichas secuencias de cADN, que comprende la etapa de producir dichas sondas de ADN o fragmentos.

16. Método para la producción de secuencias de mARN sentido o antisentido transcritas a partir de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 8 ó 9, que comprende la etapa de producir dichas sondas de ADN o fragmentos.

17. Método para la producción de oocytes no humanos que expresan el mARN sentido o antisentido de la reivindicación 16, que comprende la etapa de introducir dicho mARN en los oocytes.

18. Un método para identificar, en una muestra de prueba, ADN homólogo al ADN que codifica la(s) proteína(s) de receptor de glutamato, comprendiendo dicho método poner en contacto ADN de prueba con el ADN sonda de la reivindicación 14 bajo condiciones de hibridación de alta o de baja severidad e identificar ese ADN de prueba que se hibrida con dicha sonda como homólogo al ADN que codifica la(s) proteína(s) de receptor de glutamato.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dichas secuencias de ADN usadas como sondas incluyen el canal iónico que codifica parte(s) de GluR1, GluR2 y GluR3.

20. Un método para determinar si una sustancia es un ligando funcional para al menos una proteína receptora de glutamato seleccionada del grupo que consiste en GluR1 (Figura 1), GluR2 (Figura 3) y GluR3 (Figura 4), comprendiendo dicho método poner en contacto dicho receptor de glutamato funcional con dicha sustancia, monitorizar la actividad de canal iónico e identificar como ligandos funcionales a aquellas sustancias que provocan una respuesta de canal iónico.