CN103197077A - 一种检测微量牛免疫球蛋白g的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测微量牛免疫球蛋白G的试剂盒，包括反应滴定微孔板和包含有标准品，样品稀释液，发光底物A液、发光底物B液的检测试剂，所述反应滴定微孔板上包被有鼠抗牛IgG特异性单抗，所述检测试剂还包括工作浓度为0.11μg/ml的酶标记鼠抗牛IgG特异性抗体,所用酶稀释液中不含牛血清白蛋白（BSA）及牛血清成分。本发明的优点在于采用化学发光免疫分析法对牛免疫球蛋白（IgG）进行检测，使用鼠抗牛特异性单抗，利用化学发光酶催化发光底物，使之发生化学反应并释放出大量的能量，测定最终形成的光量子与样品中待测定的牛免疫球蛋白（IgG）含量成正比。与常规免疫比浊法、酶联免疫法检测微量牛免疫球蛋白IgG相比具有显著的优势。
Description
技术领域
本发明涉及测定牛血清、血浆及相关液体样本中牛免疫球蛋白用的试剂盒，尤其是涉及一种检测微量牛免疫球蛋白G的试剂盒。
背景技术
牛血清是人用生物制品疫苗、动物疫苗产品中重要的原材料之一，其成分直接关系到人和动物的健康。生物医药领域中疫苗的快速发展，都是通过细胞培养来实现的，在细胞培养过程中，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成分动物血清（牛血清是应用最为广泛的动物血清）对细胞的生长繁殖发挥着重要的甚至是难以替代的作用。牛血清中的牛免疫球蛋白G(IgG)含量的高低对于细胞的表达和提供抗体的滴度非常重要，而现有的检测牛免疫球蛋白G含量的免疫比浊法、酶免法的检测灵敏度的最低检测浓度仅能达到100μg/ml，不能达到ng级水平。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可精确检测微量牛免疫球蛋白G的试剂盒。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的一种检测微量牛免疫球蛋白G的试剂盒，包括反应滴定微孔板和包含有标准品，样品稀释液，发光底物A液、发光底物B液的检测试剂，所述反应滴定微孔板上包被有鼠抗牛IgG特异性单抗，所述检测试剂还包括工作浓度为0.11μg/ml的酶标记鼠抗牛IgG特异性抗体,所用酶稀释液中不含牛血清白蛋白（BSA）及牛血清成分。
鼠抗牛IgG特异性单抗的获取：使用牛IgG免疫BALB/C小鼠，利用杂交瘤抗体技术，获得鼠抗牛IgG单抗细胞株，并通过特异性筛选而获取。
所述样品稀释液中不含牛血清白蛋白及牛血清成分。
所述发光底物A液由发光剂、增强剂和氨基酸配制而成；所述发光底物B液由氨基酸氧化酶和稳定剂配制而成。
本发明的优点在于采用化学发光免疫分析法对牛免疫球蛋白（IgG）进行检测，使用鼠抗牛特异性单抗，利用化学发光酶催化发光底物，使之发生化学反应并释放出大量的能量，测定最终形成的光量子与样品中待测定的牛免疫球蛋白（IgG）含量成正比。
实验表明，使用本发明试剂盒检测微量牛免疫球蛋白IgG，各项指标可达到：线性范围：0-1200ng/ml；灵敏度：99.8%；精密度：分析内精密度为2.5%（n=10），分析间精密度为4.5%（n=10）；特异性：99.5%。与常规免疫比浊法、酶联免疫法检测微量牛免疫球蛋白IgG相比具有显著的优势。
具体实施方式
本发明所述的检测微量牛免疫球蛋白G的试剂盒，包括包被有鼠抗牛IgG特异性单抗的96孔发光不透明聚苯乙烯白色反应滴定微孔板，工作浓度为0.11μg/ml的辣根过氧化物酶标记鼠抗牛IgG特异性抗体（所用酶稀释液中不含BSA及牛血清成份）；标准品，样品稀释液（样品稀释液中不含BSA及牛血清成分），由发光剂、增强剂和氨基酸配制而成的发光底物A液、由氨基酸氧化酶和稳定剂配制而成的发光底物B液。
96孔发光不透明聚苯乙烯白色反应滴定微孔板包被鼠抗牛IgG特异性单抗：包被缓冲液采用pH9.6， 0.05M碳酸盐缓冲液；包被浓度2-4μg/ml,包被量100μl/孔，0℃-4℃包被过夜；弃去孔内液体，使用PBS-Tween洗液洗板孔1次；用pH7.4 PBS含2% Casein(m/v), 100μl/孔，室温封闭2h。
抗体标记：取辣根过氧化物酶溶于三蒸水中，加入过碘酸钠溶液活化，加入乙二醇反应，将反应混合物装入透析袋，用醋酸缓冲液透析，加入待标记物（鼠抗牛IgG特异性抗体）混匀，碳酸缓冲液调pH至碱性，加入NaHB4溶液反应后，装入透析袋，用磷酸盐缓冲液透析，分装后加入蛋白保护剂，-20度保存。
本发明试剂盒的使用方法如下：
一、实验前准备
1、取1包固体洗液用500ml蒸馏水溶解后备用。
2、取出试剂盒及待测样品，将所有试剂及样品恢复至室温（18-25℃）。
3、将恒温箱或水浴锅调至反应温度。
4、提前30分钟将发光底物A、B液等比例混合至本次试验所需体积。
二、实验步骤
1、标准品的稀释与加样：在反应滴定微孔板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第二至十孔加样品稀释液100μl，混匀；然后从第二孔中各取100μl加到第三孔，混匀，取100μl加到第四孔，依次类推到第十孔，混匀，取100μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为100μl，浓度分别为1200ng/ml、600 ng/ml、300 ng/ml、150 ng/ml、75 ng/ml、37.5 ng/ml、18.75 ng/ml、9.375 ng/ml、4.6875 ng/ml、2.34375 ng/ml）。
2、加样：在反应滴定微孔板上分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）和待测样品孔。在待测样品孔中先加样品稀释液90μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为10倍）。加样时将样品加于孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗液，静置30秒后弃去，如此重复6次，拍干。
5、加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
6、温育：操作同3。
7、洗涤：操作同5。
8、每孔加入混合后的发光底物100μl，震荡10秒后，室温（18-25℃）避光反应10分钟。
9、化学发光检测仪检测发光强度。
三、结果计算
采用以下函数拟合方式：以系列定标品浓度值的对数值为横坐标（X轴），以定标品发光值的对数值为纵坐标（Y轴），建立（log-log）线性回归曲线，由样品发光值，在定标曲线上进行计算，得到相应的浓度值。
四、检测标本情况：
五、结论
对细胞培养常用的DMEM培养基、1640培养基等基础培养基进行检测，结果成阴性（不存在交叉反应）；
鼠杂交瘤细胞株制备的腹水、体外培养物（无血清培养基培养）进行检测，结果成阴性，与鼠抗体不存在交叉反应；
通过将已知浓度牛IgG纯品梯度稀释到样品稀释液中进行检测，其线性非常好，检测的浓度较精确；
对商品化不同批次低IgG（小于10ug/mL）牛血清进行检测，其含量分别在2 ug/ml,4 ug/ml,8 ug/ml，符合要求。
Claims (3)
1.一种检测微量牛免疫球蛋白G的试剂盒，包括反应滴定微孔板和包含有标准品，样品稀释液，发光底物A液、发光底物B液的检测试剂，其特征在于：所述反应滴定微孔板上包被有鼠抗牛IgG特异性单抗，所述检测试剂还包括工作浓度为0.11μg/ml的酶标记鼠抗牛IgG特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的检测微量牛免疫球蛋白G的试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液中不含牛血清白蛋白及牛血清成分。
3.根据权利要求1或2所述的检测微量牛免疫球蛋白G的试剂盒，其特征在于：所述发光底物A液由发光剂、增强剂和氨基酸配制而成；所述发光底物B液由氨基酸氧化酶和稳定剂配制而成。
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