ES2210310T3 - Procedimiento obtenido para aumentar la inmunogenicidad, producto obtenido y composicion farmaceutica. - Google Patents
Procedimiento obtenido para aumentar la inmunogenicidad, producto obtenido y composicion farmaceutica.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA AUMENTAR LA INMUNOGENICIDAD DE UN ANTIGENO, CARACTERIZADO PORQUE EL ANTIGENO ESTA ASOCIADO POR INTERACCIONES ESTABLES A UN VECTOR PARTICULAR, LLEVANDO DICHO VECTOR; UN NUCLEO HIDROFILO NO LIQUIDO, UNA CAPA EXTERNA DE COMPUESTOS ELEGIDOS EN EL GRUPO QUE COMPRENDE LOS FOSFOLIPIDOS Y LOS ACIDOS GRASOS. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN PRODUCTO ASI OBTENIDO Y A UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LO CONTIENE.
Description
Procedimiento obtenido para aumentar la
inmunogenicidad, producto obtenido y composición farmacéutica.
La presente invención se refiere a un
procedimiento que permite aumentar la inmunogenicidad de un antígeno
y a la utilización de los productos susceptibles de obtenerse.
El citomegalovirus humano (CMV), un herpes virus
en estado latente en los individuos inmunocompetentes es responsable
de patologías muy diversas y frecuentemente mortales en caso de
inmunodepresión (fetos, transplante, Sida, leucemia, cáncer) (véase
para reseña (1)). El CMV es la fuente principal de malformaciones
congénitas de origen infeccioso. Por todas estas razones el CMV
plantea un grave problema de salud publica. La lucha contra este
virus está limitada a la quimioterapia por antivirales no
específicos como Ganciclovir® y Foscarnot®, cuyos efectos
secundarios y la nefrotoxicidad han sido descritos. En materia de
prevención, la inmunoterapia pasiva (inyección de gammaglobulinas)
disminuye la incidencia de la primera infección en los transplantes
de médula seronegativos. En los transplantes (alotransplantes de
médula, riñón, corazón e hígado), la infección por CMV está asociada
al rechazo del órgano. Los receptores, medicados con
inmunosupresores (ciclosporina) son tratados con Ganciclovir®
durante el transplante y reciben gammaglobulinas durante los tres
meses siguientes a la intervención. La inyección intravenosa con
altas dosis de inmunoglobulinas en estos pacientes ha permitido, en
determinados casos, una reducción de la frecuencia de las neumonías
y de los rechazos. Esto plantea el problema no despreciable del muy
elevado coste asociado a estos tratamientos. La infección
oportunista por CMV en los individuos HIV+ es una de las más
dramáticas y necesita una quimioterapia por antivirales.
Las economías realizadas elaborando una política
de prevención de enfermedades ligadas a la infección por CMV en los
individuos con riesgo serían sustanciales. En efecto, estimaciones
del coste asociado a la vacunación de un individuo y a la
realización (de análisis serológicos, de vacunaciones, tratamiento
de los efectos secundarios menores) efectuadas en los Estados
Unidos (2) muestran que este coste sería de alrededor de 50 veces
inferior al de los cuidados aportados a un recién nacido víctima de
una infección congénita. La infección por CMV se observa en 2/3 de
los transplantes renales y con una frecuencia elevada en los otros
transplantes. Si está asociada a complicaciones en alrededor de 1/3
de entre ellos, el coste anual añadido al coste del transplante es
considerable. A pesar del impacto de fármacos como el Ganciclovir® o
la inyección de gammaglobulinas sobre la enfermedad, la prevención
de la infección primaria y la reactivación en estos pacientes debe
ser una prioridad. Los beneficios de la inmunización son evidentes
tanto en el plano clínico como en el económico.
La puesta a punto de una vacuna
anti-CMV debería permitir frenar el desarrollo de
las patologías asociadas a las infecciones congénitas vacunando a
las mujeres jóvenes antes y durante el embarazo, asegurando la
protección de las enfermas en espera de transplantes y de iniciar
una respuesta anti-citomegalovirus en los
individuos HIV+ asintomáticos. La utilización de virus muertos no
parece apropiada ya que los extractos virales no inducen, en
general, respuesta de tipo TCD8+ citotóxica. El virus atenuado
plantea el problema del carácter oncogénico, de la latencia y de la
reactivación de las partículas vírales. El desarrollo de vacunas
recombinantes que deberían permitir evitar estos riesgos, necesita
el conocimiento de antígenos o fragmentos de antígenos (epítopos)
los más inmunógenos del agente infeccioso. El objetivo de la
vacunación es la inducción de una inmunidad protectora. Una
aproximación racional de la vacunación debe implicar tres etapas:
(I) la identificación de los mecanismos efectores responsables de
la protección, (II) la elección de un antígeno capaz de inducir una
respuesta en todos los individuos, y (III) la utilización de una
vía de administración de la vacuna capaz de inducir el tipo de
respuesta deseada (humoral: anticuerpos, celular: citotóxica y
auxiliar).
La defensa del organismo contra una infección
viral está asegurada esencialmente por el desarrollo de una
respuesta inmunitaria humoral (producción de anticuerpos
neutralizantes) que impida la adsorción del virus en la superficie
celular de una parte y de una respuesta celular de otra parte
(células TCD8+ citotóxicas y TCD4+ auxiliares) que elimina las
células infectadas y que inhiba la replicación viral (síntesis de
citoquinas (TNF\alpha, IFN\gamma...)). En lo que se refiere al
citomegalovirus humano, entre las 200 proteínas codificadas por el
ADN bicatenario (230 kpb), tres de entre ellas son las mayores
dianas respectivas de estos diferentes tipos de respuesta: la
glicoproteína de envolvente gB (3), la fosfoproteína del tegumento
pp65 (4) y la fosfoproteína de regulación IE1 (5).
Si la puesta a punto de una vacuna
anti-CMV parece ser una necesidad, subsiste el
problema general de la vectorización de los antígenos recombinantes.
Los antígenos introducidos en estructuras sintéticas deben ser
capaces de iniciar o de restaurar una respuesta inmunitaria B y T
(auxiliar CD4+ y citotóxica CD8+) duradera, que aseguren así la
protección de los individuos contra una infección primaria, una
reinfección o una reactivación del virus latente. La activación de
las células T (células células con memoria) está ligada a la
capacidad de presentación del antígeno por las células presentadoras
del antígeno de las cuales las más importantes son las células
dendríticas, los linfocitos B y los macrófagos. En este contexto las
partículas vectoras deben permitir el acceso a las vías de
presentación endógena (clase 1, TCD8+) y exógena (clase II, TCD4+).
La sociedad Biovector Therapeutics ha desarrollado un tipo de
estructura llamada Biovector Supramolecular constituida por un
núcleo polisacarídico (NPS) revestido por un cinturón de ácidos
grasos (CA) o de fosfolípidos (BVSM) del cual se puede hacer variar
la composición. La malla polisacarídica posee un grado de
reticulación modulable, puede ser funcionalizada (radical aniónico o
catiónico), es muy estable, y permite la fijación de una cantidad
importante de antígeno en el interior del núcleo tanto como en
su
periferia.
periferia.
De manera inesperada, la firma solicitante ha
encontrado que la asociación de una proteína o de un péptido con
estos vectores permitía observar una potencialización de la
respuesta inmunógena con relación a la desencadenada por la
administración del antígeno solo.
Es por lo que la presente invención tiene por
objeto un procedimiento para aumentar la inmunogenicidad de un
antígeno, caracterizado porque el antígeno se asocia por enlaces
iónicos y/o hidrófobos a un vector en forma de partículas,
incluyendo dicho vector:
- -
- un núcleo hidrófilo no líquido
- -
- una capa externa constituida por compuestos lipídicos elegidos en el grupo que incluye fosfolípidos y ácidos grasos.
De preferencia, el núcleo está constituido por
una matriz de polisacáridos o de oligosacáridos natural o
químicamente reticulados. Según uno de los aspectos de la
invención, se injertan ligandos iónicos en el núcleo, pudiendo este
ligando llevar especialmente una función elegida en el grupo que
incluye: fosfatos, sulfatos, ácidos carboxílicos, amonios
cuaternarios, aminas secundarias, aminas primarias.
Los vectores que permiten la puesta en práctica
del procedimiento pueden tener un tamaño comprendido entre 10 nm y 5
\mum, y resultados particularmente ventajosos se obtienen para
tamaños comprendidos entre alrededor de 25 nm y de 200 nm,
especialmente del orden de 80 nm.
La asociación de un antígeno a vectores en forma
de partículas acilados o fosfolipidados aumenta especialmente la
respuesta proliferativa de clones de células TCD4+ in vitro
a este antígeno, en presencia de leucocitos de sangre periférica y
de linfocitos B/EBV aislados. Los rendimientos de asociación del
antígeno a las partículas son elevados y los complejos obtenidos
son muy estables en medio fisiológico. La puesta de manifiesto de
una potencialización de la respuesta proliferativa T subraya las
propiedades notables de estos biovectores y el interés de su
utilización potencial en vacunación.
Estos resultados no se han obtenido con una
simple mezcla, sin interacción previa, del antígeno y del vector en
forma de partículas.
El antígeno se asocia al vector en forma de
partículas por enlaces iónicos y/o hidrófobos.
La capa externa del vector en forma de partículas
está constituida por ácidos grasos naturales fijados al núcleo por
enlaces covalentes. Según otro aspecto, esta capa externa está
constituida por fosfolípidos naturales o sintéticos.
La invención tiene igualmente por objeto un
producto susceptible de obtenerse por el procedimiento descrito, y
que incluye una asociación que potencializa la inmunogenicidad, de
un antígeno unido por enlaces iónicos y/o hidrófobos a un vector en
partículas, incluyendo dicho vector en partículas:
- un núcleo hidrófilo no líquido y,
- una capa externa, asociada al núcleo por
interacciones hidrófobas y/o enlaces iónicos, y constituida por
compuestos elegidos en el grupo que incluye fosfolípidos y ácidos
grasos. En este producto que potencializa la inmunogenicidad el
antígeno es una proteína del CMV.
Las notables propiedades de estos vectores pueden
en efecto ser explotadas para la encapsulación de antígenos del CMV
humano, con el objetivo de concebir una vacuna recombinante que
asociaría los antígenos IE1, pp65 y gB por las razones mencionadas
anteriormente. Tal producto sería capaz de engendrar una respuesta
humoral y citotóxica.
El antígeno pues puede ser especialmente la
proteína IE1 del CMV, o un fragmento de esta proteína.
Se ha producido y purificado un fragmento de la
proteína viral recombinante IE1 del Citomegalovirus humano (cepa
Towne), bajo la forma de una proteína de fusión
(GST-e4) en E.coli. La asociación de la
proteína a diferentes tipos de partículas (NPS, CA y BVSM) de 80 nm
es muy estable y los rendimientos muy elevados. Hemos descrito un
efecto adjuvante de los complejos antígeno (Ag)/partículas en la
respuesta proliferativa de clones TCD4+ específicos in
vitro. Este efecto ha sido observado utilizando como células
presentadoras del antígeno leucocitos de sangre periférica y
linfocitos B transformados por EBV (B/EBV).
La proliferación de clones T anti IE1 en
presencia de GST-e4 recombinante soluble o asociada
a partículas sugiere que el acoplamiento del antígeno viral a la
GST bacteriana, la ausencia de fosforilación de la proteína en este
sistema de expresión procariota, y la asociación a biovectores no
tiene influencia sobre la naturaleza de los péptidos epítopos
generados por las células presentadoras. Una de las hipótesis, por
la cual la firma solicitante no intenta de ninguna manera limitar la
invención, es que el efecto adjuvante observado cuando el antígeno
está asociado a las partículas podría estar correlacionado con una
captura más importante de proteína, por la célula presentadora que
cuando el antígeno es soluble, como ha sido constatado por la firma
solicitante. La concentración del antígeno en los compartimentos
endo-lisosomales podría favorecer la interacción de
las moléculas de clase II con péptidos vírales más bien que con
péptidos endógenos o exógenos procedentes de proteínas del suero por
ejemplo. Esto tendría como consecuencia la expresión de un mayor
número de complejos DR-péptido IE1 en la superficie
celular. El efecto potencializador observado con los CA podría ser
unido a una mayor accesibilidad del antígeno. Los vectores que hemos
utilizado han permitido la incorporación de una masa importante de
antígeno por simple mezcla en solución acuosa. Esto representa una
ventaja importante con relación a los protocolos de encapsulación en
otros tipos de partículas como los lisosomas (6).
Es posible que el efecto adjuvante observado
pueda también ser mediado por una opsonización de las partículas,
haciendo intervenir la interacción entre IgG séricas o fragmentos
del complemento como C3b y sus receptores respectivos a la
superficie de las células presentadoras.
La firma solicitante ha mostrado que una proteína
de fusión más estable que e4 sola, entre el fragmento e4 del CMV y
la glutation-S-transferasa (GST),
preparada por ingeniería genética puede ser utilizada en los
vectores según la invención, sin necesitar una etapa de separación
con el fin de eliminar la parte GST. Esto representa un progreso
considerable ya que una tal proteína es fácilmente purificable y la
supresión de la etapa de separación permite aumentar el rendimiento
y considerar su producción a gran escala.
El objetivo de la vacunación es inducir la
maduración de células implicadas en la eliminación específica de un
agente patógeno y de mantener clones de células con memoria
específicas de los antígenos diana en la circulación y en los
órganos linfoides secundarios. Se ha descrito (7) la contribución
importante de las células B en tanto que células presentadoras del
antígeno a la activación de las células T Se ha mostrado que la
célula B no endocita eficazmente los antígenos solubles, a baja
concentración, más que por el intermedio de su inmunoglobulina de
superficie. Los trabajos destinados a direccionar liposomas a los
linfocitos B recurrían a la fijación a su superficie de anticuerpos
monoclonales (8) destinados a interactuar con las inmunoglobulinas
de superficie de estas células. La frecuencia de los linfocitos B
específicos es muy reducida, el efecto observado aquí utilizando
partículas debería permitir amplificar la respuesta T específica al
antígeno complejado sin pasar por un reconocimiento para los
linfocitos B específicos. La presentación de un Ag a las células
TCD4+ activada induce, además de su proliferación, la secreción de
citoquinas y la expresión de moléculas de superficie importantes
para la proliferación y la diferenciación de las células B en
plasmocitos que secretan anticuerpos.
Según otro aspecto, la invención tiene por objeto
una utilización de un vector en forma de partículas para la
preparación de un medicamento útil para aumentar la inmunogenicidad
de un antígeno. Esta utilización incluye un antígeno asociado a un
vector en forma de partículas según las modalidades definidas
anteriormente.
Los ejemplos que siguen están destinados a
ilustrar la invención sin limitarla de ninguna manera. En estos
ejemplos, nos referiremos a las figuras siguientes:
Los lisados de bacterias no recombinantes (1) y
recombinantes GST-e4 (2) se sometieron a una
SDS-PAGE y se colorearon con azul de Coomassie.
Después de pasarlos sobre columna de
afinidad-glutation, los eluatos se analizaron en las
mismas condiciones (2, 4). Está indicado el peso molecular aparente
de los marcadores (M).
Los lisados bacterianos se sometieron a una
SDS-PAGE después se transfirieron sobre membrana de
nitrocelulosa. Una incubación de la membrana en presencia del
anti-péptido 85.75 reveló la presencia de
GST-e4 en el lisado total (5), el depósito y el
sobrenadante de ultrasonido (4, 3), y en la fracción retenida sobre
la columna de afinidad (2). La pista 1 contenía un lisado de
bacterias no recombinantes. La figura 4.B corresponde a la
autorradiografía de la membrana.
Cantidades crecientes de GST-e4
fría (50 a 400 \mug) fueron preincubadas con BVSM (100 \mug).
Los complejos así formados, se incubaron en presencia de GST- e4
radiomarcada (GST-e4^{*}) y la proporción de
asociación (cpm) de la proteína caliente se determinó por recuento
después de ultrafiltración en Microsop 300.
Complejos GST-e4^{*}/partícula
se incubaron en medio RPMI/SVF a 37ºC de 0 a 6 días. El porcentaje
de GST-e4^{*} asociado al término de cada periodo
de incubación se determinó por recuento después de
ultrafiltración.
El antígeno radiactivo
GST-e4^{*}, libre o asociado a partículas (NPS,
CA, BVSM) se incubó en presencia de 5 x 10^{5} linfocitos B/EBV en
RPMI/SVF, a 37ºC durante 15 horas. El porcentaje de captura (A), la
cantidad de antígeno asociado a las células (B), y la cantidad de
antígeno encontrado en el medio (C) están representados en función
de la concentración en proteína en los pocillos.
El antígeno radiactivo
GST-e4^{*}, libre o asociado a partículas (NPS,
CA, BVSM) se incubó en presencia de 5 x 10^{5} células Mono Mac 6
en RPMI/SVF, a 37ºC durante 15 horas. El porcentaje de captura (A),
la cantidad de antígeno asociado a las células (B), y la cantidad de
antígeno encontrado en el medio (C) están representados en función
de la concentración en proteína en los pocillos.
Las células del clon A3 se incubaron en
presencia de linfocitos B/EBV irradiados y de antígeno soluble solo
(GST, GST- e4), o con CA vacíos (CA + GST-e4), y con
el antígeno asociado a CA (CA/GST-e4). La
proliferación se determinó por la incorporación de
^{3}HJ-timidina, medida en cpm.
La GST-e4 se protegió de la
proteólisis gracias a su fijación a biovectores.
GT-e4 libre o asociada a NPS, se incubó con tripsina
(relación en masa 1/600), y se puso fin a la reacción como se
indica. Se sometieron muestras a una SDS-PAGE, y la
GST-e4 de 82 kDa se cuantificó por exploración
densitométrica del gel. Los resultados se expresaron en porcentaje
de la GST-e4 de partida.
La respuesta de los linfocitos TCD4+ a la
GST-e4, se mejoró in vitro después de la
fijación a biovectores con PBL como CPA. Las células que provenían
del clon "BeA3" se cultivaron en presencia de PBL irradiados y
de diferentes concentraciones de GST-e4 (A) y de
GST (B), bajo forma libre o de partículas.
Se mejoró in vitro la respuesta de los
linfocitos T CD4+ a GST-e4 después de la fijación a
biovectores con linfocitos B transformados por el virus EBV, como
CPA. Las células que provenían del clon "BeA3" se cultivaron en
presencia de células B transformadas por EBV e irradiadas, y de
diferentes concentraciones de GST-e4 (A) y de GST
(B), bajo forma libre o de partículas.
Los vectores utilizados en este estudio derivaban
todos del mismo núcleo polisacarídico sintetizado a partir del mismo
lote (NPS). Estos NPS fueron bien sea acilados con ácido palmítico
(CA), bien sea fosfolipidados con diferentes tipos de fosfolípidos
(BVSM).
100 g de Maltodextrina (Glucidex 6, Roquettes),
conforme a la monografía maltodextrina de la Farmacopea US NF XVII,
se disolvieron en 17 ml de agua bajo agitación mecánica violenta
después se transfirieron a un reactor de vidrio, al cual se
añadieron entonces 2,4 g de NaBH_{4}. Media hora mas tarde, se
añadieron 44 ml de sosa 10 N después 9,72 ml (0,124 moles) de un
agente reticulante, la epiclorhidrina (Fluka). Después de 90
minutos de reacción a temperatura ambiente, se añadieron 31,18 g de
un agente cationizante, hidroxicolina (cloruro de
glicidiltrimetilamonio, Fluka), previamente disueltos en 20 ml de
agua. La incubación se mantuvo durante 20 horas bajo agitación
mecánica. El gel obtenido se diluyó con 1,5 litros de agua después
se neutralizó con ácido acético. A continuación el gel se trituró
en un homogenizador por extrusión bajo alta presión, después se
ultrafiltró en mdulo filtrante de 40 kDa. La ultracentrifugación se
detuvo cuando el ultrafiltrado no reaccionó más con nitrato de
plata. El análisis del tamaño de las nanopartículas (NPS) se
efectuó con un Nanosizer Coulter N4SD.
A 10 g de NPS recientemente liofilizados
previamente dispersados en 100 ml de diclorometano (destilado
extemporáneamente), se añadieron 9,34 ml de cloruro de ácido
palmítico. La reacción siguió durante 4 horas a temperatura
ambiente. Después de haber añadido 200 ml de éter dietílico al
medio reaccionante, los CA se filtraron sobre un embudo Buchner, se
lavaron con etanol, se recuperaron en 500 ml de agua y se
homogeneizaron.
Los NPS fueron fosfolipidados (20% pds/pds de NPS
liofilizados) con diferentes proporciones de fosfolípidos.
Los vectores ensayados (NPS, CA, BVSM) se
pusieron en suspensión en agua, a una concentración de 1 mg/ml. La
pirogenicidad de las muestras se determinó in vivo en el
conejo a dosis de 100 \mug de vector por dosis según la Farmacopea
Europea.
El ADNc correspondiente al exón 4 (e4, figura 1)
se obtuvo por amplificación (PCR) con la Taq polimerasa (Promèga,
Coger, France) a partir del plásmido pRL 103 (obsequio de R.
LaFemina, (9)) que contenía la región IE del CMV (cepa Towne). Se
utilizaron los iniciadores, A1 (A1 = 5'
CCCGGG\ellAATTCTCATGGTCAAACAGATTAAGGTTC
GAG3') y A2 (A2 = 5'CCCGGGA\BoxAGCTTTTACTGGTCAGCCTTGCTTCTA3') que corresponden respectivamente al extremo 5' y 3' de e4. Sitios EcoR I (\ell) y Hind III (\Box) se introdujeron en estos iniciadores para permitir la inserción del fragmento de PCR en el plásmido pGEX-KG (10). El fragmento insertado estaba en fase con el gen de la glutation-S-transferasa (GST) cuyo promotor es inductible con el isopropil-tiogalactosido (IPTG, Sigma, France). Entre el extremo 3' del gen de la GST y el sitio múltiple de clonación se sitúa una región que codifica un sitio de escisión peptídico específico de la trombina. La transformación de bacterias Escherichia coli DH5\alpha (Gibco, Cergy, France) y el direccionamiento de los recombinantes se efectuaron según las técnicas clásicas (11). La inserción del producto de PCR correspondiente al exón 4 en pGEX-KG se verificó por análisis, sobre varios clones, fragmentos de restricción del ADN plasmídico, visualizados después por electroforesis en gel de agarosa en bromuro de etidio al 1% (BET). La inserción en pGEX-KG se confirmó ensayando la expresión del producto recombinante GST-e4 después de la inducción por IPTG. Los clones positivos se secuenciaron según la técnica de Sangor (12) con un dispositivo de ensayo "Hot tub sequenase" (Pharmacia, Saint Quentin Yvelines, France) según las indicaciones del proveedor.
GAG3') y A2 (A2 = 5'CCCGGGA\BoxAGCTTTTACTGGTCAGCCTTGCTTCTA3') que corresponden respectivamente al extremo 5' y 3' de e4. Sitios EcoR I (\ell) y Hind III (\Box) se introdujeron en estos iniciadores para permitir la inserción del fragmento de PCR en el plásmido pGEX-KG (10). El fragmento insertado estaba en fase con el gen de la glutation-S-transferasa (GST) cuyo promotor es inductible con el isopropil-tiogalactosido (IPTG, Sigma, France). Entre el extremo 3' del gen de la GST y el sitio múltiple de clonación se sitúa una región que codifica un sitio de escisión peptídico específico de la trombina. La transformación de bacterias Escherichia coli DH5\alpha (Gibco, Cergy, France) y el direccionamiento de los recombinantes se efectuaron según las técnicas clásicas (11). La inserción del producto de PCR correspondiente al exón 4 en pGEX-KG se verificó por análisis, sobre varios clones, fragmentos de restricción del ADN plasmídico, visualizados después por electroforesis en gel de agarosa en bromuro de etidio al 1% (BET). La inserción en pGEX-KG se confirmó ensayando la expresión del producto recombinante GST-e4 después de la inducción por IPTG. Los clones positivos se secuenciaron según la técnica de Sangor (12) con un dispositivo de ensayo "Hot tub sequenase" (Pharmacia, Saint Quentin Yvelines, France) según las indicaciones del proveedor.
Las bacterias recombinantes conservadas a -80ºC
se pusieron en cultivo en caldo de Luria (Difco, Osi, France) que
contenía 50 \mug/ml de ampicilina (LB/Ap) (Sigma). Este
precultivo, diluido al 1/10 en LB/Ap se cultivó en las mismas
condiciones hasta DO/600nm = 1,0. La inducción de la expresión del
producto recombinante GST-e4 se realizó añadiendo
100 \muM de IPTG al cultivo. La incubación se continuo durante 2
horas a 25ºC para evitar la formación de cuerpos de inclusiones
(13). Las bacterias, recogidas por centrifugación se lavaron en PBS
("solución salina tamponada con fosfato", pH 7,3,
Na_{2}HPO_{4}4,3 mM, KH_{2}PO_{4} 1,4 mM, NaCl 137 mM, KCl
2,7 mM). El sedimento de células, se conservó una noche a -80ºC
después se descongeló y se recogió en 50 ml de tampón de lisis (PBS,
1mg/ml de lisozima, 1mM fluoruro de fenil-metil-
sulfonida (PMSF)). La suspensión se incubó durante 30 minutos en
hielo después se sometió a ultrasonido. El lisado se agitó durante
30 minutos a temperatura ambiente en presencia de TRITON X 100
(concentración final:1%) después se clarificó por centrifugación
(30000 g/1h). El sobrenadante se depositó sobre una columna de
afinidad injertada con el sustrato de la GST (14)
(Glutation/Sefarosa 4B, Pharmacia) previamente equilibrada con PBS.
Después del lavado de la columna con PBS, la proteína de fusión
GST-e4 se eluyó con de glutation 10 mM reducido en
el tampón de elución Tris HCl 50 mM, pH 8,0.
Se realizaron marcajes metabólicos de
GST-e4 añadiendo al medio de cultivo y a razón de 10
\muCi/ml, los residuos L-[^{35}S]-metionina y
cisteina (^{35}S Express, NEN, Les Ulis, France) en el momento
de la inducción por IPTG. La purificación del producto radiactivo
(GST-e4*) se realizó en las mismas condiciones que
para el producto no radiomarcado. La concentración de los productos
purificados se determinó por el método de Bradford (Dispositivo de
ensayo
"Bio-Rad Protein assay", Biorad, Yvry sur Seine, France). La producción de la proteína de fusión GST-e4 se controló por electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% en presencia de SDS (SDS-PAGE) (15). Se utilizaron marcadores de peso molecular precoloreados (Gibco). El revelado se efectúo bien por coloración del gel con azul de Coomassie bien en la trasnferencia Western (16) después de la transferencia sobre membrana de nitrocelulosa (Hybond C super, Amersham, Les Ulis, France) como sigue. Después de saturación en "blotto" (PBS, 0,2% NP40, 2,5% leche desnatada), la membrana se incubó durante 1 hora con immunosuero de un individuo seropositivo para el CMV (CMV+) o con el antipéptido de conejo 85.75 que reconoce un epítopo situado en la parte C-terminal del exón 4 (don de J.A Nelson, (17)). El inmunosuero y el antipéptido se diluyeron respectivamente al 1/100 y al 1/500 en "blotto". La membrana se lavó 3 veces 5 minutos en PBS y se incubó durante 1 hora con IgG de cabra anti-Ig humanas o anti-Ig de conejo marcadas con la peroxidasa (GAH/PO, GAR/PO, Nordic, Tebu, Le Perrey en Yvelines, France) diluidas al 1/500 en "blotto". Después de 3 lavados de 5 minutos cada uno en PBS, la membrana se incubó en la disolución de revelado (PBS, 0,5 mg/ml diaminobenzidina (DAB), H_{2} O_{2} al 0,1%). Cuando los productos analizados estaban radiomarcados, se realizo una autorradiografía del gel o de la membrana después de transferencia Western sobre película Kodak
X-OMAT (Polylabo, France).
"Bio-Rad Protein assay", Biorad, Yvry sur Seine, France). La producción de la proteína de fusión GST-e4 se controló por electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% en presencia de SDS (SDS-PAGE) (15). Se utilizaron marcadores de peso molecular precoloreados (Gibco). El revelado se efectúo bien por coloración del gel con azul de Coomassie bien en la trasnferencia Western (16) después de la transferencia sobre membrana de nitrocelulosa (Hybond C super, Amersham, Les Ulis, France) como sigue. Después de saturación en "blotto" (PBS, 0,2% NP40, 2,5% leche desnatada), la membrana se incubó durante 1 hora con immunosuero de un individuo seropositivo para el CMV (CMV+) o con el antipéptido de conejo 85.75 que reconoce un epítopo situado en la parte C-terminal del exón 4 (don de J.A Nelson, (17)). El inmunosuero y el antipéptido se diluyeron respectivamente al 1/100 y al 1/500 en "blotto". La membrana se lavó 3 veces 5 minutos en PBS y se incubó durante 1 hora con IgG de cabra anti-Ig humanas o anti-Ig de conejo marcadas con la peroxidasa (GAH/PO, GAR/PO, Nordic, Tebu, Le Perrey en Yvelines, France) diluidas al 1/500 en "blotto". Después de 3 lavados de 5 minutos cada uno en PBS, la membrana se incubó en la disolución de revelado (PBS, 0,5 mg/ml diaminobenzidina (DAB), H_{2} O_{2} al 0,1%). Cuando los productos analizados estaban radiomarcados, se realizo una autorradiografía del gel o de la membrana después de transferencia Western sobre película Kodak
X-OMAT (Polylabo, France).
La proteína de fusión GST-e4*, en
disolución en tampón de elución 50 mM Tris-Cl, pH
8,0, se incubó con los tres principales tipos de partículas (NPS,
CA, BVSM) en suspensión en agua, a una concentración de 1 mg/ml. La
incubación se efectúo a 4ºC bajo agitación durante 1 hora. El
porcentaje de asociación se determinó midiendo la radioactividad
asociada a las partículas. El antígeno libre se eliminó por
ultrafiltración a 5000 g sobre una membrana que tenía un umbral de
corte de 300 kDa (microsop 300, Filtron, Coignieres, France). La
medida de la radioactividad libre en el eluato, en los lavados y la
asociada a las partículas se realizó tres veces en un contador
\beta (BETAmatic, Kontron). El porcentaje de asociación se calculó
haciendo la relación de la radioactividad unida sobre la suma de la
radioactividad libre y de la radioactividad unida a las partículas.
Experiencias de asociación de GST a las partículas se realizaron en
las mismas condiciones que con GSt-e4*. La
asociación de la GST a las partículas después del lavado se
confirmó en SDS-PAGE.
La asociación de GST-e4^{*} a
los tres tipos de partículas se efectúo como anteriormente con una
relación
GST-e4*/partícula de 0,1 (R = 0,1). Los lavados se realizaron en RPMI/10% suero de ternera fetal (RPMI/SVF) (Gibco) suplementado con piruvato de sodio 1mM, L-glutamina 2mM, 200U/ml de penicilina y 80 ng/ml de estreptomicina. Los complejos GST-e4*/partícula se recuperaron en el mismo medio y se incubaron a 37ºC. Se tomaron partes alícuotas a diferentes tiempos, y se determinó como anteriormente el porcentaje de GST-e4^{*} asociado a las partículas.
GST-e4*/partícula de 0,1 (R = 0,1). Los lavados se realizaron en RPMI/10% suero de ternera fetal (RPMI/SVF) (Gibco) suplementado con piruvato de sodio 1mM, L-glutamina 2mM, 200U/ml de penicilina y 80 ng/ml de estreptomicina. Los complejos GST-e4*/partícula se recuperaron en el mismo medio y se incubaron a 37ºC. Se tomaron partes alícuotas a diferentes tiempos, y se determinó como anteriormente el porcentaje de GST-e4^{*} asociado a las partículas.
El análisis de la captura de
GST-e4* soluble o asociado a las partículas se
efectúo sobre líneas de macrófagos (MonoMac 6'', DSM ACC 124) y de
linfocitos B inmortalizados por el virus de Epstein Barr (B/EBV).
Las células (5 x 10^{5}/ml), en placas de 24 pocillos de fondos
planos (Falcon, Becton Dickinson, New Jersey), se incubaron en
RPMI/SVF en atmósfera húmeda al 5% de CO_{2}, con diferentes
concentraciones de GST-e4* soluble o complejado con
las partículas (R = 0,1). Después de 15 horas de incubación, las
células se recogieron y se lavaron 2 veces en PBS. La
radioactividad libre se contó en el sobrenadante, en el líquido de
lavado y en las células resuspendidas en PBS. Los resultados del
recuento corresponden a la media de tres medidas. El porcentaje de
captura para una concentración antigénica dada se expresó por la
relación de la radiactividad unida a las células a la
radioactividad total.
Se incubó a temperatura ambiente [35S]
GST-e4 soluble, y mezclas del antígeno con
diferentes nanopartículas, con tripsina proveniente del páncreas de
buey (Sigma), la relación en masa de la enzima al sustrato fue de
1:600. Al final de diferentes intervalos de tiempo, se puso fin a
las reacciones (partes alícuotas de 20 \mul) por congelación
inmediata en nitrógeno líquido. Antes de SDS-PAGE,
las muestras se descongelaron y se llevaron a ebullición en un
tampón muestra de Laemmll durante 5 minutos. Para verificar que las
partículas no inhibían la actividad proteolítica de la tripsina, se
incubaron mezclas que contenían 5\mug de enzima, en presencia o en
ausencia de 3 mg de partículas por ml, con el sustrato enzimático
Chromozym-Try (Boehringer, Manheim, France), según
las instrucciones del fabricante. Se determinó la actividad de la
tripsina por aumento de la absorbancia a 1 = 405 nm. Se cuantificó
la proteína GST-e4 de 82 kDa por exploración
densitométrica del gel coloreado con azul de Coomassie.
Se utilizaron linfocitos B transformados por EBV
que provenían del donador "Be" y la línea linfocítica B Raji
del linfoma de Burkitt. Se incubaron las células en un medio RPMI
sin suero completo por un tampón HEPES 20 mM pH 7,2 y 1 mg/ml de
sueroalbumina de buey (BSA), a 37ºC o a 4ºC, con
rodamina-transferrina 600 nM y/o 45 mg/ml de
FITC-CA, para diferentes tiempos de incubación.
Después se lavaron las células con dos recuperaciones en PBS frío
que contenía 1 mg/ml de BSA (BSA-PBS), una vez en
PBS frío solo, y se fijaron durante 30 minutos a temperatura
ambiente en PBS que contenía 3,7% de paraformaldehído y de sacarosa
30mM. Después de 10 minutos de incubación en
NH_{4}Cl-PBS 50 mM, tres lavados en
BSA-PBS y un lavado en PBS, se montaron las células
sobre portas de microscopio en 25 mg/ml de Dabco (1,4-
diacilbiclo-(2,2,2)octano, Sigma St. Louis, MO). 100 mg/ml
de mowiol (Calbiochem, La Jolla, CA), 25% (v/v) de glicerol,
Tris-HCl 100 mM pH 8,5. Las muestras se examinaron
al microscopio confocal (Leica) fijado a un microscopio diaplan
(Leitz) equipado de un doble láser, argón-criptón.
Se registraron cortes ópticos en serie a intervalos de 0,5 mm con
la ayuda de un objetivo de 63 aumentos. Las fotografías se tomaron
sobre una película Ilford XP2 400 ASA.
La obtención de clones de linfocitos TCD4+ anti
IE1 y el análisis de su proliferación en presencia de células
presentadoras de antígeno (CPA) autologas de donadores CMV+ (Centro
de transfusión sanguínea de Toulouse) se han descrito anteriormente
(18). Brevemente, 2x10^{4} células de un clon TCD4+ se incubaron
en placas de 96 pocillos con fondo redondo (Falcon) con CPA
irradiadas que correspondían a 1x10^{5} leucocitos de sangre
periférica (PBL) o 5x10^{4} linfocitos B/EBV, autólogos o que
poseían moléculas de CMH de clase II del mismo alotipo DR. Las
células se incubaron en un volumen final de 100\mul en RPMI que
contenía 10% de un muestra de sueros humanos (RPMI/SH)
(Laboratorios FANDRE, Ludres, France) y diferentes diluciones de
antígeno libre o asociado a las partículas. Alternativamente, el Ag
soluble y las partículas vacías se añadieron extemporáneamente a
las células. Los complejos Ag/partículas se esterilizaron por
irradiación. Tres días más tarde, el cultivo se marcó durante 15
horas con 1 \muCi por pocillo de [^{3}H
]-timidina (49 Ci/mmoles, Amersham).
La proliferación de los clones T se determinó por
la medida de la incorporación de [^{3}H ]-timidina
por las células. Los resultados expresados en cpm corresponden a la
media de tres experiencias concomitantes.
Los extractos de astrocitomas humanos (U373MG)
transfectados por ADN genómico IE (A2) o no transfectados (A0) que
se habían utilizado para generar los clones (18), se emplearon como
controles positivos y negativos, respectivamente. La determinación
de alotipos DR de diferentes donadores se efectúo por PCR con
cebadores oligonucleotídicos específicos (Pr Abbal, Lab. Centr.
Imnunol, CHU Rangueil, Toulouse). Se utilizaron los clones D11 y A3
que provenían de individuos (DR3/DR4) y (UR8/DR7)
respectivamente.
El tamaño de las partículas fue de 80 nm, con una
desviación estándar de 20 nm. El porcentaje de carga se tituló con
0,8 mmoles de hidroxicolina por gramo de nanopartículas
liofilizadas. Las muestras ensayadas fueron apirógenas.
La expresión del producto de fusión
GST-e4 en los lisados bacterianos se ensayó en
SDS-PAGE. Las figuras 3 y 4 corresponden al análisis
de los lisados de bacterias cultivadas en presencia de IPTG. La
figura 3 reveló la presencia después de la coloración con azul de
Coomassie, de una banda que correspondía a una masa relativa de
82000 cuya intensidad es más importante en el lisado de bacterias
recombinantes (pista 3) que en la muestra de bacterias no
recombinantes (pista 1). En cambio, se puso en evidencia en la
pista 1 una producción importante de GST (Mr 27000). El análisis
por transferencia Western de las mismas muestras con el antipéptido
85.75 (Fig 4A) y un inmunosuero humano anti-CMV
reveló una reactividad específica asociada a una proteína de masa
relativa 82000 de acuerdo con la masa esperada para la proteína de
fusión GST-e4 (Figura 2). La autorradiografía de la
membrana (Fig 4B) reveló una buena incorporación de residuos
radiomarcados en la proteína de 82 kDa revelada por el antipéptido,
en las condiciones de cultivo descritas anteriormente.
Los lisados bacterianos se sometieron a una
cromatografía sobre sefarosa-glutation y análisis en
SDS-PAGE. Las figuras 3 y 4 muestran que las
proteínas GST (pista 2, Mr 27000) y GST-e4 (pista
4, Mr 82000) fueron retenidas específicamente por el soporte. Se
visualizaron bandas de masa más débiles que
co-emigraron con GST-e4 después de
transferencia Western (Fig 4A). Estos productos copurificados con
GST-e4 resultan probablemente de la degradación de
la proteína de fusión y contienen la secuencia peptídica reconocida
por el antisuero 85.75. No se observó ninguna señal en la pista
correspondiente a la GST (pista 1). Obtuvimos de forma reproducible
y después de un solo recorrido sobre la columna 1mg de
GST-e4* con una actividad específica de 400
mCi/mmoles.
Las partículas (NPS, CA, BVSM) se incubaron en
presencia de GST-e4 radiomarcado
(GST-e4*) a razón de 1 mg de proteína por 10 mg de
vector (R = 0,1). Las proporciones de asociación medias (20
ensayos) fueron del orden de 90% e idénticas sean cuales sean las
partículas.
Se preincubaron BVSM (100 \mug) con cantidades
crecientes de GST-e4 frío en una relación de masa
Ag/BVSM que tenía de 0,1 a 4 (R = 0,1 a R = 4). Para cada una de
estas relaciones, se añadió GST-e4* a los complejos
y la proporción de asociación de la proteína caliente a los
vectores se determinó por recuento después de ultrafiltración. La
figura 5 muestra que los BVSM se saturaron en antígeno cuando la
relación másica Ag/BVSM fue igual a 2.
Se incubaron complejos
GST-e4/partícula (R = 0,1) en RPMI/SVF a 37ºC. El
análisis del porcentaje de GST-e4 que quedó asociado
a las partículas después de varios días de incubación (Fig 6),
mostró que las cinéticas de liberación son idénticas para los tres
tipos de partículas, con una pendiente más fuerte en las primeras
24 horas. Después de 6 días de incubación, la proporción de
GST-e4* asociado fue de 85%, 80%, y 70% con BVSM,
CA, y NPS, respectivamente. Un análisis en SDS-PAGE
de las mismas muestras seguido de una autorradiografía permitió
visualizar la proteína asociada a las partículas.
El rendimiento de asociación de la
[35S]-GST-e4 estuvo comprendido
entre 80 y 90% y no dependió de la naturaleza de las partículas
cationizadas (NPS, CA, BVSM), y, cuando el antígeno se incubó con
vectores iónicos (CA fosfatado), no hubo retención de ninguna
sustancia, como se podría esperar después del punto isoelectrico
ácido de la GST-e4. Este resultado dio que pensar
que la naturaleza de las interacciones entre el antígeno y las
partículas era esencialmente iónica. Para analizar la estabilidad
de la asociación de GST-e4 a los vectores, se
determinó en función del tiempo la liberación del antígeno a partir
de las partículas en las condiciones de cultivo. En 6 días de
incubación en un medio completo (10% SVF), la cinética de liberación
del antígeno fue idéntica para NPS, para CA y para BVSM, y la
liberación jamas pasó de 30% para NPS, 20% para CA y 15% para BVSM.
Determinamos si el antígeno estaba protegido de una proteólisis por
su asociación a vectores. Con este objetivo, se sometió un antígeno
[35S]-GST-e4, soluble y complejado,
a una digestión por la tripsina, y se analizó en
SDS-PAGE. A continuación el gel se exploró para
determinar la presencia del producto de 82 kDa. Una exploración
densitométrica demostró que, en dos horas de incubación con la
enzima, 30% del antígeno complejado eran accesibles a la
proteólisis, mientras que 85% del antígeno en forma soluble era
degradado (Figura 10). El efecto protector no era debido a un
inactivación directa de la enzima por la partícula, ya que la
cinética de la actividad enzimática por utilización del sustrato
"cromozima Try" no estaba afectada por la presencia de
vectores.
Complejos GST-e4*/partícula (R =
0,1) y la proteína soluble GST-e4* se incubaron en
cantidad creciente con líneas de macrófagos y de linfocitos B/EBV.
Una cinética de asociación de preparaciones de antígeno (0,6
\mug/ml, R = 0,1) a las células mostró una incorporación
equivalente, para un tipo de muestra dada, y para tiempos de
incubación que iban de 10 minutos a 15 h (resultado no mostrado).
Las figuras 7 y 8 representan el porcentaje de antígeno asociado a
las células después de 15 h de incubación, en función de la cantidad
de proteína complejada o soluble añadida. Estas figuras muestran
que para los linfocitos B/EBV (Fig 7) y los macrófagos (Fig 8), la
cantidad de antígeno soluble asociada a las células es muy escasa
incluso con cantidades elevadas. En lo que se refiere a la captura
del antígeno en función de diferentes tipos de partícula, los BVSM
permitieron obtener el rendimiento de incorporación más elevado
(30%) con dos tipos celulares. Rendimientos del orden de 5% a 10%
se obtuvieron con NPS y CA, mientras que se acercan al 1% con el
antígeno soluble.
Para estudiar más en detalle el mecanismo por el
cual las partículas aseguran la mediación del aumento de la captura
del antígeno por las células, analizamos su aptitud para ser
internalizado por CPA por utilización de un microscopio confocal.
Se incubaron linfocitos B transformados por EBV que provenían del
donador "Be", con partículas de CA marcadas con fluoresceina, y
rodamina-transferrina, durante diferentes lapsos de
tiempo a una temperatura de 4ºC o de 37ºC. Después las células se
fijaron, se montaron y observaron bajo un microscopio confocal, como
está descrito en materiales y métodos. Se procedió a una serie Z de
cortes ópticos según incrementos de 0,5 \mum. Se obtuvo de una
manera secuencial los resultados de la medida de emisiones de la
fluoresceina y de la rodamina, a partir de la misma célula. Cada
imagen presenta un corte óptico medio de una célula representativa:
fluoresceina o rodamina. Barra: 10 nm.
Con este objetivo, se incubaron durante 19 horas
a 37ºC, con partículas CA marcadas con fluoresceina, linfocitos B
transformados por EBV que proveían del donador "Be". Se
encontraron partículas CA en las vesículas intracelulares, esto
mostró que se encontraban de hecho en el interior de las células.
Para estudiar más en detalle el mecanismo responsable de la
internalización de los vectores sintéticos, estudiamos la cinética
de la entrada, y la comparamos con la correspondiente de la
transferrina, utilizada como marcador para endocitosis mediada por
un receptor. Las células internalizaron rápidamente la transferrina,
esto se vió fácilmente en las vesículas intracelulares. En
contraste, los vectores fluorescentes CA, BVS o NPS se observaron
raramente en el interior de las células, para tiempos de incubación
inferiores a 3 horas. Al contrario de la transferrina, las
partículas fluorescentes se acumularon bajo forma de manchas o de
capuchones de grandes dimensiones sobre la superficie de las
células. Al final de 5, 7 y 19 horas a 37ºC, la mayoría de las
células presentaban partículas CA en los compartimentos celulares,
aunque los orgánulos celulares se revelasen diferentes de los que
contenían la transferrina internalizada. Se obtuvieron resultados
análogos estudiando células que provenían de la línea celular B Raji
del linfoma de Burkitt.
Nuestros resultados mostraron que los vectores CA
fueron internalizados por CPA, acumulándose lentamente en los
compartimentos intracelulares. Además, tanto la cinética de entrada
como su localización intracelular dieron que pensar que estas
partículas siguen una vía de endocitosis diferente de la
correspondiente a la transferrina.
Estudiamos si la proteína de fusión recombinada
GST-e4, libre o asociada a partículas, podría ser
eficazmente presentada por CPA a clones de linfocitos T de CD4+
anti IE1, restringidos a DR3 y DR6. Se presentaron los resultados de
una respuesta proliferativa representativa del clon BeA3, en
presencia de PBL aparejada con HLA (Figura 1). Se obtuvieron
resultados análogos con el clon FzD11. No se observó ninguna
proliferación de células T cuando se incubaron partículas vacías, o
partículas asociadas a GST, en presencia o en ausencia de PBL
(Figura 11B) y de linfocitos B (Figura 12 B). En contraste, la
capacidad de GST-e4 en forma de partículas para
estimular la proliferación de clones se reforzó con todos los tipos
de vectores. Cuando se utilizaron PBL como CPA, este efecto
adjuvante fue de 5 a 25 veces. De forma notable, se tuvo necesidad
de una cantidad hasta 25 veces más escasa de proteínas bajo forma
complejada (CA), para inducir una respuesta proliferativa de
intensidad análoga a la que se obtuvo con el antígeno libre (Figura
11A). Cuando se utilizaron linfocitos B para presentar el antígeno
en forma de partículas (Figura 12 A), el efecto fue del mismo orden
de magnitud que aquel observado con las PBL. Para determinar si el
enlace del antígeno a la partícula era una condición previa a este
efecto, se añadió extemporáneamente a las células CA vacíos y
antígeno soluble. En estas condiciones, la potencialización también
se observó, pero mucho más débil (2 veces), lo que podría ser
atribuido a una asociación rápida del antígeno a los vectores en el
momento de su introducción en los pocillos de cultivo, ya que la
fijación total de GST-e4 a las partículas se realizó
en 1 hora a 4ºC (Materiales y métodos).
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Claims (27)
1. Procedimiento para aumentar la inmunogenicidad
de un antígeno, caracterizado porque el antígeno se asocia
por enlaces iónicos y/o hidrófobos a un vector en forma de
partículas, estando constituido dicho vector bien sea (i) por un
núcleo hidrófilo no líquido, bien sea (ii) por un núcleo hidrófilo
no líquido que incluye una capa externa de fosfolípidos, o bien sea
(iii) por un núcleo hidrófilo no líquido que incluye una capa
externa de ácidos grasos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el vector está constituido por un
núcleo hidrófilo no líquido.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el vector está constituido por un
núcleo hidrófilo no líquido que incluye una capa externa de
fosfolípidos naturales o sintéticos.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el vector está constituido por un
núcleo hidrófilo no líquido que incluye una capa externa de ácidos
grasos.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque la capa externa del vector está
constituida por ácidos grasos naturales fijados al núcleo por
enlaces covalentes.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el núcleo
está constituido por una matriz de polisacáridos o de oligosacáridos
natural o químicamente reticulados.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se injertan
ligandos iónicos en el núcleo.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el ligando iónico lleva al menos una
función elegida en el grupo que incluye: fosfatos, sulfatos, ácidos
carboxílicos, amonios cuaternarios, aminas secundarias, aminas
primarias.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el antígeno se
asocia al vector en forma de partículas por enlaces iónicos.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el antígeno se
asocia al vector en forma de partículas por enlaces hidrófobos.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el antígeno se
asocia al núcleo del vector en forma de partículas.
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el antígeno se
asocia a la capa externa del vector en forma de partículas.
13. Producto susceptible de ser obtenido por el
procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, que incluye
una asociación de un antígeno unido por enlaces iónicos y/o
hidrófobos a un vector en forma de partículas, constituido bien sea
(i) por un núcleo hidrófilo no líquido, bien sea (ii) por un núcleo
hidrófilo no líquido que incluye una capa externa de fosfolípidos, o
bien sea (iii) por un núcleo hidrófilo no líquido que incluye una
capa externa de ácidos grasos, caracterizado porque el
antígeno es una proteína del CMV.
14. Producto según la reivindicación 13,
caracterizado porque el antígeno es el fragmento e4 de la
proteína IE1 del CMV.
15. Producto según la reivindicación 14,
caracterizado porque el fragmento e4 está asociado a la
GST.
16. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque el antígeno
está unido por enlaces iónicos al vector en forma de partículas.
17. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque el antígeno
está unido por enlaces hidrófobos al vector en forma de
partículas.
18. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque el vector en
forma de partículas está constituido por un núcleo hidrófilo no
líquido.
19. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque el vector en
forma de partículas está constituido por un núcleo hidrófilo no
líquido que incluye una capa externa de fosfolípidos.
20. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque el vector en
forma de partículas está constituido por un núcleo hidrófilo no
líquido que incluye una capa externa de ácidos grasos.
21. Utilización de un vector en forma de
partículas para la preparación de un medicamento útil para aumentar
la inmunogenicidad de un antígeno, estando constituido dicho vector
en forma de partículas bien sea (i) por un núcleo hidrófilo no
líquido, bien sea (ii) por un núcleo hidrófilo no líquido que
incluye una capa externa de fosfolípidos, o bien sea (iii) por un
núcleo hidrófilo no líquido que incluye una capa externa de ácidos
grasos, y estando asociado el antígeno a dicho vector en forma de
partículas por enlaces iónicos y/o hidrófobos.
22. Utilización según la reivindicación 21,
caracterizada porque el antígeno está unido por enlaces
iónicos al vector en forma de partículas.
23. Utilización según la reivindicación 21,
caracterizada porque el antígeno está unido por enlaces
hidrófobos al vector en forma de partículas.
24. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 23, caracterizada porque el vector en
forma de partículas está constituido por un núcleo hidrófilo no
líquido.
25. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 23, caracterizada porque el vector en
forma de partículas está constituido por un núcleo hidrófilo no
líquido que incluye una capa externa de fosfolípidos.
26. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 23, caracterizada porque el vector en
forma de partículas está constituido por un núcleo hidrófilo no
líquido que incluye una capa externa de ácidos grasos.
27. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, caracterizada porque dicho
medicamento es una vacuna.
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