ES2207757T3 - Deteccion de igg especifica para antigenos. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR ANTICUERPOS ESPECIFICOS DE ANTIGENOS DE LA INMUNOGLOBULINA CLASE G, EN PRESENCIA DE INMUNOGLOBULINAS DE CLASE M Y/O DEL FACTOR REUMATOIDE, EN FLUIDOS CORPORALES, POR INCUBACION CON AL MENOS DOS RECEPTORES DIFERENTES, R 1 Y R 2 , Y RECEPTO RES OPTATIVAMENTE ADICIONALES, CARACTERIZADO PORQUE UN ELEMENTO COLABORADOR DE LA FIJACION, EN FORMA DE MONOMERO ES UN CONSTITUYENTE SUSTANCIAL DE R 2 . LA INVENCION SE REFIERE IGUALM ENTE A UN REACTIVO PARA DETERMINAR EL ANTICUERPO ESPECIFICO DE UN ANTIGENO DE LA INMUNOGLOBULINA CLASE G.

Description

Detección de una IgG específica para antígenos.

El invento se refiere a un procedimiento para la determinación de anticuerpos de la clase G de inmunoglobulinas, que son específicos para antígenos, en líquidos corporales, por incubación de la muestra con por lo menos dos diferentes receptores R_{1} y R_{2}, siendo ambos receptores capaces de fijarse específicamente con el anticuerpo, estando o pudiendo estar R_{1} unido a una fase sólida y llevando R_{2} una marcación, por separación de la fase sólida con respecto de la fase líquida y por medición de la marcación, utilizándose como R_{2} un conjugado a base de un partícipe en la fijación en una forma monómera, que es reconocido específicamente por el anticuerpo que se ha de determinar, y de una marcación.

En particular el invento se refiere a un método para la detección específica de inmunoglobulinas de la clase IgG en presencia de inmunoglobulinas de la clase IgM.

El sistema inmunitario de un organismo de animal mamífero produce, como respuesta a la incorporación de sustancias ajenas, anticuerpos, que son denominados también inmunoglobulinas. Éstos sirven para la defensa frente a las sustancias ajenas, que también son denominadas antígenos. Las inmunoglobulinas se pueden clasificar en cinco diferentes clases. Se establece diferencia entre las inmunoglobulinas de las clases M, G, A, E y D. Estas cinco clases de inmunoglobulinas se diferencian en cada caso en la composición de la cadena pesada, que se designa como cadena \mu, \gamma, \alpha, \varepsilon o \delta respectivamente.

Cada clase de inmunoglobulinas tiene en el organismo una misión diferente. Las inmunoglobulinas de la clase M aparecen en el caso de un primer contacto con el antígeno, la denominada primera inmunización. La concentración de estas inmunoglobulinas disminuye sin embargo de nuevo rápidamente al progresar la infección. Las inmunoglobulinas de la clase G se forman tan sólo lentamente en una primera inmunización y aparecen en grandes cantidades en el caso de una segunda infección con el mismo antígeno. Las inmunoglobulinas de la clase A se pueden encontrar sobre las superficies de mucosas del organismo y son competentes para los procesos de defensa que allí se desarrollan.

Las inmunoglobulinas de la clase E son responsables principalmente de reacciones alérgicas. La función exacta de las inmunoglobulinas de la clase D no es conocida hasta ahora.

Las clases individuales de inmunoglobulinas se presentan en la sangre en concentraciones muy diversas. Así, las inmunoglobulinas de la clase G (IgG) en un suero humano normal, con una proporción de aproximadamente 75%, que corresponde a un contenido en suero de 8 a 18 mg/ml, son la clase mayoritariamente representada. La inmunoglobulina, que aparece en segundo lugar de las frecuencias de presentación, es la IgA, cuya concentración promedia en el suero es de 0,9 a 4,5 mg/ml. Las inmunoglobulinas de la clase M están presentes en una concentración de 0,6 a 2,8 mg/ml, las inmunoglobulinas de la clase D están presentes en una concentración de 0,003 a 0,4 mg/ml. La más pequeña es la proporción de los anticuerpos IgE, que aparecen en el suero solamente en una concentración de 0,02 a 0,05 \mug/ml.

Para el diagnóstico diferenciado de muchas enfermedades, es importante llevar a cabo la detección de anticuerpos de una o varias clases de inmunoglobulinas perfectamente determinadas, que son específicas para un determinado antígeno. Solamente mediante esta detección de anticuerpos específicos para una clase, o bien por medio de la exclusión de la presencia de determinadas clases de inmunoglobulinas (p.ej. detección de anticuerpos IgG e IgA, pero ninguna detección de anticuerpos IgM) se puede asegurar un diagnóstico satisfactorio en el caso de infecciones causadas por virus, bacterias y parásitos. Esto es especialmente importante para la diferenciación entre infecciones recientes o agudas y que se remontan a una época anterior, así como para el control clínico de la evolución de una infección. La detección de anticuerpos específicos para una clase es en particular importante en el caso de infecciones causadas por los virus HIV (de inmunodeficiencia humana), por hepatitis A, hepatitis B, toxoplasmosis, rubéola y Chlamydia. Asimismo, la detección específica para una clase de anticuerpos específicos para un antígeno determinado, es necesaria en el caso de la determinación del título de anticuerpos protectores y para la comprobación del éxito de una vacunación. Existe por lo tanto, desde el punto de vista del diagnóstico, un gran interés en detectar en particular anticuerpos de los estadios no agudos de infecciones, tales como los anticuerpos IgG e IgA.

En el estado de la técnica se describen diferentes métodos para la detección de anticuerpos de una determinada clase, que son específicos para un antígeno. Así, la detección de anticuerpos de una determinada clase, específicos para un antígeno, en una muestra, se lleva a cabo frecuentemente mediante el recurso de que los anticuerpos específicos se unen a una fase sólida revestida con el antígeno específico. La detección de las inmunoglobulinas (Ig) unidas entonces a la fase sólida, que son específicas para el antígeno, se efectúa mediante la fijación de anticuerpos, que están dirigidos específicamente contra una Ig humana de una determinada clase, a las moléculas de Ig que se han de detectar. Los anticuerpos dirigidos contra una Ig humana están provistos de una marcación, a través de la cual tiene lugar la detección. Tal modo de realizar el ensayo es sin embargo posible solamente cuando antes de la reacción con los anticuerpos específicos para una clase, marcados y dirigidos contra una Ig humana, se elimina por lavado la totalidad de las Ig no específicas y no fijadas. Una realización del ensayo en una sola etapa, tal como se necesita frecuentemente para sistemas automáticos, no es posible por consiguiente.

De acuerdo con el método descrito en la patente de los EE.UU. 4.292.403, los anticuerpos específicos para antígenos de una determinada clase de inmunoglobulinas se detectan mediante el recurso de que un anticuerpo específico para una clase se inmoviliza junto a una fase sólida, el anticuerpo de la muestra que se ha de determinar se fija, a continuación se añade el antígeno específico, y el antígeno fijado se une mediante un anticuerpo adicional marcado, que es específico para el antígeno. Sin embargo, este procedimiento tiene la desventaja de que todos los anticuerpos de la clase que se ha de determinar se fijan a los anticuerpos inmovilizados que son específicos de una clase. La fijación de los anticuerpos de la muestra no se efectúa de una manera específica para ciertos antígenos. Esto puede desarrollarse a costa de la sensibilidad del ensayo, puesto que posiblemente no están presentes suficientes sitios de fijación libres para los anticuerpos específicos para un antígeno. También en esta forma de realizar el ensayo se necesitan varias etapas de lavado. Con este procedimiento no es posible ninguna realización del ensayo en una sola etapa.

Una posibilidad de llevar a cabo una detección de anticuerpos en un ensayo de una sola etapa, la abre el denominado ensayo de puente. El concepto de ensayo de puente se describe en el documento de solicitud de patente europea EP-A-0.280.211. En este caso, un primer receptor, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, tal como por ejemplo un antígeno, está unido a una fase sólida. El anticuerpo que se ha de determinar se fija al antígeno fijado a una fase sólida. En la tanda de ensayo está presente además otro antígeno específico, que está provisto de una marcación. La detección del anticuerpo se efectúa a través de la marcación. En este ensayo se detectan todos los anticuerpos específicos para un antígeno y no solamente los anticuerpos de una determinada clase.

En el documento EP-A-0.307.149 y la patente de los EE.UU. 5.254.458 se divulgan procedimientos de acuerdo con el principio de ensayo de puente para la detección de anticuerpos, que están dirigidos específicamente contra un antígeno. En este caso, péptidos preparados por vía recombinante, que se derivan de un determinado epítopo del antígeno, se emplean para la fijación del anticuerpo que se ha de determinar. Un péptido se inmoviliza junto a una fase sólida. El anticuerpo de muestra se fija al péptido. Para la detección, un péptido marcado adicional se fija al anticuerpo de la muestra. Los péptidos recombinantes se expresan en diferentes organismos, con el fin de aumentar la especificidad de la detección. También en el caso de este método se fijan a los péptidos anticuerpos de todas las clases. No es posible una diferenciación entre anticuerpos, por ejemplo IgG e IgM.

El documento EP-A-0.386.713 describe un procedimiento para la detección de anticuerpos contra HIV mediando utilización de dos soportes sólidos, siendo inmovilizados a ambos soportes sólidos diferentes antígenos de HIV, que en cada caso se ponen en contacto con una parte alícuota de una muestra y con un antígeno de HIV marcado, siendo detectada la presencia de anticuerpos mediante una reacción positiva en por lo menos uno de los ensayos. Como antígenos de HIV se divulgan polipéptidos preparados por vía recombinante. En el documento EP-A-0.627.625 se divulga un método sobre la base de una transferencia de borrón Western, en la que mediante proteínas recombinantes o péptidos sintéticos se pueden detectar también anticuerpos de HIV. Ambos métodos no hacen posible sin embargo la detección específica para una clase de los anticuerpos específicos para ciertos antígenos.

En el documento EP 0.366.092 A2 se divulga un procedimiento para la determinación de anticuerpos específicos para una clase A de antígeno, en el que la solución de la muestra se incuba simultáneamente con un receptor R_{1}, que es capaz de fijarse con el anticuerpo que se ha de determinar, y con un exceso de anticuerpos humanos o sus fragmentos, que pertenecen a la misma clase de inmunoglobulinas, que el anticuerpo que se ha de determinar, y no es capaz de fijarse con el antígeno A, y a continuación se añade un receptor R_{2}, que está marcado y es capaz de fijarse, o bien con el anticuerpo que se ha de determinar o con el antígeno A.

El documento de solicitud de patente alemana DE 38.20.556 A1 divulga un procedimiento para la determinación de anticuerpos específicos para alergenos en líquidos corporales, por incubación con por lo menos dos receptores R_{1} y R_{2}, que son capaces de fijarse con los anticuerpos que se han de determinar, llevando R_{2} una marcación. Como R_{1} se emplea el alergeno capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar, y como R_{2} se emplea un conjugado a base de un anticuerpo, dirigido contra la parte Fc de IgE o IgG, y de una marcación.

El documento EP 0.507.587 A2 divulga un método para la detección de una inmunoglobulina específica, en particular una IgM, en una muestra. En este caso, la muestra se incuba con un receptor para la inmunoglobulina, que se puede unir a una fase sólida. En el caso de este receptor se trata de un anticuerpo, que está dirigido contra la parte Fc de la inmunoglobulina. Además, la muestra se incuba con un antígeno, al que se fija específicamente la inmunoglobulina procedente de la muestra. y con un anticuerpo marcado, que es específico para el antígeno. La detección se efectúa a través de la marcación del anticuerpo específico para el antígeno.

Con los procedimientos hasta ahora conocidos, no es posible detectar en un procedimiento de una sola etapa, un anticuerpo de una determinada clase de inmunoglobulinas, que es específico para un antígeno. Los procedimientos inmunológicos de detección, conocidos a partir del estado de la técnica, de acuerdo con el concepto de ensayo de puente, en los cuales se utiliza un antígeno marcado y un antígeno capaz de fijarse a una fase sólida, hacen posible ciertamente un ensayo en una sola etapa. Hasta ahora, sin embargo, con este sencillo principio, los anticuerpos de las clases IgG e IgM se pueden detectar solamente en común.

La misión fue por lo tanto poner a disposición un método mejorado para la detección de anticuerpos dirigidos contra un antígeno específico, de la clase de infección no aguda, es decir en particular de la clase de IgG. En el procedimiento se debería asegurar al mismo tiempo que no se detecten anticuerpos IgM con la misma especificidad. Este método debería consistir de modo preferido en un principio de ensayo de una sola etapa, con el fin de poder utilizarlo ventajosamente en sistemas automáticos.

El problema planteado por esta misión se resuelve con el procedimiento conforme al invento para la determinación de un anticuerpo de la clase G de inmunoglobulinas, que sea específico para un antígeno, por incubación de la muestra con por lo menos dos diferentes receptores R_{1} y R_{2}, siendo ambos receptores capaces de fijarse específicamente con el anticuerpo, estando o pudiendo estar R_{1} unido a una fase sólida y llevando R_{2}una marcación, que está caracterizado porque como R_{2} se utiliza un conjugado a base de un partícipe en la fijación en una forma monómera, que es reconocido específicamente por el anticuerpo que se ha de determinar, y de una marcación.

El procedimiento conforme al invento hace posible la determinación de anticuerpos de la clase G de inmunoglobulinas, que son específicos para un antígeno, en muestras, en las cuales están presentes anticuerpos de la clase IgM con la misma especificidad para un antígeno.

Los anticuerpos IgA, IgD e IgE, presentes en la muestra, que poseen la misma especificidad que los anticuerpos IgG que se han de detectar, se presentan en unas concentraciones esencialmente más bajas en comparación con las de los anticuerpos IgG. En particular, las clases de los IgD e IgE están presentes en unas concentraciones, que se sitúan en algunos órdenes de magnitud por debajo de la concentración de los IgG, de manera tal que su reactividad en el procedimiento de detección no modifica, o apenas modifica, el resultado de la medición. Los anticuerpos IgA están presentes en unas concentraciones, que corresponden aproximadamente a un 10% del contenido total de IgG. Presumiblemente, por lo tanto, en este procedimiento se determinan también anticuerpos IgA. Puesto que la finalidad principal del procedimiento consiste en detectar anticuerpos de la infección no aguda, no es crítica la detección en común de anticuerpos IgG e IgA, puesto que ambos anticuerpos representan a la infección no aguda. Puesto que los anticuerpos de IgG representan a la clase de inmunoglobulinas, representada de manera mayoritaria, de la infección no aguda, en lo sucesivo se utiliza la denominación de detección de IgG. Es esencial que no deben detectarse anticuerpos IgM con la misma especificidad para un antígeno, que aparecen en cantidad aumentada solamente en el caso de una infección aguda.

Se ha mostrado, de un modo sorprendente, que mediante el empleo conforme al invento de partícipes en la fijación en una forma monómera en un ensayo de puente de acuerdo con el principio de ensayo de dobles antígenos, se detectan exclusivamente anticuerpos de la clase IgG, que están dirigidos específicamente contra un determinado antígeno. Los anticuerpos de la clase IgM con igual especificidad, que están presentes en la misma muestra, sorprendentemente no reaccionan o solamente reaccionan de una manera despreciablemente débil con péptidos monoméricos y por consiguiente no perturban a la detección de IgG. El concepto de "despreciablemente débil" significa que los sitios de fijación a antígenos de los anticuerpos IgM no son fijados de una manera detectable por los partícipes en la fijación en una forma monómera. Esto se debe presumiblemente a la afinidad esencialmente menor de los anticuerpos IgM pentameros con respecto a los epítopos presentes en una forma monómera, en comparación con los anticuerpos IgG presentes en forma de moléculas individuales.

En el caso del procedimiento conforme al invento no se necesita indispensablemente por lo tanto una realización sucesiva de los ensayos para la separación de los anticuerpos IgM, puesto que éstos no perturban. Una ventaja especial del procedimiento es por lo tanto la sencillez del desarrollo de los ensayos.

Junto a los denominados ensayos en húmedo, en los cuales los reactivos de ensayo se presentan en una fase líquida, se pueden utilizar también todos los formatos corrientes de ensayos en seco, que son apropiados para la detección de proteínas o anticuerpos. En estos ensayos en seco o en estas tiras de ensayo, como se describen en el documento EP-A-0.186.799, los componentes del ensayo están aplicados sobre un soporte. Si el procedimiento conforme al invento se lleva a cabo en un formato de tiras de ensayo, no se necesita por lo tanto ninguna etapa de lavado. Preferiblemente, el procedimiento conforme al invento se lleva a cabo sin embargo como un ensayo en húmedo.

Es posible incubar conjuntamente todos los receptores y la muestra, y llevar a cabo el procedimiento en una sola etapa. Esto exige eventualmente solamente una única etapa de lavado después de la incubación.

Para la realización del procedimiento conforme al invento, se utilizan en el caso normal dos diferentes receptores R_{1} y R_{2}. Si se utiliza un ensayo en húmedo, entonces el receptor R_{2} se presenta en una fase líquida. R_{1} puede presentarse en una fase líquida o ya unido a la fase sólida. Si R_{1} y R_{2} están presentes en una fase líquida, entonces ellos se presentan preferiblemente en la misma concentración. Se han manifestado como bien apropiadas unas relaciones entre concentraciones de R_{1} : R_{2} de 0,5:1,0 a 1,0:5,0. Las relaciones óptimas de concentraciones pueden ser depuradas con facilidad mediante ensayo por un experto en la especialidad.

Si como R_{1} se emplea un receptor capaz de fijarse a una fase sólida, que todavía no está unido a la fase sólida, entonces la muestra se incuba con los receptores R_{1} y R_{2}. El anticuerpo de la muestra se fija en tal caso a R_{1} y a R_{2}. Esta incubación puede tener lugar en presencia de la fase sólida. Se forma en tal caso un complejo a base de una fase sólida - R_{1}- un anticuerpo de la muestra - R_{2}. A continuación, la fase sólida se separa con respecto de la fase líquida, eventualmente se lava la fase sólida, y se mide la marcación de R_{2}. La marcación se mide en la mayor parte de los casos en la fase sólida, pero se puede determinar sin embargo también en la fase líquida.

Si la incubación de la muestra se lleva a cabo con R_{1} y R_{2} en ausencia de la fase sólida, entonces la tanda de ensayo total se tiene que poner en contacto a continuación con la fase sólida, eventualmente se tiene que llevar a cabo el lavado y se tiene que medir la marcación.

Si el receptor R_{1} ya se presenta en una forma fijada a una fase sólida, entonces la muestra y el receptor R_{2} se añaden al receptor R_{1} fijado a la fase sólida, y se incuban en común. El modo de proceder ulterior corresponde al del procedimiento antes indicado.

No obstante, también es posible llevar a cabo el procedimiento conforme al invento en varias etapas. En este caso, convenientemente la muestra se incuba en primer lugar con los receptores R_{1} y R_{2}. El resultante complejo a base de R_{1}, R_{2} y los anticuerpos que se han de determinar, se incuba a continuación con otros receptores adicionales, pudiendo efectuarse esto en varias etapas. La evolución ulterior del ensayo corresponde al del procedimiento precedentemente descrito.

El receptor R_{2} es un conjugado a base de un partícipe en la fijación en una forma monómera y de una marcación. Los partícipes en la fijación en una forma monómera, conformes al invento, contienen exactamente una zona de epítopo o bien solamente un sitio de fijación para los anticuerpos que se han de determinar, es decir una estructura que reacciona inmunológicamente de una manera específica con el anticuerpo IgG que se ha de determinar. La estructura monómera del partícipe en la fijación es importante, con el fin de garantizar que solamente se fijen en una forma monómera a los partícipes en la fijación los anticuerpos IgG específicos para un antígeno que se han de detectar, y no se fijen los perturbadores anticuerpos IgM con la misma especificidad.

La zona de epítopo se puede derivar por ejemplo a partir de un antígeno o de un anticuerpo anti-idiotipo. Las zonas de epítopos pueden estar derivadas, en el caso de los partícipes en la fijación en una forma monómera, también de estructuras de azúcares y/o lípidos o de estructuras combinadas con porciones peptídicas, lipídicas y/o de azúcares. Se pueden utilizar todas las estructuras que se derivan de una zona de epítopo, que tienen un sitio de fijación, al que se fija específicamente el anticuerpo de la clase IgG, que se han de detectar, en presencia de anticuerpos IgM con la misma especificidad. La única condición para el sitio de fijación, es decir para el partícipe en la fijación en una forma monómera, que se emplea, consiste en que se ha de conservar la capacidad de fijación específica para IgG. Esta condición es válida también para el caso de que en el sitio de fijación estén contenidas estructuras de azúcares o lípidos.

Conforme al invento, se pueden emplear también partícipes en la fijación en una forma monómera, que flanquean o se solapan al sitio de fijación, al que se fija específicamente el anticuerpo IgG que se ha de detectar. Por consiguiente, es posible detectar también anticuerpos IgG que reaccionan de modo cruzado, cuyo sitio de fijación se solapa con el epítopo que se ha de detectar. Preferiblemente, para la detección de los anticuerpos IgG específicos para un antígeno se emplea por lo tanto una mezcla de partícipes en la fijación en una forma monómera.

Preferiblemente, se emplean péptidos como partícipes en la fijación en una forma monómera. Como un sitio de fijación ha de entenderse, en el caso de una proteína como analito, un péptido cuya secuencia es una parte de la secuencia proteínica un antígeno proteínico y al que se fija específicamente un anticuerpo dirigido contra esta proteína, que en el presente invento es un anticuerpo IgG. Junto a estos péptidos, como un sitio de fijación han de entenderse también todavía péptidos con unas secuencias de aminoácidos, que muestran en lo esencial una especificidad y/o una afinidad de la fijación a los anticuerpos IgG que se han de detectar, equivalentes a las de los péptidos antes mencionados. Estos péptidos se pueden derivar preferiblemente por sustitución, deleción o inserción de radicales individuales de aminoácidos a partir de los péptidos precedentemente mencionados.

Se pueden utilizar todos los péptidos, que presenten un sitio de fijación, al que se fija específicamente el anticuerpo de la clase IgG que se ha de determinar, también en presencia de anticuerpos IgM con la misma especificidad. La única condición para el sitio de fijación, es decir para el péptido empleado, consiste en que ha de permanecer conservada la capacidad específica de fijación a los IgG. Por un sitio de fijación ha de entenderse un péptido, cuya secuencia es una parte de la secuencia proteínica de un antígeno proteínico (analito), y al que se fija específicamente un anticuerpo dirigido contra esta proteína, que en el presente invento es un anticuerpo IgG. Junto a estos péptidos, han de entenderse por un sitio de fijación también todavía péptidos que tienen secuencias de aminoácidos, que muestran en lo esencial una especificidad y/o una afinidad de la fijación a los anticuerpos IgG que se han de determinar, equivalentes a las de los péptidos antes mencionados. Estos péptidos pueden derivarse a partir de los péptidos mencionados con anterioridad, preferiblemente, por sustitución, deleción o inserción de radicales individuales de aminoácidos.

Dentro de los péptidos conformes al invento, que corresponden a un sitio de fijación específico, han de entenderse también derivados peptídicos, en los que uno o varios aminoácidos se han derivatizado mediante una reacción química. Ejemplos de derivados peptídicos conformes al invento son en particular las moléculas, en las cuales el entramado principal y/o los grupos reactivos de cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo grupos amino libres, grupos carboxilo libres y/o grupos hidroxilo libres, han sido derivatizados. Ejemplos específicos para derivados de grupos amino son amidas de ácidos sulfónicos o de ácidos carboxílicos, derivados de tio-uretanos y sales de amonio, por ejemplo los hidrocloruros. Derivados de grupos carboxilo son sales, ésteres y amidas. Ejemplos de derivados de grupos hidroxilo son derivados de O-acilo o de O-alquilo. La preparación de los péptidos se efectúa preferiblemente por síntesis química de acuerdo con métodos conocidos por un experto en la especialidad y no precisan en el presente contexto ninguna explicación especial. En principio, los péptidos se pueden preparar también mediante métodos recombinantes. No obstante, los polipéptidos de mayor longitud tienden con frecuencia a la dimerización o polimerización, de manera tal que los péptidos se producen preferiblemente por medio de una síntesis química, a fin de asegurar las propiedades monómeras.

Además, el concepto de derivado peptídico abarca también los péptidos en los que uno o varios aminoácidos se reemplazan por homólogos de aminoácidos presentes en la naturaleza o no presentes en la naturaleza, seleccionados entre los 20 aminoácidos "clásicos". Ejemplos de tales homólogos son 4-hidroxi-prolina, 5-hidroxi-lisina, 3-metil-histidina, homoserina, ornitina, \beta-alanina y ácido 4-amino-butírico. Los derivados peptídicos deben tener una especificidad y/o una afinidad de la fijación a los anticuerpos IgG que se han de determinar, que en lo esencial son equivalentes a las de los péptidos a partir de los que ellos se derivan.

Como péptidos conformes al invento, que corresponden a un sitio de fijación específico, se han de entender también sustancias miméticas de péptidos, denominadas en lo sucesivo compuestos miméticos de péptidos, que presentan una especificidad y/o una afinidad de la fijación a los anticuerpos IgG que se ha determinar, en lo esencial equivalentes a las de los péptidos o derivados peptídicos precedentemente mencionados. Los compuestos miméticos de péptidos son compuestos que pueden reemplazar a los péptidos en su interacción con el anticuerpo que se ha de determinar, y que pueden tener una estabilidad aumentada frente a los péptidos nativos, en particular frente a proteínasas o peptidasas. Métodos para la preparación de compuestos miméticos de péptidos se describen en las citas de Giannis y Kolter, Angew. Chem. 195 (1993), 1303-1326 y de Lee y colaboradores, Bull. Chem. Soc. Jpn. 66 (1993), 2006-2010.

La longitud de un sitio de fijación, es decir la longitud del péptido monómero conforme al invento, es usualmente de por lo menos 4 aminoácidos. De modo preferido, la longitud está situada entre 4 y 20, entre 6 y 15, o de modo especialmente preferido entre 9 y 12 aminoácidos. En el caso de los compuestos miméticos de péptidos o derivados de péptidos se necesita una longitud análoga o un tamaño análogo de la molécula.

Los péptidos monoméricos conformes al invento en calidad de partícipes en la fijación en una forma monómera, contienen el epítopo, al que se fija específicamente el anticuerpo IgG que se ha de determinar. Junto al extremo terminal de N y/o junto al extremo terminal de C del péptido pueden estar presentes sin embargo todavía otras secuencias de péptidos flanqueadoras, que ya no correspondan al epítopo específico. Por lo demás, es posible proveer al péptido de grupos espaciadores que son habituales para un experto en la especialidad. Las únicas condiciones consisten en que el péptido como partícipe en la fijación en una forma monómera ha de presentarse realmente en una forma monómera, y en que se ha de conservar la capacidad de fijación a los anticuerpos IgG que se han de determinar.

Un constituyente adicional del receptor R_{2} es la marcación. Preferiblemente se emplea como marcación una sustancia directamente detectable, por ejemplo una sustancia quimioluminiscente, fluorescente o radiactiva, o una partícula de sol metálico, látex u oro. Además se prefieren como marcación las enzimas u otras moléculas biológicas, tales como por ejemplo haptenos. Entre los haptenos, la digoxigenina es una marcación especialmente preferida. Los procedimientos para realizar la marcación son habituales para un experto en la especialidad y no necesitan aquí de ninguna explicación adicional. La detección de la marcación se efectúa, de una manera en sí conocida, directamente por medición de la sustancia quimioluminiscente, fluorescente o radiactiva o de la partícula de sol metálico, látex u oro, o por medición del substrato convertido por la enzima.

La detección de la marcación puede efectuarse también de un modo indirecto. En este caso, un receptor adicional, que por sí mismo está acoplado a su vez con un grupo generador de señales, se fija específicamente a la marcación de R_{2}, por ejemplo un hapteno, tal como digoxigenina. La detección del grupo generador de señales, por ejemplo una sustancia quimioluminiscente, fluorescente o radiactiva, o bien una enzima o una partícula de oro, se efectúa de acuerdo con los métodos habituales para un experto en la especialidad. Como receptor adicional, se puede emplear por ejemplo un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que se fija específicamente a la marcación de R_{2}. Si se utiliza esta detección indirecta de la marcación, entonces la marcación de R_{2} es de modo preferido digoxigenina u otro hapteno distinto, y la detección se efectúa a través de un anticuerpo acoplado con una peroxidasa, que se dirige contra digoxigenina o contra el hapteno.

Un constituyente esencial del receptor R_{1} es un partícipe en la fijación, que es capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo IgG que se ha de determinar. El receptor R_{1} puede estar unido directamente a la fase sólida, o puede ser capaz de fijarse a la fase sólida. Como partícipe en la fijación, capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo IgG que se ha de determinar, se emplea un partícipe en la fijación en una forma monómera, tal como en el receptor R_{2}. Es decisivo que permanezca conservada la capacidad de fijación específica del partícipe en la fijación con los anticuerpos IgG que se han de determinar. Preferiblemente, se emplean sin embargo también péptidos para el receptor R_{1}. Los péptidos contenidos en R_{1} se preparan de acuerdo con los mismos métodos que los péptidos para R_{2}.

Los partícipes en la fijación o péptidos específicos para anticuerpos, contenidos en los receptores R_{1} y R_{2}, pueden ser idénticos o diferentes, pero ambos deben ser capaces de fijarse simultáneamente con el anticuerpo IgG que se ha de determinar.

R_{1} puede, en una alternativa, estar unido directamente a la fase sólida. La fijación directa de R_{1} a la fase sólida se efectúa de acuerdo con métodos conocidos para un experto en la especialidad. La fijación de R_{1} a la fase sólida puede efectuarse también indirectamente a través de un sistema de fijación específica. En este caso, R_{1} es un conjugado, que consta de uno de los péptidos antes ilustrados y de un partícipe en la reacción de un sistema de fijación específica. Por un sistema de fijación específica se entienden en este caso dos partícipes, que pueden reaccionar uno con otro de una manera específica. La capacidad de fijación puede deberse en este caso a una reacción inmunológica o a otra reacción específica distinta. De modo preferido, como sistema de fijación específica se utiliza una combinación de biotina y avidina, o de biotina y estreptavidina. Otras combinaciones preferidas son las de biotina y anti-biotina, de un hapteno y un anti-hapteno, de un fragmento Fc de un anticuerpo y anticuerpos contra este fragmento Fc, o de un hidrato de carbono y una lectina. Uno de los partícipes en la reacción de este par capaz de fijarse específicamente es entonces una parte del conjugado, que forma el receptor R_{1}.

El otro partícipe en la reacción del sistema de fijación específica se presenta en una fase sólida. La fijación del otro partícipe en la reacción del sistema de fijación específica, a un material de soporte insoluble, se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos usuales, que son conocidos por un experto en la especialidad. En este caso, es apropiada una fijación tanto covalente como también por adsorción. Como fase sólida son especialmente adecuados tubitos de reactivos o placas de microtitulación a base de poliestireno u otros materiales sintéticos similares, que están revestidos en su superficie interna con partícipes en la reacción del sistema de fijación específica. Además, son apropiadas y especialmente preferidas sustancias en forma de partículas, tales como por ejemplo partículas de látex, materiales de tamices moleculares, corpúsculos de vidrio, mangueras de material sintético y similares. También se pueden utilizar como soportes los soportes porosos en forma de capas, tales como papel.

En una forma preferida de realización del procedimiento conforme al invento, se emplea como R_{1} un conjugado a base de un partícipe en la fijación en una forma monómera y un partícipe en la reacción del sistema de fijación específica. En esta forma de realización preferida, los receptores R_{1} y R_{2}, así como la muestra, que contiene los anticuerpos IgG que se han de determinar, se incuban en común. En este caso, las partes peptídicas de los receptores R_{1} y R_{2} reaccionan específicamente con los anticuerpos IgG que se han de determinar. La fijación de este complejo a base de R_{1}, anticuerpos de la muestra y R_{2}, a la fase sólida, que está revestida con el otro partícipe en la fijación del sistema de fijación específica, se efectúa a través de un partícipe en la reacción del sistema de fijación específica, que es un constituyente de R_{1}. Por consiguiente, la totalidad del complejo a base de R_{1}, de los anticuerpos de la muestra y de R_{2} se ha fijado a la fase sólida. Después de la separación de la fase sólida con respecto de la fase líquida y eventualmente tras de haber lavado la fase sólida, se detecta la marcación de R_{2} de acuerdo con métodos conocidos por un experto en la especialidad. Mediante esta realización del ensayo, es posible detectar un anticuerpo IgG específico en presencia de anticuerpos IgM con igual especificidad.

En otra forma de realización preferida adicional del procedimiento conforme al invento, junto a los receptores R_{1} y R_{2} se emplea todavía un receptor adicional. En esta modalidad de realización del ensayo, se emplea como R_{1} un conjugado a base de un partícipe en la fijación en una forma monómera y de un partícipe en la fijación de un sistema de fijación específica, tal como por ejemplo biotina. Para ello, los receptores R_{1} y R_{2}, así como la muestra, que contiene los anticuerpos IgG que se han de determinar, se incuban en común. En este caso, las partes peptídicas de los receptores R_{1} y R_{2} reaccionan específicamente con los anticuerpos IgG que se han de determinar. A través de un partícipe en la reacción de un sistema de fijación específica, que es un constituyente de R_{1}, se efectúa la fijación a la fase sólida, que está revestida con el otro partícipe en la reacción del sistema de fijación específica (por ejemplo con estreptavidina). Por consiguiente, la totalidad del complejo a base de R_{1}, R_{2} y de los anticuerpos de la muestra, se ha fijado a la fase sólida. Después de haber separado la fase sólida con respecto de la fase líquida y eventualmente después de haber lavado la fase sólida, el complejo fijado a la fase sólida se incuba con un receptor adicional, que reconoce específicamente la marcación de R_{2}. El receptor adicional está acoplado con un grupo generador de señales, por ejemplo con una enzima. Después de eventualmente una etapa de lavado adicional, se efectúa la detección del anticuerpo de la muestra a través del grupo generador de señales, en este caso mediante el substrato convertido por la enzima. Si se emplea esta modalidad de realización del ensayo, como marcación de R_{2} se utiliza de modo preferido digoxigenina. El receptor adicional consta en este caso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra digoxigenina y de la enzima peroxidasa. En esta modalidad de realización del ensayo, la incubación de la muestra con R_{1}, R_{2} y el receptor adicional puede efectuarse también al mismo tiempo.

Esta modalidad de realización del ensayo es apropiada asimismo muy bien para el empleo en sistemas automáticos, pero exige dos o más etapas de lavado. La gran ventaja de esta modalidad de realización del ensayo se pone de manifiesto cuando se tienen que detectar varios anticuerpos IgG específicos para un antígeno, tales como p.ej. anticuerpos de HIV contra gp41, p17, etc.. En uno de tales casos, el receptor adicional se puede emplear como marcación universal, puesto que este receptor adicional reconoce específicamente a la marcación de R_{2}.

Como muestras se pueden utilizar todos los líquidos biológicos que son conocidos por un experto en la especialidad. Como muestras se emplean preferiblemente líquidos corporales tales como sangre entera, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, saliva, etc.

En las tandas de ensayo pueden estar presentes, junto a la muestra, la fase sólida y los receptores señalados, otros aditivos que se necesitan dependiendo de la aplicación, tales como tampones, sales, detergentes, aditivos proteínicos tales como por ejemplo RSA (de Rinder Serum Albumin = albúmina de suero bovino). Los aditivos necesarios son conocidos para un experto en la especialidad o pueden ser seleccionados por éste de una manera sencilla.

Con el fin de garantizar que anticuerpos IgM o factores reumáticos no perturben a la detección de IgG específica de un antígeno, se pueden utilizar eventualmente medidas adicionales de eliminación de perturbaciones. Entre ellas se cuentan por ejemplo el empleo, divulgado en el documento de patente europea EP-B-0.341.439, de sustancias reductoras, tales como ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE) o \beta-mercapto-etanol. Además, se pueden emplear eventualmente anticuerpos anti-Fd para la eliminación de perturbaciones causadas por factores reumáticos. Un concepto de este tipo se divulga en el documento de solicitud de patente internacional WO 96/14338. Las diferentes medidas para la eliminación de perturbaciones se pueden emplear individualmente o en una combinación arbitraria.

Un objeto adicional del invento es un reactivo para la determinación de un anticuerpo específico para un antígeno, de la clase de inmunoglobulinas G, que junto a los aditivos de ensayo usuales para ensayos inmunológicos, tales como tampones, sales, detergentes, etc., contiene un receptor R_{2} capaz de fijarse con el anticuerpo que se ha de determinar, que consta de un partícipe en la fijación en una forma monómera, y de una marcación.

Es asimismo un objeto del invento un reactivo para la determinación de un anticuerpo de la clase de inmunoglobulina G, específico para un antígeno, que junto a los usuales aditivos de ensayo para ensayos inmunológicos contiene dos receptores R_{1} y R_{2} capaces de fijarse con el anticuerpo que se ha de determinar, de los que R_{1} es capaz de fijarse con una fase sólida y R_{2} lleva una marcación, realizándose que un constituyente esencial del receptor R_{2} es un partícipe en la fijación en una forma monómera.

Es además un objeto del invento un reactivo para la determinación de un anticuerpo de la clase de inmunoglobulina G, específico para un antígeno, que junto a los usuales aditivos de ensayo para ensayos inmunológicos, contiene dos receptores R_{1} y R_{2} capaces de fijarse con el anticuerpo que se ha de determinar, de los que R_{1} es capaz de fijarse con una fase sólida y R_{2} lleva una marcación, realizándose que un constituyente esencial de ambos receptores es en cada caso un partícipe en la fijación en una forma monómera.

Por otro lado, es un objeto del presente invento la utilización de partícipes en la fijación en una forma monómera para la determinación de un anticuerpo de la clase de inmunoglobulina G, que es específico para un antígeno.

Los siguientes Ejemplos explican el invento con mayor detalle.

Ejemplos 1. Reactividad con <HIV 2> MAKs (IgG e IgM) en el caso de utilización de epítopos monómeros y multímeros Descripción de la realización del ensayo

Antígenos (de HIV 2) monómeros (ensayo A) o multímeros (ensayo B), marcados con biotina y marcados con digoxigenina, reaccionan con anticuerpos de la muestra y con una fase sólida revestida con estreptavidina (incubación a 25ºC o 37ºC, durante aproximadamente 60 a 180 min, en este Ejemplo: 120 min a 25ºC). Después de una etapa de lavado, el complejo inmunológico fijado a las paredes, reacciona con un conjugado de anti-digoxigenina y una peroxidasa (incubación a 25ºC o 37ºC, durante aproximadamente 30 a 120 min, en este Ejemplo: 60 min a 25ºC). Después de una etapa de lavado adicional, el complejo inmunológico marcado con un conjugado de una peroxidasa se detecta mediante una reacción con un substrato (incubación del conjugado durante 60 min a 25ºC). En general, la incubación del conjugado se puede llevar a cabo a 25ºC o 37ºC durante aproximadamente 30 a 120 min.

Las etapas de reacción (aparte de la reacción con el substrato) tienen lugar en un tampón de Tris/HCl (pH 7,5, de 50 a 150 mM, en este Ejemplo 100 mM) con aproximadamente 0,05 a 0,4% de un detergente (aquí 0,2% de polidocanol), y con aproximadamente 0,5% de aditivos proteínicos o derivados proteínicos (aquí, entre otros, peptona a partir de lactoalbúmina y RSA).

Los anticuerpos de la muestra son en este caso anticuerpos monoclonales (MAKs) de ratón (IgM e IgG) contra un epítopo de HIV 2, diluidos a aproximadamente 2 - 20 \mug/ml en un suero humano negativo anti-HIV.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

La utilización de partícipes en la fijación, específicos para HIV 2, en una forma monómera hace posible detectar específicamente anticuerpos IgG contra los HIV 2. No son reconocidos anticuerpos de la clase IgM con la misma especificidad para un antígeno (Ensayo A).

En el caso de la utilización de partícipes en la fijación específicos para HIV 2, en una forma multímera, no es posible la discriminación entre IgG e IgM (Ensayo B).

2. Reactividad con anticuerpos de suero de una seroconversión de HIV 2 de un chimpancé

Realización experimental igual que en el Ejemplo 1.

TABLA 2

2

La utilización de partícipes en la fijación en una forma monómera hace posible la detección de la seroconversión después de una infección causada por HIV 2. La ventaja del ensayo A se muestra de modo especialmente manifiesto en la semana 3 después de la infección. Existen solamente anticuerpos IgM, que no se detectan con los partícipes en la fijación en una forma monómera. Tan sólo después de la aparición de anticuerpos IgG, muestra el ensayo A una señal positiva. El ensayo B, que utiliza epítopos multímeros, no está en situación de diferenciar entre IgG e IgM con igual especificidad.

\newpage

3. Reactividad con anticuerpos de suero de una seroconversión de HIV 1 de un paciente

Realización experimental igual que en el Ejemplo 1, pero con antígenos de HIV 1.

TABLA 3

4

También en el caso de una infección con HIV1 es posible con el ensayo A (de una manera análoga a los HIV2 de acuerdo con el Ejemplo 2) una detección confiable de anticuerpos IgG.

4. Detección de IgG contra rubéola con péptidos que contienen epítopos monómeros Descripción de la realización del ensayo

La detección de una IgG específica para rubéola (R-IgG) mediante los partícipes en la fijación en una forma monómera conformes al invento, se lleva a cabo en un aparato Elecsys® 2010 de la entidad Boehringer Mannheim GmbH, Alemania, de acuerdo con los datos del fabricante. Se emplean los siguientes reactivos.

Reactivo R1:	péptido cíclico del antígeno de rubéola E1, biotiniliado. Tampón Tris,
	pH 7,5, 0,2% de Myrij, 0,2% de RSA, 0,1% de R-IgG.
Reactivo R2:	péptido cíclico del antígeno de rubéola E1, rutenilado. Tampón Tris,
	pH 7,5, 0,2% de Myrij, 0,2% de RSA, 0,1% de R-IgG.

Como muestras se emplean muestras de sueros humanos.

La realización del ensayo se efectúa en las siguientes etapas:

1. 30 \mul de muestra + 65 \mul de R1 + 65 \mul de R2

2. Incubación a 37ºC, durante 39 min

3. Adición de 40 \mul de glóbulos magnéticos revestidos con SA

4. Incubación a 37ºC durante 9 min

5. Reacción de detección: medición de la señal de electroquimioluminiscencia.

TABLA 4

5

Se reconocen como positivas solamente las muestras que contienen IgG específicas para un antígeno. Conforme al invento no se reconocen como positivas las muestras que solamente contienen IgG específicas para un antígeno (N^{os} 1.3 y 1.4).

Claims (7)

1. Procedimiento para la determinación de un anticuerpo de la clase G de inmunoglobulinas, que es específico para un antígeno, en un ensayo de puente de acuerdo con el principio de ensayo con dobles antígenos, mediante incubación de la muestra con por lo menos dos diferentes receptores R_{1} y R_{2}, siendo ambos receptores capaces de fijarse específicamente con los sitios de fijación a antígenos del anticuerpo, estando o pudiendo estar R_{1} fijado a una fase sólida y llevando R_{2} una marcación, caracterizado porque como R_{2} se utiliza un conjugado a base de un partícipe en la fijación en una forma monómera, que es reconocido específicamente por el anticuerpo que se ha de determinar, y de una marcación, y porque un constituyente esencial de R_{1} es un partícipe en la fijación en una forma monómera.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque como sistema de fijación específica para la fijación de R_{1} a la fase sólida se utiliza un sistema de biotina y avidina, de biotina y estreptavidina, de biotina y anti-biotina, de un hapteno y un anti-hapteno, de un fragmento Fc de un anticuerpo y anticuerpos contra este fragmento Fc, de un hidrato de carbono y una lectina.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el receptor R_{2} está marcado con una sustancia quimioluminiscente, fluorescente o radiactiva, con una enzima o con otra molécula biológica distinta.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la muestra se incuba simultáneamente con R_{1} y R_{2}.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la tanda de ensayo se incuba con un receptor adicional, que se fija específicamente a la marcación del receptor R_{2}, siendo el receptor adicional un conjugado a base de un receptor específico para la marcación de R_{2} y de una marcación, y a continuación se determina la marcación.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las relaciones entre concentraciones de R_{1} : R_{2} son de 0,5:1,0 a 1,0:5,0.

7. Reactivo para la determinación de un anticuerpo de la clase G de inmunoglobulinas, específico para un antígeno de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque contiene dos receptores R_{1} y R_{2} capaces de fijarse con el anticuerpo que se ha de determinar, de los que R_{1} es capaz de fijarse con una fase sólida y R_{2} lleva una marcación, siendo un constituyente esencial de ambos receptores en cada caso un partícipe en la fijación en una forma monómera.